JP3670745B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来共焦点顕微鏡として、特開平５−６０９８０に開示された共焦点用光スキャナを組み合わせたものがある。図４に示すように共焦点用光スキャナ（ディスクスキャナ）１０は、複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口を用いた集光ディスク１と、該マルチピンホール開口に対応した複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、図示しないレーザ光源からのレーザ光がコリメートされた照射光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２を通過した戻りの光を、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像光学系例えば集光レンズ８で結像させた試料１５の投影像をカメラ９で撮像できるように構成したものである。
【０００３】
以上述べた共焦点用光スキャナ１０を顕微鏡に用いた場合には、顕微鏡視野に相当する範囲に存在する複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを同時に照射して共焦点に結像させる、マルチピンホール方式を用いているため、ガルバノメータミラなどの往復回転鏡による光学偏向方式に比べ、高速走査に適している。
【０００４】
ここで、図４の共焦点用光スキャナ１０の作用効果について、図５を参照して説明する。図５はマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを単純化した図である。コリメートされたレーザ光１１は、マイクロレンズ１２を通過してピンホール上に集光され、スポットを形成する。ピンホール１３を通過したレーザ光は、対物レンズ１４に入射し、試料１５の上に縮小投影されたスポットを形成する。試料１５からの反射光や蛍光などの戻りの光は、再び対物レンズ１４を通過してピンホール１３の裏側へ至り、拡大投影されたスポットを形成する。ピンホール１３を再び通過した戻りの光は、ビームスプリッタ７によってレーザ光と分離され、結像光学系１７によって結像され、撮像デバイス１８の撮像面へと至る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、共焦点顕微鏡として、回折限界による究極の性能の引き出し、かつ、不必要な光量損失を防ぐためには、対物レンズ１４の像側の開口数（以下対物レンズ１４の像側のＮＡと称する）と、マイクロレンズ１２の開口数（以下マイクロレンズ１２のＮＡと称する）を一致させ、またマイクロレンズ１２による回折限界スポット直径に対してピンホール１３の開口直径が等しいか、または若干大きくさせることが必要である。
【０００６】
以下このことについて具体的に説明する。
該共焦点顕微鏡のマイクロレンズ付き開口とピンホールの仕様として、例えば油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）に適合するように仕様を設定すると、
マイクロレンズ１２のＮＡ＝０．０１２５、ピンホール１３の開口直径＝φ５０μｍ
となる。
【０００７】
ここで、マイクロレンズ１２のＮＡは、油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するように、０．０１２５を設定した。
【０００８】
また、レーザ光源として、アルゴンレーザ４８８nmを用いた場合、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、
１．２２×０．４８８／０．０１２５＝４７．６μｍ
と計算され、これに適合するように、ピンホール１３の開口直径をφ５０μｍと設定した。
【０００９】
次に、前述の最適設定からズレを生じた場合の影響について説明する。
（１）対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが一致しない場合
（１−１） 対物レンズ１４の像側のＮＡ＜マイクロレンズ１２のＮＡ
図６のごとく、レーザ光１１が対物レンズ１４の外周まで拡がり、光量損失が大きくなる。
【００１０】
（１−２） 対物レンズ１４の像側のＮＡ＞マイクロレンズ１２のＮＡ
図７のごとく対物レンズ１４のＮＡの真ん中にしかレーザ光が行かず、実効ＮＡが小さくなる。このため、共焦点効果のうちの重要なセクショニング効果が劣化する。
【００１１】
（２）マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（２−１） マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１２】
（２−２） マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１３】
（３）対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（３−１） 対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１４】
（３−２） 対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１５】
一方、セクショニング効果と並ぶ共焦点効果の一つである超解像効果については、理論的には対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが適合し、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径》ピンホール１３の開口直径（》：十分に小さいことを意味し、約１／８程度である）の全てを満足した条件で得られることになるが、（２−２）項と、（３−２）項に該当するため、光量損失は極めて大きくなる。
【００１６】
従って、一般に試料１５が例えば生物標本であってこの蛍光観察を行う場合には、共焦点効果のうちの超解像効果が重要ではなく、セクショニング効果が重要である。
【００１７】
次に、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）を基準に仕様設定した図４に示す共焦点用光スキャナ１０を用いて生物標本の深部を（セクショニング効果を生かして）観察しようとする場合、油浸対物レンズや乾燥対物レンズでは生物標本と液浸用オイル又は空気の屈折率差による収差の増大を招くために使用することができない。このため、油浸対物レンズに変えて水浸対物レンズを用いる必要がある。水浸対物レンズを用いた場合、どういう不都合が生ずるかを説明する。
【００１８】
例えば、低倍率の対物レンズ１４は、試料１５の細胞集団の全体像を把握して、高倍率の対物レンズ１４で観察すべき細胞を見つけだしたり、細胞集団としての組織形態を観察するのに用いる。
【００１９】
顕微鏡のレボルバやスライダなどの対物レンズ倍率変更手段を用いて、水浸６０倍対物レンズ（ＮＡ：０．９）に変更したとする。この場合、対物レンズの像側のＮＡは、０．９／６０＝０．０１５であり、相当する対物レンズの像側の回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、１．２２×０．４８８／０．０１５＝３９．７μｍである。これを前述の比較条件に当てあてはめると、前述の（１−２）項と、（３−１）項に該当することになる。すなわち、水浸６０倍の対物レンズ１４を使用する場合には、ピンホール１３が大き過ぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００２０】
つまり、図４の共焦点用光スキャナ１０を用いた共焦点顕微鏡では、ピンホールディスクの交換が困難であり、ピンホールディスクとしてピンホール直径が油浸１００倍対物レンズに対応させた５０μｍのものを用いるしかない。このピンホールディスク（ピンホール直径５０μｍ）を用いた場合、倍率の異なる対物レンズ１４に変更すると、この対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径がピンホール１３の直径５０μｍより小さくなるために、この対物レンズ１４の性能を生かした共焦点効果、特にセクショニング効果が得られないという問題が生ずる。このことは、水浸対物レンズのある倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズを基準にした場合の像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たすピンホール（ピンホール直径４０μｍ）１３を有するピンホールディスク２と仮に交換できたとしても、６０倍の対物レンズ以外の倍率の対物レンズに関しては上述と同様の問題が生ずる。
【００２１】
本発明の目的は、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かし、共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、請求項１に対応する発明は、光源と、前記光源から発した照射光を試料上に集光する対物レンズと、前記光源と前記対物レンズ間の像面に回転可能に配置され、前記照射光を通過する複数のピンホールを有するピンホール板と、前記対物レンズと前記光源との間に配置された光分岐光学系と、前記光分岐光学系で分岐した前記試料上の検査信号を検出する検出器とを備え、前記照射光を試料に対して走査する共焦点顕微鏡において、前記対物レンズの倍率を変更可能な対物レンズ倍率変更手段と、前記対物レンズと前記ピンホール板との間に配置され、前記試料から該ピンホール板への倍率を、前記対物レンズ倍率変更手段により変更される倍率に対応して変更可能な中間倍率変更手段とを具備した共焦点顕微鏡である。
【００２３】
請求項１に対応する発明によれば、中間倍率変更手段を設けたので、使用する対物レンズの倍率を変更しても、ピンホール板に投影される像の像側のＮＡが一定になるように補正される。これにより、使用する各対物レンズ毎に回折限界で決まる究極の共焦点効果、特にセクショニング効果の劣化を防止できる。
【００２４】
前記目的を達成するため、請求項２に対応する発明は、請求項１記載の共焦点顕微鏡において、光分岐光学系と検出器に至る光学系上に配置され、対物レンズ倍率変更手段により変更された対物レンズの倍率に対応して投影倍率を変更可能な結像系倍率変更手段をさらに追加した共焦点顕微鏡である。
【００２５】
請求項２に対応する発明によれば、対物レンズの呼称倍率で検出する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズの呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図１を参照して説明する。前述した従来の図５とは異なる点は、試料１５から対物レンズ１４以降、ピンホールディスク２に至る光学系に中間倍率変更手段例えば中間変倍光学系２０を設け、これにより試料１５からピンホールディスク２への投影倍率を変更可能に構成にしたこと、および、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８に至る結像光学系の投影倍率を変換可能に構成した結像系倍率変更手段例えば結像変倍光学系２１を設けたものである。
【００２７】
このような構成の共焦点顕微鏡は、以下のような動作を行う。複数のマイクロレンズ付開口を用いた集光ディスク１と、該集光ディスク１のマイクロレンズ付開口に対応した位置に複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、コリメートされたレーザ光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、中間変倍光学系２０、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像変倍光学系２１で結像させた投影像を撮像デバイス１８で撮像できるように構成したものである。
【００２８】
ここでの試料１５としては、例えば生物標本、特に生きた組織細胞であり、具体的には４０μｍ程度の厚さを持つ心筋である。生組織の表面約１０μｍは、組織切断時の損傷などにより死んでおり、組織切片内約２０μｍ程度の深さで共焦点効果によるセクショニングを行って、光学的な切片像を観察する。
【００２９】
通常の顕微鏡では、このように厚い切片の内部を観察することは不可能であり、高倍率観察・低倍率観察によらず、共焦点効果によるセクショニングが必要である。観察・測定の対象は、主として蛍光試薬の蛍光観察・測光による生細胞内のイオンの動的変化測定であり、ディスクスキャナによる高速走査性が有用である。
【００３０】
ここで、高倍率観察では、細胞内構造の微小構造、例えば細胞膜など、内のイオンの動的変化を測定し、低倍率観察では、細胞全体、および、隣接した複数の細胞の間でのイオンの動的変化を測定する。これによって、前者では、細胞内構造のもつ生態機能の解明が行われ、また後者では細胞間の連携による生態機能の解明が行われる。このため、対物レンズ１４の倍率変更に伴う実験が行えるように装置を構成することが不可欠である。
【００３１】
このディスクスキャナ１０は、従来の技術で説明した、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するものであり、マイクロレンズＮＡ＝０．０１２５、ピンホール開口直径＝φ５０μｍに設定したディスクスキャナ１０を用いる。
【００３２】
以上述べた共焦点顕微鏡では、例えば蛍光試薬を狙いの細胞に微小注入（マイクロインジェクション）する必要があるため、顕微鏡はステージとして例えば固定型を用いる。ステージの上で培養液に浸された生組織を、作動距離の長い水浸対物レンズで観察する。生組織の屈折率はほぼ水と等しいため、水浸対物レンズを用いることで、深部観察における収差の発生は排除されている。また、対物レンズは、無限遠補正されており、適当な結像レンズとの組合せで用いる必要がある。
【００３３】
ここで、使用可能な市販の水浸対物レンズの仕様を示すと下記の通りである。
倍率 ＮＡ 作動距離（mm）
１０ ０．３ ３．３
２０ ０．５ ３．３
４０ ０．８ ３．３
６０ ０．９ ２．０
従来の技術で説明した通り、各対物レンズの像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズのＮＡ／対物倍率
で求められ、各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側の回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側のＮＡ
で求められる。光の波長には、厳密には蛍光を励起するレーザ波長と蛍光波長とを用いる必要があるが、ここではレーザ波長４８８nmで代表することとする。
【００３４】
各対物レンズ毎の、像側のＮＡと像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）の計算結果は以下の通りである。
倍率 ＮＡ 像側のＮＡ 回折限界スポット直径（μｍ）
１０ ０．３ ０．０３ １９．８
２０ ０．５ ０．０２５ ２３．８
４０ ０．８ ０．０２ ２９．８
６０ ０．９ ０．０１５ ３９．７
従来の技術で説明した比較条件にあてはめて、ディスクスキャナ１０（ピンホール１３の直径５０μｍ）との適合性を評価すると、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４では、前述の（１−２）項と、（３−１）項が該当する。すなわち、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４のそれぞれの回折限界スポット直径に比較してピンホール１３の直径が大きすぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００３５】
ここで、対物レンズ１４とディスクスキャナ１０との間に中間倍率を作用させ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の５０μｍに揃えるよう、中間倍率を計算する。
【００３６】
中間変倍光学系２０の倍率を作用させる場合の、各対物レンズ１４の像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズ１４のＮＡ／対物倍率／中間倍率
で求められ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側ＮＡ
で求められる。
【００３７】
各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の直径５０μｍに揃えるように設定した場合の、中間倍率の計算結果は以下のようになる。
【００３８】
倍率 ＮＡ 中間倍率 像側のＮＡ 回折限界スポット直径（μｍ）
１０ ０．３ ２．４ ０．０１２５ ４７．６
２０ ０．５ ２．０ ０．０１２５ ４７．６
４０ ０．８ １．６ ０．０１２５ ４７．６
６０ ０．９ １．２ ０．０１２５ ４７．６
次に、中間倍率を導入した場合のセクショニング効果を計算により確認するが、始めにセクショニング効果の計算方法について説明する。円形開口の回折限界スポットの光軸上の分布はｓｉｎｃの二乗関数で表され、共焦点セクショニング効果は、回折限界スポットの光軸上輝度最大点からゼロ点（１次解）までのデフォーカス量Ｚの値で代表させる。
【００３９】
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量Ｚ＝２ｎ×λ／対物ＮＡ2
ここで、ｎ：媒質の屈折率（水：１．３３）
λ：波長（４８８nm）
対物ＮＡ：対物レンズの開口数
であり、これらによりデフォーカス量Ｚを計算することができる。
【００４０】
次に、ピンホールが大き過ぎる場合のデフォーカス量Ｚの値の計算方法を説明する。ピンホールに対して、マイクロレンズのＮＡが適合していると仮定し、ピンホール径に相当する像側のＮＡを求める。
【００４１】
像側のＮＡ＝１．２２×０．４８８／５０＝０．０１１９
と計算できる。これに、対物レンズ１４の倍率と中間倍率とを掛けたものを対物レンズの実効のＮＡとし、
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量（Ｚ）＝２ｎ×λ／（実効ＮＡ2 ）によって計算する。これをスキャナ１０に依存するセクショニング効果の代表値として用いることにする。
【００４２】
つまり、ピンホールサイズが大きい場合には、スキャナ１０に依存した実効ＮＡを用いて算出したＺ値を用い、ピンホールサイズが適当な場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚの値を用いることとする。これにより、ピンホールサイズが適当であれば、両者は一致することとなり、ピンホールサイズが大きければ、スキャナ１０に依存して実効ＮＡが小さくなり、Ｚの値が大きくなることになる。
【００４３】
なお、本実施形態における計算では該当しないが、もしピンホールディスク２に形成されているピンホール１３の方が小さい場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚ値よりもセクショニング効果が向上することは期待できないので、対物レンズ１４のＺ値を用いることとすればよい。
【００４４】
まず、中間変倍光学系２０の倍率を導入しない場合のデフォーカス量Ｚの計算結果をまとめると次のようになる。
中間倍率を導入しない場合（従来の技術の場合）
倍率 ＮＡ 中間倍率 総合倍率 Ｚ値（μｍ）
１０ ０．３ １ １０ ９１．７
２０ ０．５ １ ２０ ２２．９
４０ ０．８ １ ４０ ５．７
６０ ０．９ １ ６０ ２．５
次に、中間倍率を導入した場合のＺ値の計算結果は次のようになる。
【００４５】
倍率 ＮＡ 中間倍率 総合倍率 Ｚ値（μｍ）
１０ ０．３ ２．４ ２４ １４．４
２０ ０．５ ２．０ ４０ ５．２
４０ ０．８ １．６ ６４ ２．０
６０ ０．９ １．２ ７２ １．６
以上述べた計算の結果から明らかなように、試料１５からピンホールディスク２までの光学系に対物レンズ１４とは別の中間変倍光学系２０を設け、使用する対物レンズ１４の倍率に合わせて、像側のＮＡがピンホール１３のサイズと適合するように構成することで、Ｚ値を小さくすること、すなわち、共焦点効果であるセクショニング分解能を向上させることができる。
【００４６】
なお、図１の実施形態において、試料１５から撮像デバイス１８までの総合倍率は、対物レンズ１４の倍率とピンホールディスク２までの中間変倍光学系２０の倍率の積に、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の倍率を掛けたものである。従って、対物レンズ１４の呼称倍率で撮像する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００４７】
ただし、本発明の実施の形態の結像変倍光学系２１により結像光学系の倍率を変えることは、本発明の基本的な効果である共焦点セクショニングの効果の向上には寄与するものではなく、本発明の実施形態において必ずしも必要なものではない。また、観察像倍率の補正すなわち、結像変倍光学系２１の倍率の変更は必ずしも必要なものではなく、その代わりに画像処理により表示倍率の変換を行うことなど、代替案が考えられる。
【００４８】
ここで、図１における中間変倍光学系２０の具体的な例について、図２、図３を参照して説明する。図２は、中間変倍光学系２０としては、結像レンズ２２、２３を図示しないレボルバまたはスライダ等の変換機構に取り付けたものである。
【００４９】
この場合、対物レンズ１４は前述の使用可能な対物レンズのうち、４０倍、ＮＡが０．８の対物レンズである。対物レンズ１４は無限遠補正されており、所定の焦点距離ｆを有する結像レンズ２２によって、４０倍（中間倍率：１倍）の像を結ぶ。中間倍率は、焦点距離の異なる結像レンズ２２を用いることにより、ｆと結像レンズ２２の焦点距離との比が中間倍率となる。
【００５０】
図２（ａ）には、中間倍率１倍の結像レンズ２２を用いた場合、図２（ｂ）には前述した計算結果に応じた中間倍率１．６倍の結像レンズ２３（１．６ｆ）を用いた場合をそれぞれ示している。
【００５１】
このように、結像レンズ２２，２３を変換する場合には、予め使用する対物レンズ１４の組み合わせを決めておき、それに応じた結像レンズ２２，２３の組み合わせを変倍ターレットに設置する必要がある。もし、使用する対物レンズ１４の組み合わせを変更する場合には、ターレットに取り付けられた複数の対物レンズのうち所望の倍率の対物レンズを光軸上に選択挿入すれば良い。図２においては、中間変倍光学系２０の作用を理解しやすいように、結像レンズを薄肉レンズとして図示したため、結像レンズ２２と２３の位置が、光軸方向にシフトしているが、複数枚の構成によって適宜レンズを設計することで、光軸方向の位置を合わせることができ、ターレット機構による変換を無理なく行うことが可能である。
【００５２】
図２（ａ）では、中間倍率が１倍のため、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料側のＮＡが小さくなっている。このため、破線で示す２０倍の対物レンズ１４が本来持っている試料１５側のＮＡを使いきれていない。
【００５３】
一方、図２（ｂ）では、中間倍率１．６倍の結像レンズ２３により、対物レンズ１４への平行光束が太くなり、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料１５側のＮＡが大きくなる。ＮＡが小さい場合には、共焦点効果、特にセクショニング効果が劣化するが、前述のようにＮＡを大きくすることで改善される。
【００５４】
図３は、中間変倍光学系２０として結像レンズ２２とアフォーカルズーム光学系２４を使用した例であり、この構成によれば、レンズ２枚の位置関係を回転カム機構など適宜調整するように構成し、中間倍率を連続的に可変することができる。これにより、新たな対物レンズを使用する場合でも最適に調整することができる。
【００５５】
また、実験をしながら対物レンズ１４の倍率設定手段を動かし、最適条件を探すことも可能である。この構成においても、図２で説明した作用効果と同一の作用効果が得られる。具体的には、図３（ａ）は中間倍率すなわち結像レンズ２２を１倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが小さく、セクショニング効果が悪いが、図３（ｂ）は中間倍率すなわち結像レンズ２３を１．６倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが大きく、セクショニング効果が良い。
【００５６】
図１における結像変倍光学系２１についても、中間変倍光学系２０と同様に、ターレット切換による方法と、ズーム機構による連続変換が可能である。ここで、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の変倍を、中間変倍光学系２０の倍率と連動可能に構成することにより、中間倍率の変倍分を吸収し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した総合倍率を得ることができる。
【００５７】
なお、本発明の実施の形態では、ピンホール１３のサイズが大きすぎる場合のセクショニング効果の劣化に着目して、改善策として中間倍率として拡大倍率を作用させる場合についてのみ説明したが、ピンホールサイズが小さすぎて光量損失の大きい場合でも、中間倍率として縮小倍率を作用させることで、光量損失の少ない共焦点顕微鏡を実現することができる。つまり、本発明は中間倍率が拡大であっても、縮小であっても本発明の目的を達成することができる。
【００５８】
また、本発明の実施の形態では、油浸１００倍の対物レンズを基準に仕様設定したピンホール直径が５０μｍのピンホールを有するピンホールディスクを用いたが、ピンホールの直径は５０μｍに限定されるものではなく、基準となる乾燥または液浸対物レンズのある特定の倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たす４０μｍのピンホール直径を有するピンホールディスクを用い、他の倍率の対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ４０μｍとなるように中間倍率を設定することも可能である。すなわち、ピンホールディスクのピンホール直径に各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ満たされるように中間倍率を設定できるので、ピンホールディスクのピンホール直径の大きさに拘る必要がない。
【００５９】
【発明の効果】
以上述べた本発明によれば、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かした共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による共焦点顕微鏡の実施形態の概略構成を示す図。
【図２】図１の中間変倍光学系の第１の例を説明するための図。
【図３】図１の中間変倍光学系の第２の例を説明するための図。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の一例を説明するための図。
【図５】図４の問題点を説明するための図４の簡略図。
【図６】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＜マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【図７】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＞マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【符号の説明】
１…集光ディスク、
２…ピンホールディスク、
３…ドラム、
４…モータ、
７…ビームスプリッタ、
９…カメラ、
１０…共焦点用光スキャナ、
１１…レーザ光、
１２…マイクロレンズ、
１３…ピンホール、
１４…対物レンズ、
１５…試料、
１８…撮像デバイス、
２０…中間変倍光学系、
２１…結像変倍光学系、
２２，２３…結像レンズ、
２４…アフォーカルズーム光学系。
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来共焦点顕微鏡として、特開平５−６０９８０に開示された共焦点用光スキャナを組み合わせたものがある。図４に示すように共焦点用光スキャナ（ディスクスキャナ）１０は、複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口を用いた集光ディスク１と、該マルチピンホール開口に対応した複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、図示しないレーザ光源からのレーザ光がコリメートされた照射光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２を通過した戻りの光を、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像光学系例えば集光レンズ８で結像させた試料１５の投影像をカメラ９で撮像できるように構成したものである。
【０００３】
以上述べた共焦点用光スキャナ１０を顕微鏡に用いた場合には、顕微鏡視野に相当する範囲に存在する複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを同時に照射して共焦点に結像させる、マルチピンホール方式を用いているため、ガルバノメータミラなどの往復回転鏡による光学偏向方式に比べ、高速走査に適している。
【０００４】
ここで、図４の共焦点用光スキャナ１０の作用効果について、図５を参照して説明する。図５はマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを単純化した図である。コリメートされたレーザ光１１は、マイクロレンズ１２を通過してピンホール上に集光され、スポットを形成する。ピンホール１３を通過したレーザ光は、対物レンズ１４に入射し、試料１５の上に縮小投影されたスポットを形成する。試料１５からの反射光や蛍光などの戻りの光は、再び対物レンズ１４を通過してピンホール１３の裏側へ至り、拡大投影されたスポットを形成する。ピンホール１３を再び通過した戻りの光は、ビームスプリッタ７によってレーザ光と分離され、結像光学系１７によって結像され、撮像デバイス１８の撮像面へと至る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、共焦点顕微鏡として、回折限界による究極の性能の引き出し、かつ、不必要な光量損失を防ぐためには、対物レンズ１４の像側の開口数（以下対物レンズ１４の像側のＮＡと称する）と、マイクロレンズ１２の開口数（以下マイクロレンズ１２のＮＡと称する）を一致させ、またマイクロレンズ１２による回折限界スポット直径に対してピンホール１３の開口直径が等しいか、または若干大きくさせることが必要である。
【０００６】
以下このことについて具体的に説明する。
該共焦点顕微鏡のマイクロレンズ付き開口とピンホールの仕様として、例えば油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）に適合するように仕様を設定すると、
マイクロレンズ１２のＮＡ＝０．０１２５、ピンホール１３の開口直径＝φ５０μｍ
となる。
【０００７】
ここで、マイクロレンズ１２のＮＡは、油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するように、０．０１２５を設定した。
【０００８】
また、レーザ光源として、アルゴンレーザ４８８nmを用いた場合、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、
１．２２×０．４８８／０．０１２５＝４７．６μｍ
と計算され、これに適合するように、ピンホール１３の開口直径をφ５０μｍと設定した。
【０００９】
次に、前述の最適設定からズレを生じた場合の影響について説明する。
（１）対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが一致しない場合
（１−１） 対物レンズ１４の像側のＮＡ＜マイクロレンズ１２のＮＡ
図６のごとく、レーザ光１１が対物レンズ１４の外周まで拡がり、光量損失が大きくなる。
【００１０】
（１−２） 対物レンズ１４の像側のＮＡ＞マイクロレンズ１２のＮＡ
図７のごとく対物レンズ１４のＮＡの真ん中にしかレーザ光が行かず、実効ＮＡが小さくなる。このため、共焦点効果のうちの重要なセクショニング効果が劣化する。
【００１１】
（２）マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（２−１） マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１２】
（２−２） マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１３】
（３）対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（３−１） 対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１４】
（３−２） 対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１５】
一方、セクショニング効果と並ぶ共焦点効果の一つである超解像効果については、理論的には対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが適合し、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径》ピンホール１３の開口直径（》：十分に小さいことを意味し、約１／８程度である）の全てを満足した条件で得られることになるが、（２−２）項と、（３−２）項に該当するため、光量損失は極めて大きくなる。
【００１６】
従って、一般に試料１５が例えば生物標本であってこの蛍光観察を行う場合には、共焦点効果のうちの超解像効果が重要ではなく、セクショニング効果が重要である。
【００１７】
次に、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）を基準に仕様設定した図４に示す共焦点用光スキャナ１０を用いて生物標本の深部を（セクショニング効果を生かして）観察しようとする場合、油浸対物レンズや乾燥対物レンズでは生物標本と液浸用オイル又は空気の屈折率差による収差の増大を招くために使用することができない。このため、油浸対物レンズに変えて水浸対物レンズを用いる必要がある。水浸対物レンズを用いた場合、どういう不都合が生ずるかを説明する。
【００１８】
例えば、低倍率の対物レンズ１４は、試料１５の細胞集団の全体像を把握して、高倍率の対物レンズ１４で観察すべき細胞を見つけだしたり、細胞集団としての組織形態を観察するのに用いる。
【００１９】
顕微鏡のレボルバやスライダなどの対物レンズ倍率変更手段を用いて、水浸６０倍対物レンズ（ＮＡ：０．９）に変更したとする。この場合、対物レンズの像側のＮＡは、０．９／６０＝０．０１５であり、相当する対物レンズの像側の回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、１．２２×０．４８８／０．０１５＝３９．７μｍである。これを前述の比較条件に当てあてはめると、前述の（１−２）項と、（３−１）項に該当することになる。すなわち、水浸６０倍の対物レンズ１４を使用する場合には、ピンホール１３が大き過ぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００２０】
つまり、図４の共焦点用光スキャナ１０を用いた共焦点顕微鏡では、ピンホールディスクの交換が困難であり、ピンホールディスクとしてピンホール直径が油浸１００倍対物レンズに対応させた５０μｍのものを用いるしかない。このピンホールディスク（ピンホール直径５０μｍ）を用いた場合、倍率の異なる対物レンズ１４に変更すると、この対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径がピンホール１３の直径５０μｍより小さくなるために、この対物レンズ１４の性能を生かした共焦点効果、特にセクショニング効果が得られないという問題が生ずる。このことは、水浸対物レンズのある倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズを基準にした場合の像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たすピンホール（ピンホール直径４０μｍ）１３を有するピンホールディスク２と仮に交換できたとしても、６０倍の対物レンズ以外の倍率の対物レンズに関しては上述と同様の問題が生ずる。
【００２１】
本発明の目的は、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かし、共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、請求項１に対応する発明は、光源と、前記光源から発した照射光を試料上に集光する対物レンズと、前記光源と前記対物レンズ間の像面に回転可能に配置され、前記照射光を通過する複数のピンホールを有するピンホール板と、前記対物レンズと前記光源との間に配置された光分岐光学系と、前記光分岐光学系で分岐した前記試料上の検査信号を検出する検出器とを備え、前記照射光を試料に対して走査する共焦点顕微鏡において、前記対物レンズの倍率を変更可能な対物レンズ倍率変更手段と、前記対物レンズと前記ピンホール板との間に配置され、前記試料から該ピンホール板への倍率を、前記対物レンズ倍率変更手段により変更される倍率に対応して変更可能な中間倍率変更手段とを具備した共焦点顕微鏡である。
【００２３】
請求項１に対応する発明によれば、中間倍率変更手段を設けたので、使用する対物レンズの倍率を変更しても、ピンホール板に投影される像の像側のＮＡが一定になるように補正される。これにより、使用する各対物レンズ毎に回折限界で決まる究極の共焦点効果、特にセクショニング効果の劣化を防止できる。
【００２４】
前記目的を達成するため、請求項２に対応する発明は、請求項１記載の共焦点顕微鏡において、光分岐光学系と検出器に至る光学系上に配置され、対物レンズ倍率変更手段により変更された対物レンズの倍率に対応して投影倍率を変更可能な結像系倍率変更手段をさらに追加した共焦点顕微鏡である。
【００２５】
請求項２に対応する発明によれば、対物レンズの呼称倍率で検出する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズの呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図１を参照して説明する。前述した従来の図５とは異なる点は、試料１５から対物レンズ１４以降、ピンホールディスク２に至る光学系に中間倍率変更手段例えば中間変倍光学系２０を設け、これにより試料１５からピンホールディスク２への投影倍率を変更可能に構成にしたこと、および、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８に至る結像光学系の投影倍率を変換可能に構成した結像系倍率変更手段例えば結像変倍光学系２１を設けたものである。
【００２７】
このような構成の共焦点顕微鏡は、以下のような動作を行う。複数のマイクロレンズ付開口を用いた集光ディスク１と、該集光ディスク１のマイクロレンズ付開口に対応した位置に複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、コリメートされたレーザ光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、中間変倍光学系２０、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像変倍光学系２１で結像させた投影像を撮像デバイス１８で撮像できるように構成したものである。
【００２８】
ここでの試料１５としては、例えば生物標本、特に生きた組織細胞であり、具体的には４０μｍ程度の厚さを持つ心筋である。生組織の表面約１０μｍは、組織切断時の損傷などにより死んでおり、組織切片内約２０μｍ程度の深さで共焦点効果によるセクショニングを行って、光学的な切片像を観察する。
【００２９】
通常の顕微鏡では、このように厚い切片の内部を観察することは不可能であり、高倍率観察・低倍率観察によらず、共焦点効果によるセクショニングが必要である。観察・測定の対象は、主として蛍光試薬の蛍光観察・測光による生細胞内のイオンの動的変化測定であり、ディスクスキャナによる高速走査性が有用である。
【００３０】
ここで、高倍率観察では、細胞内構造の微小構造、例えば細胞膜など、内のイオンの動的変化を測定し、低倍率観察では、細胞全体、および、隣接した複数の細胞の間でのイオンの動的変化を測定する。これによって、前者では、細胞内構造のもつ生態機能の解明が行われ、また後者では細胞間の連携による生態機能の解明が行われる。このため、対物レンズ１４の倍率変更に伴う実験が行えるように装置を構成することが不可欠である。
【００３１】
このディスクスキャナ１０は、従来の技術で説明した、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するものであり、マイクロレンズＮＡ＝０．０１２５、ピンホール開口直径＝φ５０μｍに設定したディスクスキャナ１０を用いる。
【００３２】
以上述べた共焦点顕微鏡では、例えば蛍光試薬を狙いの細胞に微小注入（マイクロインジェクション）する必要があるため、顕微鏡はステージとして例えば固定型を用いる。ステージの上で培養液に浸された生組織を、作動距離の長い水浸対物レンズで観察する。生組織の屈折率はほぼ水と等しいため、水浸対物レンズを用いることで、深部観察における収差の発生は排除されている。また、対物レンズは、無限遠補正されており、適当な結像レンズとの組合せで用いる必要がある。
【００３３】
ここで、使用可能な市販の水浸対物レンズの仕様を示すと下記の通りである。
倍率 ＮＡ 作動距離（mm）
１０ ０．３ ３．３
２０ ０．５ ３．３
４０ ０．８ ３．３
６０ ０．９ ２．０
従来の技術で説明した通り、各対物レンズの像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズのＮＡ／対物倍率
で求められ、各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側の回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側のＮＡ
で求められる。光の波長には、厳密には蛍光を励起するレーザ波長と蛍光波長とを用いる必要があるが、ここではレーザ波長４８８nmで代表することとする。
【００３４】
各対物レンズ毎の、像側のＮＡと像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）の計算結果は以下の通りである。
倍率 ＮＡ 像側のＮＡ 回折限界スポット直径（μｍ）
１０ ０．３ ０．０３ １９．８
２０ ０．５ ０．０２５ ２３．８
４０ ０．８ ０．０２ ２９．８
６０ ０．９ ０．０１５ ３９．７
従来の技術で説明した比較条件にあてはめて、ディスクスキャナ１０（ピンホール１３の直径５０μｍ）との適合性を評価すると、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４では、前述の（１−２）項と、（３−１）項が該当する。すなわち、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４のそれぞれの回折限界スポット直径に比較してピンホール１３の直径が大きすぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００３５】
ここで、対物レンズ１４とディスクスキャナ１０との間に中間倍率を作用させ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の５０μｍに揃えるよう、中間倍率を計算する。
【００３６】
中間変倍光学系２０の倍率を作用させる場合の、各対物レンズ１４の像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズ１４のＮＡ／対物倍率／中間倍率
で求められ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側ＮＡ
で求められる。
【００３７】
各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の直径５０μｍに揃えるように設定した場合の、中間倍率の計算結果は以下のようになる。
【００３８】
倍率 ＮＡ 中間倍率 像側のＮＡ 回折限界スポット直径（μｍ）
１０ ０．３ ２．４ ０．０１２５ ４７．６
２０ ０．５ ２．０ ０．０１２５ ４７．６
４０ ０．８ １．６ ０．０１２５ ４７．６
６０ ０．９ １．２ ０．０１２５ ４７．６
次に、中間倍率を導入した場合のセクショニング効果を計算により確認するが、始めにセクショニング効果の計算方法について説明する。円形開口の回折限界スポットの光軸上の分布はｓｉｎｃの二乗関数で表され、共焦点セクショニング効果は、回折限界スポットの光軸上輝度最大点からゼロ点（１次解）までのデフォーカス量Ｚの値で代表させる。
【００３９】
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量Ｚ＝２ｎ×λ／対物ＮＡ2
ここで、ｎ：媒質の屈折率（水：１．３３）
λ：波長（４８８nm）
対物ＮＡ：対物レンズの開口数
であり、これらによりデフォーカス量Ｚを計算することができる。
【００４０】
次に、ピンホールが大き過ぎる場合のデフォーカス量Ｚの値の計算方法を説明する。ピンホールに対して、マイクロレンズのＮＡが適合していると仮定し、ピンホール径に相当する像側のＮＡを求める。
【００４１】
像側のＮＡ＝１．２２×０．４８８／５０＝０．０１１９
と計算できる。これに、対物レンズ１４の倍率と中間倍率とを掛けたものを対物レンズの実効のＮＡとし、
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量（Ｚ）＝２ｎ×λ／（実効ＮＡ2 ）によって計算する。これをスキャナ１０に依存するセクショニング効果の代表値として用いることにする。
【００４２】
つまり、ピンホールサイズが大きい場合には、スキャナ１０に依存した実効ＮＡを用いて算出したＺ値を用い、ピンホールサイズが適当な場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚの値を用いることとする。これにより、ピンホールサイズが適当であれば、両者は一致することとなり、ピンホールサイズが大きければ、スキャナ１０に依存して実効ＮＡが小さくなり、Ｚの値が大きくなることになる。
【００４３】
なお、本実施形態における計算では該当しないが、もしピンホールディスク２に形成されているピンホール１３の方が小さい場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚ値よりもセクショニング効果が向上することは期待できないので、対物レンズ１４のＺ値を用いることとすればよい。
【００４４】
まず、中間変倍光学系２０の倍率を導入しない場合のデフォーカス量Ｚの計算結果をまとめると次のようになる。
中間倍率を導入しない場合（従来の技術の場合）
倍率 ＮＡ 中間倍率 総合倍率 Ｚ値（μｍ）
１０ ０．３ １ １０ ９１．７
２０ ０．５ １ ２０ ２２．９
４０ ０．８ １ ４０ ５．７
６０ ０．９ １ ６０ ２．５
次に、中間倍率を導入した場合のＺ値の計算結果は次のようになる。
【００４５】
倍率 ＮＡ 中間倍率 総合倍率 Ｚ値（μｍ）
１０ ０．３ ２．４ ２４ １４．４
２０ ０．５ ２．０ ４０ ５．２
４０ ０．８ １．６ ６４ ２．０
６０ ０．９ １．２ ７２ １．６
以上述べた計算の結果から明らかなように、試料１５からピンホールディスク２までの光学系に対物レンズ１４とは別の中間変倍光学系２０を設け、使用する対物レンズ１４の倍率に合わせて、像側のＮＡがピンホール１３のサイズと適合するように構成することで、Ｚ値を小さくすること、すなわち、共焦点効果であるセクショニング分解能を向上させることができる。
【００４６】
なお、図１の実施形態において、試料１５から撮像デバイス１８までの総合倍率は、対物レンズ１４の倍率とピンホールディスク２までの中間変倍光学系２０の倍率の積に、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の倍率を掛けたものである。従って、対物レンズ１４の呼称倍率で撮像する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００４７】
ただし、本発明の実施の形態の結像変倍光学系２１により結像光学系の倍率を変えることは、本発明の基本的な効果である共焦点セクショニングの効果の向上には寄与するものではなく、本発明の実施形態において必ずしも必要なものではない。また、観察像倍率の補正すなわち、結像変倍光学系２１の倍率の変更は必ずしも必要なものではなく、その代わりに画像処理により表示倍率の変換を行うことなど、代替案が考えられる。
【００４８】
ここで、図１における中間変倍光学系２０の具体的な例について、図２、図３を参照して説明する。図２は、中間変倍光学系２０としては、結像レンズ２２、２３を図示しないレボルバまたはスライダ等の変換機構に取り付けたものである。
【００４９】
この場合、対物レンズ１４は前述の使用可能な対物レンズのうち、４０倍、ＮＡが０．８の対物レンズである。対物レンズ１４は無限遠補正されており、所定の焦点距離ｆを有する結像レンズ２２によって、４０倍（中間倍率：１倍）の像を結ぶ。中間倍率は、焦点距離の異なる結像レンズ２２を用いることにより、ｆと結像レンズ２２の焦点距離との比が中間倍率となる。
【００５０】
図２（ａ）には、中間倍率１倍の結像レンズ２２を用いた場合、図２（ｂ）には前述した計算結果に応じた中間倍率１．６倍の結像レンズ２３（１．６ｆ）を用いた場合をそれぞれ示している。
【００５１】
このように、結像レンズ２２，２３を変換する場合には、予め使用する対物レンズ１４の組み合わせを決めておき、それに応じた結像レンズ２２，２３の組み合わせを変倍ターレットに設置する必要がある。もし、使用する対物レンズ１４の組み合わせを変更する場合には、ターレットに取り付けられた複数の対物レンズのうち所望の倍率の対物レンズを光軸上に選択挿入すれば良い。図２においては、中間変倍光学系２０の作用を理解しやすいように、結像レンズを薄肉レンズとして図示したため、結像レンズ２２と２３の位置が、光軸方向にシフトしているが、複数枚の構成によって適宜レンズを設計することで、光軸方向の位置を合わせることができ、ターレット機構による変換を無理なく行うことが可能である。
【００５２】
図２（ａ）では、中間倍率が１倍のため、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料側のＮＡが小さくなっている。このため、破線で示す２０倍の対物レンズ１４が本来持っている試料１５側のＮＡを使いきれていない。
【００５３】
一方、図２（ｂ）では、中間倍率１．６倍の結像レンズ２３により、対物レンズ１４への平行光束が太くなり、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料１５側のＮＡが大きくなる。ＮＡが小さい場合には、共焦点効果、特にセクショニング効果が劣化するが、前述のようにＮＡを大きくすることで改善される。
【００５４】
図３は、中間変倍光学系２０として結像レンズ２２とアフォーカルズーム光学系２４を使用した例であり、この構成によれば、レンズ２枚の位置関係を回転カム機構など適宜調整するように構成し、中間倍率を連続的に可変することができる。これにより、新たな対物レンズを使用する場合でも最適に調整することができる。
【００５５】
また、実験をしながら対物レンズ１４の倍率設定手段を動かし、最適条件を探すことも可能である。この構成においても、図２で説明した作用効果と同一の作用効果が得られる。具体的には、図３（ａ）は中間倍率すなわち結像レンズ２２を１倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが小さく、セクショニング効果が悪いが、図３（ｂ）は中間倍率すなわち結像レンズ２３を１．６倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが大きく、セクショニング効果が良い。
【００５６】
図１における結像変倍光学系２１についても、中間変倍光学系２０と同様に、ターレット切換による方法と、ズーム機構による連続変換が可能である。ここで、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の変倍を、中間変倍光学系２０の倍率と連動可能に構成することにより、中間倍率の変倍分を吸収し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した総合倍率を得ることができる。
【００５７】
なお、本発明の実施の形態では、ピンホール１３のサイズが大きすぎる場合のセクショニング効果の劣化に着目して、改善策として中間倍率として拡大倍率を作用させる場合についてのみ説明したが、ピンホールサイズが小さすぎて光量損失の大きい場合でも、中間倍率として縮小倍率を作用させることで、光量損失の少ない共焦点顕微鏡を実現することができる。つまり、本発明は中間倍率が拡大であっても、縮小であっても本発明の目的を達成することができる。
【００５８】
また、本発明の実施の形態では、油浸１００倍の対物レンズを基準に仕様設定したピンホール直径が５０μｍのピンホールを有するピンホールディスクを用いたが、ピンホールの直径は５０μｍに限定されるものではなく、基準となる乾燥または液浸対物レンズのある特定の倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たす４０μｍのピンホール直径を有するピンホールディスクを用い、他の倍率の対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ４０μｍとなるように中間倍率を設定することも可能である。すなわち、ピンホールディスクのピンホール直径に各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ満たされるように中間倍率を設定できるので、ピンホールディスクのピンホール直径の大きさに拘る必要がない。
【００５９】
【発明の効果】
以上述べた本発明によれば、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かした共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による共焦点顕微鏡の実施形態の概略構成を示す図。
【図２】図１の中間変倍光学系の第１の例を説明するための図。
【図３】図１の中間変倍光学系の第２の例を説明するための図。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の一例を説明するための図。
【図５】図４の問題点を説明するための図４の簡略図。
【図６】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＜マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【図７】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＞マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【符号の説明】
１…集光ディスク、
２…ピンホールディスク、
３…ドラム、
４…モータ、
７…ビームスプリッタ、
９…カメラ、
１０…共焦点用光スキャナ、
１１…レーザ光、
１２…マイクロレンズ、
１３…ピンホール、
１４…対物レンズ、
１５…試料、
１８…撮像デバイス、
２０…中間変倍光学系、
２１…結像変倍光学系、
２２，２３…結像レンズ、
２４…アフォーカルズーム光学系。
Claims (2)
- 光源と、前記光源から発した照射光を試料上に集光する対物レンズと、前記光源と前記対物レンズ間の像面に回転可能に配置され、前記照射光を通過する複数のピンホールを有するピンホール板と、前記対物レンズと前記光源との間に配置された光分岐光学系と、前記光分岐光学系で分岐した前記試料上の検査信号を検出する検出器とを備え、前記照射光を試料に対して走査する共焦点顕微鏡において、
前記対物レンズの倍率を変更可能な対物レンズ倍率変更手段と、
前記対物レンズと前記ピンホール板との間に配置され、前記試料から該ピンホール板への倍率を、前記対物レンズ倍率変更手段により変更される倍率に対応して変更可能な中間倍率変更手段と、
を具備した共焦点顕微鏡。 - 前記光分岐光学系と前記検出器に至る光学系上に配置され、前記対物レンズ倍率変更手段により変更された対物レンズの倍率に対応して投影倍率を変更可能な結像系倍率変更手段と、
をさらに具備した請求項１記載の共焦点顕微鏡。
Priority Applications (1)
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