JP3670260B2 - プローブ反応性チップ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNAマイクロアレイおよび該DNAマイクロアレイなどを用いた試料の解析手法に関する。特に、ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイの画像解析において、スキャナにより読みとられたDNAマイクロアレイ画像に対して、解析ツールが定義する検出エリアの位置決めおよび画像の補正を実行することによって、DNAマイクロアレイの画像解析の精度を向上させるとともに自動化するための技術に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子解析が実現されている。
【0003】
本明細書において、DNAマイクロアレイあるいはDNAチップとは、ガラス等からなるアレイ基板の上にDNAを、グリッド状にスポットしたものをいう。
【0004】
DNAマイクロアレイ上には、標識されたDNAサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、DNAがスポットされている。
【0005】
解析すべき未知のDNAサンプルに光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けて、かかるDNAマイクロアレイ上に流し込むと、DNAサンプルがグリッド上のDNAと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。サンプルが結びつかなかったDNAをすべて洗い流し、判定したいDNAサンプルを発光させ、これをスキャナーにより読みとると、二重鎖となったDNAの状況を画像として観察することができる。すなわち、DNAマイクロアレイ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかが解析される。このように、DNAマイクロアレイ上に既知のDNAセットを構成し、かかるDNAセットを換えることで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
【0006】
図1は、かかるDNAマイクロアレイ解析の一連の処理工程を示す。
【0007】
図1に示すように、ハイブリダイゼーション工程3において、DNAが搭載されたスポット領域1aを含むDNAマイクロアレイの試験片1上に、解析すべき未知のDNAサンプルが、発光用のマークを付けて滴下される。ここで、DNAサンプルがグリッド上のDNAと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。次に、洗浄工程5において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたDNAマイクロアレイ1が洗浄されると、結びつかなかったDNAがすべて洗い流される。この洗浄されたDNAマイクロアレイに対して、スキャニング工程7において、スキャナー装置内において、発光用のマーク(例えば、Cy3,Cy5など)を励起するのに適した所定の波長のレーザー光が照射され走査されることにより、スポットされた各DNA(遺伝子)の発光量が測定される。スキャンされたDNAマイクロアレイ1の画像は、DNAマイクロアレイ画像ファイル11に格納される。解析工程9において、DNAマイクロアレイ画像ファイル11が読み込まれ、DNAマイクロアレイの解析処理が実行される。具体的には、解析工程9においては、読み込まれた画像データに基づいて、各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。
【0008】
なお、DNAマイクロアレイ画像ファイル11を介さずに、スキャナーにより読み込まれたDNAマイクロアレイ画像が順次解析工程9に入力されてもよい。
【0009】
解析結果は、数値化データファイル13として記録され、必要に応じて表示装置15を介して表示出力されてもよく、印刷装置17を介して印刷出力されてもよい。
【0010】
図2は、DNAマイクロアレイ解析に用いられるDNAマイクロアレイ1の一例を示す。図2に示すように、DNAマイクロアレイ1は、その基板2のグリッド上に、cDNA(相補DNA)の個々の遺伝子(以下、「スポット」と称する。)が行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを形成してなる。なお、基板2上のスポット領域1aに配置されるスポットは、既にその塩基配列が解読されている互いに異なるDNAにそれぞれ対応するものであり、基板2上におけるその配置位置は、予め定められている。
【0011】
図3は、解析処理において、DNAマイクロアレイ画像ファイル11に対して適用されるテンプレートの一例を示す。図3に示すように、テンプレートは、例えばA〜Fなどの複数のフィールドに分割されており、各フィールド内においてはm行n列(図3では4×4)のマトリクス状に配置された検出エリア(DNAマイクロアレイの個々のスポットに対応する。)により形成されるブロックが、複数(図3ではp×24個)存在する。このブロックには、XY両方向において、それぞれ、例えばa〜p、1〜24のアドレス番号が付与されており、各ブロックの位置は、各フィールドにおいて例えば「a、1」として表すことができる。
【0012】
上記の解析工程9においては、読みとられたDNAマイクロアレイのスキャン画像中の個々のスポットが、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアに当てはめられる。かかる画像への検出エリアの当てはめによる位置決め動作を、アラインメントと称する。解析工程9において、解析ツールが、DNAマイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度を算出し、正確な解析を実行するためには、画像上の個々のスポットに対して、予め定義されている、DNAマイクロアレイの基板2上に配置された個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント(位置決め)処理が正確に実行される必要がある。(読み取られた画像を正しく解析するためには、このアラインメントにおいて、個々のスポットに対して対応する個々の検出エリアが当てはめられる必要がある。)このアラインメント(位置決め)処理において、位置ずれが検出された場合には、画像あるいは検出スポットの位置が、対応するテンプレートの検出エリアに正しく設定されるよう、補正されなければならない。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来における、ハイブリダイゼーション工程3を経たDNAマイクロアレイの解析手法には、以下の解決すべき問題点があった。
【0014】
すなわち、DNAマイクロアレイを構成する、ガラスからなる基板2の加工精度の低さ、カケ・割れなどの発生、スキャナーのオートローダーにDNAマイクロアレイを載置する際またはこれらをスキャナーに装着する際の位置ずれの発生、オートローダーやスキャナーなどの機械精度上生ずる誤差、さらには基板2に付着した微少なゴミなどが種々原因となって、解析すべきDNAマイクロアレイの画像ファイルには、不可避的に位置ずれが生じてしまう。
【0015】
しかし、ここで、DNAマイクロアレイを構成する基板2の外形寸法は、ガラスの加工精度、カケ・割れなどにより、その精度が低い。このため、基板2の外形自体をDNAマイクロアレイと解析ツールが提供するテンプレートとの位置決めに使用することは実用上できなかった。
【0016】
従って、オートローダーに多数のDNAマイクロアレイが載置され、連続的にスキャナーによってDNAマイクロアレイがスキャンされて画像データ11が自動的に蓄積されていくにもかかわらず、後続の解析工程9においては、画像のθずれ(回転ずれ)、x方向ずれ、y方向ずれにより生じる位置ずれを検出し、DNAマイクロアレイ画像ファイル11に検出エリアを位置決めし、あるいは、既存の解析装置によって実行される検出エリアの位置決めがミスしているか否かの判断が、人手を介して行われる必要があった。
【0017】
特に、画像の位置ずれが大きい場合には、既存の解析装置によっては、正しく位置決め処理を自動的に実行することができなかった。
【0018】
従って、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定が、人間の視認、判断に依存しており、自動的に処理することができずに全体におけるボトルネックを構成していた。
【0019】
ことに、解析すべき画像の枚数が多い場合には、これら検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定には、膨大な時間および労力を必要としていた。さらに、DNAマイクロアレイ上へのスポットの形成技術におけるインクジェット方式の採用に伴い、スポットの径が微細化するとともにスポット間の間隔がハイピッチ化してきたことで、視認によって正確な位置決め処理を行うことは、人手によっても殊更困難となっている。
【0020】
本発明は、上記の技術的課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、DNAマイクロアレイの解析において、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なDNAマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【0021】
また、本発明の他の目的は、検出エリアの位置決めの成否の判定を、定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なDNAマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【0022】
また、本発明の他の目的は、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化を図る点にある。
【0023】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、解析されるべきDNAマイクロアレイの基板上に、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準パターンを設け、このDNAマイクロアレイの基準パターンを利用して、正確な位置決め処理および位置ずれ補正処理を実行する。
【0024】
この基準パターンは、例えば、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせにより構成することができる。
【0025】
また、本発明においては、DNAマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理を解析処理において実行してもよい。
【0026】
本発明のある特徴によれば、基板と、前記基板表面に、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットが、マトリクス状に形成されたスポット領域と、前記基板表面に、前記スポット領域内または前記スポット領域近傍に配置され、前記試料の解析において、前記スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域とを具備することを特徴とするプローブ反応性チップが提供される。
【0027】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによりなる。
【0028】
本発明の他の特徴によれば、前記スポット領域は、前記基板表面において、複数のブロック化されたスポットサブ領域からなり、前記基準パターン領域は、前記スポットサブ領域内にそれぞれ配置される。
【0029】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【0030】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、核酸吸着物質である。
【0031】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか1つ以上である。
【0032】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットの周囲に複数の必ず発光しないスポットが配置されてなる。
【0033】
本発明の他の特徴によれば、上記プローブ反応性チップは、さらに、前記基板表面上の前記スポット領域外に配置された、前記スポット領域の位置ずれを補正するための基準マークを具備する。
【0034】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【0035】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、核酸吸着物質である。
【0036】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか1つ以上である。
【0037】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、複数の必ず発光するスポット、または必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットとの組み合わせ配列からなる。
【0038】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、チップの種別、製作ロット識別子を含む、チップ固有の情報を示す。
【0039】
本発明の他の特徴によれば、前記スポットサブ領域は、隣接する他のスポットサブ領域と、前記スポットサブ領域内に配置されるスポット領域内の各スポット間隔の少なくとも2倍以上の間隔をもって配置される。
【0040】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を定義する基準パターン情報記憶部と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む画像データ読み込み部と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する画像データ位置決め部と、前記画像データ位置決め部により位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する判定部と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正部と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する解析部とを具備することを特徴とする試料解析装置が提供される。
【0041】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【0042】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【0043】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【0044】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め部は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【0045】
本発明の他の特徴によれば、前記解析部は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定部は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【0046】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査部を具備し、前記走査部および前記解析部は、並列的に処理を実行する。
【0047】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め部は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第1の位置決め部と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第2の位置決め部とを具備する。
【0048】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第3の位置決め部を具備する。
【0049】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義するステップと、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込むステップと、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成するステップと、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定するステップと、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正するステップと、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力するステップとを含むことを特徴とする試料解析方法が提供される。
【0050】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【0051】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【0052】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【0053】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決めステップは、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【0054】
本発明の他の特徴によれば、前記解析ステップは、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定ステップは、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【0055】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査ステップを含み、前記走査ステップおよび前記解析ステップは、並列的に実行される。
【0056】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決めステップは、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第1の位置決めステップと、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第2の位置決めステップとを含む。
【0057】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第3の位置決めステップを含む。
【0058】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【0059】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【0060】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【0061】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【0062】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め処理は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【0063】
本発明の他の特徴によれば、前記解析処理は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定処理は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【0064】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査処理を含み、前記走査処理および前記解析処理は、並列的に実行される。
【0065】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め処理は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第1の位置決め処理と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第2の位置決め処理とを含む。
【0066】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第3の位置決め処理を含む。
【0067】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【0068】
【発明の実施の形態】
以下、図4乃至図33を参照して、本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイ(DNAチップ)、試料解析装置および試料解析方法を詳細に説明する。
【0069】
本実施形態においては、解析されるべきDNAマイクロアレイの基板上に、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準マークを設けるとともに、DNAマイクロアレイのスポット領域を構成するブロック内に、上記位置決め処理および位置ずれ補正処理に利用される基準パターンを配置し、このDNAマイクロアレイを利用して、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置ずれ補正処理が実行される。また、本実施形態においては、DNAマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理が解析処理において実行される。
【0070】
図4は、本発明の実施形態に係る試料解析システム全体の構成を示すブロック図である。
【0071】
図4に示すように、本発明の実施形態に係る試料解析システムは、スキャナー装置71と、制御用パーソナル・コンピュータ73と、解析用パーソナル・コンピュータ91とを具備する。
【0072】
スキャナー装置71は、DNAマイクロアレイ1を複数載置するオートローダー機構を備え、発光性のマーカーによりマーキングされたDNAサンプルを滴下したDNAマイクロアレイを、レーザー光により励起し、得られた画像を、DNAマイクロアレイ画像ファイル11に格納する。このDNAマイクロアレイ1は、例えば蛍光色素Cy3,Cy5に対応する励起波長でスキャンされ、1つのDNAマイクロアレイ1に対応してそれぞれの励起波長に対応した画像ファイルが得られる。この画像ファイルは、例えば、16ビットグレイスケールTiffフォーマット画像であるが、その他Multi−ImageTiffフォーマット画像、JPEGフォーマット画像などでもよい。
【0073】
制御用パーソナル・コンピュータ73は、例えば汎用パーソナルコンピュータなど、スキャナー装置71に例えばLANケーブルを介して接続可能なコンピュータであれば足り、スキャナー装置71におけるDNAマイクロアレイ1の走査、および画像取得の制御を行う。
【0074】
解析用パーソナル・コンピュータ91は、DNAマイクロアレイ画像ファイル11を読み込む。あるいはスキャナー装置71または制御用パーソナル・コンピュータ73から直接読み取られたDNAマイクロアレイ画像を入力する。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル群93を読み込んで、DNAマイクロアレイ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル13に出力する。この解析用パーソナル・コンピュータ91には、本実施形態に係る解析処理を実行するための解析ツールとなるプログラムが導入される。この解析プログラムは、本実施形態に係る解析処理を実行するプログラムであればよいが、例えば、MircoSoft Windows(登録商標)上で稼働するInterMedical社製の「GenePix Pro」(TM)などをその基礎または一部として利用することができる。
【0075】
この解析用パーソナル・コンピュータ91上で稼働する解析プログラムは、DNAマイクロアレイ画像ファイル11の解析を自動制御するものであって、その処理内容の詳細は後述するが、DNAマイクロアレイ画像ファイル11を読み込むとともに解析定義ファイル群93を読み込み、読み込まれたDNAマイクロアレイ画像上の基準マークが、解析定義ファイル群93に記憶されるテンプレート上の基準位置と一致するように、位置決め処理(基準マークを用いた位置決め処理)を実行する。さらに、解析プログラムは、画像データと検出エリアとによる、DNAマイクロアレイ上のスポット単位での位置決め処理(スポット単位の位置決め処理)および、基準パターンを用いた、DNAマイクロアレイ上の複数のスポット領域を構成するブロック単位での画像データの位置決め処理(ブロック単位の位置決め処理)をそれぞれ実行する。位置決めミスがある場合には、解析プログラムは、画像ファイルの位置ずれを検出エリアに合わせて自動補正する。
【0076】
予め設定した時間内に処理すべき画像ファイルが数値化できない場合は、解析プログラムは、所定回数解析処理を再試行し、再試行が所定回数を越えた場合には手動での数値化を通知すべく、当該画像についての数値化ミスを示す情報をログファイルに出力する。最後に、解析プログラムは、数値化された画像データの情報を数値化データファイル13に出力する。
【0077】
なお、この解析用パーソナル・コンピュータ91は、一対のスキャナー装置71および制御用パーソナル・コンピュータ73に対して、複数設置され、これら複数の装置が、大量の画像ファイルを、並列に解析処理してもよい。また、一対のスキャナー装置71および制御用パーソナル・コンピュータ73がなくても、DNAマイクロアレイ画像ファイル11が、他の手段により読み込み可能であればよい。
【0078】
解析定義ファイル群93は、具体的には、解析パラメータファイル931と解析自動化情報定義ファイル933とを具備する。
【0079】
解析パラメータファイル931は、次の情報を含む。
【0080】
・DNAマイクロアレイ上のブロックおよびスポットの配列定義(行・列方向のブロック数、行・列方向のスポット数、スポットの直径など)
・DNAマイクロアレイ上のブロック、スポットの位置情報の定義
・各スポットに対する遺伝子名等の遺伝子識別情報の定義
・各スポットに対する属性の定義(例えば、「存在しないスポット」であること、「良いスポット」であること、または「悪いスポット」であることなど。なお、「見つからないスポット」など、位置決め処理時に変化する属性もある)
解析自動化情報定義ファイル933は、次の情報を含む。
【0081】
・画像ファイル生成方法の指定(スキャナー装置によるスキャンに連動/非連動)
・解析対象画像ファイル名定義と数値化データ保存先の指定
・上記基準マークを用いた位置決めで用いられる基準マークの定義(基準マークの個数、最低蛍光強度、座標、認識エリア、許容位置ずれ量等)
・位置決め(アラインメント)判定用の基準パターンの定義(基準パターンの個数、最低蛍光強度、座標、許容位置ずれ量等)
・画像ファイルが存在しない場合の再試行回数(または最大待ち時間)の定義
・位置決めミス時のリトライ方法の定義(再試行回数または最大待ち時間、検出エリアの移動順および移動量等)
図35は、本実施形態に係る試料解析装置の機能構成を示すブロック図である。図35に示すように、本実施形態に係る試料解析装置は、上記解析プログラムを導入した解析用コンピュータ91であって、解析画像記憶部351と、定義ファイル記憶部353と、基準マークを用いた位置決め処理部355と、スポット単位の位置決め処理部357と、ブロック単位の位置決め処理部359と、位置決め判定部361と、解析制御部363と、解析結果出力部365と、ログファイル367と、解析結果ファイル369と、解析ミス画像ファイル371とを具備する。解析画像記憶部351は、図4におけるDNAマイクロアレイ画像ファイル11を記憶する。
【0082】
定義ファイル記憶部353は、図4における定義ファイル群(以下の図6における解析パラメータファイル931および解析自動化情報ファイル933)を記憶する。この定義ファイル記憶部353は、請求項における基準パターン情報記憶部に対応する。基準マークを用いた位置決め処理部355は、請求項における画像データ読み込み部を含む。基準マークを用いた位置決め処理部355と、スポット単位の位置決め処理部357と、ブロック単位の位置決め処理部359とは、請求項における画像データ位置決め部および補正部に対応する。位置決め判定部361は、請求項における判定部に対応する。解析制御部363および解析結果出力部365は、請求項における解析部に対応する。
【0083】
なお、解析画像記憶部351,定義ファイル記憶部353,基準マークを用いた位置決め処理部355,スポット単位の位置決め処理部357,ブロック単位の位置決め処理部359,解析制御部363,位置決め判定部361,解析結果処理部365は、いずれも、図4における解析用パーソナル・コンピュータ91に実装される。この解析用パーソナル・コンピュータ91は、1台であってもよく、あるいは複数台をネットワークで接続して、解析コンピュータ・システムとして構成されてもよい。
【0084】
図5は、解析用パーソナル・コンピュータ91が出力する数値化データの一部の一例を示す。図5に示すように、数値化データは、例えば、Cy3励起波長およびCy5励起波長それぞれで検出されたスポットの蛍光強度のデータとして得られる。より具体的には、数値化データ13は、各スポットについて、次の情報を含む。
【0085】
・検出スポットに対するフラグ
・ブロック番号
・ブロック内の行・列番号
・遺伝子名を含む遺伝子識別情報
・検出スポットの中心座標(x、y)
・Cy3励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Cy3励起波長での検出スポット周囲(背景)の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Cy5励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Cy5励起波長での検出スポット周囲(背景)の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・品質に関する各種データ等
次に、本実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を説明する。
【0086】
図6は、本発明の実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を示すフローチャートである。
【0087】
まず、解析プログラムの初期化が実行され、処理が開始される(ステップS1)。次に、解析パラメータファイル931および解析自動化情報ファイル933が読み込まれる(ステップS3)。この解析自動化情報ファイル933の読み込みにより、解析画像定義ファイル名、解析パラメータファイル名、画像待ち再試行回数、画像待ち時間等が読み込まれる。解析画像定義ファイル名より、解析すべき画像と、枚数が、解析プログラム上設定される。
【0088】
この解析すべき画像の枚数が、読み込まれた画像の総枚数(すなわち終了条件End)に到達するまで、ステップS5からステップS35までの処理が繰り返し実行される(ステップS5)。
【0089】
次に、解析すべき画像があるか否かが判定され(ステップS7)、解析すべき画像がない場合には(ステップS7N)、画像待ち再試行回数が、ステップS3において読み込まれ、解析プログラムに設定された回数を超えるまで、ステップS11からステップS15の処理を繰り返し実行する(ステップS11)。さらに、解析すべき画像が有るか否かが判定され(ステップS13)、解析すべき画像が有る場合には(ステップS13Y)、ステップS9に進み、一方解析すべき画像が得られない場合には(ステップS13N)、画像待ち再試行回数のカウンタをインクリメントして(ステップS15)、設定された回数を超えた場合は、ステップS35に進む。
【0090】
ステップS7に戻り、解析すべき画像がある場合には(ステップS7Y)、解析すべきDNAマイクロアレイとして対応する画像ファイルが、DNAマイクロアレイ画像ファイル11から読み込まれる(ステップS9)。あるいは、解析すべき画像ファイルは、DNAマイクロアレイ画像ファイル11は介さずに、スキャナー装置71および制御パーソナル・コンピュータ73側から直接入力されてもよい。続いて、基準マークによる位置決め処理(上記基準マークを用いた位置決め処理)が実行される(ステップS17)。ステップS17における基準マークを用いた位置決め処理の実行後、画像データの画像処理が実行され(ステップS19)、画像処理が失敗判定された場合には(ステップS19N)、ステップS35に進む。一方、画像処理が成功判定された場合には、画像処理後の解析すべき画像ファイルが読み込まれる(ステップS21)。
【0091】
次に、DNAマイクロアレイ上の各スポット単位での位置決め処理(上記スポット単位の位置決め処理)が実行され(ステップS23)、さらにDNAマイクロアレイ上のブロック単位での位置決め処理(上記ブロック単位の位置決め処理)が実行される(ステップS25)。なお、ステップS23およびステップS25は、ステップS21の解析画像読み込み処理の後であって、ステップS27の位置決め判定の前であれば、いずれが先に実行されてもよい。
【0092】
基準マークを用いた位置決め処理およびスポット単位の位置決め処理後に数値化された画像データに基づいて、位置決め(アラインメント)が成功したか失敗したかが判定される(ステップS27)。位置決めが成功と判定されれば(ステップS27Y)、数値化された画像データが、数値化データファイル13に出力され、解析すべき画像枚数のカウンタがインクリメントされる(ステップS35)。一方、位置決めが失敗したと判定されれば(ステップS27N)、さらに、所定の検出エリアの移動回数(または移動時間)以下であるか否かが判定され(ステップS31)、所定の検出エリア移動回数に到達した場合には(ステップS31N)、ステップS35に進む。一方、所定の検出エリア移動回数以下である場合には(ステップS31Y)、DNAマイクロアレイのブロック単位での検出エリアの移動処理(補正処理)が実行され(ステップS33)、ステップS23のスポット単位での位置決め処理に戻る。
【0093】
より具体的には、ステップS33における検出エリアの移動(補正)処理においては、基準マークによる概略の位置決めが正しいという仮定の下、少ない移動量から例えば時計回りに徐々に大きな移動量となるよう、一対のスポットと検出エリアとの位置決めが試行されていく。
【0094】
最後に、すべての解析すべき画像の解析終了後、解析ミスが生じた画像について、ステップS7からステップS35までの処理を、さらに所定回数繰り返して実行してもよい(ステップS37)。
【0095】
次に、本実施形態における各位置決め処理の詳細を説明する。本実施形態の位置決め処理においては、
(1)まず、DNAマイクロアレイ上に、発光する基準マークを配置する。また、同じくDNAマイクロアレイ上、基板2表面のブロック内(あるいはブロック近傍)に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置する。このDNAマイクロアレイの解析自動化情報として、少なくとも基準マークと各ブロックの位置関係を示す情報、および基準パターンの配列パターンおよび各ブロックとの位置関係を示す情報は、予め登録されているものであって既知とする。
【0096】
(2)画像上の基準マークを認識検出後、予めテンプレートの解析自動化情報として定義された基準マークの位置座標を用いて、基準マークが本来ある位置(設計位置)に画像を補正(回転・移動)することにより、予めテンプレート上各々のスポットを定義した検出エリアに概略当てはめる(基準マークを用いた位置決め処理)。その後、各スポットへのテンプレート上の各検出エリアの当てはめを実行する(スポット単位の位置決め処理)。
【0097】
(3)スキャンされた画像上で、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの配列パターン(基準パターン)を、予めテンプレートに定義された基準パターンについてのパターン情報および位置情報を用いたパターンマッチングにより検出し、その位置の特定を行い、ブロック単位で位置決めを実行する(ブロック単位の位置決め処理)。
【0098】
図7は、本実施形態に係る基準マークを用いた、図6のステップS17における基準マークを用いた位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【0099】
図7に示すように、本実施形態に係る基準マークを用いた解析処理部355は、DNAマイクロアレイ画像ファイル11を読み込み(ステップS171)、予め解析自動化情報ファイル933から読み込んだ基準パターン認識エリアを含むテンプレートを自動認識するとともに、テンプレート上の基準パターン認識エリア内の基準パターン定義位置に、読み込まれた画像ファイルの基準パターンが一致するように、画像ファイルを解析(数値)処理し(ステップ173)、基準マークを位置決めする。
【0100】
図8は、ステップS171において読み込まれた画像ファイルの一例を示す。
【0101】
図8に示すように、スポットが配置されたスポット領域の周辺に、本実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理に用いられる基準マークが、予め基板上配置されている。
【0102】
この基準マークは、DNAマイクロアレイをスキャナー装置71によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質などの蛍光性物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【0103】
なお、本明細書において、自家蛍光物質とは、それ自体の物性として、元々蛍光を有する物質である。この自家蛍光物質は、DNAマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。核酸吸着物質とは、それ自体の物性として蛍光は有さないが、DNAマイクロアレイに滴下するサンプル中の、蛍光標識された核酸を吸着する物質であればよいが、例えばポリアリルアミンを用いることができる。この核酸吸着物質は、蛍光標識された核酸を吸着しているため、DNAマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。ハウスキーピング・ジーンとは、元々生体内で常に一定以上の発現量を持つ遺伝子であり、それ自体の物性として蛍光は有さない。このハウスキーピング・ジーンをDNAマイクロアレイにスポットしておけば、サンプル液中の蛍光標識した核酸と必ずハイブリダイゼーションを起こすので、DNAマイクロアレイをスキャンしたときに、やはり蛍光シグナルを発する。これら自家蛍光物質、核酸吸着物質、ハウスキーピング・ジーンはいずれも、DNAマイクロアレイにスポットされた場合、スキャンされた際に必ず発光する特性を有するスポットとなり、本明細書においては、これらをポジティブコントロールと称する。他方、スキャンされた際に、必ず発光しない特性を有するスポットは、本明細書において、ネガティブ・コントロールと称する。
【0104】
図9は、スキャナー装置71によって読み込まれた図8の画像に対して、基準マーク認識エリアを含むテンプレートが自動認識された状態を示す。図9において、テンプレートの基準マーク認識エリア10a中の基準マークの定義位置10bと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク10cとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図10に示すように、画像ファイル中の基準マーク10cとテンプレート上の基準マーク定義位置10bとが一致するよう位置補正する。なお、図10中、テンプレートの基準マーク認識エリア10aおよび基準パターンの定義位置10bは、便宜上図示したものであって、実画像として可視的に表示されるものである必要はない。
【0105】
この基準マークを用いた位置決め処理によって、DNAマイクロアレイ全体(すなわち、アレイ上のスポット領域全体)がテンプレート全体に対して概略位置決めされる。
【0106】
図7に戻り、図9に示す、テンプレートの基準マーク認識エリア10a中の基準マークの定義位置10bと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク10cとの位置ずれによるシフト量が計算され(ステップS175)、計算されたシフト量に基づき、図10に示すように、画像が回転・移動される(ステップS177)。最後に、補正された画像ファイルが、補正後の画像ファイルを格納する画像ファイル11bに格納される。なお、この格納先は、ステップ171において画像ファイルの読み込み元である画像ファイル11であってもよい。
【0107】
次に、本実施形態におけるスポット単位の位置決め処理(図6におけるステップS23)の詳細を説明する。
【0108】
図11は、本実施形態に係る、DNAマイクロアレイ上のスポット単位で実行される、図6のステップS23におけるスポット単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【0109】
図11に示すように、本実施形態に係るスポット単位の位置決め処理部357は、ステップS21において読み込まれた位置補正処理(画像処理)後の画像ファイル11b中の、各DNAマイクロアレイにおける各スポット画像に対して、予め解析自動化情報ファイル933から読み込んだテンプレートの、各スポットに対応する検出エリアへの位置決めを実行する(ステップS231)。
【0110】
図13は、図6のステップS21において読み込まれた位置補正後のDNAマイクロアレイ画像に対して、テンプレートの各検出エリアが当てはめられた状態を示す。図13において、テンプレートの各検出エリア13bと、読み込まれた画像ファイル中の各スポットとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図14に示すように、画像ファイル中の各スポット画像とテンプレート上の各検出エリアとが適合するよう、スポット単位の位置決め処理部357が位置補正する。
【0111】
図11に戻り、図14に示す位置補正後の画像ファイルが、テンプレートの定義情報に基づいて数値化され(ステップS233)、数値化されたファイルが、数値化データファイル13に格納される(ステップS235)。
【0112】
次に、本実施形態におけるブロック単位の位置決め処理(図6におけるステップS25)の詳細を説明する。ブロック単位の位置決め処理部359によるブロック単位の位置決め処理においては、基準パターンの有するパターン配列を用いたパターンマッチングによる位置決め処理および基準パターンの位置座標を用いた位置決め処理の双方が用いられる。あるいは、これらの一方のみが実行されてもよい。
【0113】
図15は、図6におけるステップ23におけるスポット単位での位置決め処理によって、誤って位置決めされたDNAマイクロアレイ画像ファイルの一例を示す。図15に示すように、スポット単位の位置決め処理においては、スポット単位での位置決めは、DNAマイクロアレイ上のブロックごとに、ブロック内のスポットに対してテンプレート上の検出エリアのブロックが適合するかを試行されることによって実行される。このため、例えばDNAマイクロアレイの基板上にゴミが付着している場合などに、各スポットが適合されるべき検出エリアが誤って判断されてしまい、ブロックの位置決めの誤りが生ずることになる。DNAマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、微細なゴミの付着による上記位置決め誤りは避けがたい。
【0114】
そこで、本実施形態においては、DNAマイクロアレイ上のブロック内に、ブロック単位の位置決めを調整するための基準パターンを予め配置し、このスポット単位の位置決め処理によって生ずる位置決め誤りを調整する。
【0115】
図12は、本実施形態において用いられるDNAマイクロアレイの一例を示す。図12に示すように、DNAマイクロアレイ1上には、複数のブロック群1bが配置される。各ブロック内には、遺伝子がスポットされているが、本実施形態においては、各ブロック内に、必ず発光するスポットであるポジティブ・コントロールおよび必ず発光しない(光ってはおかしい)スポットであるネガティブ・コントロールとを配置する。これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールは、通常、ハイブリダイゼーション工程が異常なく処理されたか否かを判断するための標識(マーカー)として使用される。本実施形態では、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせでなる基準パターンを形成する。この基準パターンを、プローブである遺伝子を固定するスポットをマトリクス状に形成した各ブロック内に配置することによって、ブロック単位の位置決め処理におけるブロック単位の位置決めの基準パターンとする。このブロックは、請求項におけるスポットサブ領域に対応する。
【0116】
なお、このポジティブ・コントロールは、上記基準マークと同様、DNAマイクロアレイをスキャナー装置71によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【0117】
具体的には、図12の1cで示されるように、各ブロック内にポジティブ・コントロールを配置し、その周囲に、1dで示されるように、ネガティブ・コントロールを配置する。この基準パターンは、ブロック内の一角に設けられてもよく、あるいはブロック内の任意の位置に設けられてもよい。または、必要に応じて、スポット領域を構成するブロック外であってその近傍に設けられてもよい。このブロック内に配置されたポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターン配列およびその位置座標の情報は、予めテンプレートに関する属性情報の1つとして、解析自動化情報ファイル933に登録されている。ブロック単位の位置決め処理においては、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの蛍光強度および位置座標の判定を実行することによって、各ブロック内のスポットの位置を特定することができる。
【0118】
ブロック内のある基準パターンの下に、さらに、ネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる他のパターンを配置してもよく、あるいは、ブロック内のあるパターンに対し、ブロックの対角線上にネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールの他のパターンを配置してもよい。1つのブロック内にこのような他のパターンをさらに配置して基準パターンを複数にすることによって、DNAマイクロアレイに付着するゴミなどに起因する誤判定を低減することができる。
【0119】
一方、1つのDNAマイクロアレイによってより多くの遺伝子を解析するという観点からは、このネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる基準パターンが占有する領域は少ないことが望ましい。
【0120】
図18乃至図23は、本実施形態におけるこのネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールのパターンの配置例を示す。なお、図18乃至図23において、ブロック内のポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロール以外は、すべて他の遺伝子がスポットされているものとする。また、ブロック単位の位置決め処理における位置決め(アラインメント)成功の判定基準は、ポジティブ・コントロールの蛍光強度が設定された最低蛍光強度以上であって、ポジティブ・コントロール座標が予めテンプレートの属性として設定された閾値以下とする。
【0121】
図18においては、ブロック1bを跨って1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり9個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が1個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【0122】
図19においては、ブロック1bを跨って、離隔した2つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり15個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が2個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【0123】
図20においては、ブロック1bを跨って、1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されているとともに、ブロック内の対角位置に、1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり16個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が2個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。図20に示すパターンは、図18のパターンと比較して、ブロックのθずれの検出が強化されている。
【0124】
図21乃至図23は、ブロック1b間のピッチが、スポット間隔のピッチより2倍以上離れて配置されている(すなわち、ブロック1b間にスポット一個分1eに相当する間隔がある)。
【0125】
図21においては、ブロック1bは、隣接するブロック1bと、最低スポット1個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち1つの角に配置された1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり4個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が1個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【0126】
図22においては、ブロック1bは、隣接するブロック1bと、最低スポット1個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち1つの角に配置された1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されているとともに、その対角に配置された1つのポジティブ・コントロール1cの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり8個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、2個のポジティブコントロールと同じ配置で計2個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【0127】
図23においては、ブロック1bは、隣接するブロック1bと、最低スポット1個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち1つの角に配置された1つのポジティブ・コントロール1cおよびこれと離隔した他の1つのポジティブ・コントロールの周囲にネガティブ・コントロール1dが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は1ブロックあたり8個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、2個のポジティブコントロールと同じ配置で計2個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【0128】
図21乃至図23から理解されるように、ブロック1bの間隔を、ブロック内のスポット間隔の2倍以上のピッチとすると、ポジティブ・コントロールの周囲を、ブロックを跨いでネガティブ・コントロールで囲む必要がなくなる。このため、より少ないポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数でブロックの位置の特定が可能となる。
【0129】
上記図18乃至図23においては、いずれも、ポジティブ・コントロールの周囲をネガティブ・コントロールが取り囲む配置であるが、本実施形態においてこの配置を用いるのは、次の理由による。すなわち、例えば図16に示すように、ネガティブ・コントロールが配置されておらず、ポジティブ・コントロールが1個のみ配置されているブロック、ポジティブ・コントロールが2個並んで配置されているブロック、およびポジティブ・コントロールが対角に2個配置されているブロックとの配置を想定する。図17は、この図16の配置に対して、解析プログラムによるテンプレート上の検出エリアのブロック単位の位置決め処理が実行された後の状態を示す。このブロック単位の位置決め処理後の合否判定においては、
(1)まず、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の蛍光強度の判定においては、閾値以上の蛍光強度を持つDNAが存在するため、合格となる。
【0130】
(2)次に、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の位置の判定においては、位置座標の許容ずれ量以上であるので、不合格となる。
【0131】
しかしながら、DNAマイクロアレイ上のスポットの間隔が微細化しているため、スポットの配置精度、スキャナー装置71の読み取り精度、ハイブリダイゼーション後のスポット形状等からスポットの間隔と、位置座標の許容ずれ量とが近似してきている。このため、実際には、不合格となるように位置座標の許容ずれ量の設定をすると、本来は合格が判定されるべき位置決め(アラインメント)であっても不合格となってしまい、正確な位置決め合否判定が成立しない。
【0132】
一方、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで取り囲む本実施形態に係る配置パターンを用いれば、位置座標の許容ずれ量を、スポットの間隔の2倍以上に設定できる。このため、有意かつ正確な位置決め合否判定を実現することができる。なお、(1)および(2)の判定を用いず、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターンマッチングによる判定のみでも、位置決め後のパターンとテンプレート上のパターンとが同じパターン配列を持たない限り、位置決め合格が判定されないので、有効である。
【0133】
また、例えば、スポットの位置精度、機械精度などにより許容ずれ量が3倍ピッチ分しか設定できない場合には、図34に示すように、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで二重に取り囲む構成が好ましい。画像への検出エリアの当てはめでたまたま同じ蛍光強度の配列を持つDNAのスポット配列があって、誤認識された場合、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの合格が判定されたとしても、位置座標の判定によって、位置決め不合格であることを正しく判定することができる。
【0134】
なお、本実施形態における上記解析処理と、上記のDNAマイクロアレイとは、必ずしも併用されることを要するものではなく、上記のDNAマイクロアレイは、本実施形態に係る解析プログラム以外の解析プログラムに用いられてもよい。
【0135】
図24は、本実施形態に係る、DNAマイクロアレイ上のポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールとの配列パターンによって、ブロック単位で実行される、図6のステップS25におけるブロック単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【0136】
図24に示すように、本実施形態に係るブロック単位の位置決め処理部359は、ステップS21において読み込まれた位置補正処理(画像処理)後の画像ファイル11bを読み込む(ステップS251)。次に、予めテンプレート上に定義された、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの基準パターンと、画像ファイルとのパターンマッチングが実行される(ステップS253)。あるいは、このステップS253において、パターンマッチングとともに、あるいはパターンマッチングに換えて、位置座標の判定が用いられてもよい。
【0137】
このパターンマッチングの結果、算出されたシフト量に基づいて、検出エリアへのブロック画像の当てはめが試行され、ブロック画像が位置決めされる(ステップS255)。このブロック単位の位置決めに基づき、画像ファイルが数値化され(ステップS257)、数値化されたデータが、数値化データファイル13に格納される(ステップS259)。
【0138】
次に、本実施形態における位置決め判定部361が行う位置決め成否の判定処理の詳細を説明する。
【0139】
すなわち、上記基準マークを用いた位置決め処理、スポット単位の位置決め処理およびブロック単位の位置決め処理の完了後、それぞれのスポットの数値化(解析)を実行し、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度、位置座標の判定が実行され、これによって、位置決めが正しく実行されたか否かが判定される。
【0140】
図25は、このそれぞれのスポットが数値化された後のデータの一例を示す。
【0141】
図25において、Pnは注目するスポット(例えばポジティブ・コントロール)を示す。InはPnの蛍光強度を示す。(xn,yn)はPnの画像上の実座標を示す。(Xn,Yn)はPnの設計上の座標を示す。nは1〜Zの自然数である。
【0142】
(1)ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度を用いた判定方法
次の条件がすべて満たされたとき、個数と蛍光強度の判定は合格であるとする。
【0143】
・個数の判定を行うポジティブ・コントロールをPnとするとき、その個数はZである。
【0144】
・個数の判定を行うネガティブ・コントロールをPnとしたとき、その個数はZである。
【0145】
・判定を行うポジティブ・コントロールをPnとして数値化データより抽出したとき、n=1〜Zに対し、最低ポジティブ・コントロール蛍光強度≦Inを満たす。
【0146】
・判定を行うネガティブ・コントロールをPnとして数値化データより抽出した場合、n=1〜Zに対し、In≦最大ネガティブ・コントロール蛍光強度を満たす。
【0147】
(2)位置座標の判定方法
次の判定方法の双方または一方が用いられて判定される。
【0148】
・絶対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをPnとして、n=1〜Zに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【0149】
(|Xn−xn|≦x方向許容ずれ量)かつ、(|Yn−yn|≦y方向許容ずれ量)
・相対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをPnとして、P1を基準とする。n=1〜Zに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【0150】
(|xn−x1|≦|Xn−X1|+x方向許容ずれ量)かつ、(|yn−y1|≦|Yn−Y1|+y方向許容ずれ量)
解析結果出力部365は、上記の位置決め判定処理(図6のステップS27)の結果、位置決めの成功が判定された数値化データを、数値化データファイル13に保存する。一方、所定の再試行回数の位置決めによっても成功判定が得られなかった画像については(図6のステップS35)、解析結果出力部365は、成功判定が得られなかった旨を示す情報をログファイル367に出力するとともに、成功判定が得られなかった画像をミス画像として解析ミス画像ファイル371に出力する。この解析ミス画像は、人間の視認による位置決め処理に供される。解析制御部363は、必要に応じて、基準マークを用いた位置決め処理部355,スポット単位の位置決め処理部357,ブロック単位の位置決め処理部359,位置決め判定部361,解析結果出力部365を呼び出して実行することにより、図6における一連の解析処理全体を実行する。
【0151】
次に、図26乃至図32を参照して、本実施形態に係る解析処理における画面表示の一例を説明する。
【0152】
図26は、DNAマイクロアレイ画像ファイル11から入力される、スキャン画像の画像認識処理が実行中である画面表示の一例を示す。サブウインドウ263に示されているように、スキャン画像中のスポット領域外部、左右に配置された基準マークの位置座標が表示され、この基準マークの位置座標に基づき、スキャン画像の認識処理(画像処理)において、回転移動(θ方向補正)が実行中である旨のメッセージが表示されている。なお、手動による回転角算出ボタン265,手動回転処理ボタン267が提供されている。
【0153】
図27は、DNAマイクロアレイ画像ファイル11から読み込まれたスキャン画像のイメージ表示の一例を示す。DNAマイクロアレイのブロック内に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールを含む、それぞれの蛍光強度のスポットが配置されている。
【0154】
図28は、図27の表示された画像イメージに対して、解析パラメータファイル931に登録されたテンプレートの検出エリアが呼び出された状態の一例を示す。DNAマイクロアレイ画像イメージ内の各スポット画像と、テンプレート上の各検出エリアとが位置ずれしている。
【0155】
図29は、本実施形態によらない場合の、図28の画像に対する位置決め後の状態の一例を示す。θ方向ずれ量や、x方向ずれ、y方向ずれ量が大きい場合、正しい位置決めが行われず、検出エリアの位置決めが誤っている様子が示されている。本実施形態によらなければ、この図29の状態から、人手で視認によって1つずつ検出エリアをずらしながら画像に当てはめる修正操作を繰り返し行う必要がある。
【0156】
図30は、本実施形態におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによりなる基準パターンを用いない場合の、位置決め後の状態の一例を示す。DNAマイクロアレイ上のスポット間のピッチの微細化に伴い、スポットのピッチに対してスポットの位置精度が近づいているために、単に検出エリアの位置座標データによる判定では各スポットに各検出エリアが正しく当てはめられているか否かの判断が困難になる。本実施形態によらない場合、この図30の状態から、各ブロック画像を拡大表示して、全体のバランスを人間が判断して検出エリアが正しく当てはめられているか否かを確認していた。
【0157】
図31は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン311を配置した場合に、なお位置決め誤りを起こした状態の一例を示す。例えば、DNAマイクロアレイ上に大きなブロックを配置しなければならない場合は、θ方向ずれの影響が生じやすく、ブロック上、一角のみに基準パターンを配置しただけでは、基準パターン判定およびその位置座標による判定(ブロック単位の位置決め)において、位置決め誤りであるにもかかわらず、位置決め成功と判定されてしまう。この場合、例えば対角の313の位置にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置すれば、正確な位置決め判定を行うことができる。
【0158】
図32は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン311を配置した場合に、位置決め判定が成功した状態の一例を示す。ブロック上の一角にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンが配置されている。
【0159】
図33は、本発明の実施形態に係る試料解析装置および試料解析システムのハードウエア構成を示すブロック図である。
【0160】
本発明の実施形態に係る試料解析装置は、例えば、図33に示される構成を有する。すなわち、本発明の実施形態に係る試料解析装置は1つまたは複数のコンピュータシステム内に試料解析処理の各要素を内蔵することにより構成される。
【0161】
図33に示すように、コンピュータシステム100は、マイクロプロセッサのような中央演算処理装置110およびシステムバス112を介して相互に接続される他の多くのユニットからなる。このコンピュータシステムは、ランダムアクセスメモリ114と、リードオンリーメモリ116と、ハードディスク装置120などのような周辺装置をシステムバス112に接続するI/Oアダプタ118と、キーボード124,マウス126,スピーカ128、マイク132あるいはタッチスクリーン(図示せず)等のユーザーインターフェース装置をシステムバス112に接続するユーザーインターフェースアダプタ122と、通信ネットワークへこのコンピュータシステムを接続する通信アダプタ134と、表示装置138をシステムバス112に接続するディスプレーアダプタ136と、フレキシブルディスク144,光ディスク146および各種メモリカード148をそれぞれ駆動する外部ディスクドライバー142とを具備する。
【0162】
これらフレキシブルディスク144,光ディスク146および各種メモリカード148などに代表されるコンピュータ読み取り可能な各種の記憶媒体に、本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための解析プログラムを格納し、外部ディスクドライバーを介してこれらの記憶媒体からの所定の読み出し操作を行うことにより、これらの記憶媒体に格納された本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための試料解析プログラムをコンピュータシステム内にインストールすることができる。これらのプログラムをランダムアクセスメモリ114にロードし、中央演算処理装置110で実行することにより、本実施形態に係る試料解析処理が実現される。なお、上記試料解析プログラムは、1つのコンピュータ上で実行されてもよく、複数のネットワーク接続されたコンピュータ上で実行されてもよい。複数のコンピュータ上で実行される場合には、それぞれのコンピュータ上で稼働するモジュールが、これを記憶する記憶媒体によりそれぞれのコンピュータにロードされる。
【0163】
本実施形態によれば、以下の効果が得られる。すなわち、DNAマイクロアレイの解析において、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。特に、DNAマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、人手による位置決め処理は困難となっていることから、本実施形態により、試料解析の一連の処理におけるボトルネックが大きく解消される。
【0164】
さらに、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化が図られる。
【0165】
なお、本実施形態においては、DNAマイクロアレイにDNAがスポットされた実施形態として説明したが、これに限定されない。本実施形態に係るDNAマイクロアレイは、例えば、RNA、蛋白質など、特異的に結合する生体分子にも適用可能であり、DNAに限定されるものではない。
【0166】
なお、本発明はここでは記載していない様々実施の形態等を包含するということは十分に理解すべきである。したがって、本発明はこの開示から妥当な特許請求の範囲に係わる発明特定事項によってのみ限定されるものでなければならない。
【0167】
【発明の効果】
本発明によれば、DNAマイクロアレイの解析において、DNAマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図1】DNAマイクロアレイを用いた試料解析の一連の工程を示す概略図である。
【図2】DNAマイクロアレイの一例を示す斜視図である。
【図3】試料解析工程において用いられるテンプレートの検出エリアの配置の一例を示す図である。
【図4】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示すブロック図である。
【図5】本発明の実施形態に係る試料解析装置により数値化された画像データの一例を示す図である。
【図6】本発明の実施形態に係る試料解析方法の概略処理手順を示すフローチャートである。
【図7】図6におけるステップS17の基準マークを用いた位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図8】本発明の実施形態に係る試料解析装置により読み込まれたDNAマイクロアレイの画像イメージの一例を示す図である。
【図9】図8の画像イメージに、定義ファイル記憶部353に記憶されたテンプレートがオーバーラップした状態を示す図である。
【図10】図9の画像が、本発明の実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理部355によって位置決めされた後の状態を示す図である。
【図11】図6におけるステップS23のスポット単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図12】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイ上のスポットの配置の一例を示す図である。
【図13】図6におけるステップS21で、スポット単位の位置決め処理部357によって読み込まれた画像の一例を示す図である。
【図14】図6におけるステップS23のスポット単位の位置決め処理後の、図13の画像の一例を示す図である。
【図15】図6におけるステップS23のスポット単位の位置決め処理後の、図13の画像の他の一例を示す図である。
【図16】本発明の実施形態に係る、ポジティブ・コントロールを配置したスポット領域を有するDNAマイクロアレイのブロックの一例を示す図である。
【図17】図16のブロックが、誤って位置決めされた状態の一例を示す図である。
【図18】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の一例を示す図である。
【図19】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図20】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図21】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図22】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図23】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図24】図6におけるステップS25のブロック単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図25】本発明の実施形態における位置決め判定処理を説明する図である。
【図26】本発明の実施形態に係る解析制御部363が提供する、画像処理画面イメージの一例を示す図である。
【図27】本発明の実施形態に係る解析制御部363が提供する、DNAマイクロアレイのスキャン画像の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図28】図27のスキャン画像に対して、テンプレートの検出エリアが呼び出された状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図29】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図30】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図31】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図32】本発明の実施形態に係る解析制御部363が提供する、位置決め判定処理が成功した場合の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図33】本発明の実施形態に係る制御用パーソナル・コンピュータ73および解析用パーソナル・コンピュータ91のハードウエア構成の一例を示す図である。
【図34】本発明の実施形態に係るDNAマイクロアレイ上の基準パターンの配置の他の例を示す図である。
【図35】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示す図である。
【符号の説明】
1 DNAマイクロアレイ
1a スポット領域
1b ブロック
1c ポジティブ・コントロール
1d ネガティブ・コントロール
11 DNAマイクロアレイ画像ファイル
13 数値化データファイル
71 スキャナー装置
73 制御用パーソナル・コンピュータ
91 解析用パーソナル・コンピュータ
93 定義ファイル
351 解析画像記憶部
353 定義ファイル記憶部
355 基準マークを用いた位置決め部
357 スポット単位の位置決め部
359 ブロック単位の位置決め部
361 位置決め判定部
363 解析制御部
365 解析結果出力部
367 ログファイル
369 解析結果ファイル
371 解析ミス画像
Claims (13)
- 基板と、
前記基板表面に、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットがマトリクス状に形成されたスポット領域を複数にブロック化してなるスポットサブ領域と、
前記スポットサブ領域内にそれぞれ配置され、前記試料の解析において、前記スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域とを具備する
ことを特徴とするプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによりなる
ことを特徴とする請求項1に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である
ことを特徴とする請求項2に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、核酸吸着物質である
ことを特徴とする請求項2に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか1つ以上である
ことを特徴とする請求項2に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットの周囲に複数の必ず発光しないスポットが配置されてなる
ことを特徴とする請求項2に記載のプローブ反応性チップ。 - 上記プローブ反応性チップは、さらに、
前記基板表面上の前記スポット領域外に配置された、前記スポット領域の位置ずれを補正するための基準マークを具備する
ことを特徴とする請求項1に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である
ことを特徴とする請求項7に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、核酸吸着物質である
ことを特徴とする請求項7に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか1つ以上である
ことを特徴とする請求項7記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、複数の必ず発光するスポット、または必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットとの組み合わせ配列からなる
ことを特徴とする請求項7に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、チップの種別、製作ロット識別子を含む、チップ固有の情報を示す
ことを特徴とする請求項7に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記スポットサブ領域は、隣接する他のスポットサブ領域と、前記スポットサブ領域内に配置されるスポット領域内の各スポット間隔の少なくとも2倍以上の間隔をもって配置される
ことを特徴とする請求項1に記載のプローブ反応性チップ。
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