JP3670260B2 - プローブ反応性チップ - Google Patents
プローブ反応性チップ Download PDFInfo
- Publication number
- JP3670260B2 JP3670260B2 JP2002259338A JP2002259338A JP3670260B2 JP 3670260 B2 JP3670260 B2 JP 3670260B2 JP 2002259338 A JP2002259338 A JP 2002259338A JP 2002259338 A JP2002259338 A JP 2002259338A JP 3670260 B2 JP3670260 B2 JP 3670260B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- spot
- positioning
- analysis
- image
- dna microarray
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
- B01J2219/00527—Sheets
- B01J2219/00529—DNA chips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00277—Apparatus
- B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
- B01J2219/00572—Chemical means
- B01J2219/00576—Chemical means fluorophore
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00677—Ex-situ synthesis followed by deposition on the substrate
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00686—Automatic
- B01J2219/00689—Automatic using computers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00693—Means for quality control
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00695—Synthesis control routines, e.g. using computer programs
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
- B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00722—Nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
- G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
- G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
- G01N35/04—Details of the conveyor system
- G01N2035/0474—Details of actuating means for conveyors or pipettes
- G01N2035/0491—Position sensing, encoding; closed-loop control
- G01N2035/0494—Detecting or compensating piositioning errors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイおよび該ＤＮＡマイクロアレイなどを用いた試料の解析手法に関する。特に、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイの画像解析において、スキャナにより読みとられたＤＮＡマイクロアレイ画像に対して、解析ツールが定義する検出エリアの位置決めおよび画像の補正を実行することによって、ＤＮＡマイクロアレイの画像解析の精度を向上させるとともに自動化するための技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子解析が実現されている。
【０００３】
本明細書において、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップとは、ガラス等からなるアレイ基板の上にＤＮＡを、グリッド状にスポットしたものをいう。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイ上には、標識されたＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、ＤＮＡがスポットされている。
【０００５】
解析すべき未知のＤＮＡサンプルに光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けて、かかるＤＮＡマイクロアレイ上に流し込むと、ＤＮＡサンプルがグリッド上のＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。サンプルが結びつかなかったＤＮＡをすべて洗い流し、判定したいＤＮＡサンプルを発光させ、これをスキャナーにより読みとると、二重鎖となったＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかが解析される。このように、ＤＮＡマイクロアレイ上に既知のＤＮＡセットを構成し、かかるＤＮＡセットを換えることで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
【０００６】
図１は、かかるＤＮＡマイクロアレイ解析の一連の処理工程を示す。
【０００７】
図１に示すように、ハイブリダイゼーション工程３において、ＤＮＡが搭載されたスポット領域１ａを含むＤＮＡマイクロアレイの試験片１上に、解析すべき未知のＤＮＡサンプルが、発光用のマークを付けて滴下される。ここで、ＤＮＡサンプルがグリッド上のＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。次に、洗浄工程５において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたＤＮＡマイクロアレイ１が洗浄されると、結びつかなかったＤＮＡがすべて洗い流される。この洗浄されたＤＮＡマイクロアレイに対して、スキャニング工程７において、スキャナー装置内において、発光用のマーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を励起するのに適した所定の波長のレーザー光が照射され走査されることにより、スポットされた各ＤＮＡ（遺伝子）の発光量が測定される。スキャンされたＤＮＡマイクロアレイ１の画像は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に格納される。解析工程９において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１が読み込まれ、ＤＮＡマイクロアレイの解析処理が実行される。具体的には、解析工程９においては、読み込まれた画像データに基づいて、各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。
【０００８】
なお、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を介さずに、スキャナーにより読み込まれたＤＮＡマイクロアレイ画像が順次解析工程９に入力されてもよい。
【０００９】
解析結果は、数値化データファイル１３として記録され、必要に応じて表示装置１５を介して表示出力されてもよく、印刷装置１７を介して印刷出力されてもよい。
【００１０】
図２は、ＤＮＡマイクロアレイ解析に用いられるＤＮＡマイクロアレイ１の一例を示す。図２に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ１は、その基板２のグリッド上に、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）の個々の遺伝子（以下、「スポット」と称する。）が行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを形成してなる。なお、基板２上のスポット領域１ａに配置されるスポットは、既にその塩基配列が解読されている互いに異なるＤＮＡにそれぞれ対応するものであり、基板２上におけるその配置位置は、予め定められている。
【００１１】
図３は、解析処理において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に対して適用されるテンプレートの一例を示す。図３に示すように、テンプレートは、例えばＡ〜Ｆなどの複数のフィールドに分割されており、各フィールド内においてはｍ行ｎ列（図３では４×４）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡマイクロアレイの個々のスポットに対応する。）により形成されるブロックが、複数（図３ではｐ×２４個）存在する。このブロックには、ＸＹ両方向において、それぞれ、例えばａ〜ｐ、１〜２４のアドレス番号が付与されており、各ブロックの位置は、各フィールドにおいて例えば「ａ、１」として表すことができる。
【００１２】
上記の解析工程９においては、読みとられたＤＮＡマイクロアレイのスキャン画像中の個々のスポットが、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアに当てはめられる。かかる画像への検出エリアの当てはめによる位置決め動作を、アラインメントと称する。解析工程９において、解析ツールが、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度を算出し、正確な解析を実行するためには、画像上の個々のスポットに対して、予め定義されている、ＤＮＡマイクロアレイの基板２上に配置された個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント（位置決め）処理が正確に実行される必要がある。（読み取られた画像を正しく解析するためには、このアラインメントにおいて、個々のスポットに対して対応する個々の検出エリアが当てはめられる必要がある。）このアラインメント（位置決め）処理において、位置ずれが検出された場合には、画像あるいは検出スポットの位置が、対応するテンプレートの検出エリアに正しく設定されるよう、補正されなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来における、ハイブリダイゼーション工程３を経たＤＮＡマイクロアレイの解析手法には、以下の解決すべき問題点があった。
【００１４】
すなわち、ＤＮＡマイクロアレイを構成する、ガラスからなる基板２の加工精度の低さ、カケ・割れなどの発生、スキャナーのオートローダーにＤＮＡマイクロアレイを載置する際またはこれらをスキャナーに装着する際の位置ずれの発生、オートローダーやスキャナーなどの機械精度上生ずる誤差、さらには基板２に付着した微少なゴミなどが種々原因となって、解析すべきＤＮＡマイクロアレイの画像ファイルには、不可避的に位置ずれが生じてしまう。
【００１５】
しかし、ここで、ＤＮＡマイクロアレイを構成する基板２の外形寸法は、ガラスの加工精度、カケ・割れなどにより、その精度が低い。このため、基板２の外形自体をＤＮＡマイクロアレイと解析ツールが提供するテンプレートとの位置決めに使用することは実用上できなかった。
【００１６】
従って、オートローダーに多数のＤＮＡマイクロアレイが載置され、連続的にスキャナーによってＤＮＡマイクロアレイがスキャンされて画像データ１１が自動的に蓄積されていくにもかかわらず、後続の解析工程９においては、画像のθずれ（回転ずれ）、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれにより生じる位置ずれを検出し、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に検出エリアを位置決めし、あるいは、既存の解析装置によって実行される検出エリアの位置決めがミスしているか否かの判断が、人手を介して行われる必要があった。
【００１７】
特に、画像の位置ずれが大きい場合には、既存の解析装置によっては、正しく位置決め処理を自動的に実行することができなかった。
【００１８】
従って、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定が、人間の視認、判断に依存しており、自動的に処理することができずに全体におけるボトルネックを構成していた。
【００１９】
ことに、解析すべき画像の枚数が多い場合には、これら検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定には、膨大な時間および労力を必要としていた。さらに、ＤＮＡマイクロアレイ上へのスポットの形成技術におけるインクジェット方式の採用に伴い、スポットの径が微細化するとともにスポット間の間隔がハイピッチ化してきたことで、視認によって正確な位置決め処理を行うことは、人手によっても殊更困難となっている。
【００２０】
本発明は、上記の技術的課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なＤＮＡマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【００２１】
また、本発明の他の目的は、検出エリアの位置決めの成否の判定を、定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なＤＮＡマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【００２２】
また、本発明の他の目的は、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化を図る点にある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、解析されるべきＤＮＡマイクロアレイの基板上に、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準パターンを設け、このＤＮＡマイクロアレイの基準パターンを利用して、正確な位置決め処理および位置ずれ補正処理を実行する。
【００２４】
この基準パターンは、例えば、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせにより構成することができる。
【００２５】
また、本発明においては、ＤＮＡマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理を解析処理において実行してもよい。
【００２６】
本発明のある特徴によれば、基板と、前記基板表面に、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットが、マトリクス状に形成されたスポット領域と、前記基板表面に、前記スポット領域内または前記スポット領域近傍に配置され、前記試料の解析において、前記スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域とを具備することを特徴とするプローブ反応性チップが提供される。
【００２７】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによりなる。
【００２８】
本発明の他の特徴によれば、前記スポット領域は、前記基板表面において、複数のブロック化されたスポットサブ領域からなり、前記基準パターン領域は、前記スポットサブ領域内にそれぞれ配置される。
【００２９】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【００３０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、核酸吸着物質である。
【００３１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である。
【００３２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットの周囲に複数の必ず発光しないスポットが配置されてなる。
【００３３】
本発明の他の特徴によれば、上記プローブ反応性チップは、さらに、前記基板表面上の前記スポット領域外に配置された、前記スポット領域の位置ずれを補正するための基準マークを具備する。
【００３４】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【００３５】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、核酸吸着物質である。
【００３６】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である。
【００３７】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、複数の必ず発光するスポット、または必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットとの組み合わせ配列からなる。
【００３８】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、チップの種別、製作ロット識別子を含む、チップ固有の情報を示す。
【００３９】
本発明の他の特徴によれば、前記スポットサブ領域は、隣接する他のスポットサブ領域と、前記スポットサブ領域内に配置されるスポット領域内の各スポット間隔の少なくとも２倍以上の間隔をもって配置される。
【００４０】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を定義する基準パターン情報記憶部と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む画像データ読み込み部と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する画像データ位置決め部と、前記画像データ位置決め部により位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する判定部と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正部と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する解析部とを具備することを特徴とする試料解析装置が提供される。
【００４１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００４２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００４３】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００４４】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め部は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００４５】
本発明の他の特徴によれば、前記解析部は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定部は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００４６】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査部を具備し、前記走査部および前記解析部は、並列的に処理を実行する。
【００４７】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め部は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決め部と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決め部とを具備する。
【００４８】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決め部を具備する。
【００４９】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義するステップと、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込むステップと、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成するステップと、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定するステップと、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正するステップと、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力するステップとを含むことを特徴とする試料解析方法が提供される。
【００５０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００５１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００５２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００５３】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決めステップは、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００５４】
本発明の他の特徴によれば、前記解析ステップは、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定ステップは、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００５５】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査ステップを含み、前記走査ステップおよび前記解析ステップは、並列的に実行される。
【００５６】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決めステップは、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決めステップと、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決めステップとを含む。
【００５７】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決めステップを含む。
【００５８】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【００５９】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００６０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００６１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００６２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め処理は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００６３】
本発明の他の特徴によれば、前記解析処理は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定処理は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００６４】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査処理を含み、前記走査処理および前記解析処理は、並列的に実行される。
【００６５】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め処理は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決め処理と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決め処理とを含む。
【００６６】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決め処理を含む。
【００６７】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【００６８】
【発明の実施の形態】
以下、図４乃至図３３を参照して、本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、試料解析装置および試料解析方法を詳細に説明する。
【００６９】
本実施形態においては、解析されるべきＤＮＡマイクロアレイの基板上に、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準マークを設けるとともに、ＤＮＡマイクロアレイのスポット領域を構成するブロック内に、上記位置決め処理および位置ずれ補正処理に利用される基準パターンを配置し、このＤＮＡマイクロアレイを利用して、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置ずれ補正処理が実行される。また、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理が解析処理において実行される。
【００７０】
図４は、本発明の実施形態に係る試料解析システム全体の構成を示すブロック図である。
【００７１】
図４に示すように、本発明の実施形態に係る試料解析システムは、スキャナー装置７１と、制御用パーソナル・コンピュータ７３と、解析用パーソナル・コンピュータ９１とを具備する。
【００７２】
スキャナー装置７１は、ＤＮＡマイクロアレイ１を複数載置するオートローダー機構を備え、発光性のマーカーによりマーキングされたＤＮＡサンプルを滴下したＤＮＡマイクロアレイを、レーザー光により励起し、得られた画像を、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に格納する。このＤＮＡマイクロアレイ１は、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長でスキャンされ、１つのＤＮＡマイクロアレイ１に対応してそれぞれの励起波長に対応した画像ファイルが得られる。この画像ファイルは、例えば、１６ビットグレイスケールＴｉｆｆフォーマット画像であるが、その他Ｍｕｌｔｉ−ＩｍａｇｅＴｉｆｆフォーマット画像、ＪＰＥＧフォーマット画像などでもよい。
【００７３】
制御用パーソナル・コンピュータ７３は、例えば汎用パーソナルコンピュータなど、スキャナー装置７１に例えばＬＡＮケーブルを介して接続可能なコンピュータであれば足り、スキャナー装置７１におけるＤＮＡマイクロアレイ１の走査、および画像取得の制御を行う。
【００７４】
解析用パーソナル・コンピュータ９１は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込む。あるいはスキャナー装置７１または制御用パーソナル・コンピュータ７３から直接読み取られたＤＮＡマイクロアレイ画像を入力する。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル群９３を読み込んで、ＤＮＡマイクロアレイ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル１３に出力する。この解析用パーソナル・コンピュータ９１には、本実施形態に係る解析処理を実行するための解析ツールとなるプログラムが導入される。この解析プログラムは、本実施形態に係る解析処理を実行するプログラムであればよいが、例えば、ＭｉｒｃｏＳｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）上で稼働するＩｎｔｅｒＭｅｄｉｃａｌ社製の「ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ」（ＴＭ）などをその基礎または一部として利用することができる。
【００７５】
この解析用パーソナル・コンピュータ９１上で稼働する解析プログラムは、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１の解析を自動制御するものであって、その処理内容の詳細は後述するが、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込むとともに解析定義ファイル群９３を読み込み、読み込まれたＤＮＡマイクロアレイ画像上の基準マークが、解析定義ファイル群９３に記憶されるテンプレート上の基準位置と一致するように、位置決め処理（基準マークを用いた位置決め処理）を実行する。さらに、解析プログラムは、画像データと検出エリアとによる、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット単位での位置決め処理（スポット単位の位置決め処理）および、基準パターンを用いた、ＤＮＡマイクロアレイ上の複数のスポット領域を構成するブロック単位での画像データの位置決め処理（ブロック単位の位置決め処理）をそれぞれ実行する。位置決めミスがある場合には、解析プログラムは、画像ファイルの位置ずれを検出エリアに合わせて自動補正する。
【００７６】
予め設定した時間内に処理すべき画像ファイルが数値化できない場合は、解析プログラムは、所定回数解析処理を再試行し、再試行が所定回数を越えた場合には手動での数値化を通知すべく、当該画像についての数値化ミスを示す情報をログファイルに出力する。最後に、解析プログラムは、数値化された画像データの情報を数値化データファイル１３に出力する。
【００７７】
なお、この解析用パーソナル・コンピュータ９１は、一対のスキャナー装置７１および制御用パーソナル・コンピュータ７３に対して、複数設置され、これら複数の装置が、大量の画像ファイルを、並列に解析処理してもよい。また、一対のスキャナー装置７１および制御用パーソナル・コンピュータ７３がなくても、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１が、他の手段により読み込み可能であればよい。
【００７８】
解析定義ファイル群９３は、具体的には、解析パラメータファイル９３１と解析自動化情報定義ファイル９３３とを具備する。
【００７９】
解析パラメータファイル９３１は、次の情報を含む。
【００８０】
・ＤＮＡマイクロアレイ上のブロックおよびスポットの配列定義（行・列方向のブロック数、行・列方向のスポット数、スポットの直径など）
・ＤＮＡマイクロアレイ上のブロック、スポットの位置情報の定義
・各スポットに対する遺伝子名等の遺伝子識別情報の定義
・各スポットに対する属性の定義（例えば、「存在しないスポット」であること、「良いスポット」であること、または「悪いスポット」であることなど。なお、「見つからないスポット」など、位置決め処理時に変化する属性もある）
解析自動化情報定義ファイル９３３は、次の情報を含む。
【００８１】
・画像ファイル生成方法の指定（スキャナー装置によるスキャンに連動／非連動）
・解析対象画像ファイル名定義と数値化データ保存先の指定
・上記基準マークを用いた位置決めで用いられる基準マークの定義（基準マークの個数、最低蛍光強度、座標、認識エリア、許容位置ずれ量等）
・位置決め（アラインメント）判定用の基準パターンの定義（基準パターンの個数、最低蛍光強度、座標、許容位置ずれ量等）
・画像ファイルが存在しない場合の再試行回数（または最大待ち時間）の定義
・位置決めミス時のリトライ方法の定義（再試行回数または最大待ち時間、検出エリアの移動順および移動量等）
図３５は、本実施形態に係る試料解析装置の機能構成を示すブロック図である。図３５に示すように、本実施形態に係る試料解析装置は、上記解析プログラムを導入した解析用コンピュータ９１であって、解析画像記憶部３５１と、定義ファイル記憶部３５３と、基準マークを用いた位置決め処理部３５５と、スポット単位の位置決め処理部３５７と、ブロック単位の位置決め処理部３５９と、位置決め判定部３６１と、解析制御部３６３と、解析結果出力部３６５と、ログファイル３６７と、解析結果ファイル３６９と、解析ミス画像ファイル３７１とを具備する。解析画像記憶部３５１は、図４におけるＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を記憶する。
【００８２】
定義ファイル記憶部３５３は、図４における定義ファイル群（以下の図６における解析パラメータファイル９３１および解析自動化情報ファイル９３３）を記憶する。この定義ファイル記憶部３５３は、請求項における基準パターン情報記憶部に対応する。基準マークを用いた位置決め処理部３５５は、請求項における画像データ読み込み部を含む。基準マークを用いた位置決め処理部３５５と、スポット単位の位置決め処理部３５７と、ブロック単位の位置決め処理部３５９とは、請求項における画像データ位置決め部および補正部に対応する。位置決め判定部３６１は、請求項における判定部に対応する。解析制御部３６３および解析結果出力部３６５は、請求項における解析部に対応する。
【００８３】
なお、解析画像記憶部３５１，定義ファイル記憶部３５３，基準マークを用いた位置決め処理部３５５，スポット単位の位置決め処理部３５７，ブロック単位の位置決め処理部３５９，解析制御部３６３，位置決め判定部３６１，解析結果処理部３６５は、いずれも、図４における解析用パーソナル・コンピュータ９１に実装される。この解析用パーソナル・コンピュータ９１は、１台であってもよく、あるいは複数台をネットワークで接続して、解析コンピュータ・システムとして構成されてもよい。
【００８４】
図５は、解析用パーソナル・コンピュータ９１が出力する数値化データの一部の一例を示す。図５に示すように、数値化データは、例えば、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長それぞれで検出されたスポットの蛍光強度のデータとして得られる。より具体的には、数値化データ１３は、各スポットについて、次の情報を含む。
【００８５】
・検出スポットに対するフラグ
・ブロック番号
・ブロック内の行・列番号
・遺伝子名を含む遺伝子識別情報
・検出スポットの中心座標（ｘ、ｙ）
・Ｃｙ３励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ３励起波長での検出スポット周囲（背景）の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ５励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ５励起波長での検出スポット周囲（背景）の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・品質に関する各種データ等
次に、本実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を説明する。
【００８６】
図６は、本発明の実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を示すフローチャートである。
【００８７】
まず、解析プログラムの初期化が実行され、処理が開始される（ステップＳ１）。次に、解析パラメータファイル９３１および解析自動化情報ファイル９３３が読み込まれる（ステップＳ３）。この解析自動化情報ファイル９３３の読み込みにより、解析画像定義ファイル名、解析パラメータファイル名、画像待ち再試行回数、画像待ち時間等が読み込まれる。解析画像定義ファイル名より、解析すべき画像と、枚数が、解析プログラム上設定される。
【００８８】
この解析すべき画像の枚数が、読み込まれた画像の総枚数（すなわち終了条件Ｅｎｄ）に到達するまで、ステップＳ５からステップＳ３５までの処理が繰り返し実行される（ステップＳ５）。
【００８９】
次に、解析すべき画像があるか否かが判定され（ステップＳ７）、解析すべき画像がない場合には（ステップＳ７Ｎ）、画像待ち再試行回数が、ステップＳ３において読み込まれ、解析プログラムに設定された回数を超えるまで、ステップＳ１１からステップＳ１５の処理を繰り返し実行する（ステップＳ１１）。さらに、解析すべき画像が有るか否かが判定され（ステップＳ１３）、解析すべき画像が有る場合には（ステップＳ１３Ｙ）、ステップＳ９に進み、一方解析すべき画像が得られない場合には（ステップＳ１３Ｎ）、画像待ち再試行回数のカウンタをインクリメントして（ステップＳ１５）、設定された回数を超えた場合は、ステップＳ３５に進む。
【００９０】
ステップＳ７に戻り、解析すべき画像がある場合には（ステップＳ７Ｙ）、解析すべきＤＮＡマイクロアレイとして対応する画像ファイルが、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から読み込まれる（ステップＳ９）。あるいは、解析すべき画像ファイルは、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１は介さずに、スキャナー装置７１および制御パーソナル・コンピュータ７３側から直接入力されてもよい。続いて、基準マークによる位置決め処理（上記基準マークを用いた位置決め処理）が実行される（ステップＳ１７）。ステップＳ１７における基準マークを用いた位置決め処理の実行後、画像データの画像処理が実行され（ステップＳ１９）、画像処理が失敗判定された場合には（ステップＳ１９Ｎ）、ステップＳ３５に進む。一方、画像処理が成功判定された場合には、画像処理後の解析すべき画像ファイルが読み込まれる（ステップＳ２１）。
【００９１】
次に、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポット単位での位置決め処理（上記スポット単位の位置決め処理）が実行され（ステップＳ２３）、さらにＤＮＡマイクロアレイ上のブロック単位での位置決め処理（上記ブロック単位の位置決め処理）が実行される（ステップＳ２５）。なお、ステップＳ２３およびステップＳ２５は、ステップＳ２１の解析画像読み込み処理の後であって、ステップＳ２７の位置決め判定の前であれば、いずれが先に実行されてもよい。
【００９２】
基準マークを用いた位置決め処理およびスポット単位の位置決め処理後に数値化された画像データに基づいて、位置決め（アラインメント）が成功したか失敗したかが判定される（ステップＳ２７）。位置決めが成功と判定されれば（ステップＳ２７Ｙ）、数値化された画像データが、数値化データファイル１３に出力され、解析すべき画像枚数のカウンタがインクリメントされる（ステップＳ３５）。一方、位置決めが失敗したと判定されれば（ステップＳ２７Ｎ）、さらに、所定の検出エリアの移動回数（または移動時間）以下であるか否かが判定され（ステップＳ３１）、所定の検出エリア移動回数に到達した場合には（ステップＳ３１Ｎ）、ステップＳ３５に進む。一方、所定の検出エリア移動回数以下である場合には（ステップＳ３１Ｙ）、ＤＮＡマイクロアレイのブロック単位での検出エリアの移動処理（補正処理）が実行され（ステップＳ３３）、ステップＳ２３のスポット単位での位置決め処理に戻る。
【００９３】
より具体的には、ステップＳ３３における検出エリアの移動（補正）処理においては、基準マークによる概略の位置決めが正しいという仮定の下、少ない移動量から例えば時計回りに徐々に大きな移動量となるよう、一対のスポットと検出エリアとの位置決めが試行されていく。
【００９４】
最後に、すべての解析すべき画像の解析終了後、解析ミスが生じた画像について、ステップＳ７からステップＳ３５までの処理を、さらに所定回数繰り返して実行してもよい（ステップＳ３７）。
【００９５】
次に、本実施形態における各位置決め処理の詳細を説明する。本実施形態の位置決め処理においては、
（１）まず、ＤＮＡマイクロアレイ上に、発光する基準マークを配置する。また、同じくＤＮＡマイクロアレイ上、基板２表面のブロック内（あるいはブロック近傍）に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置する。このＤＮＡマイクロアレイの解析自動化情報として、少なくとも基準マークと各ブロックの位置関係を示す情報、および基準パターンの配列パターンおよび各ブロックとの位置関係を示す情報は、予め登録されているものであって既知とする。
【００９６】
（２）画像上の基準マークを認識検出後、予めテンプレートの解析自動化情報として定義された基準マークの位置座標を用いて、基準マークが本来ある位置（設計位置）に画像を補正（回転・移動）することにより、予めテンプレート上各々のスポットを定義した検出エリアに概略当てはめる（基準マークを用いた位置決め処理）。その後、各スポットへのテンプレート上の各検出エリアの当てはめを実行する（スポット単位の位置決め処理）。
【００９７】
（３）スキャンされた画像上で、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの配列パターン（基準パターン）を、予めテンプレートに定義された基準パターンについてのパターン情報および位置情報を用いたパターンマッチングにより検出し、その位置の特定を行い、ブロック単位で位置決めを実行する（ブロック単位の位置決め処理）。
【００９８】
図７は、本実施形態に係る基準マークを用いた、図６のステップＳ１７における基準マークを用いた位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【００９９】
図７に示すように、本実施形態に係る基準マークを用いた解析処理部３５５は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込み（ステップＳ１７１）、予め解析自動化情報ファイル９３３から読み込んだ基準パターン認識エリアを含むテンプレートを自動認識するとともに、テンプレート上の基準パターン認識エリア内の基準パターン定義位置に、読み込まれた画像ファイルの基準パターンが一致するように、画像ファイルを解析（数値）処理し（ステップ１７３）、基準マークを位置決めする。
【０１００】
図８は、ステップＳ１７１において読み込まれた画像ファイルの一例を示す。
【０１０１】
図８に示すように、スポットが配置されたスポット領域の周辺に、本実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理に用いられる基準マークが、予め基板上配置されている。
【０１０２】
この基準マークは、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナー装置７１によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質などの蛍光性物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【０１０３】
なお、本明細書において、自家蛍光物質とは、それ自体の物性として、元々蛍光を有する物質である。この自家蛍光物質は、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。核酸吸着物質とは、それ自体の物性として蛍光は有さないが、ＤＮＡマイクロアレイに滴下するサンプル中の、蛍光標識された核酸を吸着する物質であればよいが、例えばポリアリルアミンを用いることができる。この核酸吸着物質は、蛍光標識された核酸を吸着しているため、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。ハウスキーピング・ジーンとは、元々生体内で常に一定以上の発現量を持つ遺伝子であり、それ自体の物性として蛍光は有さない。このハウスキーピング・ジーンをＤＮＡマイクロアレイにスポットしておけば、サンプル液中の蛍光標識した核酸と必ずハイブリダイゼーションを起こすので、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、やはり蛍光シグナルを発する。これら自家蛍光物質、核酸吸着物質、ハウスキーピング・ジーンはいずれも、ＤＮＡマイクロアレイにスポットされた場合、スキャンされた際に必ず発光する特性を有するスポットとなり、本明細書においては、これらをポジティブコントロールと称する。他方、スキャンされた際に、必ず発光しない特性を有するスポットは、本明細書において、ネガティブ・コントロールと称する。
【０１０４】
図９は、スキャナー装置７１によって読み込まれた図８の画像に対して、基準マーク認識エリアを含むテンプレートが自動認識された状態を示す。図９において、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａ中の基準マークの定義位置１０ｂと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク１０ｃとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図１０に示すように、画像ファイル中の基準マーク１０ｃとテンプレート上の基準マーク定義位置１０ｂとが一致するよう位置補正する。なお、図１０中、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａおよび基準パターンの定義位置１０ｂは、便宜上図示したものであって、実画像として可視的に表示されるものである必要はない。
【０１０５】
この基準マークを用いた位置決め処理によって、ＤＮＡマイクロアレイ全体（すなわち、アレイ上のスポット領域全体）がテンプレート全体に対して概略位置決めされる。
【０１０６】
図７に戻り、図９に示す、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａ中の基準マークの定義位置１０ｂと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク１０ｃとの位置ずれによるシフト量が計算され（ステップＳ１７５）、計算されたシフト量に基づき、図１０に示すように、画像が回転・移動される（ステップＳ１７７）。最後に、補正された画像ファイルが、補正後の画像ファイルを格納する画像ファイル１１ｂに格納される。なお、この格納先は、ステップ１７１において画像ファイルの読み込み元である画像ファイル１１であってもよい。
【０１０７】
次に、本実施形態におけるスポット単位の位置決め処理（図６におけるステップＳ２３）の詳細を説明する。
【０１０８】
図１１は、本実施形態に係る、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット単位で実行される、図６のステップＳ２３におけるスポット単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【０１０９】
図１１に示すように、本実施形態に係るスポット単位の位置決め処理部３５７は、ステップＳ２１において読み込まれた位置補正処理（画像処理）後の画像ファイル１１ｂ中の、各ＤＮＡマイクロアレイにおける各スポット画像に対して、予め解析自動化情報ファイル９３３から読み込んだテンプレートの、各スポットに対応する検出エリアへの位置決めを実行する（ステップＳ２３１）。
【０１１０】
図１３は、図６のステップＳ２１において読み込まれた位置補正後のＤＮＡマイクロアレイ画像に対して、テンプレートの各検出エリアが当てはめられた状態を示す。図１３において、テンプレートの各検出エリア１３ｂと、読み込まれた画像ファイル中の各スポットとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図１４に示すように、画像ファイル中の各スポット画像とテンプレート上の各検出エリアとが適合するよう、スポット単位の位置決め処理部３５７が位置補正する。
【０１１１】
図１１に戻り、図１４に示す位置補正後の画像ファイルが、テンプレートの定義情報に基づいて数値化され（ステップＳ２３３）、数値化されたファイルが、数値化データファイル１３に格納される（ステップＳ２３５）。
【０１１２】
次に、本実施形態におけるブロック単位の位置決め処理（図６におけるステップＳ２５）の詳細を説明する。ブロック単位の位置決め処理部３５９によるブロック単位の位置決め処理においては、基準パターンの有するパターン配列を用いたパターンマッチングによる位置決め処理および基準パターンの位置座標を用いた位置決め処理の双方が用いられる。あるいは、これらの一方のみが実行されてもよい。
【０１１３】
図１５は、図６におけるステップ２３におけるスポット単位での位置決め処理によって、誤って位置決めされたＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルの一例を示す。図１５に示すように、スポット単位の位置決め処理においては、スポット単位での位置決めは、ＤＮＡマイクロアレイ上のブロックごとに、ブロック内のスポットに対してテンプレート上の検出エリアのブロックが適合するかを試行されることによって実行される。このため、例えばＤＮＡマイクロアレイの基板上にゴミが付着している場合などに、各スポットが適合されるべき検出エリアが誤って判断されてしまい、ブロックの位置決めの誤りが生ずることになる。ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、微細なゴミの付着による上記位置決め誤りは避けがたい。
【０１１４】
そこで、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイ上のブロック内に、ブロック単位の位置決めを調整するための基準パターンを予め配置し、このスポット単位の位置決め処理によって生ずる位置決め誤りを調整する。
【０１１５】
図１２は、本実施形態において用いられるＤＮＡマイクロアレイの一例を示す。図１２に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ１上には、複数のブロック群１ｂが配置される。各ブロック内には、遺伝子がスポットされているが、本実施形態においては、各ブロック内に、必ず発光するスポットであるポジティブ・コントロールおよび必ず発光しない（光ってはおかしい）スポットであるネガティブ・コントロールとを配置する。これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールは、通常、ハイブリダイゼーション工程が異常なく処理されたか否かを判断するための標識（マーカー）として使用される。本実施形態では、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせでなる基準パターンを形成する。この基準パターンを、プローブである遺伝子を固定するスポットをマトリクス状に形成した各ブロック内に配置することによって、ブロック単位の位置決め処理におけるブロック単位の位置決めの基準パターンとする。このブロックは、請求項におけるスポットサブ領域に対応する。
【０１１６】
なお、このポジティブ・コントロールは、上記基準マークと同様、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナー装置７１によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【０１１７】
具体的には、図１２の１ｃで示されるように、各ブロック内にポジティブ・コントロールを配置し、その周囲に、１ｄで示されるように、ネガティブ・コントロールを配置する。この基準パターンは、ブロック内の一角に設けられてもよく、あるいはブロック内の任意の位置に設けられてもよい。または、必要に応じて、スポット領域を構成するブロック外であってその近傍に設けられてもよい。このブロック内に配置されたポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターン配列およびその位置座標の情報は、予めテンプレートに関する属性情報の１つとして、解析自動化情報ファイル９３３に登録されている。ブロック単位の位置決め処理においては、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの蛍光強度および位置座標の判定を実行することによって、各ブロック内のスポットの位置を特定することができる。
【０１１８】
ブロック内のある基準パターンの下に、さらに、ネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる他のパターンを配置してもよく、あるいは、ブロック内のあるパターンに対し、ブロックの対角線上にネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールの他のパターンを配置してもよい。１つのブロック内にこのような他のパターンをさらに配置して基準パターンを複数にすることによって、ＤＮＡマイクロアレイに付着するゴミなどに起因する誤判定を低減することができる。
【０１１９】
一方、１つのＤＮＡマイクロアレイによってより多くの遺伝子を解析するという観点からは、このネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる基準パターンが占有する領域は少ないことが望ましい。
【０１２０】
図１８乃至図２３は、本実施形態におけるこのネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールのパターンの配置例を示す。なお、図１８乃至図２３において、ブロック内のポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロール以外は、すべて他の遺伝子がスポットされているものとする。また、ブロック単位の位置決め処理における位置決め（アラインメント）成功の判定基準は、ポジティブ・コントロールの蛍光強度が設定された最低蛍光強度以上であって、ポジティブ・コントロール座標が予めテンプレートの属性として設定された閾値以下とする。
【０１２１】
図１８においては、ブロック１ｂを跨って１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり９個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が１個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２２】
図１９においては、ブロック１ｂを跨って、離隔した２つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり１５個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２３】
図２０においては、ブロック１ｂを跨って、１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されているとともに、ブロック内の対角位置に、１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり１６個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。図２０に示すパターンは、図１８のパターンと比較して、ブロックのθずれの検出が強化されている。
【０１２４】
図２１乃至図２３は、ブロック１ｂ間のピッチが、スポット間隔のピッチより２倍以上離れて配置されている（すなわち、ブロック１ｂ間にスポット一個分１eに相当する間隔がある）。
【０１２５】
図２１においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり４個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が１個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２６】
図２２においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されているとともに、その対角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり８個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、２個のポジティブコントロールと同じ配置で計２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２７】
図２３においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃおよびこれと離隔した他の１つのポジティブ・コントロールの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり８個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、２個のポジティブコントロールと同じ配置で計２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２８】
図２１乃至図２３から理解されるように、ブロック１ｂの間隔を、ブロック内のスポット間隔の２倍以上のピッチとすると、ポジティブ・コントロールの周囲を、ブロックを跨いでネガティブ・コントロールで囲む必要がなくなる。このため、より少ないポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数でブロックの位置の特定が可能となる。
【０１２９】
上記図１８乃至図２３においては、いずれも、ポジティブ・コントロールの周囲をネガティブ・コントロールが取り囲む配置であるが、本実施形態においてこの配置を用いるのは、次の理由による。すなわち、例えば図１６に示すように、ネガティブ・コントロールが配置されておらず、ポジティブ・コントロールが１個のみ配置されているブロック、ポジティブ・コントロールが２個並んで配置されているブロック、およびポジティブ・コントロールが対角に２個配置されているブロックとの配置を想定する。図１７は、この図１６の配置に対して、解析プログラムによるテンプレート上の検出エリアのブロック単位の位置決め処理が実行された後の状態を示す。このブロック単位の位置決め処理後の合否判定においては、
（１）まず、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の蛍光強度の判定においては、閾値以上の蛍光強度を持つＤＮＡが存在するため、合格となる。
【０１３０】
（２）次に、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の位置の判定においては、位置座標の許容ずれ量以上であるので、不合格となる。
【０１３１】
しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの間隔が微細化しているため、スポットの配置精度、スキャナー装置７１の読み取り精度、ハイブリダイゼーション後のスポット形状等からスポットの間隔と、位置座標の許容ずれ量とが近似してきている。このため、実際には、不合格となるように位置座標の許容ずれ量の設定をすると、本来は合格が判定されるべき位置決め（アラインメント）であっても不合格となってしまい、正確な位置決め合否判定が成立しない。
【０１３２】
一方、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで取り囲む本実施形態に係る配置パターンを用いれば、位置座標の許容ずれ量を、スポットの間隔の２倍以上に設定できる。このため、有意かつ正確な位置決め合否判定を実現することができる。なお、（１）および（２）の判定を用いず、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターンマッチングによる判定のみでも、位置決め後のパターンとテンプレート上のパターンとが同じパターン配列を持たない限り、位置決め合格が判定されないので、有効である。
【０１３３】
また、例えば、スポットの位置精度、機械精度などにより許容ずれ量が３倍ピッチ分しか設定できない場合には、図３４に示すように、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで二重に取り囲む構成が好ましい。画像への検出エリアの当てはめでたまたま同じ蛍光強度の配列を持つＤＮＡのスポット配列があって、誤認識された場合、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの合格が判定されたとしても、位置座標の判定によって、位置決め不合格であることを正しく判定することができる。
【０１３４】
なお、本実施形態における上記解析処理と、上記のＤＮＡマイクロアレイとは、必ずしも併用されることを要するものではなく、上記のＤＮＡマイクロアレイは、本実施形態に係る解析プログラム以外の解析プログラムに用いられてもよい。
【０１３５】
図２４は、本実施形態に係る、ＤＮＡマイクロアレイ上のポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールとの配列パターンによって、ブロック単位で実行される、図６のステップＳ２５におけるブロック単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【０１３６】
図２４に示すように、本実施形態に係るブロック単位の位置決め処理部３５９は、ステップＳ２１において読み込まれた位置補正処理（画像処理）後の画像ファイル１１ｂを読み込む（ステップＳ２５１）。次に、予めテンプレート上に定義された、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの基準パターンと、画像ファイルとのパターンマッチングが実行される（ステップＳ２５３）。あるいは、このステップＳ２５３において、パターンマッチングとともに、あるいはパターンマッチングに換えて、位置座標の判定が用いられてもよい。
【０１３７】
このパターンマッチングの結果、算出されたシフト量に基づいて、検出エリアへのブロック画像の当てはめが試行され、ブロック画像が位置決めされる（ステップＳ２５５）。このブロック単位の位置決めに基づき、画像ファイルが数値化され（ステップＳ２５７）、数値化されたデータが、数値化データファイル１３に格納される（ステップＳ２５９）。
【０１３８】
次に、本実施形態における位置決め判定部３６１が行う位置決め成否の判定処理の詳細を説明する。
【０１３９】
すなわち、上記基準マークを用いた位置決め処理、スポット単位の位置決め処理およびブロック単位の位置決め処理の完了後、それぞれのスポットの数値化（解析）を実行し、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度、位置座標の判定が実行され、これによって、位置決めが正しく実行されたか否かが判定される。
【０１４０】
図２５は、このそれぞれのスポットが数値化された後のデータの一例を示す。
【０１４１】
図２５において、Ｐｎは注目するスポット（例えばポジティブ・コントロール）を示す。ＩｎはＰｎの蛍光強度を示す。（ｘｎ，ｙｎ）はＰｎの画像上の実座標を示す。（Ｘｎ，Ｙｎ）はＰｎの設計上の座標を示す。ｎは１〜Ｚの自然数である。
【０１４２】
（１）ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度を用いた判定方法
次の条件がすべて満たされたとき、個数と蛍光強度の判定は合格であるとする。
【０１４３】
・個数の判定を行うポジティブ・コントロールをＰｎとするとき、その個数はＺである。
【０１４４】
・個数の判定を行うネガティブ・コントロールをＰｎとしたとき、その個数はＺである。
【０１４５】
・判定を行うポジティブ・コントロールをＰｎとして数値化データより抽出したとき、ｎ＝１〜Ｚに対し、最低ポジティブ・コントロール蛍光強度≦Ｉｎを満たす。
【０１４６】
・判定を行うネガティブ・コントロールをＰｎとして数値化データより抽出した場合、ｎ＝１〜Ｚに対し、Ｉｎ≦最大ネガティブ・コントロール蛍光強度を満たす。
【０１４７】
（２）位置座標の判定方法
次の判定方法の双方または一方が用いられて判定される。
【０１４８】
・絶対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをＰｎとして、ｎ＝１〜Ｚに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【０１４９】
（｜Ｘｎ−ｘｎ｜≦ｘ方向許容ずれ量）かつ、（｜Ｙｎ−ｙｎ｜≦ｙ方向許容ずれ量）
・相対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをＰｎとして、Ｐ１を基準とする。ｎ＝１〜Ｚに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【０１５０】
（｜ｘｎ−ｘ１｜≦｜Ｘｎ−Ｘ１｜＋ｘ方向許容ずれ量）かつ、（｜ｙｎ−ｙ１｜≦｜Ｙｎ−Ｙ１｜＋ｙ方向許容ずれ量）
解析結果出力部３６５は、上記の位置決め判定処理（図６のステップＳ２７）の結果、位置決めの成功が判定された数値化データを、数値化データファイル１３に保存する。一方、所定の再試行回数の位置決めによっても成功判定が得られなかった画像については（図６のステップＳ３５）、解析結果出力部３６５は、成功判定が得られなかった旨を示す情報をログファイル３６７に出力するとともに、成功判定が得られなかった画像をミス画像として解析ミス画像ファイル３７１に出力する。この解析ミス画像は、人間の視認による位置決め処理に供される。解析制御部３６３は、必要に応じて、基準マークを用いた位置決め処理部３５５，スポット単位の位置決め処理部３５７，ブロック単位の位置決め処理部３５９，位置決め判定部３６１，解析結果出力部３６５を呼び出して実行することにより、図６における一連の解析処理全体を実行する。
【０１５１】
次に、図２６乃至図３２を参照して、本実施形態に係る解析処理における画面表示の一例を説明する。
【０１５２】
図２６は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から入力される、スキャン画像の画像認識処理が実行中である画面表示の一例を示す。サブウインドウ２６３に示されているように、スキャン画像中のスポット領域外部、左右に配置された基準マークの位置座標が表示され、この基準マークの位置座標に基づき、スキャン画像の認識処理（画像処理）において、回転移動（θ方向補正）が実行中である旨のメッセージが表示されている。なお、手動による回転角算出ボタン２６５，手動回転処理ボタン２６７が提供されている。
【０１５３】
図２７は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から読み込まれたスキャン画像のイメージ表示の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイのブロック内に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールを含む、それぞれの蛍光強度のスポットが配置されている。
【０１５４】
図２８は、図２７の表示された画像イメージに対して、解析パラメータファイル９３１に登録されたテンプレートの検出エリアが呼び出された状態の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイ画像イメージ内の各スポット画像と、テンプレート上の各検出エリアとが位置ずれしている。
【０１５５】
図２９は、本実施形態によらない場合の、図２８の画像に対する位置決め後の状態の一例を示す。θ方向ずれ量や、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれ量が大きい場合、正しい位置決めが行われず、検出エリアの位置決めが誤っている様子が示されている。本実施形態によらなければ、この図２９の状態から、人手で視認によって１つずつ検出エリアをずらしながら画像に当てはめる修正操作を繰り返し行う必要がある。
【０１５６】
図３０は、本実施形態におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによりなる基準パターンを用いない場合の、位置決め後の状態の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間のピッチの微細化に伴い、スポットのピッチに対してスポットの位置精度が近づいているために、単に検出エリアの位置座標データによる判定では各スポットに各検出エリアが正しく当てはめられているか否かの判断が困難になる。本実施形態によらない場合、この図３０の状態から、各ブロック画像を拡大表示して、全体のバランスを人間が判断して検出エリアが正しく当てはめられているか否かを確認していた。
【０１５７】
図３１は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン３１１を配置した場合に、なお位置決め誤りを起こした状態の一例を示す。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上に大きなブロックを配置しなければならない場合は、θ方向ずれの影響が生じやすく、ブロック上、一角のみに基準パターンを配置しただけでは、基準パターン判定およびその位置座標による判定（ブロック単位の位置決め）において、位置決め誤りであるにもかかわらず、位置決め成功と判定されてしまう。この場合、例えば対角の３１３の位置にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置すれば、正確な位置決め判定を行うことができる。
【０１５８】
図３２は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン３１１を配置した場合に、位置決め判定が成功した状態の一例を示す。ブロック上の一角にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンが配置されている。
【０１５９】
図３３は、本発明の実施形態に係る試料解析装置および試料解析システムのハードウエア構成を示すブロック図である。
【０１６０】
本発明の実施形態に係る試料解析装置は、例えば、図３３に示される構成を有する。すなわち、本発明の実施形態に係る試料解析装置は１つまたは複数のコンピュータシステム内に試料解析処理の各要素を内蔵することにより構成される。
【０１６１】
図３３に示すように、コンピュータシステム１００は、マイクロプロセッサのような中央演算処理装置１１０およびシステムバス１１２を介して相互に接続される他の多くのユニットからなる。このコンピュータシステムは、ランダムアクセスメモリ１１４と、リードオンリーメモリ１１６と、ハードディスク装置１２０などのような周辺装置をシステムバス１１２に接続するＩ／Ｏアダプタ１１８と、キーボード１２４，マウス１２６，スピーカ１２８、マイク１３２あるいはタッチスクリーン（図示せず）等のユーザーインターフェース装置をシステムバス１１２に接続するユーザーインターフェースアダプタ１２２と、通信ネットワークへこのコンピュータシステムを接続する通信アダプタ１３４と、表示装置１３８をシステムバス１１２に接続するディスプレーアダプタ１３６と、フレキシブルディスク１４４，光ディスク１４６および各種メモリカード１４８をそれぞれ駆動する外部ディスクドライバー１４２とを具備する。
【０１６２】
これらフレキシブルディスク１４４，光ディスク１４６および各種メモリカード１４８などに代表されるコンピュータ読み取り可能な各種の記憶媒体に、本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための解析プログラムを格納し、外部ディスクドライバーを介してこれらの記憶媒体からの所定の読み出し操作を行うことにより、これらの記憶媒体に格納された本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための試料解析プログラムをコンピュータシステム内にインストールすることができる。これらのプログラムをランダムアクセスメモリ１１４にロードし、中央演算処理装置１１０で実行することにより、本実施形態に係る試料解析処理が実現される。なお、上記試料解析プログラムは、１つのコンピュータ上で実行されてもよく、複数のネットワーク接続されたコンピュータ上で実行されてもよい。複数のコンピュータ上で実行される場合には、それぞれのコンピュータ上で稼働するモジュールが、これを記憶する記憶媒体によりそれぞれのコンピュータにロードされる。
【０１６３】
本実施形態によれば、以下の効果が得られる。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。特に、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、人手による位置決め処理は困難となっていることから、本実施形態により、試料解析の一連の処理におけるボトルネックが大きく解消される。
【０１６４】
さらに、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化が図られる。
【０１６５】
なお、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイにＤＮＡがスポットされた実施形態として説明したが、これに限定されない。本実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイは、例えば、ＲＮＡ、蛋白質など、特異的に結合する生体分子にも適用可能であり、ＤＮＡに限定されるものではない。
【０１６６】
なお、本発明はここでは記載していない様々実施の形態等を包含するということは十分に理解すべきである。したがって、本発明はこの開示から妥当な特許請求の範囲に係わる発明特定事項によってのみ限定されるものでなければならない。
【０１６７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイを用いた試料解析の一連の工程を示す概略図である。
【図２】ＤＮＡマイクロアレイの一例を示す斜視図である。
【図３】試料解析工程において用いられるテンプレートの検出エリアの配置の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示すブロック図である。
【図５】本発明の実施形態に係る試料解析装置により数値化された画像データの一例を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る試料解析方法の概略処理手順を示すフローチャートである。
【図７】図６におけるステップＳ１７の基準マークを用いた位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図８】本発明の実施形態に係る試料解析装置により読み込まれたＤＮＡマイクロアレイの画像イメージの一例を示す図である。
【図９】図８の画像イメージに、定義ファイル記憶部３５３に記憶されたテンプレートがオーバーラップした状態を示す図である。
【図１０】図９の画像が、本発明の実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理部３５５によって位置決めされた後の状態を示す図である。
【図１１】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図１２】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの配置の一例を示す図である。
【図１３】図６におけるステップＳ２１で、スポット単位の位置決め処理部３５７によって読み込まれた画像の一例を示す図である。
【図１４】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理後の、図１３の画像の一例を示す図である。
【図１５】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理後の、図１３の画像の他の一例を示す図である。
【図１６】本発明の実施形態に係る、ポジティブ・コントロールを配置したスポット領域を有するＤＮＡマイクロアレイのブロックの一例を示す図である。
【図１７】図１６のブロックが、誤って位置決めされた状態の一例を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の一例を示す図である。
【図１９】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２０】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２１】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２２】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２３】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２４】図６におけるステップＳ２５のブロック単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図２５】本発明の実施形態における位置決め判定処理を説明する図である。
【図２６】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、画像処理画面イメージの一例を示す図である。
【図２７】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、ＤＮＡマイクロアレイのスキャン画像の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図２８】図２７のスキャン画像に対して、テンプレートの検出エリアが呼び出された状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図２９】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図３０】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図３１】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図３２】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、位置決め判定処理が成功した場合の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図３３】本発明の実施形態に係る制御用パーソナル・コンピュータ７３および解析用パーソナル・コンピュータ９１のハードウエア構成の一例を示す図である。
【図３４】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ上の基準パターンの配置の他の例を示す図である。
【図３５】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示す図である。
【符号の説明】
１ ＤＮＡマイクロアレイ
１ａ スポット領域
１ｂ ブロック
１ｃ ポジティブ・コントロール
１ｄ ネガティブ・コントロール
１１ ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル
１３ 数値化データファイル
７１ スキャナー装置
７３ 制御用パーソナル・コンピュータ
９１ 解析用パーソナル・コンピュータ
９３ 定義ファイル
３５１ 解析画像記憶部
３５３ 定義ファイル記憶部
３５５ 基準マークを用いた位置決め部
３５７ スポット単位の位置決め部
３５９ ブロック単位の位置決め部
３６１ 位置決め判定部
３６３ 解析制御部
３６５ 解析結果出力部
３６７ ログファイル
３６９ 解析結果ファイル
３７１ 解析ミス画像
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイおよび該ＤＮＡマイクロアレイなどを用いた試料の解析手法に関する。特に、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイの画像解析において、スキャナにより読みとられたＤＮＡマイクロアレイ画像に対して、解析ツールが定義する検出エリアの位置決めおよび画像の補正を実行することによって、ＤＮＡマイクロアレイの画像解析の精度を向上させるとともに自動化するための技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子解析が実現されている。
【０００３】
本明細書において、ＤＮＡマイクロアレイあるいはＤＮＡチップとは、ガラス等からなるアレイ基板の上にＤＮＡを、グリッド状にスポットしたものをいう。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイ上には、標識されたＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、ＤＮＡがスポットされている。
【０００５】
解析すべき未知のＤＮＡサンプルに光学的に検出可能な発光又は蛍光マークを付けて、かかるＤＮＡマイクロアレイ上に流し込むと、ＤＮＡサンプルがグリッド上のＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。サンプルが結びつかなかったＤＮＡをすべて洗い流し、判定したいＤＮＡサンプルを発光させ、これをスキャナーにより読みとると、二重鎖となったＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイ上で発光するマークの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかが解析される。このように、ＤＮＡマイクロアレイ上に既知のＤＮＡセットを構成し、かかるＤＮＡセットを換えることで、遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
【０００６】
図１は、かかるＤＮＡマイクロアレイ解析の一連の処理工程を示す。
【０００７】
図１に示すように、ハイブリダイゼーション工程３において、ＤＮＡが搭載されたスポット領域１ａを含むＤＮＡマイクロアレイの試験片１上に、解析すべき未知のＤＮＡサンプルが、発光用のマークを付けて滴下される。ここで、ＤＮＡサンプルがグリッド上のＤＮＡと相補的な関係にあれば、結びついて二重鎖になる。次に、洗浄工程５において、所定の洗浄液により、ハイブリダイズされたＤＮＡマイクロアレイ１が洗浄されると、結びつかなかったＤＮＡがすべて洗い流される。この洗浄されたＤＮＡマイクロアレイに対して、スキャニング工程７において、スキャナー装置内において、発光用のマーク（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を励起するのに適した所定の波長のレーザー光が照射され走査されることにより、スポットされた各ＤＮＡ（遺伝子）の発光量が測定される。スキャンされたＤＮＡマイクロアレイ１の画像は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に格納される。解析工程９において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１が読み込まれ、ＤＮＡマイクロアレイの解析処理が実行される。具体的には、解析工程９においては、読み込まれた画像データに基づいて、各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。
【０００８】
なお、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を介さずに、スキャナーにより読み込まれたＤＮＡマイクロアレイ画像が順次解析工程９に入力されてもよい。
【０００９】
解析結果は、数値化データファイル１３として記録され、必要に応じて表示装置１５を介して表示出力されてもよく、印刷装置１７を介して印刷出力されてもよい。
【００１０】
図２は、ＤＮＡマイクロアレイ解析に用いられるＤＮＡマイクロアレイ１の一例を示す。図２に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ１は、その基板２のグリッド上に、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）の個々の遺伝子（以下、「スポット」と称する。）が行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを形成してなる。なお、基板２上のスポット領域１ａに配置されるスポットは、既にその塩基配列が解読されている互いに異なるＤＮＡにそれぞれ対応するものであり、基板２上におけるその配置位置は、予め定められている。
【００１１】
図３は、解析処理において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に対して適用されるテンプレートの一例を示す。図３に示すように、テンプレートは、例えばＡ〜Ｆなどの複数のフィールドに分割されており、各フィールド内においてはｍ行ｎ列（図３では４×４）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡマイクロアレイの個々のスポットに対応する。）により形成されるブロックが、複数（図３ではｐ×２４個）存在する。このブロックには、ＸＹ両方向において、それぞれ、例えばａ〜ｐ、１〜２４のアドレス番号が付与されており、各ブロックの位置は、各フィールドにおいて例えば「ａ、１」として表すことができる。
【００１２】
上記の解析工程９においては、読みとられたＤＮＡマイクロアレイのスキャン画像中の個々のスポットが、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアに当てはめられる。かかる画像への検出エリアの当てはめによる位置決め動作を、アラインメントと称する。解析工程９において、解析ツールが、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットの蛍光強度を算出し、正確な解析を実行するためには、画像上の個々のスポットに対して、予め定義されている、ＤＮＡマイクロアレイの基板２上に配置された個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント（位置決め）処理が正確に実行される必要がある。（読み取られた画像を正しく解析するためには、このアラインメントにおいて、個々のスポットに対して対応する個々の検出エリアが当てはめられる必要がある。）このアラインメント（位置決め）処理において、位置ずれが検出された場合には、画像あるいは検出スポットの位置が、対応するテンプレートの検出エリアに正しく設定されるよう、補正されなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来における、ハイブリダイゼーション工程３を経たＤＮＡマイクロアレイの解析手法には、以下の解決すべき問題点があった。
【００１４】
すなわち、ＤＮＡマイクロアレイを構成する、ガラスからなる基板２の加工精度の低さ、カケ・割れなどの発生、スキャナーのオートローダーにＤＮＡマイクロアレイを載置する際またはこれらをスキャナーに装着する際の位置ずれの発生、オートローダーやスキャナーなどの機械精度上生ずる誤差、さらには基板２に付着した微少なゴミなどが種々原因となって、解析すべきＤＮＡマイクロアレイの画像ファイルには、不可避的に位置ずれが生じてしまう。
【００１５】
しかし、ここで、ＤＮＡマイクロアレイを構成する基板２の外形寸法は、ガラスの加工精度、カケ・割れなどにより、その精度が低い。このため、基板２の外形自体をＤＮＡマイクロアレイと解析ツールが提供するテンプレートとの位置決めに使用することは実用上できなかった。
【００１６】
従って、オートローダーに多数のＤＮＡマイクロアレイが載置され、連続的にスキャナーによってＤＮＡマイクロアレイがスキャンされて画像データ１１が自動的に蓄積されていくにもかかわらず、後続の解析工程９においては、画像のθずれ（回転ずれ）、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれにより生じる位置ずれを検出し、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に検出エリアを位置決めし、あるいは、既存の解析装置によって実行される検出エリアの位置決めがミスしているか否かの判断が、人手を介して行われる必要があった。
【００１７】
特に、画像の位置ずれが大きい場合には、既存の解析装置によっては、正しく位置決め処理を自動的に実行することができなかった。
【００１８】
従って、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定が、人間の視認、判断に依存しており、自動的に処理することができずに全体におけるボトルネックを構成していた。
【００１９】
ことに、解析すべき画像の枚数が多い場合には、これら検出エリアの位置決め処理や、検出エリアの位置決めの成否の判定には、膨大な時間および労力を必要としていた。さらに、ＤＮＡマイクロアレイ上へのスポットの形成技術におけるインクジェット方式の採用に伴い、スポットの径が微細化するとともにスポット間の間隔がハイピッチ化してきたことで、視認によって正確な位置決め処理を行うことは、人手によっても殊更困難となっている。
【００２０】
本発明は、上記の技術的課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なＤＮＡマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【００２１】
また、本発明の他の目的は、検出エリアの位置決めの成否の判定を、定量的、自動的、かつ高精度に実行可能なＤＮＡマイクロアレイ、試料解析装置および試料解析方法を提供することにある。
【００２２】
また、本発明の他の目的は、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化を図る点にある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、解析されるべきＤＮＡマイクロアレイの基板上に、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準パターンを設け、このＤＮＡマイクロアレイの基準パターンを利用して、正確な位置決め処理および位置ずれ補正処理を実行する。
【００２４】
この基準パターンは、例えば、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせにより構成することができる。
【００２５】
また、本発明においては、ＤＮＡマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理を解析処理において実行してもよい。
【００２６】
本発明のある特徴によれば、基板と、前記基板表面に、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットが、マトリクス状に形成されたスポット領域と、前記基板表面に、前記スポット領域内または前記スポット領域近傍に配置され、前記試料の解析において、前記スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域とを具備することを特徴とするプローブ反応性チップが提供される。
【００２７】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによりなる。
【００２８】
本発明の他の特徴によれば、前記スポット領域は、前記基板表面において、複数のブロック化されたスポットサブ領域からなり、前記基準パターン領域は、前記スポットサブ領域内にそれぞれ配置される。
【００２９】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【００３０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、核酸吸着物質である。
【００３１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である。
【００３２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットの周囲に複数の必ず発光しないスポットが配置されてなる。
【００３３】
本発明の他の特徴によれば、上記プローブ反応性チップは、さらに、前記基板表面上の前記スポット領域外に配置された、前記スポット領域の位置ずれを補正するための基準マークを具備する。
【００３４】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である。
【００３５】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、核酸吸着物質である。
【００３６】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である。
【００３７】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、複数の必ず発光するスポット、または必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットとの組み合わせ配列からなる。
【００３８】
本発明の他の特徴によれば、前記基準マークは、チップの種別、製作ロット識別子を含む、チップ固有の情報を示す。
【００３９】
本発明の他の特徴によれば、前記スポットサブ領域は、隣接する他のスポットサブ領域と、前記スポットサブ領域内に配置されるスポット領域内の各スポット間隔の少なくとも２倍以上の間隔をもって配置される。
【００４０】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を定義する基準パターン情報記憶部と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む画像データ読み込み部と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する画像データ位置決め部と、前記画像データ位置決め部により位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する判定部と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正部と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する解析部とを具備することを特徴とする試料解析装置が提供される。
【００４１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００４２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００４３】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００４４】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め部は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００４５】
本発明の他の特徴によれば、前記解析部は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定部は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００４６】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査部を具備し、前記走査部および前記解析部は、並列的に処理を実行する。
【００４７】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め部は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決め部と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決め部とを具備する。
【００４８】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析装置は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決め部を具備する。
【００４９】
本発明の他の特徴によれば、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義するステップと、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込むステップと、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成するステップと、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定するステップと、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正するステップと、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力するステップとを含むことを特徴とする試料解析方法が提供される。
【００５０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００５１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００５２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００５３】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決めステップは、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００５４】
本発明の他の特徴によれば、前記解析ステップは、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定ステップは、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００５５】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査ステップを含み、前記走査ステップおよび前記解析ステップは、並列的に実行される。
【００５６】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決めステップは、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決めステップと、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決めステップとを含む。
【００５７】
本発明の他の特徴によれば、上記試料解析方法は、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決めステップを含む。
【００５８】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理と、補正された画像データを解析して、前記試料に関する数値化データを出力する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【００５９】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによるパターンである。
【００６０】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、基準マークからの相対座標である。
【００６１】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン情報記憶部に記憶される前記基準パターン領域の情報は、予め定義された前記基準パターン間の相対座標である。
【００６２】
本発明の他の特徴によれば、前記基準パターン領域の情報は、前記基準パターン情報記憶部において、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域ごとに定義され、前記画像データ位置決め処理は、前記スポットサブ領域単位で前記画像データを位置決めする。
【００６３】
本発明の他の特徴によれば、前記解析処理は、自動モードまたは手動モードのいずれかにおいて選択的に動作し、前記判定処理は、前記位置決めされた画像データの解析を所定回数繰り返し実行して、所望する解析結果が得られない場合には、当該チップについて位置決め処理が失敗したことを示す情報を出力データに付加する。
【００６４】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して前記画像データを得る走査処理を含み、前記走査処理および前記解析処理は、並列的に実行される。
【００６５】
本発明の他の特徴によれば、画像データ位置決め処理は、画像データ中のそれぞれのスポット単位で、前記画像データのスポットを検出エリアに位置決めする第１の位置決め処理と、前記プローブ反応性チップ上の、複数のブロック化されたスポットサブ領域単位で、前記画像データを位置決めする第２の位置決め処理とを含む。
【００６６】
本発明の他の特徴によれば、上記プログラムは、さらに、基準マークを用いて、前記スポット領域全体の単位で前記画像データを位置決めする第３の位置決め処理を含む。
【００６７】
本発明の他の特徴によれば、コンピュータに試料解析処理を実行させるプログラムであって、プローブ反応性チップ上に形成された、スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域の情報を基準パターン情報記憶部に定義する処理と、前記プローブ反応性チップ上の、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットを走査して得られた画像データを読み込む処理と、前記基準パターン情報記憶部から読み出された基準パターン領域の情報に基づいて、前記画像データを、予め定義された検出対象エリアに位置決めするとともに、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する補正データを生成する処理と、前記位置決めされた画像データを解析することにより、前記位置決めの合否を判定する処理と、前記補正データに基づいて、前記画像データと前記検出対象エリアとの位置ずれを補正する処理とを含むことを特徴とするプログラムが提供される。
【００６８】
【発明の実施の形態】
以下、図４乃至図３３を参照して、本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）、試料解析装置および試料解析方法を詳細に説明する。
【００６９】
本実施形態においては、解析されるべきＤＮＡマイクロアレイの基板上に、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決めに用いる基準マークを設けるとともに、ＤＮＡマイクロアレイのスポット領域を構成するブロック内に、上記位置決め処理および位置ずれ補正処理に利用される基準パターンを配置し、このＤＮＡマイクロアレイを利用して、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置ずれ補正処理が実行される。また、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイ単位、スポット単位およびブロック単位で、複数段階の位置決め処理が解析処理において実行される。
【００７０】
図４は、本発明の実施形態に係る試料解析システム全体の構成を示すブロック図である。
【００７１】
図４に示すように、本発明の実施形態に係る試料解析システムは、スキャナー装置７１と、制御用パーソナル・コンピュータ７３と、解析用パーソナル・コンピュータ９１とを具備する。
【００７２】
スキャナー装置７１は、ＤＮＡマイクロアレイ１を複数載置するオートローダー機構を備え、発光性のマーカーによりマーキングされたＤＮＡサンプルを滴下したＤＮＡマイクロアレイを、レーザー光により励起し、得られた画像を、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１に格納する。このＤＮＡマイクロアレイ１は、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長でスキャンされ、１つのＤＮＡマイクロアレイ１に対応してそれぞれの励起波長に対応した画像ファイルが得られる。この画像ファイルは、例えば、１６ビットグレイスケールＴｉｆｆフォーマット画像であるが、その他Ｍｕｌｔｉ−ＩｍａｇｅＴｉｆｆフォーマット画像、ＪＰＥＧフォーマット画像などでもよい。
【００７３】
制御用パーソナル・コンピュータ７３は、例えば汎用パーソナルコンピュータなど、スキャナー装置７１に例えばＬＡＮケーブルを介して接続可能なコンピュータであれば足り、スキャナー装置７１におけるＤＮＡマイクロアレイ１の走査、および画像取得の制御を行う。
【００７４】
解析用パーソナル・コンピュータ９１は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込む。あるいはスキャナー装置７１または制御用パーソナル・コンピュータ７３から直接読み取られたＤＮＡマイクロアレイ画像を入力する。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル群９３を読み込んで、ＤＮＡマイクロアレイ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル１３に出力する。この解析用パーソナル・コンピュータ９１には、本実施形態に係る解析処理を実行するための解析ツールとなるプログラムが導入される。この解析プログラムは、本実施形態に係る解析処理を実行するプログラムであればよいが、例えば、ＭｉｒｃｏＳｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）上で稼働するＩｎｔｅｒＭｅｄｉｃａｌ社製の「ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ」（ＴＭ）などをその基礎または一部として利用することができる。
【００７５】
この解析用パーソナル・コンピュータ９１上で稼働する解析プログラムは、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１の解析を自動制御するものであって、その処理内容の詳細は後述するが、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込むとともに解析定義ファイル群９３を読み込み、読み込まれたＤＮＡマイクロアレイ画像上の基準マークが、解析定義ファイル群９３に記憶されるテンプレート上の基準位置と一致するように、位置決め処理（基準マークを用いた位置決め処理）を実行する。さらに、解析プログラムは、画像データと検出エリアとによる、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット単位での位置決め処理（スポット単位の位置決め処理）および、基準パターンを用いた、ＤＮＡマイクロアレイ上の複数のスポット領域を構成するブロック単位での画像データの位置決め処理（ブロック単位の位置決め処理）をそれぞれ実行する。位置決めミスがある場合には、解析プログラムは、画像ファイルの位置ずれを検出エリアに合わせて自動補正する。
【００７６】
予め設定した時間内に処理すべき画像ファイルが数値化できない場合は、解析プログラムは、所定回数解析処理を再試行し、再試行が所定回数を越えた場合には手動での数値化を通知すべく、当該画像についての数値化ミスを示す情報をログファイルに出力する。最後に、解析プログラムは、数値化された画像データの情報を数値化データファイル１３に出力する。
【００７７】
なお、この解析用パーソナル・コンピュータ９１は、一対のスキャナー装置７１および制御用パーソナル・コンピュータ７３に対して、複数設置され、これら複数の装置が、大量の画像ファイルを、並列に解析処理してもよい。また、一対のスキャナー装置７１および制御用パーソナル・コンピュータ７３がなくても、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１が、他の手段により読み込み可能であればよい。
【００７８】
解析定義ファイル群９３は、具体的には、解析パラメータファイル９３１と解析自動化情報定義ファイル９３３とを具備する。
【００７９】
解析パラメータファイル９３１は、次の情報を含む。
【００８０】
・ＤＮＡマイクロアレイ上のブロックおよびスポットの配列定義（行・列方向のブロック数、行・列方向のスポット数、スポットの直径など）
・ＤＮＡマイクロアレイ上のブロック、スポットの位置情報の定義
・各スポットに対する遺伝子名等の遺伝子識別情報の定義
・各スポットに対する属性の定義（例えば、「存在しないスポット」であること、「良いスポット」であること、または「悪いスポット」であることなど。なお、「見つからないスポット」など、位置決め処理時に変化する属性もある）
解析自動化情報定義ファイル９３３は、次の情報を含む。
【００８１】
・画像ファイル生成方法の指定（スキャナー装置によるスキャンに連動／非連動）
・解析対象画像ファイル名定義と数値化データ保存先の指定
・上記基準マークを用いた位置決めで用いられる基準マークの定義（基準マークの個数、最低蛍光強度、座標、認識エリア、許容位置ずれ量等）
・位置決め（アラインメント）判定用の基準パターンの定義（基準パターンの個数、最低蛍光強度、座標、許容位置ずれ量等）
・画像ファイルが存在しない場合の再試行回数（または最大待ち時間）の定義
・位置決めミス時のリトライ方法の定義（再試行回数または最大待ち時間、検出エリアの移動順および移動量等）
図３５は、本実施形態に係る試料解析装置の機能構成を示すブロック図である。図３５に示すように、本実施形態に係る試料解析装置は、上記解析プログラムを導入した解析用コンピュータ９１であって、解析画像記憶部３５１と、定義ファイル記憶部３５３と、基準マークを用いた位置決め処理部３５５と、スポット単位の位置決め処理部３５７と、ブロック単位の位置決め処理部３５９と、位置決め判定部３６１と、解析制御部３６３と、解析結果出力部３６５と、ログファイル３６７と、解析結果ファイル３６９と、解析ミス画像ファイル３７１とを具備する。解析画像記憶部３５１は、図４におけるＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を記憶する。
【００８２】
定義ファイル記憶部３５３は、図４における定義ファイル群（以下の図６における解析パラメータファイル９３１および解析自動化情報ファイル９３３）を記憶する。この定義ファイル記憶部３５３は、請求項における基準パターン情報記憶部に対応する。基準マークを用いた位置決め処理部３５５は、請求項における画像データ読み込み部を含む。基準マークを用いた位置決め処理部３５５と、スポット単位の位置決め処理部３５７と、ブロック単位の位置決め処理部３５９とは、請求項における画像データ位置決め部および補正部に対応する。位置決め判定部３６１は、請求項における判定部に対応する。解析制御部３６３および解析結果出力部３６５は、請求項における解析部に対応する。
【００８３】
なお、解析画像記憶部３５１，定義ファイル記憶部３５３，基準マークを用いた位置決め処理部３５５，スポット単位の位置決め処理部３５７，ブロック単位の位置決め処理部３５９，解析制御部３６３，位置決め判定部３６１，解析結果処理部３６５は、いずれも、図４における解析用パーソナル・コンピュータ９１に実装される。この解析用パーソナル・コンピュータ９１は、１台であってもよく、あるいは複数台をネットワークで接続して、解析コンピュータ・システムとして構成されてもよい。
【００８４】
図５は、解析用パーソナル・コンピュータ９１が出力する数値化データの一部の一例を示す。図５に示すように、数値化データは、例えば、Ｃｙ３励起波長およびＣｙ５励起波長それぞれで検出されたスポットの蛍光強度のデータとして得られる。より具体的には、数値化データ１３は、各スポットについて、次の情報を含む。
【００８５】
・検出スポットに対するフラグ
・ブロック番号
・ブロック内の行・列番号
・遺伝子名を含む遺伝子識別情報
・検出スポットの中心座標（ｘ、ｙ）
・Ｃｙ３励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ３励起波長での検出スポット周囲（背景）の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ５励起波長での検出スポットの蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・Ｃｙ５励起波長での検出スポット周囲（背景）の蛍光強度中央値、平均値、標準偏差等
・品質に関する各種データ等
次に、本実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を説明する。
【００８６】
図６は、本発明の実施形態に係る試料解析方法における試料解析処理の手順を示すフローチャートである。
【００８７】
まず、解析プログラムの初期化が実行され、処理が開始される（ステップＳ１）。次に、解析パラメータファイル９３１および解析自動化情報ファイル９３３が読み込まれる（ステップＳ３）。この解析自動化情報ファイル９３３の読み込みにより、解析画像定義ファイル名、解析パラメータファイル名、画像待ち再試行回数、画像待ち時間等が読み込まれる。解析画像定義ファイル名より、解析すべき画像と、枚数が、解析プログラム上設定される。
【００８８】
この解析すべき画像の枚数が、読み込まれた画像の総枚数（すなわち終了条件Ｅｎｄ）に到達するまで、ステップＳ５からステップＳ３５までの処理が繰り返し実行される（ステップＳ５）。
【００８９】
次に、解析すべき画像があるか否かが判定され（ステップＳ７）、解析すべき画像がない場合には（ステップＳ７Ｎ）、画像待ち再試行回数が、ステップＳ３において読み込まれ、解析プログラムに設定された回数を超えるまで、ステップＳ１１からステップＳ１５の処理を繰り返し実行する（ステップＳ１１）。さらに、解析すべき画像が有るか否かが判定され（ステップＳ１３）、解析すべき画像が有る場合には（ステップＳ１３Ｙ）、ステップＳ９に進み、一方解析すべき画像が得られない場合には（ステップＳ１３Ｎ）、画像待ち再試行回数のカウンタをインクリメントして（ステップＳ１５）、設定された回数を超えた場合は、ステップＳ３５に進む。
【００９０】
ステップＳ７に戻り、解析すべき画像がある場合には（ステップＳ７Ｙ）、解析すべきＤＮＡマイクロアレイとして対応する画像ファイルが、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から読み込まれる（ステップＳ９）。あるいは、解析すべき画像ファイルは、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１は介さずに、スキャナー装置７１および制御パーソナル・コンピュータ７３側から直接入力されてもよい。続いて、基準マークによる位置決め処理（上記基準マークを用いた位置決め処理）が実行される（ステップＳ１７）。ステップＳ１７における基準マークを用いた位置決め処理の実行後、画像データの画像処理が実行され（ステップＳ１９）、画像処理が失敗判定された場合には（ステップＳ１９Ｎ）、ステップＳ３５に進む。一方、画像処理が成功判定された場合には、画像処理後の解析すべき画像ファイルが読み込まれる（ステップＳ２１）。
【００９１】
次に、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポット単位での位置決め処理（上記スポット単位の位置決め処理）が実行され（ステップＳ２３）、さらにＤＮＡマイクロアレイ上のブロック単位での位置決め処理（上記ブロック単位の位置決め処理）が実行される（ステップＳ２５）。なお、ステップＳ２３およびステップＳ２５は、ステップＳ２１の解析画像読み込み処理の後であって、ステップＳ２７の位置決め判定の前であれば、いずれが先に実行されてもよい。
【００９２】
基準マークを用いた位置決め処理およびスポット単位の位置決め処理後に数値化された画像データに基づいて、位置決め（アラインメント）が成功したか失敗したかが判定される（ステップＳ２７）。位置決めが成功と判定されれば（ステップＳ２７Ｙ）、数値化された画像データが、数値化データファイル１３に出力され、解析すべき画像枚数のカウンタがインクリメントされる（ステップＳ３５）。一方、位置決めが失敗したと判定されれば（ステップＳ２７Ｎ）、さらに、所定の検出エリアの移動回数（または移動時間）以下であるか否かが判定され（ステップＳ３１）、所定の検出エリア移動回数に到達した場合には（ステップＳ３１Ｎ）、ステップＳ３５に進む。一方、所定の検出エリア移動回数以下である場合には（ステップＳ３１Ｙ）、ＤＮＡマイクロアレイのブロック単位での検出エリアの移動処理（補正処理）が実行され（ステップＳ３３）、ステップＳ２３のスポット単位での位置決め処理に戻る。
【００９３】
より具体的には、ステップＳ３３における検出エリアの移動（補正）処理においては、基準マークによる概略の位置決めが正しいという仮定の下、少ない移動量から例えば時計回りに徐々に大きな移動量となるよう、一対のスポットと検出エリアとの位置決めが試行されていく。
【００９４】
最後に、すべての解析すべき画像の解析終了後、解析ミスが生じた画像について、ステップＳ７からステップＳ３５までの処理を、さらに所定回数繰り返して実行してもよい（ステップＳ３７）。
【００９５】
次に、本実施形態における各位置決め処理の詳細を説明する。本実施形態の位置決め処理においては、
（１）まず、ＤＮＡマイクロアレイ上に、発光する基準マークを配置する。また、同じくＤＮＡマイクロアレイ上、基板２表面のブロック内（あるいはブロック近傍）に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置する。このＤＮＡマイクロアレイの解析自動化情報として、少なくとも基準マークと各ブロックの位置関係を示す情報、および基準パターンの配列パターンおよび各ブロックとの位置関係を示す情報は、予め登録されているものであって既知とする。
【００９６】
（２）画像上の基準マークを認識検出後、予めテンプレートの解析自動化情報として定義された基準マークの位置座標を用いて、基準マークが本来ある位置（設計位置）に画像を補正（回転・移動）することにより、予めテンプレート上各々のスポットを定義した検出エリアに概略当てはめる（基準マークを用いた位置決め処理）。その後、各スポットへのテンプレート上の各検出エリアの当てはめを実行する（スポット単位の位置決め処理）。
【００９７】
（３）スキャンされた画像上で、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの配列パターン（基準パターン）を、予めテンプレートに定義された基準パターンについてのパターン情報および位置情報を用いたパターンマッチングにより検出し、その位置の特定を行い、ブロック単位で位置決めを実行する（ブロック単位の位置決め処理）。
【００９８】
図７は、本実施形態に係る基準マークを用いた、図６のステップＳ１７における基準マークを用いた位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【００９９】
図７に示すように、本実施形態に係る基準マークを用いた解析処理部３５５は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１を読み込み（ステップＳ１７１）、予め解析自動化情報ファイル９３３から読み込んだ基準パターン認識エリアを含むテンプレートを自動認識するとともに、テンプレート上の基準パターン認識エリア内の基準パターン定義位置に、読み込まれた画像ファイルの基準パターンが一致するように、画像ファイルを解析（数値）処理し（ステップ１７３）、基準マークを位置決めする。
【０１００】
図８は、ステップＳ１７１において読み込まれた画像ファイルの一例を示す。
【０１０１】
図８に示すように、スポットが配置されたスポット領域の周辺に、本実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理に用いられる基準マークが、予め基板上配置されている。
【０１０２】
この基準マークは、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナー装置７１によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質などの蛍光性物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【０１０３】
なお、本明細書において、自家蛍光物質とは、それ自体の物性として、元々蛍光を有する物質である。この自家蛍光物質は、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。核酸吸着物質とは、それ自体の物性として蛍光は有さないが、ＤＮＡマイクロアレイに滴下するサンプル中の、蛍光標識された核酸を吸着する物質であればよいが、例えばポリアリルアミンを用いることができる。この核酸吸着物質は、蛍光標識された核酸を吸着しているため、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、蛍光シグナルを発する。ハウスキーピング・ジーンとは、元々生体内で常に一定以上の発現量を持つ遺伝子であり、それ自体の物性として蛍光は有さない。このハウスキーピング・ジーンをＤＮＡマイクロアレイにスポットしておけば、サンプル液中の蛍光標識した核酸と必ずハイブリダイゼーションを起こすので、ＤＮＡマイクロアレイをスキャンしたときに、やはり蛍光シグナルを発する。これら自家蛍光物質、核酸吸着物質、ハウスキーピング・ジーンはいずれも、ＤＮＡマイクロアレイにスポットされた場合、スキャンされた際に必ず発光する特性を有するスポットとなり、本明細書においては、これらをポジティブコントロールと称する。他方、スキャンされた際に、必ず発光しない特性を有するスポットは、本明細書において、ネガティブ・コントロールと称する。
【０１０４】
図９は、スキャナー装置７１によって読み込まれた図８の画像に対して、基準マーク認識エリアを含むテンプレートが自動認識された状態を示す。図９において、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａ中の基準マークの定義位置１０ｂと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク１０ｃとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図１０に示すように、画像ファイル中の基準マーク１０ｃとテンプレート上の基準マーク定義位置１０ｂとが一致するよう位置補正する。なお、図１０中、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａおよび基準パターンの定義位置１０ｂは、便宜上図示したものであって、実画像として可視的に表示されるものである必要はない。
【０１０５】
この基準マークを用いた位置決め処理によって、ＤＮＡマイクロアレイ全体（すなわち、アレイ上のスポット領域全体）がテンプレート全体に対して概略位置決めされる。
【０１０６】
図７に戻り、図９に示す、テンプレートの基準マーク認識エリア１０ａ中の基準マークの定義位置１０ｂと、読み込まれた画像ファイル中の基準マーク１０ｃとの位置ずれによるシフト量が計算され（ステップＳ１７５）、計算されたシフト量に基づき、図１０に示すように、画像が回転・移動される（ステップＳ１７７）。最後に、補正された画像ファイルが、補正後の画像ファイルを格納する画像ファイル１１ｂに格納される。なお、この格納先は、ステップ１７１において画像ファイルの読み込み元である画像ファイル１１であってもよい。
【０１０７】
次に、本実施形態におけるスポット単位の位置決め処理（図６におけるステップＳ２３）の詳細を説明する。
【０１０８】
図１１は、本実施形態に係る、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット単位で実行される、図６のステップＳ２３におけるスポット単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【０１０９】
図１１に示すように、本実施形態に係るスポット単位の位置決め処理部３５７は、ステップＳ２１において読み込まれた位置補正処理（画像処理）後の画像ファイル１１ｂ中の、各ＤＮＡマイクロアレイにおける各スポット画像に対して、予め解析自動化情報ファイル９３３から読み込んだテンプレートの、各スポットに対応する検出エリアへの位置決めを実行する（ステップＳ２３１）。
【０１１０】
図１３は、図６のステップＳ２１において読み込まれた位置補正後のＤＮＡマイクロアレイ画像に対して、テンプレートの各検出エリアが当てはめられた状態を示す。図１３において、テンプレートの各検出エリア１３ｂと、読み込まれた画像ファイル中の各スポットとが位置ずれしている様子が示されている。解析プログラムは、この位置ずれした状態から、図１４に示すように、画像ファイル中の各スポット画像とテンプレート上の各検出エリアとが適合するよう、スポット単位の位置決め処理部３５７が位置補正する。
【０１１１】
図１１に戻り、図１４に示す位置補正後の画像ファイルが、テンプレートの定義情報に基づいて数値化され（ステップＳ２３３）、数値化されたファイルが、数値化データファイル１３に格納される（ステップＳ２３５）。
【０１１２】
次に、本実施形態におけるブロック単位の位置決め処理（図６におけるステップＳ２５）の詳細を説明する。ブロック単位の位置決め処理部３５９によるブロック単位の位置決め処理においては、基準パターンの有するパターン配列を用いたパターンマッチングによる位置決め処理および基準パターンの位置座標を用いた位置決め処理の双方が用いられる。あるいは、これらの一方のみが実行されてもよい。
【０１１３】
図１５は、図６におけるステップ２３におけるスポット単位での位置決め処理によって、誤って位置決めされたＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルの一例を示す。図１５に示すように、スポット単位の位置決め処理においては、スポット単位での位置決めは、ＤＮＡマイクロアレイ上のブロックごとに、ブロック内のスポットに対してテンプレート上の検出エリアのブロックが適合するかを試行されることによって実行される。このため、例えばＤＮＡマイクロアレイの基板上にゴミが付着している場合などに、各スポットが適合されるべき検出エリアが誤って判断されてしまい、ブロックの位置決めの誤りが生ずることになる。ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、微細なゴミの付着による上記位置決め誤りは避けがたい。
【０１１４】
そこで、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイ上のブロック内に、ブロック単位の位置決めを調整するための基準パターンを予め配置し、このスポット単位の位置決め処理によって生ずる位置決め誤りを調整する。
【０１１５】
図１２は、本実施形態において用いられるＤＮＡマイクロアレイの一例を示す。図１２に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ１上には、複数のブロック群１ｂが配置される。各ブロック内には、遺伝子がスポットされているが、本実施形態においては、各ブロック内に、必ず発光するスポットであるポジティブ・コントロールおよび必ず発光しない（光ってはおかしい）スポットであるネガティブ・コントロールとを配置する。これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールは、通常、ハイブリダイゼーション工程が異常なく処理されたか否かを判断するための標識（マーカー）として使用される。本実施形態では、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせでなる基準パターンを形成する。この基準パターンを、プローブである遺伝子を固定するスポットをマトリクス状に形成した各ブロック内に配置することによって、ブロック単位の位置決め処理におけるブロック単位の位置決めの基準パターンとする。このブロックは、請求項におけるスポットサブ領域に対応する。
【０１１６】
なお、このポジティブ・コントロールは、上記基準マークと同様、ＤＮＡマイクロアレイをスキャナー装置７１によりスキャンした際に、蛍光シグナルを発する物質によるマークであればよく、例えば、自家蛍光物質、核酸吸着物質、あるいはハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部にハウスキーピングジーン若しくはその断片を含む核酸を用いることができる。
【０１１７】
具体的には、図１２の１ｃで示されるように、各ブロック内にポジティブ・コントロールを配置し、その周囲に、１ｄで示されるように、ネガティブ・コントロールを配置する。この基準パターンは、ブロック内の一角に設けられてもよく、あるいはブロック内の任意の位置に設けられてもよい。または、必要に応じて、スポット領域を構成するブロック外であってその近傍に設けられてもよい。このブロック内に配置されたポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターン配列およびその位置座標の情報は、予めテンプレートに関する属性情報の１つとして、解析自動化情報ファイル９３３に登録されている。ブロック単位の位置決め処理においては、これらポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの蛍光強度および位置座標の判定を実行することによって、各ブロック内のスポットの位置を特定することができる。
【０１１８】
ブロック内のある基準パターンの下に、さらに、ネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる他のパターンを配置してもよく、あるいは、ブロック内のあるパターンに対し、ブロックの対角線上にネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールの他のパターンを配置してもよい。１つのブロック内にこのような他のパターンをさらに配置して基準パターンを複数にすることによって、ＤＮＡマイクロアレイに付着するゴミなどに起因する誤判定を低減することができる。
【０１１９】
一方、１つのＤＮＡマイクロアレイによってより多くの遺伝子を解析するという観点からは、このネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールからなる基準パターンが占有する領域は少ないことが望ましい。
【０１２０】
図１８乃至図２３は、本実施形態におけるこのネガティブ・コントロールで囲まれたポジティブ・コントロールのパターンの配置例を示す。なお、図１８乃至図２３において、ブロック内のポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロール以外は、すべて他の遺伝子がスポットされているものとする。また、ブロック単位の位置決め処理における位置決め（アラインメント）成功の判定基準は、ポジティブ・コントロールの蛍光強度が設定された最低蛍光強度以上であって、ポジティブ・コントロール座標が予めテンプレートの属性として設定された閾値以下とする。
【０１２１】
図１８においては、ブロック１ｂを跨って１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり９個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が１個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２２】
図１９においては、ブロック１ｂを跨って、離隔した２つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり１５個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２３】
図２０においては、ブロック１ｂを跨って、１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されているとともに、ブロック内の対角位置に、１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり１６個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。図２０に示すパターンは、図１８のパターンと比較して、ブロックのθずれの検出が強化されている。
【０１２４】
図２１乃至図２３は、ブロック１ｂ間のピッチが、スポット間隔のピッチより２倍以上離れて配置されている（すなわち、ブロック１ｂ間にスポット一個分１eに相当する間隔がある）。
【０１２５】
図２１においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり４個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が１個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２６】
図２２においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されているとともに、その対角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり８個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、２個のポジティブコントロールと同じ配置で計２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２７】
図２３においては、ブロック１ｂは、隣接するブロック１ｂと、最低スポット１個分の間隔をもって配置されている。四隅のうち１つの角に配置された１つのポジティブ・コントロール１ｃおよびこれと離隔した他の１つのポジティブ・コントロールの周囲にネガティブ・コントロール１ｄが配置されており、必要なポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの数は１ブロックあたり８個となる。このパターンを使用した場合、ポジティブ・コントロールの周辺に、最低蛍光強度以上を有するゴミ等が、２個のポジティブコントロールと同じ配置で計２個以上存在すると、これをポジティブ・コントロールであると誤認識することになる。
【０１２８】
図２１乃至図２３から理解されるように、ブロック１ｂの間隔を、ブロック内のスポット間隔の２倍以上のピッチとすると、ポジティブ・コントロールの周囲を、ブロックを跨いでネガティブ・コントロールで囲む必要がなくなる。このため、より少ないポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数でブロックの位置の特定が可能となる。
【０１２９】
上記図１８乃至図２３においては、いずれも、ポジティブ・コントロールの周囲をネガティブ・コントロールが取り囲む配置であるが、本実施形態においてこの配置を用いるのは、次の理由による。すなわち、例えば図１６に示すように、ネガティブ・コントロールが配置されておらず、ポジティブ・コントロールが１個のみ配置されているブロック、ポジティブ・コントロールが２個並んで配置されているブロック、およびポジティブ・コントロールが対角に２個配置されているブロックとの配置を想定する。図１７は、この図１６の配置に対して、解析プログラムによるテンプレート上の検出エリアのブロック単位の位置決め処理が実行された後の状態を示す。このブロック単位の位置決め処理後の合否判定においては、
（１）まず、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の蛍光強度の判定においては、閾値以上の蛍光強度を持つＤＮＡが存在するため、合格となる。
【０１３０】
（２）次に、ポジティブ・コントロールとして判定するスポット場所の位置の判定においては、位置座標の許容ずれ量以上であるので、不合格となる。
【０１３１】
しかしながら、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの間隔が微細化しているため、スポットの配置精度、スキャナー装置７１の読み取り精度、ハイブリダイゼーション後のスポット形状等からスポットの間隔と、位置座標の許容ずれ量とが近似してきている。このため、実際には、不合格となるように位置座標の許容ずれ量の設定をすると、本来は合格が判定されるべき位置決め（アラインメント）であっても不合格となってしまい、正確な位置決め合否判定が成立しない。
【０１３２】
一方、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで取り囲む本実施形態に係る配置パターンを用いれば、位置座標の許容ずれ量を、スポットの間隔の２倍以上に設定できる。このため、有意かつ正確な位置決め合否判定を実現することができる。なお、（１）および（２）の判定を用いず、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールのパターンマッチングによる判定のみでも、位置決め後のパターンとテンプレート上のパターンとが同じパターン配列を持たない限り、位置決め合格が判定されないので、有効である。
【０１３３】
また、例えば、スポットの位置精度、機械精度などにより許容ずれ量が３倍ピッチ分しか設定できない場合には、図３４に示すように、ポジティブ・コントロールをネガティブ・コントロールで二重に取り囲む構成が好ましい。画像への検出エリアの当てはめでたまたま同じ蛍光強度の配列を持つＤＮＡのスポット配列があって、誤認識された場合、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの合格が判定されたとしても、位置座標の判定によって、位置決め不合格であることを正しく判定することができる。
【０１３４】
なお、本実施形態における上記解析処理と、上記のＤＮＡマイクロアレイとは、必ずしも併用されることを要するものではなく、上記のＤＮＡマイクロアレイは、本実施形態に係る解析プログラム以外の解析プログラムに用いられてもよい。
【０１３５】
図２４は、本実施形態に係る、ＤＮＡマイクロアレイ上のポジティブ・コントロールとネガティブ・コントロールとの配列パターンによって、ブロック単位で実行される、図６のステップＳ２５におけるブロック単位の位置決め処理の詳細を説明するフローチャートである。
【０１３６】
図２４に示すように、本実施形態に係るブロック単位の位置決め処理部３５９は、ステップＳ２１において読み込まれた位置補正処理（画像処理）後の画像ファイル１１ｂを読み込む（ステップＳ２５１）。次に、予めテンプレート上に定義された、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの基準パターンと、画像ファイルとのパターンマッチングが実行される（ステップＳ２５３）。あるいは、このステップＳ２５３において、パターンマッチングとともに、あるいはパターンマッチングに換えて、位置座標の判定が用いられてもよい。
【０１３７】
このパターンマッチングの結果、算出されたシフト量に基づいて、検出エリアへのブロック画像の当てはめが試行され、ブロック画像が位置決めされる（ステップＳ２５５）。このブロック単位の位置決めに基づき、画像ファイルが数値化され（ステップＳ２５７）、数値化されたデータが、数値化データファイル１３に格納される（ステップＳ２５９）。
【０１３８】
次に、本実施形態における位置決め判定部３６１が行う位置決め成否の判定処理の詳細を説明する。
【０１３９】
すなわち、上記基準マークを用いた位置決め処理、スポット単位の位置決め処理およびブロック単位の位置決め処理の完了後、それぞれのスポットの数値化（解析）を実行し、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度、位置座標の判定が実行され、これによって、位置決めが正しく実行されたか否かが判定される。
【０１４０】
図２５は、このそれぞれのスポットが数値化された後のデータの一例を示す。
【０１４１】
図２５において、Ｐｎは注目するスポット（例えばポジティブ・コントロール）を示す。ＩｎはＰｎの蛍光強度を示す。（ｘｎ，ｙｎ）はＰｎの画像上の実座標を示す。（Ｘｎ，Ｙｎ）はＰｎの設計上の座標を示す。ｎは１〜Ｚの自然数である。
【０１４２】
（１）ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの個数と蛍光強度を用いた判定方法
次の条件がすべて満たされたとき、個数と蛍光強度の判定は合格であるとする。
【０１４３】
・個数の判定を行うポジティブ・コントロールをＰｎとするとき、その個数はＺである。
【０１４４】
・個数の判定を行うネガティブ・コントロールをＰｎとしたとき、その個数はＺである。
【０１４５】
・判定を行うポジティブ・コントロールをＰｎとして数値化データより抽出したとき、ｎ＝１〜Ｚに対し、最低ポジティブ・コントロール蛍光強度≦Ｉｎを満たす。
【０１４６】
・判定を行うネガティブ・コントロールをＰｎとして数値化データより抽出した場合、ｎ＝１〜Ｚに対し、Ｉｎ≦最大ネガティブ・コントロール蛍光強度を満たす。
【０１４７】
（２）位置座標の判定方法
次の判定方法の双方または一方が用いられて判定される。
【０１４８】
・絶対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをＰｎとして、ｎ＝１〜Ｚに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【０１４９】
（｜Ｘｎ−ｘｎ｜≦ｘ方向許容ずれ量）かつ、（｜Ｙｎ−ｙｎ｜≦ｙ方向許容ずれ量）
・相対座標による判定
位置座標の判定を行うスポットをＰｎとして、Ｐ１を基準とする。ｎ＝１〜Ｚに対し、次の条件を満たす場合に、位置座標の判定を合格とする。
【０１５０】
（｜ｘｎ−ｘ１｜≦｜Ｘｎ−Ｘ１｜＋ｘ方向許容ずれ量）かつ、（｜ｙｎ−ｙ１｜≦｜Ｙｎ−Ｙ１｜＋ｙ方向許容ずれ量）
解析結果出力部３６５は、上記の位置決め判定処理（図６のステップＳ２７）の結果、位置決めの成功が判定された数値化データを、数値化データファイル１３に保存する。一方、所定の再試行回数の位置決めによっても成功判定が得られなかった画像については（図６のステップＳ３５）、解析結果出力部３６５は、成功判定が得られなかった旨を示す情報をログファイル３６７に出力するとともに、成功判定が得られなかった画像をミス画像として解析ミス画像ファイル３７１に出力する。この解析ミス画像は、人間の視認による位置決め処理に供される。解析制御部３６３は、必要に応じて、基準マークを用いた位置決め処理部３５５，スポット単位の位置決め処理部３５７，ブロック単位の位置決め処理部３５９，位置決め判定部３６１，解析結果出力部３６５を呼び出して実行することにより、図６における一連の解析処理全体を実行する。
【０１５１】
次に、図２６乃至図３２を参照して、本実施形態に係る解析処理における画面表示の一例を説明する。
【０１５２】
図２６は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から入力される、スキャン画像の画像認識処理が実行中である画面表示の一例を示す。サブウインドウ２６３に示されているように、スキャン画像中のスポット領域外部、左右に配置された基準マークの位置座標が表示され、この基準マークの位置座標に基づき、スキャン画像の認識処理（画像処理）において、回転移動（θ方向補正）が実行中である旨のメッセージが表示されている。なお、手動による回転角算出ボタン２６５，手動回転処理ボタン２６７が提供されている。
【０１５３】
図２７は、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル１１から読み込まれたスキャン画像のイメージ表示の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイのブロック内に、ポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールを含む、それぞれの蛍光強度のスポットが配置されている。
【０１５４】
図２８は、図２７の表示された画像イメージに対して、解析パラメータファイル９３１に登録されたテンプレートの検出エリアが呼び出された状態の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイ画像イメージ内の各スポット画像と、テンプレート上の各検出エリアとが位置ずれしている。
【０１５５】
図２９は、本実施形態によらない場合の、図２８の画像に対する位置決め後の状態の一例を示す。θ方向ずれ量や、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれ量が大きい場合、正しい位置決めが行われず、検出エリアの位置決めが誤っている様子が示されている。本実施形態によらなければ、この図２９の状態から、人手で視認によって１つずつ検出エリアをずらしながら画像に当てはめる修正操作を繰り返し行う必要がある。
【０１５６】
図３０は、本実施形態におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによりなる基準パターンを用いない場合の、位置決め後の状態の一例を示す。ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間のピッチの微細化に伴い、スポットのピッチに対してスポットの位置精度が近づいているために、単に検出エリアの位置座標データによる判定では各スポットに各検出エリアが正しく当てはめられているか否かの判断が困難になる。本実施形態によらない場合、この図３０の状態から、各ブロック画像を拡大表示して、全体のバランスを人間が判断して検出エリアが正しく当てはめられているか否かを確認していた。
【０１５７】
図３１は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン３１１を配置した場合に、なお位置決め誤りを起こした状態の一例を示す。例えば、ＤＮＡマイクロアレイ上に大きなブロックを配置しなければならない場合は、θ方向ずれの影響が生じやすく、ブロック上、一角のみに基準パターンを配置しただけでは、基準パターン判定およびその位置座標による判定（ブロック単位の位置決め）において、位置決め誤りであるにもかかわらず、位置決め成功と判定されてしまう。この場合、例えば対角の３１３の位置にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンを配置すれば、正確な位置決め判定を行うことができる。
【０１５８】
図３２は、本実施形態において、ブロックの一角のみにポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールの組み合わせによる基準パターン３１１を配置した場合に、位置決め判定が成功した状態の一例を示す。ブロック上の一角にポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターンが配置されている。
【０１５９】
図３３は、本発明の実施形態に係る試料解析装置および試料解析システムのハードウエア構成を示すブロック図である。
【０１６０】
本発明の実施形態に係る試料解析装置は、例えば、図３３に示される構成を有する。すなわち、本発明の実施形態に係る試料解析装置は１つまたは複数のコンピュータシステム内に試料解析処理の各要素を内蔵することにより構成される。
【０１６１】
図３３に示すように、コンピュータシステム１００は、マイクロプロセッサのような中央演算処理装置１１０およびシステムバス１１２を介して相互に接続される他の多くのユニットからなる。このコンピュータシステムは、ランダムアクセスメモリ１１４と、リードオンリーメモリ１１６と、ハードディスク装置１２０などのような周辺装置をシステムバス１１２に接続するＩ／Ｏアダプタ１１８と、キーボード１２４，マウス１２６，スピーカ１２８、マイク１３２あるいはタッチスクリーン（図示せず）等のユーザーインターフェース装置をシステムバス１１２に接続するユーザーインターフェースアダプタ１２２と、通信ネットワークへこのコンピュータシステムを接続する通信アダプタ１３４と、表示装置１３８をシステムバス１１２に接続するディスプレーアダプタ１３６と、フレキシブルディスク１４４，光ディスク１４６および各種メモリカード１４８をそれぞれ駆動する外部ディスクドライバー１４２とを具備する。
【０１６２】
これらフレキシブルディスク１４４，光ディスク１４６および各種メモリカード１４８などに代表されるコンピュータ読み取り可能な各種の記憶媒体に、本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための解析プログラムを格納し、外部ディスクドライバーを介してこれらの記憶媒体からの所定の読み出し操作を行うことにより、これらの記憶媒体に格納された本実施形態に係る試料解析処理の各機能を実行するための試料解析プログラムをコンピュータシステム内にインストールすることができる。これらのプログラムをランダムアクセスメモリ１１４にロードし、中央演算処理装置１１０で実行することにより、本実施形態に係る試料解析処理が実現される。なお、上記試料解析プログラムは、１つのコンピュータ上で実行されてもよく、複数のネットワーク接続されたコンピュータ上で実行されてもよい。複数のコンピュータ上で実行される場合には、それぞれのコンピュータ上で稼働するモジュールが、これを記憶する記憶媒体によりそれぞれのコンピュータにロードされる。
【０１６３】
本実施形態によれば、以下の効果が得られる。すなわち、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。特に、ＤＮＡマイクロアレイ上のスポット間隔の微細化に伴い、人手による位置決め処理は困難となっていることから、本実施形態により、試料解析の一連の処理におけるボトルネックが大きく解消される。
【０１６４】
さらに、スキャニング工程から解析工程を経て、所望の解析データを得るまでの工程を、無人で連続的に実行可能にすることによって、並列的な解析処理を可能とし、解析処理の省力化および迅速化が図られる。
【０１６５】
なお、本実施形態においては、ＤＮＡマイクロアレイにＤＮＡがスポットされた実施形態として説明したが、これに限定されない。本実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイは、例えば、ＲＮＡ、蛋白質など、特異的に結合する生体分子にも適用可能であり、ＤＮＡに限定されるものではない。
【０１６６】
なお、本発明はここでは記載していない様々実施の形態等を包含するということは十分に理解すべきである。したがって、本発明はこの開示から妥当な特許請求の範囲に係わる発明特定事項によってのみ限定されるものでなければならない。
【０１６７】
【発明の効果】
本発明によれば、ＤＮＡマイクロアレイの解析において、ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイルへの検出エリアの位置決め処理および位置決め成否の判定処理を定量的、自動的、かつ高精度に実行可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡマイクロアレイを用いた試料解析の一連の工程を示す概略図である。
【図２】ＤＮＡマイクロアレイの一例を示す斜視図である。
【図３】試料解析工程において用いられるテンプレートの検出エリアの配置の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示すブロック図である。
【図５】本発明の実施形態に係る試料解析装置により数値化された画像データの一例を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る試料解析方法の概略処理手順を示すフローチャートである。
【図７】図６におけるステップＳ１７の基準マークを用いた位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図８】本発明の実施形態に係る試料解析装置により読み込まれたＤＮＡマイクロアレイの画像イメージの一例を示す図である。
【図９】図８の画像イメージに、定義ファイル記憶部３５３に記憶されたテンプレートがオーバーラップした状態を示す図である。
【図１０】図９の画像が、本発明の実施形態に係る基準マークを用いた位置決め処理部３５５によって位置決めされた後の状態を示す図である。
【図１１】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図１２】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの配置の一例を示す図である。
【図１３】図６におけるステップＳ２１で、スポット単位の位置決め処理部３５７によって読み込まれた画像の一例を示す図である。
【図１４】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理後の、図１３の画像の一例を示す図である。
【図１５】図６におけるステップＳ２３のスポット単位の位置決め処理後の、図１３の画像の他の一例を示す図である。
【図１６】本発明の実施形態に係る、ポジティブ・コントロールを配置したスポット領域を有するＤＮＡマイクロアレイのブロックの一例を示す図である。
【図１７】図１６のブロックが、誤って位置決めされた状態の一例を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の一例を示す図である。
【図１９】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２０】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２１】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２２】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２３】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイのブロック中におけるポジティブ・コントロールおよびネガティブ・コントロールからなる基準パターン配置の他の一例を示す図である。
【図２４】図６におけるステップＳ２５のブロック単位の位置決め処理における処理手順の詳細を示すフローチャートである。
【図２５】本発明の実施形態における位置決め判定処理を説明する図である。
【図２６】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、画像処理画面イメージの一例を示す図である。
【図２７】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、ＤＮＡマイクロアレイのスキャン画像の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図２８】図２７のスキャン画像に対して、テンプレートの検出エリアが呼び出された状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図２９】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図３０】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図３１】本発明の実施形態によらずに、誤った位置決めがされた状態の表示画面イメージの他の一例を示す図である。
【図３２】本発明の実施形態に係る解析制御部３６３が提供する、位置決め判定処理が成功した場合の表示画面イメージの一例を示す図である。
【図３３】本発明の実施形態に係る制御用パーソナル・コンピュータ７３および解析用パーソナル・コンピュータ９１のハードウエア構成の一例を示す図である。
【図３４】本発明の実施形態に係るＤＮＡマイクロアレイ上の基準パターンの配置の他の例を示す図である。
【図３５】本発明の実施形態に係る試料解析装置のハードウエア構成の一例を示す図である。
【符号の説明】
１ ＤＮＡマイクロアレイ
１ａ スポット領域
１ｂ ブロック
１ｃ ポジティブ・コントロール
１ｄ ネガティブ・コントロール
１１ ＤＮＡマイクロアレイ画像ファイル
１３ 数値化データファイル
７１ スキャナー装置
７３ 制御用パーソナル・コンピュータ
９１ 解析用パーソナル・コンピュータ
９３ 定義ファイル
３５１ 解析画像記憶部
３５３ 定義ファイル記憶部
３５５ 基準マークを用いた位置決め部
３５７ スポット単位の位置決め部
３５９ ブロック単位の位置決め部
３６１ 位置決め判定部
３６３ 解析制御部
３６５ 解析結果出力部
３６７ ログファイル
３６９ 解析結果ファイル
３７１ 解析ミス画像
Claims (13)
- 基板と、
前記基板表面に、光学的に検出可能に標識されている試料と特異的に反応可能なプローブを固定するスポットがマトリクス状に形成されたスポット領域を複数にブロック化してなるスポットサブ領域と、
前記スポットサブ領域内にそれぞれ配置され、前記試料の解析において、前記スポットの位置ずれを補正するための複数の異種の位置マークからなる基準パターン領域とを具備する
ことを特徴とするプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットおよび必ず発光しないスポットの組み合わせによりなる
ことを特徴とする請求項１に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である
ことを特徴とする請求項２に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、核酸吸着物質である
ことを特徴とする請求項２に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域中の前記必ず発光するスポットは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である
ことを特徴とする請求項２に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準パターン領域は、必ず発光するスポットの周囲に複数の必ず発光しないスポットが配置されてなる
ことを特徴とする請求項２に記載のプローブ反応性チップ。 - 上記プローブ反応性チップは、さらに、
前記基板表面上の前記スポット領域外に配置された、前記スポット領域の位置ずれを補正するための基準マークを具備する
ことを特徴とする請求項１に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、所定の蛍光強度以上で発光する蛍光性物質である
ことを特徴とする請求項７に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、核酸吸着物質である
ことを特徴とする請求項７に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、ハウスキーピングジーン、該ハウスキーピングジーンの断片、またはその塩基配列の一部に前記ハウスキーピングジーン若しくは前記断片を含む核酸のうち、いずれか１つ以上である
ことを特徴とする請求項７記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、複数の必ず発光するスポット、または必ず発光するスポットと必ず発光しないスポットとの組み合わせ配列からなる
ことを特徴とする請求項７に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記基準マークは、チップの種別、製作ロット識別子を含む、チップ固有の情報を示す
ことを特徴とする請求項７に記載のプローブ反応性チップ。 - 前記スポットサブ領域は、隣接する他のスポットサブ領域と、前記スポットサブ領域内に配置されるスポット領域内の各スポット間隔の少なくとも２倍以上の間隔をもって配置される
ことを特徴とする請求項１に記載のプローブ反応性チップ。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002259338A JP3670260B2 (ja) | 2002-02-14 | 2002-09-04 | プローブ反応性チップ |
| EP03250911A EP1336662A3 (en) | 2002-02-14 | 2003-02-14 | Dna chip, sample analysis apparatus and method thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002037418 | 2002-02-14 | ||
| JP2002-37418 | 2002-02-14 | ||
| JP2002259338A JP3670260B2 (ja) | 2002-02-14 | 2002-09-04 | プローブ反応性チップ |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005036900A Division JP4280720B2 (ja) | 2002-02-14 | 2005-02-14 | 試料解析装置および試料解析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003307518A JP2003307518A (ja) | 2003-10-31 |
| JP3670260B2 true JP3670260B2 (ja) | 2005-07-13 |
Family
ID=27624616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002259338A Expired - Fee Related JP3670260B2 (ja) | 2002-02-14 | 2002-09-04 | プローブ反応性チップ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1336662A3 (ja) |
| JP (1) | JP3670260B2 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7072500B2 (en) * | 2004-05-07 | 2006-07-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Image locking system for DNA micro-array synthesis |
| JP5184353B2 (ja) * | 2005-07-20 | 2013-04-17 | コーニング インコーポレイテッド | ラベルフリーハイスループット生体分子スクリーニングシステム及び方法 |
| JP4711125B2 (ja) | 2005-09-27 | 2011-06-29 | 横河電機株式会社 | バイオチップ、バイオチップ読み取り装置、およびバイオチップ読み取り方法 |
| JP5092405B2 (ja) * | 2006-01-12 | 2012-12-05 | 東レ株式会社 | 選択結合性物質固定化担体 |
| WO2008096318A2 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Identification system |
| JP2008256428A (ja) * | 2007-04-03 | 2008-10-23 | Intec Systems Institute Inc | マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法 |
| JP5205798B2 (ja) | 2007-04-27 | 2013-06-05 | 富士通株式会社 | マイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法 |
| CN102459641B (zh) * | 2009-06-16 | 2014-10-15 | 东洋钢钣株式会社 | 微阵列中的探针定位方法 |
| JP5817378B2 (ja) | 2011-01-28 | 2015-11-18 | 東レ株式会社 | マイクロアレイの解析方法および読取り装置 |
| PL2864765T3 (pl) * | 2012-06-22 | 2021-10-11 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Sposób i urządzenie do wykrywania analitu w płynie ustrojowym |
| CA3178433A1 (en) * | 2012-09-28 | 2014-04-03 | Vibrant Holdings, Llc | Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis |
| JP2014226055A (ja) * | 2013-05-20 | 2014-12-08 | 株式会社ニコン | 検出方法、検出装置、スクリーニング方法、スクリーニング装置、及びバイオチップ |
| JP2015194379A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | 株式会社ニコン | バイオチップ及びバイオチップにおけるアライメントマークの検出方法 |
| JP6459438B2 (ja) * | 2014-11-27 | 2019-01-30 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キット |
| WO2016103473A1 (ja) * | 2014-12-26 | 2016-06-30 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 核酸分析用基板、核酸分析用フローセルおよび核酸分析装置 |
| WO2017179085A1 (ja) * | 2016-04-13 | 2017-10-19 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | マイクロアレイにおけるプローブの位置決定方法、及び標識反応用キット |
| EP3281701B1 (en) * | 2016-08-10 | 2021-07-14 | Roche Diagnostics GmbH | Plate with wells for chemical or biological reactions, and method for multiple imaging of such a plate by means of an imaging system |
| JP2018049034A (ja) * | 2017-12-18 | 2018-03-29 | 株式会社ニコン | 検出方法、検出装置、スクリーニング方法、スクリーニング装置、及びバイオチップ |
| JP2018124289A (ja) * | 2018-04-10 | 2018-08-09 | 株式会社ニコン | バイオチップ及びバイオチップにおけるアライメントマークの検出方法 |
| JP7091164B2 (ja) * | 2018-06-27 | 2022-06-27 | 株式会社日立ハイテク | 核酸分析用基板、核酸分析用フローセル、及び解析方法 |
| WO2020145124A1 (ja) * | 2019-01-09 | 2020-07-16 | 株式会社日立ハイテク | 核酸分析用基板、核酸分析用フローセル、及び画像解析方法 |
| CN117036248A (zh) * | 2019-10-01 | 2023-11-10 | 10X基因组学有限公司 | 用于识别组织样品中的形态学模式的***和方法 |
| EP4062373A1 (en) * | 2019-11-21 | 2022-09-28 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of analytes |
| CA3158891A1 (en) | 2019-11-22 | 2021-05-27 | Neil Ira WEISENFELD | Systems and methods for spatial analysis of analytes using fiducial alignment |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6027880A (en) * | 1995-08-02 | 2000-02-22 | Affymetrix, Inc. | Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis |
| EP1002297A1 (en) * | 1997-08-07 | 2000-05-24 | Imaging Research, Inc. | A digital imaging system for assays in well plates, gels and blots |
| EP1206315A2 (en) * | 1999-02-09 | 2002-05-22 | Illumina, Inc. | Arrays comprising a fiducial and automated information processing in randomly ordered arrays |
| US6362004B1 (en) * | 1999-11-09 | 2002-03-26 | Packard Biochip Technologies, Llc | Apparatus and method for using fiducial marks on a microarray substrate |
| WO2002072889A2 (en) * | 2001-01-12 | 2002-09-19 | Applera Corporation | Methods and compositions for microarray control |
| WO2003030620A2 (en) * | 2001-10-12 | 2003-04-17 | Vysis, Inc. | Imaging microarrays |
-
2002
- 2002-09-04 JP JP2002259338A patent/JP3670260B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-02-14 EP EP03250911A patent/EP1336662A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1336662A2 (en) | 2003-08-20 |
| EP1336662A3 (en) | 2004-02-18 |
| JP2003307518A (ja) | 2003-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4280720B2 (ja) | 試料解析装置および試料解析方法 | |
| JP3670260B2 (ja) | プローブ反応性チップ | |
| CN109416323B (zh) | 具有反射基准的***和方法 | |
| US7200254B2 (en) | Probe reactive chip, sample analysis apparatus, and method thereof | |
| EP1048723B1 (en) | Biochip and method of using biochip | |
| US7130458B2 (en) | Computer software system, method, and product for scanned image alignment | |
| US7206439B2 (en) | Feature locations in array reading | |
| TWI425443B (zh) | 解析處理方法及裝置 | |
| US20030152255A1 (en) | Probe reactive chip, apparatus for analyzing sample and method thereof | |
| US6733968B2 (en) | Microarray, method for producing the same, and method for correcting inter-pin spotting amount error of the same | |
| CN109414673B (zh) | 具有响应于多个激发频率的基准的***和方法 | |
| EP1227311B1 (en) | Imaging method | |
| CN109416324B (zh) | 利用非闭合形状的基准的***和方法 | |
| US20050186670A1 (en) | Method of detecting error spot in DNA chip and system using the method | |
| JP3537752B2 (ja) | バイオチップを用いたハイブリダイゼーション反応の実験結果表示方法及び実験誤差評価方法 | |
| CN109416322B (zh) | 具有偏移布局的基准的***和方法 | |
| EP3577440B1 (en) | System and method with fiducials in non-rectilinear layouts | |
| JP2007017282A (ja) | 生体情報処理装置および生体情報処理方法、学習装置および学習制御方法、プログラム並びに記録媒体 | |
| KR20240025515A (ko) | 선형 푸리에 기점 | |
| CN117545555A (zh) | 线性傅里叶基准 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20040419 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041214 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050214 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050405 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050413 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090422 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100422 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100422 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110422 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110422 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120422 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120422 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130422 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140422 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |