JP3652526B2 - プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法 - Google Patents
プロテアーゼ、これを生産する微生物及び当該プロテアーゼの製造法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱変性コラーゲン(ゼラチン)及び未変性可溶化コラーゲンに対し限定分解活性を示す新規なプロテアーゼ、これを生産する微生物及びこのプロテアーゼの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
熱変性コラーゲンたるゼラチンは、ゲル化剤、起泡剤、増粘剤等として食品、化粧品等に広く用いられ、また、医薬のカプセルとしても用いられている。一方、コラーゲンは、エラスチンとともに動物の結合組織を構成する繊維状タンパク質であり、食品、化粧品、医薬品、塗料、プラスチック材料等の用途がある。
【0003】
ゼラチンやコラーゲンは、分子量が通常10万〜30万程度であり、通常の消化ゼラチンや消化コラーゲンは分子量が1万以下である。
【0004】
しかしながら、上記の如き多種多様な用途を考慮すると、所望の性質、例えば、低抗原性、易溶解性、低ゲル化強度、易フィルム形成性、易包接性等をもつものが要求され、このため分子量が上記以外のものが求められる。
【0005】
従来、ゼラチンやコラーゲンを分解し、より低分子量のものとするには、プロテアーゼやコラゲナーゼが用いられ、これら酵素は、アクロモバクター イオファーガス(Achromo-bactor iophagus)やクロストリジューム ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)を培養することにより得られることが知られている。
【0006】
しかしながら、これらの微生物は病原性が確認されており、かつ嫌気的条件下で培養しなければならない等の問題点があり、これらの微生物から大量の酵素を得るためには、煩雑な操作が必要であった。また、これら微生物から得られる酵素は、ゼラチンやコラーゲンを最小単位(分子量数100〜数1000)まで分解してしまい、適度の分子量を持つゼラチンやコラーゲンの分解物を得ることができないものであった。
【0007】
また、小腸由来のコラゲナーゼも知られているが、このものは高価であり、かつ、これを得るためには、煩雑な操作が必要で、多量に調整する事は困難であるため、これを用いることは工業的に有利な方法とは言い難いものであった。更にこのコラゲナーゼは、コラーゲンを分子量数100〜数1000に分解してしまうものであった。
【0008】
従って、本発明の目的は、適度な分子量のゼラチンやコラーゲンの分解物を製造するための酵素、この酵素を産生する微生物及び当該酵素の製造法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
斯かる実情において、本発明者は、ゼラチン及びコラーゲンを適度な分子量のペプチドに分解する酵素を自然界に求め鋭意探索した結果、分子量約13万のゼラチン及びコラーゲンを分子量約7万と約4万のペプチドに分解する酵素を産生する微生物を土壌中に見出し、本発明を完成した。
【0010】
すなわち本発明は、次の酵素学的性質を有するプロテアーゼ、これを産生する微生物、この微生物を利用した当該プロテアーゼの製造法を提供するものである。
【0011】
(1)作用
分子量約13万の熱変性コラーゲン及び分子量約30万の未変性可溶化コラーゲンを分子量約7万と分子量約4万のペプチドに分解する限定分解活性を示すが、コラゲナーゼ基質であるDNP−Pro−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argの合成基質に対してはわずかに分解活性を示し、DNP−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argの合成基質に対しては、分解活性を示さない。また、アゾコール及びカゼインに対して分解活性を示す。なお、ここでDNPはジニトロフェニル基を示し、DはArgがD体であることを示す。
(2)至適pH
pH5.5〜7
(3)至適温度
37〜40℃
(4)分子量
23,000±2,000(SDS−PAGEによる)
(5)酵素阻害
o−フェナントリン、L−システインにより活性阻害を受けるが、エチレンジアミン四酢酸、N−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミドによる活性阻害は少ない。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明のプロテアーゼは、例えばオウレオバクテリウム(Aureobacterium)属に属するプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。
【0013】
斯かるオウレオバクテリウム属に属する本発明プロテアーゼ生産菌としては、上記の本発明プロテアーゼを生産するものである限り特に制限されないが、例えば次の菌学的性質を示すMIM−CG−9535−I株が挙げられる。
【0014】
(1)形態
細胞の大きさ 0.4〜0.6×0.6〜3μm
細胞の形 短桿〜桿菌
細胞の多形性 あり
運動性の有無 なし
べん毛の有無 なし
グラム染色性 陽性
【0015】
(2)各培地における生育状況
肉汁寒天平板培養 コロニー円形、光沢あり、黄色、半球状
肉汁寒天斜面培養 画像状に生育、光沢黄色コロニー
肉汁液体培地 均一に濁る
肉汁ゼラチン培地 液化
リトマス・ミルク ピンクに変色、2層分離
【0016】
(3)生理学的性質
硝酸塩の還元 −
VPテスト −
インドールの生成 −
IPA反応 −
硫化水素の生成 −
色素の生成 −
ウレアーゼ −
(クリステンゼン培地) −
オキシダーゼ −
生育の範囲
温度 20〜35℃(至適温度28℃)
pH 5.5〜10.0(至適pH7.0付近)
酵素に対する態度 好気的
OFテスト 酸化
ガスの生成
(クリグラー培地) −
アシルアミダーゼ −
DNase +
耐塩性 NaCl 10%未満
運動性 −
【0017】
糖から酸の生成
グルコース 嫌気的 −
好気的 +
マルトース +
キシロース −
マンニトール −
乳糖分解 −
デカルボキシラーゼ反応
リジン −
オルニチン +
アルギニン加水分解試験 −
クエン酸の利用 −(生育せず)
【0018】
炭素源の資化
D−グルコース +
L−アラビノース −
D−キシロース −
D−ガラクトース +
D−フルクトース +
D−マンニトール −
D−ソルビトール −
D−ラムノース −
D−ソルボース −
L−アルギニン −
L−オルニチン −
L−スレオニン −
D−バリン −
酢酸 −
尿酸 ±
マロン酸 −
コハク酸 +
クエン酸 −
マレイン酸 −
フマール酸 −
グルコン酸 −
イタコン酸 −
グリセリン +
コール酸 −
【0019】
(4)細胞壁構成成分
D−オルニチン、L−アラニン、グリシンを含む
(5)キノン分析
ユビキノンを認めず、MK−9 2.7%、MK−10 8.2%、MK−11 30.5%、MK−12 54.5%含有する。
(6)DNAのG+C含量
67.1mol%
【0020】
以上の菌学的諸性質を、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)の記載に照らして検討すると、本菌株は桿菌、グラム陽性であり、細胞壁構成成分、キノン分析、DNAのG+C含量等の結果より、オウレオバクテリウム・エスピー(Aureobacterium sp.)に属する事が確認された。しかしながら、本菌株は公知の菌株とは異なるので、オウレオバクテリウム・エスピー(Aureobacterium sp.)MIM−CG−9535−Iと命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−15326として寄託した。
【0021】
本菌株を用いて、目的とするプロテアーゼを得るためには、当該菌体を培地に接種し、常法に従って培養し、得られた培養物から該プロテアーゼを採取すればよい。
【0022】
ここで使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該菌体が生育可能なものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。
【0023】
窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されないが、例えば窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、
炭素源としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、
無機塩類としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。
【0024】
培地のpHは6〜7程度が好ましく、培養温度は28〜30℃で、20〜48時間振とう培養することが好ましい。
【0025】
培養物中からの目的物質であるプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。すなわち、培養物を遠心、又は濾過などによって菌体を分離し、その培養濾液から通常の分離手段、例えば、硫酸アンモニウム沈澱法、限外濾過膜による濃縮等を用い、カラムクロマトグラフィー等により精製する方法が挙げられる。
【0026】
このようにして得られるMIM−CG−9535−I由来のプロテアーゼは以下に示す酵素学的性質を有する。
【0027】
(酵素学的性質)
1.基質特異性(表1)
1−1 分解使用基質として、未変性可溶化コラーゲン(M.W.30万、宮城化学工業株式会社)、熱変性コラーゲン(M.W.13万、ゼラチン化基質)(宮城化学工業株式会社製)、豚皮ゼラチン(M.W.13万、宮城化学工業株式会社製)、牛骨ゼラチン(M.W.13万、宮城化学工業株式会社製)を基質とし、各0.1%溶液に1/10量の酵素液を添加し37℃での分解活性を、ポリアクリルアミドゲル(4〜20%ゲル)の電気泳動法により確認した。
この結果、ゼラチンに強い限定分解活性(分子量約7万と約4万に分解)を示し、コラーゲンにも同様の限定分解活性を示した(図1)。
また、乳製カゼインについても、分解が確認された。これらの事から、基質に対する種特異性はない事が確認された。
【0028】
1−2 アゾコール試薬での活性測定法として、アゾコール試薬{アゾコール試薬(CALBIOCHEM)4mg/ml、0.05% Brij35、0.2M NaCl、10mM CaCl2、0.02% NaN3、50mM MES pH5.5}を調製し、アゾコール試薬1mlに各希釈酵素液100μl(−H2Oブランク)を加え、37℃30分反応を行い、(10分毎に転倒混和)、直ちに遠心分離(10,000rpm、20sec)後、上清について波長520nmによる測定を行った。(30分で吸光度1.00上昇させる酵素量を1単位とする)
この結果、アゾコール試薬に強い色素可溶化作用を示した。
【0029】
1−3 合成基質でのコラゲナーゼ活性の測定は、合成基質DNP−Pro−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−ArgとDNP−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argの2種を用いて、30℃30分反応を行った。反応後、上清について波長365nmによる吸光度の測定を行った。
その結果、合成基質DNP−Pro−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−ArgとDNP−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argに対し、Proが入った基質はわずかに分解活性を示し、Proが入っていない基質は分解活性を示さない。
【0030】
【表1】
【0031】
2.反応至適温度
各温度で、アゾコール試薬を用い酵素液と30分反応させ、波長520nmで吸光度の測定を行った。
その結果、至適温度は37〜42℃で、40℃で活性最大値を示した(図2)。
【0032】
3.温度安定性
各温度で酵素液を1時間放置し、その酵素液について、37℃30分でのアゾコール分解活性を測定した。
その結果、−80℃及び氷冷下では安定で、30℃1時間で70%の活性低下、40℃1時間では100%活性低下を示した(図3)。
【0033】
4.至適pH
下記の条件で緩衝液を調製し測定を行った。
緩衝液はpH3.0〜5.0で酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0〜9.0はMES−HEPES−ホウ酸緩衝液をpH0.5刻みで用い、各緩衝液にアゾコール試薬を入れた物を調製し、酵素液を37℃30分反応させ、波長520nmの吸光度を測定した。
その結果、至適pHはpH5.5〜7.0であった(図4)。
【0034】
5.pH安定性
上記各緩衝液に酵素液を入れ、緩やかに攪拌しながら1時間氷冷した。その酵素液を用い、37℃30分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、pH5.5〜9.0で安定であった。(図5)。
【0035】
6.酵素阻害
下記条件で、阻害剤を調製し測定を行った。
阻害剤としてエチレンジアミン四酢酸、2−メルカプトエタノール、N−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、o−フェナントリン、L−システイン、ヨードアセトアミドの入ったアゾコール試薬を調製し、酵素液を加え、37℃30分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、o−フェナントリン、L−システインで酵素阻害が見られた(表2)。
【0036】
【表2】
【0037】
7.分子量
分子量は、ポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動で測定を行った。
すなわち、ポリアクリルアミドゲル15/25%(第一化学薬品(株))、使用分子量マーカーとして、タンパク質分子量マーカー「第一」III(第一化学薬品(株))を使用し、SDS及び還元剤入りサンプル処理とサンプルを1:1に混合し、90℃5分加熱処理を行ったものを用いた。電気泳動は、電気泳動操作法に準拠し、染色法は銀染色法に準拠した(第一化学薬品(株))。
染色後、分子量マーカー及びタンパクの移動度から分子量を23,000±2,000と決定した(図6)。
【0038】
8.金属イオンの影響
金属イオンとしてカルシウムイオン(CaCl2・2H2O)、コバルトイオンCo(CH3COO)2・4H2O、マンガンイオン(MnCl2・4H2O)、マグネシウムイオン(MgCl2・6H2O)をアゾコール試薬に添加し、37℃30分反応させアゾコール分解活性を測定した。
その結果、カルシウムイオンと、コバルトイオンに活性促進効果が確認され、マンガンイオンと、マグネシウムイオンに活性阻害効果が確認された(表3)。
【0039】
【表3】
【0040】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼは、分子量約13万〜30万のゼラチン及びコラーゲンを分子量約7万と4万のペプチド分解することができ、この分解物は、例えば抗原性の低さ、易溶解性、低ゲル化強度、易フィルム形成性、易包接性等の特徴を生かし、新たな用途が期待できる。
【0041】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【0042】
実施例1
宮城県仙台市の土壌試料0.1〜0.2gを改良スタイナー基礎培地(0.5M Na2HPO4−KH2PO4緩衝液(pH6.8)80ml/l、Hunter無機塩溶液20ml/l、酵母エキス0.1g/l、0.3%ゼラチン及びコラーゲン溶液300ml/l)からなる培地懸濁し、30℃で振盪培養を行った。
この、培養上清液を電気泳動によりゼラチン及びコラーゲンを、限定分解する菌株の存在を確認した土壌試料培養液を、適当な増殖用平板培地に蒔きコロニー形成を行った。
再度、このコロニーについてゼラチン及びコラーゲン入りの培地で培養を行い、限定分解活性を確認し、本菌株、オウレオバクテリウム・エスピー(Aureobacterium sp.)MIM−CG−9535−Iを分離することができた。
【0043】
実施例2
本分離菌株オウレオバクテリウム・エスピー(Aureobacterium sp.)MIM−CG−9535−Iを、増殖培地(表4)で好気的に28℃、16〜24時間培養した。培養後遠心分離により菌体を分離した培養液に、硫酸アンモニウムを加えて55%飽和沈澱画分を遠心分離にて集めた。
この沈澱を、20mM Tris塩酸(pH7.5)、8mM塩化カルシウム、0.1M硫酸アンモニウム緩衝液に溶解し、同緩衝液0.8M硫酸アンモニウム濃度に調製後遠心分離を行い上清を得た。
この溶液をブチルトヨパール(Butyl-TOYOPEARL)「東ソー株式会社」カラムにかけ、硫酸アンモニウム0.8M〜0.1Mリニアグラジェントにて溶出を行い、溶出される活性タンパク画分をアゾコール試薬及び電気泳動にて確認を行った。
更に、活性画分を硫酸アンモニウム70%飽和で沈澱画分を集め、20mM Tris塩酸(pH7.5)、8mM塩化カルシウム緩衝液で透析を行い、スーパーQトヨパール(Super Q TOYOPEARL)「東ソー株式会社」カラムにかけ、塩化ナトリウム0〜0.3M リニアグラジェントにて溶出した。活性タンパク画分を、アゾコール及び電気泳動にて確認を行った(表5)。
この、得られた活性タンパクを限外濾過膜M.W.1万膜にて濃縮を行い、10mM MES(pH5.5)、150mM塩化ナトリウム、5mM塩化カルシウム緩衝液で透析を行い精製標品とした。
この得られた酵素は、ポリアクリルアミドゲル(15〜25%ゲル)の電気泳動法で、単一バンドとして確認された(図6)。
【0044】
【表4】
【0045】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のプロテアーゼにより分解されたゼラチンの電気泳動を示す図である。
【図2】本発明のプロテアーゼの温度と分解率を示す図である。
【図3】本発明のプロテアーゼの温度安定性を示す図である。
【図4】本発明のプロテアーゼのpHと分解率を示す図である。
【図5】本発明のプロテアーゼのpH安定性を示す図である。
【図6】本発明のプロテアーゼの分子量を示す電気泳動図である。
Claims (3)
- 次の酵素学的性質を有するプロテアーゼ。
(1)作用
分子量約13万の熱変性コラーゲン及び分子量約30万の未変性可溶化コラーゲンを分子量約7万と分子量約4万のペプチドに分解する限定分解活性を示すが、コラゲナーゼ基質であるDNP−Pro−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argの合成基質に対してはわずかに分解活性を示し、DNP−Gln−Gly−Ile−Ala−Gly−Gln−D−Argの合成基質に対しては、分解活性を示さない。
(2)至適pH
pH5.5〜7
(3)至適温度
37〜40℃
(4)分子量
23,000±2,000(SDS−PAGEによる)
(5)酵素阻害
o−フェナントリン、L−システインにより活性阻害を受けるが、エチレンジアミン四酢酸、N−エチルマレイミド、フェニルメタンスルホニルフルオリド、ヨードアセトアミドによる活性阻害は少ない。 - オウレオバクテリウム エスピー(Aureobacterium sp.)MIM−CG−9535−Iと命名され、FERM P−16867として寄託された微生物。
- 請求項2記載の微生物を培養し、その培養物から請求項1記載のプロテアーゼを採取することを特徴とする請求項1記載のプロテアーゼの製造法。
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