JP3649480B2

JP3649480B2 - A novel protein whose expression increases with nerve damage

Info

Publication number: JP3649480B2
Application number: JP19208295A
Authority: JP
Inventors: 健一郎上部; 忠久北村; 義成我原
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: JPH0940697A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質；該タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質を認識する抗体；および、該抗体を産生し得るハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経の軸索損傷により影響を受けた神経細胞の逆行性変性または軸索の再生は、中枢および末梢神経系で通常に生じるプロセスである。ラットの顔面神経の軸索切断により影響を受けた神経細胞では、以下のような一連のグリア反応が報告されている。第１に、アストログリア細胞で、グリア線維性酸性タンパク質のレベルが増加する（KitamuraおよびFujita、Denshi-kenbikyou 19:193-199 (1985)；GraeberおよびKreutzberg、J Neurocytol 15:363-373 (1986)）。第２に、ミクログリア細胞が活性化され、そして増殖する（KitamuraおよびFujita、(1985)前出；Graeberら、Neurosci Lett 85:317-321 (1988)）。第３に、神経周囲のミクログリア細胞が、シナプス結合に侵入し、神経細胞体および主要樹状突起の表面からシナプス末端を阻害する（BlinzingerおよびKreutzberg、Z Zellforsch Mikrosk Anat 85:145-157 (1968)）。このような一連の反応が起こった後に、顔面神経の軸索が再生を起こすことが知られている。
【０００３】
これらの現象論的観察にも関わらず、軸索切断に応答する神経細胞体の周りの領域で生じる分子生物学的事象についてはほとんど知られていない。GAP-43（Basiら、Cell 49:785-791 (1987)）、α-チューブリン（α-tubulin）（Millerら、J Neurosci 9:1452-1463 (1989)）、α-インターネキシン（α-internexin）（Fliegnerら、EMBO J 9:749-755 (1990)）、SCG-10（Okazakiら、Genomics 18:360-373 (1993)）、ユビキチン（Finchら、Nucleic Acids Res 18:1907 (1990)）、MHCクラスI RT1 Aa α鎖（Radaら、Proc Natl Acad Sci USA 87:2167-2171 (1990)）、カテプシンS（PetanceskaおよびDevi、J Biol Chem 267:26038-26043 (1992)）、ニューロフィラメント（KitamuraおよびWatanabe、Acta Histochem Cytochem 23:375-386 (1990)；Kitamuraら、Neuropathology Suppl 4:263-268 (1991)）、GFAP（Kitamura、「Functional neuroteratology of short-term exposure to drugs」（Fujita TおよびBoer GJ編）187-197頁、Tokyo、Teikyo UP (1991)；Tetzlaffら、J Neurosci 11:2528-2544 (1991)）、神経成長因子レセプター（Saikaら、Mol Brain Res 9:157-160 (1991)；Chiuら、J Comp Neurol 328:351-363 (1993)）、およびアミロイドβタンパク質前駆体（βAPP：Solaら、Eur J Neurosci 5795-5808 (1993)）を含む非常に少数の遺伝子が、軸索切断後にその発現レベルが変化することが既に報告されている。しかし、これらの同定された遺伝子は、軸索切断によりその発現が変動した一部の遺伝子であり、軸索切断後に重要な役割を果たすさらに他の未知遺伝子の存在が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経損傷に伴い発現が変動する上記従来技術の遺伝子とは別の遺伝子から発現するタンパク質、特にその発現が上昇するタンパク質を提供することにある。さらに本発明の目的は、上記タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質に対する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリドーマを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、顔面神経の軸索切断により転写レベルで影響を受ける遺伝子についてさらに種々の検討を行うために、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法を用いた。これによりいくつかの軸索切断に伴いその発現が変動する遺伝子を単離し得、このうちの１つは、軸索切断により転写レベルで発現が上昇する新規の遺伝子であり、これをｒａｎｐ−１と命名した。ＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列、および大腸菌を用いてこの遺伝子を発現して得られた産物（ｒａｎｐ−１タンパク質）が、５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を有するタンパク質であることを見出した。さらに、このタンパク質が、５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないが、５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質（ｒａｎｐ−１タンパク質）は、５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含む。
【０００７】
好ましい実施態様によれば、上記５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列は、配列表の配列番号１の２１９位のMetから２２９位のSerまでのアミノ酸配列またはその類似の配列である。
【０００８】
好ましい実施態様によれば、上記タンパク質は、配列表の配列番号１の１位のMetから２９３位のGluまでのアミノ酸配列またはその類似の配列を含む。
【０００９】
本発明のＤＮＡ配列は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする。
【００１０】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の７４１位のＡから７７３位のＴまででなる塩基配列を有する。
【００１１】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の８７位のＡから９６５位のＧまででなる塩基配列を有する。
【００１２】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の１位のＧから１７３３位のＡまででなる塩基配列を有する。
【００１３】
本発明の発現ベクターは、上記のいずれかに記載のＤＮＡ配列を有する。
【００１４】
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを宿主に導入して得られる。
【００１５】
好ましい実施態様によれば、上記宿主は大腸菌である。
【００１６】
本発明の神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する。
【００１７】
本発明の抗体は、上記のいずれかに記載のタンパク質を認識する。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、上記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
本発明のハイブリドーマは、上記のいずれかに記載の抗体を産生し得る。
【００２０】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）定義
「５'-ヌクレオチダーゼ」は、ヌクレオチドの５'位のリン酸を加水分解してヌクレオシドにする酵素であり、その触媒する反応を図１に示す。本明細書中では、特にＣＤ７３と呼ばれる膜表面上に存在する５'-ヌクレオチダーゼを指し、これは、真核生物では原形質膜に局在し、細胞膜表面に活性部位を有するエクト型の酵素である。エクト型の酵素とは、一般に、細胞膜の内在性タンパク質で細胞の外表に活性部位を有し、外側に向かって活性を発揮する酵素である。
【００２１】
アミノ酸配列またはＤＮＡ配列に「類似の配列」とは、特定の配列に必ずしも限定されることはなく、この配列に加えて当業者に公知の置換、挿入、欠失などを含み、そしてコードされるタンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度である改変を含む配列をいう。あるいは、タンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度であるならば、化学的または生化学的な改変、あるいは非天然または誘導体化されたアミノ酸または塩基を含んでいてもよい。
【００２２】
（ＩＩ）本発明のタンパク質またはＤＮＡ配列の単離または同定に用い得る方法本発明の各工程において用い得る一般的な分子生物学的実験手法（ＤＮＡの電気泳動、電気泳動分離したＤＮＡをゲル中から回収する方法、ライゲーション、宿主の形質転換、組換え宿主の培養、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの制限酵素による切断、ＤＮＡの放射標識など）は、例えばMolecular Cloning 第２版（Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)）に記載されているような、当業者に公知の方法が採用される。
【００２３】
以下に本発明のタンパク質またはＤＮＡ配列の単離または同定に用い得る一般的方法を述べる。
【００２４】
（１）ｒａｎｐ−１のｃＤＮＡのクローニング
本発明のタンパク質であるｒａｎｐ−１をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片のクローニングを配列決定方法と共に以下に例示する。本発明のｒａｎｐ−１については、顔面神経軸索切断により発現が上昇すること以外に情報がないので、この遺伝子を得るために、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いて、例えば、以下に記載のように行う。
【００２５】
（Ａ）ＲＮＡの調製
例えばラットなどの動物を麻酔して、その片側の顔面神経を、例えば茎乳突孔のレベルで切断する。適当な時間の後、これらの動物を屠殺し、その脳幹から、切断側および非切断側の顔面神経核を取り出す。それぞれの取り出した顔面神経核を有する脳組織から、グアニジンチオシアネート法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal Biochem 162:156-159 (1987)）に従ってＲＮＡを抽出し得る。
【００２６】
（Ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにして得た切断側または非切断側顔面神経核由来のＲＮＡから、例えば市販のｃＤＮＡ構築キット（GIBCO BRL社製）を用いて構築し得る。ｃＤＮＡ合成用のアダプタープライマーとして、および適切なベクターへのｃＤＮＡ挿入物用のアダプターとしての適当な長さのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機などで化学的に合成し得る。
【００２７】
（Ｃ）ディファレンシャルハイブリダイゼーション
上記のようにして得たｃＤＮＡライブラリーを、例えば大腸菌にエレクトロポレーションする。この菌をプレーティングして増殖し、次いで大腸菌の各クローンの中のｃＤＮＡ挿入物を、適当なオリゴマーを用いてＰＣＲで増幅し得る。得られたＰＣＲ産物について、例えばアガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロンメンブレンにトランスファーする。顔面神経軸索切断７日後の切断側神経核から抽出したＲＮＡから作製した二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡと、同じラットの非切断側神経核由来のｄｓｃＤＮＡとを、例えば³²P-dCTPでランダムラベルし、これをハイブリダイゼーション用のプローブとして用い得る。上記メンブレンとプローブとをハイブリダイズさせた後、メンブレンを洗浄する。これをＸ線フィルムに露光することにより、切断側で発現が上昇するＤＮＡが検出される。
【００２８】
（Ｄ）ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列のホモロジー検索
上記のようにして、軸索切断後に顔面神経核で発現が上昇するいくつかのｃＤＮＡを単離し得る。このような軸索切断により影響を受ける遺伝子を有するクローンについて、例えばジデオキシ法により部分的に配列決定し、そしてこの配列を、例えば、GenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースに対して核酸ホモロジー検索を行い得る。この検索の結果、新規のｃＤＮＡクローンを１つ単離し、これをｒａｎｐ−１と命名した。
【００２９】
上記のようにして得られたｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの一部をプローブとして、軸索切断側の顔面神経核から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンを分離し得る。ＤＮＡ塩基配列の解析は、例えば、DNASIS（Hitachiソフトウェア社製）を用いて行い、このｃＤＮＡの塩基配列を決定し得る。ＤＮＡから予想されるタンパク質のアミノ酸配列について、例えば、データベースであるprositeに対してモチーフ検索を行い得る。タンパク質のモチーフ検索の結果、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質のＣ末端に、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）のコンセンサス配列が存在することが明らかとなった。
【００３０】
５'-ヌクレオチダーゼは、脊椎動物のほとんど全臓器で発現しており、正常成熟ラットの脳では、主としてグリア細胞の膜表面上に存在する。神経細胞においては、現在のところ、網膜光受容体および上部頸管ガングリオンのシナプスにのみ存在が認められている。また、ラットの顔面神経軸索切断側の神経核周囲に存在する神経周囲のミクログリア細胞で、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼの発現が損傷に伴い上昇することも知られている（Schoenら、GLIA 6:314-317 (1992)）。このことから、細胞外のヌクレオチドをこの酵素がヌクレオシドに変換し、そのことにより生体膜に対する透過性が上昇し、増殖中のグリア細胞およびその周囲の神経細胞への核酸前駆体の取り込みを補助していることが推測されている。また、ラット海馬の嗅内皮質に損傷を与えて歯状回の分子層に存在する神経細胞を変性させた場合、変性した神経細胞の神経終末と、この領域を再生するために中隔核から発芽し、シナプス形成を行った神経細胞とのシナプス間隙に、高い５'-ヌクレオチダーゼの活性が認められる。さらにエクト型の５'-ヌクレオチダーゼは、脂質により膜に挿入されたタンパク質で、活性部位を含めた全領域が膜の外に出ており、細胞マトリックスのラミニン、フィブロネクチン等と結合する接着分子としての一面を持っているために、神経損傷時の神経周囲のミクログリアの突起進展との関係が予想されている。以上のことより、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼは、神経再生に何らかの積極的な役割を果たしているものと推測されている。従って、このような５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を有する本発明のｒａｎｐ−１タンパク質も、神経再生に関与すると考えられる。
【００３１】
（２）ｒａｎｐ−１の組織および組織内分布の確認
本発明のｒａｎｐ−１の組織分布は、例えば、ｍＲＮＡの発現またはｒａｎｐ−１タンパク質の発現を解析することにより、確認することができる。ｍＲＮＡの発現については、本発明のｒａｎｐ−１ｃＤＮＡを用いてノーザンブロット分析により確認し得る。ｒａｎｐ−１タンパク質の発現については、このタンパク質に対する抗体を作成した後、ウエスタンブロット分析により確認することができる。本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡは、正常ラットの全組織で発現しており、特に肝臓、腎臓、および脳に多く発現していた。また、脳細胞質で本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の発現が確認されている。
【００３２】
本発明のｒａｎｐ−１の組織内分布は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションなどによりｍＲＮＡを、抗体を使用する免疫組織化学などによりタンパク質を分析することによって確認することができる。インサイチュハイブリダイゼーションは、例えば、公知の文献に記載のように（Nakayamaら、Mol Brain Res 21:206-218 (1994)）、同位体またはジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて、組織の凍結切片について行い得る。これを顕微鏡検査することにより、本発明のｒａｎｐ−１ｍＲＮＡが、神経切断側の神経核で上昇していることが明らかとなった。
【００３３】
（３）ｒａｎｐ−１タンパク質の発現
本発明のｒａｎｐ−１をコードする遺伝子は、適当なベクター、例えば、pGEX5X-3、pGEX4T-3などに組み込まれて、ｒａｎｐ−１タンパク質を発現させるための発現ベクターとされる。
【００３４】
この発現ベクターを、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体が作成される。この形質転換体を培養することにより、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が産生され得る。また、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、適当なタンパク質との融合タンパク質としても産生され得る。
【００３５】
発現させた本発明のｒａｎｐ−１タンパク質またはその融合タンパク質は、ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体を産生するための抗原として用い得る。本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の特定部分のみを抗原として利用して、抗体を作成し得る。
【００３６】
例えば、pGEX5X-3のSmaI部位に本発明のｒａｎｐ−１タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで、該遺伝子を含む発現ベクターを作成し、これを大腸菌などに導入することによって形質転換体を作成し得る。この形質転換体は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現され得る。このようにして得られたｒａｎｐ−１遺伝子産生培養物は、アフィニティーカラム法などで精製され得る。
【００３７】
（４）ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体の産生
上記（３）項のようにして得られるｒａｎｐ−１タンパク質または融合タンパク質を、例えば、ウサギに注射して抗血清を誘起し、その血清から抗体をｒａｎｐ−１タンパク質アフィニティーカラムで精製し得る。このようにして得られる抗体を用いて、例えば、上記（２）項のウエスタンブロット分析を行い得る。
【００３８】
（５）５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定
５'-ヌクレオチダーゼ活性は、５'-ＡＭＰを基質として決定し得る。例えば、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質、陰性コントロールとしてＧＳＴタンパク質、または陽性コントロールとして５'-ヌクレオチダーゼを、50 mM グリシン緩衝液、pH 8.5、５mM MgCl₂、10mM ５'-ＡＭＰを含む基質液中で37℃、30分間インキュベーションし、反応停止液（10％トリクロロ酢酸、0.02％アスコルビン酸）を加える。この反応液中の５'-ＡＭＰから遊離したリン酸の量により、５'-ヌクレオチダーゼ活性を定量し得る。この結果から、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないことが明らかになった。
【００３９】
（６）５'-ＡＭＰとの結合アッセイ
例えば、５'-ＡＭＰセファロース4Bゲルにサンプルをかけて、フリーの５'-ＡＭＰを用いてゲルに特異的に結合しているタンパク質を交換置換反応により溶出させることにより、５'-ＡＭＰとの結合アッセイを行い得る。このアッセイ結果より、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、５'-ＡＭＰと特異的に結合する領域を有することが明らかとなった。
【００４０】
（７）抗ｒａｎｐ−１抗体の作製
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体は、例えば、ｒａｎｐ−１タンパク質またはその一部分を認識する抗体を産生させ得るタンパク質を免疫原とし、マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫して、その血清由来の抗体（ポリクローナル抗体）を作製し得る。または、免疫した動物の脾臓またはリンパ節から細胞を取り出し、ミエローマ細胞などの細胞と融合させてハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生させ得る。
【００４１】
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体を用いて、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質を免疫学的に測定することができる。例えば、免疫に用いた免疫原と同一の抗原部位を有する標識した一定量のタンパク質に、濃度既知の非標識抗原、および血清由来のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を加えて、抗原抗体競合反応を行わせる。非標識抗原の濃度を適当に変化させた後、抗体に結合した標識抗原と抗体に結合していない標識抗原とを適当な方法で分離して、抗体と結合した標識抗原の放射能量、酵素活性、または蛍光強度を測定する。非標識抗原の量が増すにつれ、抗体と結合する標識抗原の量は減少する。この関係をグラフにして標準曲線を得る。
【００４２】
次に、上記の反応系に濃度既知の非標識抗原の代わりに未知量の抗原を含む試料を加え、これを反応させた後に得られる放射能量、酵素活性、または蛍光強度を、標準曲線にあてはめれば、試料中の抗原の量を知ることができる。
【００４３】
【実施例】
［実施例１］ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーション
顔面神経軸索切断により発現が変動する遺伝子を得るために、ラットの顔面神経核のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーとプローブとを用いて、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを以下に記載のように行った。
【００４４】
（１）ＲＮＡの調製
40匹の成熟雄Sprague-Dawley系ラット（６〜８週齢）を、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、左側顔面神経を茎乳突孔のレベルで切断した。その７日後にこれらのラットをエーテル麻酔下で断頭により屠殺した。ラットの脳幹を、両側の顔面神経核が1.5mm厚の薄片に含まれるようにかみそりの刃で切断し、そして各顔面神経核を15ゲージのステンレス管で穴をあけて取り出した（Yu、「A dissection and tissue culture manual of the nervous system 」（Shaharら編）30-39頁、New York:Alan R. Liss Inc. (1989)）。それぞれの取り出した顔面神経核を有する脳組織から、公知の方法（ChomczynskiおよびSacchi、(1987) 前出）に従ってＲＮＡを抽出した。
【００４５】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにして得た左側（切断）または右側（非切断）顔面神経核由来の30〜60μgの総ＲＮＡから、Superscript ｃＤＮＡ合成キット（GIBCO-BRL社製）を用いて構築した：第１鎖のｃＤＮＡ合成用のアダプタープライマーとして、オリゴマーＡ（配列表の配列番号２）を用い、そしてpBluescript SKベクター（Stratagene社製）へのｃＤＮＡ挿入物用のアダプターとして、オリゴマーＢおよびＣ（それぞれ、配列表の配列番号３および配列番号４）をアニールしたアダプターを用いた。これらのオリゴマーは、Pharmacia Gene Assembler Plus ＤＮＡ合成機で合成した。ゲルろ過により二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡのサイズ分画を行い、pBluescript SKベクター（Stratagene社製）に結合して、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４６】
（３）ディファレンシャルハイブリダイゼーション
上記（２）項で得たｃＤＮＡライブラリーを、GenePulser（Bio-Rad社製）を用いて16.6kv/cm、パルス長４msの条件で、大腸菌ElectroMAXDH10B（GIBCO-BRL社製）にエレクトロポレーションを行った。ＬＢプレート（１L中、トリプトン10g、イーストエキストラクト５g、塩化ナトリウム10g、および寒天10gを含む（pH 7.0））にこの菌をプレーティングし、大腸菌各クローンの中のｃＤＮＡ挿入物をオリゴマーＡおよびオリゴマーＢを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、以下の熱サイクル条件を用いて、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer-Cetus社製）およびＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer-Cetus社製）で行った：94℃にて30秒変性、55℃にて30秒アニール、72℃にて１分伸長；30サイクル。各ＰＣＲ産物について等量（10μl）ずつ各２レーンで１％アガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロンメンブレン（PALL社製）にそれぞれトランスファーした。顔面神経軸索切断７日後の切断側神経核から抽出したＲＮＡから作製したｄｓｃＤＮＡと、同じラットの非切断側神経核由来のｄｓｃＤＮＡとを、Prime-It II（Stratagene社製）を用いて、³²P-dCTP（Amersham社製）でランダムラベルした。これらをそれぞれプローブとして用い、各メンブレンについてハイブリダイゼーション緩衝液（0.5M リン酸ナトリウム（pH 7.2）、1mM EDTA、１％ BSA、７％ SDS）中で、65℃、16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後メンブレンを0.1×SSC、55℃で洗浄し、これを、増感紙存在下−70℃で16時間、Ｘ線フィルム（Eastman Kodak社製）に露光した。
【００４７】
（４）ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列のホモロジー検索
ディファレンシャルハイブリダイゼーションを行い、陽性と判断した大腸菌クローンをLBブロス培地で増殖した後、アルカリ変性法（0.2N NaOHおよび１％SDS中、氷上にて５分間ＤＮＡを変性させ、次いで7.5M 酢酸アンモニウムを加えて中和する。次に、フェノールを加えてタンパク質を変性させ、除タンパクを行うために遠心分離し、上清を回収後、エタノール沈殿する。）により大腸菌内のプラスミドを回収して、軸索切断後に顔面神経核で転写レベルで発現が上昇するいくつかのｃＤＮＡを単離した。このような軸索切断により影響を受ける遺伝子を有するクローンについて、T7 Sequencingキット（Pharmacia社製）を用いてジデオキシ法により部分的に配列決定し（100〜200塩基対（bp））、そしてこの配列をGenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースに対してFASTAプログラムを用いて核酸ホモロジー検索を行った。この核酸ホモロジー検索により、GAP43、α-チューブリンなどの、軸索切断後に顔面神経核で転写レベルで発現が上昇している既知のｃＤＮＡクローンを７つ、および新規のｃＤＮＡクローンを１つ単離した。この新規の遺伝子をｒａｎｐ−１と命名した。
【００４８】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションで得られたｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの一部（３'末端の約400bp）をプローブとして、軸索切断側の顔面神経核から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンを分離した。その後、ＤＮＡ塩基配列の解析をDNASIS（Hitachiソフトウェア社製）を用いて行い、このｃＤＮＡの塩基配列（1733bp）を決定した。全長ｃＤＮＡについて、再度ＤＮＡデータベースでのホモロジー検索を行った結果、この遺伝子と高いホモロジーのある遺伝子は存在しなかった。従って、ｒａｎｐ−１は新規の遺伝子である。この遺伝子は、２９２アミノ酸のオープンリーディングフレームを含み、予想されるタンパク質の分子量は34キロダルトン（kd）、等電点は7.4である。また、ＤＮＡから予想されるタンパク質のアミノ酸配列について、コンピュータソフトMacPattern 2.01（Fuchs、Biosci 7:105-106 (1991)）を用いて、データベースであるprositeに対してモチーフ検索を行った。タンパク質のモチーフ検索の結果、Ｃ末端にエクト型の５'-ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）のコンセンサス配列が存在することが明らかとなった。
【００４９】
［実施例２］ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション
ｒａｎｐ−１のｃＤＮＡの３'末端の約400bpが挿入されているプラスミドＤＮＡを、制限酵素MluI（TOYOBO社製）で消化後、T3ＲＮＡポリメラーゼを用いて³⁵S-UTP（800 Ci/mmol、Amersham社製）標識のアンチセンスＲＮＡを作製した。これをプローブとして用い、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した軸索切断７日後のラット脳幹部の切片を用いて、以下のようにインサイチュハイブリダイゼーションを行った。すなわち、固定した切片を、ハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、0.5M NaCl、10mM Tris-HCl (pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ BSA、0.02％フィコール、0.02％ポリ[ビニルピロリドン]、0.1％ SDS、100μg/mlサケ***ＤＮＡ、500μg/mlイーストｔＲＮＡ、125nM ウリジン 5'-[α-tチオ]トリホスフェート、10mM DTT、10％硫酸デキストラン）中で、³⁵S標識ＲＮＡプローブ（比活性：１×10⁶cpm/ml）とともに、55℃にて16時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズした切片を、洗浄緩衝液（0.1×SCC、20mM DTT）で、65℃にて30分間洗浄した。次いで、切片をRNaseＡ（20μg/ml：Sigma社製）で、37℃にて30分間処理した。これを、さらに65℃にて30分間洗浄した後、エタノールで脱水して風乾した。乾燥した切片を、Kodak nuclear emulsion NTB2中に浸して、暗所で４℃にて３時間感光した。現像した後、切片をヘマトキシリン-エオシン染色し、暗視野−明視野像を観察できる顕微鏡（Zeiss Axiophoto：Karl-Zeiss）を用いてシグナルを検出した。
【００５０】
暗視野顕微鏡検査による結果を図２に示す。顔面神経核は図の矢印の所にあり、左側が切断側、右側が非切断側である。図中の白い点として確認される部分にｒａｎｐ−１ｍＲＮＡが存在する。図から明らかなように、ｒａｎｐ−１の発現は切断側の神経核で上昇していた。また、図３に明視野顕微鏡検査の結果を示す。図中の黒い斑点として確認される部分がｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの存在する部分であり、ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡは神経細胞に存在することも明らかとなった。
【００５１】
［実施例３］ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの正常ラット組織内での発現
ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡのラット各組織での発現を検討するために、以下のようにしてノーザンブロット分析を行った。ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの３'末端の約400bpを含むＤＮＡフラグメントを、Prime-It II（Stratagene社製）を用い、³²P-dCTP（Amersham社製）でランダムラベルした。これをプローブとして、正常ラットの各臓器（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および精巣）から得たｍＲＮＡを５μgブロットしたナイロンメンブレン（Rat Multiple Tissue Northern (MTN) Blot（Clontech社製））と、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、65℃、16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後フィルターを0.1×SSC、65℃で洗浄し、これを増感紙存在下−70℃、16時間Ｘ線フィルムに露光させた。
【００５２】
結果を図４に示す。ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡは検討した全組織で発現しており、特に肝臓、腎臓、および脳で多いことが明らかになった。また、そのサイズは全て2.4kbであった。
【００５３】
［実施例４］ｒａｎｐ−１タンパク質の大腸菌内での発現
ｒａｎｐ−１タンパク質のオープンリーディングフレーム全長をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡが挿入されているプラスミドＤＮＡを、制限酵素BalI（Takara Shuzo社製）で消化した。この断片をアガロースゲル電気泳動した後、DEAEメンブレン（Schleicher & Schnell社製）を用いて、発現に必要なＤＮＡフラグメントを回収し、精製した。得られたＤＮＡフラグメントを、制限酵素SmaI（Takara Shuzo社製）で消化後、ウシ小腸アルカシホスファターゼ（CIAP：Takara Shuzo社製）処理したプラスミドpGEX5X-3（Pharmacia社製）に、アミノ酸の読み枠があうように、T4ＤＮＡリガーゼ（GIBC0-BRL社製）を用いて16℃で、16時間をかけて結合させた。これを大腸菌ElectroMaxDH10B（GIBCO-BRL社製）にエレクトロポレーションした。次いで、目的の大腸菌クローンを分離し、ＬＢ培地で培養し、対数増殖期の菌液中に、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトピラノシド（Sigma社製）を最終濃度が0.5 mMになるように添加し、37℃で２時間培養して、タンパク質の発現誘導を行った。大腸菌を集菌し、Triton X100を１％含むＰＢＳ中で菌を音波処理し、４℃で10分間、10,000×gにて遠心分離した。得られた上清の可溶性画分を、グルタチオン-セファロース4B（Pharmacia社製）に室温で５分間吸着させた。次いで、このゲルをＰＢＳで十分に洗浄し、ゲルに結合したタンパク質を５mMのグルタチオン（KOHJIN社製）を含む50 mM Tris-HCl、pH 8.0）の溶出緩衝液中、室温で５分間放置することにより溶出させた。次にこのタンパク質を陽イオン交換カラムであるHiTrapQ（Pharmacia社製）にかけ、移動相である50 mM Tris-HCl（pH8.0）に０〜１M NaCl塩濃度グラジエントをFPLC（Pharmacia社製）でかけることによリ、ｒａｎｐ−１タンパク質を溶出し、精製した。得られたタンパク質１μgを、12.5％ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色により精製融合タンパク質を検出した。
【００５４】
このタンパク質を検出した結果を図５に示す。Ｍのレーンは分子量マーカーである。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のレーンには、予想される分子量のタンパク質（34kd）が観察された。
【００５５】
［実施例５］ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体の産生
上記実施例４で得た精製ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質100μgを、フロイントの完全アジュバント（DIFCO社製）を用いてエマルジョン形成した後、ニュージーランドホワイトウサギの皮下に注射した。初回免疫の１カ月後にブーストを行い、その18日後に全血を採取した。
【００５６】
上記実施例４で得た精製したＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質およびＧＳＴタンパク質を、それぞれCNBr活性化セファロース4B（Pharmacia社製）ゲルに結合して固相化し、これらをそれぞれカラムに充填し、それぞれＧＳＴ-ｒａｎｐ−１カラムおよびＧＳＴカラムとした。まず、ウサギ抗血清をＧＳＴ-ｒａｎｐ−１カラムにかけ、結合緩衝液（20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、0.3M NaCl）でゲルを洗浄後、溶出緩衝液（0.17 M グリシン-HCl、pH 2.3）で、ゲルに特異的に結合している抗体を溶出した。１M Tris-HCl、pH 9.0で中和した後、この抗体をＧＳＴカラムにかけた。抗ＧＳＴ抗体はカラムに吸着するので、素通り画分を回収することにより抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体を得た。
【００５７】
得られた抗体は、ウエスタンブロット分析により以下のようにして確認した。精製ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質およびＧＳＴタンパク質を、それぞれ0.1μgおよび0.5μgSDS化した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲル上のバンドをニ卜ロセルロースメンブレン（ATTO社製）にトランスファーした。このメンブレンを、５％スキムミルク（DIFCO社製）を含むＰＢＳ（ブロッキング液）中で４℃、16時間ブロッキングした。次いで、ブロッキングしたメンブレンを、ブロッキング液で１：500希釈した精製抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体（一次抗体）と、１時間、室温で反応させた。0.05％ Tween20を含むＰＢＳでメンブレンを洗浄し、ＡＢＣキット（Vectastain社製）を用い、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ビオチン（二次抗体）と反応をさせた後、化学発光増強システム（Amersham社製）を用いて、タンパク質を検出した。
【００５８】
結果を図６に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のレーンのみにバンドが検出され（62kd）、ＧＳＴタンパク質は検出されなかった。従って、得られた抗体がｒａｎｐ−１タンパク質のみを認識する抗体であることが明らかとなった。
【００５９】
［実施例６］ｒａｎｐ−１タンパク質のラット脳組織内での発現
正常ラットの脳細胞のタンパク質を、以下のようにウエスタンブロット分析を行って、ｒａｎｐ−１タンパク質の発現について検討した。正常ラットの脳を、溶解緩衝液（25 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、２％ NP-40、0.2％ SDS、１mM PMSF）中でホモジナイズした。これを、４℃にて10分間、12,000rpmで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質定量は、Bio-Rad Protein Assayを用いて行った。サンプル15μgをSDS化した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲル上のバンドをニ卜ロセルロースメンブレン（ATTO社製）にトランスファーした。このメンブレンを、５％スキムミルク（DIFCO社製）を含むＰＢＳ（ブロッキング液）中で４℃、16時間ブロッキングした。次いで、ブロッキングしたメンブレンを、ブロッキング液で１：500希釈した精製抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体（一次抗体）と、１時間、室温で反応させた。0.05％ Tween20を含むＰＢＳでメンブレンを洗浄し、ＡＢＣキット（Vectastain社製）を用い、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ビオチン（二次抗体）と反応をさせた後、化学発光増強システム（Amersham社製）を用いて、ｒａｎｐ−１タンパク質を検出した。
【００６０】
結果を図７に示す。Ｍのレーンは分子量マーカーである。正常ラットの脳の細胞質タンパク質のレーンには、68kdのタンパク質が検出された。ｒａｎｐ−１タンパク質の推定分子量は34kdであるため、このタンパク質は、細胞内で翻訳後修飾を受けていると考えられる。
【００６１】
［実施例７］ｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定
ｒａｎｐ−１タンパク質はモチーフ検索により、Ｃ末端に５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含むことが明らかとなった。そこで、大腸菌内で発現させたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質を用い、ｒａｎｐ−１タンパク質に５'-ヌクレオチダーゼ活性があるかどうかの検討を行った。
【００６２】
５'-ヌクレオチダーゼ活性は、５'-ＡＭＰを基質として以下のようにして決定した。50mM グリシン緩衝液、pH 8.5、５mM MgCl₂、および10mM ５'-ＡＭＰを含む基質液200μlにサンプルを加えて、これを37℃で、30分間インキュベーションした後、反応停止液１ml（10％トリクロロ酢酸、0.02％アスコルビン酸）を加えた。反応液の一部（750μl）を取り、５'-ＡＭＰから遊離したリン酸をGerlachらのリンモリブテン酸定量法（GerlachおよびHiby、「Methods of Enzymatic Analysis」第2巻（Bergmeyer編）871-875頁、Academic Press、New York (1974)）に従って定量した。すなわち、５'-ヌクレオチダーゼ反応液（750μl）に水を加えて１mlとし、これに40mM モリブデン酸アンモニウム（200μl）および還元溶液（100μl）を加えて室温で10分間放置した。次いで、2.5M 酢酸ナトリウム（400μl）および水300μlを加えて反応を停止し、この溶液の578nmにおける吸光度を測定した。酵素１ユニットは、37℃で基質５'-ＡＭＰから１分間に１μmolの無機リン酸を加水分解する単位と定義する。
【００６３】
図８は、上記の基質液中に、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.2μg、陰性コントロールとしてＧＳＴタンパク質1.6μg、または陽性コントロールとして５'-ヌクレオチダーゼ（5'-N；crotalus atrox venom（ヘビ毒）由来、Sigma社製）0.1ユニットを加えて、５'-ヌクレオチダーゼ活性を測定した結果を示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性は、陰性コントロールであるＧＳＴタンパク質と同等であり、ｒａｎｐ−１タンパク質は５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないことが明らかになった。
【００６４】
次に、このタンパク質が５'-ヌクレオチダーゼに及ぼす影響について検討した。上記基質液200μl中に、５'-ヌクレオチダーゼを0.01ユニット加え、さらに、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.5μg（24 pmol）またはＧＳＴタンパク質0.8μg（29 pmol）を加え、以下は５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定法に従って行った。結果を図９に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質を添加することにより、５'-ヌクレオチダーゼ活性は約５倍になった。このことから、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質が、インビトロで５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強する機能を有することが示唆された。また、ＧＳＴタンパク質の添加ではこのような活性の増強が認められなかったため、５'-ヌクレオチダーゼ活性の増強はｒａｎｐ−１タンパク質に起因すると考えられる。
【００６５】
［実施例８］ｒａｎｐ−１タンパク質と５'-ＡＭＰとの結合アッセイ
エクト型の５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列は、５'-ヌクレオチダーゼ配列中に２種類あることが知られており、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質はこのうちの片方の配列を有している。現在、２種類のコンセンサス配列の一方が酵素の活性中心に対応し、他方が基質である５'-ＡＭＰの結合に必要であると考えられているが、その配列との対応は知られていない。ｒａｎｐ−１タンパク質がインビトロで５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強する機能を有する理由として、ｒａｎｐ−１タンパク質が、５'-ヌクレオチダーゼの基質である５'-ＡＭＰに結合し、５'-ヌクレオチダーゼに効率よくそれを受け渡す機構が予想される。
【００６６】
このことを検討するために、ｒａｎｐ−１タンパク質と５'-ＡＭＰとの結合アッセイを行った。結合緩衝液（10 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、0.5M NaCl）500μl中に、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.4μgおよびＧＳＴタンパク質1.6μgをそれぞれ含む液に対して、同じ緩衝液で平衡化した５'-ＡＭＰセファロース4B（Pharmacia社製）ゲルを50μl加えた。室温で10分間放置した後、ゲルを結合緩衝液で十分に洗浄し、これに10 mM ５'-ＡＭＰを含むグリシン緩衝液（pH 7.0）を加えた。室温で10分間放置し、５'-ＡＭＰの交換置換反応によりゲルに特異的に結合しているタンパク質を溶出させた。溶出液のそれぞれ10μlをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、５'-ＡＭＰに結合したタンパク質を検出した。
【００６７】
結果を図１０に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質は５'-ＡＭＰによりカラムから溶出されたので、５'-ＡＭＰに特異的に結合していたことが示された。ＧＳＴタンパク質は、５'-ＡＭＰによりカラムから溶出されなかったので、５'-ＡＭＰに結合していなかったことが示された。従って、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のｒａｎｐ−１部分に５'-ＡＭＰと特異的に結合する領域があることが明らかになった。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、神経損傷に伴い発現が上昇する、上記従来技術とは別のタンパク質、特に５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含むタンパク質が提供される。さらに本発明によれば、上記タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質を認識する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリドーマが提供される。
【００６９】
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強し、５'-ヌクレオチダーゼの基質である５'-ＡＭＰと特異的に結合する。従って、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が５'-ヌクレオチダーゼに関与して、基質をこの酵素に効率よく渡す機能、そして核酸の細胞への利用効率が高められると考えられる。エクト型の５'-ヌクレオチダーゼもまた、神経再生に関与が示唆される分子であることから、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼ活性をコントロールすることにより、神経細胞の機能回復に深く関与している可能性がある。このことから、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、神経再生の機構の解明に有用であり得る。さらに、本発明のｒａｎｐ−１遺伝子は、肝臓などの脳以外にも存在している。従って、本発明のｒａｎｐ−１遺伝子およびタンパク質の発現をコントロールすることによって、神経疾患の治療に応用すること、および身体の諸臓器の活性を高めることが可能になり得る。
【００７０】
【配列表】
【００７１】
【配列番号１】

【００７２】
【配列番号２】

【００７３】
【配列番号３】

【００７４】
【配列番号４】

【図面の簡単な説明】
【図１】エクト型５'-ヌクレオチダーゼが触媒する生化学反応を示す図である。
【図２】ラットの顔面神経軸索切断７日後の顔面神経核におけるインサイチュハイブリダイゼーションによる、本発明のｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの発現を示す暗視野顕微鏡写真である。
【図３】ラットの顔面神経軸索切断７日後の顔面神経核におけるインサイチュハイブリダイゼーションによる、本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡの発現を示す明視野顕微鏡写真である。
【図４】ラットの各組織における本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡの発現についてのノーザンブロット分析の結果を示す電気泳動像の写真である。
【図５】大腸菌中で発現させたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質の発現を示す、免疫ブロッティング分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図６】抗ｒａｎｐ−１抗体を用いたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図７】ラット脳細胞質における本発明のｒａｎｐ−１タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図８】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性に及ぼす影響を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ＡＭＰへの特異的結合を検討した結果を示す、免疫ブロッティング分析の電気泳動像の写真である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention includes a protein whose expression increases with nerve damage; a structural gene of the protein; an expression vector having the gene; a transformant into which the expression vector is introduced; and an expression that increases with nerve damage using the transformant. And an antibody that recognizes the protein; and a hybridoma capable of producing the antibody.
[0002]
[Prior art]
Retrograde degeneration of nerve cells affected by nerve axonal injury or axonal regeneration is a process that normally occurs in the central and peripheral nervous systems. The following series of glial responses have been reported in neurons affected by axotomy of the rat facial nerve. First, Astro Greer In cells, the level of glial fibrillary acidic protein is increased (Kitamura and Fujita, Denshi-kenbikyou 19: 193-199 (1985); Graeber and Kreutzberg, J Neurocytol 15: 363-373 (1986)). Second, microglial cells are activated and proliferate (Kitamura and Fujita, (1985) supra; Graeber et al., Neurosci Lett 85: 317-321 (1988)). Third, perineural microglial cells invade synaptic junctions and inhibit synaptic ends from the surface of neuronal cell bodies and major dendrites (Blinzinger and Kreutzberg, Z Zellforsch Mikrosk Anat 85: 145-157 (1968). ). After such a series of reactions, the facial nerve axis Search Is known to cause regeneration.
[0003]
Despite these phenomenological observations, little is known about the molecular biological events that occur in the area around the neuronal cell body in response to axotomy. GAP-43 (Basi et al., Cell 49: 785-791 (1987)), α-tubulin (Miller et al., J Neurosci 9: 1452-1463 (1989)), α-internexin (α- internexin) (Fliegner et al., EMBO J 9: 749-755 (1990)), SCG-10 (Okazaki et al., Genomics 18: 360-373 (1993)), ubiquitin (Finch et al., Nucleic Acids Res 18: 1907 (1990) ), MHC class I RT1 Aa α chain (Rada et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 2167-2171 (1990)), cathepsin S (Petanceska and Devi, J Biol Chem 267: 26038-26043 (1992)), neurofilament (Kitamura and Watanabe, Acta Histochem Cytochem 23: 375-386 (1990); Kitamura et al., Neuropathology Suppl 4: 263-268 (1991)), GFAP (Kitamura, “Functional neuroteratology of short-term exposure to drugs” (Fujita T And Boer GJ) 187-197, Tokyo, Teikyo UP (1991); Tetzlaff et al., J Neurosci 11: 2528-2544 (1991)), nerve growth factor receptor (Saika et al., Mol Brain Res 9: 157-160 ( 1991); Chiu et al., J Comp Neurol 328: 351-36 3 (1993)), and very few genes, including amyloid β protein precursor (βAPP: Sola et al., Eur J Neurosci 5795-5808 (1993)), have already been shown to change their expression levels after axotomy. It has been reported. However, these identified genes are some genes whose expression was changed by axotomy, and there may be other unknown genes that play an important role after axotomy.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a protein expressed from a gene different from the above-described conventional gene whose expression varies with nerve damage, particularly a protein whose expression increases. Another object of the present invention is to provide a structural gene of the above protein; an expression vector having the gene; a transformant into which the expression vector is introduced; a method for producing a protein whose expression increases with nerve damage using the transformant; An antibody against a protein; and a hybridoma capable of producing the antibody.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The inventors used a differential hybridization method to further investigate various genes that are affected at the transcription level by axotomy of the facial nerve. As a result, several genes whose expression fluctuates with axotomy can be isolated, and one of them is a novel gene whose expression is increased at the transcriptional level by axotomy. Named. It was found that the amino acid sequence deduced from the DNA sequence and the product (ranp-1 protein) obtained by expressing this gene using E. coli were proteins having a 5′-nucleotidase consensus sequence. Furthermore, the present inventors have found that this protein has no 5′-nucleotidase activity but enhances 5′-nucleotidase activity, and has completed the present invention.
[0006]
The protein whose expression increases with nerve injury of the present invention (ranp-1 protein) contains a consensus sequence of 5′-nucleotidase.
[0007]
According to a preferred embodiment, the 5′-nucleotidase consensus sequence is an amino acid sequence from Met at position 219 to Ser at position 229 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a similar sequence thereof.
[0008]
According to a preferred embodiment, the protein comprises an amino acid sequence from Met at position 1 to Glu at position 293 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a similar sequence thereof.
[0009]
The DNA sequence of the present invention encodes any of the proteins described above.
[0010]
According to a preferred embodiment, the DNA sequence has a base sequence consisting of A in position 741 to T in position 773 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0011]
According to a preferred embodiment, the DNA sequence has a base sequence consisting of A at position 87 to G at position 965 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0012]
According to a preferred embodiment, the DNA sequence has a base sequence consisting of G at position 1 to A at position 1733 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0013]
The expression vector of the present invention has any of the DNA sequences described above.
[0014]
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the above expression vector into a host.
[0015]
According to a preferred embodiment, the host is E. coli.
[0016]
The method for producing a protein whose expression increases with nerve damage of the present invention includes a step of culturing the transformant and a step of recovering the produced protein from the culture medium.
[0017]
The antibody of the present invention recognizes any of the proteins described above.
[0018]
According to a preferred embodiment, the antibody is a monoclonal antibody.
[0019]
The hybridoma of the present invention can produce any of the antibodies described above.
[0020]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(I) Definition
“5′-Nucleotidase” is an enzyme that hydrolyzes the 5′-position phosphate of a nucleotide into a nucleoside. In the present specification, it refers to a 5′-nucleotidase that is present on the membrane surface specifically called CD73, which is an ecto-type enzyme that is localized in the plasma membrane and has an active site on the cell membrane surface in eukaryotes. It is. An ecto-type enzyme is an enzyme that is an endogenous protein of a cell membrane and has an active site on the outer surface of a cell and exhibits activity toward the outside.
[0021]
A “similar sequence” to an amino acid sequence or DNA sequence is not necessarily limited to a specific sequence, and includes and is encoded in addition to this sequence, substitutions, insertions, deletions, etc. known to those skilled in the art. A sequence containing modifications that have substantially the same degree of protein function or activity. Alternatively, it may contain chemical or biochemical modifications, or non-natural or derivatized amino acids or bases, provided that the function or activity of the protein is substantially the same.
[0022]
(II) Method that can be used for isolation or identification of the protein or DNA sequence of the present invention General molecular biology experimental method that can be used in each step of the present invention (DNA electrophoresis, DNA separated by electrophoresis in gel) Recovery methods, ligation, host transformation, recombinant host culture, plasmid DNA preparation, DNA restriction enzyme cleavage, DNA radiolabeling, etc., for example, Molecular Cloning 2nd edition (Maniatis et al., Cold Spring) Methods known to those skilled in the art are employed as described in Harbor Laboratory, New York (1989)).
[0023]
The following describes general methods that can be used to isolate or identify the protein or DNA sequences of the present invention.
[0024]
(1) Cloning of ranp-1 cDNA
The cloning of a DNA fragment containing DNA encoding ranp-1, which is the protein of the present invention, is exemplified below together with a sequencing method. For ranp-1 of the present invention, since there is no information other than that expression is increased by facial nerve axotomy, in order to obtain this gene, differential hybridization is used, for example, as described below. .
[0025]
(A) Preparation of RNA
For example, an animal such as a rat is anesthetized and the facial nerve on one side is cut, for example, at the level of the stylus mastole. After an appropriate time, the animals are sacrificed and the cut and uncut facial facial nuclei are removed from their brain stem. RNA can be extracted from the brain tissue with each extracted facial nerve nucleus according to the guanidine thiocyanate method (Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156-159 (1987)).
[0026]
(B) Construction of cDNA library
A cDNA library can be constructed from RNA derived from the cut or non-cut facial facial nucleus obtained as described above using, for example, a commercially available cDNA construction kit (manufactured by GIBCO BRL). Oligonucleotides of appropriate length as adapter primers for cDNA synthesis and as adapters for insertion of cDNA into an appropriate vector can be chemically synthesized with a DNA synthesizer or the like.
[0027]
(C) Differential hybridization
The cDNA library obtained as described above is electroporated, for example, into E. coli. The fungus can be plated and grown, and then the cDNA insert in each clone of E. coli can be amplified by PCR using appropriate oligomers. The obtained PCR product is subjected to, for example, agarose gel electrophoresis and then transferred to a nylon membrane. For example, a double-stranded (ds) cDNA prepared from RNA extracted from a cleaved nerve nucleus 7 days after facial nerve axotomy, and a ds cDNA derived from the same rat non-cleaved nucleus, ³² Random labeling with P-dCTP can be used as a probe for hybridization. After the membrane and the probe are hybridized, the membrane is washed. By exposing this to an X-ray film, DNA whose expression increases on the cleavage side is detected.
[0028]
D
As described above, several cDNAs whose expression is elevated in the facial nucleus after axotomy can be isolated. A clone having such a gene affected by axotomy is partially sequenced by, for example, the dideoxy method, and this sequence is subjected to a nucleic acid homology search against, for example, the GenBank / EMBL / DDBJ DNA sequence database. obtain. As a result of this search, one new cDNA clone was isolated and named ranp-1.
[0029]
Using a portion of the ranp-1 cDNA obtained as described above as a probe, a cDNA library prepared from the facial nerve nucleus on the axotomy side was screened to isolate a clone containing almost the entire ranp-1 cDNA. obtain. The DNA base sequence can be analyzed using, for example, DNASIS (manufactured by Hitachi Software), and the base sequence of this cDNA can be determined. With respect to the amino acid sequence of a protein predicted from DNA, for example, a motif search can be performed on prosite which is a database. As a result of protein motif search, it was revealed that an ecto-type 5′-nucleotidase (CD73) consensus sequence exists at the C-terminus of the ranp-1 protein of the present invention.
[0030]
5'-nucleotidase is expressed in almost all organs of vertebrates and is present mainly on the membrane surface of glial cells in the brain of normal adult rats. In neurons, the presence of retinal photoreceptors and upper cervical ganglion synapses is currently recognized. It is also known that the expression of ecto-type 5'-nucleotidase increases with damage in perineuronal microglial cells existing around the nucleus on the facial nerve axotomy side of rats (Schoen et al., GLIA 6: 314-317 (1992)). This indicates that this enzyme converts extracellular nucleotides into nucleosides, which increases the permeability to biological membranes and assists in the uptake of nucleic acid precursors into proliferating glial cells and surrounding neurons. It is speculated that. In addition, when neurons in the molecular layer of the dentate gyrus are denatured by damaging the olfactory cortex of the rat hippocampus, the nerve endings of the degenerated neurons and the septal nucleus to regenerate this region High 5′-nucleotidase activity is observed in the synaptic space between the germinated and synaptically formed neurons. Furthermore, the ecto-type 5'-nucleotidase is a protein inserted into the membrane by lipids, and the entire region including the active site protrudes outside the membrane. As an adhesion molecule that binds to laminin, fibronectin, etc. Therefore, it is expected to be related to the microglial process around the nerve at the time of nerve injury. From the above, it is speculated that the ecto-type 5′-nucleotidase plays some positive role in nerve regeneration. Therefore, the ranp-1 protein of the present invention having such a 5′-nucleotidase consensus sequence is also considered to be involved in nerve regeneration.
[0031]
(2) Confirmation of ranp-1 tissue and tissue distribution
The tissue distribution of ranp-1 of the present invention can be confirmed by, for example, analyzing mRNA expression or ranp-1 protein expression. The expression of mRNA can be confirmed by Northern blot analysis using the ranp-1 cDNA of the present invention. The expression of ranp-1 protein can be confirmed by Western blot analysis after preparing an antibody against this protein. The ranp-1 mRNA of the present invention was expressed in all tissues of normal rats, and in particular, it was highly expressed in the liver, kidney, and brain. In addition, the expression of the ranp-1 protein of the present invention has been confirmed in the brain cytoplasm.
[0032]
The tissue distribution of ranp-1 of the present invention can be confirmed, for example, by analyzing mRNA by in situ hybridization or the like and protein by immunohistochemistry using an antibody or the like. In situ hybridization can be performed on frozen sections of tissues using, for example, isotope or digoxigenin labeled RNA probes as described in the known literature (Nakayama et al., Mol Brain Res 21: 206-218 (1994)). . this Reveal Microscopic examination revealed that ranp-1 mRNA of the present invention was elevated in the nerve nucleus on the nerve cut side.
[0033]
(3) Expression of ranp-1 protein
The gene encoding ranp-1 of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, pGEX5X-3, pGEX4T-3, etc., and is used as an expression vector for expressing ranp-1 protein.
[0034]
This expression vector is introduced into, for example, bacteria, yeast, insect cells, or animal cells to produce transformants. By culturing the transformant, the ranp-1 protein of the present invention can be produced. The ranp-1 protein of the present invention can also be produced as a fusion protein with an appropriate protein.
[0035]
The expressed ranp-1 protein of the present invention or a fusion protein thereof can be used as an antigen for producing an antibody against the ranp-1 protein. An antibody can be prepared using only a specific portion of the ranp-1 protein of the present invention as an antigen.
[0036]
For example, a transformant can be prepared by incorporating a gene encoding the ranp-1 protein of the present invention into the SmaI site of pGEX5X-3, creating an expression vector containing the gene, and introducing it into Escherichia coli or the like. . This transformant can be expressed as a glutathione S-transferase (GST) fusion protein. The ranp-1 gene production culture thus obtained can be purified by an affinity column method or the like.
[0037]
(4) Production of antibodies against ranp-1 protein
The ranp-1 protein or fusion protein obtained as described in the above section (3) can be injected into, for example, a rabbit to induce antiserum, and the antibody can be purified from the serum using a ranp-1 protein affinity column. By using the antibody thus obtained, for example, the Western blot analysis described in the above item (2) can be performed.
[0038]
(5) Measurement of 5′-nucleotidase activity
5′-nucleotidase activity can be determined using 5′-AMP as a substrate. For example, GST-ranp-1 fusion protein, GST protein as a negative control, or 5′-nucleotidase as a positive control, 50 mM glycine buffer, pH 8.5, 5 mM MgCl. ₂ Incubate for 30 minutes at 37 ° C. in a substrate solution containing 10 mM 5′-AMP, and add a reaction stop solution (10% trichloroacetic acid, 0.02% ascorbic acid). The 5′-nucleotidase activity can be quantified by the amount of phosphate liberated from 5′-AMP in the reaction solution. From this result, it was revealed that the ranp-1 protein of the present invention does not have 5′-nucleotidase activity.
[0039]
(6) Binding assay with 5′-AMP
For example, a sample is applied to a 5′-AMP Sepharose 4B gel, and free 5′-AMP is used to elute proteins that are specifically bound to the gel by an exchange substitution reaction. Binding assays can be performed. From this assay result, it was revealed that the ranp-1 protein of the present invention has a region that specifically binds to 5′-AMP.
[0040]
(7) Production of anti-ranp-1 antibody
The antibody against the ranp-1 protein of the present invention is derived, for example, from a serum obtained by immunizing an animal such as a mouse, rat, or rabbit with a protein capable of producing an antibody that recognizes the ranp-1 protein or a part thereof as an immunogen. Antibodies (polyclonal antibodies) can be prepared. Alternatively, after removing cells from the spleen or lymph node of an immunized animal and fusing with cells such as myeloma cells to produce a hybridoma, a monoclonal antibody can be produced from the hybridoma.
[0041]
The ranp-1 protein of the present invention can be immunologically measured using an antibody against the ranp-1 protein of the present invention. For example, an antigen-antibody competition reaction is performed by adding an unlabeled antigen of known concentration and a polyclonal or monoclonal antibody derived from serum to a certain amount of labeled protein having the same antigenic site as the immunogen used for immunization. . After appropriately changing the concentration of the unlabeled antigen, the labeled antigen bound to the antibody and the labeled antigen not bound to the antibody are separated by an appropriate method, and the amount of radioactivity and enzyme activity of the labeled antigen bound to the antibody Or measure fluorescence intensity. As the amount of unlabeled antigen increases, the amount of labeled antigen that binds to the antibody decreases. This relationship is graphed to obtain a standard curve.
[0042]
Next, a sample containing an unknown amount of antigen is added to the above reaction system instead of an unlabeled antigen with a known concentration, and the amount of radioactivity, enzyme activity, or fluorescence intensity obtained after reacting this is applied to a standard curve. If so, the amount of the antigen in the sample can be known.
[0043]
【Example】
[Example 1] Differential hybridization of cDNA library
In order to obtain a gene whose expression fluctuates due to facial nerve axotomy, differential hybridization was performed as described below using a cDNA library prepared from mRNA of rat facial nerve nucleus and a probe.
[0044]
(1) Preparation of RNA
Forty adult male Sprague-Dawley rats (6-8 weeks old) were anesthetized with sodium pentobarbital, and the left facial nerve was dissected at the level of the pedicle mastole. Seven days later, these rats were sacrificed by decapitation under ether anesthesia. The rat brainstem was cut with a razor blade so that the facial nerve nuclei on both sides were contained in a 1.5 mm thick slice, and each facial nucleus was removed with a 15 gauge stainless tube (Yu, “ A dissection and tissue culture manual of the nervous system "(Shahar et al., Pp. 30-39, New York: Alan R. Liss Inc. (1989)). RNA was extracted from each extracted brain tissue with facial nucleus in accordance with a known method (Chomczynski and Sacchi, (1987) supra).
[0045]
(2) Construction of cDNA library
A cDNA library was constructed from 30-60 μg of total RNA derived from the left (cut) or right (non-cut) facial nucleus obtained as described above, using the Superscript cDNA synthesis kit (GIBCO-BRL). Oligomer A (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) was used as an adapter primer for first strand cDNA synthesis, and oligomers B and C were used as adapters for cDNA insertion into pBluescript SK vector (Stratagene). Adapters annealed (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, respectively) were used. These oligomers were synthesized with a Pharmacia Gene Assembler Plus DNA synthesizer. A double-stranded (ds) cDNA was size-fractionated by gel filtration and bound to the pBluescript SK vector (Stratagene) to prepare a cDNA library.
[0046]
(3) Differential hybridization
The cDNA library obtained in the above (2) is electroporated to E. coli ElectroMAXDH10B (GIBCO-BRL) using GenePulser (Bio-Rad) under the conditions of 16.6 kv / cm and pulse length 4 ms. went. This bacterium is plated on a LB plate (containing 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 10 g of sodium chloride, and 10 g of agar (pH 7.0) in 1 L), and the cDNA insert in each clone of E. coli is used as oligomer A and oligomer. Amplified by PCR using B. PCR was performed with AmpliTaq DNA polymerase (Perkin-Elmer-Cetus) and DNA thermal cycler (Perkin-Elmer-Cetus) using the following thermal cycling conditions: Denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, 55 30 seconds anneal at ℃, 1 minute extension at 72 ℃; 30 cycles. Each PCR product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis in two lanes each in an equal amount (10 μl), and then transferred to a nylon membrane (manufactured by PALL). Using a Prime-It II (Stratagene), dscDNA prepared from RNA extracted from the cleaved nerve nucleus 7 days after facial nerve axotomy, and dscDNA derived from the same rat non-cleaved nucleus, ³² Randomly labeled with P-dCTP (Amersham). Each of these membranes was used as a probe, and each membrane was hybridized in a hybridization buffer (0.5 M sodium phosphate (pH 7.2), 1 mM EDTA, 1% BSA, 7% SDS) at 65 ° C. for 16 hours. Thereafter, the membrane was washed with 0.1 × SSC at 55 ° C., and exposed to an X-ray film (Eastman Kodak) at −70 ° C. for 16 hours in the presence of an intensifying screen.
[0047]
(4) Homology search of DNA sequence and deduced amino acid sequence
After carrying out differential hybridization and growing a positive E. coli clone in LB broth medium, the DNA was denatured for 5 minutes on ice in 0.2N NaOH and 1% SDS, and then 7.5M ammonium acetate was added. Next, add phenol to denature the protein, centrifuge to remove protein, collect the supernatant and precipitate with ethanol.) Several cDNAs were isolated that increased expression at the transcriptional level in the facial nucleus after transection. A clone having such a gene affected by axotomy is partially sequenced by the dideoxy method (100 to 200 base pairs (bp)) using the T7 Sequencing kit (Pharmacia), and this sequence A nucleic acid homology search was performed on the GenBank / EMBL / DDBJ DNA sequence database using the FASTA program. By this nucleic acid homology search, seven known cDNA clones, such as GAP43 and α-tubulin, whose expression was increased at the transcriptional level in the facial nucleus after axotomy, and one new cDNA clone were isolated. did. This new gene was named ranp-1.
[0048]
By screening a cDNA library prepared from the facial nerve nucleus on the axotomy side using a part of the ranp-1 cDNA obtained by differential hybridization (about 400 bp at the 3 ′ end) as a probe, A clone containing the full length was isolated. Thereafter, the DNA base sequence was analyzed using DNASIS (manufactured by Hitachi Software), and the base sequence (1733 bp) of this cDNA was determined. As a result of homology search in the DNA database again for the full-length cDNA, there was no gene having high homology with this gene. Therefore, ranp-1 is a novel gene. This gene contains an open reading frame of 292 amino acids, the predicted protein molecular weight is 34 kilodaltons (kd), and the isoelectric point is 7.4. In addition, the amino acid sequence of a protein predicted from DNA was subjected to motif search against prosite, which is a database, using computer software MacPattern 2.01 (Fuchs, Biosci 7: 105-106 (1991)). As a result of protein motif search, it was revealed that an ecto-type 5′-nucleotidase (CD73) consensus sequence exists at the C-terminus.
[0049]
[Example 2] In situ hybridization of ranp-1 mRNA
Plasmid DNA into which about 400 bp at the 3 ′ end of ranp-1 cDNA is inserted is digested with restriction enzyme MluI (manufactured by TOYOBO), and then T3 RNA polymerase is used. ³⁵ Antisense RNA labeled with S-UTP (800 Ci / mmol, manufactured by Amersham) was prepared. Using this as a probe, in situ hybridization was performed as follows using a section of a rat brain stem 7 days after axotomy fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde. That is, the fixed section was mixed with hybridization buffer (50% formamide, 0.5M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% poly [vinylpyrrolidone], 0.1% SDS, 100 μg / ml salmon sperm DNA, 500 μg / ml yeast tRNA, 125 nM uridine 5 ′-[α-tthio] triphosphate, 10 mM DTT, 10% dextran sulfate) ³⁵ S-labeled RNA probe (specific activity: 1 × 10 ⁶ cpm / ml) and hybridization at 55 ° C. for 16 hours. The hybridized section was washed with a washing buffer (0.1 × SCC, 20 mM DTT) at 65 ° C. for 30 minutes. Next, the sections were treated with RNase A (20 μg / ml: Sigma) at 37 ° C. for 30 minutes. This was further washed at 65 ° C. for 30 minutes, dehydrated with ethanol and air-dried. The dried sections were soaked in Kodak nuclear emulsion NTB2 and exposed to light at 4 ° C. for 3 hours in the dark. After development, the sections were stained with hematoxylin-eosin, and a signal was detected using a microscope (Zeiss Axiophoto: Karl-Zeiss) capable of observing a dark field-bright field image.
[0050]
Night vision Noken The result of microscopic inspection is shown in FIG. The facial nucleus is at the arrow in the figure, with the left side being the cut side and the right side being the non-cut side. Ranp-1 mRNA exists in the part confirmed as a white point in the figure. As is apparent from the figure, the expression of ranp-1 was elevated in the nerve nucleus on the cut side. Also clearly shown in FIG. Noken The result of microscopic examination is shown. The part confirmed as a black spot in the figure is a part where ranp-1 mRNA exists, and it was also clarified that ranp-1 mRNA exists in nerve cells.
[0051]
[Example 3] Expression of ranp-1 mRNA in normal rat tissue
In order to examine the expression of ranp-1 mRNA in each rat tissue, Northern blot analysis was performed as follows. A DNA fragment containing about 400 bp at the 3 ′ end of ranp-1 cDNA was used with Prime-It II (Stratagene), ³² Randomly labeled with P-dCTP (Amersham). Using this as a probe, a nylon membrane (Rat Multiple Tissue Northern (MTN) Blot (Clontech) with 5 μg of mRNA obtained from each organ (heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and testis) of normal rats was used as a probe. And a hybridization buffer solution at 65 ° C. for 16 hours. Thereafter, the filter was washed with 0.1 × SSC at 65 ° C., and exposed to an X-ray film at −70 ° C. for 16 hours in the presence of an intensifying screen.
[0052]
The results are shown in FIG. ranp-1 mRNA was expressed in all tissues examined, and was found to be particularly abundant in the liver, kidney, and brain. Moreover, all the sizes were 2.4 kb.
[0053]
[Example 4] Expression of ranp-1 protein in E. coli
In order to express the full length of the open reading frame of ranp-1 protein as a fusion protein with glutathione S-transferase (GST), the plasmid DNA into which ranp-1 cDNA has been inserted is digested with the restriction enzyme BalI (Takara Shuzo). did. After this fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, a DNA fragment necessary for expression was recovered and purified using a DEAE membrane (manufactured by Schleicher & Schnell). The obtained DNA fragment was digested with the restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo), and then treated with bovine small intestine alkaphosphatase (CIAP: Takara Shuzo). Plasmid pGEX5X-3 (Pharmacia) reads the amino acid reading frame. As such, T4 DNA ligase (GIBC0-BRL) was used for binding at 16 ° C. for 16 hours. This was electroporated into Escherichia coli ElectroMaxDH10B (GIBCO-BRL). Next, the desired E. coli clone is isolated, cultured in LB medium, and isopropylthio-β-D-galactopyranoside (manufactured by Sigma) is added to the final concentration of 0.5 mM in the bacterial solution in the logarithmic growth phase. And was incubated at 37 ° C. for 2 hours to induce protein expression. E. coli was collected, sonicated in PBS containing 1% Triton X100, and centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes at 4 ° C. The soluble fraction of the obtained supernatant was adsorbed to glutathione-Sepharose 4B (Pharmacia) for 5 minutes at room temperature. Next, this gel is thoroughly washed with PBS, and the protein bound to the gel is left in an elution buffer of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 5 mM glutathione (manufactured by KOHJIN) at room temperature for 5 minutes. Was eluted with. Next, this protein is applied to HiTrapQ (Pharmacia) which is a cation exchange column, and 0 to 1 M NaCl salt concentration gradient is applied to 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) which is a mobile phase by FPLC (Pharmacia). The ranp-1 protein was eluted and purified. 1 μg of the obtained protein was subjected to 12.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the purified fusion protein was detected by Coomassie Brilliant Blue staining.
[0054]
The result of detecting this protein is shown in FIG. The M lane is a molecular weight marker. The expected molecular weight protein (34 kd) was observed in the lane of the GST-ranp-1 fusion protein.
[0055]
[Example 5] Production of antibody against ranp-1 protein
100 μg of the purified GST-ranp-1 fusion protein obtained in Example 4 was formed into an emulsion using Freund's complete adjuvant (manufactured by DIFCO), and then injected subcutaneously into a New Zealand white rabbit. A boost was performed one month after the first immunization, and whole blood was collected 18 days later.
[0056]
The purified GST-ranp-1 fusion protein and GST protein obtained in Example 4 above were each bound to a CNBr-activated Sepharose 4B (Pharmacia) gel and immobilized, and each was packed in a column, A GST-ranp-1 column and a GST column were used. First, the rabbit antiserum was applied to a GST-ranp-1 column, the gel was washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 0.3 M NaCl), and then an elution buffer (0.17 M glycine-HCl, pH In 2.3), the antibody specifically bound to the gel was eluted. After neutralization with 1M Tris-HCl, pH 9.0, the antibody was applied to a GST column. Since the anti-GST antibody adsorbs to the column, an anti-ranp-1 protein antibody was obtained by collecting the flow-through fraction.
[0057]
The obtained antibody was confirmed by Western blot analysis as follows. Purified GST-ranp-1 fusion protein and GST protein were converted to 0.1 μg and 0.5 μg SDS, respectively, followed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the band on the gel was transferred to a nanocellulose membrane (manufactured by ATTO). did. This membrane was blocked in PBS (blocking solution) containing 5% skim milk (manufactured by DIFCO) at 4 ° C. for 16 hours. Next, the blocked membrane was reacted with a purified anti-ranp-1 protein antibody (primary antibody) diluted 1: 500 with a blocking solution for 1 hour at room temperature. The membrane was washed with PBS containing 0.05% Tween 20, and reacted with avidin-horseradish peroxidase-labeled biotin (secondary antibody) using an ABC kit (manufactured by Vectastain), and then a chemiluminescence enhancement system (manufactured by Amersham) Was used to detect the protein.
[0058]
The results are shown in FIG. A band was detected only in the lane of the GST-ranp-1 fusion protein (62 kd), and no GST protein was detected. Therefore, it was revealed that the obtained antibody was an antibody that recognizes only the ranp-1 protein.
[0059]
[Example 6] Expression of ranp-1 protein in rat brain tissue
The protein of normal rat brain cells was subjected to Western blot analysis as follows to examine the expression of ranp-1 protein. Normal rat brains were homogenized in lysis buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 50 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 2% NP-40, 0.2% SDS, 1 mM PMSF). This was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered. Protein quantification was performed using Bio-Rad Protein Assay. After 15 μg of the sample was converted to SDS, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed, and the band on the gel was transferred to a nanocellulose membrane (manufactured by ATTO). This membrane was blocked in PBS (blocking solution) containing 5% skim milk (manufactured by DIFCO) at 4 ° C. for 16 hours. Next, the blocked membrane was reacted with a purified anti-ranp-1 protein antibody (primary antibody) diluted 1: 500 with a blocking solution for 1 hour at room temperature. The membrane was washed with PBS containing 0.05% Tween 20, and reacted with avidin-horseradish peroxidase-labeled biotin (secondary antibody) using an ABC kit (manufactured by Vectastain), and then a chemiluminescence enhancement system (manufactured by Amersham) Was used to detect ranp-1 protein.
[0060]
The results are shown in FIG. The M lane is a molecular weight marker. A 68 kd protein was detected in the cytoplasmic protein lane of normal rat brain. Since the estimated molecular weight of ranp-1 protein is 34 kd, this protein is considered to have undergone post-translational modification in the cell.
[0061]
[Example 7] Measurement of 5'-nucleotidase activity of ranp-1 protein
The ranp-1 protein was found to contain a 5′-nucleotidase consensus sequence at the C-terminus by motif search. Therefore, the GST-ranp-1 fusion protein expressed in E. coli was used to examine whether or not the ranp-1 protein has 5′-nucleotidase activity.
[0062]
5'-nucleotidase activity was determined as follows using 5'-AMP as a substrate. 50 mM glycine buffer, pH 8.5, 5 mM MgCl ₂ The sample was added to 200 μl of a substrate solution containing 10 mM 5′-AMP and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then 1 ml of a reaction stop solution (10% trichloroacetic acid, 0.02% ascorbic acid) was added. A part (750 μl) of the reaction solution is taken and phosphoric acid liberated from 5′-AMP is converted into phosphomolybthenic acid by Gerlach et al. (Gerlach and Hiby, “Methods of Enzymatic Analysis”, Volume 2 (Bergmeyer) 871-875. Page, Academic Press, New York (1974)). That is, 5 ml of 5′-nucleotidase reaction solution (750 μl) was added with water to make 1 ml, 40 mM ammonium molybdate (200 μl) and a reducing solution (100 μl) were added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, the reaction was stopped by adding 2.5 M sodium acetate (400 μl) and 300 μl of water, and the absorbance at 578 nm of this solution was measured. One unit of enzyme is defined as a unit that hydrolyzes 1 μmol of inorganic phosphate per minute from the substrate 5′-AMP at 37 ° C.
[0063]
FIG. 8 shows that in the above substrate solution, 1.2 μg of GST-ranp-1 fusion protein, 1.6 μg of GST protein as a negative control, or 5′-nucleotidase (5′-N; crotalus atrox venom (snake venom) as a positive control. ) Origin, manufactured by Sigma) 0.1 unit was added, and the results of measuring 5′-nucleotidase activity are shown. The 5′-nucleotidase activity of the GST-ranp-1 fusion protein was equivalent to that of the negative control GST protein, and it was revealed that the ranp-1 protein has no 5′-nucleotidase activity.
[0064]
Next, the effect of this protein on 5′-nucleotidase was examined. In 200 μl of the substrate solution, 0.01 unit of 5′-nucleotidase was added, and 1.5 μg (24 pmol) of GST-ranp-1 fusion protein or 0.8 μg (29 pmol) of GST protein was added. The measurement was performed according to the method for measuring the dase activity. The results are shown in FIG. By adding the GST-ranp-1 fusion protein, the 5′-nucleotidase activity was approximately 5-fold. This suggested that the GST-ranp-1 fusion protein has a function of enhancing 5′-nucleotidase activity in vitro. In addition, the addition of GST protein did not show such an increase in activity, and thus the increase in 5′-nucleotidase activity is considered to be due to the ranp-1 protein.
[0065]
[Example 8] Binding assay between ranp-1 protein and 5'-AMP
It is known that there are two types of consensus sequences of ecto-type 5′-nucleotidase in the 5′-nucleotidase sequence, and the ranp-1 protein of the present invention has one of these sequences. . Currently, one of the two types of consensus sequences corresponds to the active center of the enzyme, and the other is thought to be necessary for the binding of 5′-AMP, which is a substrate, but the correspondence to that sequence is not known. . The reason that ranp-1 protein has the function of enhancing 5′-nucleotidase activity in vitro is that ranp-1 protein binds to 5′-AMP, which is a substrate of 5′-nucleotidase, and 5′-nucleotidase. It is expected that a mechanism will deliver it efficiently.
[0066]
To examine this, a binding assay between ranp-1 protein and 5′-AMP was performed. Equilibrate with the same buffer for solutions containing 1.4 μg of GST-ranp-1 fusion protein and 1.6 μg of GST protein in 500 μl of binding buffer (10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 0.5 M NaCl), respectively. 50 μl of the 5′-AMP Sepharose 4B (Pharmacia) gel was added. After standing at room temperature for 10 minutes, the gel was washed thoroughly with binding buffer, and glycine buffer (pH 7.0) containing 10 mM 5′-AMP was added thereto. The protein specifically bound to the gel was eluted by leaving it at room temperature for 10 minutes and exchanging with 5′-AMP. 10 μl of each eluate was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to detect proteins bound to 5′-AMP.
[0067]
The results are shown in FIG. The GST-ranp-1 fusion protein was eluted from the column with 5′-AMP, indicating that it was specifically bound to 5′-AMP. GST protein was not eluted from the column with 5′-AMP, indicating that it was not bound to 5′-AMP. Therefore, it was revealed that there is a region that specifically binds to 5′-AMP in the ranp-1 portion of the GST-ranp-1 fusion protein.
[0068]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a protein different from the above-mentioned conventional technology, in particular, a protein containing a 5′-nucleotidase consensus sequence, whose expression increases with nerve damage. Furthermore, according to the present invention, a structural gene of the above protein; an expression vector having the gene; a transformant introduced with the expression vector; a method for producing a protein whose expression increases with nerve damage using the transformant; An antibody that recognizes the protein; and a hybridoma capable of producing the antibody are provided.
[0069]
The ranp-1 protein of the present invention enhances 5′-nucleotidase activity and specifically binds to 5′-AMP, which is a substrate for 5′-nucleotidase. Therefore, it is considered that the ranp-1 protein of the present invention is involved in 5'-nucleotidase, and the function of efficiently passing a substrate to this enzyme and the utilization efficiency of nucleic acids to cells are enhanced. Since the ecto-type 5′-nucleotidase is also a molecule that is implicated in nerve regeneration, the ranp-1 protein of the present invention controls the ecto-type 5′-nucleotidase activity to control nerves. It may be deeply involved in cell function recovery. From this, the ranp-1 protein of the present invention may be useful for elucidating the mechanism of nerve regeneration. Furthermore, the ranp-1 gene of the present invention is also present in brains other than the liver. Therefore, by controlling the expression of the ranp-1 gene and protein of the present invention, it may be possible to apply to the treatment of neurological diseases and increase the activities of various organs of the body.
[0070]
[Sequence Listing]
[0071]
[SEQ ID NO: 1]

[0072]
[SEQ ID NO: 2]

[0073]
[SEQ ID NO: 3]

[0074]
[SEQ ID NO: 4]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a biochemical reaction catalyzed by ecto-type 5′-nucleotidase.
FIG. 2 is a dark-field photomicrograph showing the expression of ranp-1 mRNA of the present invention by in situ hybridization in the facial nerve nucleus 7 days after the cut of facial nerve axons in rats.
FIG. 3 is a bright-field photomicrograph showing the expression of the ranp-1 mRNA of the present invention by in situ hybridization in the facial nerve nucleus 7 days after facial nerve axotomy in rats.
FIG. 4 is a photograph of an electrophoretic image showing the results of Northern blot analysis for the expression of ranp-1 mRNA of the present invention in each tissue of rats.
FIG. 5 is a photograph of an electrophoretic image showing the results of an immunoblotting analysis showing the expression of a GST-ranp-1 fusion protein expressed in E. coli.
FIG. 6 is a photograph of an electrophoretic image showing the results of Western blot analysis of a GST-ranp-1 fusion protein using an anti-ranp-1 antibody.
FIG. 7 is a photograph of an electrophoretic image showing the results of Western blot analysis of the ranp-1 protein of the present invention in rat brain cytoplasm.
FIG. 8 is a graph showing the measurement results of 5′-nucleotidase activity of the ranp-1 protein of the present invention.
FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the influence of the ranp-1 protein of the present invention on 5′-nucleotidase activity.
FIG. 10 is a photograph of an electrophoretic image of immunoblotting analysis showing the results of examining specific binding of ranp-1 protein of the present invention to 5′-AMP.

Claims

配列表の配列番号１の１位のMetから２９３位のGluまでのアミノ酸配列からなるタンパク質。Protein consisting of the amino acid sequence from Met at position 1 of SEQ ID No. 1 to 293 of the Glu.

請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子。A nucleic acid molecule encoding the protein of claim 1 .

配列表の配列番号１の８７位のＡから９６５位のＧまででなる塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸分子。 Consisting 965 of the nucleotide sequence comprising up to G from position 87 A of SEQ ID No. 1, the nucleic acid molecule of claim 2.

配列表の配列番号１の１位のＧから１７３３位のＡまででなる塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸分子。 Consisting of the nucleotide sequence consisting of up to A in 1733 from position 1 of the G of SEQ ID No. 1, the nucleic acid molecule of claim 2.

請求項２〜４のいずれかに記載の核酸分子を有する発現ベクター。An expression vector comprising the nucleic acid molecule according to any one of claims 2 to 4 .

請求項５に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。A transformant obtained by introducing the expression vector according to claim 5 into a host.

前記宿主が大腸菌である請求項６に記載の形質転換体。The transformant according to claim 6 , wherein the host is Escherichia coli.

請求項６に記載の形質転換体を培養する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。The method for producing a protein according to claim 1, comprising a step of culturing the transformant according to claim 6 and a step of recovering the produced protein from the culture medium.