JP3644780B2

JP3644780B2 - Immunological quantification equipment

Info

Publication number: JP3644780B2
Application number: JP34618896A
Authority: JP
Inventors: 秀規鈴木; 利夫原; 秀一松岡
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-12-25
Filing date: 1996-12-25
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2016-12-25
Also published as: JPH10185921A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的反応を利用して試料溶液中の目的物質を定量的に測定可能な免疫学的測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学診断薬の分野での液体試料中に含まれる物質の測定手段として、種々の分析法が開発されているが、特に高感度測定法として抗原抗体反応を利用した免疫学的方法が幅広く用いられている。臨床検査分野ではこの測定原理を応用した装置を用いて多くの対象項目について分析されている。さらに、医院や、一般家庭でもこの免疫反応を利用した簡易測定の必要性も高まり、その目的のための簡易型測定装置／方法（以下システムと略す）の開発も進歩しつつある。
【０００３】
この様なシステムの中に例えば「スティック法（特開昭６２−５０１０３４、同６４−４６３等参照）」がある。この方法は一般に固体支持体上に固定化された抗体と試験試料とを反応させた後、この支持体を取り出して洗浄し、標識試薬と反応させ検出可能なシグナルを得る方法で、洗浄工程並びに複数の操作手順を必要とする。
【０００４】
洗浄工程を省略したシステムとして、「膜アッセイ法（特開昭６３−２８１０５３、特開平１−２９９４６４、同２−１２０６１、特表平２−５００５４０等参照）」がある。この方法は多孔質膜に抗体を固定化し、この多孔質膜と吸収剤を組み合わせ、試験試料、標識化試薬を順次加えて検出可能なシグナルを得る方法で、複数の操作手順を必要とする。
また、操作手順を簡略化したシステムとして、「凝集法（特開昭６２−３９７７０、特開平１−１２３１４９等参照）」があるが、測定時間（３０〜６０分）が長く、判定に個人差を生じやすい等の欠点がある。
【０００５】
この様な欠点を補うシステムとして「免疫クロマトグラフィー法（特公平７−４６１０７、同７−１３６４０、特開昭６４−６３８６５並びに同６１−１４５４５９等参照）」が開発された。このシステムは、抗体が固定化されたフィルター状担体に各試薬をあらかじめ塗布しておき、試験試料を所定の位置に加え、毛細管現象により多孔質担体上を試料が移動した後、所定の位置に結合した標識試薬を計測する方法で、洗浄操作（未反応物質の除去工程）が必要ないため、簡便でかつ迅速な方法である。
【０００６】
更に、試験試料と特異的に結合可能な捕獲抗体を試料適用部からの距離に比例して段階的に高濃度になるように複数本ライン状に固定化することで、定量的に検出できるようになった（特開平７−１５９３９８）。しかし、尿中アルブミンのように測定対象濃度が高濃度領域にある場合は、高濃度でプロゾーン現象が現れ、結果の判定が困難である。
そこで、被検物質であるヒトアルブミンと測定装置上に固相化したアルブミンとの間でアルブミンに対する標識抗体を競合的に反応させることで、このプロゾーン現象を回避することができたが、結果を呈色の色調又は強度で肉眼的に判定するため、結果の保存性が低く、客観性に欠け、定量的に検出できない等の問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プロゾーン現象を起こすことなく、ワンステップでしかも迅速に試料溶液中の目的物質すなわち測定対象物を定量的に測定でき、かつ測定結果の保存ができる免疫測定装置を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決するために、免疫クロマト装置上で固定化された目的物質と試料溶液中の目的物質との間で目的物質と反応性を有する標識化された反応体（標識反応体、例えば標識抗体）を競合的に反応させ、吸収されずに展開された目的物質と標識反応体との反応生成物を判定部でライン状に複数本固定化した標識反応体に対する抗体で捕獲し、結合した反応体のライン数ないしはそれらの出現パターンで定量的に測定する方法を鋭意検討した結果、従来の免疫クロマト法で採用されていた方法とは逆に、検出領域で目的物質と特異的に結合可能な捕獲抗体の濃度を試料適用部からの距離に反比例して段階的に下げることにより、定量的に検出できることが明らかとなった。
【０００９】
従って、本発明は、試料溶液中の目的物質を定量的に測定するための多孔性担体からなる装置であって、該多孔性担体に試料溶液が直接又は間接的に接触可能な部位と、その下流に試料溶液中の目的物質と親和性を有する標識化された反応体（標識反応体と称し、その代表例として標識抗体と称する場合もある）が移動可能な状態で保存された部位と、その下流に目的物質または目的物質と同等な抗原性を有する物質が多孔性担体に固定化された部位と、更にその下流に標識反応体に対する抗体が検体溶液の移動方向に対して交差する方向に複数本ライン状に固定化され、下流側のラインの抗体量が上流側のラインの抗体量比べ段階的に少なくなるように設定されている部位とからなる、免疫測定装置を提供する。
【００１０】
【発明の効果】
本発明はクロマト担体上で競合反応を行うため、プロゾーン現象を抑制することができる。また、従来の方法では目的物質の濃度を判定領域において呈色の色調又は強度で肉眼的に判定していたため、客観性に欠け結果の保存性も低かったが、本発明では標識反応体に対する抗体を梯子状に固相化しており、反応したラインの本数ないしはその呈色パターンによって判定するため、客観的に目的物質の定量ができ、かつ簡易で迅速な測定が可能となった。また、標識反応体の標識物質に直接目視可能な標識物質を使用することにより、結果を保存することもできる。
【００１１】
【具体的な説明】
本発明装置は、多孔性担体に試料溶液が直接又は間接的に接触可能な部位と、その下流に試料溶液中の目的物質と親和性を有する標識反応体が移動可能な状態で保存された部位と、その下流に目的物質または目的物質と同等な抗原性を有する物質が多孔性担体に固定化された部位と、更にその下流に標識反応体に対する抗体が検体溶液の移動方向に対して交差する方向に複数本ライン状に固定化され、下流側のラインの抗体量が上流側のラインの抗体量比べ段階的に少なくなるように設定されている部位とからなるものである。
【００１２】
その一例を模式的図１に示すが、図１において第１領域では目的物質と標識反応体が反応し複合体を形成する。第２領域ではこの複合体と固定化した目的物質又は目的物質と同等な抗原性を有する物質との間で競合反応が起こり、目的物質と反応しなかった過剰の標識反応体が固相にトラップされる。第３領域では第２領域でトラップされなかった複合体がライン状に複数本固定化された標識反応体に対する抗体によって捉えられる。以下詳細に説明する。
【００１３】
第１領域中の試料添加部は多孔性担体から成り、直接又は間接的に添加された尿などの試料溶液は毛細管現象等の作用により担体に保持され、次の領域へ移動する。これらの担体は必要に応じてpH緩衝剤または非特異的結合を阻止する目的で蛋白質を塗布することもでき、これにより試料の反応環境を整えることができる。このための緩衝剤の種類およびpHは、分析試料の種類、そのpH、分析対象の種類、分析に用いる反応試薬（例えば抗原、抗体、標識物質等）により異なるが、例えばＴｒｉｓ緩衝剤、ジエタノール緩衝剤、リン酸緩衝剤、等、常用の緩衝剤を用いることができる。担体に緩衝剤を付加するには、例えば緩衝液、１００ｍＭ〜１Ｍ濃度の緩衝液により担体を含浸し、これを常法にしたがって乾燥すればよい。非特異的結合阻止の目的の常用のブロッキング剤としては例えばゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン等を用いることができる。
【００１４】
試料添加部の下流には標識反応体が移動可能な状態で保持されており、毛細管現象により下流へ移動してきた試料溶液中の目的物質と結合して複合体を形成し、未結合の標識反応体と共に、第２領域へと移動して行く（目的物質が存在しない場合は、標識反応体のみが第２領域へと移動していく）。本発明において、目的物質に親和性を有する反応体としては目的物質に対する抗体、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が好ましい。例えば、目的物質（分析対象）がヒトアルブミンである場合、抗ヒトアルブミンモノクローナルまたモノクローナル抗体が使用される。
【００１５】
標識反応体の標識物としては、この分野において知られている常用の標識物質を用いることができる。例えば標識物質として、それ自体が色を有し、直接目視できる物質、それ自体発光性を有する物質、更なる反応によって検出可能なシグナルを発生する物質等を用いることができるが、簡便性、迅速性の点から直接目視可能な物質又はそれ自体発光性を有する物質が好ましい。
【００１６】
直接目視可能な物質としては、例えば、Ｌａｔｅｘ等の着色粒子、ＣｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄＣｏｌｌｏｉｄａｌｓｉｌｖｅｒ等のコロイド状粒子、Ｆｏｒｏｎ，ＢｒｉｌｌｉａｎＢｌｕｅＳＲ，ＰａｌａｎｉｌＹｅｌｌｏｗ３ＧＥ等の染料粒子（分散染料）等を挙げることができるが、コロイド状粒子、染料粒子等が特に好ましい。また、それ自体発光性を有する物質としては蛍光呈色団、例えばフルオレッセイン等を用いることができる。更なる反応により検出可能なシグナルを発生させる事ができる物質としては、例えば酵素、酵素等を収容したリポソーム等を用いることができる。
【００１７】
酵素としては例えばアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることができ、これらの検出方法、並びに抗体への導入方法もこの分野で知られている方法を用いることができる。このような要件を満たすための担体としては例えばガラス繊維濾紙、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などがある。
第１領域中の標識反応体保持部の多孔性担体の寸法は特に制限はないが、使用時においては試料添加部と同じ幅を持ち、例えば幅２mm〜１０mm、長さ５mm〜３０mm、厚さ２０μｍ〜１０００μｍ程度のものを使用できる。
【００１８】
第２領域においては、第１領域から展開してきた試料中の目的物質と標識反応体の反応混合物（反応生成物である複合体と未反応の標識反応体を含む）のうち目的物質に結合していない過剰の標識反応体を吸収除去するために、目的物質または目的物質と同じ抗原性を有する物質を固定化した担体を用いることができる。担体としては、例えばガラス繊維濾紙、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などがある。多孔性担体の寸法は特に制限はないが、使用時においては第１領域と同じ幅を有し、例えば幅２mm〜１０mm、長さ５mm〜３０mm、厚さ２０μｍ〜１０００μｍ程度のものを使用できる。目的物質また目的物質と同じ抗原性を有する物質としては、目的物質それ自体が好ましく、例えば目的物質（分析対象物）がヒトアルブミンである場合、ヒトアルブミンを固相化するのが好ましい。
【００１９】
固相化される物質が蛋白質等の場合、蛋白質の脱離をなくすために共有結合による固相化のできるジアゾ化濾紙等を用いることができるが、この目的のため例えばＰａｕｌ社のイムノダインＡＢＣ等を用いることができる。一般的には目的の物質（目的物質またはアナログ）の溶液にこれらの担体をある程度の時間浸漬して反応させた後、多量の緩衝液または洗浄液により濯ぎ洗浄して、通常の乾燥法にて乾燥することで調製する。洗浄液としては一般的なpH緩衝液またはこれらにＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を加えたものが使用できる。
【００２０】
第３領域においては、反応混合物中で第２領域で除去されなかった目的物質と結合した標識反応体（複合体）を捕捉する目的で、この標識反応体に対する抗体を固定化した担体を用いることができる。例えば反応体がマウスの抗体である場合はウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体、ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体等を用いることができる。本発明では、この第３領域に標識反応体に対する抗体（以下抗反応体抗体と略す）をライン状に複数本固定化し、下流側のラインの抗体量が上流側のラインの抗体量に比べ段階的に少なくなるように設定することにより定量的に検出することができる。ラインの数は被検物質によっても異なるが、通常２〜８本程度であり、好ましくは３〜５本である。
【００２１】
これらの標識反応体に対する抗体の調製にはこれらの抗体溶液を担体にライン状に塗布して反応させた後、非特異的結合阻止のためにブロッキング剤、例えばゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン等により担体を処理することが望ましい。最終的に多量の緩衝液ないしは洗浄液にて濯ぎ洗浄して、通常の乾燥法にて乾燥することで第３領域の判定部を調製する。洗浄液としては一般的なpH緩衝液またはこれらにＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を加えたものが使用できる。
【００２２】
担体としては、例えばガラス繊維濾紙、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などがある。多孔性担体の寸法は特に制限はないが、使用時においては第１領域および第２領域と同じ幅を有し、例えば幅２mm〜１０mm、長さ３０mm〜１００mm、厚さ２０μｍ〜１０００μｍ程度のものを使用できる。固相化される物質が蛋白質等の場合、蛋白質の離脱をなくすために共有結合による固相化のできるジアゾ化濾紙等を用いることができるが、この目的のため例えばＰａｕｌ社のイムノダインＡＢＣ等を用いることができる。
【００２３】
第１領域〜第３領域のこれらの担体はそれぞれ別々のパーツとして製造することもできるが、一本の担体上の各部分として固相化したものを用意することもできる。図１に第１領域〜第３領域の相対位置関係を模式的に示す。図１中、３は第１領域中の試料添加部を示し、４は第１領域中の標識反応体保持部を示し、５は第２領域、すなわち目的物質または目的物質と同じ抗原性を有する物質が固定化された領域を示し、そして６は第３領域、すなわち判定領域を示し、この領域中には、反応体に対する抗体が７で示すように梯状に固定化されている。
【００２４】
本発明の装置の他の態様においては、装置の各部分を若干の剛性をもつストリップ状または棒状の基材２の上に配置することができる。また、配置された各部分のパーツの上にカバー１を付けることができる。この場合は少なくとも判定部分では窓を付けるか又は、透明部材により構成するか、あるいはカバーが存在しないようにする必要がある。この構成により、分析装置の下流端を全体的に分析対象試料中に浸漬するか、又は該下流端に試料溶液を注ぎかけることにより極めて簡単に試料を適用することができる。
【００２５】
本発明の装置のより具体化したものの１態様を図２に示す。図２において、試料添加部多孔質担体３、標識反応体保持部、すなわち標識化抗体塗布担体４、目的物質固相化担体５、及び判定部すなわち抗反応体固相化担体６が基材２上に配置されており、上記担体３〜６を覆うようにカバー１が配置されている。試料添加部３の少なくとも１部分は露出している。このためには、カバー１が試料添加部３の先端まで伸びでないように構成するか、又はカバー１の試料添加部に対応する部分に窓（孔）を形成しておく。また、カバー１の判定部に対応する部分は透明な材料で構成するか、又は観察窓を設けるのが好ましい。
【００２６】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．ヒトアルブミンの測定
ａ）金コロイド標識化マウス抗ヒトアルブミン抗体の調製
ヒトアルブミン（ＰＥＮＴＥＸ（商標）ＨｕｍａｎＡｌｂｕｍｉｎ，Ｍｉｌｅｓ）をアジュバントとともにＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。追加免疫を行った後、脾臓を摘出し、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を電気融合法で融合し、ヒトアルブミンに対するマウスモノクローナル抗体を調製した。
【００２７】
得られた抗体は、ウシ、ニワトリのアルブミンにはほとんど反応せず、ヒトアルブミンと高い親和力で反応した。抗体の金コロイド標識化方法は、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ１（１），７７−９１，１９８０に記載されている方法によって、金コロイドＧ３０（粒径３０nm，ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ．）３０mlあたり１２０mgを結合させた。
【００２８】
この反応液を遠心し得られた沈査を１％ＢＳＡ，０．０５％ＰＥＧ２０，０００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．２）に再浮遊させ、再度遠心した。この操作を３回繰り返し最終的に得られた沈査を１％ＢＳＡ，０．０５％ＰＥＧ２０，０００を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．２）で再浮遊させ、５％ＢＳＡ，０．０５％ＰＥＧ２０，０００、０．３ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．２）で２倍希釈した。得られた金コロイド標識化抗体液を波長５２０nmでの吸光度が１．０になるように３％ＢＳＡ，０．０５％ＰＥＧ２０，０００、０．１５ＭＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．２）で希釈した。
【００２９】
ｂ）定量分析用担体の調製
ウサギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ＩｇＧＦｒａｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），SEIKAGAKU CORPORATION)溶液を４，１、及び０．５mg／mlの各濃度に１０ｍＭリン酸緩衝液生理食塩水（pH７．２以下ＰＢＳ）で調製し、ナイロン膜（ＩＭＭＵＮＯＤＹＮＥＡＢＣＭＥＭＢＲＡＮＥＤＡＴＡＳＨＥＥＴ，ＰＡＬＬ，２００mm×５５mm）上流側から下流側に向かって濃い濃度または薄い濃度の抗体液からディスペンサー（ＳＨＯＴＭＡＳＴＥＲ（商標）２，MUSASHI ENGINEERING, INC.)によって直線を階段状に３本塗布し、２５℃で１時間乾燥した。次に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．５％ガゼインに３０分浸した後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。これを陰圧乾燥後、抗体の塗布線に垂直に５mm幅で切断し、５mm×５５０mmの定量分析用担体を作製した。
【００３０】
ｃ）アルブミン固定化膜の調製
ヒトアルブミン（ＰＥＮＴＥＸ（商標）ＨｕｍａｎＡｌｂｕｍｉｎ）１mg／mlの濃度になるようにＰＢＳで溶解し、これにナイロン膜（ＩＭＭＵＮＯＤＹＮＥＡＢＣＭＥＭＢＲＡＮＥＤＡＴＡＳＨＥＥＴ，ＰＡＬＬ，９０mm×５０mm）を２５℃で３０分浸し、２５℃で１時間乾燥した。次に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．５％カゼイン液に３０分浸した後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。これを陰圧乾燥後、５mm×１５mmの大きさに切断した。
【００３１】
ｄ）標識化試薬含有部材の調製
実施例１．ａ）項に記載の方法で調製した標識化試薬を粘ちょう性濾紙（ＮＯ．６０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）１０mm×１００mmに２５０ml塗布し、凍結乾燥後、５mm×１０mmの大きさに切断した。
【００３２】
ｅ）フィルターの調製
粘ちょう性濾紙（ＮＯ．６０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）１０mm×１００mmを０．５％カゼイン液に３０分浸した後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。陰圧乾燥後、５mm×１０mmの大きさに切断した。
【００３３】
ｆ）ヒトアルブミンの測定
実施例１．のａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）およびｅ）に記載の方法で調製した定量分析用担体、標識化試薬含有部材およびフィルターを用いた、図１に示す装置を組み立てた。定量分析用担体は、上流側から下流側に向かって濃い濃度の抗体液から塗布したもの（パターンＡ）と薄い濃度の抗体液から塗布したもの（パターンＢ）を用いて比較した。ヒトアルブミン０，２０，３０，５０又は１００μｇ／mlをそれぞれ含む０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳを試験試料とし、この各試験試料に試料添加部を３秒間浸した後引き上げ、可視的に１０分後の発色パターンを記録した。パターンＡの結果を表１のＡに、パターンＢの結果を表１のＢに示す。
【００３４】
【表１】

また、パターンＡとパターンＢの種々のアルブミン濃度における呈色バンドの数の比較を表２に示す。
【００３５】
【表２】

表２の結果から、判定領域において、抗反応体抗体を、上流のラインの抗体量に比べて下流に進むほど抗体量が少なくなるように固定化した場合、試料中のヒトアルブミンの量と呈色ラインの本数とがよく相関することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の装置の構造を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の装置の１態様を示す図である。
【符号の説明】
１…カバー
２…装置支持用部材
３…試料添加部多孔質担体
４…標識化反応体（標識化抗体）塗布担体
５…目的物質固相化担体
６…判定部
７…抗反応体抗体固定化ライン[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunological measurement apparatus capable of quantitatively measuring a target substance in a sample solution using an immunological reaction.
[0002]
[Prior art]
Various analytical methods have been developed as a means of measuring substances contained in liquid samples in the field of medical diagnostics, but immunological methods using antigen-antibody reactions are widely used, especially as high-sensitivity measuring methods. ing. In the field of clinical testing, many target items are analyzed using a device that applies this measurement principle. Furthermore, the need for simple measurement using this immune reaction is also increasing in clinics and general households, and development of a simple measurement device / method (hereinafter abbreviated as system) for that purpose is also progressing.
[0003]
An example of such a system is the “stick method” (see Japanese Patent Laid-Open Nos. 62-501034 and 64-463). This method is generally a method in which an antibody immobilized on a solid support is reacted with a test sample, and then the support is removed and washed, and reacted with a labeling reagent to obtain a detectable signal. Requires multiple operating procedures.
[0004]
As a system in which the washing step is omitted, there is a “membrane assay method” (see JP-A 63-281053, JP-A-1-299464, JP-A-2-12061, JP 2-500540, etc.). This method is a method of immobilizing an antibody on a porous membrane, combining this porous membrane and an absorbent, and sequentially adding a test sample and a labeling reagent to obtain a detectable signal, and requires a plurality of operating procedures.
In addition, as a system in which the operation procedure is simplified, there is a “aggregation method (see JP-A-62-39770, JP-A-1-123149, etc.)”. There are drawbacks such as
[0005]
“Immunochromatography (see Japanese Patent Publication Nos. 7-46107, 7-13640, JP-A-64-63865, and 61-145559, etc.)” has been developed as a system to compensate for such drawbacks. In this system, each reagent is preliminarily applied to a filter-like carrier on which an antibody is immobilized, a test sample is added to a predetermined position, and the sample moves on the porous carrier by capillary action, and then is moved to a predetermined position. This method measures the bound labeling reagent and does not require a washing operation (unreacted substance removal step), and is a simple and quick method.
[0006]
Furthermore, it is possible to detect quantitatively by immobilizing a capture antibody that can specifically bind to the test sample in multiple lines so that the concentration increases stepwise in proportion to the distance from the sample application part. (JP-A-7-159398). However, when the concentration to be measured is in a high concentration region such as albumin in urine, the prozone phenomenon appears at a high concentration, and it is difficult to determine the result.
Therefore, the prozone phenomenon could be avoided by competitively reacting the labeled antibody against albumin between human albumin, which is the test substance, and albumin immobilized on the measuring device. Therefore, there is a problem that the result is poorly preserved, lacks objectivity, and cannot be quantitatively detected.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an immunoassay apparatus capable of quantitatively measuring a target substance, that is, a measurement object in a sample solution in a single step without causing a prozone phenomenon, and storing a measurement result. Is.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present invention provides a labeled reactant (labeling reaction) having reactivity with a target substance between the target substance immobilized on the immunochromatography apparatus and the target substance in the sample solution. Body, for example, labeled antibody), and captures the reaction product of the target substance and the labeled reactant unabsorbed by the antibody against the labeled reactant, which is immobilized in multiple lines in the judgment section. However, as a result of intensive studies on the method of quantitatively measuring the number of bound reactant lines or their appearance pattern, it is contrary to the method used in the conventional immunochromatography method. It was clarified that the concentration of the capture antibody capable of binding to the target can be detected quantitatively by decreasing it stepwise in inverse proportion to the distance from the sample application part.
[0009]
Therefore, the present invention is an apparatus comprising a porous carrier for quantitatively measuring a target substance in a sample solution, the site where the sample solution can be directly or indirectly contacted with the porous carrier, A site where a labeled reactant having an affinity for a target substance in a sample solution downstream (referred to as a labeled reactant, sometimes referred to as a labeled antibody) is stored in a movable state; Downstream of the site where the target substance or a substance having the same antigenicity as the target substance is immobilized on the porous carrier, and further downstream the antibody against the labeled reactant intersects the direction of movement of the sample solution. Provided is an immunoassay device comprising a plurality of lines that are fixed in a line shape and are set such that the amount of antibody in the downstream line is stepwise reduced compared to the amount of antibody in the upstream line.
[0010]
【The invention's effect】
Since the present invention performs a competitive reaction on a chromatographic carrier, the prozone phenomenon can be suppressed. Further, in the conventional method, since the concentration of the target substance was visually determined in the determination region by the color tone or intensity of the coloration, the objectivity was poor and the preservation of the result was low. Is solidified in a ladder form, and the target substance can be quantified objectively and can be measured easily and quickly because it is determined by the number of reacted lines or its color pattern. Further, the result can be stored by using a directly visible labeling substance as the labeling substance of the labeling reactant.
[0011]
[Specific explanation]
The apparatus of the present invention comprises a part where the sample solution can be directly or indirectly brought into contact with the porous carrier, and a part where the labeled reactant having affinity for the target substance in the sample solution is moved downstream. And downstream of the site where the target substance or a substance having the same antigenicity as the target substance is immobilized on the porous carrier, and further downstream the antibody against the labeled reactant intersects the direction of movement of the sample solution. A plurality of lines are fixed in the direction, and the site is such that the amount of antibody on the downstream line is set so as to decrease stepwise compared to the amount of antibody on the upstream line.
[0012]
An example thereof is schematically shown in FIG. 1. In FIG. 1, in the first region, the target substance and the labeling reactant react to form a complex. In the second region, a competitive reaction occurs between this complex and the immobilized target substance or a substance having the same antigenicity as the target substance, and excess labeled reactant that did not react with the target substance is trapped in the solid phase. Is done. In the third region, a plurality of complexes not trapped in the second region are captured by an antibody against the labeled reactant immobilized in a line. This will be described in detail below.
[0013]
The sample addition part in the first region is composed of a porous carrier, and a sample solution such as urine added directly or indirectly is held on the carrier by an action such as capillary action and moves to the next region. These carriers can be coated with a protein for the purpose of preventing pH buffering agent or non-specific binding, if necessary, thereby adjusting the reaction environment of the sample. The type and pH of the buffering agent for this vary depending on the type of analysis sample, its pH, the type of analysis target, and the reaction reagent used for the analysis (eg, antigen, antibody, labeling substance, etc.), but for example, Tris buffer, diethanol buffer Commonly used buffering agents such as agents and phosphate buffering agents can be used. In order to add a buffering agent to the carrier, for example, the carrier is impregnated with a buffer solution or a buffer solution having a concentration of 100 mM to 1 M, and then dried according to a conventional method. As a conventional blocking agent for the purpose of blocking nonspecific binding, for example, gelatin, bovine serum albumin, ovalbumin, casein and the like can be used.
[0014]
The labeling reactant is held in a movable state downstream of the sample addition section, and binds with the target substance in the sample solution that has moved downstream by capillary action to form a complex, thereby unbound labeling reaction. Along with the body, it moves to the second region (if the target substance does not exist, only the labeled reactant moves to the second region). In the present invention, the reactant having affinity for the target substance is preferably an antibody against the target substance, such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. For example, when the target substance (analysis target) is human albumin, anti-human albumin monoclonal or monoclonal antibody is used.
[0015]
As the labeling substance of the labeling reactant, a commonly used labeling substance known in this field can be used. For example, as a labeling substance, a substance that itself has a color and can be directly observed, a substance that itself emits light, a substance that generates a signal that can be detected by further reaction, and the like can be used. From the standpoint of sexuality, a directly visible substance or a substance having luminescence per se is preferred.
[0016]
Examples of directly visible substances include colored particles such as Latex, colloidal particles such as Colloidal gold Colloidal silver, and dye particles (dispersed dyes) such as Foron, Brilliant Blue SR, and Palalan Yellow 3GE. Particularly preferred are colloidal particles, dye particles and the like. In addition, as a substance having a light emitting property per se, a fluorescent color group such as fluorescein can be used. As a substance capable of generating a detectable signal by further reaction, for example, an enzyme, a liposome containing an enzyme, or the like can be used.
[0017]
As the enzyme, for example, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase and the like can be used, and methods known in this field can also be used for these detection methods and antibody introduction methods. Examples of the carrier for satisfying such requirements include glass fiber filter paper, cellulose membrane, nitrocellulose membrane, and nylon membrane.
The size of the porous carrier of the labeling reactant holding part in the first region is not particularly limited, but has the same width as the sample addition part when used, for example, 2 mm to 10 mm in width, 5 mm to 30 mm in length, and thickness. The thing of about 20 micrometers-1000 micrometers can be used.
[0018]
In the second region, it binds to the target substance in the reaction mixture of the target substance and the labeling reactant in the sample developed from the first region (including the complex as the reaction product and the unreacted labeling reactant). In order to absorb and remove the excess labeling reactant that is not present, a carrier on which a target substance or a substance having the same antigenicity as the target substance is immobilized can be used. Examples of the carrier include glass fiber filter paper, cellulose membrane, nitrocellulose membrane, and nylon membrane. The size of the porous carrier is not particularly limited, but when used, it has the same width as that of the first region. For example, a porous carrier having a width of 2 mm to 10 mm, a length of 5 mm to 30 mm, and a thickness of about 20 μm to 1000 μm can be used. As the target substance or the substance having the same antigenicity as the target substance, the target substance itself is preferable. For example, when the target substance (analyte) is human albumin, it is preferable to immobilize human albumin.
[0019]
When the substance to be immobilized is a protein or the like, a diazotized filter paper that can be immobilized by a covalent bond can be used to eliminate protein detachment. For this purpose, for example, Paul's Immunodyne ABC or the like. Can be used. In general, these carriers are immersed in a solution of the target substance (target substance or analog) for a certain period of time, reacted, rinsed and washed with a large amount of buffer solution or washing solution, and dried by a normal drying method. To prepare. As the washing solution, a general pH buffer solution or a solution obtained by adding a surfactant such as Tween 20 to these can be used.
[0020]
In the third region, a carrier on which an antibody against this labeled reactant is immobilized is used to capture the labeled reactant (complex) bound to the target substance that has not been removed in the second region in the reaction mixture. Can do. For example, when the reactant is a mouse antibody, a rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody, a goat anti-mouse immunoglobulin antibody, or the like can be used. In the present invention, a plurality of antibodies against the labeling reactant (hereinafter abbreviated as anti-reactor antibodies) are immobilized in a line shape in the third region, and the amount of antibody in the downstream line is compared with the amount of antibody in the upstream line. Therefore, it is possible to detect quantitatively by setting so that the number is reduced. The number of lines varies depending on the test substance, but is usually about 2 to 8, and preferably 3 to 5.
[0021]
For preparation of antibodies against these labeling reactants, these antibody solutions are coated on a carrier in a line form and reacted, and then blocking agents such as gelatin, bovine serum albumin, ovalbumin, It is desirable to treat the carrier with casein or the like. Finally, the third region determination unit is prepared by rinsing and washing with a large amount of buffer solution or washing solution, and drying by a normal drying method. As the washing solution, a general pH buffer solution or a solution obtained by adding a surfactant such as Tween 20 to these can be used.
[0022]
Examples of the carrier include glass fiber filter paper, cellulose membrane, nitrocellulose membrane, and nylon membrane. The size of the porous carrier is not particularly limited, but when used, it has the same width as the first region and the second region, for example, a width of 2 mm to 10 mm, a length of 30 mm to 100 mm, and a thickness of about 20 μm to 1000 μm. Can be used. When the substance to be immobilized is a protein or the like, a diazotized filter paper or the like that can be immobilized by covalent bond can be used to eliminate protein detachment. For this purpose, for example, Paul's Immunodyne ABC or the like can be used. Can be used.
[0023]
These carriers in the first region to the third region can be produced as separate parts, but a solid phase can be prepared as each part on one carrier. FIG. 1 schematically shows the relative positional relationship between the first region to the third region. In FIG. 1, 3 indicates a sample addition part in the first region, 4 indicates a labeled reactant holding part in the first region, and 5 indicates the second region, that is, the target substance or the same antigenicity as the target substance. An area where the substance is immobilized is shown, and 6 is a third area, that is, a determination area. In this area, an antibody against the reactant is immobilized in a ladder shape as indicated by 7.
[0024]
In another embodiment of the device of the present invention, each part of the device can be arranged on a strip-like or rod-like substrate 2 having some rigidity. Moreover, the cover 1 can be attached on the part of each arrange | positioned part. In this case, at least in the determination part, it is necessary to attach a window, or to configure it with a transparent member, or to prevent the cover from being present. With this configuration, the sample can be applied very simply by immersing the downstream end of the analyzer as a whole in the sample to be analyzed or pouring the sample solution onto the downstream end.
[0025]
One embodiment of a more specific version of the device of the present invention is shown in FIG. In FIG. 2, the sample addition part porous carrier 3, the labeled reactant holding part, that is, the labeled antibody coating carrier 4, the target substance-immobilized carrier 5, and the determination part, that is, the anti-reactor immobilized carrier 6 are the substrate 2. The cover 1 is arrange | positioned so that it may be arrange | positioned and the said carriers 3-6 may be covered. At least one part of the sample addition part 3 is exposed. For this purpose, the cover 1 is configured not to extend to the tip of the sample addition section 3, or a window (hole) is formed in a portion corresponding to the sample addition section of the cover 1. Moreover, it is preferable that the part corresponding to the determination part of the cover 1 is made of a transparent material or provided with an observation window.
[0026]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1. Measurement of human albumin a) Preparation of colloidal gold-labeled mouse anti-human albumin antibody Human albumin (PENTEX ™ Human Albumin, Miles) was injected intraperitoneally into Balb / c mice with adjuvant. After booster immunization, the spleen was removed, and the spleen cells and mouse myeloma cells P3U1 were fused by an electrofusion method to prepare a mouse monoclonal antibody against human albumin.
[0027]
The obtained antibody hardly reacted with bovine or chicken albumin but reacted with human albumin with high affinity. The colloidal gold labeling method of the antibody was performed by binding 120 mg per 30 ml of colloidal gold G30 (particle size 30 nm, Amersham International plc.) According to the method described in Journal of Immunoassay 1 (1), 77-91, 1980. .
[0028]
The precipitate obtained by centrifuging this reaction solution was resuspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 1% BSA and 0.05% PEG 20,000, and centrifuged again. This operation was repeated three times, and the finally obtained precipitate was resuspended in 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing 1% BSA, 0.05% PEG 20,000, and 5% BSA, 0.05. It was diluted 2-fold with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) containing% PEG 20,000 and 0.3 M NaCl. 20 mM Tris containing 3% BSA, 0.05% PEG 20,000, 0.15 M NaCl, and 0.1% Tween 20 so that the obtained colloidal gold labeled antibody solution has an absorbance at a wavelength of 520 nm of 1.0. Dilute with hydrochloric acid buffer (pH 8.2).
[0029]
b) Preparation of quantitative analysis carrier Rabbit anti-mouse immunoglobulin antibody (IgG Fraction of Anti Mouse IgG (H + L), SEIKAGAKU CORPORATION) solution at concentrations of 4, 1 and 0.5 mg / ml at 10 mM phosphorus. Nylon membrane (IMMUNODYNE ABC MEMBRANE DATA SHEET, PALL, 200 mm × 55 mm) prepared with an acid buffer saline (pH 7.2 or less PBS), dispenser from an antibody solution having a high or low concentration from upstream to downstream. Three straight lines were applied stepwise by (SHOTMASTER ™ 2, MUSASHI ENGINEERING, INC.) And dried at 25 ° C. for 1 hour. Next, it was immersed in 0.5% casein containing 0.1% Tween 20 for 30 minutes and then washed 3 times with PBS containing 0.1% Tween 20. This was dried under negative pressure and then cut at a width of 5 mm perpendicular to the antibody coating line to prepare a carrier for quantitative analysis of 5 mm × 550 mm.
[0030]
c) Preparation of albumin-immobilized membrane Human albumin (PENTEX (TM) Human Albumin) was dissolved in PBS to a concentration of 1 mg / ml, and nylon membrane (IMMUNODYNE ABC MEMBRANE DATA SHEET, PALL, 90 mm) × 50 mm) was immersed at 25 ° C. for 30 minutes and dried at 25 ° C. for 1 hour. Next, it was immersed in a 0.5% casein solution containing 0.1% Tween 20 for 30 minutes and then washed three times with PBS containing 0.1% Tween 20. After drying this under negative pressure, it was cut into a size of 5 mm × 15 mm.
[0031]
d) Preparation of labeling reagent-containing member Example 1. 250 ml of the labeling reagent prepared by the method described in the item a) was applied to a viscous filter paper (NO. 60, ADVANTEC) 10 mm × 100 mm, lyophilized, and cut into a size of 5 mm × 10 mm.
[0032]
e) Preparation of filter A viscous filter paper (NO. 60, ADVANTEC) 10 mm x 100 mm was immersed in a 0.5% casein solution for 30 minutes and then washed three times with PBS containing 0.05% Tween20. After drying under negative pressure, it was cut into a size of 5 mm × 10 mm.
[0033]
f) Measurement of human albumin Example 1. The apparatus shown in FIG. 1 was assembled using the quantitative analysis support, the labeled reagent-containing member and the filter prepared by the method described in a), b), c), d) and e). The carrier for quantitative analysis was compared using the one coated from a high concentration antibody solution (pattern A) and the one coated from a thin antibody solution (pattern B) from the upstream side toward the downstream side. 0.2% BSA-PBS each containing 0, 20, 30, 50 or 100 μg / ml of human albumin was used as a test sample, and the sample addition part was immersed in each test sample for 3 seconds, then pulled up, and visually 10 minutes later. The color development pattern was recorded. The result of pattern A is shown in A of Table 1, and the result of pattern B is shown in B of Table 1.
[0034]
[Table 1]

Table 2 shows a comparison of the number of colored bands at various albumin concentrations of Pattern A and Pattern B.
[0035]
[Table 2]

From the results in Table 2, when the anti-reactor antibody is immobilized in the determination region so that the amount of antibody decreases as it goes downstream compared to the amount of antibody in the upstream line, the amount of human albumin in the sample is displayed. It was confirmed that the number of color lines correlated well.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of an apparatus of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing one embodiment of the apparatus of the present invention.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Cover 2 ... Device support member 3 ... Sample addition part porous carrier 4 ... Labeling reactant (labeled antibody) coating carrier 5 ... Target substance solid-phase support 6 ... Determination part 7 ... Anti-reactor antibody immobilization line

Claims

検体溶液中の目的物質を定量するための多孔性担体からなる装置であって、該多孔性担体に検体溶液が直接又は間接的に接触可能な部位と、その下流に検体溶液中の目的物質と親和性を有する標識化された反応体が移動可能な状態で保存された部位と、その下流に目的物質または目的物質と同等な抗原性を有する物質が多孔性担体に固定化された部位と、更にその下流に反応体に対する抗体が検体溶液の移動方向に対して交差する方向に複数本ライン状に固定化され、下流側のラインの抗体量が上流側のラインの抗体量に比べ段階的に少なくなるように設定されている部位とからなる免疫学的定量装置。An apparatus comprising a porous carrier for quantifying a target substance in a sample solution, the part where the sample solution can directly or indirectly contact the porous carrier, and a target substance in the sample solution downstream thereof A site where the labeled reactant having affinity is stored in a movable state, a site where a target substance or a substance having antigenicity equivalent to the target substance is immobilized downstream of the target substance, and a porous carrier; Further downstream, antibodies against the reactant are immobilized in a plurality of lines in a direction crossing the direction of movement of the sample solution, and the amount of antibody on the downstream line is stepwise compared to the amount of antibody on the upstream line. An immunological quantification device consisting of parts set to be reduced.

目的物質と親和性を有する標識化された反応体が目的物質に対する抗体である請求項１記載の免疫学的定量装置。2. The immunological quantification apparatus according to claim 1, wherein the labeled reactant having affinity for the target substance is an antibody against the target substance.

標識化された反応体の標識物質が直接目視可能な標識物質である請求項１または２記載のいずれか１項記載の免疫学的定量装置。The immunological quantification apparatus according to claim 1 or 2, wherein the labeled substance of the labeled reactant is a directly visible labeling substance.

ライン状に固定化された部位が、３本である請求項１〜３記載のいずれか１項記載の免疫学的定量装置。The immunological quantification apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the number of sites immobilized in a line is three.

検出目的物質が尿中アルブミンである請求項１〜４記載のいずれか１項記載の免疫学的定量装置。The immunological quantification apparatus according to any one of claims 1 to 4, wherein the detection target substance is urinary albumin.