JP3612675B2 - ｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置及び測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば診断、食品検査などにおいて、溶液中の基質を分解してその溶液のｐＨ変化を誘因する物質（例えば酵素）もしくは生物体（細胞、微生物など）を測定する装置および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学や食品の分野で、基質溶液のｐＨ変化を誘因する微量の物質あるいは生物体に対する特異的かつ迅速な測定が求められている。ｐＨ変化を誘因する物質や生物体はｐＨ電極を用いて検出することができる。しかし、一般的にｐＨ電極による測定は特異性と感度において十分高いとは言えない。この点を改良する方法として、近年抗体の特異的分子認識能と微小ｐＨ電極の特徴を生かした、特異的、高感度、かつ迅速な測定を行うことができる装置が開示された（特開平１−２１２３４７号、特開平７−１２８２８１号）。
【０００３】
その装置を図４に示し、その装置の使用時の状態を図５に示す。各部を説明すると、測定セル１は、筒状であり、その上下端に開口部を有している。下端部近傍の周壁には貫通孔が設けられておりこれが基質溶液入り口２となっている。測定セル１の内部は、下端側から径大の未反応基質溶液滞留部３、次に径小のｐＨ電極ボディー収容部５、そしてこのｐＨ電極ボディー収容部５よりも若干径大の細径管固相挿入部７となっており、全体としてｐＨ電極３０が挿入されている。ｐＨ電極３０のｐＨ電極ボディー部４は、未反応基質溶液滞留部３およびｐＨ電極ボディー収容部５に収容されており、ｐＨ電極３０のｐＨ電極感応部６は細径管固相挿入部７内に収容されている。ｐＨ電極３０の基端はｐＨ電極コネクタ１３が取り付けられており、測定セル１の下端の開口部はこのｐＨ電極コネクタ１３によって密閉されている。比較電極１２は、ｐＨ電極コネクタ１３に取り付けられており、未反応基質溶液滞留部３に収容された状態とされている。
【０００４】
測定セル１の細径管固相挿入部７の周壁にはリング状の溝が設けられており、そこにＯリング８が嵌め込まれている。このＯリング８は、図５に示す細径管固相１９が細径管固相挿入部７に挿入さたときに、細径管固相１９と細径管固相挿入部７の周壁との間を密閉するためのものである。
【０００５】
測定セル１の上端開口部は図５に示す細径管固相１９を細径管固相挿入部７に挿入するための細径管固相挿入口９となっている。更に測定セル１の上端外側は溢れた基質溶液を回収する基質溶液オーバーフロー部１０となっている。この基質溶液オーバーフロー部１０で回収された基質溶液は基質溶液出口１１を経て廃液容器１６に至るようにされている。
【０００６】
一方、測定セル１への基質溶液の供給は、基質溶液容器１５に収容されている基質溶液を送液ポンプ１４によって、前述した基質溶液入り口２から行われるようにされている。
【０００７】
電気回路部１７は、ｐＨ電極３０および比較電極１２から得られる電気信号に基づいて演算を行ってｐＨ変動を求め、その結果を表示部に出力するデータ処理機能と、送液ポンプ１４を駆動制御する駆動制御機能を備えている。
【０００８】
表示部１８は、電気回路部１７から与えられる信号に応じた表示を行うものである。
【０００９】
このように構成された装置を用いて、例えばヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼを検出する場合には、細径管固相１９の内外壁に受容体としてヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対するモノクローナル抗体を固着しておく。
【００１０】
そして操作者は、この細径管固相１９の一端側を検体溶液に一定時間浸漬して取り出し、その一端側を測定セル１の細径管固相挿入口９から、細径管固相挿入部７内に収容する。このとき図５に示すように細径管固相１９の内部にｐＨ電極感応部６が挿入された状態いわゆるカップリングの状態となる。この状態で操作者は電気回路部１７に動作開始を指示する。これにより送液ポンプ１４は駆動され、細径管固相１９の内部に基質溶液を供給されその内部が洗浄される。所定時間経過後、送液ポンプ１４は停止し、細径管固相１９の内部の基質溶液にｐＨ変化が生じる。電気回路部１７はその変化をｐＨ電極３０の出力電圧から求め、その値を表示部１８に表示させる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この装置において、上記のように細径管固相１９の細径管とｐＨ電極３０のｐＨ電極感応部６をカップリングさせると次のような問題点が存在することが判明した。
【００１２】
（１）この装置においては、検出感度と検出速度を良くするために、細径管内壁とｐＨ電極感応部との距離を可能な限り近付けることが必要である。そのためには細径管内径とｐＨ電極感応部を可能な限り細くすることが必要である。しかし、それらの製造は困難であり、特にｐＨ電極感応部を細くすることには限界がある。例えば、ｐＨ電極としてｐＨ感応性電界効果トランジスタ（ 以下ｐＨ−ＦＥＴと称する） を用いた場合、実用的にはその感応部の太さは０．５ｍｍ 程度であり、それに応じて細径管の内径を ０．６ｍｍ 程度にすることは可能であるが、それ以上細い細径管ではカップリングは不可能である。
【００１３】
（２）細径管とｐＨ電極感応部をカップリングさせる方法では、細径管の寸法や形に誤差があった場合、両者が接触し、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする危険性がある。
【００１４】
本発明の目的は、検出感度と検出速度に優れた測定を行うことができ、また細径管とｐＨ電極感応部が接触することなく測定を行うことができるようにすることである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１の装置は、細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相と、前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセルと、前記細径管固相の少くとも一端を前記セル内に保持する細径管固相保持手段と、前記セル内であって前記細径管固相の外部にその感応部が配置され前記基質溶液のｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、前記セル内に保持された細径管固相の内部の前記基質溶液を前記感応部側に移動させる基質溶液移動手段と、を具備する。
【００１６】
このような装置を用いてｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定する場合、操作者は、細径管固相の一端を検体溶液に浸漬した後、その細径管固相をセル内に保持手段によって保持させる。そして基質溶液をセルに収容すると、細径管固相内部の基質溶液にｐＨ変化が生じる。その後、基質溶液移動手段によって細径管固相内部の基質溶液をｐＨ電極の感応部に移動させる。ｐＨ電極はこのときの基質溶液のｐＨを検出する。
【００１７】
請求項２の装置は、請求項１の装置であって、セル内において、ｐＨ電極の感応部の基端から細径管固相の一端までの間の容積のうち前記感応部が占める容積を除いた容積が１０マイクロリットル以下であることを特徴とする。この部分の容積がこの程度であれば、細径管固相の内部の基質液が殆ど希釈されることなくｐＨ電極の感応部に至る。
【００１８】
請求項３の装置は、請求項１の装置であって、受容体がヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対する抗体であり、かつ基質溶液が尿素を含有する溶液であることを特徴とする。この装置により、ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ濃度を測定される。
【００１９】
請求項４の装置は、請求項１の装置であって、ｐＨ電極はｐＨ−ＦＥＴであることを特徴とする。この装置は、小型であり、これを用いた測定は応答性が良く、高感度である。
請求項５の装置は、請求項１の装置であって、ｐＨ電極の感応部の端面と、細径管固相の端面は、間隔をあけて対向配置されることを特徴とする。
【００２０】
請求項６の装置は、請求項１の装置であって、細径管固相は細径管の内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された繊維状物質を有する。この装置では、単なる細径管よりも固相の比表面積を大きくすることができ、それによって測定対象物質または生物体の検出限界を下げることができる。
【００２１】
請求項７の方法は、細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相の一端を検体溶液に浸漬して取り出した後、前記細径管固相の一端を、前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセル内に保持して、前記セル内においてｐＨ電極の感応部が前記細径管固相の外部に配置された状態とし、前記感応部にｐＨ変化誘因反応後の前記細径管固相内の前記基質溶液を移動させるようにした測定方法である。この方法において、ｐＨ電極は、細径管固相内に感応部を挿入して測定した結果と同じ結果を出力する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
図１はその装置の構成を示し、図２はその装置の使用時の状態を示す。この装置が図４、図５に示した従来の装置と異なる点は、その従来の装置における測定セル１のｐＨ電極ボディー収容部５と細径管固相挿入部７との間にｐＨ電極感応部収容部２１を設けた点であり、ｐＨ電極感応部６はここに収容される。また前記従来の装置では送液ポンプ１４は基質溶液を一方的に測定セル１に供給するのみであったが、本実施の形態の装置の送液ポンプ４０はその基質溶液の供給量にくらべればきわめて僅かではあるが、測定セル１内の基質溶液を吸引するようにも動作するものである。したがって本装置の電気回路部７０も前記従来の装置の電気回路部１７と若干異なり、送液ポンプ４０を正逆いずれの方向にも駆動させることができるようになっている。他の各部は上記従来の装置の各部と同じであるので、同一の番号を付している。以下、その主な各部を詳細に説明する。
【００２３】
（１）測定セル１；測定セル１の材質としては例えばプラスチック、金属、ガラス等を用いる。
【００２４】
（２）ｐＨ電極３０；通常のガラス電極、ｐＨ−ＦＥＴ等を用いる。ｐＨ−ＦＥＴは小型化が容易で、ｐＨ変化に対する応答が速く、かつｐＨ感度等の特性の経時変化が少い等の特徴があるので本実施の形態の装置として最適である。
【００２５】
（３）ｐＨ電極感応部収容部２１；ｐＨ電極感応部６を収容する部分であり、ｐＨ変化誘因反応後に細径管固相１９内の基質溶液を逆流させて満たす所である。その時の希釈効果を極小に抑えるために、この部分の死容量（ｐＨ電極感応部収容部２１の容積と、そこに収容されているｐＨ電極部分すなわちｐＨ電極感応部６の容積との差）は小さい方が望ましい。またこのように部分の死容量を小さくすれば、逆流液量が少くて済み、測定セル全体の容積を小さくすることができ、検体溶液の必要量を少くすることができるという効果がある。この死容量としては１０μリットル以下が好ましい。
【００２６】
（４）細径管固相挿入部７；細径管固相１９の一端側が挿入される所である。ここに細径管固相１９が挿入されると、Ｏリング８は、細径管固相１９と細径管固相挿入部７の周壁との間を密閉する。このため基質溶液は細径管固相１９の内部のみを流れ、細径管固相１９の外周部には流れないようにされる。また、ここに細径管固相１９が挿入されると、その先端より外側にｐＨ電極感応部６は位置する。細径管固相挿入部７とＯリング８が細径管固相保持手段を構成する。
【００２７】
（５）比較電極１２；未反応基質溶液滞留部３の中に設置される。飽和カンコウ電極や銀−塩化銀電極等の液絡式比較電極を用いる。また、ここに参照用のｐＨ−ＦＥＴと疑似比較電極（銀線等）を設置し、測定用ｐＨ−ＦＥＴとの出力電位の差を測定するようにしても良い（特願平７−３５３７１９参照）。
【００２８】
（６）送液ポンプ４０；正逆いずれの方向にも送液できるポンプであり、正確な量を送液できるようにステッピングモータを用いたものが好適である。この送液ポンプ４０の逆流機能が基質溶液移動手段に相当する。
【００２９】
（７）細径管固相１９；細径管の材質としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等を用いる。細径管固相１９は上記の細径管の少くとも内壁面上に測定対象物質あるいは測定対象生物体に対する受容体を固定化することによって作製される。受容体としては抗体、特定蛋白質に対する結合性蛋白（レセプタ類を含む）、細胞接着因子等を用いる。
【００３０】
これらの受容体を細径管に固定化するためには、酵素免疫測定法の固相を調製する時と同様の方法を用いる。最も一般的には細径管に受容体を物理吸着させた後に、牛の血清アルブミン等でブロッキングすることによって調製される。
【００３１】
細径管の内径をｒ、長さをｌとすれば、細径管内部の容積に対する内壁の比表面積ｓは次式のように細径管の内径ｒに反比例する。
ｓ＝（２πｒｌ）／（πｒ２ ｌ）＝２／ｒ
【００３２】
すなわち細径管の内径ｒが小さいほど比表面積ｓが増大し、ｐＨ変化誘因反応の速度が大きくなる。したがって、細径管の内径ｒは小さいほど好ましく、通常は内径ｒは１ｍｍ以下が好ましい。しかし、実際的には細径管を金型で成型する時の成型性、さらにそれに受容体を固定化するときの操作性等から内径ｒを０．１ｍｍ以下にすることは難しい。したがって、細径管の内径ｒとしては、０．１ｍｍから１ｍｍ程度が好ましい。
【００３３】
さらに本装置においては、細径管とｐＨ電極をカップリングさせないので、細径管の内部に例えば受容体をあらかじめ固定化したガラス繊維とか合成繊維を充填して細径管固相を作製しても良い。この場合には繊維の比表面積が大きいので、細径管の内径そのものは１ｍｍ以上であっても良い。
【００３４】
（８）基質溶液；本装置に用いられる基質溶液とは、ｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体によって分解ないしは代謝されてｐＨ変化を誘因する化合物（基質）を含む溶液を意味する。測定対象物質が酵素の場合、基質としては、ウレアーゼ／尿素、グルコースオキシダーゼ／グルコース、リパーゼ／トリアシルグリセロール等を用いる。
【００３５】
測定対象物質が細胞、微生物等の生物体の場合には、基質溶液として、これらの生物体によって代謝されてｐＨ変化を誘因する基質を含む水溶液を使用すれば良い。このような基質としては、例えばグリコース、フラクトース、シュクロース等の糖類が最も一般的である。
【００３６】
（９）電気回路部７０；ｐＨ電極３０および比較電極１２から得られる電気信号に基づいて演算を行ってｐＨ変動を求め、その結果を表示部に出力するデータ処理部７１と、送液ポンプ４０を駆動制御する駆動制御部７２を備えている。
【００３７】
次にこのように構成された本装置を用いて検体溶液中の測定対象物質もしくは測定対象生物体の濃度を測定する方法を説明する。
【００３８】
まず操作者は、細径管固相１９の一端側を検体溶液中に浸漬し、検体溶液を細径管内部に吸引させる。細径管の内径が１ｍｍ以下であれば、故意に吸引させなくとも、毛細管現象で自然に検体溶液が細径管内に吸引される。この状態で一定時間静置すると、細径管内の受容体によって検体溶液中の測定対象たるｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体が捕捉される。
【００３９】
次に操作者は、上記の操作を終えた細径管固相１９の一端側を測定セル１の細径管固相挿入口９から、細径管固相挿入部７内に挿入する。このときの状態を図２に示す。その後、操作者は電気回路部７０に動作を開始させる。これにより駆動制御部７２は送液ポンプ４０を駆動させ、基質溶液容器１５に収容されている基質溶液を測定セル１に送り込み、細径管固相１９の内部を十分洗浄する。この操作によって、細径管固相１９の内部に遊離状態（受容体と結合していない状態）で付着している測定対象物質もしくは測定対象生物体が洗い落とされ、受容体と結合した測定対象物質もしくは測定対象生物体のみが細径管内部に残る。ここで洗浄時の基質溶液の流速を十分高くしておくならば、洗浄直後のこの出力電圧Ｖ０ を未反応の基質溶液のｐＨに対応する出力電圧とみなすことができる。
【００４０】
データ処理部７１は、この洗浄が終了した時点でのｐＨ電極３０の出力電圧Ｖ０ を読み取り、記憶する。
【００４１】
その後、駆動制御部７２は送液ポンプ４０を所定時間停止させる。このとき、細径管固相１９の内部で、その捕捉されたｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体と基質との反応が進行する。その反応によって基質溶液中の基質が分解され、細径管固相１９の内部の基質溶液のｐＨが変動してくる。
【００４２】
その後、駆動制御部７２は送液ポンプ４０をわずかに逆転させて基質溶液を逆流させ、送液ポンプ４０を停止させる。これにより、細径管固相１９の内部の反応後の基質溶液が、ｐＨ電極感応部収容部２１に至る。それに応じてｐＨ電極３０の出力電圧が変動する。データ処理部７１は、上記の送液ポンプ１４の停止から所定時間後、ｐＨ電極３０の出力電圧Ｖを読み取り、記憶する。この電圧は反応後の基質溶液のｐＨに対応する。データ処理部７１は、記憶したデータＶ０，Ｖから次式を計算してｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体による基質溶液のｐＨ変化を求める。この値は表示部１８に表示される。
ΔｐＨ＝（Ｖ−Ｖ０ ）／Ｓ （１）
【００４３】
ここでＳはｐＨ電極３０の感度である。このΔｐＨが検体溶液中の測定対象たるｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体の濃度の増大とともに増大（マイナスの場合は減少）する。
【００４４】
次に操作者は、細径管固相１９を測定セル１から抜き取り、駆動制御部７２に指示を与え、送液ポンプ４０を正転させる。これにより測定セル１の内部は基質溶液によって洗浄される。
【００４５】
本発明をより具体的に説明するため、以下に試験例を示す。
試験例１．
Ａ．装置の構成
基本的には図１に示した構成である。ｐＨ電極３０としては、特公平４−５１７８６ 号公報に記載されている、酸化タンタルをｐＨ感応膜とするｐＨ−ＦＥＴを用いた。その寸法は幅０．４５ｍｍ、厚み０．２ｍｍ、長さ５．５ｍｍで、その先端０．８ｍｍの部分がｐＨ電極感応部６である。このｐＨ−ＦＥＴの先端約２ｍｍを露出し、残りの部分をこの素子にボンディングされたソース、ドレインのリード線とともに、外径０．６０ｍｍの樹脂体に埋め込み、ｐＨ電極ボディー部４とした。このｐＨ−ＦＥＴのｐＨ感度は２５℃で５８ｍＶ／ｐＨ、相互コンダクタンスは３５０マイクロジーメンスであった。
【００４６】
比較電極１２としては表面が塩素化された銀線を用いた。このｐＨ電極３０はそのｐＨ電極感応部６がその収容部２１（内径０．７ｍｍ）に収まるように、また比較電極１２はそれが未反応基質溶液滞留部３に収容されるように位置決めしてこれらをｐＨ電極コネクタ１３に固定した。なお、この時ｐＨ電極３０の上端と細径管固相１９の下端との間の距離が約０．１−２．０ｍｍになるようにｐＨ電極３０の位置決めを行った。ｐＨ電極３０（ｐＨ−ＦＥＴ）の作動は、ドレイン電圧３ボルト、ドレイン電流７μＡで定電流回路に接続して行った。またｐＨ電極３０（ｐＨ−ＦＥＴ）の出力信号としては比較電極１２を基準とするｐＨ電極３０のソース電位を測定した。
【００４７】
送液ポンプ４０としては、ステッピングモータ駆動によるチューブポンプを使用した。
【００４８】
電気回路部７０は、ディジタルコンピュータを備え、このディジタルコンピュータに、送液ポンプ４０を制御する機能、ｐＨ電極３０の出力信号に基づいて演算処理をする機能を備えさせた。それぞれの機能が、図１に示した駆動制御部７２、データ処理部７１に対応する。
【００４９】
Ｂ．細径管固相１９の調製
受容体としてヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対するモノクローナル抗体（Ｋ．Ｎａｇａｔａ， Ｔ．Ｍｉｚｕｔａ， Ｙ．Ｔｏｎｏｋａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０，， ４８２６−３１（１９９２） 参照）を使用した。このモノクローナル抗体５０μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１ｍｌ中に内径０．６０ｍｍ、外径１ｍｍ、長さ１５ｍｍのポリプロピレン製細径管２０本を浸漬し、室温下２４時間静置することによって、この細径管の内外表面に抗体を固定化した。
【００５０】
次いで遠心分離によって抗体溶液の液切りを行い、この細径管をシュクロース１０％、牛血清アルブミン１％、およびアジ化ナトリウム０．１％を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、室温下２４時間静置することによって、ブロッキング処理を行った。その後、遠心分離によってブロッキング溶液の液切りを行った。さらに室温下で風乾した細径管固相を密閉容器の中に収容して、４℃で保存した。
【００５１】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ（Ｋ．Ｎａｇａｔａ他、の同上文献参照）をＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で希釈して、定められた濃度がそれぞれ異なる複数種の検体溶液を調製した。各検体溶液１０μｌに上記Ｂで作製した細径管固相１９をそれぞれ浸漬し、室温で１時間静置した。
【００５２】
基質溶液として、２ｍＭ尿素と１０ｍＭ塩化アンモニウム、および１５４ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液を使用した。
【００５３】
操作者は電気回路部７０に、動作を開始させ、送液ポンプ４０により測定セル１に基質溶液を３ｍｌ／分の流速で供給しつつ、検体溶液から取り出した１本の細径管固相１９を測定セル１の細径管固相挿入部７に挿入する。この基質溶液の供給はその開始から６０秒間行われ、細径管固相１９の内部が洗浄される。この６０秒が経過すると、駆動制御部７１は送液ポンプ４０を停止させ、同時に、データ処理部７１はその時のｐＨ電極３０のソース電位Ｖ０ を読取り、記憶する。
【００５４】
この後、駆動制御部７１は５５秒間、送液ポンプ４０を停止させ、細径管固相１９の内部で基質の分解反応を進行させた後、送液ポンプ４０を２ステップだけ逆転させて停止させる。この逆転ステップ数は細径管固相１９内の基質溶液を約１μｌ逆流させる量になっている。データ処理部７１はこの逆転から５秒後のｐＨ電極３０のソース電位Ｖを読取り、記憶し、このＶと既に記憶している電位Ｖ０ に基づいて上記式（１） を用いて計算を行い、ΔｐＨを求め、これを表示部１８に表示させる。
【００５５】
次に、操作者は、細径管固相１９を測定セル１から抜き取り、駆動制御部７１に指示を与えて、送液ポンプ４０を正転駆動させ基質溶液を測定セル１に３ｍｌ／分の流速で１５秒間供給し、測定セル１内を洗浄する。
【００５６】
操作者は、以上の作業を各検体溶液に浸漬された細径管固相１９について行った。その結果を、図３に白四角の点として示した。
【００５７】
試験例２．
Ａ．装置の構成
試験例１のＡと同じ。
【００５８】
Ｂ．細径管固相の調製
細径管固相として、細径管の内部に抗体を固定化したガラスウールを充填したものを以下のようにして調製した。
【００５９】
試験例１で説明したものと同じ抗体溶液１ｍｌにガラスウール０．２ｇを浸漬し、室温で２４時間静置した。遠心分離によって液切りを行った後、このガラスウールを試験例１で説明したものと同じブロッキング溶液１ｍｌに２４時間浸漬し、ブロッキングを行った。再度遠心分離によって液切りし、風乾した。このガラスウール約５ｍｇを試験例１で用いたものと同じ細径管（抗体を固定化していないもの）の内部に一様に充填し、これを細径管固相とした。
【００６０】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
試験例１のＣと同じ。その測定結果を、図３に黒丸の点として示した。
【００６１】
比較例
本発明の装置と従来の装置とを比較するために、以下の試験を行った。
Ａ．装置の構成
試験例１のＡに使用した部品と同じものを使用して構成した。ただし、ｐＨ電極感応部６が細径管固相収容部７の中に収容されるように、ｐＨ電極３０の位置を少し上方にずらした。
【００６２】
Ｂ．細径管固相の調製
試験例１のＢと同じ。
【００６３】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
試験例１のＣと同じようにして、細径管固相と検体溶液とを１時間反応させ、基質溶液を送液しながら細径管固相を測定セルに挿入し、６０秒間洗浄した後、Ｖ０ を読み取った。次いで送液ポンプを５５秒間停止させ、５５秒目のｐＨ電極出力Ｖを読み取った。その後、細径管固相を測定セルから抜き取り、１５秒間洗浄した。このようにして測定されたＶ０ 、Ｖから（１） 式によってΔｐＨを計算した。その測定結果を、図３に白丸の点として示した。
【００６４】
図３の結果から明らかなように、同じ細径管固相を用いて測定を行った場合、その測定結果は本発明によるものと、従来のカップリングによるものとはほぼ同じ信号強度が得られる。すなわち、本発明のように細径管固相とｐＨ電極との接触の危険性を完全に回避する方法においても、従来のカップリングによる方法と同程度の信号強度が得られる。さらに従来のカップリングによる方法では物理的に使用不可能であったガラスウール固相を充填した細径管固相のように、より比表面積が大きな細径管固相を用いることにより、検出信号強度を大幅に増大することも、本発明によって可能となった。
【００６５】
【発明の効果】
請求項１の発明によれば、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度にｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定することができる。
【００６６】
請求項２の発明によれば、細径管固相の内部の基質液が殆ど希釈されることなくｐＨ電極の感応部に至り、高精度に測定を行うことができる。さらに、移動液量が少くて済み、セル全体の容積を小さくすることができ、検体の必要量がわずかで良いという効果も有する。
【００６７】
請求項３の発明によれば、ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ濃度の測定を、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度に行うことができる。
【００６８】
請求項４の発明の装置は小型であり、かつ応答性が良く、高感度である。また請求項５の発明の装置によれば、ｐＨ電極の感応部の端面と、細径管固相の端面は、間隔をあけて対向配置されるので、細径管固相の内部の基質溶液を効率良く感応部側に移動させることができる。
【００６９】
請求項６の発明によれば、固相の比表面積を大きくし、検出限界を下げることができる。
【００７０】
請求項７の発明によれば、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度にｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の装置の構成図。
【図２】図１に示した装置を用いた測定の説明図。
【図３】本発明により行った測定結果を従来方法による測定結果と比較して示す図。
【図４】従来の測定装置を示す図。
【図５】図４に示した装置を用いた測定の説明図。
【符号の説明】
１ 測定セル
１９ 細径管固相
３０ ｐＨ電極
６ ｐＨ電極感応部
４０ 送液ポンプ
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば診断、食品検査などにおいて、溶液中の基質を分解してその溶液のｐＨ変化を誘因する物質（例えば酵素）もしくは生物体（細胞、微生物など）を測定する装置および方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学や食品の分野で、基質溶液のｐＨ変化を誘因する微量の物質あるいは生物体に対する特異的かつ迅速な測定が求められている。ｐＨ変化を誘因する物質や生物体はｐＨ電極を用いて検出することができる。しかし、一般的にｐＨ電極による測定は特異性と感度において十分高いとは言えない。この点を改良する方法として、近年抗体の特異的分子認識能と微小ｐＨ電極の特徴を生かした、特異的、高感度、かつ迅速な測定を行うことができる装置が開示された（特開平１−２１２３４７号、特開平７−１２８２８１号）。
【０００３】
その装置を図４に示し、その装置の使用時の状態を図５に示す。各部を説明すると、測定セル１は、筒状であり、その上下端に開口部を有している。下端部近傍の周壁には貫通孔が設けられておりこれが基質溶液入り口２となっている。測定セル１の内部は、下端側から径大の未反応基質溶液滞留部３、次に径小のｐＨ電極ボディー収容部５、そしてこのｐＨ電極ボディー収容部５よりも若干径大の細径管固相挿入部７となっており、全体としてｐＨ電極３０が挿入されている。ｐＨ電極３０のｐＨ電極ボディー部４は、未反応基質溶液滞留部３およびｐＨ電極ボディー収容部５に収容されており、ｐＨ電極３０のｐＨ電極感応部６は細径管固相挿入部７内に収容されている。ｐＨ電極３０の基端はｐＨ電極コネクタ１３が取り付けられており、測定セル１の下端の開口部はこのｐＨ電極コネクタ１３によって密閉されている。比較電極１２は、ｐＨ電極コネクタ１３に取り付けられており、未反応基質溶液滞留部３に収容された状態とされている。
【０００４】
測定セル１の細径管固相挿入部７の周壁にはリング状の溝が設けられており、そこにＯリング８が嵌め込まれている。このＯリング８は、図５に示す細径管固相１９が細径管固相挿入部７に挿入さたときに、細径管固相１９と細径管固相挿入部７の周壁との間を密閉するためのものである。
【０００５】
測定セル１の上端開口部は図５に示す細径管固相１９を細径管固相挿入部７に挿入するための細径管固相挿入口９となっている。更に測定セル１の上端外側は溢れた基質溶液を回収する基質溶液オーバーフロー部１０となっている。この基質溶液オーバーフロー部１０で回収された基質溶液は基質溶液出口１１を経て廃液容器１６に至るようにされている。
【０００６】
一方、測定セル１への基質溶液の供給は、基質溶液容器１５に収容されている基質溶液を送液ポンプ１４によって、前述した基質溶液入り口２から行われるようにされている。
【０００７】
電気回路部１７は、ｐＨ電極３０および比較電極１２から得られる電気信号に基づいて演算を行ってｐＨ変動を求め、その結果を表示部に出力するデータ処理機能と、送液ポンプ１４を駆動制御する駆動制御機能を備えている。
【０００８】
表示部１８は、電気回路部１７から与えられる信号に応じた表示を行うものである。
【０００９】
このように構成された装置を用いて、例えばヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼを検出する場合には、細径管固相１９の内外壁に受容体としてヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対するモノクローナル抗体を固着しておく。
【００１０】
そして操作者は、この細径管固相１９の一端側を検体溶液に一定時間浸漬して取り出し、その一端側を測定セル１の細径管固相挿入口９から、細径管固相挿入部７内に収容する。このとき図５に示すように細径管固相１９の内部にｐＨ電極感応部６が挿入された状態いわゆるカップリングの状態となる。この状態で操作者は電気回路部１７に動作開始を指示する。これにより送液ポンプ１４は駆動され、細径管固相１９の内部に基質溶液を供給されその内部が洗浄される。所定時間経過後、送液ポンプ１４は停止し、細径管固相１９の内部の基質溶液にｐＨ変化が生じる。電気回路部１７はその変化をｐＨ電極３０の出力電圧から求め、その値を表示部１８に表示させる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、この装置において、上記のように細径管固相１９の細径管とｐＨ電極３０のｐＨ電極感応部６をカップリングさせると次のような問題点が存在することが判明した。
【００１２】
（１）この装置においては、検出感度と検出速度を良くするために、細径管内壁とｐＨ電極感応部との距離を可能な限り近付けることが必要である。そのためには細径管内径とｐＨ電極感応部を可能な限り細くすることが必要である。しかし、それらの製造は困難であり、特にｐＨ電極感応部を細くすることには限界がある。例えば、ｐＨ電極としてｐＨ感応性電界効果トランジスタ（ 以下ｐＨ−ＦＥＴと称する） を用いた場合、実用的にはその感応部の太さは０．５ｍｍ 程度であり、それに応じて細径管の内径を ０．６ｍｍ 程度にすることは可能であるが、それ以上細い細径管ではカップリングは不可能である。
【００１３】
（２）細径管とｐＨ電極感応部をカップリングさせる方法では、細径管の寸法や形に誤差があった場合、両者が接触し、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする危険性がある。
【００１４】
本発明の目的は、検出感度と検出速度に優れた測定を行うことができ、また細径管とｐＨ電極感応部が接触することなく測定を行うことができるようにすることである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
請求項１の装置は、細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相と、前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセルと、前記細径管固相の少くとも一端を前記セル内に保持する細径管固相保持手段と、前記セル内であって前記細径管固相の外部にその感応部が配置され前記基質溶液のｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、前記セル内に保持された細径管固相の内部の前記基質溶液を前記感応部側に移動させる基質溶液移動手段と、を具備する。
【００１６】
このような装置を用いてｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定する場合、操作者は、細径管固相の一端を検体溶液に浸漬した後、その細径管固相をセル内に保持手段によって保持させる。そして基質溶液をセルに収容すると、細径管固相内部の基質溶液にｐＨ変化が生じる。その後、基質溶液移動手段によって細径管固相内部の基質溶液をｐＨ電極の感応部に移動させる。ｐＨ電極はこのときの基質溶液のｐＨを検出する。
【００１７】
請求項２の装置は、請求項１の装置であって、セル内において、ｐＨ電極の感応部の基端から細径管固相の一端までの間の容積のうち前記感応部が占める容積を除いた容積が１０マイクロリットル以下であることを特徴とする。この部分の容積がこの程度であれば、細径管固相の内部の基質液が殆ど希釈されることなくｐＨ電極の感応部に至る。
【００１８】
請求項３の装置は、請求項１の装置であって、受容体がヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対する抗体であり、かつ基質溶液が尿素を含有する溶液であることを特徴とする。この装置により、ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ濃度を測定される。
【００１９】
請求項４の装置は、請求項１の装置であって、ｐＨ電極はｐＨ−ＦＥＴであることを特徴とする。この装置は、小型であり、これを用いた測定は応答性が良く、高感度である。
請求項５の装置は、請求項１の装置であって、ｐＨ電極の感応部の端面と、細径管固相の端面は、間隔をあけて対向配置されることを特徴とする。
【００２０】
請求項６の装置は、請求項１の装置であって、細径管固相は細径管の内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された繊維状物質を有する。この装置では、単なる細径管よりも固相の比表面積を大きくすることができ、それによって測定対象物質または生物体の検出限界を下げることができる。
【００２１】
請求項７の方法は、細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相の一端を検体溶液に浸漬して取り出した後、前記細径管固相の一端を、前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセル内に保持して、前記セル内においてｐＨ電極の感応部が前記細径管固相の外部に配置された状態とし、前記感応部にｐＨ変化誘因反応後の前記細径管固相内の前記基質溶液を移動させるようにした測定方法である。この方法において、ｐＨ電極は、細径管固相内に感応部を挿入して測定した結果と同じ結果を出力する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
図１はその装置の構成を示し、図２はその装置の使用時の状態を示す。この装置が図４、図５に示した従来の装置と異なる点は、その従来の装置における測定セル１のｐＨ電極ボディー収容部５と細径管固相挿入部７との間にｐＨ電極感応部収容部２１を設けた点であり、ｐＨ電極感応部６はここに収容される。また前記従来の装置では送液ポンプ１４は基質溶液を一方的に測定セル１に供給するのみであったが、本実施の形態の装置の送液ポンプ４０はその基質溶液の供給量にくらべればきわめて僅かではあるが、測定セル１内の基質溶液を吸引するようにも動作するものである。したがって本装置の電気回路部７０も前記従来の装置の電気回路部１７と若干異なり、送液ポンプ４０を正逆いずれの方向にも駆動させることができるようになっている。他の各部は上記従来の装置の各部と同じであるので、同一の番号を付している。以下、その主な各部を詳細に説明する。
【００２３】
（１）測定セル１；測定セル１の材質としては例えばプラスチック、金属、ガラス等を用いる。
【００２４】
（２）ｐＨ電極３０；通常のガラス電極、ｐＨ−ＦＥＴ等を用いる。ｐＨ−ＦＥＴは小型化が容易で、ｐＨ変化に対する応答が速く、かつｐＨ感度等の特性の経時変化が少い等の特徴があるので本実施の形態の装置として最適である。
【００２５】
（３）ｐＨ電極感応部収容部２１；ｐＨ電極感応部６を収容する部分であり、ｐＨ変化誘因反応後に細径管固相１９内の基質溶液を逆流させて満たす所である。その時の希釈効果を極小に抑えるために、この部分の死容量（ｐＨ電極感応部収容部２１の容積と、そこに収容されているｐＨ電極部分すなわちｐＨ電極感応部６の容積との差）は小さい方が望ましい。またこのように部分の死容量を小さくすれば、逆流液量が少くて済み、測定セル全体の容積を小さくすることができ、検体溶液の必要量を少くすることができるという効果がある。この死容量としては１０μリットル以下が好ましい。
【００２６】
（４）細径管固相挿入部７；細径管固相１９の一端側が挿入される所である。ここに細径管固相１９が挿入されると、Ｏリング８は、細径管固相１９と細径管固相挿入部７の周壁との間を密閉する。このため基質溶液は細径管固相１９の内部のみを流れ、細径管固相１９の外周部には流れないようにされる。また、ここに細径管固相１９が挿入されると、その先端より外側にｐＨ電極感応部６は位置する。細径管固相挿入部７とＯリング８が細径管固相保持手段を構成する。
【００２７】
（５）比較電極１２；未反応基質溶液滞留部３の中に設置される。飽和カンコウ電極や銀−塩化銀電極等の液絡式比較電極を用いる。また、ここに参照用のｐＨ−ＦＥＴと疑似比較電極（銀線等）を設置し、測定用ｐＨ−ＦＥＴとの出力電位の差を測定するようにしても良い（特願平７−３５３７１９参照）。
【００２８】
（６）送液ポンプ４０；正逆いずれの方向にも送液できるポンプであり、正確な量を送液できるようにステッピングモータを用いたものが好適である。この送液ポンプ４０の逆流機能が基質溶液移動手段に相当する。
【００２９】
（７）細径管固相１９；細径管の材質としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等を用いる。細径管固相１９は上記の細径管の少くとも内壁面上に測定対象物質あるいは測定対象生物体に対する受容体を固定化することによって作製される。受容体としては抗体、特定蛋白質に対する結合性蛋白（レセプタ類を含む）、細胞接着因子等を用いる。
【００３０】
これらの受容体を細径管に固定化するためには、酵素免疫測定法の固相を調製する時と同様の方法を用いる。最も一般的には細径管に受容体を物理吸着させた後に、牛の血清アルブミン等でブロッキングすることによって調製される。
【００３１】
細径管の内径をｒ、長さをｌとすれば、細径管内部の容積に対する内壁の比表面積ｓは次式のように細径管の内径ｒに反比例する。
ｓ＝（２πｒｌ）／（πｒ２ ｌ）＝２／ｒ
【００３２】
すなわち細径管の内径ｒが小さいほど比表面積ｓが増大し、ｐＨ変化誘因反応の速度が大きくなる。したがって、細径管の内径ｒは小さいほど好ましく、通常は内径ｒは１ｍｍ以下が好ましい。しかし、実際的には細径管を金型で成型する時の成型性、さらにそれに受容体を固定化するときの操作性等から内径ｒを０．１ｍｍ以下にすることは難しい。したがって、細径管の内径ｒとしては、０．１ｍｍから１ｍｍ程度が好ましい。
【００３３】
さらに本装置においては、細径管とｐＨ電極をカップリングさせないので、細径管の内部に例えば受容体をあらかじめ固定化したガラス繊維とか合成繊維を充填して細径管固相を作製しても良い。この場合には繊維の比表面積が大きいので、細径管の内径そのものは１ｍｍ以上であっても良い。
【００３４】
（８）基質溶液；本装置に用いられる基質溶液とは、ｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体によって分解ないしは代謝されてｐＨ変化を誘因する化合物（基質）を含む溶液を意味する。測定対象物質が酵素の場合、基質としては、ウレアーゼ／尿素、グルコースオキシダーゼ／グルコース、リパーゼ／トリアシルグリセロール等を用いる。
【００３５】
測定対象物質が細胞、微生物等の生物体の場合には、基質溶液として、これらの生物体によって代謝されてｐＨ変化を誘因する基質を含む水溶液を使用すれば良い。このような基質としては、例えばグリコース、フラクトース、シュクロース等の糖類が最も一般的である。
【００３６】
（９）電気回路部７０；ｐＨ電極３０および比較電極１２から得られる電気信号に基づいて演算を行ってｐＨ変動を求め、その結果を表示部に出力するデータ処理部７１と、送液ポンプ４０を駆動制御する駆動制御部７２を備えている。
【００３７】
次にこのように構成された本装置を用いて検体溶液中の測定対象物質もしくは測定対象生物体の濃度を測定する方法を説明する。
【００３８】
まず操作者は、細径管固相１９の一端側を検体溶液中に浸漬し、検体溶液を細径管内部に吸引させる。細径管の内径が１ｍｍ以下であれば、故意に吸引させなくとも、毛細管現象で自然に検体溶液が細径管内に吸引される。この状態で一定時間静置すると、細径管内の受容体によって検体溶液中の測定対象たるｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体が捕捉される。
【００３９】
次に操作者は、上記の操作を終えた細径管固相１９の一端側を測定セル１の細径管固相挿入口９から、細径管固相挿入部７内に挿入する。このときの状態を図２に示す。その後、操作者は電気回路部７０に動作を開始させる。これにより駆動制御部７２は送液ポンプ４０を駆動させ、基質溶液容器１５に収容されている基質溶液を測定セル１に送り込み、細径管固相１９の内部を十分洗浄する。この操作によって、細径管固相１９の内部に遊離状態（受容体と結合していない状態）で付着している測定対象物質もしくは測定対象生物体が洗い落とされ、受容体と結合した測定対象物質もしくは測定対象生物体のみが細径管内部に残る。ここで洗浄時の基質溶液の流速を十分高くしておくならば、洗浄直後のこの出力電圧Ｖ０ を未反応の基質溶液のｐＨに対応する出力電圧とみなすことができる。
【００４０】
データ処理部７１は、この洗浄が終了した時点でのｐＨ電極３０の出力電圧Ｖ０ を読み取り、記憶する。
【００４１】
その後、駆動制御部７２は送液ポンプ４０を所定時間停止させる。このとき、細径管固相１９の内部で、その捕捉されたｐＨ変化誘因性物質もしくはｐＨ変化誘因性生物体と基質との反応が進行する。その反応によって基質溶液中の基質が分解され、細径管固相１９の内部の基質溶液のｐＨが変動してくる。
【００４２】
その後、駆動制御部７２は送液ポンプ４０をわずかに逆転させて基質溶液を逆流させ、送液ポンプ４０を停止させる。これにより、細径管固相１９の内部の反応後の基質溶液が、ｐＨ電極感応部収容部２１に至る。それに応じてｐＨ電極３０の出力電圧が変動する。データ処理部７１は、上記の送液ポンプ１４の停止から所定時間後、ｐＨ電極３０の出力電圧Ｖを読み取り、記憶する。この電圧は反応後の基質溶液のｐＨに対応する。データ処理部７１は、記憶したデータＶ０，Ｖから次式を計算してｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体による基質溶液のｐＨ変化を求める。この値は表示部１８に表示される。
ΔｐＨ＝（Ｖ−Ｖ０ ）／Ｓ （１）
【００４３】
ここでＳはｐＨ電極３０の感度である。このΔｐＨが検体溶液中の測定対象たるｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体の濃度の増大とともに増大（マイナスの場合は減少）する。
【００４４】
次に操作者は、細径管固相１９を測定セル１から抜き取り、駆動制御部７２に指示を与え、送液ポンプ４０を正転させる。これにより測定セル１の内部は基質溶液によって洗浄される。
【００４５】
本発明をより具体的に説明するため、以下に試験例を示す。
試験例１．
Ａ．装置の構成
基本的には図１に示した構成である。ｐＨ電極３０としては、特公平４−５１７８６ 号公報に記載されている、酸化タンタルをｐＨ感応膜とするｐＨ−ＦＥＴを用いた。その寸法は幅０．４５ｍｍ、厚み０．２ｍｍ、長さ５．５ｍｍで、その先端０．８ｍｍの部分がｐＨ電極感応部６である。このｐＨ−ＦＥＴの先端約２ｍｍを露出し、残りの部分をこの素子にボンディングされたソース、ドレインのリード線とともに、外径０．６０ｍｍの樹脂体に埋め込み、ｐＨ電極ボディー部４とした。このｐＨ−ＦＥＴのｐＨ感度は２５℃で５８ｍＶ／ｐＨ、相互コンダクタンスは３５０マイクロジーメンスであった。
【００４６】
比較電極１２としては表面が塩素化された銀線を用いた。このｐＨ電極３０はそのｐＨ電極感応部６がその収容部２１（内径０．７ｍｍ）に収まるように、また比較電極１２はそれが未反応基質溶液滞留部３に収容されるように位置決めしてこれらをｐＨ電極コネクタ１３に固定した。なお、この時ｐＨ電極３０の上端と細径管固相１９の下端との間の距離が約０．１−２．０ｍｍになるようにｐＨ電極３０の位置決めを行った。ｐＨ電極３０（ｐＨ−ＦＥＴ）の作動は、ドレイン電圧３ボルト、ドレイン電流７μＡで定電流回路に接続して行った。またｐＨ電極３０（ｐＨ−ＦＥＴ）の出力信号としては比較電極１２を基準とするｐＨ電極３０のソース電位を測定した。
【００４７】
送液ポンプ４０としては、ステッピングモータ駆動によるチューブポンプを使用した。
【００４８】
電気回路部７０は、ディジタルコンピュータを備え、このディジタルコンピュータに、送液ポンプ４０を制御する機能、ｐＨ電極３０の出力信号に基づいて演算処理をする機能を備えさせた。それぞれの機能が、図１に示した駆動制御部７２、データ処理部７１に対応する。
【００４９】
Ｂ．細径管固相１９の調製
受容体としてヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対するモノクローナル抗体（Ｋ．Ｎａｇａｔａ， Ｔ．Ｍｉｚｕｔａ， Ｙ．Ｔｏｎｏｋａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６０，， ４８２６−３１（１９９２） 参照）を使用した。このモノクローナル抗体５０μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）１ｍｌ中に内径０．６０ｍｍ、外径１ｍｍ、長さ１５ｍｍのポリプロピレン製細径管２０本を浸漬し、室温下２４時間静置することによって、この細径管の内外表面に抗体を固定化した。
【００５０】
次いで遠心分離によって抗体溶液の液切りを行い、この細径管をシュクロース１０％、牛血清アルブミン１％、およびアジ化ナトリウム０．１％を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、室温下２４時間静置することによって、ブロッキング処理を行った。その後、遠心分離によってブロッキング溶液の液切りを行った。さらに室温下で風乾した細径管固相を密閉容器の中に収容して、４℃で保存した。
【００５１】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ（Ｋ．Ｎａｇａｔａ他、の同上文献参照）をＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で希釈して、定められた濃度がそれぞれ異なる複数種の検体溶液を調製した。各検体溶液１０μｌに上記Ｂで作製した細径管固相１９をそれぞれ浸漬し、室温で１時間静置した。
【００５２】
基質溶液として、２ｍＭ尿素と１０ｍＭ塩化アンモニウム、および１５４ｍＭの塩化ナトリウムを含む水溶液を使用した。
【００５３】
操作者は電気回路部７０に、動作を開始させ、送液ポンプ４０により測定セル１に基質溶液を３ｍｌ／分の流速で供給しつつ、検体溶液から取り出した１本の細径管固相１９を測定セル１の細径管固相挿入部７に挿入する。この基質溶液の供給はその開始から６０秒間行われ、細径管固相１９の内部が洗浄される。この６０秒が経過すると、駆動制御部７１は送液ポンプ４０を停止させ、同時に、データ処理部７１はその時のｐＨ電極３０のソース電位Ｖ０ を読取り、記憶する。
【００５４】
この後、駆動制御部７１は５５秒間、送液ポンプ４０を停止させ、細径管固相１９の内部で基質の分解反応を進行させた後、送液ポンプ４０を２ステップだけ逆転させて停止させる。この逆転ステップ数は細径管固相１９内の基質溶液を約１μｌ逆流させる量になっている。データ処理部７１はこの逆転から５秒後のｐＨ電極３０のソース電位Ｖを読取り、記憶し、このＶと既に記憶している電位Ｖ０ に基づいて上記式（１） を用いて計算を行い、ΔｐＨを求め、これを表示部１８に表示させる。
【００５５】
次に、操作者は、細径管固相１９を測定セル１から抜き取り、駆動制御部７１に指示を与えて、送液ポンプ４０を正転駆動させ基質溶液を測定セル１に３ｍｌ／分の流速で１５秒間供給し、測定セル１内を洗浄する。
【００５６】
操作者は、以上の作業を各検体溶液に浸漬された細径管固相１９について行った。その結果を、図３に白四角の点として示した。
【００５７】
試験例２．
Ａ．装置の構成
試験例１のＡと同じ。
【００５８】
Ｂ．細径管固相の調製
細径管固相として、細径管の内部に抗体を固定化したガラスウールを充填したものを以下のようにして調製した。
【００５９】
試験例１で説明したものと同じ抗体溶液１ｍｌにガラスウール０．２ｇを浸漬し、室温で２４時間静置した。遠心分離によって液切りを行った後、このガラスウールを試験例１で説明したものと同じブロッキング溶液１ｍｌに２４時間浸漬し、ブロッキングを行った。再度遠心分離によって液切りし、風乾した。このガラスウール約５ｍｇを試験例１で用いたものと同じ細径管（抗体を固定化していないもの）の内部に一様に充填し、これを細径管固相とした。
【００６０】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
試験例１のＣと同じ。その測定結果を、図３に黒丸の点として示した。
【００６１】
比較例
本発明の装置と従来の装置とを比較するために、以下の試験を行った。
Ａ．装置の構成
試験例１のＡに使用した部品と同じものを使用して構成した。ただし、ｐＨ電極感応部６が細径管固相収容部７の中に収容されるように、ｐＨ電極３０の位置を少し上方にずらした。
【００６２】
Ｂ．細径管固相の調製
試験例１のＢと同じ。
【００６３】
Ｃ．ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼの測定
試験例１のＣと同じようにして、細径管固相と検体溶液とを１時間反応させ、基質溶液を送液しながら細径管固相を測定セルに挿入し、６０秒間洗浄した後、Ｖ０ を読み取った。次いで送液ポンプを５５秒間停止させ、５５秒目のｐＨ電極出力Ｖを読み取った。その後、細径管固相を測定セルから抜き取り、１５秒間洗浄した。このようにして測定されたＶ０ 、Ｖから（１） 式によってΔｐＨを計算した。その測定結果を、図３に白丸の点として示した。
【００６４】
図３の結果から明らかなように、同じ細径管固相を用いて測定を行った場合、その測定結果は本発明によるものと、従来のカップリングによるものとはほぼ同じ信号強度が得られる。すなわち、本発明のように細径管固相とｐＨ電極との接触の危険性を完全に回避する方法においても、従来のカップリングによる方法と同程度の信号強度が得られる。さらに従来のカップリングによる方法では物理的に使用不可能であったガラスウール固相を充填した細径管固相のように、より比表面積が大きな細径管固相を用いることにより、検出信号強度を大幅に増大することも、本発明によって可能となった。
【００６５】
【発明の効果】
請求項１の発明によれば、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度にｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定することができる。
【００６６】
請求項２の発明によれば、細径管固相の内部の基質液が殆ど希釈されることなくｐＨ電極の感応部に至り、高精度に測定を行うことができる。さらに、移動液量が少くて済み、セル全体の容積を小さくすることができ、検体の必要量がわずかで良いという効果も有する。
【００６７】
請求項３の発明によれば、ヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼ濃度の測定を、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度に行うことができる。
【００６８】
請求項４の発明の装置は小型であり、かつ応答性が良く、高感度である。また請求項５の発明の装置によれば、ｐＨ電極の感応部の端面と、細径管固相の端面は、間隔をあけて対向配置されるので、細径管固相の内部の基質溶液を効率良く感応部側に移動させることができる。
【００６９】
請求項６の発明によれば、固相の比表面積を大きくし、検出限界を下げることができる。
【００７０】
請求項７の発明によれば、ｐＨ電極を破損したり、汚染したりする恐れなく、高感度にかつ高速度にｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態の装置の構成図。
【図２】図１に示した装置を用いた測定の説明図。
【図３】本発明により行った測定結果を従来方法による測定結果と比較して示す図。
【図４】従来の測定装置を示す図。
【図５】図４に示した装置を用いた測定の説明図。
【符号の説明】
１ 測定セル
１９ 細径管固相
３０ ｐＨ電極
６ ｐＨ電極感応部
４０ 送液ポンプ
Claims (7)
- 細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相と、
前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセルと、
前記細径管固相の少くとも一端を前記セル内に保持する細径管固相保持手段と、
前記セル内であって前記細径管固相の外部にその感応部が配置され前記基質溶液のｐＨ変化を検出するｐＨ電極と、
前記セル内に保持された細径管固相の内部の前記基質溶液を前記感応部側に移動させる基質溶液移動手段と、
を具備するｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。 - セル内において、ｐＨ電極の感応部の基端から細径管固相の一端までの間の容積のうち前記感応部が占める容積を除いた容積が１０マイクロリットル以下であることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。
- 受容体がヘリコバクターピロリ由来ウレアーゼに対する抗体であり、かつ基質溶液が尿素を含有する溶液であることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。
- ｐＨ電極はｐＨ感応性電界効果トランジスタであることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。
- ｐＨ電極の感応部の端面と、細径管固相の端面は、間隔をあけて対向配置されることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。
- 細径管固相は細径管の内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された繊維状物質を有することを特徴とする請求項１に記載のｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定装置。
- 細径管を備え少くともその内部に測定対象とするｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する特異的な受容体が固定化された細径管固相の一端を検体溶液に浸漬して取り出した後、前記細径管固相の一端を、前記ｐＨ変化誘因性物質またはｐＨ変化誘因性生物体に対する基質を含む基質溶液を収容するセル内に保持して、前記セル内においてｐＨ電極の感応部が前記細径管固相の外部に配置された状態とし、前記感応部にｐＨ変化誘因反応後の前記細径管固相内の前記基質溶液を移動させるようにしたｐＨ変化誘因性物質または生物体の測定方法。
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