JP3607201B2 - Ｆａｐ活性化抗腫瘍性化合物 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は腫瘍の部位で薬剤に変換されるプロドラッグの投与による腫瘍治療の分野に関する。特に、本発明はＦＡＰαの触媒作用によって薬剤に変換されるプロドラッグ、その製造及び医薬用途に関する。
背景及び従来技術
ヒトの繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）は本来モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９と同定されるＭ_ｒ ９５，０００細胞表面分子である（Ｒｅｔｔｉｇら （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ３１１０−３１１４； Ｒｅｔｔｉｇら （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ３３２７−３３３５）。ＦＡＰα ｃＤＮＡは大きな細胞外領域を有するＩＩ型内在性膜タンパク質、膜貫通セグメント及び短い細胞質末端（ｓｈｏｒｔ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ）をコードする（Ｓｃａｎｌａｎら （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ５６５７−５６６１； ＷＯ ９７／３４９２７）。ＦＡＰαはＴ細胞活性化抗原ＣＤ２６、またジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ； ＥＣ ３．４．１４．５）としても知られる、ジペプチジルペプチダーゼ活性を有する膜結合タンパク質と４８％のアミノ酸配列同一性を示す（Ｓｃａｎｌａｎら， 上記引用文献）。ＦＡＰαは酵素活性を有し、酵素機能にとって重要な意味を持つセリン６２４を有するセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである（ＷＯ ９７／３４９２７）。膜オーバーレイアッセイを使用する研究は、ＦＡＰαダイマーがＡｌａ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン及びＬｙｓ−Ｐｒｏ−７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリンジペプチドを切断できることを明らかにした（ＷＯ ９７／３４９２７）。
【０００２】
ＦＡＰαは、ヒトの上皮がん、創傷治癒の肉芽組織、及びある骨及び軟部組織肉腫の悪性細胞の多くの細胞学的タイプの反応性ストローマ繊維芽細胞内で選択的に発現される。正常な成人の組織は一般的に検出可能なＦＡＰαに欠けているが、幾つかの胎児の間葉組織は過渡的に分子を発現する。対照的に、***、小細胞型でない肺（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ）及び結腸直腸腺がんの９０％よりも多くを含む大抵の上皮がんの一般的なタイプは、ＦＡＰα反応性ストローマ繊維芽細胞を含む（Ｓｃａｎｌａｎら， 上記引用文献）。これらのＦＡＰα^＋繊維芽細胞は新しく形成された腫瘍血管を伴い、腫瘍毛細血管内皮及び悪性の上皮細胞クラスターの基底の側面の間に挿入した別の細胞区画を形成する（Ｗｅｌｔら （１９９４） Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２（６）， １１９３−１２０３）。ＦＡＰα^＋ストローマ繊維芽細胞は一次及び転移性がんで発見されるが、***の繊維腺腫及び結腸直腸腺腫等の検査した良性及び前がん上皮病変はまれにＦＡＰα^＋ストローマ細胞のみを含む（Ｗｅｌｔら， 上記引用文献）。正常な組織のＦＡＰαの制限分布パターン及び多くの悪性腫瘍の支持ストローマ内のその均一な発現に基づいて、^１３１Ｉ−標識ｍＡｂ Ｆ１９による臨床試験は転移性大腸がんを有する患者において開始された（Ｗｅｌｔら， 上記引用文献）。
【０００３】
細胞障害薬又は細胞***停止薬に基づく新しいがん治療について、多くの考察は、がん組織の死滅の効力を改善すること及び／又は細胞障害剤又は細胞***停止剤の正常な組織に対する毒性を減少させることによる治療係数の増加である。腫瘍組織の死滅の特異性を増加し、及び正常な組織への毒性を減少させるために、トリガー機構は、そのプロドラッグ又は不活性化状態で合成される毒物が必要とされる時及び場所、特にがん組織において活性化されるように設計される（Ｐａｎｃｈａｌ （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５５， ２４７−２５２）。トリガー機構は光又は化学的等の外来性因子又はがん組織において制限された発現を有する酵素等の内在性細胞因子を含んでもよい。更に詳しく述べられている他の概念は、‘酵素プロドラッグ治療用抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ）’（ＡＤＥＰＴ）又は‘触媒用抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃａｔａｌｙｓｉｓ）’（ＡＤＳ）と呼ばれる（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２， ２３４−２３９； Ｂａｇｓｈａｗｅ （１９９４） Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ２７， ３６８−３７６； Ｗａｎｇら（１９９２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２， ４４８４−４４９１； Ｓｐｅｒｋｅｒら（１９９７） Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ． ３３（１）， １８−３１）。ＡＤＥＰＴにおいて、腫瘍結合型（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）抗原に関する抗体は特定の酵素が腫瘍部位を標的にするように使用される。腫瘍に位置する（ｔｕｍｏｒ−ｌｏｃａｔｅｄ）酵素は、続いて投与されるプロドラッグを活性化した細胞障害剤に変換する。抗体酵素接合体（ＡＥＣ）は細胞膜の標的抗原又は細胞外液（ＥＣＦ）の遊離した抗原と結合する。ＡＥＣ及びプロドラッグを与える時間間隔は、プロドラッグが正常な組織又は血液で活性化されないようにＡＥＣを正常な組織から除去する。しかし、ＡＤＥＰＴの幾つかの欠点はＡＥＣの性質に関係する（Ｂａｇｓｈａｗｅ， 上記引用文献）。例えば、ヒトにおいて、標的ＡＥＣの投与量の小さなフラクションは腫瘍組織と結合し、残りは体液によって分配され、それは明らかな時間遅れによって除去される。血漿及び正常なＥＣＦの量は腫瘍ＥＣＦの量よりもはるかに多いために、非常に低い濃度の非結合性酵素は毒性効果を有するために充分なプロドラッグを触媒する。また、ＡＥＣは免疫原性であってもよく、これにより多くの場合、繰り返しの投与を防止する。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ ９７／１２６２４及びＷＯ ９７／１４４１６は、アミノ酸配列を含み、遊離した前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）によって認識され、タンパク分解性切断される以下のペンタ−及びヘキサペプチド（ＳＥＱ． ＩＤ． ＮＯｓ．： １５１及び１７７： ｈＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ； ｈＡｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）を含むオリゴペプチド及びそのようなオリゴペプチドと公知の治療薬又は細胞障害剤の接合体を含む治療薬を開示する。少なくとも１つのグルタミン−セリン部分を含むこれらのオリゴペプチド接合体は前立腺がんの治療のみに有用である。
本発明の基礎をなす課題は、広範囲の腫瘍組織に対して公知の効力を有する細胞障害剤又は細胞***停止剤の正常組織耐容性を改善するための方法及び手段を提供することである。
【０００５】
発明の開示
本発明は酵素活性化抗腫瘍化合物に関する。特に、本発明は、ヒトのがん組織に存在することが示される内在性繊維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）の触媒作用によって薬剤に変換され得るプロドラッグを提供する。好ましくは、本発明のプロドラッグはＦＡＰαの触媒作用によって薬剤に変換され、前記プロドラッグはＦＡＰαによって認識される切断部位を有し、前記薬剤は生理学的条件下でがん細胞に対して細胞障害性又は細胞***停止性である。
本発明に関連して、“薬剤”は病気の治療の援助としてヒト又は動物に投与してもよい化学物質を意味するものとする。特に、薬剤は薬理学的な活性剤である。
【０００６】
用語“細胞障害性化合物”は生細胞への毒性がある化学物質、特に細胞を破壊又は死滅させる薬剤を意味するものとする。用語“細胞***停止性化合物”は細胞の成長及び***を抑制し、こうして細胞の増殖を阻害する化合物を意味するものとする。本発明に適した細胞障害性又は細胞***停止性化合物としては、ドキソルビシン等のアントラサイクリン誘導体、メトトレキセート、プリトレキシム（ｐｒｉｔｒｅｘｉｍｅ）、トリメトレキセート又はＤＤＭＰ等のメトトレキセート類縁体、メルファラン、シスプラチン、ＪＭ２１６、ＪＭ３３５、ビス（プラチナム）又はカルボプラチン等のシスプラチン類縁体、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、６−チオグアニン、フルルダラビン（ｆｌｕｒｄａｒａｂｉｎｅ）、２−デオキシコホルマイシン（２−ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）等のプリン及びピリミジン類縁体、及び９−アミノカンプトセシン、 Ｄ，Ｌ−アミノグルテチミド、トリメトプリム、ピリメタミン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、シクロホスファナミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｎａｍｉｄｅ）、５−フルオロウラシル、エキストラマスチン（ｅｘｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、ポドフィロトキシン、ブレオマイシン又はタキソール等のその他の化学療法剤類縁体が挙げられる。
【０００７】
“プロドラッグ”は、投与により、薬理学的活性剤になる前に代謝プロセスによって化学的変換されなければならない化合物を意味するものとする。特に、プロドラッグは薬剤の前駆物質である。本発明に関連して、プロドラッグは、ＦＡＰαの触媒作用によって変換される薬剤よりも明らかに小さな細胞障害性又は細胞***停止性である。専門家は化合物の細胞障害性の測定方法を知っており、例えば本明細書の実施例６又はＭｏｓｍａｎｎ（（１９８３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈ． ６５， ５５−６３）を参照されたい。好ましくは、プロドラッグはインビトロのアッセイの薬剤と比較して少なくとも３倍少ない細胞障害性である。
“生理学的条件下で細胞***停止性又は細胞障害性である薬剤”は生きているヒト又は動物のからだの中で細胞***停止性又は細胞障害性である化学物質、特に生きているヒト又は動物のからだの中で細胞を死滅させ、又は細胞の増殖を抑制する化合物を意味するものとする。
【０００８】
“ＦＡＰαによって認識される切断部位を有するプロドラッグ”はＦＡＰαの酵素活性のための基質として作用できるプロドラッグを意味するものとする。特に、ＦＡＰαの酵素活性は生理学的条件下でプロドラッグの共有結合の切断を触媒できる。この共有結合の切断により、プロドラッグは、直接又は間接的に薬剤に変換される。間接的な活性化は、ＦＡＰαが触媒する工程の切断産物がそれ自体薬理学的活性剤ではなく、別の反応工程、例えば加水分解を経て、活性化する場合である。より好ましくは、プロドラッグの切断部位はＦＡＰαによって特異的に認識されるが、ヒト又は動物のからだに存在するその他のタンパク質分解酵素によっては認識されない。また、好ましくは、切断部位はＦＡＰαによって特異的に認識されるが、ヒト又は動物の体液、特に血漿中に存在するタンパク質分解酵素によっても認識されない。特に好ましい実施態様において、プロドラッグは、生理活性ＦＡＰαが存在しない、又は検出されない血漿、その他の体液、又は組織中で安定である。好ましくは、本明細書の実施例７で実施されるインビトロのアッセイにおいて、３７℃で８時間後でも５０％より多く、より好ましくは、８０％よりも多く、更に好ましくは９０％よりも多いプロドラッグが１０％（ｖ／ｖ）のヒトの血漿を含む溶液中に存在する。切断部位はＦＡＰαに特異的であるのが最も好ましい。好ましい実施態様において、切断部位はアミド結合により細胞障害又は細胞***停止薬と結合しているＬ−プロリン残基を含む。このクラスの例としてはドキソルビシン−ペプチド接合体が挙げられる。ＦＡＰαは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基（好ましくはＬ−プロリン）と細胞障害性又は細胞***停止性化合物とのペプチド結合の切断を触媒してもよい。
【０００９】
好ましい化合物は、以下に挙げられる標準条件下で、少なくとも１０％の遊離した薬剤への変換を示す。より好ましくは、標準条件下で、少なくとも２０％の遊離した薬剤への変換を示す化合物である。更に好ましくは、標準条件下で、少なくとも５０％の遊離した薬剤への変換を示す化合物である。これに関連して、標準条件は以下のように定義される：各化合物は５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝剤、１５０ｍＭのＮａＣＩ、ｐＨ ７．２に、５μＭの最終濃度で溶解され、１００ｎｇのＣＤ８ＦＡＰα（実施例４参照）により２４時間３７℃でインキュベートされる。ＣＤ８ＦＡＰαによる遊離した薬剤の放出は実施例５に記載されるように測定される。
好ましくは、本発明は下記式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容されるその塩に関する。
【００１０】
【化２２】

【００１１】
（式中、Ｒ^１はアミノアルカノイル、オリゴペプチドイル、特にジ−又はトリペプチドイル基、キャッピング基と結合してもよいＮ末端アミノ官能基を表し；
Ｒ^ａ及びＲ^ｂは間にあるＮ−Ｃ基と一緒になって、必要により置換されていてもよい、必要によりベンゾ−又はシクロヘキサノ−縮合されていてもよい３−から７−員飽和又は不飽和複素環を形成し、その化合物中の１個又は２個のＣＨ_２基はＮＨ、Ｏ又はＳによって置換されていてもよく、
Ｒ^４はＨ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを表し；及び
Ｃｙｔ’は細胞障害化合物又は細胞***停止化合物の残基を表すが、但し
Ｎ２−アセチル−Ｌ−ホモアルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−セリル−Ｎ−［２，３，６−トリデオキシ−１−Ｏ−［（１Ｓ，３Ｓ）−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロ−３，５，１２−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシアセチル）−１０−メトキシ−６，１１−ジオキソ−１−ナフタセニル］−α−Ｌ−ｌｙｘｏ−ヘキソピラノス−３−イル］−Ｌ−プロリンアミド；及び
Ｎ２−アセチル−Ｌ−ホモアルギニル−Ｌ−チロシル−Ｌ−グルタミニル−Ｌ−セリル−Ｌ−セリル−Ｎ−［２，３，６−トリデオキシ−１−Ｏ−［（１Ｓ，３Ｓ）−１，２，３，４，６，１１−ヘキサヒドロ−３，５，１２−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシアセチル）−１０−メトキシ−６，１１−ジオキソ−１−ナフタセニル］−α−Ｌ−ｌｙｘｏ−ヘキソピラノス−３−イル］−Ｌ−プロリンアミドは除外される。）
【００１２】
特に好ましくは、Ｒ^１が式Ｃｇ−Ａ、Ｃｇ−Ｂ−Ａ又はＣｇ−（Ｄ）_ｍ−Ｂ−Ａの残基である式Ｉの化合物である。
式中、Ｃｇは水素原子又はＲ^５−ＣＯ、Ｒ^５−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ^５−ＮＨ−ＣＯ−、Ｒ^５−ＳＯ_２−又はＲ^５−からなる群から選択されるキャッピング基を表し、ここでＲ^５は必要により置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル、アリール、アラルキル又はヘテロアリール基であり；
好ましくはＣｇはアセチル、ベンゾイル、Ｄ−アラニル、（Ｒ）−Ｈ_２ＮＣＨ（ＣＨ_３）−、又はＨ_２ＮＣＯＣＨ_２ＣＨ_２− 置換基又はＮ末端アミノ官能基の保護のための他のキャッピング基であり；
Ａ、Ｂ及びＤは、それぞれ独立に式−［ＮＲ^６−（Ｘ）_ｐ−ＣＯ］−のアミノカルボン酸から誘導される部分を表し、ここでＸはＣＲ^７Ｒ^８を表し、Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８は、それぞれ独立に水素原子、必要により置換されていてもよいＣ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル、アリール又はヘテロアリール基を表し、ｐは１、２、３、４、５であり；又は
Ａ、Ｂ及びＤは、それぞれ独立に下記式の環状アミノカルボン酸から誘導される部分を表す。
【００１３】
【化２３】

【００１４】
（式中、Ｒ^９はＣ_１−Ｃ_６−アルキル、ＯＨ又はＮＨ_２を表し、
ｍは１から１０までの整数であり、
ｑは０、１又は２であり、
ｒは０、１又は２である。）
【００１５】
さらに好ましくは、Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８がそれぞれ独立して水素原子又はＣＨ_３−、ＣＨ_３ＣＨ_２−、ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２−、（ＣＨ_３）_２ＣＨ−、ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、（ＣＨ_３）_２ＣＨＣＨ_２−、ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）−、（ＣＨ_３）_３Ｃ−、ＨＯＣＨ_２−、ＣＨ_３ＣＨ（ＯＨ）−、ＣＨ_３ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_２−、ＨＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−、ＨＳＣＨ_２−、ＣＨ_３ＳＣＨ_２ＣＨ_２−、ＨＯＯＣＣＨ_２−、ＨＯＯＣＣＨ_２ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２−、Ｈ_２ＮＣ（＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２−，ベンジル、パラヒドロキシベンジル、
【００１６】
【化２４】

【００１７】
シクロヘキシル、フェニルを表し、
ｐが１である式Ｉの化合物であり、ここでＣＲ^７Ｒ^８の立体配置はＲ又はＳであってもよく；Ｒ^７がＨ以外である場合、Ｒ^８は好ましくはＨであり；Ｒ^６は好ましくはＨであり；ｐが１よりも大きい場合、Ｒ^７及びＲ^８は好ましくはＨである。
本発明の他の好ましい実施態様は、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及び間にあるＮ−Ｃによって形成される複素環がＲ^２及びＲ^３によって置換されている式Ｉの化合物であり、ここでＲ^２及びＲ^３はそれぞれ独立して水素又はハロゲン原子又はＣ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルコキシ、チオール、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルチオ、オキソ、イミノ、ホルミル（ｆｏｍｙｌ）、Ｃ_１−Ｃ_６−アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル、アリール又はヘテロアリール基を表す。
他に示さない限り、単一の立体異性体と同様立体異性体の混合物又はラセミ体も本発明に含まれる。
【００１８】
“C₁-C₆-アルキル”は一般に1から6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐の炭化水素ラジカルを表す。
基又は部分に関して上記又は下記で使用される用語“必要に置換されていてもよい”は、必要により、1つ又は互いに同一又は異なっていてもよい複数のハロゲン原子、ヒドロキシル、アミノ、C₁-C₆-アルキルアミノ、ジ-C₁-C₆-アルキルアミノ、C₁-C₆-アルキルオキシ、チオール、C₁-C₆-アルキルチオ、=0、=NH、-CHO、-COOH、-CONH₂、-NHC(=NH)NH₂、C₃-C₈-シクロアルキル、アリール又はヘテロアリール置換基で置換されていてもよい基又は部分を意味する。
以下のラジカルは例として挙げられる：
メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル（イソプロピル）、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-l-メチルプロピル及び1-エチル-2-メチルプロピル、HOCH₂-、CH₃CH(OH)-、CH₃CH(OH)CH₂CH₂-、HOCH₂CH₂CH₂CH₂-、H₂NCH₂CH₂CH₂-、H₂NCH₂CH₂CH₂CH₂-、H₂NCH₂CH(OH)CH₂CH₂-、H₂NC(=NH)NHCH₂CH₂CH₂-、HSCH₂-、CH₃SCH₂CH₂-、HOOCCH₂-、HOOCCH₂CH₂-、H₂NC(=O)CH₂-、H₂NC(=O)CH₂CH₂-、ベンジル、パラヒドロキシベンジル、
【００１９】
【化２５】

【００２０】
Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル基が置換されている場合、その置換基は、好ましくはヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、＝Ｏ、＝ＮＨ、−ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、パラヒドロキシベンジル、
【００２１】
【化２６】

【００２２】
である。
Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルがアリール又はヘテロアリールによって置換されている場合、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルは好ましくはＣ_１、より好ましくはメチレン基である。
ラジカルＲ^１に関して、上記又は下記で使用される用語“アミノアルカノイル”及び“ジ−又はトリペプチドイル”を含む“オリゴペプチドイル”は、アミノ酸又は１２個まで、好ましくは２又は３個のアミノ酸部分を含むオリゴマーがアミド結合により複素環の窒素原子とＣ末端に結合しているラジカルを記載する。
アミノ酸及びオリゴペプチドの化学において、当業者は、最初のアミノ酸又はオリゴペプチドの生物活性が修飾によっても保存されている場合、ある種のアミノ酸がその他の同相的、同配的（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）及び／又は等電子的（ｉｓｏｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）アミノ酸によって置換されてもよいことをすでに理解している。また、ある種の変性及び修飾された未変性アミノ酸は対応する未変性アミノ酸を置換するために利用してもよい。このように、例えばチロシンは３−ヨードチロシン、２−又は３−メチルチロシン、３−フルオロチロシンによって置換してもよい。
【００２３】
アミノアルカノイル又はラジカルＲ^１のオリゴペプチドイル基のＮ末端窒素原子と結合した基に関して、上記又は下記で使用される用語“キャッピング基”は、温血動物の血漿中に存在するアミノペプチドの作用による本発明の化合物の酵素分解を減少させ、又は排除する基又は部分を定義する。好適なキャッピング基としてはＣ_１−Ｃ_１０−アルカノイル、Ｃ_６−Ｃ_１８−アリール−Ｃ_１−Ｃ_１０−アルカノイル、Ｃ_６−Ｃ_１８−アリール−Ｃ_１−Ｃ_１０−アルキルスルホニルが挙げられる。また、このようなキャッピング基は親水性官能基の存在により選択される親水性ブロッキング基を含む。このようなキャッピング基は本発明の化合物の親水性を増大させ、水性培地におけるそれらの溶解性を高める。これらの親水性増大キャッピング基は、ヒドロキシル化アルカノール、ポリヒドロキシル化アルカノイル、ヒドロキシル化アロイル、ヒドロキシル化アリールアルカノイル、ポリヒドロキシル化アロイル、ポリヒドロキシル化アリールアルカノイル、ポリエチレングリコール、グリコシル化物（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｓ）、糖、及びクラウンエーテルから選択されるのが好ましい。
【００２４】
“Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル”は、一般的に、必要により１つ又は互いに同一又は異なっていてもよい複数のヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルオキシ、チオール、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＯＮＨ_２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、又はハロゲン置換基によって置換されていてもよい３から８個の炭素原子を有する環状炭化水素ラジカルを表す。
【００２５】
その間のＮ−Ｃ基と一緒になってＲ^ａ及びＲ^ｂにより形成される基に関して、上記又は下記で使用される“複素環”は、一般に３から７員、好ましくは４−、５−又は６員非芳香族複素環系を表し、１つの窒素原子を含み、必要により窒素、酸素及び硫黄の群から選択される追加のヘテロ原子を１つ又は２つ含んでもよく、１つ又は互いに同一又は異なっていてもよい複数のハロゲン原子又はＣ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルオキシ、チオール、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルチオ、オキソ、イミノ、ホルミル（ｆｏｍｙｌ）、Ｃ_１−Ｃ_６−アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ_３−Ｃ_８−シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基によって置換されていてもよく、必要によりベンゾ−又はシクロヘキサノ縮合であってもよい。このような複素環は、アゼチジン、又は完全に又は部分的に水素付加されたピロール、ピリジン、チアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン基から誘導されるのが好ましい。最も好ましくは、アゼチジン、ピロリジン、３，４−デヒドロピロリジン、ピペリジン、ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン（ａｚｅｐｉｎｅ）、オクタヒドロインドール、イミダゾリジン、チアゾリジンである。
このような複素環が置換されている場合、置換基は、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、−ＣＨＯ、− ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、又は−ＣＯＮＨ_２であるのが好ましい。
【００２６】
“アリール”は、一般に６から１０個、好ましくは６個の炭素原子を有する芳香族環系を表し、、必要により１つ又は互いに同一又は異なっていてもよい複数のヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルオキシ、チオール、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルチオ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＯＮＨ_２、又はハロゲン置換基によって置換されていてもよく、また必要によりベンゾ縮合されていてもよい。アリール置換基は、好ましくはベンゼンから誘導され、好ましい例としては、フェニル、２−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−ヒドロキシフェニル、４−アミノフェニル、２−アミノフェニル、３−アミノフェニルである。
アリールが置換されている場合、置換基は、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、又は−ＣＯＮＨ_２であるのが好ましい。
【００２７】
“ヘテロアリール”は、一般的には窒素、酸素、又は硫黄の群から選択される１から５個のヘテロ原子を含む５から１０員芳香族複素環系を表し、必要により１つ又は互いに同一又は異なっていてもよい複数のヒドロキシル、アミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルアミノ、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルオキシ、チオール、Ｃ_１−Ｃ_６−アルキルチオ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＯＮＨ_２、又はハロゲン置換基によって置換されていてもよく、また必要によりベンゾ縮合されていてもよい。ヘテロアリール置換基は、好ましくはフラン、ピロール、チオフェン、ピリジン、チアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、ベンゾフラン、チアナフテン、インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、キノリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、キナゾリン、ピラン、プリン、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシルから誘導される。
ヘテロアリールが置換されている場合、置換基は、メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ヒドロキシル、アミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、チオール、メチルチオール、メトキシ、エトキシ、−ＣＨＯ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ_３、−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ_３、又は−ＣＯＮＨ_２であるのが好ましい。
【００２８】
“細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基”は、式（Ｉ）で示されるアミド結合の切断によって放出される化合物Ｈ_２Ｎ−Ｃｙｔ’がそれ自体細胞障害性又は細胞***停止性であり、又は後の工程で細胞障害性又は細胞***停止性化合物に変換されることを意味する。
後者の場合において、−Ｃｙｔ’は式−Ｌ−Ｃｙｔ’’の残基であってもよく、ここでＬは、二官能性分子、例えばジアミンＨ_２Ｎ−Ｌ’−ＮＨ_２、アミノアルコールＨ_２Ｎ−Ｌ’−ＯＨ、例えばｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢＯＨ）、アミノカーボネート、例えば
【００２９】
【化２７】

【００３０】
又は変性なアミノカルボン酸から誘導されるリンカー残基である。−Ｃｙｔ’が式−Ｌ−Ｃｙｔ’’である場合、化合物Ｈ_２Ｎ−Ｌ’−Ｃｙｔ’’は式（Ｉ）で示されるアミド結合の酵素切断によって産生される。化合物Ｈ_２Ｎ−Ｌ’−Ｃｙｔ’’はそれ自体細胞障害性又は細胞***停止性であってもよく、細胞障害剤又は細胞***停止剤を放出する後の工程でＣｙｔ’’から切断されるリンカー残基であってもよい。例えば、化合物Ｈ_２Ｎ−Ｌ’−Ｃｙｔ’’は生理学的条件下で化合物Ｈ_２Ｎ−Ｌ’−ＯＨ及び活性な治療薬である細胞障害性又は細胞***停止性化合物Ｈ−Ｃｙｔ’’に加水分解される（以下においては、簡略化のために、用語Ｃｙｔ’のみがＣｙｔ’及びＣｙｔ’’を表すために使用され、用語ＬのみがＬ及びＬ’を表すために使用される）。
【００３１】
本発明の化合物の医薬的に許容される塩は、非毒性の無機又は有機酸から形成される通常の非毒性の塩を含む。例えば、このような通常の非毒性の塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸からなるもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、蓚酸トリフルオロ酢酸等の有機酸から調製される塩が挙げられる。
式Ｉの好ましい化合物は、式ＩＡのものである。
【００３２】
【化２８】

【００３３】
（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｃｙｔ’は上記で定義された通りであり、Ｒ^１はアミノアルカノイル又はオリゴペプチドイル基を表し、Ｘ−ＹはＣＨＲ^２−ＣＨ_２、ＣＲ^２＝ＣＨ、ＮＨ−ＣＨ_２、ＣＨ_２−ＮＨ、−ＣＲ^２−、ＣＨ_２−ＣＨＲ^２−ＣＨ_２を表すが、但しＸ−ＹがＣＨ_２−ＣＨ_２基を表す場合、Ｒ^１はアミノアルカノイル、ジ−又はトリペプチドイル基を表し、又はＲ^１はＧｌｎ−Ｓｅｒアミノ酸配列を含まない３つのアミノ酸部分よりも多くを有するオリゴペプチドイルを表す。）
好ましくは、環状アミノ酸残基のα炭素原子がラセミ、すなわち（Ｒ／Ｓ）立体配置であり、最も好ましくは（Ｓ）立体配置であり；特に好ましい実施態様において、α炭素原子は（Ｓ）立体配置であり、Ｒ^２はＨである。Ｒ^２がＯＨである場合、それはトランス位にあるのが好ましい。
Ｒ^２、Ｒ^３は、好ましくは水素原子又はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、フェニル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシ基、最も好ましくは水素原子を表す。Ｒ^４は、好ましくは水素原子又はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はフェニル基であり、最も好ましくは水素原子である。
式ＩＡの特に好ましい化合物は、ＩＡ１、ＩＡ２、ＩＡ３、ＩＡ４及びＩＡ５から選択される。
【００３４】
【化２９】

【００３５】
Ｈ_２Ｎ−Ｃｙｔ’は、好ましくは式ＩＩのアントラサイクリン誘導体であり、
【００３６】
【化３０】

【００３７】
（式中、
Ｒ^ｃはＣ_１−Ｃ_６−アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６−ヒドロキシアルキル又はＣ_１−Ｃ_６−アルカノイルオキシ−Ｃ_１−Ｃ_６−アルキル、特にメチル、ヒドロキシメチル、ジエトキシアセトキシメチル又はブチリルオキシメチルを表し；
Ｒ^ｄは水素、ヒドロキシ又はＣ_１−Ｃ_６−アルコキシ、特にメトキシを表し；
Ｒ^ｅ及びＲ^ｆの一つは水素原子を表し；他は水素原子又はヒドロキシ又はテトラヒドロピラン−２−イロキシ（ｙｌｏｘｙ）（ＯＴＨＰ）基を表す。
特に好ましくは式ＩＩの以下の化合物である。

【００３８】
最も好ましくはドキソルビシン（Ｄｏｘ）である。その他の細胞障害性又は細胞***停止性残基Ｃｙｔ’は、例えばメトトレキセート、トリメトレキセート、プリトレキシム（ｐｙｒｉｔｒｅｘｉｍ）、５，１０−ジデアザテトラヒドロ葉酸ピリメタミン、トリメトプリム１０−プロパラジル（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）−５，８−ジデアザ葉酸２，４−ジアミノ−５（３’， ４’−ジクロロフェニル（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｙｌ））−６−メチルピリミジン、アミノグルテチミド、ゴレセレリン（ｇｏｒｅｓｅｒｅｌｉｎ）、メルファラン、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、９−アミノカンプトテシン（ａｍｉｎｏｃａｍｔｏｔｈｅｃｉｎ）等のその他の化学療法剤類縁体から誘導してもよい（例えば、Ｂｕｒｒｉｓ ＨＡ， ｒ．ｄ．及びＳ．Ｍ．Ｆｉｅｌｄｓ （１９９４） ”Ｔｏｐｏｉ ｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｎａｌｏｇｓ． ［Ｒｅｖｉｅｗ］．” Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ８（２）： ３３３−３５５； Ｉｙｅｒ， Ｌ．及びＭ．Ｊ．Ｒａｔａｉｎ （１９９８） ”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ． ［Ｒｅｖｉｅｗ］［１３７ ｒｅｆｓ］．” Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４２ Ｓｕｐｐｌ： Ｓ３１−Ｓ４３参照）。
【００３９】
式（Ｉ）において、またＣｙｔ’は、例えばＴＮＦαに似た腫瘍細胞の破壊を直接的又は間接的に行う生物学的エフェクター分子であってもよい。
Ａ、Ｂ及びＤユニットを誘導するアミノカルボン酸の好ましい例としては、グリシン（Ｇｌｙ）、又はＤ−、又はより好ましくはＬ−型アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、５−ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、５−ヒドロキシノルロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン（Ｈｙｎ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、メチオニン−Ｓ−酸化物（Ｍｅｔ）、β−シクロプロピルアラニン（Ｃｐａ）、ｔｅｒｔ．−ロイシン（Ｔｌｅ）、又はホモセリン（Ｈｓｅ）が挙げられる。
【００４０】
好ましい化合物は、Ａユニットがアラニン、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トランス−４−ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、５−ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、５−ヒドロキシノルロイシン、６−ヒドロキシノルロイシン（Ｈｙｎ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、又はシクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、メチオニン−Ｓ−酸化物（Ｍｅｔ（Ｏ））、β−シクロプロピルアラニン（β−Ｃｐａ）、ｔｅｒｔ．−ロイシン（Ｔｌｅ）又はホモセリン（Ｈｓｅ）から誘導される一般式（Ｉ）を有する。
【００４１】
特に好ましくは、Ｒ^１が下記式（１）から（３４）から選択される基である式（Ｉ）の化合物である：

（式中、
Ｃｇは水素原子又はベンゾイルオキシカルボニル、フェニルアセチル、フェニルメチルスルホニル及びベンジルアミノカルボニルから選択されるキャッピング基を表し；Ｘａａはアミノカルボン酸から誘導され、好ましくは天然のアミノ酸 、特にＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｈｙｐ及びＬｙｓからなる群から選択される部分を表し；ｍは１から６までの整数である。）
【００４２】
好ましいキャッピング基Ｃｇはアセチル（Ａｃ）、スクシンイミジル（Ｓｕｃ）、Ｄ−アラニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）、又はポリエチレングリコール等の高分子である。
好ましいアントラサイクリンプロドラッグは下記式ＩＩＩの化合物であり、
【００４３】
【化３１】

【００４４】
（式中、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｆ及びＲ_１は上記で定義した通りである。）
本発明の最も好ましい化合物は下記式（ＩＩＩＡ）から（ＩＩＩＦ）までのドキソルビシン誘導体である：
【００４５】
【化３２】

【００４６】
【化３３】

【００４７】
【化３４】

【００４８】
【化３５】

【００４９】
【化３６】

【００５０】
【化３７】

【００５１】
式（Ｉ）の部分Ｃｇ−Ｂ−Ａ又はＣｇ−（Ｄ）_ｍ−Ｂ−Ａが２つ以上の硫黄原子を含む場合、本発明の化合物は１つ以上のジスルフィド結合を含んでもよい。
【００５２】
本発明で使用してもよい細胞障害性又は細胞***停止性化合物の１つのクラスは、ドキソルビシンのような式（Ｉ）で示されるアミド結合の形成に利用できる一級アミノ官能基を有する。この場合、リンカー分子Ｌは必要ではない。細胞***停止性又は細胞障害性化合物がこのようなアミノ官能基を持たない場合、このような官能基は化学修飾、例えば官能基の導入又は変換又はリンカー分子を化合物と結合させることによってそのような化合物を製造してもよい。また、リンカー分子はオリゴマー部分（すなわちアミノカルボン酸残基を含む部分）と本発明の化合物の細胞***停止性又は細胞障害性部分との間に挿入して、オリゴマー部分と細胞障害性又は細胞***停止性部分との間のアミド結合の切断を保証又は最適化してもよい。リンカー分子が存在する場合、すなわち構造Ｌ−Ｃｙｔ’を含む化合物において、ＬとＣｙｔ’との間の結合はアミド結合又はエステル結合であるのが好ましい。好ましい実施態様において、このようなリンカー分子は、酵素切断後、生理学的条件下で細胞***停止性又は細胞障害性化合物を加水分解し、こうして遊離した細胞***性又は細胞障害性化合物が産生される。いずれの場合にも、本発明の化合物はＦＡＰαの触媒作用により切断可能である性質を有する必要があり、この切断の直接的又は間接的結果として、生理学的条件下で細胞***停止性又は細胞障害性化合物を放出する。
【００５３】
別の局面において、本発明はＦＡＰαの触媒作用によって薬剤に変換され得るプロドラッグに関し、前記プロドラッグはＦＡＰαによって認識される切断部位を有し、前記薬剤は生理学的条件下で細胞障害性又は細胞***停止性である。このようなプロドラッグは、好ましくは２つ以上のアミノカルボン酸残基及び細胞障害性又は細胞***停止性部分を含むオリゴマー部分を含み、オリゴマー部分のＣ末端アミノカルボン酸残基は３−から７員自然又は不自然な環状アミノ酸、好ましくはＤ−又はＬ−プロリン、又はＤ−又はＬ−ヒドロキシプロリンであり、Ｃ末端カルボキシ官能基はＦＡＰαの触媒作用によって切断されるアミド結合によって細胞障害性又は細胞***停止性部分と結合される。オリゴマー部分は、好ましくはペプチドである。好ましくは、オリゴマー部分は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のアミノカルボン酸残基を含み、より好ましくは２、３、又は４のアミノカルボン酸残基を含む。Ｎ末端アミノ官能基は、好ましくはキャッピング基によって保護される。
【００５４】
本発明の化合物は技術において公知の方法によって合成してもよい（Ｅ． Ｗｕｎｓｃｈ， Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ， ｉｎ ”Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ”， Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ（Ｅｄｓ． Ｅ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｏ． Ｂａｙｅｒ）， Ｖｏｌ． ＸＶ， Ｐａｒｔ １ ａｎｄ ２， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９７４）。例えば、前記化合物はオリゴマー部分の末端カルボキシ官能基の縮合によってブロック合成方法で合成することができ、ここでＸはＯＨ又は活性化脱離基であってもよく、結果としてアミドを形成する細胞障害性又は細胞***停止性分子Ｈ_２Ｎ−Ｃｙｔ’のアミノ基を有する。
【００５５】
【化３８】

【００５６】
リンカー残基（Ｌ）がオリゴマー部分と細胞障害剤又は細胞***停止剤との間に必要である場合、ブロック合成は同様の方法で行うことができる。
【００５７】
【化３９】

【００５８】
細胞障害性又は細胞***停止性がオリゴマー部分への結合のためのカルボキシ官能基を有する場合、リンカー分子はイミン又はアミノアルコールであってもよく、そのような化合物のブロック合成はヒドロキシ又はアミノ成分を有する活性化したＸＯＣ−Ｃｙｔ’の反応によって同様の方法で行うことができる。
【００５９】
【化４０】

【００６０】
細胞障害性又は細胞***停止性試薬がオリゴマー部分と結合するのに好適であるヒドロキシ官能基を有する場合、リンカー残基はアミノカルボン酸であってもよく、ブロック合成は同様に行うことができる。
【００６１】
必要な場合、標的分子の構築の際に反応させないユニットＣｙｔ’、Ｌ、ヒドロキシプロリン、Ａ、Ｂ及びＤのその他の官能基は、好適な保護基によって保護してもよい。好適な保護基は技術においてよく知られている（Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， ”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９１）。これらの保護基は合成の終わりに除去される。
例証として、有用なアミノ保護基としては、例えばホルミル、アセチルジクロロアセチル、プロピオニル、３，３−ジエチルヘキサノイル等 のＣ_１−Ｃ_１０−アルカノイル基、Ｃ_１−Ｃ_１０−アルコキシカルボニル及びｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、フルオレニルメトキシカルボニル等の Ｃ_６−Ｃ_１７−アラルキルオキシカルボニル基が挙げられる。最も好ましくはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）である。
好適なカルボキシ保護基としては、例えばメチル、ｔｅｒｔ−ブチル、デシル等のＣ_１−Ｃ_１０−アルキル基；ベンジル、４−メトキシベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フルオレニル等の Ｃ_６−Ｃ_１７−アラルキル；トリメチルシリル、ジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル、ジフェニル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル等のトリ− （Ｃ_１−Ｃ_１０−アルキル）シリル又は（Ｃ_１−Ｃ_１０−アルキル）−ジアリールシリル及び近縁の基が挙げられる。
【００６２】
そのようなエステル又はアミド形成を達成するために、アミン又はアルコールの求核攻撃のためのカルボン酸のカルボニル基、すなわちアミノ基によって置換されるのに適している活性基又は脱離基であるＸを活性化することが必要な場合がある。この活性化はカルボン酸の酸塩化物又は酸フッ化物への変換によって、又はカルボン酸の活性化エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル又はペンタフルオロフェニルエステルへの変換によって行われ得る。他の活性化方法は対称的又は非対称的な無水物への変換である。あるいは、アミド又はエステル結合の形成は、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）（Ｅ． Ｆｒｅｒｏｔら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９１， ４７， ２５９−７０）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（Ｋ． Ａｋａｊｉら， ＴＨＬ， ３５， １９９４， ３３１５−１８）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）（Ｒ． Ｋｎｏｒｒら， ＴＨＬ， ３０， １９８９， １９２７−３０）、１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）（Ｂ． Ｂｌａｎｋｅｎｍｅｙｅｒ−Ｍｅｎｇｅら， ＴＨＬ， ３１， １９９０， １７０１−０４）のようなインサイツのカップリング試薬の使用によって達成され得る。
【００６３】
ブロック合成に代わるものとして、一般式（Ｉ）の分子は、それぞれのモノマーＣｙｔ’、Ｌ、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びその間のＮ−Ｃ基によって形成される環状アミノ酸基、特にプロリン又はヒドロキシプロリン、Ａ、Ｂ及びＤの段階的な縮合反応によって右手側で開始する段階的方法で構築され得る。縮合反応のために、上記と同一のカップリング法が適用できる。ユニットＬ、プロリン／ヒドロキシプロリン、Ａ、Ｂ及びＤは少なくともアミノ−及び（少なくともユニットＡ、Ｂ、Ｄ、及びＲ^ａ、Ｒ^ｂ及びその間のＮ−Ｃ基によって形成される環状アミノ酸基、特にプロリン／ヒドロキシプロリン）カルボキシ基を含む二官能性分子であるため、アミノ基はカルボキシル官能基の活性化前に保護基（ＰＧ）によってブロックされる必要がある。アミノ基の保護のために、基ＢＯＣ又は好ましくは基ＦＭＯＣを利用できる。カップリング反応後、アミノ保護基は除去されなければならず、次のＦｍｏｃ−又はＢｏｃ−保護ユニットによるカップリングが行われ得る。必要な場合、標的分子の構築の際に反応してはならない、ユニットＣｙｔ’、Ｌ、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ及びその間のＮ−Ｃ基によって形成される環状アミノ基、特にヒドロキシプロリン、Ａ、Ｂ及びＤのその他の官能基は、好適な保護基によって保護してもよい。これらの保護基は合成の最後に除去される。
【００６４】
式（Ｉ）に関連して定義されるキャッピング基は、特に最後の（Ｎ末端）アミノカルボン酸ユニットが添加される場合、保護基としても役立つ場合がある。この後者の場合に、保護基は、標的分子の一部であるため、除去されない。あるいは、キャッピング基は、最後のアミノカルボン酸ユニットが結合され、脱保護された後、添加してもよい。
段階的な合成は以下のスキームに概説される。第二スキームはリンカー残基の例示であり、同様にＣｙｔ’残基はこのスキームに示されるようにその他の官能基を含んでもよい（上記参照）：
【００６５】
【化４１】

【００６６】
【化４２】

【００６７】
従って、本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、下記一般式（Ｖ）の化合物を化合物ＨＮ（Ｒ^４）−Ｃｙｔ’（式中、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、Ｒ^４は上記で定義した通りである）と反応させることを特徴とする。
【００６８】
【化４３】

【００６９】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは上記で定義した通りであり、Ｘ^１はＯＨ、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基を表す。）
好ましくは、式（Ｖ）中のＸ^１は脱離基であり、例えば−Ｃｌ、−Ｆ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ペンタフルオロフェニル、又はカルボキシレートである。あるいは、Ｘ^１はＯＨであってもよく、縮合はインサイツのカップリング試薬、例えばベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、又は１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）の使用によって達成される。
【００７０】
本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、下記一般式（ＶＩ）の化合物を化合物Ｈ_２Ｎ−Ｃｙｔ’又は化合物ＨＯ−Ｃｙｔ’（式中、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させることを特徴とする。
【００７１】
【化４４】

【００７２】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは請求の範囲第１項で定義した通りであり、Ｙ^１はＬ−ＣＯＸ^２を表し、Ｌはリンカー残基であり、Ｘ^２はＯＨ、又はアミノ基又はヒドロキシ基で置換されるのに適している脱離基を表す。）
好ましくは、式（ＶＩ）中のＸ^２は脱離基であり、例えば−Ｃｌ、−Ｆ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ペンタフルオロフェニル、又はカルボキシレートである。あるいは、Ｘ^２はＯＨであってもよく、縮合はインサイツのカップリング試薬、例えばベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、又は１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）の使用によって達成される。
【００７３】
本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、下記一般式（ＶＩＩ）の化合物を化合物Ｘ^３ＯＣ−Ｃｙｔ’（式中、Ｘ^３はＯＨ、又はアミノ基又はヒドロキシ基で置換されるのに適している脱離基であってもよく、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させることを特徴とする。
【００７４】
【化４５】

【００７５】
（式中、Ｒ^１、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは上記で定義した通りであり、Ｙ^２は式Ｌ−ＯＨ又はＬ−ＮＨ_２であり、Ｌはリンカー残基である。）
好ましくは、化合物Ｘ^３ＯＣ−Ｃｙｔ’のＸ^３は脱離基であり、例えば−Ｃｌ、−Ｆ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ペンタフルオロフェニル、又はカルボキシレートである。あるいは、ＸはＯＨであってもよく、縮合はインサイツのカップリング試薬、例えばベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、又は１−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）の使用によって達成される。
【００７６】
本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であり、化合物Ｈ_２Ｎ−Ｃｙｔ’が式（Ｉ）の化合物を形成するユニットで段階的に縮合されることを特徴とする。各カップリング工程前に、存在する場合、保護基ＰＧを除去することが必要な場合がある。
従って、本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、下記一般式（ＶＩＩＩ）の化合物を化合物ＨＮ（Ｒ^４）−Ｃｙｔ’（式中、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させ；
【００７７】
【化４６】

【００７８】
（式中、ＰＧ^１は保護基であり、その他の置換基は前述の通りの意味を有する）
次いで、保護基ＰＧ^１を除去し、引き続いて、結果として得られた下記式（ＶＩＩＩＡ）の化合物を化合物ＰＧ^２−Ａ−Ｘ^４（式中、ＰＧ^２は保護基であり、Ｘ^４はＯＨ、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基を表す）と反応させ；
【００７９】
【化４７】

【００８０】
さらに、必要な場合、完全な化合物が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする。
ＰＧ^１及びＰＧ^２は、例えばＢＯＣ、又は好ましくはＦＭＯＣであってもよい。
従って、本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、式ＰＧ^３−Ｎ（Ｒ^４）−Ｌ−ＣＯＸ^３（式中、ＰＧ^３は保護基であり、その他の置換基は前述の通りの意味を有する）の化合物を式Ｙ^４−Ｃｙｔ’（式中、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、Ｙ^４はＨ_２Ｎ又はＨＯを表す）の化合物と反応させ；
次いで保護基ＰＧ^３を除去し；結果として得られた化合物ＨＮ（Ｒ^４）−Ｌ−Ｙ^４−Ｃｙｔ’を下記式（ＶＩＩＩ）の化合物と反応させ；
【００８１】
【化４８】

【００８２】
次いで保護基ＰＧ^１を除去し、続いて、結果として得られた下記式の化合物を化合物ＰＧ^４−Ａ−Ｘ^４（式中、ＰＧ^４は保護基であり、Ｘ^４はＯＨ、又はアミノ基で置換されるのに適した脱離基であってもよい）と反応させ；
【００８３】
【化４９】

【００８４】
さらに、必要な場合、完全な化合物が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする。
本発明の別の局面は式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、式ＰＧ^５−Ｎ（Ｒ^４）−Ｌ−Ｙ^５（式中、ＰＧ^５は保護基を表し、Ｙ^５はＯＨ又はＮＨ_２を表し、置換基は前述の通りの意味を有する）の化合物を式Ｘ^５ＯＣ−Ｃｙｔ’（式中、Ｃｙｔ’は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、Ｘ^５はＯＨ又は好適な脱離基である）の化合物と反応させ；次いで、保護基ＰＧ^５を除去し；結果として得られた化合物ＨＮ（Ｒ^４）−Ｌ−Ｙ^５−ＣＯ−Ｃｙｔ’を下記式（ＶＩＩＩ）の化合物と反応させ；
【００８５】
【化５０】

【００８６】
次いで、保護基を除去し、続いて、結果として得られた下記化合物をＰＧ^２−Ａ−Ｘ^４（式中、ＰＧ^２は保護基であり、Ｘ^４はＯＨ、又はアミノ基で置換されるのに適した脱離基を表す）と反応させ；
【００８７】
【化５１】

【００８８】
さらに、必要な場合、完全な分子が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする。
本発明の他の局面は下記式（ＶＩＩＩＡ）の新規の中間体化合物である。
【００８９】
【化５２】

【００９０】
（式中、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^４及びＣｙｔ’は上記で定義された通りである）
本発明の化合物は医薬用途を目的とする。特に、これらの化合物は、ＦＡＰαを発現し、一般に入手可能な細胞障害剤及び／又は細胞***停止剤によって至適に治療されないストローマの繊維芽細胞に関連する腫瘍の治療に有用である。この性質を有する腫瘍は、例えば肺、***、及び大腸がん等の上皮がんである。また、ＦＡＰαを発現する骨組織及び軟部組織肉腫等の腫瘍はこれらの化合物により治療してもよい。
【００９１】
従って、本発明の他の局面は、本発明の化合物を含み、必要により１つ以上の好適な医薬的に許容される賦形剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ． １９ｔｈ ｅｄ． Ｅａｓｔｏｎ： Ｍａｃｋ Ｂｕｂｌ．， １９９５に例示される）を含んでもよい医薬組成物である。該医薬組成物は固体又は溶液として処方してもよい。固形製剤は注入前の溶液を調製するものであってもよい。好ましくは本発明の医薬組成物は注入のための溶液である。それらは、例えば静脈注射によって全身的に、又は例えば腫瘍部分への直接注射によって局所的に投与してもよい。投与量は患者の体重及び健康状態、根底にある病気の性質、適用する化合物の治療上の領域、溶解度等のような因子に従って、調整される。投与量を適切に調整することは、専門家の知識の範囲内である。例えば、ドキソルビシン接合体について、投与量は１０ｍｇ／ｍ^２から１３５０ｍｇ／ｍ^２までの範囲内が好ましいが、より多い又はより少ない投与量が適している場合もある。
【００９２】
従って、本発明の別の局面は、がんの治療のための医薬組成物の調製において、本発明の化合物の使用である。さらに、本発明の局面はがんの治療方法であって、患者に本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む。効能は、特異的に、以下のがんの治療を含む。
１）***、肺、結腸直腸、頭部及び頚部、膵臓、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、卵巣、精巣、食道、前立腺及び腎臓等を起源とする上皮がんの治療；
２）骨組織及び軟部組織肉腫：骨肉腫、軟骨肉腫、繊維肉腫、悪性繊維組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫；
３）造血悪性度（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）：ホジキン及び非ホジキンリンパ腫；
４）神経外胚葉性腫瘍：末梢神経腫瘍、星状細胞腫、黒色腫；
５）中皮腫。
また、慢性関節リウマチ、骨関節症、肝硬変、肺繊維症、動脈硬化、及び異常な創傷治癒等の慢性炎症状態の治療も含まれる。
【００９３】
本発明の別の局面はがんの治療方法であって、プロドラッグが患者に投与され、前記プロドラッグが酵素活性によって細胞障害薬又は細胞***停止薬に変換され、前記酵素活性は腫瘍組織に関連する細胞の発現産物である。好ましくは、前記酵素活性はＦＡＰαのタンパク質分解活性である。
該化合物の投与の方法の１つは静脈注入である。その他の可能な投与経路としては、腹腔内（ボーラス又は注入）、筋肉内又は腫瘍内注射が挙げられる。適切な場合には、直接適用が可能である（例えば肺繊維症）。
特定の試薬及び反応条件が以下の実施例において概説するが、本発明の範囲に包含される修正を行ってもよいことは、当業者によって理解されるであろう。従って、以下の実施例は本発明をさらに具体的に説明するために意図されるが、本発明を限定するものではない。
【００９４】
実施例
実施例１：ドキソルビシン接合体の合成手順
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン：Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（１１６．１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（４４ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を秤量し、窒素下で２口丸底フラスコに入れた。無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）を加え、フラスコを氷浴で０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（７８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に１ｍｌの溶液として加えた。溶液を０℃で４０分間撹拌した。 ドキソルビシン・ＨＣｌ（１００ｍｇ、ｍｍｏｌ）を小さな撹拌子と共にバイアルに秤量し、窒素下で配置した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３３．１μｌ、０．１９ｍｍｏｌ）を撹拌しながらバイアルに添加した。ドキソルビシン溶液を注射器でペプチド溶液に添加し、さらに２ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドでバイアルをすすいだ。氷浴を取り除いて、反応混合物を約４８時間室温で撹拌した。
反応溶液を酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出した。酢酸エチルを１０％のクエン酸水溶液（２５０ ｍｌ）、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２５０ｍｌ）及びブライン（２５０ ｍｌ）で連続して洗浄した。有機抽出物を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。ＤＭＦ混入物を多く含む生成物をＣ−１８逆相フラッシュカラムで、溶離剤として８：２のメタノール：水により色層分析した。長波長ＵＶ光照射により蛍光を発するｒｆが約０．３の１つのオレンジスポットを単離した。メタノールをロータリーエバポレータで除去し、溶媒の最後の極微量を高真空ポンプで一晩中除去した。
【００９５】
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（５グラム、１５ｍｍｏｌ）及びカルボニルジイミダゾール（２．４３グラム、１５ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌの３口丸底フラスコに、アルゴン雰囲気下で入れた。無水テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）を加え、溶液を室温で約４５分間撹拌した。明らかな気体（ＣＯ_２）の放出が観測された。
分離フラスコにＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ_３・ＨＣｌ（２．９グラム、１５ｍｍｏｌ）を秤量した。テトラヒドロフラン（５ｍｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．２３ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を数分間撹拌した。溶解した物質を注射器で活性化ペプチドに加え、残った物質を最少量のＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、注射器で活性化ペプチドに加えた。
反応溶液を一晩中（１５時間）室温で撹拌し、翌朝多量の白色の沈殿物を得た。反応混合物を１０％のクエン酸水溶液（３００ｍｌ）で洗浄し、酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出した。酢酸エチル抽出物を炭酸水素飽和水溶液（３００ｍｌ）で洗浄し、ブライン（３００ｍｌ）及び無水ＭｇＳＯ_４で乾燥した。酢酸エチルをロータリーエバポレータで除去して、５グラムの、良好な特性データを与える無色の油を得た。
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ_３の粗製油（５グラム、１２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコのメタノール（２０ｍｌ）中に溶解した。フラスコを周囲温度の水浴に入れた。１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（１２ｍｌ）を注意して加えた。溶液を３．５時間撹拌した後、１ＮのＨＣｌ溶液（１２ｍｌ）を加えた。溶液をロータリーエバポレータで濃縮し、ｐＨがｐＨ紙で約１．５になるまで、１ＮのＨＣｌを数滴添加した。水を真空ポンプで除去して、エタノールからゆっくり再結晶させた油を得た。
【００９６】
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン：Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（１８０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）に溶解した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５１．３ｍｇ、３８ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（７８ｍｇ、３８ｍｍｏｌ）をそれぞれ１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、溶液としてペプチドに添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。
ドキソルビシン・ＨＣｌ（１１６ｍｇ、２０ｍｍｏｌ）を分離バイアルに秤量し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４．８μｌ、２０ｍｍｏｌ）をドキソルビシンを含むバイアルに注入し、内容物を数分間撹拌して、完全な溶解を保証した。ドキソルビシン溶液を注射器で活性化ペプチドに加えた。溶液を４８時間室温で撹拌した。
生成物を酢酸エチル（２リットル）で抽出し、１０％のクエン酸水溶液（５００ｍｌ）で洗浄した。酢酸エチル層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、ロータリーエバポレータで油に濃縮した。その油をＣ−１８逆相シリカゲルで色層分析し、ｒｆ＝０．２５でオレンジの、長波長ＵＶ蛍光性スポットを得た。最終生成物は良好な特性データを示した。
【００９７】
実施例２：ＦＡＰα発現細胞株の調製
組換えＦＡＰαを発現する哺乳類の細胞株を調製した。広く知られ、受け入れ番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ ３１５でＤＳＭＺ（微生物及び細胞培養のドイツコレクション（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）， ラウンシュヴァイク， ドイツ）から入手可能なＨＴ１０８０繊維肉腫細胞を１０％のウシ胎児血清を含む５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ１２混合物に、９５％の空気及び５％のＣＯ_２の雰囲気下で維持した。製造説明書（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ：ギブコ／ＢＲＬ）に従って、リポフェクチン法を用いて、ＨＴ１０８０細胞をＦＡＰ．３８ベクター（ＷＯ ９７／３４９２７， Ｓｃａｎｌａｎら， 上記引用文献）でトランスフェクションした。トランスフェクタントを抗生物質耐性（２００ｕｇ／ｍｌのジェネテシン）で選択し、その後ジェネテシンを含む培地で維持した。耐性菌の個々の群体を採集し、増殖させて、１０ｃｍの組織培養べトリ皿でコンフルエントし、ＦＡＰα特異的モノクローナル抗体Ｆ１９を用いて免疫蛍光検定でＦＡＰαの発現を試験した（Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａら （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７ （１８）， ７２３５−７２３９）。親のＨＴ１０８０細胞株は、この免疫蛍光検定で検出可能なＦＡＰαの発現を示さないが、１つのクローン（以降、ＨＴ１０８０クローン３３として参照する）はＦＡＰαに陽性であった。
【００９８】
同様に、広く知られ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロックヴィル， ＭＤ）から入手可能なヒトの胎児の腎臓２９３細胞を１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に、９５％の空気及び５％のＣＯ_２の雰囲気で維持した。リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、細胞をＦＡＰα発現ベクター、ｐＦＡＰ．３８でトランスフェクションした（Ｐａｒｋ， Ｊ． Ｅ．， Ｃｈｅｎ， Ｈ． Ｈ．， Ｗｉｎｅｒ， Ｊ．， Ｈｏｕｃｋ， Ｋ． Ａ． ＆ Ｆｅｒｒａｒａ， Ｎ． （１９９４）． Ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ． Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ， ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ， ａ ｄ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｌｔ−１ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｏ Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（４１）， ２５６４６−２５６５４）。ＦＡＰα発現について上述したように、トランスフェクタントを選択及び解析した。親の２９３細胞株は検出可能なＦＡＰα発現を示さなかった。１つのクローン（以降、２９３−１／２として参照する）はＦＡＰα陽性を示した。
【００９９】
実施例３：トランスフェクションした細胞株におけるＦＡＰα発現の試験
ＦＡＰα発現をＨＴ１０８０及びＨＴ１０８０クローン３３細胞において試験した。代謝性標識、免疫沈降及び蛍光光度分析を基本的に行った（Ｐａｒｋら （１９９１） Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １７（２）， １３７−１５０）。ＨＴ１０８０及びＨＴ１０８０クローン３３細胞を^３５Ｓ−メチオニンで代謝性標識した。これらの細胞の洗浄剤抽出物をモノクローナル抗体Ｆ１９又はネガティブコントロールとしてマウスＩｇＧ１抗体により免疫沈降させた。沈殿物をサンプル緩衝剤中で煮沸し、ドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動によって分離した（Ｌａｅｍｍｌｉ （１９７０） Ｎａｔｕｒｅ ２２７（２５９）， ６８０−６８５によって記載される）。得られたゲルの蛍光光度分析は、ＨＴ１０８０クローン３３細胞がＦＡＰαタンパク質を産生することを証明した。ＦＡＰαタンパク質は親のＨＴ１０８０細胞の抽出物又はマウスＩｇＧ１による免疫沈降物では検出できなかった。
【０１００】
実施例４：可溶性組換えＦＡＰα
ＦＡＰαタンパク質の可溶性組換え形態を以下のように調製した。マウスのＣＤ８α（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ１２８２５）の細胞外領域（ＥＣＤ）をコードし、ＣＤ８αのＮ末端１８９アミノ酸からなるｃＤＮＡを、ＦＡＰαの細胞外領域（アミノ酸２７から７６０）をコードし、ＣＤ８α−ＣＤ４０リガンド融合タンパク質と構造的に似ている融合タンパク質構築物ＦＡＰｍＣＤ８を産生するｃＤＮＡに結合した（Ｌａｎｅら （１９９３） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７７（４）， １２０９−１２１３）。ｃＤＮＡを配列することにより検証し、ｐＶＬ１３９３ベクターに挿入した。Ｓｆ９細胞のトランスフェクション及び得られた組換えバキュロウイルスの増幅を行った（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ （１９９４） Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。４日間、組換えＦＡＰｍＣＤ８バキュロウイルスに感染したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞の培養液の上澄みを収集し、超遠心により清浄化した。活性化アガロースビーズ（ピアスケミカル， インディアナポリス， ＩＮ， ＵＳＡ）に固定した抗ＦＡＰαモノクローナル抗体を用いて、ＦＡＰｍＣＤ８融合タンパク質をこのような上澄みから精製した。培養液の上澄みを抗体親和性カラムに通し、０．１Ｍのクエン酸緩衝剤（ｐＨ ３）を用いてｐＨシフトにより溶出した。サンプルを、飽和トリス溶液（シグマケミカルズ， セントルイス， ＭＯ）で直ぐに中和し、タンパク質含有画分を貯蔵した。
【０１０１】
実施例５：ドキソルビシンペプチド接合体の切断の測定
サンプルを、ドキソルビシン−ペプチド接合体の切断を測定するために確立された逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイで分離した。ＨＰＬＣシステムは、１００マイクロリットル（μｌ）ループを備えるＷａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラー及び溶媒を搬送する２つのＷａｔｅｒｓ ｍｏｄｅｌ ５１０ポンプを含む。分離は、イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）条件下で、０．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で、５μｍの粒子サイズを有する長さ１００ｍｍ×内径４ｍｍのＮｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ−１８カラム（Ｄｒ． Ｉｎｇ． Ｈ． Ｋｎａｕｅｒ ＧｍｂＨ， ベルリン）で行った。移動相は、０．２Ｍの酢酸アンモニウムを含むメタノール：水（７０： ３０， ｖ／ｖ）から構成され、ｐＨ ３．２に調整した。Ｗａｔｅｒｓ ４７４蛍光検出器を用いて、遊離したドキソルビシン及びドキソルビシン−ペプチド接合体を蛍光（励起， ４７５ｎｍ； 発光， ５８５ｎｍ）により検出した。注射、溶媒放出、データ取得及びデータ分析はすべてＭｉｌｌｅｎｉｕｍ ２０１０クロマトグラフィーソフトウエアパッケージ（ウォーターズコーポレーション， ルフォード， ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。試験した物質は、最初にジメチルスルホキシドに５ｍＭの濃度で溶解し、続いてＨＰＬＣカラムにかける前に水溶液中に希釈した。
【０１０２】
可溶性組換えＦＡＰα酵素がドキソルビシン−ペプチド接合体から遊離したドキソルビシンを放出する能力を評価した。ドキソルビシン−ペプチド接合体保存液（５ｍＭ）をＨｅｐｅｓ−緩衝食塩水（ｐＨ ７．４）で５０から１００μＭの最終濃度に希釈した。２０μｌの得られた溶液を５０μｌの上述の精製したＦＡＰｍＣＤ８融合タンパク質（約２０ｎｇ）及び３０μｌのＨｅｐｅｓ−緩衝食塩水（ｐＨ ７．４）と混合した。混合物を３７℃で１日間インキュベートし、遊離したドキソルビシンの放出を、記載したＨＰＬＣアッセイで測定した。各ピークの面積を上述のソフトウエアパッケージを用いて数値化し、初期値を１００％と設定した。遊離したドキソルビシンの放出速度は、これらのＨＰＬＣ条件下で遊離したドキソルビシンと同じ滞留時間でのピークの出現によって測定した。各ピークの面積は、ドキソルビシン−ペプチド接合体に対する遊離したドキソルビシンの相対量を計算するために使用した。％切断を測定するためのピーク面積の組み込みは、上述のＭｉｌｌｅｎｉｕｍ ２０１０クロマトグラフィーソフトウエアパッケージを用いて行った。図１に示されるＺＧＰ−Ｄｏｘ（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン）のクロマトグラムで見られるように、ドキソルビシン−ペプチド接合体を、精製したＦＡＰｍＣＤ８融合タンパク質によるインキュベーション後、遊離したドキソルビシンに変換できるが、接合体の滞留時間は緩衝剤によるインキュベーションによって変化しない。
【０１０３】
実施例６：ＦＡＰα切断ペプチドとの接合によるドキソルビシンの細胞障害性の減少
ＦＡＰα切断ペプチドがＦＡＰα陰性、ドキソルビシン感受性細胞上でドキソルビシンの細胞障害作用をブロックする能力を測定した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ロックヴィル， ＭＤ， ＵＳＡ （ＡＴＣＣ番号： ＣＣＬ２４３）から入手したＫ５６２細胞を９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。種々の濃度の遊離したドキソルビシン又は同じモル濃度のドキソルビシン−ペプチド接合体を含む無血清細胞培地を細胞に加えた。４日後、細胞の数を自動ＣＡＳＹ（登録商標）細胞カウンター（Ｓｃｈａｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＧｍｂＨ， ロイトリンゲン， ドイツ）を用いて測定した。結果を図２に示す。
【０１０４】
実施例７：細胞結合ＦＡＰαによる遊離したドキソルビシンの放出
細胞結合ＦＡＰα酵素がドキソルビシン−ペプチド接合体から遊離したドキソルビシンを放出する能力を測定した。各接合体を無血清細胞培地に１μＭの最終濃度で溶解した。１０ｍｌのこの溶液を、１０ｃｍの組織培養皿中のＨＴ１０８０又はＨＴ１０８０クローン３３細胞のコンフルエント単層に、１９時間３７℃で加えた。培地を除去し、ドキソルビシンの放出を実施例５に記載した通りに測定した。ＦＡＰ発現細胞株、ＨＴ１０８０クローン３３は、８１％のＺＧＰ−Ｄｏｘ（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン）及び４３％のＺＰＡＧＰ−Ｄｏｘ（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ドキソルビシン）接合体を遊離したドキソルビシンに変換した。親のＨＴ１０８０細胞株は、９％のＺＧＰ−Ｄｏｘのみを同じ条件下で遊離したドキソルビシンに変換した。親のＨＴ１０８０細胞株によるＺＰＡＧＰ−Ｄｏｘの遊離したドキソルビシンへの変換は、これらの条件下でわずかに観測され、又は全く観測されなかった。
【０１０５】
実施例８：ＦＡＰα放出ドキソルビシンによる感受性細胞の死滅
ＦＡＰαがドキソルビシン感受性細胞を死滅させ得る遊離したドキソルビシンを産生する能力を測定した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， ロックヴィル， ＭＤ， ＵＳＡ（ＡＴＣＣ番号： ＣＣＬ−２４３）から入手したＫ５６２細胞を９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。１μＭのドキソルビシン−ペプチド接合体を含む無血清細胞培地をＨＴ１０８０又はＨＴ１０８０クローン３３細胞の皿に１９時間３７℃で加えた。培地を除去し、ドキソルビシンの放出を実施例５と同様に確かめた。次いで、６６μｌのこの培地を１ウエル当たりＫ５６２細胞に加えた。４日後、細胞の数を自動ＣＡＳＹ（登録商標）細胞カウンターを用いて測定した。結果を図３に示す。
【０１０６】
実施例９：ドキソルビシン−ペプチド接合体の血漿安定性
ドキソルビシン−ペプチド接合体の血漿安定性を、実施例５に記載の方法を用いて測定した。ドキソルビシン−ペプチド接合体を含むサンプル（１μＭの濃度で）を１０％（ｖ／ｖ）のマウス又はヒトの血漿の存在下で、示される時間３７℃でインキュベートした。マウス及びヒトの血漿におけるＺＧＰ−Ｄｏｘ及びＺＰＡＧＰ−Ｄｏｘの結果を図４に示す。
【０１０７】
実施例１０：選択された４−メトキシ−β−ナフチルアミド−ペプチド接合体のＦＡＰα触媒切断
好ましいＦＡＰαペプチド物質を同定するために、未変性及び／又は変成したアミノカルボン酸のオリゴマー化合物を合成し、技術において公知の方法を用いてプロリン−４−メトキシ−β−ナフチルアミン（Ｐｒｏ−ＭＮＡ）と結合させた（Ｅ． Ｗｕｎｓｃｈ， Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ （Ｅｄｓ． Ｅ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ｏ． Ｂａｙｅｒ）， Ｖｏｌ．ＸＶ， Ｐａｒｔ １ ａｎｄ ２， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， １９７４）。
【０１０８】
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−４−メトキシ−β−ナフチルアミドの合成：
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（３２ｍｇ， ０．１５ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（５３ｍｇ， ０．１５ｍｍｏｌ）及びＰｒｏ−４−メトキシ−β−ナフチルアミドヒドロクロリド（４６ｍｇ， ０．１５ｍｍｏｌ）を１：１の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド／テトラヒドロフラン（４ｍｌ）に溶解した。Ｎ−メチルピロリドン（１．７モル）に溶解したＮ−エチルジイソプロピルアミン（０．２６ｍｌ， ０．４４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩中撹拌した。
溶媒をロータリーエバポレータで除去し、残留物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に溶解し、水で３回抽出した。有機層を無水Ｎａ_２Ｓ０_４で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータで除去した。残留物をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１：４， ２５ｍｌ）に溶解し、１時間反応させた。溶媒をロータリーエバポレータで除去し、得られた油を窒素流で乾燥した。粗生成物を、アセトニトリル／水勾配を施した調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。生成物は良好な分析データを示した（ＮＭＲ及び質量スペクトル）。
次いで、ペプチドから遊離したＭＮＡの放出を、３５５ｎｍ励起／４０５ｎｍ発光フィルターセットを用いて、細胞蛍光蛍光計（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ： Ｐｅｒ Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）で測定した。酵素動力学的パラメータ（ミカエリス−メンテンＫ_ｍ及びｋ_ｃａｔ値）を、実施例２の２９３−Ｉ／２トランスフェクションした細胞の膜抽出物から誘導した ＦＡＰα酵素による技術において公知の方法（例えば、Ｙｕｎ， Ｓ． Ｌ． ＆ Ｓｕｅｌｔｅｒ， Ｃ． Ｈ． （１９７７）． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｋｍ ａｎｄ Ｖ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｃｕｒｖｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ４８０（１）， １−１３．）を用いて計算した。
【０１０９】
【表１】
表１：選択した４−メトキシ−ｐ−ナフチルアミド（ＭＮＡ）−ペプチド接合体のＦＡＰα触媒切断についての Ｋ_ｍ及びｋ_ｃａｔ値

Ｃｈｇ＝シクロヘキシルグリシン、Ｈｙｎ＝６−ヒドロキシノルロイシン、トランス−Ｈｙｐ＝トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｍｅｔ（Ｏ）＝メチオニン−Ｓ−オキシド
【０１１０】
実施例１１：ＦＡＰα対ＤＰＰ−ＩＶのＭＮＡ結合ペプチドの特異性
公知のプロリル特異的セリンオリゴペプチダーゼ科のメンバーの中で、ＦＡＰαと最も近い関係にある酵素はＤＰＰ−ＩＶである。活性ＤＰＰ−ＩＶは血漿中に、及び多くの異なる細胞タイプで見出されるため、ＤＰＰ−ＩＶと比較したＦＡＰαのプロドラッグｐｅｐｔｉｄｉｃｓの相対的な（任意の）選択性の最適化は腫瘍以外の部分（例えば血漿中）でプロドラッグの望まない変換を減少させる必要がある。ＦＡＰαに対して特異的なペプチドを同定するために、ＦＡＰαによるＭＮＡ結合ペプチドの切断を、ＤＰＰ−ＩＶが同じペプチド接合体を切断する能力と比較した。遊離したＭＮＡの放出を実施例９に記載されるように測定した。結果を表２に示す。
【０１１１】
【表２】
表２：ＦＡＰα及びＤＰＰ−ＩＶによるＭＮＡペプチド接合体の切断選択性の比較

＋ 酵素が基質を切断できることを示す。
− 切断がないことを示す。
【０１１２】
実施例１２：腫瘍サンプルにおけるＦＡＰα活性
ＦＡＰαの酵素活性をヒトの腫瘍サンプルにおいて測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）プレート（Ｃｏｓｔａｒ， コーニング， ＮＹ）を一晩４℃で、１μｇ／ｍｌのＦ１９抗体又はコントロール抗体を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ ７．４）でコートした。次いで、ウエルを洗浄緩衝剤（ＰＢＳ， ０．１％のＴｗｅｅｎ ２０， ｐＨ ７．４）ですすぎ、過剰の結合部位をブロッキング緩衝剤（５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ， ｐＨ ７．４）で、１時間室温でブロッキングした。ＦＡＰα活性を腫瘍組織（黒塗りシンボル）又は対応する正常コントロール細胞（対応する白抜きシンボル）中でコンカナバリンＡ濃縮膜抽出物から測定した（図５ａ）。腫瘍サンプルは、乳がん（★、×）、大腸がん（●）、肝臓へ転移した大腸がん（◆）、及び肺がん（▲、〔 ）を含んでいる。抽出物をＦ１９コートプレートに加え、１時間室温でインキュベートした。非結合性物質を除去し、ウエルを洗浄緩衝剤で３回洗浄し、ＦＡＰα酵素活性を１００μｌのＡｌａ−Ｐｒｏ−ＡＦＣを用いて１時間３７℃でアッセイした（ＷＯ ９７／３４９２７）。各抽出物の最初の２つのコンカナバリンＡ画分を測定し、各値を個々にプロットした。バックグラウンド蛍光（コントロール抗体コートプレートを用いて測定される）を各値から求めた。
【０１１３】
ＦＡＰα酵素活性の独立した生化学的追認及び腫瘍抽出物中のその見かけの分子量を、上述の組織抽出物を^１４Ｃ−標識ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ；ＮＥＮ−デュポン， ケルン， ドイツ）で標識することによって得た。ＤＦＰは、多くのセリンプロテアーゼの活性部位セリンと共有結合的、かつ不可逆的に結合し、その結果別の触媒作用を妨げることが知られている（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｒ．， Ｂａｉ， Ｙ． ＆ Ｈａｔａ， Ｔ． （１９７５）． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｙ ａｓ ａ ｍｅｔａｌ−ｆｒｅｅ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｖｉｎｇ ａ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７７（６）， １３１３−１３１８； Ｗａｈｌｂｙ， Ｓ． ＆ Ｅｎｇｓｔｒｏｍ， Ｌ． （１９６８）． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ． ＩＩ． Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｅｒｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｏｆ ＤＦＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５１（２）， ４０２−４０８）。図５ａの大腸サンプル●に対応する腫瘍（Ｔ）から免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｅｄ）したＦＡＰαの^１４Ｃ−ＤＦＰ標識を図５ｂに示す。標識した９５ｋＤタンパク質の存在を明らかにしたこれらのサンプルの硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． （１９７０）． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ ２２７（２５９）， ６８０−６８５）及び続くオートラジオグラフィー（Ｐａｒｋ， Ｊ． Ｅ．， Ｄｒａｐｅｒ， Ｒ． Ｋ． ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｗ． Ｊ． （１９９１）． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｄ３ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． １７（２）， １３７−１５０）は、大腸がんサンプル中に示す。放射標識バンドは正常な対応するコントロール免疫沈降物（Ｎ）又はコントロール抗体では得られなかった。免疫精製した、図５ｂに示した^１４Ｃ−標識タンパク質の見かけの分子量はＦＡＰαの前のレポートと一致する （Ｒｅｔｔｉｇ， Ｗ． Ｊ．， Ｓｕ， Ｓ． Ｌ．， Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ， Ｓ． Ｒ．， Ｓｃａｎｌａｎ， Ｍ． Ｊ．， Ｍｏｈａｎ Ｒａｊ， Ｂ． Ｋ．， Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ， Ｐ．， Ｈｅａｌｅｙ， Ｊ． Ｈ． ＆ Ｏｌｄ， Ｌ． Ｊ． （１９９４）． Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５８（３）， ３８５−３９２； ＷＯ ９７／３４９２７）。
【０１１４】
実施例１３：保護したオリゴペプチドの調製
保護したオリゴペプチドを従来技術（ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ）の手順（例えば、Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＡ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ， ”Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”， ２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎｏｗ Ｙｏｒｋ， １９９４）に従って溶液で、又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ自動ペプチド合成機での固相合成によって調製した。樹脂支持体からオリゴペプチドの脱保護及び除去は、トリフルオロ酢酸及び頻繁に使用される捕捉剤添加剤の混合物での処置によって達成される。精製は、水溶性０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配を用いて逆相Ｃ１８シリカカラムで調製用高圧液体クロマトグラフィーで行った。ペプチドの同一性及び均一性は高圧液体クロマトグラフィー及び質量スペクトル分析により確認した。この方法によって調製したオリゴペプチドを表３に示す。
【０１１５】
【表３】
表３：オリゴペプチド

Ｚはベンジルオキシカルボニルである。
Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＣｈｇはＬ−シクロヘキシルグリシル
ＮｌｅはＬ−ノルロイシニル
ＨｙｎはＬ−６−ヒドロキシノルロイシニル
【０１１６】
実施例１４：Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄｏｘの調製
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ（４４ｍｇ， ０．０７８ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより７．５に調整した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， ７８μｌ， ０．０７８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷浴中で冷却した。撹拌した状態で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， ８７μｌ， ０．０８７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を０℃で１時間撹拌した。
ドキソルビシン＊ＨＣｌ（２５ｍｇ， ０．０４３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．２μｌ， ０．０４８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を活性化したペプチドに注入した。反応は、室温まで暖めて、４８時間撹拌した。
次いで、溶媒を除去し、生成物を、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルの勾配を用いてＣ１８で、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
分析ＨＰＬＣ ＞ ９０％；ＥＳ−ＭＳ １１１０．５（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）；６７４．４
【０１１７】
実施例１５：Ｈ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄｏｘの調製
Ｆｍｏｃ−ＰＡＧＰ−Ｄｏｘ（実施例１４で調製， ４４ｍｇ， ０．０４０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／ジメチルアミン（２：１， ２０ｍｌ）に０℃で溶解し、２時間撹拌した。溶媒を除去して、生成物を、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルの勾配を用いてＣ１８で、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
分析ＨＰＬＣ ＞ ９０ ％；ＥＳ−ＭＳ ８６６．６ ［Ｍ＋Ｈ］^＋， ４５２．４
【０１１８】
実施例１６：Ｈ−Ｃｈｇ−Ｐｒｏ−Ｄｏｘの調製
Ｆｍｏｃ−Ｃｈｇ−Ｐｒｏ−ＯＨ（４６ｍｇ， ０．０９６ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより７．５に調整した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， ９６μｌ， ０．０９６ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を氷浴中で冷却した。撹拌した状態で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， １０７μｌ， ０．１０７ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を０℃で１時間撹拌した。
ドキソルビシン＊ＨＣｌ（３１ｍｇ， ０．０５３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１０μｌ， ０．０５９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を活性化したペプチドに注入した。反応は、室温まで暖めて、４８時間撹拌した。
次いで、溶媒を除去し、生成物を０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルの勾配を用いて、Ｃ１８で調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
凍結乾燥した生成物をＴＨＦ／ジエチルアミン（２：１， ２０ｍｌ）に０℃で溶解し、２時間撹拌した。溶媒を除去して、生成物を０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルの勾配を用いて、Ｃ１８で調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
分析ＨＰＬＣ ＞ ９０％；ＥＳ−ＭＳ ７８０．２（［Ｍ＋Ｈ］^＋）；３６６．４
以下の表は、類似した、調製したペプチド−ドキソルビシン接合体を示し、ＦＡＰによる切断データ（２０時間後）を含む。
【０１１９】
【化５３】

【０１２０】
【表４】
表４

Ｚはベンジルオキシカルボニルであり、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＣｈｇはＬ−シクロヘキシルグリシルであり、ＭｌｅはＬ−ノルロイシニルであり、ＨｙｎはＬ−６−ヒドロキシノルロイシニルである。
【０１２１】
実施例１７：Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−メルファランの調製
【０１２２】
【化５４】

【０１２３】
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ（２２ｍｇ， ０．０７２ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍｌ）に溶解し、ｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより７．５に調整した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， ７２μｌ， ０．０７２ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を氷浴中で冷却した。撹拌した状態で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＭＦ中に１Ｍ， ６７μｌ， ０．６７ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を０℃で２時間撹拌した。
メルファラン（１４．７ｍｇ， ０．０４８ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３μｌ， ０．０７２ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を活性化したペプチドに注入した。反応は、室温まで暖めて、２４時間撹拌した。
次いで、溶媒を除去し、生成物を０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水／アセトニトリルの勾配を用いて、Ｃ１８で調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
分析データ：ＨＰＬＣ ＞ ９０％， ＥＳ−ＭＳ ５９３．０（［Ｍ＋Ｈ］^＋）
【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＡＰαによるドキソルビシン−ペプチド接合体の切断を示す。精製したＰＡＰｍＣＤ８融合タンパク質（Ａ）、又は緩衝剤（Ｂ）によりインキュベートした後のＺＧＰ−Ｄｏｘ（Ｚ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ドキソルビシン）のクロマトグラムである。実施例５を参照。
【図２】ドキソルビシンのＦＡＰα切断性ペプチドへの接合によるドキソルビシン細胞障害性の低減を示す。実施例６を参照。
【図３】ＦＡＰα発現ＨＴ１０８０クローン３３細胞対親のＨＴ１０８０細胞によるＦＡＰα切断性ドキソルビシン−ペプチド接合体から放出されるドキソルビシンの細胞障害性の証明を示す。実施例８を参照。
【図４】マウス及びヒトの血漿中のＮ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ドキソルビシン及びＮ−Ｃｂｚ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｌａ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ドキソルビシンの血漿安定性を示す。実施例９を参照。
【図５】ヒトの腫瘍組織サンプルにおけるＦＡＰα酵素活性の証明及びその見かけの分子量の確認を示す。実施例１２を参照。

Claims (19)

1. 下記式（Ｉ）の化合物又は医薬的に許容されるその塩。
   

   

   （式中、
   R¹は式Cg-A、Cg-B-A又はCg-(D)_m-B-Aの残基を表し、
   CgはR⁵-CO、R⁵-O-CO-、R⁵-NH-CO-、R⁵-SO₂-又はR⁵-からなる群から選択されるキャッピング基を表し、ここでR⁵は必要により置換されていてもよいC₁-C₆-アルキル、C₃-C₈-シクロアルキル、アリール、アラルキル又はヘテロアリール基であり；
   AはL-プロリン、グリシン、L-ノルロイシン、L-シクロヘキシルグリシン、L-5-ヒドロキシノルロイシン、L-6-ヒドロキシノルロイシン、L-5-ヒドロキシリジン、L-アルギニン、又はL-リジンから誘導され；及び
   B及びDは、それぞれ独立して、式-[NR⁶-(X)_p-CO]-のアミノカルボン酸から誘導される部分を表し、ここでXはCR⁷R⁸を表し、R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれ独立して、水素原子、必要により置換されていてもよいC₁-C₆-アルキル、C₃-C₈-シクロアルキル、アリール又はヘテロアリール基を表し、pは1、2、3、4、5であり；又は
   B及びDは、それぞれ独立して、下記式の環状アミノカルボン酸から誘導される部分を表し、
   

   

   ここで、R⁹はC₁-C₆-アルキル、OH又はNH₂を表し、
   mは1から10までの整数であり；
   qは0、1又は2であり；
   rは0、1又は２であり；
   R^a及びR^bは間にあるN-C基と一緒になって3- から 7- 員飽和又は不飽和複素環を形成し、前記複素環は必要により置換されていてもよく、また必要によりベンゾ-又はシクロヘキサノ-縮合されていてもよく、その化合物中の1個又は2個のCH₂基はNH、O又はSによって置換されていてもよく、
   R⁴はH、C₁-C₆-アルキル、C₃-C₈-シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールを表し；及び
   Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基を表す）
2. R^a、R^b及びその間にあるN-Cによって形成される複素環がR²及びR³によって置換される請求の範囲第１項に記載の式（Ｉ）の化合物。
   （ここで、R²及びR³は、それぞれ独立して、水素又はハロゲン原子又はC₁-C₆-アルキル、C₁-C₆-アルキルアミノ、ジ-C₁-C₆-アルキルアミノ、C₁-C₆-アルコキシ、チオール、C₁-C₆-アルキルチオ、オキソ、イミノ、ホルミル、C₁-C₆-アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、C₃-C₈-シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール基を表す）
3. 下記式IAの化合物。
   

   

   （式中、R¹、R²、R³、R⁴、Cyt'は請求の範囲第１項又は第２項で定義される通りであり、
   X-YはCHR²-CH₂、CR²=CH、NH-CH₂、CH₂-NH、-CR²-、CH₂-CHR²-CH₂を表す）
4. 下記式IA1の選択された化合物。
   

   

   （式中、R¹及びCyt'は請求の範囲第１項から第３項のいずれか1項で定義される通りである）
5. 下記式IA2、IA3、IA4及びIA5から選択される化合物。
   

   

   （式中、R¹及びCyt'は請求の範囲第１項から第４項のいずれか1項で定義される通りである）
6. R¹が下記式（２１）、（２２）及び（３４）から選択される基である請求の範囲第１項から第５項のいずれか1項に記載の化合物。
   Cg-Gly （２１）
   Cg-Nle （２２）
   Cg-(Xaa)m-Xaa-Gly （３４）
   （式中、Cgは水素原子又はベンゾイルオキシカルボニル、フェニルアセチル、フェニルメチルスルホニル及びベンジルアミノカルボニルから選択されるキャッピング基を表し；
   Xaaはアミノカルボン酸から誘導される部分を表し；及び
   mは1から6までの整数である）
7. アミノアルカン酸部分が(L)-立体配置中に存在する請求の範囲第６項に記載の化合物。
8. H₂N-Cyt'がアントラサイクリン誘導体である請求の範囲第１項から第７項のいずれか1項に記載の化合物。
9. 下記式（IIIA）、（IIIB）、（IIIE）及び（IIIF）から選択される請求の範囲第８項に記載の化合物。
   

   

   

   

   
10. 医薬用途のための請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物。
11. 請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物を含み、必要により1つ以上の医薬的に許容される賦形剤を含んでもよい、医薬組成物。
12. がんの治療のための医薬組成物の調製における請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の使用。
13. 下記一般式（Ｖ）の化合物を化合物HN(R⁴)-Cyt'（式中、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、R⁴は請求の範囲第１項に定義される通りである）と反応させることを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
    

    

    （式中、R¹、R^a及びR^bは請求の範囲第１項に定義される通りであり、X¹はOH、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基を表す）
14. 下記一般式（VI）の化合物を化合物H₂N-Cyt'又は化合物HO-Cyt'（式中、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させることを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
    

    

    （式中、R¹、R^a及びR^bは請求の範囲第１項に定義される通りであり、Y¹はL-COX²を表し、Lはリンカー残基であり、X²はOH、又はアミノ基又はヒドロキシ基で置換されるのに適している脱離基を表す）
15. 下記一般式（VII）の化合物を化合物X³OC-Cyt'（式中、X³はOH、又はアミノ基又はヒドロキシ基で置換されるのに適している脱離基であってもよく、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させることを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
    

    

    （式中、R¹、R^a及びR^bは請求の範囲第１項に定義される通りであり、Y²は式L-OH又はL-NH₂であり、Lはリンカー残基である）
16. 下記一般式（VIII）の化合物を化合物HN(R⁴)-Cyt'（式中、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基である）と反応させ；
    

    

    （式中、PG¹は保護基であり、その他の置換基は前述の通りの意味を有する）
    次いで、保護基PG¹を除去し、引き続いて、得られた下記式（VIIIA）の化合物を化合物PG²-A-X⁴（式中、PG²は保護基であり、X⁴はOH、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基を表す）と反応させ；
    

    

    さらに、必要な場合、完全な化合物が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
17. 式PG³-N(R⁴)-L-COX³（式中、PG³は保護基であり、その他の置換基は前述の通りの意味を有する）の化合物を式Y⁴-Cyt'（式中、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、Y⁴はH₂N又はHOを表す）の化合物と反応させ；
    次いで保護基PG³を除去し；得られた化合物HN(R⁴)-L-Y⁴-Cyt'を下記式（VIII）の化合物と反応させ；
    

    

    次いで保護基PG¹を除去し、続いて、得られた下記式の化合物を化合物PG⁴-A-X⁴（式中、PG⁴は保護基であり、X⁴はOH、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基であってもよい）と反応させ；
    

    

    さらに、必要な場合、完全な化合物が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする、請求の範囲第１項から第９項のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
18. 式PG⁵-N(R⁴)-L-Y⁵（式中、PG⁵は保護基を表し、Y⁵はOH又はNH₂を表し、置換基は前述の通りの意味を有する）の化合物を式X⁵OC-Cyt'（式中、Cyt'は細胞障害性又は細胞***停止性化合物の残基であり、X⁵はOH又は好適な脱離基である）の化合物と反応させ；
    次いで、保護基PG⁵を除去し；得られた化合物HN(R⁴)-L-Y⁵-CO-Cyt'を下記式（VIII）の化合物と反応させ；
    

    

    次いで、保護基を除去し、続いて、得られた下記化合物を化合物PG²-A-X⁴（式中、PG²は保護基であり、X⁴はOH、又はアミノ基で置換されるのに適している脱離基を表す）と反応させ；
    

    

    さらに、必要な場合、完全な分子が得られるまで、カップリング工程を行うことを特徴とする、式（Ｉ）の化合物の製造方法。
19. 下記式（VIIIA）の化合物。
    

    

    （式中、R^a、R^b、R⁴及びCyt'は請求の範囲第１項に定義される通りである）

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