JP3603886B2 - Separation device and method of manufacturing the same - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料を分離する装置および方法に関し、さらに詳細には、微小スケールで様々なサイズの核酸断片をはじめとする物質、例えば細胞、核酸断片、あるいは、アミノ酸・ペプチド・タンパク質などの有機分子、金属イオン、コロイド、ラテックスビーズなどを分離する際などに用いて好適な分離装置および分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や核酸・タンパク質など生体物質の分析では、試料をあらかじめ分離精製したり、試料をサイズや電荷に応じて分離する操作が行われる。たとえば塩基配列決定法として広く利用されているマクサム・ギルバート法においては、ＤＮＡの一端を３２Ｐで標識し、これをさまざまな長さの断片が得られるように化学的に分解した後、これらを電気泳動にかけて分離し、その後オートラジオグラフィを行って塩基配列を読み取るというプロセスが行われる。こうした分離操作は、分析時間の長短を決定する重要な因子となっており、分離に要する時間を短縮することは、この分野における重要な技術的課題となっている。この目的のため、充分に高い分離能を有し、この結果、短時間でも所望の物質を正確に分離できる分離装置の開発が望まれている。
【０００３】
従来、分離装置として、超遠心分離装置やキャピラリ電気泳動装置が広く用いられてきた。しかしながら、超遠心分離装置やキャピラリ電気泳動は、分離に長時間を要する上、試料が大量に必要となる。また、分解能についても、必ずしも満足できる水準にはない。
【０００４】
一方、目的物質を分離する装置として、米国特許５，８３７，１１５号には、多数の障害物をアレイ状に配置した分離装置が開示されている。分離対象としては、細胞やウイルス、巨大分子、微小粒子等が例示されている。しかしながらこの技術は、以下の点でなお改善の余地を有していた。
【０００５】
第一に、巨大分子や粒子が原因となって目詰まりが生じる場合があり、スループットの向上に限界があった。第二に、多数の障害物を狭い間隔で精密に作製することが困難なため、障害物の間隔を充分に小さくすることは困難であった。特に、２００ｎｍ以下の間隔で多数の障害物を精密に作製することは、当時の技術水準ではきわめて困難であった。したがって、その適用範囲も一定のものに限られていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、様々なサイズの物質を含む試料を短時間かつ優れた分解能で分別でき、同時に目詰まり等の問題も少ない分離技術を提供することを目的とする。また、核酸やタンパク質等の小さいサイズの物質を、少量の試料で短時間に優れた分解能で分別できる技術を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、試料の通る流路と、当該流路中に設けられた試料分離領域とを備える分離装置であって、上記試料分離領域は、複数の柱状体が配設された柱状体配設部を含み、前記柱状体の表面が親水性膜で覆われたことを特徴とする分離装置が提供される。
【０００８】
また本発明によれば、基板上に形成された溝部からなる試料の通る流路と、上記流路に試料を導く試料導入部と、上記流路中に設けられた、試料を複数の成分に分離する試料分離領域と、上記試料分離領域で分離された試料を分析または分取する試料回収部と、を備え、上記試料分離領域は、上記流路内壁に複数の柱状体が形成されてなる柱状体配設部を含み、前記柱状体の表面が親水性膜で覆われたことを特徴とする分離装置が提供される。
【０００９】
この分離装置は、複数の柱状体が形成された柱状体配設部を試料分離領域とする。隣接する柱状体間の間隙が篩としての役割を果たす。本発明においてはこのような方式により試料分離が行われるので、たとえば核酸やタンパク質等、従来では分離困難であったさまざまな微小サイズの物質を分離、分別することができる。なお本発明において、複数の柱状体とは、分離機能を担保しうる程度の数の柱状体のことをいう。
【００１０】
また、本発明の分離装置は、上記柱状体の表面が親水性膜で覆われた構成となっている。親水性膜としては、たとえば上記柱状体を構成する材料の酸化膜とすることができる。具体的には、基板材料としてシリコンを用い、柱状体の表面に親水性膜としてシリコン酸化膜を設けた構成とすることができる。試料の分離に際しては装置内に緩衝液（水溶液）等を導入することが必要となるが、上記のような構成とすることによって、緩衝液等を装置内部に円滑に導入することができる。柱状体の間隔が２００ｎｍ以下、さらには１００ｎｍ以下となると、試料の分離に際して使用する緩衝液等を装置内に導入することが困難になるが、親水性膜の形成により、かかる困難が解消される。また、緩衝液等を導入して実際に装置を使用する際にも、空隙の形成を抑制し、試料の流動を円滑にする等の効果が得られる。
【００１１】
本発明の分離装置において、上記柱状体の断面形状が、頂部よりも底部において幅広となっている構成を採用することができる。こうすることによって、高いアスペクト比の柱状体を制御性良く形成でき、また、各柱状体のアスペクト比のばらつきを有効に低減することができる。たとえば、柱状体を熱処理してその表面に酸化膜を形成する場合、直方体状の柱状体であると、隣接柱状体間の凹部の底面において柱状体が進行し柱状体側壁に所望の膜厚の酸化膜を形成しようとすると、凹部底面の酸化膜が厚くなりすぎてしまい、柱状体の高さが実質的に減少し、酸化前よりもアスペクト比が低くなる。これに対し、上記のような構成を採用すれば、柱状体底部近傍の酸化の進行を抑制することができ、これにより、ばらつきの少ない高いアスペクト比の柱状体を形成することができる。
【００１２】
本発明の分離装置において、上記複数の柱状体は、隣接する柱状体の側面が、当該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成された構成を採用することができる。こうすることによって、隣接柱状体間の凹部底面における酸化膜の肥大化が抑制され、ばらつきの少ない高いアスペクト比の柱状体を形成することができる。隣接柱状体間の距離が大きいと、隣接する柱状体間に平坦な基板面が露出した状態となり、この部分で酸化膜の膜厚の増加が進行し、柱状体のアスペクト比低下をもたらす結果となる。これに対して上記構成を採用した場合、隣接柱状体間の凹部底面はもはや平面でなくなり、通常、曲面となる。たとえば図１７では、柱状体が円錐状であり、各柱状体が近接して配置しており、これらの間の凹部は先端が曲面となる。このような曲面上に酸化が進行する場合、酸化による体積膨脹が曲面形状によって抑制され、この部分に圧縮応力が発生することが考えられる。このような圧縮応力が発生すると、体積膨脹をともなう酸化の進行が抑えられ、結果として凹部底面では薄膜ないし柱状体側面と同等の膜厚となった段階で酸化が停止する。この結果、ばらつきの少ない高いアスペクト比の柱状体を形成することができる。
【００１３】
本発明の分離装置は、高いアスペクト比の柱状体が複数密集して配設されることによって高い分離性能を発現するものである。それぞれの柱状体が均一な形状・寸法で形成可能であることは、最適設計と製造を容易にする。かかる観点から、柱状体を末広がりな形状にし、また、隣接する柱状体の側面が、当該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成することは、分離装置の性能向上に大きく寄与する。
【００１４】
このような狭い間隔で柱状体を形成することは、従来技術ではなしえなかったが、本発明者は、このような構造の分離装置を、後述するように微細加工用レジストのカリックスアレーンを用いた電子線リソグラフィ技術を利用して柱状体を形成することにより、作製できることを見いだした。カリックスアレーンの分子構造の一例を以下に示す。カリックスアレーンは電子線露光用のレジストとして用いられ、ナノ加工用のレジストとして好適に利用することができる。
【００１５】
【化１】

【００１６】
本発明の分離装置において、上記試料分離領域が上記柱状体配設部を複数含み、隣接する柱状体配設部間に上記試料が通過するパスが設けられた構成を採用することができる。
【００１７】
かかる構成の装置は、前述した米国特許５，８３７，１１５号等に開示されている従来の技術とは異なる原理で試料を分離する。米国特許５，８３７，１１５号に代表される技術では、分子サイズの大きい物質ほど、障害物によって通過を阻害される程度が大きくなる。したがって、大きいサイズの物質は、小さいサイズの物質よりも後から排出される形で分離がなされる。これに対して本発明の装置は、被分離対象となる物質の大きさが小さいほど、試料分離領域中で柱状体にトラップされ、長い経路を通ることになる。すなわち、小さいサイズの物質は、大きいサイズの物質よりも後から排出される形で分離がなされる。サイズの大きい物質は比較的スムーズに分離領域を通過する方式となるので、目詰まりの問題が低減され、スループットが顕著に改善される。特に核酸やタンパク質等の分離においては、分子の慣性半径もきわめて広い範囲に及ぶため、巨大サイズの物質が目詰まりしやすく、また、いったんこうした物質が目詰まりすると洗浄しても脱離させることが困難となる。本発明によれば、このような問題が解決されるため、核酸やタンパク質等の分離に好適に適用できる。
【００１８】
この発明において、パスの幅は、柱状体配設部中の柱状体間の平均間隔よりも大きい構成とすることができる。このようにすれば、大きいサイズの物質は試料分離領域中のパスの部分を円滑に通過するとともに、小さいサイズの物質は柱状体配設部を通り、そのサイズに応じて長い経路を経た末に試料分離領域を通過する。
【００１９】
ここで、柱状体配設部中の柱状体間の間隔は、柱状体配設部ごとに任意の値に設定することができる。したがってこの発明においては、柱状体配設部中の柱状体間の距離および上記パスの幅の２種類のパラメータを任意に設定でき、これにより、サイズの分布が広い試料についても、目詰まりの発生やスループットの低下をもたらすことなく高い分解能で分離することができる。たとえば、小さいサイズの分子を高い分解能で分離するために、柱状体間の間隔を数ナノ〜数十ナノメートルオーダーと狭くする一方、上記試料分離領域中のパスの幅を大きくすることによって大きいサイズの分子を円滑に移動させ、目詰まりや分離効率の低下を防止することができる。
【００２０】
また、上記パスは流路の試料進行方向とは異なる方向に設けることもできる。このようにすることにより、試料に含まれる分子と柱状体配設部との接触頻度が上昇する。従って、柱状体配設部を構成する柱状体同士の間隔よりも小さいサイズの分子が柱状体配設部に捕捉される確率が高くなるため、分離能がさらに向上する。具体的には、試料進行方向とパスの方向とのなす角度が１０〜８０度であることが好ましく、３０〜６０度であることがさらに好ましい。試料進行方向とパスの方向とのなす角度が小さすぎる場合、試料に含まれる分子と柱状体配設部との接触頻度が充分に確保できなくなる。一方、試料進行方向とパスの方向とのなす角度が大きすぎる場合は、試料の流速が低下するため、スループットが低下してしまうためである。
【００２１】
また上記の分離装置において、上記柱状体配設部中の柱状体間の平均間隔が１００ｎｍ以下とすることができる。ここで「間隔」とは柱状体の中心間距離をいう。この場合、柱状体の間隔がきわめて狭いため、従来では分離の困難であったさまざまな物質を分離、分別することができる。たとえばタンパク質や核酸の分離に際しては、数百ナノメートルオーダー以下の微小な間隙を有する構造が必須となる。大きな間隙のみが設けられた構造では、核酸やタンパク質の分子サイズに対して大きすぎるため、間隙が篩としての機能を充分に果たし得ない。さらに上記柱状体配設部中の柱状体間の平均間隔が７０ｎｍ以下とすることができる。この場合、さらに精密な分析を実現することができる。
また、上記パスの幅や柱状体間の距離は、分離しようとする試料に含まれる複数の成分の大きさの中央値Ｍや標準偏差σなどを考慮して適宜選択することもできる。こうすることにより、分離効率を最適化することができる。例えば、柱状体の間隔をＭ、パスの幅をＭ＋２σとすることができる。また、柱状体の間隔を２Ｍ、パスの幅を２Ｍ＋２σとすることもできる。
【００２２】
また上記の分離装置において、上記柱状体配設部を構成する複数の柱状体の密度が、流路の試料進行方向に向かって次第に低くすることもできる。このようにすることにより、柱状体配設部に捕捉された分子の柱状体配設部における滞在時間が長くなるため、柱状体配設部に捕捉されない分子との保持時間の差が顕著となる。そのため、分離能の向上を図ることが可能となる。
【００２３】
また逆に、上記の分離装置において、上記柱状体配設部を構成する複数の柱状体の密度が、流路の試料進行方向に向かって次第に高くすることもできる。この場合、柱状体配設部における目詰まりが抑制されるため、スループットの向上を図ることができる。
【００２４】
さらに、上記の分離装置において、上記柱状体の頂部と上記流路の壁面とが離間していてもよい。このようにすることにより、大きなサイズの分子の通過経路が増えるため、目詰まりの解消に資することとなる。また、小さなサイズの分子についても、柱状体配設部の上方から進入することが可能となることから、柱状体配設部に捕捉される機会が増える。このため、さらなる分離能の向上効果が得られる。
【００２５】
また本発明によれば、上記の分離装置において、柱状体が一列に配設された堰止部をさらに有することを特徴とする分離装置が提供される。この分離装置は、拡散した試料を当該堰止部に隣接する一定の領域に集積することが可能である。分離に先立ち、試料を一定の領域に集積し、試料のバンドを細くせしめることは、分離能の向上に有利である。
【００２６】
上記の分離装置において、上記堰止部が上記試料分離領域に隣接して配設されている構成としてもよい。この分離装置によれば、試料が上記試料分離領域を通過する前に、試料のバンドを細くせしめることができるため、分離能が向上する。そのため高精度の分離を実現することが可能である。
【００２７】
また本発明によれば、上記の分離装置において、上記流路内壁の表面が親水化処理されたことを特徴とする分離装置が提供される。この分離装置は、試料に含まれる分子が粘着しにくいため、常に良好な分離能を発揮することができる。
【００２８】
各柱状体配設部を構成する柱状体は、同一サイズで等間隔に形成されたものとすることができる。このようにすれば、柱状体配設部における分離の感度を高めることができる。柱状体配設部内の柱状体が複数になるほど、分解能が向上する。
【００２９】
柱状体配設部は、それぞれ異なるサイズの柱状体により構成してもよい。すなわち、各柱状体配設部中に、それぞれ異なるサイズおよび間隔で柱状体が形成された構成を採用することもできる。このようにすれば、サイズの分布がきわめて広い試料についても、目詰まりの発生やスループットの低下をもたらすことなく高い分解能で分離することができる。
【００３０】
本発明の分離装置において、上記試料に外力を付与して上記試料を上記流路中で移動せしめる外力付与手段をさらに備えた構成を採用することができる。このようにすれば、外力を負荷する程度に応じて分離精度および分離に要する時間を目的に応じて適切に設定することができる。ここで、外力としては、圧力や電界を用いることが便利である。大がかりな外力付与部材が不要だからである。また、毛細管現象を利用して試料を移動させることもできる。この場合、外力付与手段が不要となり、装置の小型化に有利となる。
【００３１】
本発明の分離装置において分離対象となる試料としては、微小スケールで様々なサイズの核酸断片をはじめとする核酸、あるいは、アミノ酸・ペプチド・タンパク質などの有機分子、金属イオン、コロイド、ラテックスビーズ等が挙げられる。このうち、たとえば核酸またはタンパク質を試料とした場合、より効果的である。これらの試料の分離に際しては、小さいサイズの分子を高い分解能で分離しなければならないため、数百ナノメートルオーダー以下の微小な間隙が設けられた構造が必須となる。一方、巨大物質による目詰まりを効果的に抑制することも要求される。本発明によれば、これらの要求の双方に充分に対応できるため、核酸またはタンパク質の分離に好適である。
【００３２】
上記分離装置において、上記試料分離領域が、スリットを介して複数に分割された構成とすることができる。スリットは単一または複数のいずれでもよい。また、上記分離装置において、上記試料分離領域と、上記試料分離領域よりも柱状体が疎に形成された調整領域とが、流路中の試料進行方向に対して交互に形成された構成とすることができる。
【００３３】
このような構成とすることにより、検出部でのバンドの形状が直線的となり、検出領域を広げることが可能となり検出感度を向上することができる。
【００３４】
さらに、本発明によれば、基板表面に複数の柱状体が配設されてなるナノ構造体であって、上記柱状体の断面形状が、頂部よりも底部において幅広となっており、上記複数の柱状体は、隣接する柱状体の側面が、当該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されていることを特徴とするナノ構造体が提供される。
【００３５】
この構造体は、前述したように柱状体底部近傍の酸化の進行を抑制することができ、これにより、ばらつきの少ない高いアスペクト比の柱状体群を形成することができる。このため、分離装置の部材として好適な構造が得られるほか、各種素子の構成部材として好適に適用できる。
【００４０】
なお、本発明における分離装置は、試料分離領域を備えているものであればよく、サンプル導入領域や外力付与手段は装置自体に備わっていなくてもよい。たとえば、本発明における分離装置を使い捨て型のカートリッジタイプとし、これを、所定のユニットに組み込んで使用する方式とすることもできる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明において、流路や試料分離領域は、シリコン基板や石英等のガラス基板あるいはシリコン樹脂等の樹脂基板の表面に形成することができる。たとえば、これらの基板の表面に溝部を設け、これを表面部材によって封止し、これらによって囲まれた空間内に流路や試料分離領域を形成することができる。
【００４４】
本発明における柱状体は、たとえば、上記基板を所定のパターン形状にエッチングすることにより形成することができるが、その作製方法は特に制限はない。
【００４５】
柱状体は、円柱、楕円柱等、擬円柱形状；円錐、楕円錐、三角錐等の錐体；三角柱、四角柱等の角柱のほか、ストライプ状の突起等、さまざまな形状を含む。柱状体のサイズは、例えば、幅は１０〜２００ｎｍ程度、高さは１０〜１０００ｎｍ程度である。
【００４６】
隣接する柱状体の間隔は、分離目的に応じて適宜設定される。たとえば、
（ｉ）細胞とその他の成分の分離、濃縮
（ｉｉ）細胞を破壊して得られる成分のうち、固形物（細胞膜の断片、ミトコンドリア、小胞体）と液状分画（細胞質）の分離、濃縮
（ｉｉｉ）液状分画の成分のうち、高分子量成分（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、糖鎖）と低分子量成分（ステロイド、ブドウ糖等）の分離、濃縮
といった処理において、
（ｉ）の場合、１μｍ〜１０μｍ、
（ｉｉ）の場合、１００ｎｍ〜１μｍ、
（ｉｉｉ）の場合、１ｎｍ〜１００ｎｍ、
とすることができる。
【００４７】
本発明において、柱状体配設部は試料分離領域中に一または二以上設けることができる。柱状体配設部に含まれる柱状体群は、それぞれ同一サイズで、ほぼ等間隔に規則正しく形成してもよいし、異なるサイズの柱状体を任意の間隔で形成することもできる。各柱状体配設部中の柱状体群は、互いに異なるサイズ、間隔で形成することができる。
【００４８】
隣接する柱状体配設部間の間隔には、試料の通過し得るパスが形成される。ここで、柱状体配設部間の間隔を柱状体間の間隔よりも大きくすると、巨大サイズの分子等を円滑に移動させることができるので、分離効率を一層向上させることができる。
【００４９】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態についてさらに説明する。実施形態中、「ピラー」は柱状体の一形態として示したものであり、円柱ないし楕円柱の形状を有する微小な柱状体をいう。また、「ピラーパッチ」および「パッチ領域」は、柱状体配設部の一形態として示したものであり、多数のピラーが群をなして形成された領域をいう。
【００５０】
図１は、本発明に係る分離装置の一例を示す図である。基板１１０上に分離用流路１１２が形成され、これと交差するように投入用流路１１１および回収用流路１１４が形成されている。投入用流路１１１，分離用流路１１２および回収用流路１１４には、それぞれその両端に液溜め１０１ａ、ｂ、１０２ａ、ｂ、１０３ａ、ｂが形成されている。各々の液溜めには電極が設けられており、これを用いて例えば分離用流路１１２の両端に電界が印加することができる。
【００５１】
また、分離用流路１１２には、検出部１１３が設けられている。装置の外形寸法は用途に応じて適宜な値が選択されるが、通常は、図示したように、縦５ｍｍ〜５ｃｍ、横３ｍｍ〜３ｃｍの値とする。
【００５２】
ここで、上記の電極が設けられた液溜めの構造について、図５５および図５６を参照して説明する。図５５は、図１における液溜め１０１ａ付近の拡大図である。また図５６は、図５５におけるＡ−Ａ’断面図である。分離用流路１１２および液溜め１０１ａが設けられた基板１１０上には、緩衝液を注入できるようにするための開口部８０２が設けられた被覆８０１が配設される。また被覆８０１の上には、外部電源に接続することができるように伝導路８０３が設けられる。さらに図５６に示されるように、電極板８０４が液溜め１０１ａの壁面と伝導路８０３とに沿うように配設させる。電極板８０４と伝導路８０３とは圧着され、電気的に接続される。なお、その他の液溜めについても上記と同様な構造を有する。
【００５３】
再度図１に戻り、この装置を使って試料の分離を行う方法について説明する。まず試料を液溜め１０２ａ、もしくは液溜め１０２ｂに注入する。液溜め１０２ａに注入した場合は、液溜め１０２ｂの方向へ試料が流れるように電圧を印加し、液溜め１０２ｂに注入した場合は、液溜め１０２ａの方向へ試料が流れるように電圧を印加する。これにより、試料は投入用流路１１１へと流入し、結果的に投入用流路１１１の全体を満たす。この時、分離用流路１１２上では、試料は投入用流路１１１との交点にのみ存在し、投入用流路１１１の幅程度の狭いバンドを形成している。
【００５４】
次に、液溜め１０２ａ、液溜め１０２ｂの間への電圧印加をやめ、液溜め１０１ａと液溜め１０１ｂの間に、試料が液溜め１０１ｂの方向へ流れるように電圧を印加する。これにより試料は分離用流路１１２を通過することになり、この間に、分子の大きさと荷電の強さ、および柱状体間の隙間のサイズに応じた速度で、分離用流路１１２を進んでゆく。その結果、試料中の異なる分子群は、それぞれ異なる速度で移動するバンドに分離される。これらの分離されたバンドは、検出部１１３に至ると、光学的あるいは、他の物理化学的な方法で検出される。光学的検出とは、例えば、分子に蛍光物質を結合させておき、検出部１１３においてレーザーを照射し、分子から発せられる蛍光を観測することである。分離されたバンドは、さらに、バンドごとに回収することができる。所望のバンドが検出部１１３を通過したことを目安に、液溜め１０１ａ、液溜め１０１ｂ間への電圧印加をやめ、代わりに液溜め１０３ａ、液溜め１０３ｂの間に電圧を印加する。すると分離用流路１１２中と、回収用流路１１４の交差点に存在するバンドは、回収用流路１１４に流れこむ。液溜め１０３ａ、液溜め１０３ｂ間への電圧印加を一定時間の後に停止すると、液溜め１０３ａまたは液溜め１０３ｂに、分離されたバンドに含まれる所望の分子が回収される。
【００５５】
上記装置は、電界を印加することによって試料を移動させる方式を採用しているが、電界の印加に代え、圧力を加える方式を採用することもできる。図３０はこのような装置の一例である。分離用チップの投入用流路と分離用流路の端にある液溜め部分には、ジョイントメスが固着してある。それぞれのジョイントメスには、中空のチューブ１３、１４、１５、１６がつながれた、ジョイントオスを接続する。ジョイントを用いる理由は、液漏れを防ぐためである。ジョイントの具体的な構造は、たとえば図４１のようにする。
【００５６】
ジョイントオスにつながれた各チューブは、それぞれ電磁弁１０、４、５、１１に接合されている。電磁弁１０には、分離用ポンプ８、定速注入装置９を介して、液溜め７からバッファーが供給される。電磁弁４には、投入用ポンプ２、定速注入装置３を介して、サンプル溜め１からサンプルが供給される。電磁弁５には、投入用流路１９を介して送られてきたサンプルが供給され、廃液溜め６へと導かれる。電磁弁１１には、分離用流路２０を介して分離されたサンプルが供給され、オートサンプラー１２にて回収される。
【００５７】
制御ユニット２１は、電磁弁４、５、１０、１１、および分離用ポンプ８、投入用ポンプ２、定速注入装置９、定速注入装置３、の稼動時点を制御する。
【００５８】
この装置を用いた分離回収手順は以下のとおりである。まず、電磁弁１０、電磁弁１１を閉じる。これにより投入用流路１９からサンプルが分離用流路２０に流入することを防止できる。ついで電磁弁４、電磁弁５を開く。そして、サンプル溜め１にサンプルを投入する。
【００５９】
次に投入用ポンプ２でサンプルを加圧し、サンプルを、定速注入装置３、電磁弁４、チューブ１４を介して、投入用流路１９へ導く。投入用流路１９を介して漏出したサンプルは、チューブ１５、電磁弁５を通って、廃液溜め６に導かれる。
【００６０】
投入用流路１９にサンプルが満たされた後、電磁弁４、電磁弁５を閉じ、電磁弁１０、電磁弁１１を開く。つづいて分離用ポンプ８でバッファーを加圧し、定速注入装置９、電磁弁１０、チューブ１３を介してサンプルを分離用流路２０へ導く。こうして分離操作が開始する。分離用流路２０の先から分離された物質がバッファーとともにチューブ１６、電磁弁１１を介して出てくるので、これをオートサンプラー１２で定時的に回収する。
【００６１】
こうした手順により、サンプルの分離が行われる。この装置では、試料を移動させるための外力として圧力を利用しているため、比較的簡素な外力付与装置を設ければ済むので、製造コストの低減、装置の小型化に有利である。
【００６２】
上記装置では試料を移動させる外力として圧力を用いたが、圧力に代え、毛細管現象を利用して試料を移動させる方式を採用することもできる。この場合、電力、圧力等の外力の印加が不要で駆動のためのエネルギーが不要となる。以下、毛細管現象を利用する装置の例について図３１を参照して説明する。分離用流路５４０には、分離用ピラーが配置されている。分離用流路５４０の一端には空気穴５６０が設けられ、他端には分離時にバッファーを注入するためのバッファー注入口５１０が設けられている。分離用流路５４０は、バッファー注入口５１０、空気穴５６０以外の部分では密閉されている。分離用流路５４０の起始部には、サンプル定量管５３０がつながっており、サンプル定量管５３０の他方の端は、サンプル注入口５２０が設けられている。
【００６３】
サンプル定量管５３０には、定量用ピラーが配置されている。定量用ピラーは、分離用ピラーよりも疎につくられており、そこでサンプルの分離が起こることはない。サンプル定量管５３０のサンプル注入口５２０以外の部分は密閉されている。
【００６４】
図３２は、サンプル定量管５３０の近傍を拡大して示したものである。サンプル定量管５３０の内部の定量用ピラーとサンプル保持部５０３の間は、一時停止スリット５０２によって隔てられている。サンプル保持部５０３は、バッファー導入部５０４、分離部５０６に設置されたピラーよりも、緻密なピラーが設置されている。バッファー導入部５０４には、分離用ピラーと同等のピラーが設置されている。サンプル保持部５０３、バッファー導入部５０４および分離部５０６は、一時停止スリット５０５、５０７で隔てられている。サンプル保持部５０３の空隙体積は、サンプル定量管５３０の空隙体積と一時停止スリット５０２の体積の和にほぼ等しい。一時停止スリット５０５の幅は、一時停止スリット５０２の幅よりも狭い。
【００６５】
次に、図３１の装置を用いた分離操作の手順について説明する。まず、サンプル注入口５２０にサンプルを徐々に注入しサンプル定量管５３０を満たす。この時、水面が盛り上がらないようにする。このサンプル注入操作において、サンプルは、図３２に示されるサンプル定量管５３０に設置されたサンプル定量用ピラー間に保持される。サンプル定量管５３０がサンプルで満たされた後、サンプルは一時停止スリット５０２に徐々にしみ出してゆく。一時停止スリット５０２にしみだしたサンプルが、サンプル保持部５０３の表面に到達すると、一時停止スリット５０２およびサンプル定量管５３０の内部のサンプルは、さらに毛細管効果の大きい、サンプル保持部５０３へとすべて吸い取られる。サンプル定量管５３０よりもサンプル保持部５０３の方がより大きい毛細管効果を有する理由は、サンプル保持部５０３の方が、ピラーが密に形成され、表面積が大きいことによる。サンプル保持部５０３へのサンプル充填の間は、一時停止スリット５０５、５０７が存在するため、サンプルがバッファー導入部５０４あるいは分離部５０６に流れ込むことは無い。
【００６６】
サンプル保持部５０３にサンプルが導入された後、バッファー注入口５１０に分離用バッファーを注入する。注入されたバッファーは、バッファー導入部５０４に一時的に充填されて、サンプル保持部５０３との界面が直線状になる。さらにバッファーが充填されると、一時停止スリット５０５にしみだして、サンプル保持部５０３に流入し、さらに、サンプルをひきずりながら、一時停止スリット５０７を超えて、分離部５０６へと進行する。この際、一時停止スリット５０２の幅が、一時停止スリット５０５、５０７の幅よりも大きいため、一時停止スリット５０２へバッファーが逆流しても、サンプルは既に、サンプル保持部５０３より先に進行しているため、サンプルの逆流はほとんどない。
【００６７】
分離用バッファーは毛細管現象で、分離部５０６を空気穴５６０へ向けてさらに進行し、この過程で、サンプルが分離される。分離用バッファーが、空気穴５６０に到達すると、バッファーの流入が停止する。バッファーの流入が停止した段階、もしくは、バッファーが進行中の段階で、サンプルの分離状態を計測する。
【００６８】
上記実施形態は、毛細管現象を用いたサンプルの定量注入の例であるが、この原理を利用した試料注入の他の例について図３３、図３４を参照して説明する。この装置では、図３２におけるサンプル定量管５３０に代えて、サンプル投入管５７０が設けられている。サンプル投入管５７０の両端には、サンプル注入口５２０と、排出口５８０が設けられている。サンプル投入管５７０の内部には、ピラーは設置されていない。サンプル投入管５７０は、投入穴５０９を介して、サンプル保持部５０３に開口している。
【００６９】
この装置を用いた分離手順について説明する。まず、サンプルを、サンプル注入口５２０に投入し、排出口５８０まで満たす。この間に、サンプルは、投入穴５０９を介してサンプル保持部５０３に吸収される。
【００７０】
しかる後に、サンプル注入口５２０に空気を圧入して、サンプルを排出口５８０から排出することによりサンプル投入管５７０の内部のサンプルを払拭、乾燥する。毛細管現象による分離の場合は、上記と同様に、分離用バッファーを注入する。電気泳動による分離の場合は、サンプルの投入以前に、バッファー注入口５１０に相当する液溜め、空気穴５６０に相当する液溜めから泳動用バッファーを導入しておく。広く作られた一時停止スリット５０５、５０７が存在するため、サンプル保持部には、流入しない。
【００７１】
サンプル保持部５０３へのサンプルの保持が終わった段階で、さらに微量の泳動用バッファーを分離用流路の一端の液溜めに加えるか、サンプル保持部５０３の周辺に軽く振動を与えることで、泳動バッファーを連続させ、電圧を印加して分離する。
【００７２】
次に、分離装置中の分離用流路の構造について説明する。図２は、図１中の分離用流路１１２の構造を詳細に示したものである。なお、図中の構造は図２以降の図においても適用することが可能である。図２中、基板１２０に幅Ｗ、深さＤの溝部が形成され、この中に、直径φ、高さｄの円柱形状のピラー１２５が等間隔で規則正しく形成されている。ピラー１２５間の間隙を試料が透過する。隣接ピラー１２５間の平均間隔はｐである。各寸法は、たとえば図２に示された範囲とすることができる。
【００７３】
図３は、図２に示した流路の断面図である。基板１２０に形成された溝部が被覆部１２２によって封止され、空間を形成しており、この空間内に多数のピラー１２５が形成されている。ピラー１２５の間隙は流路１２３となる。
【００７４】
上記のように多数のピラー１２５が密集して形成された構造を試料分離手段として用いる場合、主として２つの分離方式が考えられる。一つは、図４に示す分離方式である。この方式では、分子サイズが大きい程、ピラー１２５が障害となり、図中の分離領域の通過時間が長くなる。分子サイズの小さいものは、ピラー１２５間の間隙を比較的スムーズに通過し、分子サイズが大きいものに比べて短時間で分離領域を通過する。
【００７５】
ところが、この方式では試料中に巨大なサイズの物質を含む場合、目詰まりを起こすことがある。いったん発生した目詰まりを解消することは一般に困難である。
【００７６】
目詰まりの問題は、分子サイズの小さい物質を多種類含む試料を高い分離能で分離しようとしたとき、より顕著となる。分子サイズの小さい物質を多種類含む試料を高い分離能で分離するためには、ピラー１２５間の間隙をある程度小さく設定することが必要となる。ところが、そのようにすると、大きいサイズの分子にとっては、より目詰まりしやすい形態となる。
【００７７】
この点、図５に示す分離方式では、このような問題が解消される。図５中、試料分離領域には、複数の柱状体配設部（ピラーパッチ１２１）が離間して形成されている。各柱状体配設部には、それぞれ、同一サイズのピラー１２５が等間隔に配置されている。この試料分離領域では、大きな分子が小さな分子よりも先に通過していく。分子サイズが小さいほど、分離領域中でトラップされて長い経路を通ることになる一方、大きいサイズの物質は、隣接ピラーパッチ１２１間のパスを円滑に通過するからである。この結果、小さいサイズの物質は、大きいサイズの物質よりも後から排出される形で分離がなされる。サイズの大きい物質は比較的スムーズに分離領域を通過する方式となるので、目詰まりの問題が低減され、スループットが顕著に改善される。こうした効果をより顕著にするためには、隣接ピラーパッチ１２１間のパスの幅を、ピラーパッチ１２１中のピラー１２５間の間隙よりも大きくするのが良い。パスの幅は、ピラー１２５間の間隙の好ましくは２〜２０倍程度、より好ましくは５〜１０倍程度とする。
【００７８】
また、上記実施形態では柱状体を一定間隔で配設した例を示したが、柱状体配設部内において柱状体を異なる間隔で配設することもできる。こうすることで大・中・小等の複数の大きさの分子・イオンを効率的に分離することができる。また、柱状体の配置に関し、試料の進行方向に対して互い違いに柱状体を配置する方法を採用することも有効である。こうすることにより、目詰まりを効果的に防止しつつ目的の成分を効率的に分離することができる。
【００７９】
例えば、図４９（ａ）のように、流れの向きに従ってピラーの間隔を小さくした柱状体配設部を採用することができる。この場合、柱状体配設部に進入した分子は移動するほど移動速度が低下するため、柱状体配設部に進入することができない大きめの分子との保持時間差が顕著となる。その結果、分離能の向上が実現される。一方、図４９（ｂ）のように、流れの向きに従ってピラーの間隔を大きくした柱状体配設部を採用することもできる。このようにすることにより、柱状体配設部における目詰まりを抑制することができるため、スループットの向上を図ることが可能となる。なお、流れの向きに従ってピラーの間隔を小さくしたり、大きくしたりする形態は、柱状体配設部を有しない分離領域にも適用することができる。
【００８０】
さらに、複数の柱状体配設部をまとめて更に大きな柱状体配設部とし、その大きな柱状体配設部同士の間隔を、もとの柱状体配設部同士の間隔よりも広くするような階層的な配置も可能である。その一例を図５４に示す。小さなピラーパッチ７１２が七つ集合することにより中程度のピラーパッチ７１３を形成し、さらに中程度のピラーパッチ７１３が七つ集合することにより大きなピラーパッチ７１４を形成している。このように、柱状体配設部を階層的に構成することにより、幅広いサイズレンジの分子を同時にかつ大きい順に分離することが可能になる。すなわち、より大きな分子はより大きな柱状体配設部の間を通過するのに対して、中等度のサイズの分子は中等度のサイズの柱状体配設部の内部に捕捉されて分離される。さらに小さな分子は、さらに小さな柱状体配設部の内部に捕捉されて分離される。このため、小さな分子ほど流出に時間がかかり、大きさが異なる複数の分子を、大きい順に分離することが可能になる。
【００８１】
図５に示した分離方式を実現する試料分離領域の構造について、図６を参照して説明する。図６に示したように、この試料分離領域は、流路の壁１２９によって囲まれた空間内にピラーパッチ１２１が等間隔で配置された構造となっている。ピラーパッチ１２１は、それぞれ多数のピラー１２５により構成されている。ここでは、ピラーパッチ１２１の幅Ｒは、１０μｍ以下とする。一方ピラーパッチ１２１間の間隔Ｑは２０μｍ以下とする。
【００８２】
図５においては、ピラー１２５が密集してなるピラーパッチ１２１は、上面からみて円形の領域として形成されているが、円形に限らず他の形状であってもよい。図７の例では上面からみてストライプ状の領域にパッチ領域１３０が形成されている。この形態においては、パッチ領域１３０の幅Ｒは１０μｍ以下、パッチ領域１３０間の間隔Ｑは１０〜１００μｍとする。
【００８３】
また、図５０は菱形のピラーパッチ１２１を採用し、さらにそれぞれのピラーパッチ１２１を菱形状に配置させた例である。この場合、パスと流れの向きとが一定の角度をなしており、分子とピラーパッチ１２１との接触頻度が上昇するため、ピラーパッチ１２１を構成するピラーの間隔よりも小さい分子がピラーパッチ１２１に捕捉される確率は上昇する。そのため、ピラーパッチ１２１に捕捉された分子と捕捉されない大きめの分子との保持時間差が顕著となるため、分離装置の分離能の向上を図ることができる。また、分離目的の分子の直径をＲとした場合、ピラーパッチ１２１同士の間隔ｈ、ピラーパッチ１２１の対角線Ｄおよびｄ、ピラーパッチを構成するピラーの間隔ｐについては次の条件を満たすことが好ましい。こうすることにより、目的とする分子を精度良く分離することができる。
ｈ：Ｒ≦ｈ＜１０Ｒ
ｐ：０．５Ｒ≦ｐ＜２Ｒ
Ｄ：５ｈ≦Ｄ＜２０ｈ
ｄ：５ｈ≦ｄ＜２０ｈ
【００８４】
また、パッチ領域を構成するものはピラーに限られない。例えば、板状体が一定の間隔で配置されてなるパッチ領域とすることもできる。図５１に一例を示す。図５１（ａ）は上面図であり、図中のＡ−Ａ’断面図を図５１（ｂ）に示す。このパッチ領域を図５１（ｃ）に示すように配置する。一旦パッチ領域１３０に捕捉された分子は流路１２３に脱出するまでパッチ領域１３０に留まることとなる。従って、パッチ領域に捕捉された分子と捕捉されない分子との保持時間の差が顕著となるため分離能が向上する。また、分離目的の分子の直径をＲとした場合、パッチ領域１３０同士の間隔Λ、パッチ領域１３０を構成する板状体同士の間隔λについては次の条件を満たすことが好ましい。こうすることにより、目的とする分子を精度良く分離することができる。
Λ：Ｒ≦Λ＜１０Ｒ
λ：０．５Ｒ≦λ＜２Ｒ
【００８５】
また、本発明において、上記の柱状体または板状体の頂部と流路の上面とは接していてもよいし、離間していてもよい。離間している場合は、柱状体あるいは板状体と流路上面との間に間隙が存在するため、大きな分子の通過機会が増加する。このため、さらなる目詰まりの解消を図ることができる。さらに小さな分子についても、この間隙を経由して上方からパッチ領域へ入り込む機会が増加することから、分離効果がさらに向上する。このような形態は、流路の上面となる部材（カバーガラスなど）にあらかじめ溝部を設けておくこと、または柱状体や板状体の高さを流路の深さよりも低く作製することによって容易に実現することが可能である。
【００８６】
本発明において、柱状体配設部間のパスの幅及び、柱状体配設部内の柱状体の間隔は、分離しようとする成分（核酸、アミノ酸、ペプチド・タンパク質などの有機分子、キレートした金属イオンなどの分子・イオン）のサイズに合わせて適宜に選択される。たとえば柱状体の間隔は、分離したい分子群のサイズの中央値に相当する慣性半径と同程度か、それよりもわずかに小さめあるいは大きめとするのが好ましい。具体的には、上記中央値に相当する慣性半径と、柱状体の間隔との差異を、１００ｎｍ以内、より好ましくは１０ｎｍ以内、最も好ましくは１ｎｍ以内とする。柱状体の間隔を適切に設定することにより、分離能が一層向上する。
【００８７】
隣接する柱状体配設部間の間隔（パスの幅）は、試料中に含まれる最大サイズの分子の慣性半径と同程度か、それよりもわずかに小さめあるいは大きめとするのが好ましい。具体的には、試料中に含まれる最大サイズの分子の慣性半径と柱状体配設部間の間隔との差異を、当該分子の慣性半径の１０％以内、より好ましくは５％以内、最も好ましくは１％以内とする。柱状体配設部間の間隔が広すぎると、サイズの小さい分子の分離が充分に行われなくなることがあり、柱状体配設部間の間隔が狭すぎると、目詰まりが発生しやすくなる場合がある。
【００８８】
また本発明において、流路に設けられた分離領域の直前に、一列の柱状体を配設してもよい。この一例を図４７に示した。図４７（ａ）に示されるように、流路上に設けられた分離領域７１１の直前に一列のピラー列７１０が配設されている。このピラー列７１０における各々のピラーの間隔は、分離対象の分子群７０９に含まれる最小サイズの分子と同程度とすることが好ましい。このような構成を採用することにより、以下に説明する効果が得られる。なお、分離領域７１１には、上述したようなパッチ領域あるいは柱状体配設部を設けたものであってもよいし、柱状体が満遍なく配設されてなる分離領域であってもよい。
【００８９】
図４７（ａ）において、弱い駆動力（たとえば微弱な電界）を分離対象の分子群７０９に付与すると、広範囲に拡散している分離対象の分子群７０９は流路を移動するが、ピラー列７１０に到達すると堰き止められるため、ピラー列に隣接した帯状の狭い領域において細いバンドを形成する（図４７（ｂ））。次に、一時的に強い駆動力（たとえば強い電界）を分離対象の分子群に与えることによって、当該分子群は細いバンド状態を保ちつつピラー列を通過する（図４７（ｃ））。これは、特にＤＮＡやタンパク質のような高分子の場合、分子サイズがピラー同士の間隔よりも大きい場合であっても、ピラー列が一列ないし数列程度であれば当該分子は伸長することによりピラー間をすり抜けることができることによる（レプテーション効果）。分離対象の分子群がピラー列を通過した後は、分離に適した駆動力を当該分子群に与えることにより効果的に分離することができる（図４７（ｄ））。上記したように当該分子群は細いバンド状態を保っているため、分離後のピークの重なりが少なくなることから高精度の分離が実現するためである。
【００９０】
さらに、流路壁に対してＤＮＡやタンパク質などの分子が粘着することを防ぐために、流路壁をコーティングすることが好ましい。この結果、分離装置が良好な分離能を発揮することができる。コーティング材料としては、例えば、細胞膜を構成するリン脂質に類似した構造を有する物質を流路壁にコーティングすることが挙げられる。このような物質としてはリピジュア（登録商標、日本油脂社製）などが例示される。リピジュア（登録商標）を用いる場合は、０．５ｗｔ％となるようにＴＢＥバッファなどの緩衝液に溶解させ、この溶液を流路内に満たし、数分間放置することによって流路壁をコーティングすることができる。
【００９１】
また、流路壁をフッ素系樹脂、あるいは牛血清アルブミンによりコーティングすることによって、ＤＮＡなどの分子が流路壁に粘着することを防止することもできる。
【００９２】
本発明の分離装置では、図８に示すように、分離用流路１１２の両端に電圧が印加され、これにより試料が分離用流路１１２中を移動する。ここで、試料に外力を与えるための電圧以外に、電気浸透流を抑制するための電圧を印加してもよい。図８ではこの目的のため、基板にゼータ補正電圧を印加している。このようにすれば電気浸透流が抑制され、測定ピークのブロードニングを有効に防止することができる。
【００９３】
本発明に係る分離装置は、内部に緩衝液を導入した状態で使用されることが好ましい。ここで、流路壁面や被覆部などの流路表面がプラスチックなどの疎水性材料で構成されている場合、緩衝液を導入することは通常、容易ではない。緩衝液を円滑に導入する方法としては、たとえば図９に示す方法を採用することができる。図示した方法では、遠心管１５１のホルダー１５３中にチップ１５０を固定した状態で遠心分離を行うことにより緩衝液がチップ１５０に導入される。
【００９４】
緩衝液を導入する困難を解消する方法として、分離装置内の流路表面にシリコン酸化膜等の親水性膜を形成することが有効である。親水性膜の形成により、特に外力を付与しなくとも緩衝液が円滑に導入される。この点については実施例にて後述する（図１４（ｄ）の工程で形成されるシリコン熱酸化膜２０９）。
【００９５】
本発明において、柱状体は、その頂部の直径が底部の直径よりも小さい形状を有することが好ましい。すなわち、柱状体が錐体ないし擬錐体形状を有し、断面が末広がりになっていることが好ましい。特に柱状体表面にシリコン酸化膜等の親水性膜を形成する場合、このような形状とすることによる効果が顕著となる。たとえば、柱状体を熱酸化してその表面に熱酸化膜を設けようとすると、柱状体の底部近傍で酸化が進み、柱状体の高さが減少してアスペクト比が低下することがある。柱状体の形状を上記のようにすると、このような酸化によるアスペクト比の低下を効果的に防止することができる。
【００９６】
また、柱状体の形状として上記したような形状を採用した上で、試料分離領域に設けられた柱状体を、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成することが望ましい。こうすることによって、酸化によるアスペクト比の低下を一層効果的に防止することができる。図１７は、このような構造を採用した柱状体の一例である。図示したように、基板１１０表面に円錐状の柱状体が設けられ、その表面がシリコン酸化膜１０４により覆われている。柱状体は、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されている。このような配置とすることにより、基板１１０を熱酸化して表面をシリコン酸化膜で覆った場合、柱状体底部の酸化膜厚が薄くなり、柱状体のアスペクト比を良好に維持できる。この理由は必ずしも明らかではないが、円錐状の柱状体の側面が互いに接した構造となっているため、柱状体の底部近傍で酸化が進行した際、圧縮応力が発生し、それ以上の酸化が進みにくくなることによるものと推察される。
【００９７】
次に、図１７に示した構造体の形成方法について図１８を参照して説明する。まず図１８（ａ）のように、基板１１０上にシリコン酸化膜１０５、レジスト膜１０７をこの順で成膜する。次いで電子線露光等によりレジスト膜１０７をパターニングして所定の開口部を有するパターンが形成される（図１８（ｂ））。
【００９８】
次いでこのレジスト膜１０７を用いてシリコン酸化膜１０５をドライエッチング等することにより、シリコン酸化膜１０５からなるハードマスクが形成される（図１８（ｃ））。レジスト膜１０７を除去した後（図１８（ｄ））、基板１１０をドライエッチングすることにより（図１９（ｅ））、アスペクト比の高い柱状体が得られる。シリコン酸化膜１０５を除去後（図１９（ｆ））、たとえば８５０℃以上の高温で表面を酸化する。以上の工程により、図１９に示すナノ構造体が得られる。このナノ構造体は、分離装置の試料分離部などに好適に利用することができる。
【００９９】
以上の実施形態では、レジストマスクを用いて形成したハードマスクにより基板１１０をエッチングしたが、レジストマスクを用いて直接基板エッチングすることもできる。図２０はこの方法を示す図であり、図示したプロセスでは、基板１１０上にレジスト９００を形成した後、パターニングし、これをマスクとして基板１１０をエッチングしてピラーを形成している。
【０１００】
次に、金型を用いてマスクのパターニングを行う方法を採用した、ピラー構造の形成例について説明する。図２１は、本発明に係る分離装置の製造方法を示す工程断面図である。まず図２１（ａ）に示すように、表面に樹脂膜１６０が形成されたシリコンからなる基板１１０と、成型面を所定の凹凸形状に加工した金型１０６とを用意する。樹脂膜１６０の材質はポリメチルメタクリレート系材料とし、その厚みは２００ｎｍ程度とする。金型１０６の材質は特に制限がないが、Ｓｉ、ＳｉＯ_２、ＳｉＣ等を用いることができる。
【０１０１】
次いで図２１（ｂ）に示すように、金型１０６成型面を樹脂膜１６０表面に当接させた状態で加熱しながら加圧する。圧力は６００〜１９００ｐｓｉ程度とし、温度は１４０〜１８０℃程度とする。その後、基板を脱型し、酸素プラズマアッシングを行い、樹脂膜１６０をパターニングする。
【０１０２】
つづいて樹脂膜１６０をマスクとして基板１１０をドライエッチングする。エッチングガスは、たとえばハロゲン系ガスを用いる。エッチング深さは約０．４μｍであり、エッチングにより形成されるピラーの間隔は約１００ｎｍである。エッチングのアスペクト比（縦横比）は４：１程度である。このとき、エッチングによって生じた凹部の底近傍では、マイクロローディング効果によりエッチングの進行が鈍化し、凹部の先端が狭まり、曲面となる。この結果、ピラーは末広がりになり、その断面形状は、頂部よりも底部において幅広となる。また、ピラー間の距離が狭いため、各ピラーは、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されることとなる。
【０１０３】
図２１（ｄ）の後、８００〜９００℃の炉アニールにより熱酸化を行い、ピラー側壁にシリコン熱酸化膜を形成する。このとき、ピラーおよび凹部の形状が上述のようになっているため、柱状体底部の酸化膜厚が薄くなり、柱状体のアスペクト比を良好に維持できる。この理由は必ずしも明らかではないが、円錐状の柱状体の側面が互いに接した構造となっているため、柱状体の底部近傍で酸化が進行した際、圧縮応力が発生し、それ以上の酸化が進みにくくなることによるものと推察される。
【０１０４】
以上の工程により、基板１１０上にピラー群が形成される。本実施形態では、電子線露光によるマスク開口部の形成工程が不要となるため、生産性が顕著に向上する。
【０１０５】
上記実施形態では、マスクとなる樹脂膜１６０のパターニングを行う際に金型を用いたが、この金型を用いて直接柱状体を形成することもできる。具体的には、所定のプラスチック材料を基板上にコートした後、上記と同様の工程により囲う成型することができる。基板上にコートするプラスチック材料は、成型性が良好で、かつ、適度な親水性を有するものが好ましく用いられる。たとえば、ポリビニルアルコール系樹脂、特にエチレン−ビニルアルコール樹脂（ＥＶＯＨ）、ポリエチレンテレフタレート等が好ましく用いられる。疎水性樹脂であっても、成型後、上記コーティングを行えば流路表面を親水性とすることができるので利用可能である。
【０１０６】
上記実施形態における最終工程であるシリコン熱酸化膜を形成の際に、酸化条件によっては膜が充分に形成されないこともあり得る。このような場合、電流が基板へ漏れてしまうことから、試料の分離を電気泳動により行う際には必要な電界が得られないことになる。これを回避するために、以下のようにして基板に分離用流路および液溜めを設けることができる。
【０１０７】
まず、図５２（ａ）に示すようにシリコン基板２０１を熱酸化することによりシリコン酸化膜２０２を形成する。その後、シリコン酸化膜２０２上に多結晶シリコンを堆積させ、多結晶シリコン膜７０７を形成する。つづいて多結晶シリコン膜７０７を熱酸化することにより酸化膜７０８を形成する。
【０１０８】
次に、酸化膜７０８上にカリックスアレーン電子ビームネガレジストを形成し、電子ビーム（ＥＢ）を用い、液溜めおよび試料の流路となる領域をパターン露光することによりレジストをパターニングする。その後、酸化膜７０８をＲＩＥエッチングし、レジストを除去して図５２（ｂ）に示された状態とする。つづいて、エッチングされた酸化膜７０８を保護膜として多結晶シリコン膜７０７をＥＣＲエッチングする。その後、酸化膜７０８を除去し、図５２（ｃ）に示された状態とする。その後、エッチングされた多結晶シリコン膜７０７を熱酸化することにより、シリコン酸化膜２０２と一体化させることにより図５２（ｄ）に示された状態とする。
【０１０９】
上記のようにして加工された分離用流路はシリコン基板２０１とは完全に絶縁されているため、電気泳動の際の電界を確実に確保することが可能である。
【０１１０】
なお、上記実施形態におけるシリコン基板２０１およびシリコン酸化膜２０２を石英基板で代替してもよい。また、シリコン基板２０１、シリコン酸化膜２０２および多結晶シリコン膜７０７の代わりにＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｏｎ Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）基板を利用することもできる。
【０１１１】
以上述べた実施形態においては、柱状体としてピラーを形成した例を示したが、カーボンナノチューブやカーボンナノホーンを用いて柱状体を形成することもできる。
【０１１２】
カーボンナノチューブは直径が１〜３０ｎｍのチューブ形状を有する。カーボンナノホーンは、たとえば先端が１ｎｍ程度、根本が４ｎｍの微細な形状を有している。本発明における「柱状体」は、これらのものも含む用語として定義される。
【０１１３】
試料分離領域にカーボンナノチューブやカーボンナノホーンを形成する方法としては、核付け法や、親水性の樹脂にカーボンナノチューブ、カーボンナノホーンを混入し、その後樹脂からカーボンナノチューブ、カーボンナノホーンを引き出す方法等を採用することができる。
【０１１４】
カーボンナノチューブやカーボンナノホーンは撥水性であるため、表面を親水性に変換した上で本発明に適用することが望ましい。親水性に変換する方法としては、酸化処理等、カーボンナノチューブの親水化処理方法として公知の方法を用いることができる。なお、カーボンナノチューブの親水化処理方法は、カーボンナノホーンに対しても適用することができる。
【０１１５】
次に、スリットを介して複数に分割された分離領域を流路に設けた例について図３５を参照して説明する。図示した構成では、流路中に、試料分離領域６０１が流路を塞ぐように形成されている。この試料分離領域６０１は、スリット６０２を介して複数に分割されている。壁６０３と試料分離領域６０１の間には間隙は存在しない。このような構成を採用した場合、分離された試料のバンドの形状が好適になり、分離能が向上する。この点について図３６を参照して説明する。スリットがなく単一の試料分離領域６０１を設けた場合は、図中左の分図中、上部から下部に流動する試料の液面は、曲面となる。これは、壁に沿った部分では毛細管現象により試料の移動が促進される一方、流路断面中央部では毛細管現象の効果が少ないことによる。壁近傍では試料の流動が速められる結果、図示したようなバンド形状となるのである。これに対して、試料分離領域６０１を、スリット６０２を介して複数に分割した場合、スリットの存在により、分離中の液はいったんスリット上部の試料分離領域に保持されることとなる。スリット中には空気が存在しているため、スリット上部の試料分離領域に存在する試料の圧力がスリット中の空気に由来する圧力を超えたとき、はじめて試料分離領域からスリットへの液の移動が開始する。このように、試料を含む液がいったん試料分離領域に保持されるため、壁部および中央部で移動距離の差が生じても、保持される時間中にその差が解消されることとなる。この結果、スリットを抜けた段階では、液面は分離方向にほぼ垂直な平面となる（図３６の右図）。これにより、分離方向に垂直な面での計測が正確に行われ、分離能が向上する。なお、試料分離領域６０１は、上述したようなパッチ領域あるいは柱状体配設部を設けたものであってもよいし、柱状体が満遍なく配設されてなる試料分離領域であってもよい。
【０１１６】
図３７および図３８は、上記した毛細管現象による試料のバンド形状の相違を示す図である。図３７のように、試料分離領域として単一人工ゲルを設けた場合はバンド形状が試料進行方向に対して曲がった形状となる。これに対して、図３８では、ピラーが疎に形成された領域と密に形成された領域を交互に形成した構成を採用している。ピラーが疎に形成された領域は、図３５、３６におけるスリットと同様の役割を果たす。すなわち、ピラーが疎に形成された領域の手前で試料を含む液がいったん停止し、この間にピラーが密に形成された領域において生じた液の移動距離の差が解消され、この結果、試料進行方向に対してほぼ平面のバンド形状が得られるのである。
【０１１７】
以上、毛細管現象を利用した分離装置におけるスリットおよびピラーが疎に形成された領域についての効果を説明したが、電界を利用した分離装置においても、スリット等を配設することにより上記と同様の効果を得ることができる。電気泳動などによる分離の場合でも、泳動するに従ってバンドは曲がった形状となることが知られている。このバンドの形状をスリット等によって整えることができる。なおこの場合、スリットが緩衝液で満たされていても、バンド形状を整える効果を得ることができる。
【０１１８】
以上、本発明の実施の形態について説明したが、それぞれの実施の形態で用いた構成を任意に組み合わせることもできる。たとえば、図４９（ａ）に示される柱状体配設部を有する分離領域の直前に、図４７に示されるピラー列７１０を設け、さらに流路壁をコーティングした分離装置を実現することができる。
【０１１９】
【実施例】
実施例１
（分離装置の作製）
本発明に係る分離装置を、以下に示す手順で作製した。工程の詳細について図１１〜１５を参照して説明する。
【０１２０】
まず、図１１（ａ）に示すように、シリコン基板２０１上にシリコン酸化膜２０２、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト２０３（５５ｎｍ）をこの順で形成する。シリコン酸化膜２０２、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト２０３の膜厚は、３５ｎｍ、５５ｎｍとする。次に、電子ビーム（ＥＢ）を用い、試料の流路となるアレー領域を露光する。現像はキシレンを用いて行い、イソプロピルアルコールによりリンスする。この工程により、図１１（ｂ）に示すように、パターニングされたレジスト２０４が得られる。
【０１２１】
つづいて全面にポジフォトレジスト２０５を塗布する（図１１（ｃ））。膜厚は１．８μｍとする。その後、アレー領域が露光するようにマスク露光をし、現像を行う（図１１（ｄ））。
【０１２２】
次に、シリコン酸化膜２０２をＣＦ_４、ＣＨＦ_３の混合ガスを用いてＲＩＥエッチングする。エッチング後の膜厚を３５ｎｍとする（図１２（ａ））。レジストをアセトン、アルコール、水の混合液を用いた有機洗浄により除去した後、酸化プラズマ処理をする（図１２（ｂ））。つづいて、シリコン基板２０１をＨＢｒガスを用いてＥＣＲエッチングする。エッチング後のシリコン基板の膜厚を４００ｎｍとする（図１２（ｃ））。つづいてＢＨＦバッファードフッ酸でウェットエッチングを行い、シリコン酸化膜を除去する（図１２（ｄ））。
【０１２３】
次に、シリコン基板２０１上にＣＶＤシリコン酸化膜２０６を堆積する（図１３（ａ））。膜厚は１００ｎｍとする。つづいて全面にポジフォトレジスト２０７を塗布する（図１３（ｂ））。膜厚は１．８μｍとする。つづいて図１３（ｃ）のように、流路領域をマスク露光し（アレー領域を保護）、現像する。その後、ＣＶＤシリコン酸化膜２０６をバッファードフッ酸でウェットエッチングした（図１３（ｄ））。その後、有機洗浄によりポジフォトレジストを除去した後（図１４（ａ））、ＴＭＡＨ（テトラメチルアンモニウムハイドロキサイド）を用いてシリコン基板２０１をウェットエッチングする（図１４（ｂ））。つづいてＣＶＤシリコン酸化膜２０６をバッファードフッ酸でウェットエッチングして除去する（図１４（ｃ））。この状態の基板を炉に入れてシリコン熱酸化膜２０９を形成する（図１４（ｄ））。酸化膜の膜厚が２０ｎｍとなるように熱処理条件を選択する。このような膜を形成することにより、分離装置内に緩衝液を導入する際の困難を解消することができる。その後、ガラス２１０で静電接合を行いシーリングして分離装置を完成する（図１５）。
【０１２４】
以上のようにして作製した分離装置は、外観上、問題がないことを確認した。
【０１２５】
（外観観察）
図１４（ｄ）の状態の試料を電子顕微鏡により外観観察した。ただし、シリコン酸化膜の厚みは３０ｎｍとした。結果を図１０および図１６に示す。多数のピラーが規則正しく配列していることがわかる。各ピラーの平均間隔は６０ｎｍ程度である。
【０１２６】
実施例２
本実施例では、実施例１と同様のエッチング工程によりアスペクト比の異なる２種類のピラーを作製した後、これらを熱酸化したときの酸化の進行の程度について比較検討した。エッチングによりピラー形状に加工した後、試料１では、高さ４４０ｎｍ、ピラー間隔８０ｎｍであり、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されている（図２２）。一方、試料２では、高さ２００ｎｍ、ピラー間隔１００ｎｍであり、隣接する柱状体間に平坦な基板面が露出した状態となっている（図２６）。柱状体の断面形状は、いずれも、頂部よりも底部において幅広となっており、末広がりな形状となっている。
【０１２７】
各試料の断面を電子顕微鏡観察した結果を図２２〜２９に示す。試料１は図２２〜２５に、試料２は図２６〜２９に対応している。図中、「１０ｎｍ酸化」とは、ピラー側壁の酸化膜厚みが１０ｎｍとなる状態をいう。
【０１２８】
観察の結果、試料１ではピラー側壁の酸化膜厚みが増加しても、ピラー底部での酸化の進行は認められなかったのに対し、試料２では、２０ｎｍの酸化でピラーの側壁酸化はストップしているが、３０ｎｍ酸化では周囲の酸化が進んでいるためにピラーの高さが小さくなっている様子がわかる。
【０１２９】
以上のことから、ピラー断面形状を、頂部よりも底部において幅広にし、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成することによって、ばらつきの少ない高いアスペクト比のピラー群を好適に形成できることが確認された。
【０１３０】
実施例３
本実施例では、ピラーを高密度に形成した試料分離領域と、試料分離領域よりもピラーが疎に形成された調整領域と流路中の試料進行方向に対して交互に形成された構成を有している。試料分離領域は、電子線露光およびドライエッチングにより形成され、その領域サイズは４０μｍ×６０μｍである。
【０１３１】
試料分離領域内では、ピッチ１００ｎｍで、図３９のように三角格子状にピラーが並んでいる。各試料分離領域間には、ピラーが疎に並んでいる幅５０ｎｍ程度の調整領域が形成されている。
【０１３２】
この装置を用いて試料を分離した結果を図４０に示す。この図は、試料分離領域に試料を導入したときの試料の浸透の程度を経時的に観察した結果である。図中、左側から右側へ、時間が進行している。最上段の左端の分図が、開始時の状態を示す。試料が、試料分離領域の１段目を通過するのに０．７３秒、２段目を通過するのに０．１秒、３段目を通過するのに０．１２秒、４段目を通過するのに０．１５秒、５段目を通過するのに０．２秒を要した。各段階において、試料が試料分離領域に保持され、この間に壁面近傍と断面中央部との移動距離の差が解消され、試料液面先端が平面になっている。この結果、検出部でのバンドの形状が直線的となり、検出領域を広げることが可能となり検出感度を向上できた。
【０１３３】
このように、本実施例の構成を採用することにより、ピラーの直径や密度で、毛細管現象でバッファ溶液が浸透していくスピードを制御することができ、特に、１秒以下の速さで進行する現象を制御することが可能となる。ピラーの密度分布を最適に設計すると、サンプルローディングの均一性を向上できる。
【０１３４】
実施例４
本実施例の分離装置は次のようなプロセスで作製した。まず、図４５（ａ）に示すように、シリコン基板２０１上に膜厚３５ｎｍのシリコン酸化膜２０２を形成した。次に、膜厚５５ｎｍのカリックスアレーン電子ビームネガレジストを形成し、電子ビーム（ＥＢ）を用い、試料の流路となるアレー領域を露光した。現像はキシレンを用いて行い、イソプロピルアルコールによりリンスした。この工程により、図４５（ｂ）に示すように、パターニングされたレジスト２０４が得られた。次に、シリコン酸化膜２０２をＣＦ_４、ＣＨＦ_３の混合ガスを用いてＲＩＥエッチングした（図４５（ｃ））。続いて、レジストをアセトン、アルコール、水の混合液を用いた有機洗浄により除去した後、酸化プラズマ処理し、シリコン基板２０１をＨＢｒガスおよび酸素ガスを用いてＥＣＲエッチングした（図４６（ｄ））。その後、ＢＨＦバッファードフッ酸でウェットエッチングを行い、シリコン酸化膜を除去した。こうして得られた基板を炉に入れてシリコン熱酸化膜２０９を形成した（図４６（ｅ））。
【０１３５】
上記のようにして得られた基板の表面の走査型電子顕微鏡写真を図４２に示す。この基板におけるピラーの寸法は図４３に示されるとおり、ピラーの直径は約１５０ｎｍ、ピラーの高さは３７０ｎｍ、ピラーのピッチは３５０ｎｍであった。また、パッチ領域の幅は２５００ｎｍ、パッチ領域間の間隔は１０００ｎｍであった。
【０１３６】
なお、流路長は４０ｍｍ、流路幅は８０μｍ、流路の深さは３７０ｎｍであった。
【０１３７】
図４４は、本実施例の以降の工程を示す図であり、図４４（ａ）〜（ｃ）のいずれも左側が上面図を表し、右側が当該上面図のＡ−Ａ’断面図を表している。
【０１３８】
図４４（ａ）は、上記のようにして作製されたパッチ領域を備えた分離用流路７０１、液溜め７０２，７０３を備えた基板の上面図およびそのＡ−Ａ’断面図である。なお、図４４においてはピラーの表示を省略している。この基板上に、あらかじめ直径２ｍｍの穴部７０５が設けられたカバーガラス７０４を静電接合させた（図４４（ｂ））。続いて、図４４（ｃ）に示されるように、内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、高さ５ｍｍのガラス管７０６を穴部７０５の周囲にエポキシ樹脂により接着した。
【０１３９】
次に、１×ＴＢＥバッファ（０．０９Ｍトリスボレイト＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）をガラス管７０６から注入した。その後、２ｋｂｐのＤＮＡを含むバッファを一方のリザーバーから注入した。その後、両方のガラス管７０６から白金線を挿入し、電圧（６０Ｖ）を印加することによりＤＮＡを電気泳動させた。同様の操作を５ｋｂｐ、１０ｋｂｐのＤＮＡについても実施した。このときの各ＤＮＡの平均泳動速度を図５３のグラフに示した。ＤＮＡのサイズが大きいほど泳動速度が大きくなる傾向が明らかとなった。
【０１４０】
なお、ＤＮＡの泳動速度は次のような操作により決定した。ＤＮＡをあらかじめ蛍光色素ＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製）で処理しておき、蛍光顕微鏡で１０００倍に拡大した。得られた映像をイメージインテンシファイア（浜松ホトニクス社製）により感度増強し、個々のＤＮＡをトレースした。
【０１４１】
次に、統計的な傾向につき精査するために、５ｋｂｐおよび１０ｋｂｐのＤＮＡ各々１００個について、上記と同様の操作を実施した。図４８は電気泳動の際のＤＮＡの泳動速度分布を示したグラフである。１０ｋｂｐおよび５ｋｂｐのＤＮＡの平均泳動速度はそれぞれ４０μｍ／ｓ、３４μｍ／ｓであり、ＤＮＡのサイズによって、泳動速度分布の差が認められ、分離能を有することが示唆された。
【０１４２】
１００個ずつのＤＮＡについて計測した上記の結果では，両分子の速度分布の裾野が広く見えるが、次の理由で十分高い分離能を持つことが判明した。すなわち、トレースする分子数をＮとするとき、ピークの標準偏差は１／Ｎ^１／２に比例して小さくなることが知られている（中央極限定理）。一般に、電気泳動でできるバンドには約数十万個（１０の７乗個）のＤＮＡ分子が含まれるので、同数のＤＮＡについてトレースすれば、１００個の場合と比較して，ピークの標準偏差は１０００００^１／２分の１、すなわち０．００３倍程度に小さくなる。従って、上記分離結果のピークは極めて鋭いものになるに間違いないからである。
【０１４３】
そこで上記分離装置に、１０ｋｂｐ、５ｋｂｐのＤＮＡを含むバッファを適用してピークの保持時間を正確に計測してみたところ、表１に示すように、１０ｋｂｐ、５ｋｂｐのＤＮＡの保持時間がそれぞれ９９５秒、１１７０秒となり、互いに分離することが判明した。
【０１４４】
【表１】

【０１４５】
ここで、分離流路長１４ｍｍのアジレント社製の分離装置（バイオアナライザ）を用いたときの電気泳動分析結果を表２に示す。
【０１４６】
【表２】

【０１４７】
上記アジレント製の分離装置と比較するため、上記と同じ方法で流路長が２．８ｍｍの分離装置を作製し、１０ｋｂｐ、５ｋｂｐのＤＮＡを分析した。表３にその結果を示す。
【０１４８】
【表３】

【０１４９】
アジレント社の分離装置が異なる大きさのＤＮＡを２〜４秒の保持時間の差で分離している（表２）のに対し、本実施例の分離装置は、１０ｋｂｐおよび５ｋｂｐのＤＮＡを１２秒という長い保持時間差で分離している（表３）ことから優れた分離能を有していることがわかる。また、本実施例の分離装置は、アジレント社製の分離装置よりも短い分離流路により上記の分離能を実現していることから、理論段数の高い優れた分離装置であることが証明された。さらに、アジレント社製の分離装置はゲルを用いた電気泳動によるものであるため、１０ｋｂｐ程度またはそれ以上の大きさのＤＮＡは目詰まりが起こり得るため、分析することができない場合もある。一方、本実施例の分離装置の場合は、パッチ領域間に適度な間隔が設けられているため、比較的大きなＤＮＡはパッチ領域を回避しつつ、流路を通過することができる。そのため、目詰まりが生じることなく円滑に分析することが可能である。
【０１５０】
このように、本分離装置は優れた分離能を有し、その有用性が示された。
【０１５１】
実施例５
本発明の分離装置の性能をさらに確認するため、下記のような分離実験を行った。
【０１５２】
本実施例の分離装置は、長さ４２ｍｍ、幅８０μｍの分離用流路と、長さ１８ｍｍ、幅４０μｍの試料導入用流路が十文字状にクロスして設けられている。分離用流路内には、クロス点の下流、約３０μｍの位置から５．６ｍｍにわたってピラー領域を配設した。ピラー配設部は、図５１（ｃ）の平面図のように配置された、高さ約０．４μｍ、長さ３μｍの壁状ナノピラーから成る。各壁状ナノピラーは、７００ｎｍピッチでラダー状に設け、それらのラダー間に幅１２００ｎｍの溝が設けてある。これらの壁状ナノピラーは、ＥＢ露光とガスエッチングにより作製した。
【０１５３】
試料には、２ｋｂｐ、５ｋｂｐ、および１０ｋｂｐの長さのＤＮＡを用いた。観察のために、それぞれＹＯＹＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ社製）で染色して用いた。ＤＮＡの長さに関しては、蛍光の強度と分子形状から長さを容易に判別できるようにするという観点から選択した。これら３種類の長さのＤＮＡを含む試料を、次の手順でパルス状に分離用流路に導入した。パルス状に導入するため、まず試料を試料導入用流路の一端に導入し、その端を−５０Ｖ、他端を＋３０Ｖになるように電圧を印加して試料導入用流路に試料を導入した。この時、分離用流路の両端には−４０Ｖの電圧を印加して、試料導入用流路から分離用流路への試料の拡散が生じないようにした。次に、０．５秒間だけ試料導入用流路にかけた電圧を反転させて、試料を引き戻すことにより、分離用流路にかかる部分の試料の幅を細くした。最後に、試料導入用流路の両端を−１５Ｖ、分離用流路の遠位端を０Ｖ、近位端を−１０Ｖにセットすることで、試料導入用流路から分離用流路へ試料がさらに引き込まれることを防ぎつつ、試料導入用流路と分離用流路の交点に存在する試料の細いパルス状のバンドだけを分離用流路に導入した。
【０１５４】
導入された試料は、分離用流路を通過するに従って、３種の長さのＤＮＡそれぞれが構成する３つのバンドに分離された。試料導入用流路と分離用流路のクロス点から下流に１ｍｍの位置において次の手法で蛍光量を実測した。蛍光顕微鏡を用い、染色したＤＮＡを蛍光ランプで励起するとＤＮＡの長さに応じて蛍光を発する。この蛍光を、蛍光顕微鏡に取り付けたフォトマルチプレクサ（浜松ホトニクス社製 Ｈ７４６７）で受け、その強度信号を記録した。同時に、流れている分子をハーフミラーを介して１０００倍にて観察し、どの長さのＤＮＡが通過しているかについても確認を行った。
【０１５５】
図５７は、フォトマルチプレクサの信号強度（フォトンカウント）を縦軸、試料の導入からの経過時間を横軸としたグラフである。試料が導入された時点から、まず１０ｋｂｐのＤＮＡが１６０秒で最初にピークを形成し、ついで２２０秒後に５ｋｂｐのＤＮＡが、そして２９０秒後に２ｋｂｐのＤＮＡがピークを形成し、３種類の長さのＤＮＡが明瞭に分離されていることがわかる。この結果から、この分離装置においては、サイズの大きな分子ほど分離用流路を速く通過することが示され、目詰まりをおこしにくいゲル濾過的分離機構を実現していることが明らかとなった。さらに、この分離結果をもとに理論カラム高さ（ＨＥＴＰ：ｈｅｉｇｈｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐｌａｔｅ）を計算した結果、２ｋｂｐのＤＮＡについては、４．８５μｍ、１０ｋｂｐのＤＮＡについては０．８１μｍという結果が得られた。理論カラム高さは、分離装置の分離能を計る指標の１つで、その長さが短いほど高い分離能である。通常のゲルろ過カラム、例えば、ＤＮＡを含む生体高分子の分離に用いられるカラムの理論カラム高さは、概ね１０μｍ〜１００μｍである。例えば、市販のカラム、Ｏｈｐａｃｋ ＳＢ−８０シリーズ（昭和電工株式会社製）の理論カラム高さは、２５μｍであり、同社の高分解能カラムＧＰＣ ＫＦ−４０シリーズでも１０μｍであることから、本発明の分離装置は、理論カラム高さの観点から、それらのカラムよりも優れた分離能を持つことが明らかである。
【０１５６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、試料分離領域中に、多数の柱状体が所定の間隔で配設されてなる柱状体配設部を設けており、また、柱状体の表面が親水性膜で覆われているため、目詰まり等の問題を生じることなく様々なサイズの物質を含む試料を短時間かつ優れた分解能で分別できる。また核酸やタンパク質等のサイズの小さい分子を少量の試料で短時間に優れた分解能で分別できる。
【０１５７】
また本発明によれば、試料分離領域中に、多数の柱状体が配設された柱状体配設部を複数形成し、柱状体の表面が親水性膜で覆われており、また、隣接する柱状体配設部間に前記試料が通過するパスを設けた構成を採用しているため、サイズの分布が広い試料についても、目詰まりの発生やスループットの低下をもたらすことなく高い分解能で分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る分離装置の一例を示す図である。
【図２】図１中の分離用流路の構造を詳細に示した図である。
【図３】図１中の分離用流路の構造を詳細に示した図である。
【図４】試料の分離方式を説明するための図である。
【図５】試料の分離方式を説明するための図である。
【図６】ピラーパッチの配置を示す平面図である。
【図７】ピラーパッチの配置を示す平面図である。
【図８】電気浸透流を調節するための補正電圧の印加方法を示す図である。
【図９】チップに緩衝液を導入する方法を説明する図である。
【図１０】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図１１】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１２】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１３】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１４】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１５】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１６】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図１７】本発明に係るナノ構造体の断面図である。
【図１８】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図１９】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図２０】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図２１】本発明の分離装置の製造方法を説明するための図である。
【図２２】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２３】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２４】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２５】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２６】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２７】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２８】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図２９】電子顕微鏡によるピラーの外観観察結果を示す図である。
【図３０】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３１】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３２】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３３】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３４】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３５】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３６】本発明の分離装置の一例を示す図である。
【図３７】流路構造の一例を示す図である。
【図３８】流路構造の一例を示す図である。
【図３９】本発明の分離装置中の試料分離領域の外観を示す電子顕微鏡写真である。
【図４０】本発明の分離装置を用いた試料の分離の様子を示す図である。
【図４１】本発明の分離装置に用いるジョイントの具体的な構造を示す図である。
【図４２】本発明の分離装置の表面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図４３】本発明の分離装置におけるピラーの寸法を示した図である。
【図４４】本発明の分離装置の作製の工程を説明するための図である。
【図４５】本発明の分離装置の作製の工程を説明するための図である。
【図４６】本発明の分離装置の作製の工程を説明するための図である。
【図４７】本発明の一実施形態を示した図である。
【図４８】本発明の分離装置におけるＤＮＡの泳動速度分布を示したグラフである。
【図４９】本発明の一実施形態を示した図である。
【図５０】本発明の一実施形態を示した図である。
【図５１】本発明の一実施形態を示した図である。
【図５２】本発明の分離装置の作製の工程を説明するための図である。
【図５３】本発明の分離装置におけるＤＮＡの平均泳動速度を示したグラフである。
【図５４】本発明の一実施形態を示した図である。
【図５５】本発明の実施形態の一例における液溜めの構造を説明するための図である。
【図５６】本発明の実施形態の一例における液溜めの構造を説明するための図である。
【図５７】本発明の分離装置におけるＤＮＡの分離データを示すグラフである。
【符号の説明】
１ サンプル溜め
２ 投入用ポンプ
３ 定速注入装置
４ 電磁弁
５ 電磁弁
６ 廃液溜め
７ 液溜め
８ 分離用ポンプ
９ 定速注入装置
１０ 電磁弁
１１ 電磁弁
１２ オートサンプラー
１３，１４，１５，１６ チューブ
１７ ジョイント
１９ 投入用流路
２０ 分離用流路
２１ 制御ユニット
１０１ａ、ｂ 液溜め
１０２ａ、ｂ 液溜め
１０３ａ、ｂ 液溜め
１０４ シリコン酸化膜
１０５ シリコン酸化膜
１０６ 金型
１０７ レジスト膜
１１０ 基板
１１１ 投入用流路
１１２ 分離用流路
１１３ 検出部
１１４ 回収用流路
１２０ 基板
１２１ ピラーパッチ
１２２ 被覆部
１２３ 流路
１２５ ピラー
１２９ 流路の壁
１３０ パッチ領域
１５０ チップ
１５１ 遠心管
１５３ ホルダー
１６０ 樹脂膜
２０１ シリコン基板
２０２ シリコン酸化膜
２０３ カリックスアレーン電子ビームネガレジスト
２０４ パターニングされたレジスト
２０５ ポジフォトレジスト
２０６ ＣＶＤシリコン酸化膜
２０７ ポジフォトレジスト
２０９ シリコン熱酸化膜
２１０ ガラス
５０２ 一時停止スリット
５０３ サンプル保持部
５０４ バッファー導入部
５０５ 一時停止スリット
５０６ 分離部
５０７ 一時停止スリット
５０９ 投入穴
５１０ バッファー注入口
５２０ サンプル注入口
５３０ サンプル定量管
５４０ 分離用流路
５５０ 基板
５６０ 空気穴
５７０ サンプル投入管
５８０ 排出口
６０１ 試料分離領域
６０２ スリット
６０３ 壁
７０１ 分離用流路
７０２，７０３ 液溜め
７０４ カバーガラス
７０５ 穴部
７０６ ガラス管
７０７ 多結晶シリコン膜
７０８ 酸化膜
７０９ 分離対象の分子群
７１０ ピラー列
７１１ 分離領域
７１２ 小さなピラーパッチ
７１３ 中程度のピラーパッチ
７１４ 大きなピラーパッチ
８０１ 被覆
８０２ 開口部
８０３ 伝導路
８０４ 電極板
９００ レジスト[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an apparatus and a method for separating a sample, and more particularly, to substances including nucleic acid fragments of various sizes on a micro scale, for example, cells, nucleic acid fragments, or organic molecules such as amino acids, peptides, and proteins. The present invention relates to a separation apparatus and a separation method suitable for use when separating metal ions, colloids, latex beads and the like.
[0002]
[Prior art]
In the analysis of biological substances such as cells, nucleic acids, and proteins, operations of separating and purifying a sample in advance and separating the sample according to size and charge are performed. For example, in the Maxam-Gilbert method, which is widely used as a nucleotide sequencing method, one end of DNA is labeled with 32P, and this is chemically degraded so as to obtain fragments of various lengths, and then these are electrolyzed. Separation is performed by electrophoresis, followed by autoradiography to read the base sequence. Such a separation operation is an important factor for determining the length of the analysis time, and reducing the time required for the separation is an important technical problem in this field. For this purpose, there has been a demand for the development of a separation apparatus which has a sufficiently high separation ability and, as a result, can accurately separate a desired substance even in a short time.
[0003]
Conventionally, ultracentrifugation devices and capillary electrophoresis devices have been widely used as separation devices. However, ultracentrifugation devices and capillary electrophoresis require a long time for separation and require a large amount of sample. Also, the resolution is not always at a satisfactory level.
[0004]
On the other hand, as a device for separating a target substance, US Pat. No. 5,837,115 discloses a separation device in which many obstacles are arranged in an array. Examples of cells to be separated include cells, viruses, macromolecules, microparticles, and the like. However, this technique still has room for improvement in the following points.
[0005]
First, macromolecules and particles may cause clogging, which limits the improvement of throughput. Secondly, it is difficult to precisely manufacture a large number of obstacles at narrow intervals, and thus it is difficult to sufficiently reduce the distance between the obstacles. In particular, it was extremely difficult at the time of the state of the art to precisely manufacture a large number of obstacles at intervals of 200 nm or less. Therefore, its application range was limited to a certain one.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a separation technique that can separate samples containing substances of various sizes in a short time and with excellent resolution, and at the same time, cause less problems such as clogging. I do. It is another object of the present invention to provide a technique capable of separating small-sized substances such as nucleic acids and proteins with a small amount of sample in a short time with excellent resolution.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
According to the present invention, there is provided a separation device including a flow path through which a sample passes and a sample separation area provided in the flow path, wherein the sample separation area has a plurality of columnar bodies. Including the installation part Only, the surface of the columnar body was covered with a hydrophilic film A separating device is provided.
[0008]
Further, according to the present invention, a channel through which a sample formed of a groove formed on the substrate passes, a sample introduction unit for guiding the sample to the channel, and a sample provided in the channel, the sample is divided into a plurality of components. A sample separation region to be separated; and a sample collection unit that analyzes or sorts the sample separated in the sample separation region. The sample separation region includes a plurality of columnar bodies formed on the inner wall of the flow channel. Including the columnar part Only, the surface of the columnar body was covered with a hydrophilic film A separating device is provided.
[0009]
In this separation apparatus, a columnar body provided with a plurality of columnar bodies is used as a sample separation region. The gap between adjacent columns acts as a sieve. In the present invention, since the sample is separated by such a method, various minute-sized substances such as nucleic acids and proteins, which were conventionally difficult to separate, can be separated and separated. Note that, in the present invention, the plurality of pillars refers to a number of pillars that can secure a separating function.
[0010]
Also, Separation device of the present invention Is , Wherein the surface of the columnar body is covered with a hydrophilic film Has become . As the hydrophilic film, for example, an oxide film of the material constituting the columnar body can be used. Specifically, a structure in which silicon is used as a substrate material and a silicon oxide film is provided as a hydrophilic film on the surface of the columnar body can be used. When separating a sample, it is necessary to introduce a buffer solution (aqueous solution) or the like into the apparatus. With the above configuration, a buffer solution or the like can be smoothly introduced into the apparatus. When the interval between the columnar bodies is 200 nm or less, or even 100 nm or less, it becomes difficult to introduce a buffer solution or the like used for separating the sample into the apparatus. However, formation of the hydrophilic film eliminates such difficulties. . In addition, even when the apparatus is actually used by introducing a buffer solution or the like, effects such as suppressing the formation of voids and smoothing the flow of the sample can be obtained.
[0011]
In the separation device of the present invention, a configuration in which the cross-sectional shape of the columnar body is wider at the bottom than at the top can be adopted. By doing so, a columnar body having a high aspect ratio can be formed with good controllability, and variations in the aspect ratio of each columnar body can be effectively reduced. For example, in the case where a pillar is heat-treated to form an oxide film on its surface, if the pillar is a rectangular parallelepiped, the pillar progresses on the bottom surface of the concave portion between adjacent pillars, and a desired thickness is formed on the sidewall of the pillar. If an oxide film is to be formed, the oxide film on the bottom surface of the concave portion becomes too thick, the height of the columnar body is substantially reduced, and the aspect ratio is lower than before oxidation. On the other hand, if the above-described configuration is adopted, the progress of oxidation near the bottom of the columnar body can be suppressed, and thus, a columnar body having a small variation and a high aspect ratio can be formed.
[0012]
In the separation device of the present invention, the plurality of columnar bodies may adopt a configuration in which side surfaces of adjacent columnar bodies are formed close to each other at the bottom of the columnar bodies so as to be in contact with each other. By doing so, enlargement of the oxide film on the bottom surface of the concave portion between the adjacent columnar bodies is suppressed, and a columnar body having a small aspect ratio and a high aspect ratio can be formed. If the distance between adjacent pillars is large, a flat substrate surface is exposed between the adjacent pillars, and the thickness of the oxide film increases in this part, resulting in a decrease in the aspect ratio of the pillars. Become. On the other hand, when the above configuration is adopted, the bottom surface of the concave portion between the adjacent columnar bodies is no longer a flat surface but usually a curved surface. For example, in FIG. 17, the columnar bodies are conical, and each columnar body is arranged close to each other, and the concave portion between them has a curved surface at the tip. When oxidation proceeds on such a curved surface, volume expansion due to oxidation is suppressed by the curved surface shape, and it is considered that a compressive stress is generated in this portion. When such compressive stress is generated, the progress of oxidation accompanied by volume expansion is suppressed, and as a result, the oxidation stops at the stage where the thickness of the bottom surface of the concave portion becomes equal to that of the thin film or the side surface of the columnar body. As a result, a columnar body having a small variation and a high aspect ratio can be formed.
[0013]
The separation device of the present invention expresses high separation performance by arranging a plurality of columnar bodies having a high aspect ratio in a dense manner. The fact that each column can be formed in a uniform shape and size facilitates optimum design and manufacture. From such a viewpoint, forming the columnar body to have a divergent shape and forming the side surfaces of adjacent columnar bodies so close to each other at the bottom of the columnar body greatly contribute to improving the performance of the separation device.
[0014]
The formation of the columnar bodies at such narrow intervals could not be achieved by the prior art, but the present inventor uses a separation apparatus having such a structure by using a calixarene of a resist for fine processing as described later. It has been found that it can be manufactured by forming a columnar body using electron beam lithography technology. An example of the molecular structure of calixarene is shown below. Calixarene is used as a resist for electron beam exposure, and can be suitably used as a resist for nanofabrication.
[0015]
Embedded image

[0016]
In the separation apparatus of the present invention, it is possible to adopt a configuration in which the sample separation region includes a plurality of the columnar body arrangement portions, and a path through which the sample passes is provided between adjacent columnar body arrangement portions.
[0017]
The apparatus having such a configuration separates a sample according to a principle different from that of the conventional technique disclosed in the aforementioned US Pat. No. 5,837,115. In the technology represented by US Pat. No. 5,837,115, a substance having a larger molecular size has a greater degree of being inhibited from passing by an obstacle. Thus, the larger sized material is separated in a manner that is later discharged than the smaller sized material. On the other hand, in the apparatus of the present invention, as the size of the substance to be separated is smaller, the substance is trapped in the columnar body in the sample separation region and passes through a longer path. That is, the smaller sized material is separated in a form that is later discharged than the larger sized material. Larger substances pass through the separation area relatively smoothly, thus reducing clogging problems and significantly improving throughput. In particular, in the separation of nucleic acids and proteins, the radius of inertia of the molecule is extremely wide, so large-sized substances are easily clogged, and once such substances are clogged, they can be desorbed even after washing. It will be difficult. According to the present invention, since such a problem is solved, it can be suitably applied to separation of nucleic acids, proteins, and the like.
[0018]
In the present invention, the width of the path may be configured to be larger than the average interval between the pillars in the pillar-arranged portion. In this way, the large-sized substance smoothly passes through the path portion in the sample separation region, and the small-sized substance passes through the columnar portion, and after a long path according to the size, Pass through the sample separation area.
[0019]
Here, the interval between the pillars in the pillar-arranged portion can be set to an arbitrary value for each pillar-arranged portion. Therefore, in the present invention, two types of parameters, ie, the distance between the columns in the columnar arrangement portion and the width of the path can be arbitrarily set, whereby clogging can occur even for a sample having a wide size distribution. And high resolution can be achieved without lowering the throughput. For example, in order to separate small-sized molecules with high resolution, the interval between the columnar bodies is reduced to the order of several nanometers to several tens of nanometers, while the width of the path in the sample separation region is increased to increase the size of the large-sized molecules. Molecules can be smoothly moved to prevent clogging and a decrease in separation efficiency.
[0020]
Further, the path may be provided in a direction different from the sample traveling direction of the flow path. By doing so, the frequency of contact between the molecules contained in the sample and the columnar portion is increased. Accordingly, the probability that molecules having a size smaller than the interval between the columns constituting the columnar portion are trapped by the columnar portion is increased, and the separation ability is further improved. Specifically, the angle between the sample traveling direction and the direction of the path is preferably 10 to 80 degrees, and more preferably 30 to 60 degrees. If the angle between the sample traveling direction and the path direction is too small, the contact frequency between the molecules included in the sample and the columnar portion cannot be sufficiently ensured. On the other hand, if the angle between the sample traveling direction and the direction of the path is too large, the throughput of the sample decreases because the flow velocity of the sample decreases.
[0021]
In the above-mentioned separation device, the average interval between the columns in the column-arranged portion can be 100 nm or less. Here, “spacing” refers to the distance between the centers of the columnar bodies. In this case, since the interval between the columnar bodies is extremely narrow, various substances that have been difficult to separate can be separated and separated. For example, when separating proteins and nucleic acids, a structure having minute gaps on the order of several hundred nanometers or less is essential. In a structure in which only large gaps are provided, the gaps cannot sufficiently function as a sieve because they are too large for the molecular size of nucleic acids or proteins. Further, the average interval between the columnar bodies in the columnar body arrangement portion can be set to 70 nm or less. In this case, more precise analysis can be realized.
Further, the width of the path and the distance between the columnar bodies can be appropriately selected in consideration of the median M, the standard deviation σ, and the like of the sizes of a plurality of components included in the sample to be separated. By doing so, the separation efficiency can be optimized. For example, the interval between the pillars can be M, and the width of the path can be M + 2σ. Further, the interval between the columnar bodies can be set to 2M, and the width of the path can be set to 2M + 2σ.
[0022]
Further, in the above-described separation apparatus, the density of the plurality of pillars constituting the pillar-arranged portion may be gradually reduced in the flow direction of the sample in the flow path. By doing so, the residence time of the molecules trapped in the columnar body arrangement part in the columnar body arrangement part becomes longer, so that the difference in the retention time between the molecules not trapped in the columnar body arrangement part and the molecules is remarkable. . Therefore, it is possible to improve the separation ability.
[0023]
Conversely, in the above-described separation apparatus, the density of the plurality of pillars constituting the pillar-arranged portion can be gradually increased in the flow direction of the sample in the flow path. In this case, since clogging in the columnar body arrangement portion is suppressed, throughput can be improved.
[0024]
Further, in the separation device, the top of the columnar body and the wall surface of the flow path may be separated from each other. By doing so, the number of passage paths for large-sized molecules increases, which contributes to the elimination of clogging. In addition, since even small-sized molecules can enter from above the columnar portion, the chances of being captured by the columnar portion increase. For this reason, the effect of further improving the separation ability can be obtained.
[0025]
According to the present invention, there is provided the above-described separation device, further comprising a weir portion in which the columnar bodies are arranged in a line. This separation device can accumulate the diffused sample in a certain area adjacent to the dam section. Prior to separation, accumulating the sample in a certain area and narrowing the band of the sample is advantageous for improving the separation ability.
[0026]
In the above separation apparatus, the dam section may be arranged adjacent to the sample separation region. According to this separation device, the band of the sample can be narrowed before the sample passes through the sample separation region, so that the separation ability is improved. Therefore, high-precision separation can be realized.
[0027]
According to the present invention, there is provided the above-mentioned separation device, wherein the surface of the inner wall of the flow path is subjected to a hydrophilic treatment. In this separation device, molecules contained in the sample are hardly adhered, so that a good separation ability can always be exhibited.
[0028]
The pillars constituting each pillar-arranged portion may be formed at the same size and at equal intervals. By doing so, the sensitivity of separation at the columnar body arrangement portion can be increased. The resolution improves as the number of pillars in the pillar-arranged portion increases.
[0029]
The pillar-arranged portions may be constituted by pillars of different sizes. That is, it is also possible to adopt a configuration in which the columnar bodies are formed with different sizes and intervals in each columnar body disposing portion. In this way, even a sample having an extremely wide size distribution can be separated at a high resolution without causing clogging or a decrease in throughput.
[0030]
In the separation device of the present invention, it is possible to adopt a configuration further provided with an external force applying means for applying an external force to the sample and moving the sample in the flow path. With this configuration, the separation accuracy and the time required for the separation can be appropriately set in accordance with the degree to which the external force is applied. Here, it is convenient to use a pressure or an electric field as the external force. This is because a large external force applying member is unnecessary. Further, the sample can be moved by utilizing the capillary phenomenon. In this case, no external force applying means is required, which is advantageous for miniaturization of the device.
[0031]
Samples to be separated in the separation apparatus of the present invention include nucleic acids including nucleic acid fragments of various sizes on a minute scale, or organic molecules such as amino acids, peptides, and proteins, metal ions, colloids, latex beads, and the like. No. Among them, for example, when nucleic acid or protein is used as a sample, it is more effective. When separating these samples, small-sized molecules must be separated at a high resolution, and thus a structure having minute gaps on the order of several hundred nanometers or less is essential. On the other hand, it is also required to effectively suppress clogging by a huge substance. According to the present invention, since both of these requirements can be sufficiently satisfied, it is suitable for separating nucleic acids or proteins.
[0032]
In the separation device, the sample separation region may be configured to be divided into a plurality of parts via slits. The slit may be single or plural. Further, in the separation device, the sample separation region and the adjustment region in which the columnar body is formed more sparsely than the sample separation region are alternately formed in the sample traveling direction in the flow path. be able to.
[0033]
With such a configuration, the shape of the band in the detection unit becomes linear, the detection area can be expanded, and the detection sensitivity can be improved.
[0034]
Further, according to the present invention, a nanostructure in which a plurality of pillars are arranged on the substrate surface, wherein the cross-sectional shape of the pillar is wider at the bottom than at the top, and The columnar body is provided with a nanostructure characterized in that side surfaces of adjacent columnar bodies are formed close to each other at the bottom of the columnar body so as to be in contact with each other.
[0035]
As described above, this structure can suppress the progress of oxidation near the bottom of the columnar body, thereby forming a columnar group having a small aspect ratio and a high aspect ratio. For this reason, a structure suitable as a member of the separation device can be obtained, and it can be suitably applied as a constituent member of various elements.
[0040]
Note that the separation device in the present invention only needs to have a sample separation region, and the sample introduction region and the external force applying means may not be provided in the device itself. For example, the separation device in the present invention may be a disposable cartridge type, and may be used by incorporating it into a predetermined unit.
[0043]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the flow path and the sample separation region can be formed on the surface of a silicon substrate, a glass substrate such as quartz, or a resin substrate such as a silicon resin. For example, a groove can be provided on the surface of these substrates, sealed with a surface member, and a flow path and a sample separation region can be formed in a space surrounded by the grooves.
[0044]
The columnar body in the present invention can be formed, for example, by etching the substrate into a predetermined pattern shape, but the manufacturing method is not particularly limited.
[0045]
The columnar body includes various shapes such as a pseudo columnar shape such as a circular column and an elliptical column; cones such as a cone, an elliptical cone, and a triangular pyramid; prisms such as a triangular column and a quadrangular column; The size of the columnar body is, for example, about 10 to 200 nm in width and about 10 to 1000 nm in height.
[0046]
The interval between adjacent columnar bodies is appropriately set according to the purpose of separation. For example,
(I) Separation and concentration of cells and other components
(Ii) Separation and concentration of solids (cell membrane fragments, mitochondria, endoplasmic reticulum) and liquid fraction (cytoplasm) among components obtained by disrupting cells
(Iii) Separation and concentration of high molecular weight components (DNA, RNA, proteins, sugar chains) and low molecular weight components (steroids, glucose, etc.) among the components of the liquid fraction
In such processing,
In the case of (i), 1 μm to 10 μm,
In the case of (ii), 100 nm to 1 μm,
In the case of (iii), 1 nm to 100 nm,
It can be.
[0047]
In the present invention, one or two or more columnar portions can be provided in the sample separation region. The column groups included in the column-arranged portion may have the same size and may be formed regularly at substantially equal intervals, or column members of different sizes may be formed at arbitrary intervals. The column group in each column arrangement portion can be formed with different sizes and intervals.
[0048]
A path through which the sample can pass is formed in the space between the adjacent columnar bodies. Here, if the interval between the columnar bodies is made larger than the interval between the columnar bodies, huge-sized molecules and the like can be smoothly moved, so that the separation efficiency can be further improved.
[0049]
Hereinafter, embodiments of the present invention will be further described with reference to the drawings. In the embodiments, the “pillar” is shown as one form of a columnar body, and refers to a minute columnar body having a cylindrical or elliptical column shape. Further, the “pillar patch” and the “patch region” are shown as one form of the pillar-arranged portion, and refer to a region where many pillars are formed in a group.
[0050]
FIG. 1 is a diagram showing an example of the separation device according to the present invention. A separation channel 112 is formed on the substrate 110, and an input channel 111 and a recovery channel 114 are formed so as to intersect with the separation channel 112. The reservoirs 101a, b, 102a, b, 103a, and b are formed at both ends of the charging channel 111, the separating channel 112, and the collecting channel 114, respectively. Each of the liquid reservoirs is provided with an electrode, which can be used, for example, to apply an electric field to both ends of the separation channel 112.
[0051]
Further, a detection unit 113 is provided in the separation channel 112. Appropriate values are selected for the external dimensions of the apparatus depending on the application, but usually, as shown in the figure, values of 5 mm to 5 cm in length and 3 mm to 3 cm in width.
[0052]
Here, the structure of the liquid reservoir provided with the above-described electrodes will be described with reference to FIGS. FIG. 55 is an enlarged view of the vicinity of the liquid reservoir 101a in FIG. FIG. 56 is a sectional view taken along the line AA ′ in FIG. On the substrate 110 provided with the separation channel 112 and the liquid reservoir 101a, a coating 801 provided with an opening 802 for allowing a buffer solution to be injected is provided. In addition, a conductive path 803 is provided on the cover 801 so that the conductive path 803 can be connected to an external power supply. Further, as shown in FIG. 56, the electrode plate 804 is disposed along the wall surface of the liquid reservoir 101a and the conduction path 803. The electrode plate 804 and the conductive path 803 are crimped and electrically connected. The other reservoirs have the same structure as described above.
[0053]
Returning to FIG. 1, a method for separating a sample using this apparatus will be described. First, a sample is injected into the liquid reservoir 102a or the liquid reservoir 102b. When the liquid is injected into the liquid reservoir 102a, a voltage is applied so that the sample flows toward the liquid reservoir 102b. When the liquid is injected into the liquid reservoir 102b, a voltage is applied so that the sample flows toward the liquid reservoir 102a. As a result, the sample flows into the charging channel 111, and as a result, fills the entire charging channel 111. At this time, on the separation channel 112, the sample exists only at the intersection with the input channel 111, and forms a band as narrow as the width of the input channel 111.
[0054]
Next, the voltage application between the liquid reservoirs 102a and 102b is stopped, and a voltage is applied between the liquid reservoirs 101a and 101b so that the sample flows in the direction of the liquid reservoir 101b. As a result, the sample passes through the separation channel 112, during which the sample travels through the separation channel 112 at a speed corresponding to the size of the molecule, the strength of the charge, and the size of the gap between the columnar bodies. go. As a result, different molecular groups in the sample are separated into bands that move at different speeds. When these separated bands reach the detection unit 113, they are detected by optical or other physicochemical methods. Optical detection refers to, for example, binding a fluorescent substance to a molecule, irradiating a laser in the detection unit 113, and observing fluorescence emitted from the molecule. The separated bands can be further collected for each band. When the desired band has passed through the detection unit 113, the application of the voltage between the liquid reservoirs 101a and 101b is stopped, and the voltage is applied between the liquid reservoirs 103a and 103b instead. Then, the band existing in the intersection of the separation channel 112 and the collection channel 114 flows into the collection channel 114. When the voltage application between the liquid reservoir 103a and the liquid reservoir 103b is stopped after a certain period of time, desired molecules contained in the separated band are collected in the liquid reservoir 103a or the liquid reservoir 103b.
[0055]
The above-described apparatus employs a method of moving a sample by applying an electric field, but may employ a method of applying pressure instead of applying an electric field. FIG. 30 shows an example of such an apparatus. A joint scalpel is fixed to the liquid reservoir at the end of the input channel and the separation channel of the separation chip. To each joint female, a joint male to which hollow tubes 13, 14, 15, 16 are connected is connected. The reason for using the joint is to prevent liquid leakage. The specific structure of the joint is, for example, as shown in FIG.
[0056]
The tubes connected to the joint male are connected to the solenoid valves 10, 4, 5, and 11, respectively. The buffer is supplied to the solenoid valve 10 from the liquid reservoir 7 via the separation pump 8 and the constant speed injection device 9. A sample is supplied from the sample reservoir 1 to the solenoid valve 4 via the charging pump 2 and the constant-speed injection device 3. The sample sent through the charging channel 19 is supplied to the solenoid valve 5, and is guided to the waste liquid reservoir 6. The sample separated via the separation channel 20 is supplied to the solenoid valve 11, and collected by the autosampler 12.
[0057]
The control unit 21 controls the operation points of the solenoid valves 4, 5, 10, 11, the separation pump 8, the charging pump 2, the constant speed injection device 9, and the constant speed injection device 3.
[0058]
The separation and recovery procedure using this device is as follows. First, the solenoid valves 10 and 11 are closed. This can prevent the sample from flowing into the separation channel 20 from the charging channel 19. Next, the solenoid valves 4 and 5 are opened. Then, the sample is put into the sample reservoir 1.
[0059]
Next, the sample is pressurized by the charging pump 2, and the sample is guided to the charging channel 19 via the constant speed injection device 3, the electromagnetic valve 4, and the tube 14. The sample leaked through the charging channel 19 is guided to the waste liquid reservoir 6 through the tube 15 and the electromagnetic valve 5.
[0060]
After the charging channel 19 is filled with the sample, the solenoid valves 4 and 5 are closed, and the solenoid valves 10 and 11 are opened. Subsequently, the buffer is pressurized by the separation pump 8, and the sample is guided to the separation channel 20 via the constant speed injection device 9, the solenoid valve 10, and the tube 13. Thus, the separation operation starts. The substance separated from the end of the separation channel 20 flows out together with the buffer via the tube 16 and the electromagnetic valve 11, and is collected at regular intervals by the autosampler 12.
[0061]
According to such a procedure, the sample is separated. In this device, pressure is used as an external force for moving the sample, so that a relatively simple external force applying device may be provided, which is advantageous in reducing manufacturing costs and miniaturizing the device.
[0062]
In the above apparatus, pressure is used as an external force for moving the sample, but a method of moving the sample by utilizing a capillary phenomenon instead of the pressure may be adopted. In this case, there is no need to apply an external force such as electric power or pressure, and thus no driving energy is required. Hereinafter, an example of an apparatus utilizing the capillary phenomenon will be described with reference to FIG. A separation pillar is arranged in the separation channel 540. An air hole 560 is provided at one end of the separation channel 540, and a buffer inlet 510 for injecting a buffer at the time of separation is provided at the other end. The separation channel 540 is sealed at a portion other than the buffer inlet 510 and the air hole 560. A sample quantification tube 530 is connected to the starting portion of the separation channel 540, and a sample injection port 520 is provided at the other end of the sample quantification tube 530.
[0063]
A quantification pillar is arranged in the sample quantification tube 530. Quantitative pillars are less sparse than separating pillars, where no separation of the sample occurs. Portions of the sample quantitative tube 530 other than the sample inlet 520 are sealed.
[0064]
FIG. 32 is an enlarged view of the vicinity of the sample quantification tube 530. A pause slit 502 separates the quantitation pillar inside the sample quantification tube 530 from the sample holding unit 503. The sample holding unit 503 is provided with more dense pillars than the pillars provided in the buffer introduction unit 504 and the separation unit 506. Pillars equivalent to separation pillars are installed in the buffer introduction section 504. The sample holding unit 503, the buffer introduction unit 504, and the separation unit 506 are separated by temporary stop slits 505 and 507. The void volume of the sample holding unit 503 is substantially equal to the sum of the void volume of the sample quantitative tube 530 and the volume of the temporary stop slit 502. The width of the pause slit 505 is smaller than the width of the pause slit 502.
[0065]
Next, the procedure of the separation operation using the apparatus of FIG. 31 will be described. First, a sample is gradually injected into the sample inlet 520 to fill the sample metering tube 530. At this time, make sure that the water surface does not rise. In this sample injection operation, the sample is held between the sample quantification pillars installed in the sample quantification tube 530 shown in FIG. After the sample metering tube 530 is filled with the sample, the sample gradually seeps into the pause slit 502. When the sample that has permeated into the pause slit 502 reaches the surface of the sample holding unit 503, all of the sample inside the pause slit 502 and the sample quantification tube 530 is sucked into the sample holding unit 503 having a larger capillary effect. . The reason why the sample holding unit 503 has a larger capillary effect than the sample quantitative tube 530 is that the sample holding unit 503 has a denser pillar and a larger surface area. During the filling of the sample into the sample holding unit 503, the temporary stop slits 505 and 507 exist, so that the sample does not flow into the buffer introduction unit 504 or the separation unit 506.
[0066]
After the sample is introduced into the sample holding unit 503, a separation buffer is injected into the buffer inlet 510. The injected buffer is temporarily filled in the buffer introduction unit 504, and the interface with the sample holding unit 503 becomes linear. When the buffer is further filled, the buffer is exuded into the temporary stop slit 505, flows into the sample holding unit 503, and proceeds to the separation unit 506 through the temporary stop slit 507 while dragging the sample. At this time, since the width of the pause slit 502 is larger than the widths of the pause slits 505 and 507, even if the buffer flows backward to the pause slit 502, the sample has already progressed ahead of the sample holding unit 503. There is very little backflow of the sample.
[0067]
The separation buffer further proceeds by capillary action toward the separation part 506 toward the air hole 560, and in this process, the sample is separated. When the separation buffer reaches the air hole 560, the inflow of the buffer is stopped. At the stage where the flow of the buffer is stopped or the stage where the buffer is in progress, the separation state of the sample is measured.
[0068]
The above embodiment is an example of the quantitative injection of the sample using the capillary phenomenon. Another example of the sample injection utilizing this principle will be described with reference to FIGS. In this apparatus, a sample introduction tube 570 is provided instead of the sample quantification tube 530 in FIG. A sample inlet 520 and an outlet 580 are provided at both ends of the sample inlet tube 570. No pillar is provided inside the sample introduction tube 570. The sample introduction tube 570 is open to the sample holding section 503 via the introduction hole 509.
[0069]
A separation procedure using this device will be described. First, a sample is charged into the sample inlet 520 and filled up to the outlet 580. During this time, the sample is absorbed by the sample holder 503 through the input hole 509.
[0070]
Thereafter, air is injected into the sample inlet 520, and the sample is discharged from the outlet 580, thereby wiping and drying the sample inside the sample inlet tube 570. In the case of separation by capillary action, a separation buffer is injected in the same manner as described above. In the case of separation by electrophoresis, a buffer for electrophoresis is introduced from the liquid reservoir corresponding to the buffer inlet 510 and the liquid reservoir corresponding to the air hole 560 before the sample is charged. Because of the presence of the widely formed pause slits 505 and 507, they do not flow into the sample holding unit.
[0071]
When the sample is completely held in the sample holding unit 503, a small amount of the electrophoresis buffer is added to the liquid reservoir at one end of the separation channel, or a light vibration is applied to the periphery of the sample holding unit 503. The buffer is continued and a voltage is applied to separate.
[0072]
Next, the structure of the separation channel in the separation device will be described. FIG. 2 shows the structure of the separation channel 112 in FIG. 1 in detail. Note that the structure in the drawing can be applied to the drawings after FIG. In FIG. 2, a groove having a width W and a depth D is formed in a substrate 120, in which cylindrical pillars 125 having a diameter φ and a height d are regularly formed at regular intervals. The sample passes through the gap between the pillars 125. The average spacing between adjacent pillars 125 is p. Each dimension may be, for example, in the range shown in FIG.
[0073]
FIG. 3 is a sectional view of the flow channel shown in FIG. The groove formed in the substrate 120 is sealed by the covering 122 to form a space, and a number of pillars 125 are formed in this space. The gap between the pillars 125 becomes the flow path 123.
[0074]
When a structure in which a large number of pillars 125 are densely formed as described above is used as a sample separation unit, two separation systems are mainly considered. One is a separation method shown in FIG. In this method, as the molecular size is larger, the pillar 125 becomes an obstacle, and the passage time of the separation region in the drawing becomes longer. Those having a small molecular size pass through the gap between the pillars 125 relatively smoothly, and pass through the separation region in a shorter time than those having a large molecular size.
[0075]
However, in this method, clogging may occur when the sample contains a huge-sized substance. It is generally difficult to eliminate clogging once it has occurred.
[0076]
The problem of clogging becomes more remarkable when a sample containing many kinds of substances having small molecular sizes is to be separated with high resolution. In order to separate a sample containing many kinds of substances having small molecular sizes with high resolution, it is necessary to set the gap between the pillars 125 to a certain small size. However, doing so results in a form that is more easily clogged for large size molecules.
[0077]
In this regard, the separation method shown in FIG. 5 solves such a problem. In FIG. 5, in the sample separation region, a plurality of columnar body arrangement portions (pillar patches 121) are formed separately. Pillars 125 of the same size are arranged at equal intervals in each of the pillar-arranged portions. In this sample separation region, large molecules pass before small molecules. This is because the smaller the molecular size, the longer the path is trapped in the separation region and the longer the path, while the larger the size of the substance, the smoother the path between the adjacent pillar patches 121. As a result, the smaller sized material is separated in a manner that is discharged later than the larger sized material. Larger substances pass through the separation area relatively smoothly, thus reducing clogging problems and significantly improving throughput. In order to make such an effect more conspicuous, it is preferable that the width of the path between the adjacent pillar patches 121 be larger than the gap between the pillars 125 in the pillar patch 121. The width of the path is preferably about 2 to 20 times, more preferably about 5 to 10 times the gap between the pillars 125.
[0078]
Further, in the above embodiment, the example in which the columnar bodies are arranged at regular intervals has been described. However, the columnar bodies can be arranged at different intervals in the columnar arrangement portion. By doing so, molecules / ions of a plurality of sizes such as large, medium and small can be efficiently separated. Regarding the arrangement of the pillars, it is also effective to adopt a method of alternately arranging the pillars in the traveling direction of the sample. By doing so, the target component can be efficiently separated while effectively preventing clogging.
[0079]
For example, as shown in FIG. 49A, it is possible to adopt a columnar body disposed portion in which the distance between pillars is reduced according to the direction of flow. In this case, since the moving speed of the molecules that have entered the columnar arrangement portion decreases as the molecules move, the retention time difference between the larger molecules that cannot enter the columnar arrangement portion becomes significant. As a result, an improvement in resolution is realized. On the other hand, as shown in FIG. 49 (b), it is also possible to adopt a columnar body arrangement portion in which the distance between pillars is increased according to the direction of flow. By doing so, it is possible to suppress clogging in the columnar body-arranged portion, so that it is possible to improve throughput. The form in which the distance between the pillars is made smaller or larger in accordance with the direction of the flow can also be applied to a separation region having no columnar body arrangement portion.
[0080]
Further, the plurality of columnar body arrangement portions are collectively set as a larger columnar body arrangement portion, and the interval between the large columnar body arrangement portions is made wider than the interval between the original columnar body arrangement portions. Hierarchical arrangements are also possible. An example is shown in FIG. A medium pillar patch 713 is formed by assembling seven small pillar patches 712, and a large pillar patch 714 is formed by assembling seven medium pillar patches 713. In this way, by forming the columnar portion in a hierarchical manner, molecules in a wide size range can be separated simultaneously and in descending order. That is, larger molecules pass between the larger columnar arrangements, while medium-sized molecules are trapped and separated inside the medium-sized columnar arrangements. Even smaller molecules are trapped and separated inside the smaller columnar arrangement. For this reason, the smaller the molecules, the longer it takes to flow out, and it becomes possible to separate a plurality of molecules having different sizes in descending order.
[0081]
The structure of the sample separation region for realizing the separation method shown in FIG. 5 will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 6, the sample separation region has a structure in which pillar patches 121 are arranged at equal intervals in a space surrounded by a wall 129 of the flow channel. Each of the pillar patches 121 includes a plurality of pillars 125. Here, the width R of the pillar patch 121 is 10 μm or less. On the other hand, the interval Q between the pillar patches 121 is set to 20 μm or less.
[0082]
In FIG. 5, the pillar patches 121 in which the pillars 125 are densely formed are formed as circular regions when viewed from above, but may be other shapes than circular. In the example of FIG. 7, the patch area 130 is formed in a striped area when viewed from above. In this embodiment, the width R of the patch area 130 is 10 μm or less, and the interval Q between the patch areas 130 is 10 to 100 μm.
[0083]
FIG. 50 shows an example in which diamond-shaped pillar patches 121 are adopted, and the respective pillar patches 121 are arranged in a diamond shape. In this case, the path and the direction of the flow form a fixed angle, and the frequency of contact between the molecule and the pillar patch 121 increases, so that a molecule smaller than the distance between the pillars forming the pillar patch 121 is included in the pillar patch 121. The probability of being captured increases. Therefore, the difference in retention time between the molecules captured by the pillar patch 121 and the larger molecules that are not captured becomes significant, so that the separation performance of the separation device can be improved. When the diameter of the molecule to be separated is R, the distance h between the pillar patches 121, the diagonal lines D and d of the pillar patches 121, and the distance p between the pillars forming the pillar patches preferably satisfy the following conditions. . By doing so, the target molecule can be separated with high accuracy.
h: R ≦ h <10R
p: 0.5R ≦ p <2R
D: 5h ≦ D <20h
d: 5h ≦ d <20h
[0084]
What constitutes a patch area is not limited to a pillar. For example, it may be a patch area in which plate-like bodies are arranged at regular intervals. FIG. 51 shows an example. FIG. 51A is a top view, and FIG. 51B is a sectional view taken along the line AA ′ in the figure. This patch area is arranged as shown in FIG. The molecule once captured in the patch region 130 stays in the patch region 130 until it escapes to the channel 123. Accordingly, the difference in retention time between the molecules captured in the patch region and the molecules not captured becomes significant, so that the separation ability is improved. When the diameter of the molecule to be separated is R, it is preferable that the distance Λ between the patch regions 130 and the distance λ between the plate members forming the patch region 130 satisfy the following conditions. By doing so, the target molecule can be separated with high accuracy.
Λ: R ≦ Λ <10R
λ: 0.5R ≦ λ <2R
[0085]
Further, in the present invention, the top of the above-mentioned columnar body or plate-like body and the upper surface of the flow path may be in contact with each other or may be separated from each other. When separated, there is a gap between the columnar body or the plate-like body and the upper surface of the flow channel, so that the chance of passing large molecules increases. For this reason, it is possible to further eliminate clogging. Even for smaller molecules, the chance of entering the patch region from above via this gap increases, so that the separation effect is further improved. Such a form can be easily achieved by providing a groove portion in advance on a member (such as a cover glass) serving as the upper surface of the flow path, or by manufacturing the height of the columnar body or the plate-like body lower than the depth of the flow path. It is possible to realize.
[0086]
In the present invention, the width of the path between the pillar-arranged portions and the distance between the pillars in the pillar-arranged portion are determined by the components to be separated (organic molecules such as nucleic acids, amino acids, peptides and proteins, chelated metal ions). And the size of the molecule / ion). For example, it is preferable that the interval between the columnar bodies is approximately the same as, or slightly smaller or larger than, the radius of gyration corresponding to the median of the size of the molecule group to be separated. Specifically, the difference between the radius of inertia corresponding to the above-mentioned median value and the interval between the columnar bodies is within 100 nm, more preferably within 10 nm, and most preferably within 1 nm. By appropriately setting the interval between the columnar bodies, the separation ability is further improved.
[0087]
It is preferable that the interval (width of the path) between the adjacent columnar portions is approximately the same as, or slightly smaller or larger than, the radius of gyration of the largest molecule contained in the sample. Specifically, the difference between the radius of gyration of the largest molecule contained in the sample and the distance between the columnar portions is determined to be within 10% of the radius of gyration of the molecule, more preferably within 5%, and most preferably. Is within 1%. If the distance between the columnar portions is too wide, separation of small molecules may not be performed sufficiently.If the distance between the columnar portions is too narrow, clogging is likely to occur. There is.
[0088]
In the present invention, a row of pillars may be provided immediately before the separation region provided in the flow channel. One example of this is shown in FIG. As shown in FIG. 47 (a), one pillar row 710 is provided immediately before the separation region 711 provided on the flow path. It is preferable that the distance between the pillars in the pillar row 710 is substantially the same as the minimum size molecule included in the molecule group 709 to be separated. By employing such a configuration, the following effects can be obtained. Note that the separation region 711 may be provided with the above-described patch region or columnar portion, or may be a separation region in which columnar portions are uniformly disposed.
[0089]
In FIG. 47A, when a weak driving force (for example, a weak electric field) is applied to the molecule group 709 to be separated, the molecule group 709 to be separated, which is widely diffused, moves in the flow path. Is reached, and a narrow band is formed in a narrow band-like region adjacent to the pillar row (FIG. 47B). Next, by temporarily applying a strong driving force (for example, a strong electric field) to the molecule group to be separated, the molecule group passes through the pillar array while maintaining a narrow band state (FIG. 47C). This is particularly true for macromolecules such as DNA and proteins, even if the molecular size is larger than the distance between the pillars, if the number of pillar rows is about one or several, the molecules are stretched between the pillars. (Reptation effect). After the molecules to be separated have passed through the pillar array, the molecules can be effectively separated by applying a driving force suitable for the separation to the molecules (FIG. 47D). As described above, since the molecular group maintains a narrow band state, the overlap of the peaks after separation is reduced, so that high-precision separation is realized.
[0090]
Further, in order to prevent molecules such as DNA and protein from adhering to the channel wall, it is preferable to coat the channel wall. As a result, the separation device can exhibit good separation ability. Examples of the coating material include coating a substance having a structure similar to a phospholipid constituting a cell membrane on a channel wall. Examples of such a substance include Lipidure (registered trademark, manufactured by NOF Corporation) and the like. When Lipidure (registered trademark) is used, it is dissolved in a buffer solution such as TBE buffer so as to have a concentration of 0.5 wt%, and the solution is filled in the flow path and left for a few minutes to coat the flow path wall. Can be.
[0091]
Further, by coating the channel wall with a fluororesin or bovine serum albumin, it is possible to prevent molecules such as DNA from adhering to the channel wall.
[0092]
In the separation apparatus of the present invention, as shown in FIG. 8, a voltage is applied to both ends of the separation channel 112, whereby the sample moves in the separation channel 112. Here, in addition to the voltage for applying an external force to the sample, a voltage for suppressing the electroosmotic flow may be applied. In FIG. 8, a zeta correction voltage is applied to the substrate for this purpose. By doing so, the electroosmotic flow is suppressed, and broadening of the measurement peak can be effectively prevented.
[0093]
The separation device according to the present invention is preferably used with a buffer solution introduced therein. Here, when the flow channel surface such as the flow channel wall surface and the coating portion is made of a hydrophobic material such as plastic, it is usually not easy to introduce a buffer solution. As a method for smoothly introducing the buffer solution, for example, a method shown in FIG. 9 can be employed. In the illustrated method, the buffer solution is introduced into the chip 150 by performing centrifugation while the chip 150 is fixed in the holder 153 of the centrifuge tube 151.
[0094]
As a method for solving the difficulty of introducing the buffer solution, it is effective to form a hydrophilic film such as a silicon oxide film on the surface of the flow channel in the separation device. Due to the formation of the hydrophilic film, the buffer solution is smoothly introduced without applying any external force. This point will be described later in an embodiment (a silicon thermal oxide film 209 formed in the step of FIG. 14D).
[0095]
In the present invention, the columnar body preferably has a shape in which the diameter at the top is smaller than the diameter at the bottom. That is, it is preferable that the columnar body has a cone shape or a pseudo-cone shape and the cross section is divergent. In particular, when a hydrophilic film such as a silicon oxide film is formed on the surface of the columnar body, the effect of such a shape becomes remarkable. For example, if a column is thermally oxidized to provide a thermal oxide film on its surface, oxidation proceeds in the vicinity of the bottom of the column, and the height of the column may decrease and the aspect ratio may decrease. When the shape of the columnar body is as described above, a decrease in the aspect ratio due to such oxidation can be effectively prevented.
[0096]
In addition, after adopting the above-described shape as the shape of the columnar body, the columnar body provided in the sample separation region is brought into close proximity such that the side surfaces of adjacent columnar bodies contact each other at the bottom of the columnar body. It is desirable to form. By doing so, a decrease in the aspect ratio due to oxidation can be more effectively prevented. FIG. 17 shows an example of a columnar body adopting such a structure. As shown, a conical columnar body is provided on the surface of the substrate 110, and the surface is covered with the silicon oxide film 104. The columnar body is formed such that the side surfaces of adjacent columnar bodies are close to each other at the bottom of the columnar body so as to be in contact with each other. With such an arrangement, when the substrate 110 is thermally oxidized and its surface is covered with a silicon oxide film, the oxide film thickness at the bottom of the columnar body becomes thin, and the aspect ratio of the columnar body can be favorably maintained. Although the reason for this is not necessarily clear, since the side surfaces of the conical columnar body are in contact with each other, when oxidation proceeds near the bottom of the columnar body, compressive stress is generated, and further oxidation occurs. It is presumed that it was difficult to proceed.
[0097]
Next, a method for forming the structure shown in FIG. 17 will be described with reference to FIG. First, as shown in FIG. 18A, a silicon oxide film 105 and a resist film 107 are formed on a substrate 110 in this order. Next, the resist film 107 is patterned by electron beam exposure or the like to form a pattern having a predetermined opening (FIG. 18B).
[0098]
Next, the silicon oxide film 105 is dry-etched using the resist film 107, thereby forming a hard mask made of the silicon oxide film 105 (FIG. 18C). After removing the resist film 107 (FIG. 18D), the substrate 110 is dry-etched (FIG. 19E) to obtain a columnar body having a high aspect ratio. After removing the silicon oxide film 105 (FIG. 19F), the surface is oxidized at a high temperature of, for example, 850 ° C. or higher. Through the above steps, the nanostructure shown in FIG. 19 is obtained. This nanostructure can be suitably used for a sample separation section of a separation apparatus.
[0099]
In the above embodiment, the substrate 110 is etched using the hard mask formed using the resist mask. However, the substrate may be directly etched using the resist mask. FIG. 20 is a view showing this method. In the illustrated process, a resist 900 is formed on a substrate 110, then patterned, and the substrate 110 is etched using the resist as a mask to form pillars.
[0100]
Next, an example of forming a pillar structure using a method of patterning a mask using a mold will be described. FIG. 21 is a process sectional view illustrating the method for manufacturing the separation device according to the present invention. First, as shown in FIG. 21A, a substrate 110 made of silicon having a resin film 160 formed on the surface and a mold 106 having a molded surface processed into a predetermined uneven shape are prepared. The material of the resin film 160 is a polymethyl methacrylate-based material, and its thickness is about 200 nm. The material of the mold 106 is not particularly limited. ₂ , SiC or the like can be used.
[0101]
Then, as shown in FIG. 21B, pressure is applied while heating while the molding surface of the mold 106 is in contact with the surface of the resin film 160. The pressure is about 600-1900 psi, and the temperature is about 140-180 ° C. After that, the substrate is released, oxygen plasma ashing is performed, and the resin film 160 is patterned.
[0102]
Subsequently, the substrate 110 is dry-etched using the resin film 160 as a mask. As the etching gas, for example, a halogen-based gas is used. The etching depth is about 0.4 μm, and the distance between pillars formed by etching is about 100 nm. The aspect ratio (aspect ratio) of the etching is about 4: 1. At this time, in the vicinity of the bottom of the concave portion generated by the etching, the progress of the etching is slowed down by the microloading effect, and the leading end of the concave portion is narrowed to be curved. As a result, the pillars are widened and the cross-sectional shape is wider at the bottom than at the top. In addition, since the distance between the pillars is small, each pillar is formed so close that the side surfaces of the adjacent pillars are in contact with each other at the bottom of the pillars.
[0103]
After FIG. 21D, thermal oxidation is performed by furnace annealing at 800 to 900 ° C. to form a silicon thermal oxide film on the pillar side walls. At this time, since the pillars and the concave portions have the shapes described above, the oxide film thickness at the bottom of the columnar body becomes thin, and the aspect ratio of the columnar body can be favorably maintained. Although the reason for this is not necessarily clear, since the side surfaces of the conical columnar body are in contact with each other, when oxidation proceeds near the bottom of the columnar body, compressive stress is generated, and further oxidation occurs. It is presumed that it was difficult to proceed.
[0104]
Through the above steps, a pillar group is formed on the substrate 110. In the present embodiment, the step of forming a mask opening by electron beam exposure is not required, so that productivity is significantly improved.
[0105]
In the above embodiment, a mold is used when patterning the resin film 160 serving as a mask. However, a columnar body can be directly formed using this mold. Specifically, after a predetermined plastic material is coated on the substrate, surrounding molding can be performed by the same process as described above. As the plastic material to be coated on the substrate, one having good moldability and appropriate hydrophilicity is preferably used. For example, polyvinyl alcohol-based resins, particularly ethylene-vinyl alcohol resin (EVOH), polyethylene terephthalate, and the like are preferably used. Even if it is a hydrophobic resin, it can be used because the surface of the flow channel can be made hydrophilic by performing the coating after molding.
[0106]
In forming the silicon thermal oxide film, which is the final step in the above embodiment, the film may not be formed sufficiently depending on the oxidation conditions. In such a case, since the current leaks to the substrate, a necessary electric field cannot be obtained when the sample is separated by electrophoresis. In order to avoid this, a separation channel and a liquid reservoir can be provided on the substrate as follows.
[0107]
First, a silicon oxide film 202 is formed by thermally oxidizing a silicon substrate 201 as shown in FIG. After that, polycrystalline silicon is deposited on the silicon oxide film 202 to form a polycrystalline silicon film 707. Subsequently, oxide film 708 is formed by thermally oxidizing polycrystalline silicon film 707.
[0108]
Next, a calix arene electron beam negative resist is formed on the oxide film 708, and the resist is patterned by pattern exposure using an electron beam (EB) to a liquid reservoir and a region to be a flow path of the sample. After that, the oxide film 708 is subjected to RIE etching and the resist is removed to obtain a state shown in FIG. Subsequently, the polycrystalline silicon film 707 is subjected to ECR etching using the etched oxide film 708 as a protective film. After that, the oxide film 708 is removed to obtain a state shown in FIG. Thereafter, the etched polycrystalline silicon film 707 is thermally oxidized to be integrated with the silicon oxide film 202 to obtain a state shown in FIG.
[0109]
Since the separation channel processed as described above is completely insulated from the silicon substrate 201, it is possible to reliably secure an electric field during electrophoresis.
[0110]
Note that the silicon substrate 201 and the silicon oxide film 202 in the above embodiment may be replaced with a quartz substrate. Further, instead of the silicon substrate 201, the silicon oxide film 202, and the polycrystalline silicon film 707, an SOI (Silicon On Insulator) substrate can be used.
[0111]
In the embodiment described above, an example in which pillars are formed as pillars has been described, but pillars may be formed using carbon nanotubes or carbon nanohorns.
[0112]
The carbon nanotube has a tube shape with a diameter of 1 to 30 nm. The carbon nanohorn has a fine shape with a tip of about 1 nm and a root of 4 nm, for example. The “pillars” in the present invention are defined as terms including these.
[0113]
As a method of forming carbon nanotubes or carbon nanohorns in the sample separation area, a nucleation method, a method of mixing carbon nanotubes and carbon nanohorns in a hydrophilic resin, and then extracting the carbon nanotubes and carbon nanohorns from the resin are employed. be able to.
[0114]
Since carbon nanotubes and carbon nanohorns are water-repellent, it is desirable to convert the surface to hydrophilic before applying to the present invention. As a method for converting to a hydrophilic property, a method known as a method for hydrophilizing carbon nanotubes, such as an oxidation treatment, can be used. The method for hydrophilizing carbon nanotubes can also be applied to carbon nanohorns.
[0115]
Next, an example in which a plurality of separation regions are provided in a flow path via a slit will be described with reference to FIG. In the illustrated configuration, the sample separation region 601 is formed in the flow path so as to close the flow path. This sample separation area 601 is divided into a plurality of parts via a slit 602. There is no gap between the wall 603 and the sample separation area 601. When such a configuration is employed, the shape of the band of the separated sample becomes suitable, and the separation ability is improved. This will be described with reference to FIG. When a single sample separation area 601 is provided without a slit, the liquid surface of the sample flowing from the upper part to the lower part in the left part of the drawing is a curved surface. This is because while the movement of the sample is promoted by the capillary action at the portion along the wall, the effect of the capillary action is small at the center of the cross section of the flow path. The flow of the sample near the wall is accelerated, resulting in the band shape as shown. On the other hand, when the sample separation area 601 is divided into a plurality of parts via the slit 602, the liquid being separated is once held in the sample separation area above the slit due to the presence of the slit. Since air exists in the slit, when the pressure of the sample in the sample separation area above the slit exceeds the pressure derived from the air in the slit, the liquid moves from the sample separation area to the slit for the first time. Start. As described above, since the liquid containing the sample is once held in the sample separation region, even if a difference in the moving distance occurs between the wall and the center, the difference is eliminated during the holding time. As a result, at the stage after passing through the slit, the liquid surface becomes a plane substantially perpendicular to the separation direction (the right figure in FIG. 36). Thereby, measurement on a plane perpendicular to the separation direction is accurately performed, and the separation ability is improved. Note that the sample separation region 601 may be provided with the above-described patch region or columnar arrangement portion, or may be a sample separation region in which the columnar members are arranged evenly.
[0116]
FIGS. 37 and 38 are diagrams showing the difference in the band shape of the sample due to the above-described capillary phenomenon. As shown in FIG. 37, when a single artificial gel is provided as a sample separation region, the band shape is bent in the sample traveling direction. On the other hand, FIG. 38 adopts a configuration in which regions where pillars are sparsely formed and regions where pillars are densely formed are alternately formed. The area where the pillars are sparsely formed plays the same role as the slit in FIGS. That is, the liquid containing the sample temporarily stops before the area where the pillars are sparsely formed, and the difference in the moving distance of the liquid generated in the area where the pillars are densely formed during this period is eliminated. A band shape that is substantially planar with respect to the direction is obtained.
[0117]
As described above, the effect on the region where the slits and pillars are sparsely formed in the separation device using the capillary phenomenon has been described. However, the same effect as described above can be obtained by disposing the slit and the like in the separation device using the electric field. Can be obtained. It is known that even in the case of separation by electrophoresis or the like, the bands take a bent shape as they migrate. The shape of this band can be adjusted by a slit or the like. In this case, the effect of adjusting the band shape can be obtained even if the slit is filled with the buffer solution.
[0118]
As described above, the embodiments of the present invention have been described. However, the configurations used in the respective embodiments can be arbitrarily combined. For example, it is possible to realize a separation device in which the pillar row 710 shown in FIG. 47 is provided immediately before the separation region having the columnar body arrangement portion shown in FIG. 49A and the flow path wall is further coated.
[0119]
【Example】
Example 1
(Production of separation device)
The separation device according to the present invention was manufactured by the following procedure. The details of the process will be described with reference to FIGS.
[0120]
First, as shown in FIG. 11A, a silicon oxide film 202 and a calix arene electron beam negative resist 203 (55 nm) are formed on a silicon substrate 201 in this order. The thicknesses of the silicon oxide film 202 and the calix arene electron beam negative resist 203 are 35 nm and 55 nm. Next, using an electron beam (EB), an array region serving as a flow path of the sample is exposed. The development is performed using xylene and rinsed with isopropyl alcohol. By this step, a patterned resist 204 is obtained as shown in FIG.
[0121]
Subsequently, a positive photoresist 205 is applied to the entire surface (FIG. 11C). The thickness is 1.8 μm. Thereafter, mask exposure is performed so that the array area is exposed, and development is performed (FIG. 11D).
[0122]
Next, the silicon oxide film 202 is ₄ , CHF ₃ RIE using a mixed gas of The film thickness after the etching is set to 35 nm (FIG. 12A). After the resist is removed by organic cleaning using a mixed solution of acetone, alcohol and water, an oxidizing plasma treatment is performed (FIG. 12B). Subsequently, the silicon substrate 201 is subjected to ECR etching using HBr gas. The thickness of the silicon substrate after the etching is set to 400 nm (FIG. 12C). Subsequently, wet etching is performed with BHF buffered hydrofluoric acid to remove the silicon oxide film (FIG. 12D).
[0123]
Next, a CVD silicon oxide film 206 is deposited on the silicon substrate 201 (FIG. 13A). The thickness is 100 nm. Subsequently, a positive photoresist 207 is applied to the entire surface (FIG. 13B). The thickness is 1.8 μm. Subsequently, as shown in FIG. 13C, the flow path region is exposed by a mask (protects the array region) and developed. Thereafter, the CVD silicon oxide film 206 was wet-etched with buffered hydrofluoric acid (FIG. 13D). Then, after removing the positive photoresist by organic cleaning (FIG. 14A), the silicon substrate 201 is wet-etched using TMAH (tetramethylammonium hydroxide) (FIG. 14B). Subsequently, the CVD silicon oxide film 206 is removed by wet etching with buffered hydrofluoric acid (FIG. 14C). The substrate in this state is placed in a furnace to form a silicon thermal oxide film 209 (FIG. 14D). The heat treatment conditions are selected so that the thickness of the oxide film becomes 20 nm. By forming such a membrane, difficulties in introducing a buffer solution into the separation device can be eliminated. Thereafter, the glass 210 is subjected to electrostatic bonding and sealing to complete a separation device (FIG. 15).
[0124]
It was confirmed that the separation device manufactured as described above had no problem in appearance.
[0125]
(Appearance observation)
The appearance of the sample in the state of FIG. 14D was observed with an electron microscope. However, the thickness of the silicon oxide film was 30 nm. The results are shown in FIG. 10 and FIG. It can be seen that many pillars are regularly arranged. The average distance between the pillars is about 60 nm.
[0126]
Example 2
In this example, after two types of pillars having different aspect ratios were produced by the same etching process as in Example 1, the degree of oxidation progress when these were thermally oxidized was compared and examined. After processing into a pillar shape by etching, sample 1 has a height of 440 nm and a pillar interval of 80 nm, and the side surfaces of adjacent pillars are formed close enough to contact each other at the bottom of the pillars (FIG. 22). On the other hand, in sample 2, the height is 200 nm, the pillar interval is 100 nm, and a flat substrate surface is exposed between adjacent columnar bodies (FIG. 26). Each of the columnar bodies has a wider cross section at the bottom than at the top, and has a divergent shape.
[0127]
The results of electron microscope observation of the cross section of each sample are shown in FIGS. Sample 1 corresponds to FIGS. 22 to 25, and sample 2 corresponds to FIGS. In the drawing, “10 nm oxidation” refers to a state in which the thickness of the oxide film on the pillar sidewall becomes 10 nm.
[0128]
As a result of the observation, oxidation of the pillar bottom was not observed in the sample 1 even if the thickness of the oxide film on the sidewall of the pillar was increased, whereas in sample 2, oxidation of the sidewall of the pillar was stopped by oxidation of 20 nm. However, it can be seen that in the case of 30 nm oxidation, the height of the pillar is reduced due to the progress of surrounding oxidation.
[0129]
From the above, the pillar cross-sectional shape is made wider at the bottom than at the top, and the side surfaces of adjacent columns are formed close to each other at the bottom of the column so as to be in contact with each other. It was confirmed that the pillar group of can be suitably formed.
[0130]
Example 3
This embodiment has a configuration in which a sample separation region in which pillars are formed at a high density, an adjustment region in which pillars are formed more sparsely than the sample separation region, and a sample formation direction in a flow path are alternately formed. are doing. The sample separation region is formed by electron beam exposure and dry etching, and the size of the region is 40 μm × 60 μm.
[0131]
In the sample separation region, pillars are arranged in a triangular lattice at a pitch of 100 nm as shown in FIG. An adjustment region having a width of about 50 nm, in which pillars are sparsely arranged, is formed between the sample separation regions.
[0132]
FIG. 40 shows the result of separating a sample using this apparatus. This figure is a result of observing the degree of penetration of the sample over time when the sample is introduced into the sample separation region. In the figure, time progresses from left to right. The leftmost diagram at the top shows the state at the start. The sample takes 0.73 seconds to pass through the first stage of the sample separation area, 0.1 seconds to pass through the second stage, and 0.12 seconds to pass through the third stage. It took 0.15 seconds to pass and 0.2 seconds to pass the fifth stage. In each stage, the sample is held in the sample separation region, during which the difference in the movement distance between the vicinity of the wall surface and the center of the cross section is eliminated, and the tip of the sample liquid surface is flat. As a result, the shape of the band in the detection unit became linear, and the detection area was able to be expanded, and the detection sensitivity was improved.
[0133]
As described above, by adopting the configuration of the present embodiment, it is possible to control the speed at which the buffer solution permeates due to the capillary phenomenon by the diameter and density of the pillar, and in particular, the speed at which the buffer solution permeates at a speed of 1 second or less. Phenomena can be controlled. By optimally designing the pillar density distribution, the uniformity of sample loading can be improved.
[0134]
Example 4
The separation device of this example was manufactured by the following process. First, as shown in FIG. 45A, a silicon oxide film 202 having a thickness of 35 nm was formed on a silicon substrate 201. Next, a calixarene electron beam negative resist having a thickness of 55 nm was formed, and an electron beam (EB) was used to expose an array region serving as a sample flow path. The development was performed using xylene and rinsed with isopropyl alcohol. By this step, a patterned resist 204 was obtained as shown in FIG. Next, the silicon oxide film 202 is ₄ , CHF ₃ (FIG. 45C). Subsequently, after the resist was removed by organic cleaning using a mixed solution of acetone, alcohol and water, an oxidizing plasma treatment was performed, and the silicon substrate 201 was subjected to ECR etching using HBr gas and oxygen gas (FIG. 46D). . Thereafter, wet etching was performed with BHF buffered hydrofluoric acid to remove the silicon oxide film. The substrate thus obtained was placed in a furnace to form a silicon thermal oxide film 209 (FIG. 46E).
[0135]
FIG. 42 shows a scanning electron micrograph of the surface of the substrate obtained as described above. As shown in FIG. 43, the dimensions of the pillars in this substrate were about 150 nm in pillar diameter, 370 nm in pillar height, and 350 nm in pillar pitch. The width of the patch area was 2500 nm, and the interval between the patch areas was 1000 nm.
[0136]
The channel length was 40 mm, the channel width was 80 μm, and the channel depth was 370 nm.
[0137]
FIG. 44 is a view showing the subsequent steps of this embodiment. In each of FIGS. 44 (a) to (c), the left side shows a top view, and the right side shows an AA ′ cross-sectional view of the top view. ing.
[0138]
FIG. 44A is a top view of a separation channel 701 having a patch region and a substrate having liquid reservoirs 702 and 703 manufactured as described above, and a cross-sectional view taken along line AA ′. In FIG. 44, the display of pillars is omitted. On this substrate, a cover glass 704 provided with a hole 705 having a diameter of 2 mm in advance was electrostatically bonded (FIG. 44B). Subsequently, as shown in FIG. 44C, a glass tube 706 having an inner diameter of 3 mm, an outer diameter of 5 mm, and a height of 5 mm was bonded around the hole 705 with an epoxy resin.
[0139]
Next, 1 × TBE buffer (0.09 M Tris borate + 2 mM EDTA) was injected from glass tube 706. Thereafter, a buffer containing 2 kbp DNA was injected from one reservoir. Thereafter, a platinum wire was inserted from both glass tubes 706, and DNA was electrophoresed by applying a voltage (60V). The same operation was performed for 5 kbp and 10 kbp DNA. The average migration speed of each DNA at this time is shown in the graph of FIG. It became clear that the larger the DNA size, the higher the migration speed.
[0140]
The DNA migration speed was determined by the following operation. The DNA was previously treated with a fluorescent dye YOYO-1 (Molecular probe) and magnified 1000 times with a fluorescence microscope. The sensitivity of the obtained video was enhanced by an image intensifier (manufactured by Hamamatsu Photonics), and individual DNA was traced.
[0141]
Next, in order to examine the statistical tendency, the same operation as described above was carried out for each of 100 DNAs of 5 kbp and 10 kbp. FIG. 48 is a graph showing the migration speed distribution of DNA during electrophoresis. The average migration velocities of the 10 kbp and 5 kbp DNAs were 40 μm / s and 34 μm / s, respectively. A difference in the migration velocity distribution was recognized depending on the size of the DNA, suggesting that the DNAs have separation ability.
[0142]
The above results, which were measured for 100 DNAs each, showed that the tail of the velocity distribution of both molecules appeared broad, but it was found to have sufficiently high resolution for the following reasons. That is, when the number of molecules to be traced is N, the standard deviation of the peak is 1 / N ^1/2 Is known to decrease in proportion to (Central Limit Theorem). Generally, a band formed by electrophoresis contains about several hundred thousand (10 7) DNA molecules. Therefore, if the same number of DNAs are traced, the standard deviation of the peak is smaller than that of 100 bands. Is 100000 ^1/2 It is reduced by a factor of 1 or about 0.003 times. Therefore, the peak of the separation result must be extremely sharp.
[0143]
Therefore, when a buffer containing 10 kbp and 5 kbp DNA was applied to the above-mentioned separation device and the retention time of the peak was measured accurately, as shown in Table 1, the retention time of the 10 kbp and 5 kbp DNA was 995 sec. 1170 seconds, which proved to be separated from each other.
[0144]
[Table 1]

[0145]
Here, Table 2 shows the results of electrophoretic analysis using a separation apparatus (bioanalyzer) manufactured by Agilent with a separation channel length of 14 mm.
[0146]
[Table 2]

[0147]
For comparison with the above-mentioned separation device made by Agilent, a separation device having a channel length of 2.8 mm was prepared in the same manner as described above, and DNA of 10 kbp and 5 kbp was analyzed. Table 3 shows the results.
[0148]
[Table 3]

[0149]
While the separation device of Agilent separates DNAs of different sizes with a difference in retention time of 2 to 4 seconds (Table 2), the separation device of the present example is capable of separating 10 kbp and 5 kbp DNA for 12 seconds. From the long retention time difference (Table 3). In addition, since the separation device of the present example achieves the above-described separation ability with a separation channel shorter than that of the separation device manufactured by Agilent, it was proved that the separation device was an excellent separation device having a high theoretical plate number. . Furthermore, since the separation device manufactured by Agilent is based on electrophoresis using a gel, DNA having a size of about 10 kbp or more may be clogged and may not be analyzed in some cases. On the other hand, in the case of the separation device of the present embodiment, since an appropriate interval is provided between the patch regions, relatively large DNA can pass through the flow path while avoiding the patch region. Therefore, the analysis can be performed smoothly without clogging.
[0150]
Thus, the present separation apparatus has excellent separation ability, and its usefulness has been demonstrated.
[0151]
Example 5
In order to further confirm the performance of the separation device of the present invention, the following separation experiments were performed.
[0152]
In the separation apparatus of this embodiment, a separation channel having a length of 42 mm and a width of 80 μm and a sample introduction channel having a length of 18 mm and a width of 40 μm are provided in a cross shape. In the separation channel, a pillar region was provided 5.6 mm from a position of about 30 μm downstream of the cross point. The pillar disposition portion is composed of wall-shaped nanopillars having a height of about 0.4 μm and a length of 3 μm, which are arranged as shown in the plan view of FIG. Each wall-shaped nanopillar is provided in a ladder shape at a pitch of 700 nm, and a groove having a width of 1200 nm is provided between the ladders. These wall-shaped nanopillars were produced by EB exposure and gas etching.
[0153]
The samples used were 2 kbp, 5 kbp, and 10 kbp long DNAs. For observation, each was stained with YOYO-1 (Molecular probe) and used. The length of the DNA was selected from the viewpoint that the length could be easily determined from the intensity of the fluorescence and the molecular shape. Samples containing these three lengths of DNA were pulsed into the separation channel by the following procedure. In order to introduce the sample in a pulse form, the sample was first introduced into one end of the sample introduction channel, and a voltage was applied such that the end became −50 V and the other end became +30 V, thereby introducing the sample into the sample introduction channel. . At this time, a voltage of -40 V was applied to both ends of the separation channel to prevent the sample from diffusing from the sample introduction channel to the separation channel. Next, the voltage applied to the sample introduction channel was inverted for only 0.5 seconds, and the sample was pulled back, thereby narrowing the width of the portion of the sample applied to the separation channel. Finally, by setting both ends of the sample introduction channel to −15 V, the distal end of the separation channel to 0 V, and the proximal end to −10 V, the sample flows from the sample introduction channel to the separation channel. Further, only a narrow pulse-like band of the sample existing at the intersection of the sample introduction channel and the separation channel was introduced into the separation channel while preventing the sample from being drawn.
[0154]
The introduced sample was separated into three bands each composed of DNA of three different lengths as it passed through the separation channel. The amount of fluorescence was actually measured at a position 1 mm downstream from the cross point between the sample introduction channel and the separation channel by the following method. When the stained DNA is excited by a fluorescent lamp using a fluorescence microscope, the DNA emits fluorescence according to the length of the DNA. The fluorescence was received by a photo multiplexer (H7467 manufactured by Hamamatsu Photonics) attached to a fluorescence microscope, and the intensity signal was recorded. At the same time, the flowing molecules were observed at a magnification of 1000 through a half mirror, and it was confirmed which length of DNA had passed.
[0155]
FIG. 57 is a graph in which the vertical axis indicates the signal intensity (photon count) of the photomultiplexer and the horizontal axis indicates the elapsed time from the introduction of the sample. From the time the sample was introduced, 10 kbp DNA first peaked at 160 seconds, then 5 kbp DNA at 220 seconds, and 2 kbp DNA at 290 seconds, peaking at three different lengths. It can be seen that the DNAs are clearly separated. From this result, it was shown that, in this separation device, the larger the size of the molecule, the faster it passes through the separation flow path, and it was clarified that a gel filtration-type separation mechanism that does not easily cause clogging was realized. Further, the theoretical column height (HETP: height equivalent to a theoretical plate) was calculated based on the results of the separation, and as a result, a result of 4.85 μm was obtained for 2 kbp DNA, and a result of 0.81 μm was obtained for 10 kbp DNA. Was done. The theoretical column height is one of the indices for measuring the separation ability of a separation device, and the shorter the length, the higher the separation ability. The theoretical column height of an ordinary gel filtration column, for example, a column used for separating a biopolymer containing DNA is generally 10 μm to 100 μm. For example, the theoretical column height of a commercially available column, Ohpack SB-80 series (manufactured by Showa Denko KK) is 25 μm, and the high-resolution column GPC KF-40 series of the company is 10 μm. It is clear that the device has better resolution than those columns in terms of theoretical column height.
[0156]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, in the sample separation region, a columnar body arrangement portion in which a number of columnar bodies are arranged at predetermined intervals is provided. And the surface of the columnar body is covered with a hydrophilic film Therefore, samples containing substances of various sizes can be separated in a short time and with excellent resolution without causing a problem such as clogging. In addition, small molecules such as nucleic acids and proteins can be separated with a small amount of sample in a short time with excellent resolution.
[0157]
Further, according to the present invention, in the sample separation region, a plurality of columnar body disposed portions in which a number of columnar bodies are disposed, The surface of the columnar body is covered with a hydrophilic film, Since a configuration is used in which a path through which the sample passes between adjacent columnar bodies is provided, even for a sample having a wide size distribution, high resolution can be achieved without causing clogging or a decrease in throughput. Can be separated.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of a separation device according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the structure of a separation channel in FIG. 1 in detail.
FIG. 3 is a diagram showing a structure of a separation channel in FIG. 1 in detail.
FIG. 4 is a diagram for explaining a sample separation method.
FIG. 5 is a diagram for explaining a sample separation method.
FIG. 6 is a plan view showing the arrangement of pillar patches.
FIG. 7 is a plan view showing the arrangement of pillar patches.
FIG. 8 is a diagram showing a method of applying a correction voltage for adjusting an electroosmotic flow.
FIG. 9 is a diagram illustrating a method for introducing a buffer into a chip.
FIG. 10 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 11 is a diagram for explaining a method of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 12 is a diagram for explaining a method of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 13 is a diagram for explaining a method of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 14 is a diagram illustrating a method for manufacturing a separation device according to the present invention.
FIG. 15 is a diagram for explaining a method of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 16 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 17 is a sectional view of a nanostructure according to the present invention.
FIG. 18 is a diagram illustrating a method for manufacturing a separation device according to the present invention.
FIG. 19 is a view illustrating a method for manufacturing the separation apparatus of the present invention.
FIG. 20 is a view for explaining the method for manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 21 is a diagram illustrating a method for manufacturing a separation device according to the present invention.
FIG. 22 is a view showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 23 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 24 is a view showing the results of observation of the appearance of pillars by an electron microscope.
FIG. 25 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 26 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 27 is a view showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 28 is a diagram showing the results of observation of the appearance of pillars using an electron microscope.
FIG. 29 is a diagram showing observation results of the appearance of pillars by an electron microscope.
FIG. 30 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 31 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 32 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 33 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 34 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 35 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 36 is a diagram showing an example of the separation device of the present invention.
FIG. 37 is a diagram showing an example of a flow channel structure.
FIG. 38 is a diagram showing an example of a channel structure.
FIG. 39 is an electron micrograph showing the appearance of a sample separation region in the separation device of the present invention.
FIG. 40 is a diagram showing a state of separation of a sample using the separation device of the present invention.
FIG. 41 is a diagram showing a specific structure of a joint used in the separation device of the present invention.
FIG. 42 is a scanning electron micrograph of the surface of the separation device of the present invention.
FIG. 43 is a diagram showing dimensions of pillars in the separation device of the present invention.
FIG. 44 is a view illustrating a step of manufacturing the separation apparatus of the present invention.
FIG. 45 is a view illustrating a step of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 46 is a view illustrating a step of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 47 is a diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 48 is a graph showing the distribution speed of DNA migration in the separation device of the present invention.
FIG. 49 is a diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 50 is a diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 51 is a diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 52 is a view illustrating a step of manufacturing the separation device of the present invention.
FIG. 53 is a graph showing the average migration speed of DNA in the separation device of the present invention.
FIG. 54 is a diagram showing an embodiment of the present invention.
FIG. 55 is a view for explaining the structure of the liquid reservoir in one example of the embodiment of the present invention.
FIG. 56 is a view for explaining a structure of a liquid reservoir according to an example of the embodiment of the present invention.
FIG. 57 is a graph showing DNA separation data in the separation device of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Sample reservoir
2 Pump for dosing
3 Constant speed injection device
4 Solenoid valve
5 Solenoid valve
6 Waste liquid reservoir
7 Reservoir
8 Separation pump
9 Constant speed injection device
10 Solenoid valve
11 Solenoid valve
12 Autosampler
13,14,15,16 tubes
17 Joint
19 Input channel
20 Separation channel
21 Control unit
101a, b liquid reservoir
102a, b Liquid reservoir
103a, b Liquid reservoir
104 silicon oxide film
105 silicon oxide film
106 mold
107 resist film
110 substrate
111 Input channel
112 Separation channel
113 detector
114 Recovery channel
120 substrate
121 pillar patch
122 coating
123 channel
125 pillar
129 Channel wall
130 patch area
150 chips
151 centrifuge tube
153 holder
160 resin film
201 Silicon substrate
202 Silicon oxide film
203 Calixarene electron beam negative resist
204 patterned resist
205 Positive photoresist
206 CVD silicon oxide film
207 Positive photoresist
209 Silicon thermal oxide film
210 glass
502 Pause slit
503 Sample holder
504 buffer introduction unit
505 pause slit
506 Separation unit
507 Pause slit
509 Input hole
510 buffer inlet
520 sample inlet
530 Sample quantitative tube
540 Separation channel
550 substrate
560 air hole
570 Sample input tube
580 outlet
601 Sample separation area
602 slit
603 wall
701 Separation channel
702,703 Liquid reservoir
704 cover glass
705 hole
706 glass tube
707 Polycrystalline silicon film
708 oxide film
709 Molecular groups to be separated
710 pillar row
711 Separation area
712 small pillar patch
713 Medium Pillar Patch
714 Large Pillar Patch
801 coating
802 opening
803 conduction path
804 electrode plate
900 resist

Claims (21)

試料の通る流路と、該流路中に設けられた試料分離領域とを備える分離装置であって、前記試料分離領域は、複数の柱状体が配設された柱状体配設部を含み、前記柱状体の表面が親水性膜で覆われたことを特徴とする分離装置。A flow path through the sample, a separation device and a sample separation region provided in the flow path, the sample separation region, seen including a plurality of columnar bodies columnar body arrangement portion arranged And a separation device , wherein the surface of the columnar body is covered with a hydrophilic film . 基板上に形成された溝部からなる試料の通る流路と、前記流路に試料を導く試料導入部と、前記流路中に設けられた、試料を複数の成分に分離する試料分離領域と、前記試料分離領域で分離された試料を分析または分取する試料回収部と、を備え、前記試料分離領域は、前記流路内壁に複数の柱状体が形成されてなる柱状体配設部を含み、前記柱状体の表面が親水性膜で覆われたことを特徴とする分離装置。A flow path for a sample formed of a groove formed on the substrate, a sample introduction unit for guiding the sample to the flow path, and a sample separation area provided in the flow path, for separating the sample into a plurality of components, A sample collection unit that analyzes or sorts the sample separated in the sample separation region, wherein the sample separation region includes a columnar body arrangement unit in which a plurality of columnar bodies are formed on the inner wall of the flow channel. The separation device , wherein the surface of the columnar body is covered with a hydrophilic film . 請求項１または２に記載の分離装置において、前記親水性膜は、前記柱状体を構成する材料の酸化膜であることを特徴とする分離装置。 3. The separation device according to claim 1 , wherein the hydrophilic film is an oxide film of a material forming the columnar body. 4. 請求項１乃至３いずれかに記載の分離装置において、前記柱状体の断面形状が、頂部よりも底部において幅広となっていることを特徴とする分離装置。In the separation device according to any of claims 1 to 3, the cross-sectional shape of the columnar bodies, separation device, characterized in that it is wider at the bottom than the top. 請求項１乃至４いずれかに記載の分離装置において、前記複数の柱状体は、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されたことを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 4, wherein the plurality of columnar body, the side surface of the adjacent columnar bodies, characterized in that it is formed in proximity to the extent that contact with each other at the bottom of the columnar body Separation device. 請求項１乃至５いずれかに記載の分離装置において、前記試料分離領域が前記柱状体配設部を複数含み、隣接する柱状体配設部間に前記試料が通過するパスが設けられたことを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 5, said sample separation region comprises a plurality of the columnar body arrangement portion, the path from the specimen to pass between adjacent columnar body arrangement portion is provided Characteristic separation device. 請求項６に記載の分離装置において、前記パスの幅は、柱状体配設部中の柱状体間の平均間隔よりも大きいことを特徴とする分離装置。7. The separation device according to claim 6 , wherein a width of the path is larger than an average interval between the columns in the column arrangement portion. 請求項６または７に記載の分離装置において、前記パスが流路の試料進行方向とは異なる方向に設けられたことを特徴とする分離装置。In separation apparatus according to claim 6 or 7, separator, characterized in that provided in a direction different from the sample traveling direction of the path flow path. 請求項６乃至８いずれかに記載の分離装置において、前記柱状体配設部中の柱状体間の平均間隔が１００ｎｍ以下であることを特徴とする分離装置。The separation device according to any one of claims 6 to 8 , wherein an average interval between the columns in the column-arranged portion is 100 nm or less. 請求項１乃至９いずれかに記載の分離装置において、前記柱状体配設部を構成する複数の柱状体の密度が、流路の試料進行方向に向かって次第に低くなっていることを特徴とする分離装置。The separation device according to any one of claims 1 to 9 , wherein the density of the plurality of pillars constituting the pillar-arranged portion gradually decreases in the flow direction of the sample in the flow path. Separation device. 請求項１乃至１０いずれかに記載の分離装置において、前記柱状体配設部を構成する複数の柱状体の密度が、流路の試料進行方向に向かって次第に高くなっていることを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 1 0, and wherein the density of a plurality of the columnar body constituting the columnar body arrangement portion has gradually increased toward the specimen traveling direction of the passage Separation equipment. 請求項１乃至１１いずれかに記載の分離装置において、前記柱状体の頂部と前記流路の壁面とが離間していることを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 1 1, the separation device, characterized in that the top of the columnar body and the wall surface of the flow path are separated. 請求項１乃至１２いずれかに記載の分離装置において、柱状体が一列に配設された堰止部をさらに有することを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 1 2, separation apparatus characterized by further having a damming portion columnar bodies are disposed in a row. 請求項１３に記載の分離装置において、前記堰止部が前記試料分離領域に隣接して配設されていることを特徴とする分離装置。In the separation device according to claim 1 3, separation device, characterized in that the blocking portion is disposed adjacent to the sample separation region. 請求項１乃至１４いずれかに記載の分離装置において、前記流路内壁の表面が親水化処理されたことを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 1 4, separation apparatus, characterized in that the surface of the channel inner wall is hydrophilized. 請求項１乃至１５いずれかに記載の分離装置において、前記試料分離領域が、スリットを介して複数に分割されたことを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 1 5, wherein the sample separation region, separation device characterized in that it is divided into a plurality through the slit. 請求項１乃至１６いずれかに記載の分離装置において、前記試料分離領域と、前記試料分離領域よりも柱状体が疎に形成された調整領域とが、流路中の試料進行方向に対して交互に形成されたことを特徴とする分離装置。The separation device according to any one of claims 1 to 16 , wherein the sample separation region and an adjustment region in which a columnar body is formed more sparsely than the sample separation region are arranged in a direction in which the sample travels in the flow path. A separation device characterized by being formed alternately. 請求項１乃至１７いずれかに記載の分離装置において、前記試料に外力を付与して前記試料を前記流路中で移動せしめる外力付与手段をさらに備えたことを特徴とする分離装置。The separation device according to any one of claims 1 to 17 , further comprising an external force applying means for applying an external force to the sample and moving the sample in the flow path. 請求項１８に記載の分離装置において、前記外力が圧力であることを特徴とする分離装置。The separation device according to claim 18 , wherein the external force is a pressure. 請求項１乃至１９いずれかに記載の分離装置において、前記試料が核酸またはタンパク質を含むことを特徴とする分離装置。In the separation device according to any one of claims 1 to 19, separation device, wherein the sample comprises a nucleic acid or protein. 基板表面に複数の柱状体が配設されてなるナノ構造体であって、前記柱状体の断面形状が、頂部よりも底部において幅広となっており、前記複数の柱状体は、隣接する柱状体の側面が、該柱状体の底部において互いに接する程度に近接して形成されていることを特徴とするナノ構造体。A nanostructure in which a plurality of pillars are arranged on a substrate surface, wherein a cross-sectional shape of the pillars is wider at a bottom than at a top, and the plurality of pillars are adjacent pillars. Characterized in that the side surfaces are formed close to each other at the bottom of the columnar body so as to be in contact with each other.

Images