JP3589912B2 - ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に対するモノクローナル抗体、および該抗体を利用する免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内におけるリン脂質の役割について、かつては細胞膜を構成する成分の一つとしてしか認識されていなかった。しかし、近年リン脂質の一種であるイノシトールリン脂質が細胞内情報伝達系において重要な役割を果たしていることが知られるようになってきた。特に、細胞内情報伝達系の異常は細胞の無秩序な増殖を誘発し、いわゆる癌の原因であることが知られるようになってきたことから、生体膜に存在するリン脂質であるホスファチジルイノシトール（以下ＰＩと省略する）の代謝に関する研究が活発に行われるようになってきている。
【０００３】
イノシトールリン脂質の合成はホスファチジルイノシトール−４−キナーゼ（以下ＰＩ４Ｋと省略する）によってＰＩの４位にリン酸が入り、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸が作られ、さらにホスファチジルイノシトール−４−一リン酸−５−キナーゼによって５位にリン酸が入ってホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（以下ＰＩ−４，５−Ｐ２と省略する）が作られた後、この脂質が外部刺激を受けて分解されイノシトール三リン酸（以下ＩＰ３と省略する）とジアシルグリセロール（ＤＧ）を産生するというのが通説であった。しかし、Ｃａｎｔｌｅｙら（Ｒａｍｅｈ， Ｌ．Ｅ． ａｎｄ Ｃａｎｔｌｙ， Ｌ．Ｃ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７４， ８３４７−８３５０， １９９９）は新たにイノシトール環の３位にリン酸を入れるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（以下ＰＩ３Ｋと省略する）を発見し、その酵素の産物であるホスファチジルイノシトール−３−一リン酸（以下ＰＩ−３−Ｐと省略する）やホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（以下ＰＩ−３，４，５−Ｐ３と省略する）の存在を証明した。また、 ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸はＰＩ−３，４，５−Ｐ３の５位を脱リン酸化されることによっても生じることが明らかとなっている。なお本明細書において、ホスァチジルイノシトール−３，４−二リン酸は原則としてＰＩ−３，４−Ｐ２と省略する。以下にＰＩ−３，４−Ｐ２の構造を模式的に示す。
【０００４】
【化１】
ＰＩ−３，４−Ｐ２
【０００５】
従来からＰＩ３Ｋがインスリンの情報伝達系に関与することは知られていたが、インスリンなどの刺激で活性化されるＰＩ３Ｋの産物であるＰＩ−３，４，５−Ｐ３やＰＩ−３，４−Ｐ２はＰＫＤ−１（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｉｎ ｋｉｎａｓｅ−１）やＡｋｔ／ＰＫＢなどのキナーゼを活性化し、細胞死（アポトーシス）を抑制するサバイバルシグナルを発することが明らかになってきた（Ｃｏｆｆｅｒ， Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． Ｖｏｌ．３３５， １−１３， １９９８）。すなわち、 ＰＩ−３，４−Ｐ２はＡｋｔ／ＰＫＢを活性化することによりアポトーシスを抑制し、細胞の生存維持に関与しているのである。
これらのことから、細胞内におけるこれらリン脂質の存在を特異的に検出し、あるいはその動態を明らかにすることが細胞内情報伝達やアポトーシスの機構の解明、ひいては癌や各種疾患の病因解明のために望まれていた。しかし、従来ＰＩ−３，４−Ｐ２を他のポリリン酸ホスファチジルイノシトールと区別して検出あるいは測定する方法は知られていなかった。
【０００６】
ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識できる抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２の精製や免疫測定、あるいはＰＩ−３，４−Ｐ２の阻害剤として有用であるが、一般にリン脂質抗原は免疫原性が低く、抗体を得るのは難しいとされている。さらにＰＩ−３，４−Ｐ２の場合は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を大量に得るのが難しいという問題も伴っていた。そのため、ＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定方法は現在のところ実現していない。免疫学的な測定方法は、簡便な操作で高い感度と制度を達成することが可能な優れた分析方法であり、情報伝達の研究を更に進めるためにＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定を実現することが強く望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する抗体、および該抗体を利用する免疫学的測定方法の提供を課題とする。より具体的には、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する新規な抗体の提供を通じて、たとえば酵素免疫測定法のような、特殊な設備を要求せず、簡便で高感度なＰＩ−３，４−Ｐ２の定量系の実現を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
抗ＰＩ−３，４−Ｐ２抗体の作製は、抗原を大量に得ることが困難であること、また、リン脂質であるため抗原性が低く、抗体価の高い抗体を得ることが難しいなどの問題があった。本発明者らは、ＰＩ−３，４−Ｐ２を有機合成によって大量に合成し前者の問題を解決し、更に抗原性の低さについてはサルモネラ死菌菌体にＰＩ−３，４−Ｐ２を吸着させた免疫原を使って抗原性を上昇させることで克服し、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対し特異的に結合するモノクローナル抗体の作製に成功した。この抗体を用いれば、生体のＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的な免疫学的測定方法が可能となる。本発明者らはさらに、該抗体の可変領域を構成するアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。これにより、組み換え抗体の作製が可能となった。また、本発明による抗体を利用して、ＰＩ−３，４−Ｐ２の細胞内局在の同定や、ＰＩ−３，４−Ｐ２の機能の特異的な阻害剤の開発が可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の抗体、モノクローナル抗体、あるいはその可変領域、抗体産生ハイブリドーマ、ならびにこれらの抗体を利用する免疫学的測定方法に関する。
〔１〕ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を特異的に認識する抗体。
〔２〕抗体がモノクローナル抗体である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸のイノシトール部位とグリセロール骨格とによって構成される抗原決定基を認識する〔２〕に記載の抗体。
〔４〕ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ホスファチジルイノシトール−１，４，５−三リン酸、およびホスファチジルイノシトール−１，３，４，５−四リン酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物と実質的に交差しない〔１〕−〔３〕のいずれかに記載の抗体。
〔５〕〔２〕に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
〔６〕受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託された〔５〕に記載のハイブリドーマ。
〔７〕〔５〕、または〔６〕に記載のハイブリドーマを培養することによる〔２〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
〔８〕配列番号：２に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖の可変領域。
〔９〕配列番号：４に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖の可変領域。
〔１０〕配列番号：５に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ１。
〔１１〕配列番号：６に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ２。
〔１２〕配列番号：７に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ３。
〔１３〕配列番号：８に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ１。
〔１４〕配列番号：９に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ２。
〔１５〕配列番号：１０に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ３。
〔１６〕サルモネラ死菌をアジュバントとしてホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と混合した、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体を得るための免疫原組成物。
〔１７〕〔１６〕に記載の免疫原組成物を免疫し、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体を得る方法。
〔１８〕〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体、またはその可変領域と、試料中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、両者の免疫学的な反応に基づく結合を検出する工程を含む免疫学的測定方法。
〔１９〕抗体またはその可変領域と、それが認識する抗原決定基との免疫学的な反応が、試料中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸によって阻害される程度を観察する〔１８〕に記載の免疫学的測定方法。
〔２０〕〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体またはその可変領域を含む、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の免疫学的測定用キット。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の抗体は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識し、ＰＩ−４，５−Ｐ２とは実質的に交差しない。本発明においてＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的とは、ＰＩ−３，４−Ｐ２のリン酸化の状態を認識し他のリン酸化化合物から免疫学的に識別しうることを意味する。このような抗体は、以下のような免疫操作によって得ることができる。すなわち、ＰＩ−３，４−Ｐ２をサルモネラ死菌菌体とのサスペンジョンとし、これを免疫原とするのである。リポ多糖を取り除いたサルモネラ死菌（Ｇａｌａｎｏｓ Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１１６−１２２，１９７１）に、ＰＩ−３，４−Ｐ２をコートして免疫原用サスペンジョンとする（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３７．３２６４−３２６９）。ＰＩ−３，４−Ｐ２は細胞から精製したものであっても良いし、化学的に合成することもできる。ＰＩ−３，４−Ｐ２は、構造が類似する公知の化合物の合成方法にしたがって得ることができる（Ｔｈｕｍ Ｏ．， Ｃｈｅｎ Ｊ．， Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ Ｇ． Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７， ９０１７−９０２０， １９９６； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９， ９４８５−９４８８， １９９８； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， １６９３−１６９６， １９９９； Ｓａｗａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４５， １５２１−１５２３， １９９７）。これを適当な免疫動物に免疫し、抗体価の上昇を確認したところで抗体を回収する。抗体はポリクローナル抗体としても良いが、モノクローナル抗体とすることによって特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。また、後に述べるように望ましい結合活性を備えたモノクローナル抗体の可変領域を構成するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのクローニングが、モノクローナル抗体の樹立によって可能となる。
【００１１】
モノクローナル抗体は、抗体産生細胞をクローニングすることによって得ることができる。一般的には、免疫動物から回収した抗体産生細胞を適当な融合パートナーと細胞融合させることによってハイブリドーマとし、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う（Ｇｕｌｆｒｅ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６６．５５０−５５２，１９７７）。マウスを免疫動物とするときには、融合パートナーとしては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．６５３等のマウス由来のミエローマ細胞が好適である。ＨＡＴセレクションによって選択されたハイブリドーマは、まずＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでＰＩ−３，４−Ｐ２への結合活性を持つ抗体を産生するものについては、交差性の試験を行う。すなわち、他のリン脂質抗原等への結合活性を調査して許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナルがバックグランドレベルに押さえられれば、実質的に交差反応しないということができる。
【００１２】
本発明における望ましい抗体は、以下に示すようなＰＩ−３，４−Ｐ２と構造が類似する化合物と実質的に交差しない。本発明の特に望ましい抗体は、実施例にも示すようにＰＩ−３，４−Ｐ２をこれらの類似化合物の全てと識別することができる。
ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、
ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、
ホスファチジルイノシトール−１，４，５−三リン酸、および
ホスファチジルイノシトール−１，３，４，５−四リン酸
【００１３】
ＰＩ−３，４−Ｐ２への反応性や、他のリン脂質抗原との反応性を確認するには、ＥＬＩＳＡやリポソーム溶解検定を利用すると有利である。ＥＬＩＳＡでは、反応性を観察すべき抗原を感作したマイクロプレートを用意し、これにハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウエルを洗浄し、イムノグロブリンに対する２次抗体を更に反応させる。最終的にウエルに結合した２次抗体を測定すれば、培養上清中に存在する抗体の抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。脂質抗原を使った抗体のＥＬＩＳＡは公知（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３６，２５６２−２５６７，１９８６）である。
【００１４】
一方、リポソーム溶解検定とは、抗原を感作したリポソームに抗体が反応すると、補体の作用によってリポソームが溶解する現象を利用している。補体の作用を利用していることから、補体依存性のリポソーム溶解検定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）と呼ばれている。リポソームは、たとえばジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；以下ＤＣＰと省略する）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；以下ＤＭＰＣと省略する）、コレステロールに加えて試験すべきリン脂質抗原から構成される。これらの脂質成分を適当な有機溶媒で溶解後に乾燥させてリピッドフィルムとし、水系溶媒に加えて強く撹拌すると、多層ラメラ構造のリポソームを生じる。こうして調製されたリポソームでは、膜の構成成分としてリン脂質抗原が取りこまれる。そのため現実の細胞膜に存在する形に近い状態で抗原構造が提示されることが期待できるので、モノクローナル抗体のスクリーニングには好適である。リポソーム内部には、その溶解のマーカーとなる蛍光色素を封入しておくのが有利である。蛍光色素には、４−メチルウンベリフェロン（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）やカルセイン等が用いられる。補体の存在下でこのリポソームを構成するリン脂質抗原に抗体が結合すると、リポソームは破壊され内部の蛍光色素が流出して液相の蛍光増大として観察される。ＰＩ−４，５−Ｐ２のようなリン脂質抗原を使った補体依存性のリポソーム溶解検定は公知である（Ｍｉｙａｚａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１０， １０２５−１０３１， １９８８）。交差性を確認すべきリン脂質には、構造的に類似するリン脂質抗原を挙げることができる。あるいは、部分構造が共通な類似物質についても交差性を確認しておくと良い。具体的には、次のような物質を示すことができる。これらの物質については、実施例などを通じてその構造的な特徴を図示する。
【００１５】
ＰＣ（ホスファチジルコリン）
ＰＳ（ホスファチジルセリン）
ＰＡ（ホスファチジン酸）
ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）
ＰＩ−４，５−Ｐ２（ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸）
ＩＰ３（１，４，５−イノシトール三リン酸）
ＩＰ４（１，３，４，５−イノシトール四リン酸）
ＩＰ６（１，２，３，４，５，６−イノシトール六リン酸）
【００１６】
ＥＬＩＳＡおよびリポソーム溶解検定はいずれも、ＰＩ−３，４−Ｐ２を抗原として調製した反応系を使って他の脂質抗原に対する抗体の交差性の確認が可能である。すなわち、反応特異性を試験すべき抗体とＰＩ−３，４−Ｐ２との反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
【００１７】
以上のようにして、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を持ち、かつＰＩ−４，５−Ｐ２等の構造的に類似した抗原を免疫学的に識別しうる本発明による抗体を得ることができる。本発明によるモノクローナル抗体はたとえばＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託されたハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬによって産生される。これらハイブリドーマを適当な条件のもとで培養し、産生される抗体を回収すれば本発明によるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマは、ホモハイブリドーマの場合には同系の動物の腹腔に接種して生体内培養が可能である。この場合は、モノクローナル抗体は腹水として回収される。ヘテロハイブリドーマの場合にはヌードマウスを宿主として生体内培養が可能である。
【００１８】
生体内培養のみならず、適当な培養環境を与えて生体外で培養することも一般に行われている。たとえばＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭ等の基礎培地がハイブリドーマの培地として一般に利用されている。これらの培地には、抗体産生能を高く維持するために動物血清等の添加剤を加えることができる。生体外でハイブリドーマを培養する場合には、モノクローナル抗体は培養上清として回収することができる。培養上清は、培養終了時に細胞から分離することにより回収することもできるし、あるいはホローファイバーを応用した培養装置においては、培養を継続しながら連続的に回収することも可能である。
腹水や培養上清として回収したモノクローナル抗体は、飽和硫安塩析によりそのイムノグロブリン分画を分取し、更にゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィー等の精製工程を経て本発明のモノクローナル抗体とする。この他にモノクローナル抗体がＩｇＧであれば、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムによるアフィニティクロマトグラフィーに基づく精製方法が有効である。
【００１９】
更に本発明は、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する望ましい結合活性を備えた新規な抗体について、その可変領域を構成するアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列を提供する。すなわち本発明は、配列番号：２および配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むイムノグロブリン可変領域を提供する。あるいは本発明は、配列番号：１および配列番号：３に示す塩基配列を含むイムノグロブリン可変領域をコードするｃＤＮＡを提供する。配列番号：１および配列番号：２は、イムノグロブリン重鎖由来、配列番号：３および配列番号：４はイムノグロブリン軽鎖のものである。これらアミノ酸配列、あるいはｃＤＮＡの塩基配列は、必ずしも同一である必要は無く、ＰＩ−３，４−Ｐ２との特異的な結合活性を維持する限り変異を含むことができる。後に述べるように、特にＣＤＲに相当する部分については変異性が高く、この領域においてはアミノ酸の変異が許容されるケースもある。
【００２０】
一般にイムノグロブリンは、分子量の大きな重鎖及び分子量の小さな軽鎖から構成されている。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基において可変領域と称される分子間でアミノ酸配列の異なる領域を有しており、重鎖の可変領域はＶＨ、軽鎖の可変領域はＶＬと表される。この重鎖の可変領域ＶＨと軽鎖の可変領域ＶＬが相対して静電的に結合して２量体を形成することにより、抗原結合部位が形成される。可変領域は、３つのＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：相補性決定部位）と４つのフレームワークで構成される。なお、ＣＤＲとは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し抗体の特異性を決定する部位であり、ＣＤＲの立体構造の維持に働いている４つのＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：枠組み構造領域）に挟まれて３つのＣＤＲが可変領域中にモザイク状に存在する（Ｅ． Ａ． Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「免疫学的観点におけるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」，ｖｏｌ Ｉ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （１９９１））。ＦＲのアミノ酸配列は良く保存されているのに対して、ＣＤＲの変異性は高く、超可変領域（ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれる。本発明においては、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する抗体のアミノ酸配列のうち抗原との結合活性を決定しているＣＤＲを明らかにした。すなわち、本発明は以下に示すＣＤＲ（配列番号：１または３におけるＮ末端のアミノ酸を１とする位置で示したもの）をも提供するものである。なおカッコ内に記載した数字は配列番号に対応する。
【００２１】
【００２２】
本発明によるイムノグロブリンの可変領域をコードする塩基配列を持ったｃＤＮＡは、前記ＰＩ−３，４−Ｐ２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからクローニングすることができる。たとえばＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託された本発明のハイブリドーマは、クローニングの出発材料として好適である。具体的には、可変領域遺伝子のシグナル配列と定常領域側の塩基配列を利用してＰＣＲを行い、増幅生成物を適当なクローニングベクターに挿入して増幅し、可変領域遺伝子のライブラリーとする。上記ＣＤＲに相当する部分は本発明による可変領域に特異的な配列といえるので、これをプローブとして前記可変領域のライブラリーをもとにポジティブクローンをスクリーニングする。得られたｃＤＮＡは、軽鎖と重鎖の可変領域遺伝子を適当なリンカーで連結してファージに組み込み、１本鎖抗体（いわゆるｓｃＦＶ）として発現させることができる。あるいは、公知のイムノグロブリン発現用ベクターに組み込むことにより、イムノグロブリンの産生に利用することができる。イムノグロブリン発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス） ｂａｓｅｄベクターなどを用いることができるが、特にこれらに限定されない。たとえばＢＰＶベクターの１種である「ＢＣＭＧＳ Ｎｅｏベクター」（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」，村松正実および岡山博人編，実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ．２９７−２９９ （１９９１））は、ＣＯＳ７細胞などに形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである。
【００２３】
あるいは、上記ＣＤＲを任意のイムノグロブリンのフレームワークに組み込むことにより、本発明による抗体の特異性を人為的に再構成することもできる。このような技術は、ＣＤＲグラフト抗体（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２ （１９８６））と呼ばれ、マウスのイムノグロブリンをヒト化するための技術として既に確立されている。本発明によるＣＤＲは、完全に同一のもののみならず、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性を維持する限り変異を含むものであることもできる。すなわち、本発明において、前記ＣＤＲ領域の配列を１個または数個改変したアミノ酸配列も、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合特異性が保持される限り、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列として利用することができる。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の中で変換するアミノ酸は、好ましくは全体のＣＤＲの３０％以下であり、更に好ましくは全体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の１０％以下である。前記ＣＤＲを組み込むべきＦＲは、任意のものとすることができる。本発明によるＣＤＲはもともとマウスのイムノグロブリンに由来するが、マウスのみならず他の種のイムノグロブリンのＦＲとすることも可能である。構築された可変領域をコードするｃＤＮＡは、前記ベクターに組み込むことにより発現可能となる。
【００２４】
ＣＤＲへの変異の導入にあたり、前記ファージベクターを利用することができる。ファージベクターは、抗体活性を速やかに発現することから、変異体のスクリーニングを迅速に行うことができる。またスクリーニングに十分な量の抗体分子を宿主細菌の表面にもたらす。ＣＤＲへの変異の導入により抗体の結合活性を著しく増大した例も知られていることから、本発明によって提供されるＣＤＲに基づいて更に結合活性に優れる１本鎖抗体を得られる可能性がある。
【００２５】
本発明によって提供される可変領域、または本発明に基づくＣＤＲを組み込んだ可変領域は、そのまま発現させても良いし、定常領域をコードする遺伝子と連結して完全なイムノグロブリン分子として発現させることもできる。
【００２６】
上記ｃＤＮＡをそのまま組み込んだベクター、あるいはＣＤＲのみを任意のＦＲに連結したインサートを含むベクターによる可変領域の発現にあたり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを同じ宿主細胞中で発現させて重鎖／軽鎖からなる２量体として産生させるのが有利である。そのためには、軽鎖発現ベクター及びヒト化重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることができる。形質転換の宿主としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０， ３３９３−３４０２ （１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９ （１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２ （１９９０））などが好適に用いられる。また、形質転換には、リポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６０７７ （１９８９）， Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３ （１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ ＆ Ａ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００２７】
なお発現産物である可変領域が定常領域を伴っていれば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて精製することにより精製タンパク質として回収することができる。もしも可変領域のみを発現させた場合にはこれらの精製方法が適用できないので、適当な精製方法を応用することになる。たとえば、そのＣ末端にヒスチジンタグなどの精製に有利なタンパク質を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製することが可能である。
【００２８】
本発明は、このようして得られたモノクローナル抗体、あるいはその可変領域に基づいて、ＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定方法を実現するものである。従来はＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的な抗体そのものが提供されておらず、免疫学的な測定方法は不可能であった。本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性に優れ、ＰＩ−３，４−Ｐ２の理想的な免疫学的測定方法を実現する。
【００２９】
ＰＩ−３，４−Ｐ２と本発明による抗体（可変領域を含む）との結合が、測定対象試料に由来するＰＩ−３，４−Ｐ２によって阻害されることを利用し、この阻害の程度を観察すればＰＩ−３，４−Ｐ２を測定することができる。このような測定原理を実現するひとつの方法は、固相化ＰＩ−３，４−Ｐ２を利用した測定方法である。すなわち、マイクロプレートのような容器にＰＩ−３，４−Ｐ２を吸着させておき、これにまず測定試料を加える。ＰＩ−３，４−Ｐ２はホスファチジルコリンのような適当なキャリアーに溶解して容器壁に物理吸着させることができる。次いで本発明による抗体を加えると、容器側のＰＩ−３，４−Ｐ２と試料中のＰＩ−３，４−Ｐ２とが本発明の抗体に対して競合する。抗体を適当な手段で標識しておけば、固相に結合した（またはしなかった）抗体を簡単に測定することができる。予め標準試料で測定しておいた結果と照合すれば、どの程度のＰＩ−３，４−Ｐ２が試料に含まれていたのかを決定することができる。抗体の標識には、酵素、蛍光標識、あるいは発光標識等を利用すると良い。ＰＩ−３，４−Ｐ２の測定は、組織、培養細胞、あるいは血液や血清等の体液等の生体試料を対象に行われる。同様の競合的測定方法は、本発明の抗体を容器側に固定しておくことによっても達成することができる。この場合は、標識したＰＩ−３，４−Ｐ２をＰＩ−３，４−Ｐ２含有試料と共に抗体に反応させることになる。
【００３０】
免疫学的測定方法のための試料は、前記の液状のもののみならず固体試料であっても良い。たとえば、組織標本を対象として、免疫染色を行ってＰＩ−３，４−Ｐ２の有無や局在を観察することができる。望ましい態様によれば、本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部位とグリセロール骨格とによって構成されるエピトープを認識する。このエピトープは細胞膜の表面に露出しているものと推測されるので、組織標本の染色に有利な抗体ということができる。このとき、たとえばＰＩ−４，５−Ｐ２を特異的に認識する抗体と組み合わせて、複数のリン脂質の局在を同一の試料中で観察することもできる。異なる抗体を波長の異なる蛍光色素で標識しておき、同一の試料を染色する二重染色の手法（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｉｎ）は公知である。
【００３１】
本発明は、これら免疫学的な測定方法を実施するためのキットを提供する。すなわち、本発明による抗体をはじめとして、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせてキットとすることができる。以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３２】
【実施例】
［実施例１］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体の作製
抗ＰＩ−３，４−Ｐ２抗体の作製にあたり、合成ＰＩ−３，４−Ｐ２をアジュバント（Ａｄｊｕｂａｎｔ）としてサルモネラ死菌体にコートし免疫原とした。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｅｓｏｔａを一晩培養し、菌体を回収した。菌体は蒸留水で２回遠心洗浄し、更にジエチルエーテルで１回洗浄後に真空乾燥した。洗浄後の菌体を１％酢酸水溶液に分散させ、１００℃で２時間加熱してリポ多糖類に結合したオリゴサッカライドを除去した（Ｇａｌａｎｏｓ Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１１６−１２２，１９７１）。処理後の菌体を洗浄し、５０μｇの菌体に対して４μｇのＰＩ−３，４−Ｐ２を添加してコートし、懸濁させたものを免疫原（１回分）とした（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３７．３２６４−３２６９）。ＰＩ−３，４−Ｐ２は公知の方法（Ｔｈｕｍ Ｏ．， Ｃｈｅｎ Ｊ．， Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ Ｇ． Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７， ９０１７−９０２０， １９９６； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９， ９４８５−９４８８， １９９８； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， １６９３−１６９６， １９９９； Ｓａｗａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４５， １５２１−１５２３， １９９７）により化学的に合成したものを用いた。この免疫原をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の尾静脈に１週間おきに数回免疫し、抗体価の上昇したマウスについて、その脾臓細胞をミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．６５３と融合しハイブリドーマを作製した。
【００３３】
ＨＡＴセレクションの後、生存しているハイブリドーマの培養上清中に含まれる抗体のＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を指標にスクリーニングを行った。抗体の結合活性はリポソーム溶解検定によってスクリーニングするとともに、陽性クローンが産出する抗体については間接法ＥＬＩＳＡによって交差反応性の試験も行った。
【００３４】
リポソーム溶解検定ではまずＰＩ−３，４−Ｐ２（〜１％）、ホスファチジルコリン（４０％）、コレステロール（５０％）、ジセチルホスフェート（１０％）をクロロホルムに溶解し、減圧乾固してリピットフィルムを作製した。これに蛍光色素であるカルセインの高濃度水溶液を加えて強く撹拌し、カルセイン封入多重膜リポソームを調製した。このリポソームに培養上清を補体とともに加え、抗体の抗原への結合により補体が活性化されて膜に穴を開ける反応を起こさせた。培養上清にＰＩ−３，４−Ｐ２に結合する抗体が存在すれば、リポソーム内の高濃度のカルセインが流出して濃度が下がり蛍光を発するようになる。この蛍光の強さを測定することによって、抗体の抗原への活性を測定した。
【００３５】
一方、間接法ＥＬＩＳＡは以下のように行った。まず、プレートに５μｇ／ｍＬのホスファチジルコリン（キャリアー）に溶かした１００ｎｇ／ｍＬのＰＩ−３，４−Ｐ２を入れ、一晩室温で静置してコーティングを行い、その後乾燥させた。次に、ブロッキングバッファー（１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＨＢＳ， ｐＨ ７．６））で３０分間室温でインキュベートした。ブロッキング処理した抗原感作プレートは、洗浄後に密封して使用時まで冷蔵保存した。
【００３６】
抗原感作プレートのウエルに、ＰＩＰ３、ＰＩ−４，５−Ｐ２、ＩＰ３、ＩＰ４、およびＩＰ６（０．５％ ＢＳＡ／ＨＢＳで１００−１０４ｎｇ／ｍＬに段階希釈したもの）１００μＬとハイブリドーマの培養上清１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。反応液を除去し、ＨＢＳで洗浄して第２抗体（アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ３または抗マウスＩｇＭ；０．５％ ＢＳＡ／ＨＢＳで１／２０００に希釈したもの）を加え、室温で２時間インキュベートした。第２抗体の反応後、未反応の抗体を除去して再度ＨＢＳで洗浄し、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート （ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＮＰＰ）を加えてウエルに残ったアルカリホスファターゼの活性を測定した。培養上清に含まれる抗体がＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的なものであれば、共存する各種化合物の競合阻害を受けることなくＰＩ−３，４−Ｐ２との免疫反応が進み、固相には高いアルカリフォスファターゼ活性が保持される。一方、 ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する反応性が無かったり、あるいは共存する各種の抗原に対して交差性を持った抗体では、競合阻害のために固相のＰＩ−３，４−Ｐ２と反応する抗体の数が減るので、結果として固相に保持されるアルカリフォスファターゼ活性は低いものとなる。間接法ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬの培養上清の測定結果を図１に示した。８Ｃ２−ＦＮＬはＰＩ−３，４−Ｐ２のみと反応する抗体を産生するので、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対してのみ濃度依存的に結合％（培養上清のみを添加したときの吸光度測定値を１００とする％）の低下が起きている。
【００３７】
このスクリーニングの結果、ＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応する抗体を産生する４クローンを樹立した。各クローンの名称を以下にまとめる。ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する相対的反応性は、４０％のリポソームを溶解させるのに必要な濃度の逆数（ｍｌ／μｇ）として定義した。これらクローンのうち、ＰＩ−３，４−Ｐ２に最も高い反応性を示す８Ｃ２−ＦＮＬが産生する抗体（以下、特に断りのないときには８Ｃ２はモノクローナル抗体を指すものとする）について、更にその反応性を詳細に検討した。
【００３８】
［実施例２］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体８Ｃ２ （ＩｇＧ３）の特異性の検討
実施例１で得られた抗体の中で、ＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応し最も特異性の高かった８Ｃ２についてリポソーム溶解検定により、更に検討を行った。検討に先だって、ハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬをプリスタン処理したマウスの腹腔に接種し、その腹水から硫安分画によりイムノグロブリンを精製しモノクローナル抗体８Ｃ２とした。リポソーム溶解検定に用いた脂質抗原は以下のとおりである。
ホスファチジルコリン（ＰＣ）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）
ホスファチジン酸（ＰＡ）
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）
【００３９】
リポソームは５０％コレステロール、４０％ホスファチジルコリンを主成分とし残りの１０％をそれぞれ違った脂質に変えたものを用意した。脂質の組成が異なる他は、同様の操作でリポソームを調製した。このリポソームに対して抗体の希釈度を１０−１−１０−７に変えて８Ｃ２の結合活性を検定したところ、ＰＩ−３，４−Ｐ２を含むリポソームでのみ濃度依存的にリポソームの溶解が起こった。一方、ＰＣ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＩ、あるいはＰＥといった、細胞膜を構成する他のリン脂質を含むリポソームでは用意した最高の抗体濃度の希釈溶液（１０−１）を用いても溶解は観察されなかった（図２）。なお図中、リポソーム溶解（％）とは、反応させたすべてのリポソームが溶解したときの蛍光強度を１００とする％を意味する。これらのことから、８Ｃ２がリン脂質の中からＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応することが確認された。８Ｃ２が認識するエピトープについて更に詳細な情報を得ることを目的として、ホスファチジルイノシトールの各種リン酸化誘導体抗原との交差反応性を検討した。
【００４０】
５０％コレステロール、４０％ホスファチジルコリン、９％ジセチルホスフェートを主成分とし、残りの１％を以下のリン脂質のリン酸化誘導体としたリポソームを用意した。
ＰＩ
ＰＩ４Ｐ（ホスファチジルイノシトールリン酸）
ＰＩ−３，４−Ｐ２
ＰＩ−４，５−Ｐ２
Ｎ−ＰＩＰ３（天然のＰＩＰ３、アレクシス社より購入）
Ｓ−ＰＩＰ３（化学合成したＰＩＰ３）
ＰＡ（ホスファチジン酸）
ＰＣ
ＰＥ
ＰＳ
カルジオリピン
【００４１】
抗体の希釈度を１０−１−１０−６に変えてアッセイしたところ、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対しては先の実験と同様濃度依存的に溶解が起こったが、その他のいずれのリン脂質に対しても、用意した最高の抗体濃度の希釈溶液を用いても反応しなかった（図３）。構造的にたいへん良く似ているＰＩ−４，５−Ｐ２に対しても、ＰＩ−３，４−Ｐ２の１％以下の交差反応性しか観察されなかった。以上のことから、８Ｃ２の抗原の認識にはイノシトール部の４位のリン酸基が重要であり３位のリン酸基もエピトープ構造に関与していると考えられた。
【００４２】
［実施例３］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体 ８Ｃ２ （ＩｇＧ３） のエピトープの検討 ８Ｃ２の抗体の認識部位を探るためＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部分と構造の似たイノシトールポリリン酸３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭを競合剤として先に述べたリポソーム溶解検定を行った。イノシトールポリリン酸としては、次の化合物を用意した。
イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）
イノシトール−１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）
イノシトール−１，２，３，４，５，６−六リン酸（ＩＰ６）
【００４３】
その結果、競合剤としてフリーのＰＩ−３，４−Ｐ２を加えた時は固相化されたＰＩ−３，４−Ｐ２との競合により吸光度が濃度依存的に減少したが、他のイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、イノシトール−１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）、イノシトール−１，２，３，４，５，６−六リン酸（ＩＰ６）では影響は見られなかった（図４）。
【００４４】
これらの結果から、抗体の認識部位にはグリセロール骨格も含まれていることが示唆された。更にＰＩ−３，４−Ｐ２の添加濃度に依存して溶解度が減少していることから明らかなように、本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２の競合的原理に基づく免疫測定を可能とする。しかも他の類似の構造を持った種々の化合物の影響をほとんど受けないことから、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性に優れた測定系を容易に実現するものである。
次に、ＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖が抗体の認識部位を構成しているのかどうかを調べるために、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖の長さを変えたものについてリポソーム溶解検定により反応性を検討したるＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖の長さが異なる以下の構造式からな化合物について実験を行った。
【００４５】
【化２】
ＰＳ
【００４６】
【化３】
Ｃ１６ＰＩ−３，４−Ｐ２
【００４７】
【化４】
Ｃ４ＰＩ−３，４−Ｐ２
【００４８】
その結果、ＰＳでは濃度に依存せずリポソームの溶解の度合いは一定であり、ＰＳによる競合は認められなかったが、Ｃ１６ＰＩ−３，４−Ｐ２、およびＣ４ＰＩ−３，４−Ｐ２ではいずれも濃度の上昇に伴いリポソームの溶解が減少した（図５）。このことから側鎖の長さの違いによらず本発明による抗体がイノシトール環の部分を認識していることが分かった。
【００４９】
本発明による抗体を産生するハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬは、次のように国際寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９）。
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日（原寄託日） 平成１１年８月１８日
（ｃ）受託番号 生命研条寄第６８４９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９）
【００５０】
［実施例４］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体の超可変領域（ＣＤＲ）の特定
本発明によるＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識するモノクローナル抗体８Ｃ２について、その可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニングを試みた。ハイブリドーマから抽出したＲＮＡにシグナルペプチド、コンスタントリージョン（定常領域）の配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。まず、ハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養し、ポリＡ＋ＲＮＡを調製した。そのポリＡ＋ＲＮＡ ５μｇより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分を１サイクルとし、ＰＣＲを３０サイクル行った。用いたプライマーの５’側には、クローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのクローニングサイトに合わせた制限酵素の認識配列がそれぞれ付加されている。
【００５１】
得られた増幅生成物から、アガロースゲル電気泳動によって重鎖の場合は約４００ｂｐ、軽鎖の場合は約３００ｂｐの長さを持つバンドを分離し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んで、クローニングの後にベクターを回収した。インサートの塩基配列は、ベクタープライマーと［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いたジデオキシ法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４， １２０５−１２１０ （１９８１））により確認した。こうして得た遺伝子がコードするアミノ酸配列を導出し、構造予測法（コーティアのナンバーリングスキーム）により超可変領域ＣＤＲを特定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／￣ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ＧｅｎｅｒａｌＩｎｆｏ．ｈｔｍｌ＃ｋａｂａｔｎｕｍ， Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２７３，９２７−９４８，１９９７）。得られた結果を以下にまとめる。
【００５２】
［実施例５］Ｈ２Ｏ２処理によって産生を誘導されたＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫染色
２９３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｎｏ．ＪＣＲＢ９０６８）を、カバーグラス上で培養し、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）を加えたものと、加えないものを作り、その後１０ｍＭ Ｈ２Ｏ２で０分、３分、１０分間処理した。１０％ホルマリン入りＰＢＳで１０分間室温で反応させ固定し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１０分間室温で反応させ細胞を透過性にした。１０％子牛血清入りダルベッコ培地で１０分以上室温で反応させ、ブロッキングした後、８Ｃ２−ＦＮＬハイブリドーマの培養上清をそのまま用いて、湿箱中で室温２時間以上反応させ、一次反応とした（培養液：１０％ 牛胎児血清入りイスコフ改変ダルベッコ培地）。つづいてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ３（サザンバイオテクノロジー社、１１００−０２）、ブロッキング液で１／１００希釈し、室温２時間以上反応させ二次反応とした。反応後の標本は９０％グリセロールで封入して観察した。
【００５３】
その結果、Ｈ２Ｏ２処理によってＰＩ−３，４−Ｐ２の産生を誘導する前に、ウォルトマンニンを加えなかった場合には、Ｈ２Ｏ２処理後３分、１０分でＰＩ−３，４−Ｐ２の染色が認められ、時間とともに染色が強くなったが、ウォルトマンニンを加えた場合では、Ｈ２Ｏ２処理後においても細胞の染色が認められず、本発明による抗体がＰＩ−３，４−Ｐ２と反応することが確認された（図７）。
次に、８Ｃ２の特異性を確認するために、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＩ−３，４−Ｐ２、ＰＩ−４，５−Ｐ２を添加して、その影響を調べた。その結果、ＰＣ、ＰＩ−４，５−Ｐ２の添加によっては競合を受けず、細胞中のＰＩ−３，４−Ｐ２の染色による蛍光が観察されたが、ＰＩ−３，４−Ｐ２を添加した場合には、抗体が吸収され細胞の蛍光は認められなかった（図８）。このことから本発明による抗体が、ＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的であることが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対し特異的に結合するモノクローナル抗体が提供された。また本発明によって、この抗体を用いた免疫学的測定方法が提供された。この抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部位のみならずグリセロール骨格もエピトープとして認識していると考えられ、他のイノシトール化合物とＰＩ−３，４−Ｐ２を識別することが可能である。
また本発明は、この抗体の可変領域をコードする遺伝子も取得し、組み換え抗体の作成が可能となった。この抗体を用いることでそのＰＩ−３，４−Ｐ２への特異的な結合を利用して、例えば細胞内でのＰＩ−３，４−Ｐ２の存在場所の特定や、ＰＩ−３，４−Ｐ２の下流への情報伝達を阻害して影響を調べるといった、従来の解析法ではできなかった研究を行うことが可能となる。
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】８Ｃ２の各種イノシトールポリリン酸に対する交差反応性を確認するための間接法ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図中、縦軸は８Ｃ２の結合（％）を、横軸は競合剤の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図２】類似が類似したリン脂質に対する８Ｃ２の結合活性を確認するためのリポソーム溶解検定の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は抗体の希釈度（１０−ｎ）を示す。
【図３】構造が類似した化合物に対する８Ｃ２の結合活性を確認するためのリポソーム溶解検定の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は抗体の希釈度（１０ｎ）を示す。
【図４】リポソーム溶解検定における競合反応を用いた構造が類似するイノシトール化合物に対する、８Ｃ２の反応性の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は競合化合物の濃度（Ｍ）を示す。
【図５】リポソーム溶解検定における競合反応を用いた側鎖の長さが異なるＰＩ−３，４−Ｐ２に対する、８Ｃ２の反応性の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は競合化合物の濃度（Ｍ）を示す。
【図６】モノクローナル抗体８Ｃ２の軽鎖および重鎖の可変領域中の、予測される超可変（ＣＤＲ）領域を示す図である。
【図７】Ｈ２Ｏ２処理によって産生を誘導されたＰＩ−２，３−Ｐ２の免疫染色の図である。上段の６つはウォルトマンニンを加えていない場合、下段の６つは加えた場合である。
【図８】類似化合物の競合反応により８Ｃ２の特異性を示す免疫染色の図である。Ａ、Ｂは競合剤なし、Ｃ、Ｄは５０μＭホスファチジルコリン、Ｅ、Ｆは５０μＭ ＰＩ−３，４−Ｐ２、Ｇ、Ｈは５０μＭ ＰＩ−４，５−Ｐ２を競合剤として加えた場合である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に対するモノクローナル抗体、および該抗体を利用する免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内におけるリン脂質の役割について、かつては細胞膜を構成する成分の一つとしてしか認識されていなかった。しかし、近年リン脂質の一種であるイノシトールリン脂質が細胞内情報伝達系において重要な役割を果たしていることが知られるようになってきた。特に、細胞内情報伝達系の異常は細胞の無秩序な増殖を誘発し、いわゆる癌の原因であることが知られるようになってきたことから、生体膜に存在するリン脂質であるホスファチジルイノシトール（以下ＰＩと省略する）の代謝に関する研究が活発に行われるようになってきている。
【０００３】
イノシトールリン脂質の合成はホスファチジルイノシトール−４−キナーゼ（以下ＰＩ４Ｋと省略する）によってＰＩの４位にリン酸が入り、ホスファチジルイノシトール−４−一リン酸が作られ、さらにホスファチジルイノシトール−４−一リン酸−５−キナーゼによって５位にリン酸が入ってホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（以下ＰＩ−４，５−Ｐ２と省略する）が作られた後、この脂質が外部刺激を受けて分解されイノシトール三リン酸（以下ＩＰ３と省略する）とジアシルグリセロール（ＤＧ）を産生するというのが通説であった。しかし、Ｃａｎｔｌｅｙら（Ｒａｍｅｈ， Ｌ．Ｅ． ａｎｄ Ｃａｎｔｌｙ， Ｌ．Ｃ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２７４， ８３４７−８３５０， １９９９）は新たにイノシトール環の３位にリン酸を入れるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（以下ＰＩ３Ｋと省略する）を発見し、その酵素の産物であるホスファチジルイノシトール−３−一リン酸（以下ＰＩ−３−Ｐと省略する）やホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（以下ＰＩ−３，４，５−Ｐ３と省略する）の存在を証明した。また、 ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸はＰＩ−３，４，５−Ｐ３の５位を脱リン酸化されることによっても生じることが明らかとなっている。なお本明細書において、ホスァチジルイノシトール−３，４−二リン酸は原則としてＰＩ−３，４−Ｐ２と省略する。以下にＰＩ−３，４−Ｐ２の構造を模式的に示す。
【０００４】
【化１】
ＰＩ−３，４−Ｐ２
従来からＰＩ３Ｋがインスリンの情報伝達系に関与することは知られていたが、インスリンなどの刺激で活性化されるＰＩ３Ｋの産物であるＰＩ−３，４，５−Ｐ３やＰＩ−３，４−Ｐ２はＰＫＤ−１（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｉｎ ｋｉｎａｓｅ−１）やＡｋｔ／ＰＫＢなどのキナーゼを活性化し、細胞死（アポトーシス）を抑制するサバイバルシグナルを発することが明らかになってきた（Ｃｏｆｆｅｒ， Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． Ｖｏｌ．３３５， １−１３， １９９８）。すなわち、 ＰＩ−３，４−Ｐ２はＡｋｔ／ＰＫＢを活性化することによりアポトーシスを抑制し、細胞の生存維持に関与しているのである。
これらのことから、細胞内におけるこれらリン脂質の存在を特異的に検出し、あるいはその動態を明らかにすることが細胞内情報伝達やアポトーシスの機構の解明、ひいては癌や各種疾患の病因解明のために望まれていた。しかし、従来ＰＩ−３，４−Ｐ２を他のポリリン酸ホスファチジルイノシトールと区別して検出あるいは測定する方法は知られていなかった。
【０００６】
ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識できる抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２の精製や免疫測定、あるいはＰＩ−３，４−Ｐ２の阻害剤として有用であるが、一般にリン脂質抗原は免疫原性が低く、抗体を得るのは難しいとされている。さらにＰＩ−３，４−Ｐ２の場合は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を大量に得るのが難しいという問題も伴っていた。そのため、ＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定方法は現在のところ実現していない。免疫学的な測定方法は、簡便な操作で高い感度と制度を達成することが可能な優れた分析方法であり、情報伝達の研究を更に進めるためにＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定を実現することが強く望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する抗体、および該抗体を利用する免疫学的測定方法の提供を課題とする。より具体的には、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する新規な抗体の提供を通じて、たとえば酵素免疫測定法のような、特殊な設備を要求せず、簡便で高感度なＰＩ−３，４−Ｐ２の定量系の実現を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
抗ＰＩ−３，４−Ｐ２抗体の作製は、抗原を大量に得ることが困難であること、また、リン脂質であるため抗原性が低く、抗体価の高い抗体を得ることが難しいなどの問題があった。本発明者らは、ＰＩ−３，４−Ｐ２を有機合成によって大量に合成し前者の問題を解決し、更に抗原性の低さについてはサルモネラ死菌菌体にＰＩ−３，４−Ｐ２を吸着させた免疫原を使って抗原性を上昇させることで克服し、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対し特異的に結合するモノクローナル抗体の作製に成功した。この抗体を用いれば、生体のＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的な免疫学的測定方法が可能となる。本発明者らはさらに、該抗体の可変領域を構成するアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。これにより、組み換え抗体の作製が可能となった。また、本発明による抗体を利用して、ＰＩ−３，４−Ｐ２の細胞内局在の同定や、ＰＩ−３，４−Ｐ２の機能の特異的な阻害剤の開発が可能であることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の抗体、モノクローナル抗体、あるいはその可変領域、抗体産生ハイブリドーマ、ならびにこれらの抗体を利用する免疫学的測定方法に関する。
〔１〕ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を特異的に認識する抗体。
〔２〕抗体がモノクローナル抗体である、〔１〕に記載の抗体。
〔３〕ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸のイノシトール部位とグリセロール骨格とによって構成される抗原決定基を認識する〔２〕に記載の抗体。
〔４〕ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、ホスファチジルイノシトール−１，４，５−三リン酸、およびホスファチジルイノシトール−１，３，４，５−四リン酸からなる群より選ばれた少なくとも１つの化合物と実質的に交差しない〔１〕−〔３〕のいずれかに記載の抗体。
〔５〕〔２〕に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
〔６〕受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託された〔５〕に記載のハイブリドーマ。
〔７〕〔５〕、または〔６〕に記載のハイブリドーマを培養することによる〔２〕に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
〔８〕配列番号：２に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖の可変領域。
〔９〕配列番号：４に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖の可変領域。
〔１０〕配列番号：５に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ１。
〔１１〕配列番号：６に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ２。
〔１２〕配列番号：７に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン重鎖のＣＤＲ３。
〔１３〕配列番号：８に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ１。
〔１４〕配列番号：９に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ２。
〔１５〕配列番号：１０に示すアミノ酸配列、または１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列からなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸に特異的に結合するイムノグロブリン軽鎖のＣＤＲ３。
〔１６〕サルモネラ死菌をアジュバントとしてホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と混合した、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体を得るための免疫原組成物。
〔１７〕〔１６〕に記載の免疫原組成物を免疫し、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体を得る方法。
〔１８〕〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体、またはその可変領域と、試料中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、両者の免疫学的な反応に基づく結合を検出する工程を含む免疫学的測定方法。
〔１９〕抗体またはその可変領域と、それが認識する抗原決定基との免疫学的な反応が、試料中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸によって阻害される程度を観察する〔１８〕に記載の免疫学的測定方法。
〔２０〕〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の抗体またはその可変領域を含む、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の免疫学的測定用キット。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の抗体は、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識し、ＰＩ−４，５−Ｐ２とは実質的に交差しない。本発明においてＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的とは、ＰＩ−３，４−Ｐ２のリン酸化の状態を認識し他のリン酸化化合物から免疫学的に識別しうることを意味する。このような抗体は、以下のような免疫操作によって得ることができる。すなわち、ＰＩ−３，４−Ｐ２をサルモネラ死菌菌体とのサスペンジョンとし、これを免疫原とするのである。リポ多糖を取り除いたサルモネラ死菌（Ｇａｌａｎｏｓ Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１１６−１２２，１９７１）に、ＰＩ−３，４−Ｐ２をコートして免疫原用サスペンジョンとする（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３７．３２６４−３２６９）。ＰＩ−３，４−Ｐ２は細胞から精製したものであっても良いし、化学的に合成することもできる。ＰＩ−３，４−Ｐ２は、構造が類似する公知の化合物の合成方法にしたがって得ることができる（Ｔｈｕｍ Ｏ．， Ｃｈｅｎ Ｊ．， Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ Ｇ． Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７， ９０１７−９０２０， １９９６； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９， ９４８５−９４８８， １９９８； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， １６９３−１６９６， １９９９； Ｓａｗａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４５， １５２１−１５２３， １９９７）。これを適当な免疫動物に免疫し、抗体価の上昇を確認したところで抗体を回収する。抗体はポリクローナル抗体としても良いが、モノクローナル抗体とすることによって特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。また、後に述べるように望ましい結合活性を備えたモノクローナル抗体の可変領域を構成するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのクローニングが、モノクローナル抗体の樹立によって可能となる。
【００１１】
モノクローナル抗体は、抗体産生細胞をクローニングすることによって得ることができる。一般的には、免疫動物から回収した抗体産生細胞を適当な融合パートナーと細胞融合させることによってハイブリドーマとし、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う（Ｇｕｌｆｒｅ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６６．５５０−５５２，１９７７）。マウスを免疫動物とするときには、融合パートナーとしては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．６５３等のマウス由来のミエローマ細胞が好適である。ＨＡＴセレクションによって選択されたハイブリドーマは、まずＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を指標としてスクリーニングを行う。次いでＰＩ−３，４−Ｐ２への結合活性を持つ抗体を産生するものについては、交差性の試験を行う。すなわち、他のリン脂質抗原等への結合活性を調査して許容できるものを選択する。許容できる交差性とは、目的とする抗体の用途において、無視しうる程度の交差性を意味する。たとえば、免疫学的な測定に用いるためのモノクローナル抗体であれば、最終的な測定系において交差反応によるシグナルがバックグランドレベルに押さえられれば、実質的に交差反応しないということができる。
【００１２】
本発明における望ましい抗体は、以下に示すようなＰＩ−３，４−Ｐ２と構造が類似する化合物と実質的に交差しない。本発明の特に望ましい抗体は、実施例にも示すようにＰＩ−３，４−Ｐ２をこれらの類似化合物の全てと識別することができる。
ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸、
ホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸、
ホスファチジルイノシトール−１，４，５−三リン酸、および
ホスファチジルイノシトール−１，３，４，５−四リン酸
【００１３】
ＰＩ−３，４−Ｐ２への反応性や、他のリン脂質抗原との反応性を確認するには、ＥＬＩＳＡやリポソーム溶解検定を利用すると有利である。ＥＬＩＳＡでは、反応性を観察すべき抗原を感作したマイクロプレートを用意し、これにハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウエルを洗浄し、イムノグロブリンに対する２次抗体を更に反応させる。最終的にウエルに結合した２次抗体を測定すれば、培養上清中に存在する抗体の抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。脂質抗原を使った抗体のＥＬＩＳＡは公知（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３６，２５６２−２５６７，１９８６）である。
【００１４】
一方、リポソーム溶解検定とは、抗原を感作したリポソームに抗体が反応すると、補体の作用によってリポソームが溶解する現象を利用している。補体の作用を利用していることから、補体依存性のリポソーム溶解検定（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｌｙｓｉｓ ａｓｓａｙ）と呼ばれている。リポソームは、たとえばジセチルホスフェート（ｄｉｃｅｔｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；以下ＤＣＰと省略する）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；以下ＤＭＰＣと省略する）、コレステロールに加えて試験すべきリン脂質抗原から構成される。これらの脂質成分を適当な有機溶媒で溶解後に乾燥させてリピッドフィルムとし、水系溶媒に加えて強く撹拌すると、多層ラメラ構造のリポソームを生じる。こうして調製されたリポソームでは、膜の構成成分としてリン脂質抗原が取りこまれる。そのため現実の細胞膜に存在する形に近い状態で抗原構造が提示されることが期待できるので、モノクローナル抗体のスクリーニングには好適である。リポソーム内部には、その溶解のマーカーとなる蛍光色素を封入しておくのが有利である。蛍光色素には、４−メチルウンベリフェロン（４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）やカルセイン等が用いられる。補体の存在下でこのリポソームを構成するリン脂質抗原に抗体が結合すると、リポソームは破壊され内部の蛍光色素が流出して液相の蛍光増大として観察される。ＰＩ−４，５−Ｐ２のようなリン脂質抗原を使った補体依存性のリポソーム溶解検定は公知である（Ｍｉｙａｚａｗａ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１０， １０２５−１０３１， １９８８）。交差性を確認すべきリン脂質には、構造的に類似するリン脂質抗原を挙げることができる。あるいは、部分構造が共通な類似物質についても交差性を確認しておくと良い。具体的には、次のような物質を示すことができる。これらの物質については、実施例などを通じてその構造的な特徴を図示する。
【００１５】
ＰＣ（ホスファチジルコリン）
ＰＳ（ホスファチジルセリン）
ＰＡ（ホスファチジン酸）
ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）
ＰＩ−４，５−Ｐ２（ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸）
ＩＰ３（１，４，５−イノシトール三リン酸）
ＩＰ４（１，３，４，５−イノシトール四リン酸）
ＩＰ６（１，２，３，４，５，６−イノシトール六リン酸）
【００１６】
ＥＬＩＳＡおよびリポソーム溶解検定はいずれも、ＰＩ−３，４−Ｐ２を抗原として調製した反応系を使って他の脂質抗原に対する抗体の交差性の確認が可能である。すなわち、反応特異性を試験すべき抗体とＰＩ−３，４−Ｐ２との反応の場に、交差性を確認すべき他の抗原を共存させれば、両者の競合状態を観察することによって交差性の確認を行うことができる。競合阻害の原理を利用したこのような交差性の確認方法は、すべての抗原について反応系を調製する必要がないのでスクリーニングを迅速に行うことができる。
【００１７】
以上のようにして、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を持ち、かつＰＩ−４，５−Ｐ２等の構造的に類似した抗原を免疫学的に識別しうる本発明による抗体を得ることができる。本発明によるモノクローナル抗体はたとえばＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託されたハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬによって産生される。これらハイブリドーマを適当な条件のもとで培養し、産生される抗体を回収すれば本発明によるモノクローナル抗体を得ることができる。ハイブリドーマは、ホモハイブリドーマの場合には同系の動物の腹腔に接種して生体内培養が可能である。この場合は、モノクローナル抗体は腹水として回収される。ヘテロハイブリドーマの場合にはヌードマウスを宿主として生体内培養が可能である。
【００１８】
生体内培養のみならず、適当な培養環境を与えて生体外で培養することも一般に行われている。たとえばＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭ等の基礎培地がハイブリドーマの培地として一般に利用されている。これらの培地には、抗体産生能を高く維持するために動物血清等の添加剤を加えることができる。生体外でハイブリドーマを培養する場合には、モノクローナル抗体は培養上清として回収することができる。培養上清は、培養終了時に細胞から分離することにより回収することもできるし、あるいはホローファイバーを応用した培養装置においては、培養を継続しながら連続的に回収することも可能である。
腹水や培養上清として回収したモノクローナル抗体は、飽和硫安塩析によりそのイムノグロブリン分画を分取し、更にゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィー等の精製工程を経て本発明のモノクローナル抗体とする。この他にモノクローナル抗体がＩｇＧであれば、プロテインＡカラムやプロテインＧカラムによるアフィニティクロマトグラフィーに基づく精製方法が有効である。
【００１９】
更に本発明は、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する望ましい結合活性を備えた新規な抗体について、その可変領域を構成するアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列を提供する。すなわち本発明は、配列番号：２および配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むイムノグロブリン可変領域を提供する。あるいは本発明は、配列番号：１および配列番号：３に示す塩基配列を含むイムノグロブリン可変領域をコードするｃＤＮＡを提供する。配列番号：１および配列番号：２は、イムノグロブリン重鎖由来、配列番号：３および配列番号：４はイムノグロブリン軽鎖のものである。これらアミノ酸配列、あるいはｃＤＮＡの塩基配列は、必ずしも同一である必要は無く、ＰＩ−３，４−Ｐ２との特異的な結合活性を維持する限り変異を含むことができる。後に述べるように、特にＣＤＲに相当する部分については変異性が高く、この領域においてはアミノ酸の変異が許容されるケースもある。
【００２０】
一般にイムノグロブリンは、分子量の大きな重鎖及び分子量の小さな軽鎖から構成されている。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基において可変領域と称される分子間でアミノ酸配列の異なる領域を有しており、重鎖の可変領域はＶＨ、軽鎖の可変領域はＶＬと表される。この重鎖の可変領域ＶＨと軽鎖の可変領域ＶＬが相対して静電的に結合して２量体を形成することにより、抗原結合部位が形成される。可変領域は、３つのＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：相補性決定部位）と４つのフレームワークで構成される。なお、ＣＤＲとは、抗原分子と相補的な立体構造を形成し抗体の特異性を決定する部位であり、ＣＤＲの立体構造の維持に働いている４つのＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：枠組み構造領域）に挟まれて３つのＣＤＲが可変領域中にモザイク状に存在する（Ｅ． Ａ． Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「免疫学的観点におけるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」，ｖｏｌ Ｉ，第５版，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ （１９９１））。ＦＲのアミノ酸配列は良く保存されているのに対して、ＣＤＲの変異性は高く、超可変領域（ｈｙｐｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼ばれる。本発明においては、ＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識する抗体のアミノ酸配列のうち抗原との結合活性を決定しているＣＤＲを明らかにした。すなわち、本発明は以下に示すＣＤＲ（配列番号：１または３におけるＮ末端のアミノ酸を１とする位置で示したもの）をも提供するものである。なおカッコ内に記載した数字は配列番号に対応する。
【００２１】
本発明によるイムノグロブリンの可変領域をコードする塩基配列を持ったｃＤＮＡは、前記ＰＩ−３，４−Ｐ２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからクローニングすることができる。たとえばＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９として寄託された本発明のハイブリドーマは、クローニングの出発材料として好適である。具体的には、可変領域遺伝子のシグナル配列と定常領域側の塩基配列を利用してＰＣＲを行い、増幅生成物を適当なクローニングベクターに挿入して増幅し、可変領域遺伝子のライブラリーとする。上記ＣＤＲに相当する部分は本発明による可変領域に特異的な配列といえるので、これをプローブとして前記可変領域のライブラリーをもとにポジティブクローンをスクリーニングする。得られたｃＤＮＡは、軽鎖と重鎖の可変領域遺伝子を適当なリンカーで連結してファージに組み込み、１本鎖抗体（いわゆるｓｃＦＶ）として発現させることができる。あるいは、公知のイムノグロブリン発現用ベクターに組み込むことにより、イムノグロブリンの産生に利用することができる。イムノグロブリン発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス） ｂａｓｅｄベクターなどを用いることができるが、特にこれらに限定されない。たとえばＢＰＶベクターの１種である「ＢＣＭＧＳ Ｎｅｏベクター」（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」，村松正実および岡山博人編，実験医学別冊：遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ．２９７−２９９ （１９９１））は、ＣＯＳ７細胞などに形質転換することによって外来遺伝子を効率良く発現する望ましいベクターである。
【００２３】
あるいは、上記ＣＤＲを任意のイムノグロブリンのフレームワークに組み込むことにより、本発明による抗体の特異性を人為的に再構成することもできる。このような技術は、ＣＤＲグラフト抗体（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２ （１９８６））と呼ばれ、マウスのイムノグロブリンをヒト化するための技術として既に確立されている。本発明によるＣＤＲは、完全に同一のもののみならず、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性を維持する限り変異を含むものであることもできる。すなわち、本発明において、前記ＣＤＲ領域の配列を１個または数個改変したアミノ酸配列も、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合特異性が保持される限り、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列として利用することができる。ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の中で変換するアミノ酸は、好ましくは全体のＣＤＲの３０％以下であり、更に好ましくは全体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の１０％以下である。前記ＣＤＲを組み込むべきＦＲは、任意のものとすることができる。本発明によるＣＤＲはもともとマウスのイムノグロブリンに由来するが、マウスのみならず他の種のイムノグロブリンのＦＲとすることも可能である。構築された可変領域をコードするｃＤＮＡは、前記ベクターに組み込むことにより発現可能となる。
【００２４】
ＣＤＲへの変異の導入にあたり、前記ファージベクターを利用することができる。ファージベクターは、抗体活性を速やかに発現することから、変異体のスクリーニングを迅速に行うことができる。またスクリーニングに十分な量の抗体分子を宿主細菌の表面にもたらす。ＣＤＲへの変異の導入により抗体の結合活性を著しく増大した例も知られていることから、本発明によって提供されるＣＤＲに基づいて更に結合活性に優れる１本鎖抗体を得られる可能性がある。
【００２５】
本発明によって提供される可変領域、または本発明に基づくＣＤＲを組み込んだ可変領域は、そのまま発現させても良いし、定常領域をコードする遺伝子と連結して完全なイムノグロブリン分子として発現させることもできる。
【００２６】
上記ｃＤＮＡをそのまま組み込んだベクター、あるいはＣＤＲのみを任意のＦＲに連結したインサートを含むベクターによる可変領域の発現にあたり、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを同じ宿主細胞中で発現させて重鎖／軽鎖からなる２量体として産生させるのが有利である。そのためには、軽鎖発現ベクター及びヒト化重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換し、この形質転換細胞から本発明による抗体を得ることができる。形質転換の宿主としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０， ３３９３−３４０２ （１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９ （１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２ （１９９０））などが好適に用いられる。また、形質転換には、リポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６０７７ （１９８９）， Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３ （１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ ＆ Ａ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
【００２７】
なお発現産物である可変領域が定常領域を伴っていれば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリン抗体アフィニティーカラム等を用いて精製することにより精製タンパク質として回収することができる。もしも可変領域のみを発現させた場合にはこれらの精製方法が適用できないので、適当な精製方法を応用することになる。たとえば、そのＣ末端にヒスチジンタグなどの精製に有利なタンパク質を融合させた構造として発現させれば、対応するリガンドを利用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製することが可能である。
【００２８】
本発明は、このようして得られたモノクローナル抗体、あるいはその可変領域に基づいて、ＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫学的な測定方法を実現するものである。従来はＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的な抗体そのものが提供されておらず、免疫学的な測定方法は不可能であった。本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性に優れ、ＰＩ−３，４−Ｐ２の理想的な免疫学的測定方法を実現する。
【００２９】
ＰＩ−３，４−Ｐ２と本発明による抗体（可変領域を含む）との結合が、測定対象試料に由来するＰＩ−３，４−Ｐ２によって阻害されることを利用し、この阻害の程度を観察すればＰＩ−３，４−Ｐ２を測定することができる。このような測定原理を実現するひとつの方法は、固相化ＰＩ−３，４−Ｐ２を利用した測定方法である。すなわち、マイクロプレートのような容器にＰＩ−３，４−Ｐ２を吸着させておき、これにまず測定試料を加える。ＰＩ−３，４−Ｐ２はホスファチジルコリンのような適当なキャリアーに溶解して容器壁に物理吸着させることができる。次いで本発明による抗体を加えると、容器側のＰＩ−３，４−Ｐ２と試料中のＰＩ−３，４−Ｐ２とが本発明の抗体に対して競合する。抗体を適当な手段で標識しておけば、固相に結合した（またはしなかった）抗体を簡単に測定することができる。予め標準試料で測定しておいた結果と照合すれば、どの程度のＰＩ−３，４−Ｐ２が試料に含まれていたのかを決定することができる。抗体の標識には、酵素、蛍光標識、あるいは発光標識等を利用すると良い。ＰＩ−３，４−Ｐ２の測定は、組織、培養細胞、あるいは血液や血清等の体液等の生体試料を対象に行われる。同様の競合的測定方法は、本発明の抗体を容器側に固定しておくことによっても達成することができる。この場合は、標識したＰＩ−３，４−Ｐ２をＰＩ−３，４−Ｐ２含有試料と共に抗体に反応させることになる。
【００３０】
免疫学的測定方法のための試料は、前記の液状のもののみならず固体試料であっても良い。たとえば、組織標本を対象として、免疫染色を行ってＰＩ−３，４−Ｐ２の有無や局在を観察することができる。望ましい態様によれば、本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部位とグリセロール骨格とによって構成されるエピトープを認識する。このエピトープは細胞膜の表面に露出しているものと推測されるので、組織標本の染色に有利な抗体ということができる。このとき、たとえばＰＩ−４，５−Ｐ２を特異的に認識する抗体と組み合わせて、複数のリン脂質の局在を同一の試料中で観察することもできる。異なる抗体を波長の異なる蛍光色素で標識しておき、同一の試料を染色する二重染色の手法（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｉｎ）は公知である。
【００３１】
本発明は、これら免疫学的な測定方法を実施するためのキットを提供する。すなわち、本発明による抗体をはじめとして、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせてキットとすることができる。以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００３２】
【実施例】
［実施例１］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体の作製
抗ＰＩ−３，４−Ｐ２抗体の作製にあたり、合成ＰＩ−３，４−Ｐ２をアジュバント（Ａｄｊｕｂａｎｔ）としてサルモネラ死菌体にコートし免疫原とした。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｅｓｏｔａを一晩培養し、菌体を回収した。菌体は蒸留水で２回遠心洗浄し、更にジエチルエーテルで１回洗浄後に真空乾燥した。洗浄後の菌体を１％酢酸水溶液に分散させ、１００℃で２時間加熱してリポ多糖類に結合したオリゴサッカライドを除去した（Ｇａｌａｎｏｓ Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４，１１６−１２２，１９７１）。処理後の菌体を洗浄し、５０μｇの菌体に対して４μｇのＰＩ−３，４−Ｐ２を添加してコートし、懸濁させたものを免疫原（１回分）とした（Ｕｍｅｄａ Ｍ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３７．３２６４−３２６９）。ＰＩ−３，４−Ｐ２は公知の方法（Ｔｈｕｍ Ｏ．， Ｃｈｅｎ Ｊ．， Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ Ｇ． Ｄ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７， ９０１７−９０２０， １９９６； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３９， ９４８５−９４８８， １９９８； Ｓｈｉｒａｉ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ４０， １６９３−１６９６， １９９９； Ｓａｗａｄａ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４５， １５２１−１５２３， １９９７）により化学的に合成したものを用いた。この免疫原をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）の尾静脈に１週間おきに数回免疫し、抗体価の上昇したマウスについて、その脾臓細胞をミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ．６５３と融合しハイブリドーマを作製した。
【００３３】
ＨＡＴセレクションの後、生存しているハイブリドーマの培養上清中に含まれる抗体のＰＩ−３，４−Ｐ２に対する結合活性を指標にスクリーニングを行った。抗体の結合活性はリポソーム溶解検定によってスクリーニングするとともに、陽性クローンが産出する抗体については間接法ＥＬＩＳＡによって交差反応性の試験も行った。
【００３４】
リポソーム溶解検定ではまずＰＩ−３，４−Ｐ２（〜１％）、ホスファチジルコリン（４０％）、コレステロール（５０％）、ジセチルホスフェート（１０％）をクロロホルムに溶解し、減圧乾固してリピットフィルムを作製した。これに蛍光色素であるカルセインの高濃度水溶液を加えて強く撹拌し、カルセイン封入多重膜リポソームを調製した。このリポソームに培養上清を補体とともに加え、抗体の抗原への結合により補体が活性化されて膜に穴を開ける反応を起こさせた。培養上清にＰＩ−３，４−Ｐ２に結合する抗体が存在すれば、リポソーム内の高濃度のカルセインが流出して濃度が下がり蛍光を発するようになる。この蛍光の強さを測定することによって、抗体の抗原への活性を測定した。
【００３５】
一方、間接法ＥＬＩＳＡは以下のように行った。まず、プレートに５μｇ／ｍＬのホスファチジルコリン（キャリアー）に溶かした１００ｎｇ／ｍＬのＰＩ−３，４−Ｐ２を入れ、一晩室温で静置してコーティングを行い、その後乾燥させた。次に、ブロッキングバッファー（１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＨＢＳ， ｐＨ ７．６））で３０分間室温でインキュベートした。ブロッキング処理した抗原感作プレートは、洗浄後に密封して使用時まで冷蔵保存した。
【００３６】
抗原感作プレートのウエルに、ＰＩＰ３、ＰＩ−４，５−Ｐ２、ＩＰ３、ＩＰ４、およびＩＰ６（０．５％ ＢＳＡ／ＨＢＳで１００−１０４ｎｇ／ｍＬに段階希釈したもの）１００μＬとハイブリドーマの培養上清１００μＬを加え、室温で２時間インキュベートした。反応液を除去し、ＨＢＳで洗浄して第２抗体（アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ３または抗マウスＩｇＭ；０．５％ ＢＳＡ／ＨＢＳで１／２０００に希釈したもの）を加え、室温で２時間インキュベートした。第２抗体の反応後、未反応の抗体を除去して再度ＨＢＳで洗浄し、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート （ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰＮＰＰ）を加えてウエルに残ったアルカリホスファターゼの活性を測定した。培養上清に含まれる抗体がＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的なものであれば、共存する各種化合物の競合阻害を受けることなくＰＩ−３，４−Ｐ２との免疫反応が進み、固相には高いアルカリフォスファターゼ活性が保持される。一方、 ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する反応性が無かったり、あるいは共存する各種の抗原に対して交差性を持った抗体では、競合阻害のために固相のＰＩ−３，４−Ｐ２と反応する抗体の数が減るので、結果として固相に保持されるアルカリフォスファターゼ活性は低いものとなる。間接法ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬの培養上清の測定結果を図１に示した。８Ｃ２−ＦＮＬはＰＩ−３，４−Ｐ２のみと反応する抗体を産生するので、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対してのみ濃度依存的に結合％（培養上清のみを添加したときの吸光度測定値を１００とする％）の低下が起きている。
【００３７】
このスクリーニングの結果、ＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応する抗体を産生する４クローンを樹立した。各クローンの名称を以下にまとめる。ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する相対的反応性は、４０％のリポソームを溶解させるのに必要な濃度の逆数（ｍｌ／μｇ）として定義した。これらクローンのうち、ＰＩ−３，４−Ｐ２に最も高い反応性を示す８Ｃ２−ＦＮＬが産生する抗体（以下、特に断りのないときには８Ｃ２はモノクローナル抗体を指すものとする）について、更にその反応性を詳細に検討した。
［実施例２］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体８Ｃ２ （ＩｇＧ３）の特異性の検討
実施例１で得られた抗体の中で、ＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応し最も特異性の高かった８Ｃ２についてリポソーム溶解検定により、更に検討を行った。検討に先だって、ハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬをプリスタン処理したマウスの腹腔に接種し、その腹水から硫安分画によりイムノグロブリンを精製しモノクローナル抗体８Ｃ２とした。リポソーム溶解検定に用いた脂質抗原は以下のとおりである。
ホスファチジルコリン（ＰＣ）
ホスファチジルセリン（ＰＳ）
ホスファチジン酸（ＰＡ）
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）
【００３９】
リポソームは５０％コレステロール、４０％ホスファチジルコリンを主成分とし残りの１０％をそれぞれ違った脂質に変えたものを用意した。脂質の組成が異なる他は、同様の操作でリポソームを調製した。このリポソームに対して抗体の希釈度を１０−１−１０−７に変えて８Ｃ２の結合活性を検定したところ、ＰＩ−３，４−Ｐ２を含むリポソームでのみ濃度依存的にリポソームの溶解が起こった。一方、ＰＣ、ＰＳ、ＰＡ、ＰＩ、あるいはＰＥといった、細胞膜を構成する他のリン脂質を含むリポソームでは用意した最高の抗体濃度の希釈溶液（１０−１）を用いても溶解は観察されなかった（図２）。なお図中、リポソーム溶解（％）とは、反応させたすべてのリポソームが溶解したときの蛍光強度を１００とする％を意味する。これらのことから、８Ｃ２がリン脂質の中からＰＩ−３，４−Ｐ２のみに反応することが確認された。８Ｃ２が認識するエピトープについて更に詳細な情報を得ることを目的として、ホスファチジルイノシトールの各種リン酸化誘導体抗原との交差反応性を検討した。
【００４０】
５０％コレステロール、４０％ホスファチジルコリン、９％ジセチルホスフェートを主成分とし、残りの１％を以下のリン脂質のリン酸化誘導体としたリポソームを用意した。
ＰＩ
ＰＩ４Ｐ（ホスファチジルイノシトールリン酸）
ＰＩ−３，４−Ｐ２
ＰＩ−４，５−Ｐ２
Ｎ−ＰＩＰ３（天然のＰＩＰ３、アレクシス社より購入）
Ｓ−ＰＩＰ３（化学合成したＰＩＰ３）
ＰＡ（ホスファチジン酸）
ＰＣ
ＰＥ
ＰＳ
カルジオリピン
【００４１】
抗体の希釈度を１０−１−１０−６に変えてアッセイしたところ、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対しては先の実験と同様濃度依存的に溶解が起こったが、その他のいずれのリン脂質に対しても、用意した最高の抗体濃度の希釈溶液を用いても反応しなかった（図３）。構造的にたいへん良く似ているＰＩ−４，５−Ｐ２に対しても、ＰＩ−３，４−Ｐ２の１％以下の交差反応性しか観察されなかった。以上のことから、８Ｃ２の抗原の認識にはイノシトール部の４位のリン酸基が重要であり３位のリン酸基もエピトープ構造に関与していると考えられた。
【００４２】
［実施例３］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体 ８Ｃ２ （ＩｇＧ３） のエピトープの検討 ８Ｃ２の抗体の認識部位を探るためＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部分と構造の似たイノシトールポリリン酸３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭを競合剤として先に述べたリポソーム溶解検定を行った。イノシトールポリリン酸としては、次の化合物を用意した。
イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）
イノシトール−１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）
イノシトール−１，２，３，４，５，６−六リン酸（ＩＰ６）
【００４３】
その結果、競合剤としてフリーのＰＩ−３，４−Ｐ２を加えた時は固相化されたＰＩ−３，４−Ｐ２との競合により吸光度が濃度依存的に減少したが、他のイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、イノシトール−１，３，４，５−四リン酸（ＩＰ４）、イノシトール−１，２，３，４，５，６−六リン酸（ＩＰ６）では影響は見られなかった（図４）。
【００４４】
これらの結果から、抗体の認識部位にはグリセロール骨格も含まれていることが示唆された。更にＰＩ−３，４−Ｐ２の添加濃度に依存して溶解度が減少していることから明らかなように、本発明の抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２の競合的原理に基づく免疫測定を可能とする。しかも他の類似の構造を持った種々の化合物の影響をほとんど受けないことから、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対する特異性に優れた測定系を容易に実現するものである。
次に、ＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖が抗体の認識部位を構成しているのかどうかを調べるために、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、およびＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖の長さを変えたものについてリポソーム溶解検定により反応性を検討したるＰＩ−３，４−Ｐ２の側鎖の長さが異なる以下の構造式からな化合物について実験を行った。
【００４５】
【化２】
ＰＳ
【化３】
Ｃ１６ＰＩ−３，４−Ｐ２
【化４】
Ｃ４ＰＩ−３，４−Ｐ２
その結果、ＰＳでは濃度に依存せずリポソームの溶解の度合いは一定であり、ＰＳによる競合は認められなかったが、Ｃ１６ＰＩ−３，４−Ｐ２、およびＣ４ＰＩ−３，４−Ｐ２ではいずれも濃度の上昇に伴いリポソームの溶解が減少した（図５）。このことから側鎖の長さの違いによらず本発明による抗体がイノシトール環の部分を認識していることが分かった。
【００４９】
本発明による抗体を産生するハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬは、次のように国際寄託されている（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９）。
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日（原寄託日） 平成１１年８月１８日
（ｃ）受託番号 生命研条寄第６８４９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８４９）
【００５０】
［実施例４］抗ＰＩ−３，４−Ｐ２モノクローナル抗体の超可変領域（ＣＤＲ）の特定
本発明によるＰＩ−３，４−Ｐ２を特異的に認識するモノクローナル抗体８Ｃ２について、その可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニングを試みた。ハイブリドーマから抽出したＲＮＡにシグナルペプチド、コンスタントリージョン（定常領域）の配列をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。まず、ハイブリドーマ８Ｃ２−ＦＮＬを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養し、ポリＡ＋ＲＮＡを調製した。そのポリＡ＋ＲＮＡ ５μｇより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて９４℃１分、５５℃２分、７２℃２分を１サイクルとし、ＰＣＲを３０サイクル行った。用いたプライマーの５’側には、クローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのクローニングサイトに合わせた制限酵素の認識配列がそれぞれ付加されている。
【００５１】
得られた増幅生成物から、アガロースゲル電気泳動によって重鎖の場合は約４００ｂｐ、軽鎖の場合は約３００ｂｐの長さを持つバンドを分離し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んで、クローニングの後にベクターを回収した。インサートの塩基配列は、ベクタープライマーと［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰを用いたジデオキシ法（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１４， １２０５−１２１０ （１９８１））により確認した。こうして得た遺伝子がコードするアミノ酸配列を導出し、構造予測法（コーティアのナンバーリングスキーム）により超可変領域ＣＤＲを特定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／￣ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ＧｅｎｅｒａｌＩｎｆｏ．ｈｔｍｌ＃ｋａｂａｔｎｕｍ， Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２７３，９２７−９４８，１９９７）。得られた結果を以下にまとめる。
［実施例５］Ｈ２Ｏ２処理によって産生を誘導されたＰＩ−３，４−Ｐ２の免疫染色
２９３細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｎｏ．ＪＣＲＢ９０６８）を、カバーグラス上で培養し、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）を加えたものと、加えないものを作り、その後１０ｍＭ Ｈ２Ｏ２で０分、３分、１０分間処理した。１０％ホルマリン入りＰＢＳで１０分間室温で反応させ固定し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１０分間室温で反応させ細胞を透過性にした。１０％子牛血清入りダルベッコ培地で１０分以上室温で反応させ、ブロッキングした後、８Ｃ２−ＦＮＬハイブリドーマの培養上清をそのまま用いて、湿箱中で室温２時間以上反応させ、一次反応とした（培養液：１０％ 牛胎児血清入りイスコフ改変ダルベッコ培地）。つづいてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ３（サザンバイオテクノロジー社、１１００−０２）、ブロッキング液で１／１００希釈し、室温２時間以上反応させ二次反応とした。反応後の標本は９０％グリセロールで封入して観察した。
【００５３】
その結果、Ｈ２Ｏ２処理によってＰＩ−３，４−Ｐ２の産生を誘導する前に、ウォルトマンニンを加えなかった場合には、Ｈ２Ｏ２処理後３分、１０分でＰＩ−３，４−Ｐ２の染色が認められ、時間とともに染色が強くなったが、ウォルトマンニンを加えた場合では、Ｈ２Ｏ２処理後においても細胞の染色が認められず、本発明による抗体がＰＩ−３，４−Ｐ２と反応することが確認された（図７）。
次に、８Ｃ２の特異性を確認するために、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＩ−３，４−Ｐ２、ＰＩ−４，５−Ｐ２を添加して、その影響を調べた。その結果、ＰＣ、ＰＩ−４，５−Ｐ２の添加によっては競合を受けず、細胞中のＰＩ−３，４−Ｐ２の染色による蛍光が観察されたが、ＰＩ−３，４−Ｐ２を添加した場合には、抗体が吸収され細胞の蛍光は認められなかった（図８）。このことから本発明による抗体が、ＰＩ−３，４−Ｐ２に特異的であることが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、ＰＩ−３，４−Ｐ２に対し特異的に結合するモノクローナル抗体が提供された。また本発明によって、この抗体を用いた免疫学的測定方法が提供された。この抗体はＰＩ−３，４−Ｐ２のイノシトール部位のみならずグリセロール骨格もエピトープとして認識していると考えられ、他のイノシトール化合物とＰＩ−３，４−Ｐ２を識別することが可能である。
また本発明は、この抗体の可変領域をコードする遺伝子も取得し、組み換え抗体の作成が可能となった。この抗体を用いることでそのＰＩ−３，４−Ｐ２への特異的な結合を利用して、例えば細胞内でのＰＩ−３，４−Ｐ２の存在場所の特定や、ＰＩ−３，４−Ｐ２の下流への情報伝達を阻害して影響を調べるといった、従来の解析法ではできなかった研究を行うことが可能となる。
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】８Ｃ２の各種イノシトールポリリン酸に対する交差反応性を確認するための間接法ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図中、縦軸は８Ｃ２の結合（％）を、横軸は競合剤の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図２】類似が類似したリン脂質に対する８Ｃ２の結合活性を確認するためのリポソーム溶解検定の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は抗体の希釈度（１０−ｎ）を示す。
【図３】構造が類似した化合物に対する８Ｃ２の結合活性を確認するためのリポソーム溶解検定の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は抗体の希釈度（１０ｎ）を示す。
【図４】リポソーム溶解検定における競合反応を用いた構造が類似するイノシトール化合物に対する、８Ｃ２の反応性の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は競合化合物の濃度（Ｍ）を示す。
【図５】リポソーム溶解検定における競合反応を用いた側鎖の長さが異なるＰＩ−３，４−Ｐ２に対する、８Ｃ２の反応性の結果を示すグラフである。図中、縦軸はリポソームの溶解（％）を、横軸は競合化合物の濃度（Ｍ）を示す。
【図６】モノクローナル抗体８Ｃ２の軽鎖および重鎖の可変領域中の、予測される超可変（ＣＤＲ）領域を示す図である。
【図７】Ｈ２Ｏ２処理によって産生を誘導されたＰＩ−２，３−Ｐ２の免疫染色の図である。上段の６つはウォルトマンニンを加えていない場合、下段の６つは加えた場合である。
【図８】類似化合物の競合反応により８Ｃ２の特異性を示す免疫染色の図である。Ａ、Ｂは競合剤なし、Ｃ、Ｄは５０μＭホスファチジルコリン、Ｅ、Ｆは５０μＭ ＰＩ−３，４−Ｐ２、Ｇ、Ｈは５０μＭ ＰＩ−４，５−Ｐ２を競合剤として加えた場合である。
Claims (17)
- ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識し、かつホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸に対する交差反応性が１％以下であるモノクローナル抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片。
- 以下に記載の重鎖可変領域と軽鎖可変領域によって構成される、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片。
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む重鎖の可変領域：および
重鎖CDR1：配列番号：５
重鎖CDR2：配列番号：６
重鎖CDR3：配列番号：７
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む軽鎖の可変領域：
軽鎖CDR1：配列番号：８
軽鎖CDR2：配列番号：９
軽鎖CDR3：配列番号：１０ - モノクローナル抗体の重鎖可変領域が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２に記載のモノクローナル抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片。
- モノクローナル抗体の軽鎖可変領域が、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項３に記載のモノクローナル抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片。
- 受託番号FERM BP-6849として寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片。
- 請求項１−５に記載のモノクローナル抗体、およびそれらの可変領域を含む抗体の断片のいずれかからなる、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の免疫染色用抗体。
- 受託番号FERM BP-6849として寄託されたハイブリドーマ。
- ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片と、組織標本中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、免疫染色によって前記組織標本におけるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の有無および／または局在を検出する工程を含む免疫学的測定方法であって、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体が、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識し、かつホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸に対する交差反応性が１％以下であるモノクローナル抗体である、免疫学的測定方法。
- モノクローナル抗体が、以下に記載の重鎖可変領域と軽鎖可変領域によって構成されるモノクローナル抗体である、請求項８に記載の免疫学的測定方法。
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む重鎖の可変領域：および
重鎖CDR1：配列番号：５
重鎖CDR2：配列番号：６
重鎖CDR3：配列番号：７
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む軽鎖の可変領域：
軽鎖CDR1：配列番号：８
軽鎖CDR2：配列番号：９
軽鎖CDR3：配列番号：１０ - モノクローナル抗体の重鎖可変領域が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項９に記載の免疫学的測定方法。
- モノクローナル抗体の軽鎖可変領域が、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１０に記載の免疫学的測定方法。
- ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片と、組織標本中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、免疫染色によって前記組織標本におけるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の有無および／または局在を検出する工程を含む免疫学的測定方法であって、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体が、受託番号FERM BP-6849として寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、免疫学的測定方法。
- ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片と、組織標本中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、免疫染色によって前記組織標本におけるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の有無および／または局在を検出するためのキットであって、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体が、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識し、かつホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸に対する交差反応性が１％以下であるモノクローナル抗体であるキット。
- モノクローナル抗体が、以下に記載の重鎖可変領域と軽鎖可変領域によって構成されるモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のキット。
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む重鎖の可変領域：および
重鎖CDR1：配列番号：５
重鎖CDR2：配列番号：６
重鎖CDR3：配列番号：７
それぞれ次のアミノ酸配列からなるCDRを含む軽鎖の可変領域：
軽鎖CDR1：配列番号：８
軽鎖CDR2：配列番号：９
軽鎖CDR3：配列番号：１０ - モノクローナル抗体の重鎖可変領域が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
- モノクローナル抗体の軽鎖可変領域が、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１５に記載のキット。
- ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体、またはその可変領域を含む抗体の断片と、組織標本中に存在するホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸と反応させ、免疫染色によって前記組織標本におけるホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸の有無および／または局在を検出するためのキットであって、ホスファチジルイノシトール−３，４−二リン酸を認識する抗体が、受託番号FERM BP-6849として寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体であるキット。
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