JP3584283B2 - オリゴチロシンを有するペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品、特定保健用食品、研究用試薬としての利用を目的とした、チロシンからなるペプチド、親水性アミノ酸を含むチロシンからなるペプチド、並びにこれらのペプチドを含むエイズウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−１）プロテアーゼ阻害剤またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らはキノコや小麦のフスマから抽出したリグニン様物質、ｐ−クマル酸の重合体からなるリグニン様物質、フェルラ酸の重合体からなるリグニン様物質などがエイズウイルスのＨＩＶ−１プロテアーゼの働きを阻害することを報告した（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６２， ｐ．５７５ （１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６３， ｐ．２２０２ （１９９９））。また、このようなリグニン様物質がサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害し、哺乳動物細胞サイクリックＡＭＰ濃度を上昇させることも見出した（特願２０００−１９２５６２、特願２０００−１９２５６３、特願２０００−１９２５６４）。しかしながら、リグニンはフェニルプロペノイドを構成単位とし、それが複雑に重縮合した不定形ポリフェノールであることから、物質として単一でなく、医薬品としての用途には、それを単一物質に精製する必要があった。
【０００３】
一方、エイズウイルスのＨＩＶ−１プロテアーゼはＨＩＶ−１の前駆体蛋白質を切断し、ウイルス自体の酵素と構造蛋白質を生成する。この過程はウイルス粒子の形成に必須であり、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤はエイズの治療に役立つとされている。ＨＩＶ−１プロテアーゼは９９個のアミノ酸からなる蛋白質がホモ２量体を形成し、その活性を発現する。本酵素は活性中心にＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ配列を有しているなど、アスパラギン酸プロテアーゼとしての特徴があることから、ペプスタチンやアセチルペプスタチン（Ｋｉ＝３５ｎＭ， ｐＨ５．０）により阻害される（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．２４７， ｐ１１３， １９８９）。また、基質の遷移状態を模倣した構造の阻害剤 Ｒｏ３１−８９５９（Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ， ＩＣ５０ ＜０．４ｎＭ）、ＫＮＩ−２７２（Ｋｉ＝０．００５５ｎＭ）などが多数合成されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２４８， ｐ３５８， １９９０、医学のあゆみ， Ｖｏｌ．１７７， ｐ９６２， １９９６、蛋白質核酸酵素， Ｖｏｌ． ４３， ｐ７２５， １９９８、蛋白質核酸酵素， Ｖｏｌ． ４３， ｐ７４４， １９９８）。また、天然物からもＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕなどのペプチドが見出されている（特開２０００−１１９２９９）。また、前述のようにリグニン様物質などがＨＩＶ−１プロテアーゼを阻害することも知られている（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６２， ｐ．５７５ （１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６３， ｐ．２２０２ （１９９９））。しかし、本発明のようにオリゴチロシンを有するペプチドは報告されていない。
【０００４】
一方、サイクリックＡＭＰ（サイクリックアデノシン３’， ５’− 一リン酸、環状ＡＭＰ、ｃＡＭＰ）は多くのホルモンや神経伝達物質の情報を細胞内の標的分子に伝えるセカンドメッセンジャーであり、細胞膜に存在するアデニル酸シクラーゼによって、ＡＴＰから合成される。サイクリックＡＭＰは細菌や動物界に広く存在する。高等動物では、各種のホルモンが受容体・Ｇ蛋白質・アデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックＡＭＰの産生を促進する。動物におけるサイクリックＡＭＰの作用点はサイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（Ａキナーゼ）であり、Ａキナーゼは細胞内の多くの蛋白質を基質とするため、サイクリックＡＭＰは細胞の多彩な機能を調節する。例えば、Ａキナーゼは転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答配列結合蛋白質）をリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢがＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答配列）に結合し遺伝子の転写活性を制御することが知られている。このような機能を有するサイクリックＡＭＰはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼによって５’−ＡＭＰに分解される。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼはアデニル酸シクラーゼとともに、細胞内のサイクリックＡＭＰの量的水準を調節していると考えられている。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼは脳、肺、肝臓、心臓など種々の組織中に存在し、カルモジュリン（活性化因子）に対する結合性、基質に対する親和性などが異なる数種類の酵素が存在する。
【０００５】
このように、アデニル酸シクラーゼ、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼなどの活性を制御することにより、サイクリックＡＭＰの濃度を調節することで、様々な生体機能を調節することが可能と考えられる。また、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する物質としてはテオフィリンなどプリンアルカロイド系のものや前述のリグニン様物質などが知られているが（特願２０００−１９２５６２号、特願２０００−１９２５６３号、特願２０００−１９２５６４号）、オリゴチロシンを有するペプチドにそのような活性は報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、チロシンからなるペプチド、親水性アミノ酸を含むチロシンからなるペプチド、並びにこれらのペプチドを含むエイズウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−１）プロテアーゼ阻害剤またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リグニンと同様にＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害並びにサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害活性を保持しているが、不定形でない単一物質の開発を試みた。リグニンはフェニルプロペノイドを構成単位とし、それが複雑に重縮合した不定形ポリフェノールであることから、本発明者らはフェノール性水酸基を有するアミノ酸であるチロシンに着目し、チロシンを重合させることにより、リグニンを模倣したオリゴペプチドを合成した。また、かかる疎水性であるチロシンのみからなる重合体は水に溶けにくいため、鋭意検討の結果、チロシン重合体にわずか数個の親水性のアミノ酸を付加または挿入することにより水溶性が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
「 すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１） １２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
（２） １２残基のチロシンからなる（１）のペプチド
（３） セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる１つまたは２つの親水性アミノ酸がN 末端に付加された１２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
（４） １つまたは２つの親水性アミノ酸がN末端に付加された、（３）のペプチド。
（５） ヒスチジン、アルギニン、アルギニン-アルギニン、グルタミンおよびセリンからなる群から選ばれる親水性アミノ酸が付加された、（３）または（４）のペプチド。
（６） 下記(a)〜(e)のいずれかのアミノ酸配列からなる、（５）のペプチド。
(a) His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号２）
(b) Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号３）
(c) Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号４）
(d) Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号５）
(e) Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号６）
（７） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤。
（８） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。」
【０００９】
（６） 下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、（５）のペプチド。
（ａ） Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号２）
（ｂ） Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号３）
（ｃ） Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号４）
（ｄ） Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号５）
（ｅ） Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号６）
（７） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤。
（８） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、フェノール性水酸基を有するチロシンを重合させることにより不定形ポリフェノールであるリグニンの構造を模倣したペプチドであり、リグニンの有するエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤効果およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤効果を有する。
本発明において、アミノ酸とはＬ−アミノ酸を意味する。
【００１１】
重合させるチロシンの数は、リグニンの構造を模倣している限り、特に限定されないが、例えば６〜２５０残基のチロシンを含むペプチドが挙げられる。チロシンの数が少な過ぎてはリグニンを模倣することができない。また、合成を行う上では、チロシンの数は多過ぎないほうが有利であり、好ましくは７〜６０残基のチロシンを含む分子量１万を超えないペプチド、特に好ましくは１２残基のチロシンを含むペプチドが挙げられる。
【００１２】
本発明のペプチドが含み得る親水性アミノ酸残基は、親水性のアミノ酸である限りにおいて特に限定されないが、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる残基が好ましく、ヒスチジン、アルギニン、グルタミンおよびセリンからなる群から選ばれる残基が特に好ましい。
【００１３】
本発明のペプチドが含み得る親水性アミノ酸の数または付加若しくは挿入の位置は、エイズウイルスプロテアーゼ活性またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤活性を有する限りにおいて特に限定されない。１〜数個の親水性アミノ酸がペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に付加されていてもよく、ペプチドの末端を除く部分（ペプチド内部）に挿入されていてもよく、またＮ末端、Ｃ末端またはペプチド内部の複数の部分に付加および／または挿入されていてもよいが、Ｎ末端またはＣ末端に付加されているのが好ましく、その数は、例えば１２残基のチロシンに対して１〜２個の親水性アミノ酸が付加されているのが好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴチロシンを有するペプチドは通常、有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法により合成することができる。かかる方法としては固相ペプチド合成又は液相ペプチド合成法が知られており、例えば泉屋信夫著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善発行などに詳細に記載されている。また、当該ペプチドを含有する生体成分あるいは蛋白質加水分解物から常法に準じて採取することができ、かかる方法としては、例えば、蛋白質を酵素で加水分解し、得られた液を限外濾過膜、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などに付して精製することにより得ることができる。本発明のペプチドは他に、遺伝子工学的方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法により製造することも可能である。遺伝子工学的方法により得る場合は、該ペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを挿入した組み換え体ＤＮＡにより、宿主細胞を形質転換または形質導入し、得られた組み換え宿主を用いて生産させるという公知の手法により行うことができる。また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法により行う場合は、例えば一島英治編「プロテアーゼ」（学会出版センター発行）などに記載されている方法に準じて行えばよい。本合成法では、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ等の酵素を使用し、一般に酵素、原料の保護アミノ酸とも、分解反応における値よりも高濃度を添加し、必要に応じてメタノール、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒を添加した状態で反応させてアミノ酸のペプチド結合を順次形成させる。
【００１５】
また、本発明のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤の塩としては、製薬上許容される酸付加塩及び塩基付加塩が包含される。製薬上許容される酸付加塩として、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸との塩等が挙げられ、また製薬上許容されうる塩付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等のアミン類との塩等が挙げられる。
【００１６】
本発明のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤はそのままで、または通常用いられる個体担体、液体担体、乳化分散剤等により錠剤、粉剤、水和剤、乳剤、カプセル剤等の形に製剤化してＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤として使用することが出来る。上記担体としては、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。
【００１７】
本発明のペプチドはＨＩＶ−１プロテアーゼやエイズウイルスの性質を研究する、あるいは細胞の機能を研究する研究用試薬として、あるいは新しい化合物をデザインするリード化合物としての試薬として利用することができる。また、その機能が臨床的に十分に評価されれば、エイズ等の治療に利用できる。あるいはサイクリックＡＭＰをセカンドメッセンジャーとするホルモンの代替をする医薬として利用できる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明に係るオリゴチロシンを有するペプチドの実施例を説明する。ただし、本発明は、このような実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内でさらにいろいろな実施例があることは言うまでもない。
【００１９】
実施例１
（Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号１）、
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号２）、
Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号３）、
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号４）、
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号５）、
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号６）で示されるペプチドの化学合成）
【００２０】
チロシン１２残基のペプチドを合成する場合はアプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置（４３０Ａ 型）に、０．５ミリモルのｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭ樹脂及び各２ミリモルのｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ） カートリッジ１１個を装填する。Ｎ末端に親水性のアミノ酸を付加する場合には、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ） カートリッジ１１個に加えてｔ−Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ） カートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ） カートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ） カートリッジ２個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｎカートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）カートリッジ１個を装填する。そして、ＤＣＣによる無水対称法により保護基のついたペプチド−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭを合成した。なお、ｔ−Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基、Ｔｏｓはトシル基、Ｂｚｌはベンジル基を示す。また、ここで用いるアミノ酸は全てＬ体である。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装置に上記合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール１．５ｍｌを添加後、フッ化水素１０ｍｌを導入した。−２℃、１時間の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無水エーテル、クロロホルムで交互に３回洗浄し、２Ｎ酢酸６０ｍｌにペプチドを溶解させ、凍結乾燥した。次いで、それぞれのペプチドはＨＰＬＣにより精製した。得られた３．５ｍｇないし５．０ｍｇ各ペプチドの分子量はＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ社ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ Ｍａｓｓによる質量分析の結果、それぞれ１９７５、２１１４．５、２１３４．０、２２９０．４、２１２８．１、２０８６．２であり理論値と一致した。
【００２１】
実施例２（ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤としての有効性の確認）
上記配列番号１〜６のペプチド、ペプチドＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号７）およびＰｏｌｙ−Ｔｙｒを試料としてＨＩＶ−Ｉプロテアーゼ阻害剤としての有効性の確認を行った。
【００２２】
バケム社より購入したＨＩＶ−１プロテアーゼ（遺伝子組み替えにより大腸菌で生産させたもの）を緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ４．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール、１０％（Ｖ／Ｖ） グリセロールを含む）に溶解し０．０２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液とした。また、１ｍｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（バケム社製）を蒸留水に溶解し基質溶液とした。０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、上記緩衝液１００μｌ、試料溶液１０μｌ、酵素溶液２５μｌを入れ、３７℃で５分間保温した後、基質溶液１０μｌを加えよく混合して、３７℃で２０分の反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸１５μｌを添加することにより反応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離してくるｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の通りである。
【００２３】
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ８ ３００Å（ウォーターズ社３．９ ｘ １５０ ｍｍ）
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：３００ｎｍの吸収
このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出した。
阻害率＝ （Ａ − Ｂ） ／ Ａ Ｘ １００ （％）
式中、Ａ：阻害剤無添加時のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積、Ｂ：阻害剤添加時のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積また、上記阻害率が５０％になるペプチド濃度をＩＣ５０値で表した。
このようにして得られたＩＣ５０値を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例３（サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤としての有効性の確認）
上記配列番号１〜６のペプチドおよびＰｏｌｙ−Ｔｙｒを試料としてサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤としての有効性の確認を行った。
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用の測定は下記の方法により行った。
【００２６】
シグマ社より購入したウシ心臓由来ホスホジエステラーゼを０．０２ユニット／ｍｌの濃度で緩衝液（６２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、６．３ｍＭ塩化マグネシウム、３．８ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０３８ｍＭ塩化カルシウム）に溶解し、酵素溶液とした。また、１ｍＭのサイクリックＡＭＰ水溶液を基質溶液とした。
【００２７】
０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、緩衝液１４０μｌ、酵素溶液２０μｌ、測定試料溶液２０μｌを入れ、３０℃で５分間保温した後、基質溶液２０μｌを加えよく混合して、３０℃で４０分間反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸２０μｌを添加することにより反応を停止させた。反応停止後、生成したＡＭＰを下記条件下で高速液体ＨＰＬＣにより定量した。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Å（ウォーターズ社３．９ ｘ １５０ ｍｍ）
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２６０ｎｍの紫外部吸収
このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出した。
【００２８】
【式１】
阻害率＝ （Ａ − Ｂ） ／ Ａ Ｘ １００ （％）
式中、Ａ：阻害剤無添加時のＡＭＰのピーク面積、Ｂ：阻害剤添加時のＡＭＰのピーク面積
また、上記阻害率が５０％になるペプチド濃度をＩＣ５０値で表した。
このようにして得られたＩＣ５０値を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【発明の効果】
本発明のチロシンからなるペプチド、およびセリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる１つまたは２つの親水性アミノ酸が付加若しくは挿入されたチロシンからなるペプチドは、エイズウイルスプロテアーゼ阻害活性、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害活性を有する。
【００３１】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品、特定保健用食品、研究用試薬としての利用を目的とした、チロシンからなるペプチド、親水性アミノ酸を含むチロシンからなるペプチド、並びにこれらのペプチドを含むエイズウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−１）プロテアーゼ阻害剤またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らはキノコや小麦のフスマから抽出したリグニン様物質、ｐ−クマル酸の重合体からなるリグニン様物質、フェルラ酸の重合体からなるリグニン様物質などがエイズウイルスのＨＩＶ−１プロテアーゼの働きを阻害することを報告した（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６２， ｐ．５７５ （１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６３， ｐ．２２０２ （１９９９））。また、このようなリグニン様物質がサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害し、哺乳動物細胞サイクリックＡＭＰ濃度を上昇させることも見出した（特願２０００−１９２５６２、特願２０００−１９２５６３、特願２０００−１９２５６４）。しかしながら、リグニンはフェニルプロペノイドを構成単位とし、それが複雑に重縮合した不定形ポリフェノールであることから、物質として単一でなく、医薬品としての用途には、それを単一物質に精製する必要があった。
【０００３】
一方、エイズウイルスのＨＩＶ−１プロテアーゼはＨＩＶ−１の前駆体蛋白質を切断し、ウイルス自体の酵素と構造蛋白質を生成する。この過程はウイルス粒子の形成に必須であり、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤はエイズの治療に役立つとされている。ＨＩＶ−１プロテアーゼは９９個のアミノ酸からなる蛋白質がホモ２量体を形成し、その活性を発現する。本酵素は活性中心にＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ配列を有しているなど、アスパラギン酸プロテアーゼとしての特徴があることから、ペプスタチンやアセチルペプスタチン（Ｋｉ＝３５ｎＭ， ｐＨ５．０）により阻害される（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．２４７， ｐ１１３， １９８９）。また、基質の遷移状態を模倣した構造の阻害剤 Ｒｏ３１−８９５９（Ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ， ＩＣ５０ ＜０．４ｎＭ）、ＫＮＩ−２７２（Ｋｉ＝０．００５５ｎＭ）などが多数合成されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２４８， ｐ３５８， １９９０、医学のあゆみ， Ｖｏｌ．１７７， ｐ９６２， １９９６、蛋白質核酸酵素， Ｖｏｌ． ４３， ｐ７２５， １９９８、蛋白質核酸酵素， Ｖｏｌ． ４３， ｐ７４４， １９９８）。また、天然物からもＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕなどのペプチドが見出されている（特開２０００−１１９２９９）。また、前述のようにリグニン様物質などがＨＩＶ−１プロテアーゼを阻害することも知られている（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．６２， ｐ．５７５ （１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．６３， ｐ．２２０２ （１９９９））。しかし、本発明のようにオリゴチロシンを有するペプチドは報告されていない。
【０００４】
一方、サイクリックＡＭＰ（サイクリックアデノシン３’， ５’− 一リン酸、環状ＡＭＰ、ｃＡＭＰ）は多くのホルモンや神経伝達物質の情報を細胞内の標的分子に伝えるセカンドメッセンジャーであり、細胞膜に存在するアデニル酸シクラーゼによって、ＡＴＰから合成される。サイクリックＡＭＰは細菌や動物界に広く存在する。高等動物では、各種のホルモンが受容体・Ｇ蛋白質・アデニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックＡＭＰの産生を促進する。動物におけるサイクリックＡＭＰの作用点はサイクリックＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（Ａキナーゼ）であり、Ａキナーゼは細胞内の多くの蛋白質を基質とするため、サイクリックＡＭＰは細胞の多彩な機能を調節する。例えば、Ａキナーゼは転写因子ＣＲＥＢ（サイクリックＡＭＰ応答配列結合蛋白質）をリン酸化し、リン酸化されたＣＲＥＢがＣＲＥ（サイクリックＡＭＰ応答配列）に結合し遺伝子の転写活性を制御することが知られている。このような機能を有するサイクリックＡＭＰはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼによって５’−ＡＭＰに分解される。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼはアデニル酸シクラーゼとともに、細胞内のサイクリックＡＭＰの量的水準を調節していると考えられている。サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼは脳、肺、肝臓、心臓など種々の組織中に存在し、カルモジュリン（活性化因子）に対する結合性、基質に対する親和性などが異なる数種類の酵素が存在する。
【０００５】
このように、アデニル酸シクラーゼ、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼなどの活性を制御することにより、サイクリックＡＭＰの濃度を調節することで、様々な生体機能を調節することが可能と考えられる。また、サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する物質としてはテオフィリンなどプリンアルカロイド系のものや前述のリグニン様物質などが知られているが（特願２０００−１９２５６２号、特願２０００−１９２５６３号、特願２０００−１９２５６４号）、オリゴチロシンを有するペプチドにそのような活性は報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、チロシンからなるペプチド、親水性アミノ酸を含むチロシンからなるペプチド、並びにこれらのペプチドを含むエイズウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−１）プロテアーゼ阻害剤またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リグニンと同様にＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害並びにサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害活性を保持しているが、不定形でない単一物質の開発を試みた。リグニンはフェニルプロペノイドを構成単位とし、それが複雑に重縮合した不定形ポリフェノールであることから、本発明者らはフェノール性水酸基を有するアミノ酸であるチロシンに着目し、チロシンを重合させることにより、リグニンを模倣したオリゴペプチドを合成した。また、かかる疎水性であるチロシンのみからなる重合体は水に溶けにくいため、鋭意検討の結果、チロシン重合体にわずか数個の親水性のアミノ酸を付加または挿入することにより水溶性が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
「 すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１） １２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
（２） １２残基のチロシンからなる（１）のペプチド
（３） セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる１つまたは２つの親水性アミノ酸がN 末端に付加された１２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
（４） １つまたは２つの親水性アミノ酸がN末端に付加された、（３）のペプチド。
（５） ヒスチジン、アルギニン、アルギニン-アルギニン、グルタミンおよびセリンからなる群から選ばれる親水性アミノ酸が付加された、（３）または（４）のペプチド。
（６） 下記(a)〜(e)のいずれかのアミノ酸配列からなる、（５）のペプチド。
(a) His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号２）
(b) Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号３）
(c) Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号４）
(d) Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号５）
(e) Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号６）
（７） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤。
（８） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。」
【０００９】
（６） 下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、（５）のペプチド。
（ａ） Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号２）
（ｂ） Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号３）
（ｃ） Ａｒｇ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号４）
（ｄ） Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号５）
（ｅ） Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ （配列番号６）
（７） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤。
（８） ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは（３）〜（６）のいずれかのペプチドを含むサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、フェノール性水酸基を有するチロシンを重合させることにより不定形ポリフェノールであるリグニンの構造を模倣したペプチドであり、リグニンの有するエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤効果およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤効果を有する。
本発明において、アミノ酸とはＬ−アミノ酸を意味する。
【００１１】
重合させるチロシンの数は、リグニンの構造を模倣している限り、特に限定されないが、例えば６〜２５０残基のチロシンを含むペプチドが挙げられる。チロシンの数が少な過ぎてはリグニンを模倣することができない。また、合成を行う上では、チロシンの数は多過ぎないほうが有利であり、好ましくは７〜６０残基のチロシンを含む分子量１万を超えないペプチド、特に好ましくは１２残基のチロシンを含むペプチドが挙げられる。
【００１２】
本発明のペプチドが含み得る親水性アミノ酸残基は、親水性のアミノ酸である限りにおいて特に限定されないが、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる残基が好ましく、ヒスチジン、アルギニン、グルタミンおよびセリンからなる群から選ばれる残基が特に好ましい。
【００１３】
本発明のペプチドが含み得る親水性アミノ酸の数または付加若しくは挿入の位置は、エイズウイルスプロテアーゼ活性またはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤活性を有する限りにおいて特に限定されない。１〜数個の親水性アミノ酸がペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に付加されていてもよく、ペプチドの末端を除く部分（ペプチド内部）に挿入されていてもよく、またＮ末端、Ｃ末端またはペプチド内部の複数の部分に付加および／または挿入されていてもよいが、Ｎ末端またはＣ末端に付加されているのが好ましく、その数は、例えば１２残基のチロシンに対して１〜２個の親水性アミノ酸が付加されているのが好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴチロシンを有するペプチドは通常、有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法により合成することができる。かかる方法としては固相ペプチド合成又は液相ペプチド合成法が知られており、例えば泉屋信夫著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善発行などに詳細に記載されている。また、当該ペプチドを含有する生体成分あるいは蛋白質加水分解物から常法に準じて採取することができ、かかる方法としては、例えば、蛋白質を酵素で加水分解し、得られた液を限外濾過膜、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などに付して精製することにより得ることができる。本発明のペプチドは他に、遺伝子工学的方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法により製造することも可能である。遺伝子工学的方法により得る場合は、該ペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡを挿入した組み換え体ＤＮＡにより、宿主細胞を形質転換または形質導入し、得られた組み換え宿主を用いて生産させるという公知の手法により行うことができる。また、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法により行う場合は、例えば一島英治編「プロテアーゼ」（学会出版センター発行）などに記載されている方法に準じて行えばよい。本合成法では、サーモリシン、カルボキシペプチダーゼＹ等の酵素を使用し、一般に酵素、原料の保護アミノ酸とも、分解反応における値よりも高濃度を添加し、必要に応じてメタノール、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒を添加した状態で反応させてアミノ酸のペプチド結合を順次形成させる。
【００１５】
また、本発明のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤の塩としては、製薬上許容される酸付加塩及び塩基付加塩が包含される。製薬上許容される酸付加塩として、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸との塩等が挙げられ、また製薬上許容されうる塩付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、エタノールアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等のアミン類との塩等が挙げられる。
【００１６】
本発明のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤はそのままで、または通常用いられる個体担体、液体担体、乳化分散剤等により錠剤、粉剤、水和剤、乳剤、カプセル剤等の形に製剤化してＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤として使用することが出来る。上記担体としては、水、ゼラチン、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース、植物油等が挙げられる。
【００１７】
本発明のペプチドはＨＩＶ−１プロテアーゼやエイズウイルスの性質を研究する、あるいは細胞の機能を研究する研究用試薬として、あるいは新しい化合物をデザインするリード化合物としての試薬として利用することができる。また、その機能が臨床的に十分に評価されれば、エイズ等の治療に利用できる。あるいはサイクリックＡＭＰをセカンドメッセンジャーとするホルモンの代替をする医薬として利用できる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明に係るオリゴチロシンを有するペプチドの実施例を説明する。ただし、本発明は、このような実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲の技術的事項の範囲内でさらにいろいろな実施例があることは言うまでもない。
【００１９】
実施例１
（Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号１）、
Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号２）、
Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号３）、
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号４）、
Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号５）、
Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号６）で示されるペプチドの化学合成）
【００２０】
チロシン１２残基のペプチドを合成する場合はアプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置（４３０Ａ 型）に、０．５ミリモルのｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭ樹脂及び各２ミリモルのｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ） カートリッジ１１個を装填する。Ｎ末端に親水性のアミノ酸を付加する場合には、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ） カートリッジ１１個に加えてｔ−Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｏｓ） カートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ） カートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ） カートリッジ２個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｎカートリッジ１個、或いはｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）カートリッジ１個を装填する。そして、ＤＣＣによる無水対称法により保護基のついたペプチド−Ｏ−ＣＨ２−ＰＡＭを合成した。なお、ｔ−Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基、Ｔｏｓはトシル基、Ｂｚｌはベンジル基を示す。また、ここで用いるアミノ酸は全てＬ体である。次に、ペプチド研究所製フッ化水素装置に上記合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール１．５ｍｌを添加後、フッ化水素１０ｍｌを導入した。−２℃、１時間の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチドを無水エーテル、クロロホルムで交互に３回洗浄し、２Ｎ酢酸６０ｍｌにペプチドを溶解させ、凍結乾燥した。次いで、それぞれのペプチドはＨＰＬＣにより精製した。得られた３．５ｍｇないし５．０ｍｇ各ペプチドの分子量はＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅ社ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ Ｍａｓｓによる質量分析の結果、それぞれ１９７５、２１１４．５、２１３４．０、２２９０．４、２１２８．１、２０８６．２であり理論値と一致した。
【００２１】
実施例２（ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤としての有効性の確認）
上記配列番号１〜６のペプチド、ペプチドＴｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号７）およびＰｏｌｙ−Ｔｙｒを試料としてＨＩＶ−Ｉプロテアーゼ阻害剤としての有効性の確認を行った。
【００２２】
バケム社より購入したＨＩＶ−１プロテアーゼ（遺伝子組み替えにより大腸菌で生産させたもの）を緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ４．９、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ ジチオスレイトール、１０％（Ｖ／Ｖ） グリセロールを含む）に溶解し０．０２０ｍｇ／ｍｌの酵素溶液とした。また、１ｍｇ／ｍｌのＨｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２（バケム社製）を蒸留水に溶解し基質溶液とした。０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、上記緩衝液１００μｌ、試料溶液１０μｌ、酵素溶液２５μｌを入れ、３７℃で５分間保温した後、基質溶液１０μｌを加えよく混合して、３７℃で２０分の反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸１５μｌを添加することにより反応を停止させた。反応停止後、酵素反応により遊離してくるｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２をＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の通りである。
【００２３】
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ８ ３００Å（ウォーターズ社３．９ ｘ １５０ ｍｍ）
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：３００ｎｍの吸収
このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出した。
阻害率＝ （Ａ − Ｂ） ／ Ａ Ｘ １００ （％）
式中、Ａ：阻害剤無添加時のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積、Ｂ：阻害剤添加時のｐ−ｎｉｔｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−ＮＨ２のピーク面積また、上記阻害率が５０％になるペプチド濃度をＩＣ５０値で表した。
このようにして得られたＩＣ５０値を表１に示す。
【００２４】
【表１】
実施例３（サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤としての有効性の確認）
上記配列番号１〜６のペプチドおよびＰｏｌｙ−Ｔｙｒを試料としてサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤としての有効性の確認を行った。
サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害作用の測定は下記の方法により行った。
【００２６】
シグマ社より購入したウシ心臓由来ホスホジエステラーゼを０．０２ユニット／ｍｌの濃度で緩衝液（６２．５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、６．３ｍＭ塩化マグネシウム、３．８ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．０３８ｍＭ塩化カルシウム）に溶解し、酵素溶液とした。また、１ｍＭのサイクリックＡＭＰ水溶液を基質溶液とした。
【００２７】
０．５ｍｌ容量のプラスチックチューブに、緩衝液１４０μｌ、酵素溶液２０μｌ、測定試料溶液２０μｌを入れ、３０℃で５分間保温した後、基質溶液２０μｌを加えよく混合して、３０℃で４０分間反応を行った。その後、１０％トリフルオロ酢酸２０μｌを添加することにより反応を停止させた。反応停止後、生成したＡＭＰを下記条件下で高速液体ＨＰＬＣにより定量した。
ＨＰＬＣ測定条件
カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μＣ１８ ３００Å（ウォーターズ社３．９ ｘ １５０ ｍｍ）
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸を含む０〜６３％のアセトニトリルの直線濃度勾配（２０分）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２６０ｎｍの紫外部吸収
このような実験を複数回行い、阻害率を次の式より算出した。
【００２８】
【式１】
阻害率＝ （Ａ − Ｂ） ／ Ａ Ｘ １００ （％）
式中、Ａ：阻害剤無添加時のＡＭＰのピーク面積、Ｂ：阻害剤添加時のＡＭＰのピーク面積
また、上記阻害率が５０％になるペプチド濃度をＩＣ５０値で表した。
このようにして得られたＩＣ５０値を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【発明の効果】
本発明のチロシンからなるペプチド、およびセリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる１つまたは２つの親水性アミノ酸が付加若しくは挿入されたチロシンからなるペプチドは、エイズウイルスプロテアーゼ阻害活性、およびサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害活性を有する。
【００３１】
【配列表】
Claims (8)
- １２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
- １２残基のチロシンからなる請求項１に記載のペプチド
- セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選ばれる１つまたは２つの親水性アミノ酸がN 末端に付加された１２〜６０残基のチロシンからなるペプチド。
- １つまたは２つの親水性アミノ酸がN末端に付加された、請求項３に記載のペプチド。
- ヒスチジン、アルギニン、アルギニン-アルギニン、グルタミンおよびセリンからなる群から選ばれる親水性アミノ酸が付加された、請求項３または４に記載のペプチド。
- 下記(a)〜(e)のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項５に記載のペプチド。
(a) His Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号２）
(b) Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号３）
(c) Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号４）
(d) Gln Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号５）
(e) Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr （配列番号６） - ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは請求項３〜６のいずれか１項に記載のペプチドを含むエイズウイルスプロテアーゼ阻害剤。
- ６〜２５０残基のチロシンからなるペプチドまたは請求項３〜６のいずれか１項に記載のペプチドを含むサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ阻害剤。」
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