JP3579711B2 - Cancer cell growth inhibitor - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガン細胞増殖抑制剤に関するものである。本明細書中では、本発明において利用する特定のタンパク質をコードする遺伝子について、必要に応じ、「遺伝子Any-RF」と略称することもある。
【０００２】
【従来の技術】
地球上には１００万種ともいわれる程の多種類で多様な昆虫があらゆる環境で強かに、そして力強く生育している。熱帯から、温帯、針葉樹林、氷雪地、砂漠、さらには湖沼地に至るまで地球のほぼ全域の環境に昆虫は適応しながら生存している。こうした現象は、昆虫があらゆる環境の中で強かに生き、あるいは生き残るべく多様な機能特性を獲得しているからに他ならない。我々が昆虫から学ぶべきものは多い。昆虫の機能特性として挙げられるのは、生体防御機構や、成長・発育制御機構、広範な物質分解、生産機能、鋭い感覚機能、行動調節機構、脳・神経機構、媒介機能、あるいは環境適応能等である。こうした昆虫が持つ環境適応的でかつ省エネルギー的な機能を解析することにより、将来的には、最先端の創造的な新しいテクノロジー構築に役立つ貴重な情報が得られる。
【０００３】
昆虫の持つ機能を解析して、昆虫由来で多様な機能性を持つ生理活性物質を高度に利用する技術を開発することは極めて興味深い研究課題である。昆虫から単離し、そして構造決定した生理活性物質は、高品質のかつ新規な製品に対する農業分野での技術開発や医薬品分野での技術開発のための応用研究の対象として重要な意義を持っている。
【０００４】
昆虫由来で、いわゆる生体防御物質として知られている抗菌性ペプチドは１５０種類以上にもおよび、それらの多くが単離され、構造決定されている。本明細書では、生体細胞の細胞制御機能、例えばガン細胞の増殖抑制機能、すなわち抗腫瘍機能または抗ガン機能を持つ昆虫由来の新規生理活性物質であるタンパク質を対象とするため、以下、昆虫由来の細胞増殖抑制機能物質を中心に記述することにする。
【０００５】
昆虫由来の抗ガン性物質には、例えばセクロピンと呼ばれるペプチドがある。セクロピア蚕から単離され、構造決定されたものであり、その構造決定後、類似の構造を持った物質が多くの昆虫から単離され、同定されている。こうした研究解析はごく最近の研究成果によるものである。セクロピンは、リンパ腫や白血病の培養細胞に対して抗腫瘍作用があると報告されている（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。セクロピンの遺伝子がヒトの膀胱ガン由来の培養細胞に遺伝子組換えされ、その細胞をヌードマウスに注射した結果、腫瘍細胞の成長が抑制（抗ガン性）されることが実証されている（Ｗｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０００６】
また、モンシロチョウの蛹から単離された９８ｋＤａの高分子タンパク質は、ヒトの胃ガン細胞（ＴＭＫ−１）のようなガン細胞に対して強い細胞毒性（細胞毒性とは、最終的に細胞死を誘導し、その結果抗ガン性があることを意味している）を有し、ガン細胞の増殖を抑制し、最終的にはアポトーシス（細胞死）を誘発する特異的な生理活性を示すことが報告されており、このタンパク質はピエリシン（ｐｉｅｒｉｓｉｎ）と命名されている（Ｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ， Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ８７， １２５９−１２６２， １９９６； Ｋｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
昆虫由来で抗腫瘍活性を持つ新規物質発見の歴史は短く、新規物質に関する知見は少ない。
【０００８】
上記したような昆虫由来の腫瘍細胞成長抑制物質またはガン細胞増殖抑制物質としてこれまで報告のあるセクロピア蚕からの単離タンパク質（セクロピン）やモンシロチョウの蛹からの単離タンパク質（ピエリシン）は、約４ｋＤａとか９８ｋＤａの高分子量のものである。これら既知の生理活性物質は、ガンの生細胞において細胞死を誘導することによりガン細胞を効率的に減少させるが、ガン細胞周期のステージを確実に変化させ、ガン細胞を一旦休止状態にさせることは不可能であるという問題がある。また、セクロピンが、ヒトのガン細胞の増殖を抑制させ得ることが報告されているとしても、実用的な視点からすると、生体に適用した場合、高分子量のタンパク質は生体内で抗原抗体反応を起こすので、セクロピン等を生体に対して使用することは困難であるという問題がある。そこで、ガン細胞の増殖阻害物質に関して、昆虫由来の生理活性物質であり、ガン細胞の増殖抑制機能のような生体細胞の細胞制御機能を持ち、しかも生体に投与した際には、抗原抗体反応を起こさない生理活性物質の出現が強く望まれてきた。
【０００９】
本発明は、ガン細胞の増殖抑制機能を持ち、生体内で抗原抗体反応を起こさない生理活性物質を有効成分とするガン細胞の増殖抑制剤を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、同一出願人の先の出願（特願平１１−１５２２７３号；特許第３０２３７９０号）において、前幼虫休眠タイプの天蚕、マイマイガ、ウスバシロチョウ、オビカレハ、カシワマイマイ等の鱗翅目昆虫および直翅目昆虫を中心とした４０種以上の広範な昆虫（これらの前幼虫休眠タイプの昆虫としては、梅谷与七郎、蚕の越冬卵より見たる昆虫の卵態越冬現象、蚕糸試験場報告、１２：３９３−４８１（１９４６）およびＵｍｅｔａｎｉ Ｙ．， Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉａｐａｕｓｅ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔｓ， Ｐｒｏｃ． Ｊｐｎ． Ａｃａｄ．， ２６， １−９ （１９５０）に記載されている）に特異的かつ効率的に作用する休眠制御活性を有する生理活性物質に関する発明について明らかにしたが、その後の研究推進により、この生理活性物質が生体細胞の効率的な制御活性、例えば、ガン細胞の効率的な増殖抑制活性を有するものであることを見出し、本発明を完成するに至ったのである。すなわち、先願発明における遺伝子Ａｎｙ−ＲＦは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が５７０．９５９であるタンパク質をコードするものであり、本発明者らはこの生理活性物質がガン細胞の増殖を効率的に抑制すること、ひいては生体細胞を効率的に制御する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至ったのである。
【００１１】
本発明の生体細胞のガン細胞の増殖抑制剤は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、Asp-Ile-Leu-Arg-Glyを有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が５７０．９５９であるペプチドを有効成分として含有するものである。本発明の有効成分である生理活性物質は、上記のように、Ｎ末端より５番目までのアミノ酸配列がAsp-Ile-Leu-Arg-Glyであって、Ｃ末端が遊離酸化された化合物ではなく、アミド化されているものである。この有効成分は、例えば、天蚕前幼虫体等のような鱗翅目昆虫の前幼虫体を粉砕したものをメタノール：水：酢酸からなる酸メタノール液に加え、乳鉢内で摩砕後、遠心処理し、得られた上清をHPLCシステムに導入することにより単離・精製して得ることもできるし、または公知のペプチド合成装置を用いて公知の方法に従って調製することもできる。
また、このペプチドは生体細胞の細胞周期を制御し、ガン細胞の増殖を抑制する。
【００１２】
また、本発明の生体細胞のガン細胞増殖抑制剤は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からＮ末端のAspを欠いたアミノ酸配列、Ile-Leu-Arg-Glyを有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が４５６．５８であるペプチドを有効成分として含有するものであってもよい。このペプチドは生体細胞の細胞周期を制御し、ガン細胞の増殖を抑制する。
【００１３】
本発明における生理活性物質は、例えばガンの生細胞を効率的に減少させることができ、ガン細胞周期のステージを確実に変化させ、ガン細胞を一旦休止状態にさせる方向へと移行させることが可能である。こうした機能を持つ生理活性物質は有効なガン細胞増殖抑制剤として用いられ、ひいては抗ガン剤として実用化できる可能性がある。従来の抗ガン剤が持つ正常細胞への悪影響（細胞死）問題を解消し、静止期にある多くの正常細胞へは影響がなく、増殖細胞だけを抑制するという優れた働きを持つ。また、この生理活性物質は、生体細胞の細胞制御因子（ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として細胞増殖を可逆的に制御できるものであり、例えばガン細胞の増殖を効率的に抑制でき、しかもアミノ酸５個から成る低分子量のペンタペプチドであり、生物界では新規物質である。さらに、この生理活性物質は、上記セクロピンあるいはピエリシンとは構造上の類似性は全く無く、しかも、例えばマウスの肝ガン細胞等の増殖を効率的に抑制すると同時に、ガン細胞を抑制するメカニズムについても従来技術には無い特徴ある抑制機構を示す。すなわち、細胞周期を改変する特徴を有し、細胞増殖を可逆的に制御することが可能である。また、細胞周期のメカニズムを解明する上でも有用な生理活性物質である。
【００１４】
一般に、タンパク質は、実際に生体に適用する場合、その分子量が大きいと、生体内で抗原抗体反応を起こすので、大きな障害となる。蚕由来のセクロピンは分子量が約４ｋＤａであり、また、モンシロチョウ由来のピエリシンは９８ｋＤａであるので、生体に投与すると抗原抗体反応が起こり易い。これに対し、本発明における天蚕由来の生理活性物質は、０．５７１９５９ｋＤａと低分子量のペンタペプチドであるので、生体に投与しても抗原抗体反応が起こり難いという特徴を有している。従って、抗ガン活性という特異的な機能を有しているこのペプチドは、そのままでも種々の動物に直接投与できる。高等動物においても、本ペプチドのように短い低分子のペプチドは抗原とはなり難いので、該ペプチドの生体外からの投与によって、抗ガン機能を発揮させることができるという特徴を持っている。
【００１５】
さらに、本発明におけるペプチドは、抗原抗体反応を起こすことがなく、しかも細胞増殖抑制効果をもち、かつ新しい医薬、または抗ガン剤開発のリード化合物としても有望である。しかも、ガン細胞の生細胞を増加させることのない機能を保つ（図２、図３、および図４）とともに、生存するガン細胞に対して、ガン細胞の周期ステージを変化させ、細胞増殖を一旦休止状態にさせるという大きな特徴を持っている。この点において従来の如何なる抗ガン剤の作用機序とも異なっている。すなわち、本発明の生理活性物質は、ＤＮＡ複製期に相当するＳ期間を減少させ、静止期のＧ０ならびに第１期に符合するＧ１期を延長させる機能を持つ。かくして、本発明の生理活性物質はガン細胞の増殖を効率的に阻害する。これに対し、セクロピンにしろピエリシンにしろ、生細胞を減少せしめることによりガン細胞の増殖を抑制する機能を持ち、細胞死（アポトーシス）を引き起こすことによりガン細胞の増殖を阻害しているに過ぎない。
【００１６】
一般に、細胞周期においてはＧ０期とＧ１期が最も長い時間を要するといわれている。その両ステージを増大するように作用する本発明における生理活性物質は、従来報告されている昆虫由来のガン細胞抑制効果物質とは根本的に異なっている。従来のものはアポトーシス（細胞死）に伴う核の凝縮や断片化を誘導し、その結果、生細胞数を減少せしめるものである。しかし、本発明の生理活性物質の機能は、細胞周期のＧ０とＧ１を増大しＳ期を減少させ、その結果、生細胞の細胞周期が長時間となり、最終的には増殖抑制をすることにある。従って、本発明の生理活性物質は、ガン細胞増殖において細胞死を誘導するのではなく、細胞周期を制御し細胞の増殖を抑制することで細胞数が増えないように作用している。
【００１７】
本発明における生理活性物質は、先願発明で述べたように、生理活性機能の一つとして、天蚕前幼虫の休眠を長く維持するように作用する。一般に生物の休眠とは、細胞の増殖が停止し低エネルギー状態を維持することが特徴と考えられている。従って、この物質の機能を多面的に応用する一例として、哺乳類のガン細胞増殖を制御する目的においても活用できる。さらに、多くの生物細胞の増殖を抑えることが予想され、細胞レベル・個体レベルの長期保存剤の開発にも利用できる。
【００１８】
本発明における遺伝子Ａｎｙ−ＲＦを有する低分子量のペプチドは、副作用を伴なわずに効率的にガン細胞の増殖を阻害する機能を持ち、マウスの肝ガン細胞の増殖を抑制することから、ヒトの子宮ガン、肝臓ガン、肺ガン、胃ガン、乳ガン等の細胞増殖を効率的に抑制し、ひいては生体細胞の細胞制御を効率的に行う蓋然性が極めて高い。
【００１９】
以上述べたように、本発明により、昆虫内分泌学上従来全く知られていない物質で、生体細胞の細胞制御因子である生理活性物質が始めて明らかになった。
【００２０】
また、上記アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙに対する塩基配列として５’−ＧＡＹ−ＡＴＨ−ＹＴＮ−ＭＧＮ−ＧＧＮ−３’が考えられる。
【００２１】
本発明においてガン細胞増殖制御剤（ガン細胞増殖抑制剤）とするためには、通常の薬剤と同様に、公知の各種添加剤、賦形剤等を通常の方法で配合し、所定の薬剤とすればよい。本発明の細胞制御剤としての有効量は、一般に５０〜３５０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｋｇであり、その投与方法は、生体内に投与できる方法であれば手段を選ばない。例えば、経口投与でも、静脈注射でも、腹腔内投与等でもよい。
【００２２】
本発明において用いる上記生理活性物質であるペプチドは、従来のセクロピンやピエリシンと比べて、生体内での副作用がほとんどなく、また、急性毒性も観測されなかった。すなわち、ラットとマウスとに対して、それぞれ体重１ｋｇ当たり０．５ｇの本発明のペプチドを経口及び経皮の２通りの方法で投与し、所定の方法で毒性試験を行ったところ、いずれの動物にも痙攣や嘔吐のような急性毒性は観測されなかった。さらに、毒性試験後の各動物の生殖器官の精巣を摘出して、その組織について顕微鏡により観察したが、異常性は認められなかった。また、本発明のペプチドは、低分子量のペンタペプチドであるため、安全性からみても抗原抗体反応は起こり難い。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、上記先願発明において、本発明で用いる生理活性物質が昆虫の休眠を維持する機能のあることを明らかにした。本発明の内容を詳細に記述するのに先立って、話の流れを容易にするため、先願発明の概要を先ず繰り返し説明する。
【００２４】
先ず、生理活性物質の単離された天蚕について述べる。天蚕（正式和名：ヤママユ、学名：Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍｅｎｅｖｉｌｌｅ）は、わが国を原産地とし、江戸時代から飼育の記録があり長い歴史を持つこと、最近人工飼料が開発されて幼虫の飼育が容易であること、農家段階で一般的に飼育されていることから、飼育に関する情報が多く、しかも入手が容易であると共に、年１回発生し、卵で越年する。家蚕（カイコ）幼虫が専ら桑の葉を食べるのに対して、天蚕はクヌギ、コナラ、カシワ、アベマキ等の葉を食べる。養蚕農家が家蚕幼虫を飼育するのに対して、野生の天蚕幼虫は、自然状態で生育する。天蚕種の孵化率は低く、繭糸から絹糸となる割合（糸歩）は極めて少ない。また、繭糸をとる作業が困難であるため希少価値としての意義がある。天蚕絹糸１ｋｇの価格が２０万円とも３０万円ともいわれ、絹のダイヤモンドと呼ばれるほど希少価値があるのはこのためである。野蚕である柞蚕絹糸の配合率が増加した絹織物では糸の滑りが抑えられ、縫目の滑脱抵抗が改善できるため好んで用いられる。そのため、将来、大型絹糸昆虫である天蚕を利用した分野の発展が大いに期待される。従って、天蚕由来の各種機能を持つ生理活性物質の単離や構造決定の重要性はますます高まっている。
【００２５】
先願発明では、先ず、天蚕の前幼虫の休眠中幼虫、休眠覚醒幼虫、死亡幼虫の個体数および休眠覚醒率を調べた。天蚕の前幼虫の休眠中幼虫に蒸留水を注射してもほぼすべての天蚕の前幼虫は休眠覚醒状態にあった。しかしながら、ペプチドＡｓｐ−Ｉｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２を１００ピコモル／０．０５μｌの量で、天蚕前幼虫に１回注射した場合に比べ、２回注射した場合には休眠覚醒率を５３．３％から３０％まで減少でき、さらに３回注射した場合にはさらに１３．３％まで減少させることができた。これにより、先願発明における生理活性物質は、昆虫の休眠を維持する因子であると結論付けた。このようにして、天蚕由来で休眠制御活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、およびその機能が明らかとなった。
【００２６】
天蚕由来の上記生理活性物質では、休眠維持の機能以外の効果は全く分かっていなかったが、本発明により、ガン細胞の増殖抑制機能のような生体細胞制御機能を持つ物質であることがはじめて明らかとなった。この物質は、それ自体が生体細胞の細胞制御剤として有用であることに加え、将来的にはガン治療薬を含めた新規医薬品開発のためのリード化合物として重要となるものと考えられる。
【００２７】
上記したようにガン細胞の増殖を抑制する機能を持つペプチドのアミノ酸配列構造は、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２である。このペンタペプチドは、コンピューターサーチ（ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ）によっても既知のものが無く、生物界においては新規な抗ガン機能を持つペプチドである。これを、Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ−Ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ（略称Ａｎｙ−ＲＦ）と命名した。５個のアミノ酸のＣ末端がアミド化されている本ペプチドは、フリーの存在様式として、生物界では本発明が完成されるまで見出されていなかったが、いくつかの生物タンパク質のアミノ酸配列の中には、同じ−−−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｇｒ−Ｇｌｙ−−−の配列がみられる。例えば、コンピューターサーチによれば、イーストの仮説２２．１ＫＤタンパク質（１９３個のアミノ酸）の１６６〜１７０番までの配列、ヒトの白血病阻止因子前駆体（２０２個のアミノ酸）の１４２〜１４６番までの配列が同じである。しかし、この部分のアミノ酸配列の機能についてはまったく明らかにされていない。すなわち、アミノ酸配列が同じでも、本ペプチドのように、Ｎ末端とＣ末端の間に介在し、Ｃ末端がアミド化してフリーの存在様式で生理機能を有するものは、まったく見出されていない。
【００２８】
ガン細胞の増殖の場合、その周期ステージは、通常の細胞増殖と同様、基本的な細胞周期に依存するが、そのチェックポイント制御系に異常が発生することで細胞増殖が進行しつづける（ここで、チェックポイント制御系とは、細胞周期にミスが発生し、破滅的な遺伝的損傷が細胞に起こるのを防ぐシステムを意味するものであり、こうした機能を利用すれば細胞周期を制御できる）。これとは逆に、成長分化し終えた細胞においては、Ｇ０期（静止期）で細胞***は起こらない。一般的に、成長過程の細胞は次のような細胞周期ステージを展開する。すなわち、Ｇ０期（静止期）からＧ１期（ＤＮＡ複製決定期）へと進み、次いで、Ｓ期（ＤＮＡ複製期）を経て、Ｇ２期（有糸***準備期）からＭ期（細胞***期）へと進行する（本明細書中では、Ｇ２／Ｍ期と略記）。その後、再びＧ０期へと進むか、またはＧ０期を経ないで直接Ｇ１期（ＤＮＡ複製決定期）（本明細書中では、Ｇ０／Ｇ１期と略記）へと進むこともある。
【００２９】
本発明の生理活性物質は、ガン細胞数を増加させない機能を保つとともに、生存するガン細胞の周期ステージを大きく変化させる点に大きな特徴があり、ＤＮＡ複製期に相当するＳ期を減少させ、静止期のＧ０およびＤＮＡ複製決定期に符合するＧ１期を延長させる機能を持つ。かくして、本発明の生理活性物質がガン細胞の増殖を効率的に阻害することになる。本発明における天蚕由来の生理活性物質がガン細胞の増殖を効果的に阻害することは、上記のように特定のガン細胞周期ステージに特異的に効果を現すことからも明らかである。
【００３０】
本発明によるガン細胞の増殖を抑制する生理活性物質は、休眠中の天蚕前幼虫から、図１に示す方法に従って単離・構造決定できる。単離、精製の概略は以下の通りである。
【００３１】
産卵後１ヶ月以内の天蚕の休眠中の卵から前幼虫を摘出し、直ちに液体窒素で凍結し、その後は使用まで−８０℃で保存した。約１，５００頭（約６ｇ）の前幼虫に１０倍容の酸メタノール液（例えば、メタノール：水：酢酸＝９０：９：１（容量％））を加え、乳鉢内で摩砕後、１０，０００ｇで３０分間遠心処理してその上清を得た。この操作を３回繰り返し、合わせた上清を遠心バポライザーで濃縮した。濃縮液を１００℃で１０分間熱処理し、１０，０００ｇで１５分間遠心処理した。かくして得られた上清に、上清の最終濃度が８０％になるように冷アセトンを添加し、１０，０００ｇで１５分間遠心処理して沈殿物を得た。この沈殿物を水に溶解し、フィルター（ミリポア社のミリポアフィルター（ＳＬＬＨ ＲＯ４ ＮＬ、０．５μｍ）を通したものを逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィで２回溶出処理し、最後に混合分離モードカラムによる高速液体クロマトグラフィで溶出処理し、単離精製物を得た。 この単離方法における最初の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）では、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー株式会社製）を使用し、２回目のＲＰ−ＨＰＬＣシステムでも同じカラムを使用した。３回目の逆相とイオン交換モードを備えたカラムによるＨＰＬＣシステムでは、ＲＳｐａｋ ＮＮ−６１４カラム（昭和電工株式会社製）を使用した。いずれのシステムでも、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液（容量％）にアセトニトリルを添加しながら、アセトニトリルの濃度（％）勾配を変化させ、その濃度勾配を利用しながら活性画分を溶出した。吸光度は２２０ｎｍで測定し、流速は１ｍｌ／分または０．５ｍｌ／分とした。
【００３２】
酸メタノール液に酢酸を用いる理由は、次の通りである。この抽出法は他の昆虫のペプチドホルモンを抽出する際にも使用されており、酢酸を添加することによって、９０％以上のプロテアーゼ活性を抑制し、ペプチドの分解を抑えることができる。酸メタノール液としては、メタノール：水：酢酸＝９０：９：１（容量％）が最適であるが、この範囲に特に限定されるわけではない。
【００３３】
前幼虫の取り出し方としては、上記したように産卵後１ヶ月以内の休眠卵を用いるとベストであるが、その理由は次の通りである。産卵後約１０日から休眠開始して２０日以内は、休眠の深度が強いと考えられるが、一般に昆虫の休眠は、さらに時間が経過すれば浅くなるためである。本発明において、天蚕の前幼虫１，５００頭より最終的に得られるホルモン様物質である生理活性物質は、僅か２１．４μｇというかなりの少量である。ところが、天蚕は、カイコと比較して完全な人工飼料も開発されておらず、産卵技術も困難であることから、１卵当たり５〜２０円という高価格になる。従って、天蚕を用いて本発明における生理活性物質を調製するには効率的、経済的に引き合わない。
【００３４】
上記単離精製物の構造は次のようにして決定された。すなわち、単離精製物のＮ末端アミノ酸配列を、ペプチドシークエンサーのＧ１０００Ａ（ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）社製）によって解析した。その結果、アミノ酸配列は、Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｇｒ−Ｇｌｙであることが確認された。次いで、該物質について、そのＣ末端がアミド化（−ＮＨ_２）されているのか、または遊離酸化（−ＣＯＯＨ）されているのかを調べるため、この単離精製物を質量分析計により分析した。なお、上記アミノ酸配列を有するペプチドであって、Ｃ末端がアミド化されているものと遊離酸化されているものとを下記のペプチドの合成方法に従って製造し、これを対照として用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ （Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ 質量分析計） （Ｖｏｙａｇｅｒ ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、単離精製物質および合成ペプチドを、それぞれ、０．５μｌ宛この質量分析計のサンプルプレート穴に注入し、等量のマトリックス（０．１％ＴＦＡ水溶液とアセトニトリルとを５０：５０（容量％）の割合で混合したものの中にα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を飽和せしめたもの）と混合した。乾燥後、陽イオン化マトリックスとして分子量を決定した。単離精製物においては５７１．８５８と５７２．８４６とに大きな２つのピークが認められ、生体内においては両タイプのアミノ酸配列が存在しているものと考えられたが、以下の実施例で検討したようにＣ末端がアミド化されたものが細胞制御活性を有するものである。また、合成Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｇｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２では５７１．９５９に最大ピークが認められ、そして合成Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｇｒ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨでは５７３．０４５に最大ピークが認められた。かくして、本発明の生理活性物質は、５７１．９５９の分子量を有するペンタペプチドである。
【００３５】
上記ペンタペプチドは、天蚕の前幼虫態休眠だけではなく、他の昆虫の幼虫期や蛹休眠期で発見される可能性もある。昆虫ホルモンでは、昆虫種が異なり、ステージが異なれば、同じ構造物質でも異なる機能を有することがあるからである。すなわち、昆虫の休眠は、天蚕の場合のように前幼虫態休眠するだけではなく、カイコのように胚子休眠する種、ヨトウのように幼虫休眠する種、サクサンやモンシロチョウのように蛹休眠する種、そしてナミテントウやハムシ類のように成虫休眠する種等に分類されている。あらゆる休眠形態からでも本発明における生理活性物質は単離できると当然に予想され得る。従って、同じペンタペプチドならびにその関連物質は、多くの昆虫種から、ガン細胞増殖抑制因子のような細胞制御因子として同定できる。該ペンタペプチドは、このような多くの昆虫種の個体全体から、図１に示した方法に従って、上記した天蚕前幼虫と同じ方法で抽出できる。直接体液から抽出する場合には、幼虫体の脚等の生体組織の一部を切開することで体液を流出せしめ、図１のメタノール：水：酢酸＝９０：１：１の水の部分を体液に置き換えることで調製した９０％酸メタノール液を氷冷中で混合し、その後、図１に従って抽出するとよい。
【００３６】
一般に、ホルモン様物質の抽出で重要な要因となるのは、高い回収率を得るために原材料として何を選ぶかという点および効率よく分離するためにカラム樹脂として何を選ぶかという点であるが、合成できればそれに越したことはない。しかるに、上記したように、本発明における生理活性物質のアミノ酸配列は判明しているので、この配列を持つ生理活性物質は、既存のアミノ酸合成装置を用いて、従来の方法で経済的に、効率的に合成できる。
【００３７】
本発明におけるペプチドは、５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドの一種であって、低分子量のペプチドであるため、昆虫以外の生物種においては抗原とはなり難いという特徴を持ち、昆虫等から分離・精製されたペプチドでも合成されたペプチドでも有効な効果を発揮できる。脊椎動物の免疫グロブリンによる抗原抗体反応では、生体外から侵入するのが低分子のオリゴペプチドであれば抗原とはならないからである。さらに、合成ペプチドによる生体外からの投与によって、可能性のある機能について簡易に試験研究できるという特徴もある。
【００３８】
本発明における生理活性物質は、天蚕の前幼虫から単離・精製できるが、天蚕で前幼虫以外のステージまたは天蚕以外の昆虫で、例えば、同じステージで休眠する昆虫類や他のステージ（天蚕の場合）で、また、サクサンやクスサンのような他の野蚕でも、当該生理活性物質を単離できる可能性はある。
【００３９】
本発明における抗ガン機能を保つ生理活性物質は、ラットの肝ガン細胞の増殖を抑制することから、ヒトの肝ガン、胃ガン、肺ガン、乳ガン等あらゆるガン細胞に対して増殖抑制効果を発揮する可能性が高い。
【００４０】
【実施例】
次に、本発明を実施例および比較例により詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。以下の実施例では、単離ペプチドと同じ配列構造を有する合成ペプチドを用いて各種試験を行った。
（１）ペプチドの合成
本発明におけるガン細胞増殖抑制物質は天蚕幼虫由来の新規な物質であり、構造的にはたった５個のアミノ酸からできている。従って、ペプチド合成法により多量に製造することが可能である。ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８、（株）島津製作所製）を用いて、通常の方法によってペプチドＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２またはＲＦ−ＮＨ_２と称す）およびＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ（ＤＩＬＲＧ−ＣＯＯＨまたはＲＦ−ＣＯＯＨと称す）を合成した。精製は逆相カラム ＵＬＴＲＯＮ ＶＸ−ＯＤＳ（２０ｍｍ×２５０ｍｍ、信和化工（株）製）をＨＰＬＣのシステム（ＬＣ−１０Ａ、（株）島津製作所）に接続して行った。溶出は、８ｍｌ／分の流速で、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下でアセトニトリルの濃度勾配（０〜５分は１〜５％、５〜３５分は５〜６０％）を用いて行い、活性画分を溶出せしめた、吸光度は２２０ｎｍで測定した。精製したペプチドは、サンプルプレート上で等量のマトリックス（５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡα−ＣＨＣＡを飽和させたもの）と混合した後乾燥させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ ＰｅｒＳｅｐｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって純度を確認した。
【００４１】
上記の方法に従って、ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２（純度：９５％以上、ＨＰＬＣとＴＯＦ−ＭＳで検定）およびＤＩＬＲＧ−ＣＯＯＨ（純度：９５％以上、ＨＰＬＣとＴＯＦ−ＭＳで検定）の２種類を合成し、以下の実施例で用いた。
（２）細胞と培地組成
ラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）を用い、この細胞の培養には、４ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌカナマシンが含有された１０％ウシ新生児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。上記細胞について、３７℃で５％ＣＯ_２を含む湿潤環境下で細胞培養を行った。
（３）ガン細胞の増殖抑制アッセイ
１００ｍｍのデイッシュ（一般的にはシャーレ）に生育している細胞の古い培地を除いてＰＢＳ（−）（リン酸生理緩衝液からＣａイオンとＭｇイオンを除去したもの）で１回洗浄した。１０％トリプシン液１．５ｍｌを加え、均一となるように静かにディッシュ全体に行きわたらせた後に、１ｍｌを除いて３７℃で５分間保温し、顕微鏡で細胞が底から剥がれているのを確認した。次いで、新しいＤＥＭＥ培地を９．５ｍｌ加え、ピペッテイングにより細胞を１個１個バラバラにして浮遊させた。この浮遊液を１／２０希釈率で１００ｍｍのデイッシュ（総量は１０ｍｌ）に植え込み、これをインキュベーターに入れ、２４時間培養した。所定の濃度になるように各ディッシュにそれぞれのペプチドを添加して３７℃で培養し、２４時間および４８時間経過後の時点で血球計算板を用いて細胞数を計測し、細胞増殖抑制機能を検討した。
（４）形態的観察
各ペプチドで処理した細胞を遠心分離により回収した後、これに１００μｌの１／２ＰＢＳ（−）を加え懸濁せしめた。次ぎに、カルノア固定液を２滴加えて懸濁させ、カルノア固定液を１ｍｌ加え重層した。この重層液を静かに撹拌し、室温で５分間静置した後遠心分離（４，０００ｒｐｍ、５分）し、上清を除いて、少量のカルノア固定液を添加し懸濁せしめた。この懸濁液をスライドガラス上に１滴滴下し風乾した。さらに、細胞上に固定液１滴を滴下し、再び風乾した。これにギムザ染色液を重層し、３０分間室温で染色したのち水洗し、風乾後封入を行った。顕微鏡下で核の変化を観察した。
（５）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析
各ペプチドで処理した細胞を７０％エタノールで４℃で４時間固定した。固定した細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、２ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを用いて３７℃で３０分間処理し、ＲＮＡを分解した。その後、ヨウ化プロピジウム（２５μｇ／ｍｌ）により３０分以上染色し、ナイロンメッシュを用いて濾過した。フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＦＡＣＳＶＡＮＴＡＧＥ）により１０，０００個の細胞の蛍光強度（細胞あたりのＤＮＡ含量）を解析した。
（実施例１）ペンタペプチドによるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の増殖抑制効果：ガン細胞の増殖に及ぼすペンタペプチドの抑制効果を次のようにして調べた。ガン細胞としては、比較的簡単に入手し易く、しかも細胞培養が容易であるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）を用いた。本発明の生理活性物質（ＲＦ−ＮＨ_２）とガン細胞増殖の関係を明らかにするために、対照区として、細胞培地にＰＢＳ（−）を添加したもの、実験区として、細胞培地に上記Ｃ末端がアミド化されているタイプのＲＦ−ＮＨ_２およびＣ末端が遊離酸化されているＲＦ−ＣＯＯＨを、それぞれ、２００μｇ／ｍｌ添加したものを用いて培養を行った。培養細胞数を３〜５×１０^５個に調整し、所定量の各ペプチドを添加しまたは添加しないで、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で培養した。培養後２４時間後と４８時間後の培養液について、ガン細胞の形態的な観察を倒立顕微鏡下で直接行った。この顕微鏡写真を図２に示す。
【００４２】
図２に示したように、ＲＦ−ＮＨ_２を添加した実験区では、２４時間後および４８時間後とも、培養開始時点（０時間）の細胞数と比較しても増加はほとんどなく、しかも４８時間後には細胞の形態が紡錘形から丸形に変化していた。このような細胞の形態変化は、細胞***活動の状態から***活動の停止状態へと変化したことを意味する。一方、対照区およびＲＦ−ＣＯＯＨを添加した実験区では、２４時間後および４８時間後とも、培養開始時点の細胞数と比較して極めて顕著に増加していた。図２の結果は、本発明における生理活性物質を培養細胞に添加することによって、ラットのガン細胞の増殖が形態的に抑制されることを意味している。
（実施例２）ペンタペプチド濃度によるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の増殖抑制効果：
３×１０^５個のｄＲＬｈ８４細胞に対し所定の濃度（０、５０、１００、２００μｇ／ｍｌ）となるようにペプチド（ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２またはＤＩＬＲＧ−ＣＯＯＨ）を細胞培地に添加し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で４０時間培養した。その後トリパンブルーで処理し生細胞数を計測した。得られた結果を図３に示す。
【００４３】
図３に見るとおり、実験区のＲＦ−ＣＯＯＨの場合、２００μｇ／ｍｌの高濃度でも生細胞数は１４．６×１０^５個のレベルで増殖活性にほとんど変化は認められない。しかし、 ＲＦ−ＮＨ_２添加区では、５０μｇ／ｍｌ濃度から生細胞数は顕著に減少し、２００μｇ／ｍｌの高濃度では対照区の約半分の生細胞数に当たる７．７×１０^５個のレベルまで減少した。図３から、実施例１において形態的に観察したＲＦ−ＮＨ_２によるガン細胞増殖抑制が生細胞数の減少と符合することがわかる。また、本発明における生理活性物質でＣ末端をアミド化したペプチドには、顕著なガン細胞の増殖抑制効果があるが、Ｃ末端が遊離酸化されているタイプのペプチドにおいては抑制効果がまったく発現しなかったことがわかる。
（実施例３）ラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）増殖能力と培養時間との関係：
実施例１と２の結果から、昆虫の生理活性物質がラット肝ガン細胞の増殖を抑制することが明らかになったので、さらに、本発明の生理活性物質を用いガン細胞の増殖能力と培養時間との関係を検討するために、培養時間を延長して培養を行った。培養法としては、実施例２と同様の方法で行った。培養時間は７２時間まで延長し、対照区としてはＰＢＳ（−）を使用し、また、実験区としては、３×１０^５個の細胞に対し濃度が２００μｇ／ｍｌとなるようにペプチド（ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２）を細胞培地に添加し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で２４、４８、７２時間それぞれ培養した。その後、トリパンブルーで処理し生細胞数を計測した。得られた結果を図４に示す。
【００４４】
図４に見るとおり、細胞数が、対照区では培養後７２時間まで培養時間が増すに従って急激に増殖し、生細胞数が３×１０^５個から６０×１０^５個まで２０倍以上にも増大した。一方、実験区では７２時間の間に細胞数が３×１０^５個から８×１０^５個と２．７倍の増加を示したに過ぎなかった。この結果は、本発明の生理活性物質がガン細胞増殖能力を７．５分の１レベルに抑制することを意味するものである。すなわち、本発明の生理活性物質は、ガン細胞増殖能を、かなりのレベルで抑制する効果を発揮していることが明らかである。
【００４５】
次いで、上記ペプチド添加培地の培養後４８時間の培養液から培養細胞だけを新鮮な培地に移し変えて、上記と同じ培養条件で培養し、その後のガン細胞の増殖量変化を調べた。その結果、増殖が一旦抑制されていたガン細胞は、対照区のＰＢＳ（−）添加の場合と同様に急速に増殖を開始した。従って、このことは、ガン細胞抑制のためには本発明のペプチドの存在が常時不可欠であること、さらに、このペプチドによりあらゆる生物の細胞増殖を可逆的に制御できることを示唆するものである。
（実施例４）ペプチド添加による細胞周期変化の解析：
実施例１、２、および３（図２、３、および４）により、本発明の生理活性物質がラットガン細胞の増殖能力を抑制することは実証できた。次に、その抑制のメカニズムを検討することにした。濃度が２００μｇ／ｍｌとなるようにペプチド（ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２）を実施例１と同じ条件で培地に添加して、培養し、４８時間培養した細胞をエタノール固定後、ヨウ化プロピジウム染色を行った。また、対照区としてＰＢＳ（−）を添加したものについても同様に処理した。細胞のＤＮＡ含量をフローサイトメーターを用いて解析した。得られた結果を図５に示す。なお、この目的のために、フローサイトメトリー解析を使用するが、この方法は、ＤＮＡ結合性の蛍光色素であるヨウ化プロジウムで染色して、ＤＮＡ含量を測定するものであり、細胞周期制御の解析が可能となる。すなわち、生物細胞は***しながらＧ０／Ｇ１、Ｓ（ＤＮＡ複製期）、そしてＭ期（細胞***期）へと周期変化を起こしながら増殖するが、図５は個々のガン細胞のＤＮＡ量をフローサイトメーターを用いて測定し、解析したものである。図５に示したように、ＰＢＳ（−）添加の対照区（図５（Ａ））とＲＦ−ＮＨ_２添加の実験区（図５（Ｂ））における細胞周期変化によれば、ペプチド添加および無添加により、ラット肝ガン細胞周期への影響パターンが異なることが推測された。
【００４６】
次ぎに、図５で見られたパターンを詳細に計測した。Ｇ０／Ｇ１期では、ＤＮＡ量は２ｎであるのに対し、Ｍ期では２倍の４ｎとなる。図５の解析で２ｎのＤＮＡ量は３６０に、そして４ｎのＤＮＡはＤＮＡ量は７００に対応したピークまたは幅広いピークに対応する。図５に示す細胞周期変化の解析パターンがＧ０／Ｇ１、Ｓ、Ｍ期に特色のあるピークの線型結合からなると仮定し、それぞれの成分に分割することにより各ステージの細胞の割合が求められる。得られた結果を表１に掲げる。
【００４７】
【表１】

【００４８】
表１に示したように、細胞周期ステージのＧ２（有糸***準備期）とＭ期（細胞***期）（表中では、Ｇ２／Ｍ期に符合）の細胞割合は、対照区が１１．９２％、実験区が１２．１０％であり、両者ともほとんど変わらないが、Ｇ０期（静止期）とＧ１期（ＤＮＡ複製決定期）（表中では、Ｇ０／Ｇ１期と符合）の細胞割合は、対照区が５０．５３％であるのに対し、実験区が６６．０７％であり、対照区より３割以上多かった。また、Ｓ期（ＤＮＡ複製期）の場合は逆に、対照区の３７．５５％に対し、実験区は２１．８４％であり、対照区より４割以上少なかった。従って、この結果は、本発明の生理活性物質が細胞周期のＧ０とＧ１の両ステージを増大させるように作用し、それによってＳ期が少なくなり、生細胞数の増殖が抑制されたことを実証するものである。
（実施例５）本発明の生理活性物質の構造と細胞増殖抑制効果の関係：
実施例１、２、および３の結果から、昆虫の生理活性物質がラット肝ガン細胞に対して増殖抑制効果を有すること明らかにすることができた。さらに、実施例４の結果から、そのメカニズムとして細胞周期を制御することで細胞増殖の抑制を発現することを示すことができた。そこで、この物質の５個のアミノ酸配列のどの部分が構造的に不可欠であるか検討することにした。培養法としては、実施例１と同様の方法で行ったが、対照区としては、ＰＢＳ（−）と、棘皮動物から昆虫および哺乳類までにわたって広範に存在する４個のアミノ酸から構成され、Ｃ末端がアミド化されているＦＭＲＦ−ＮＨ_２とをそれぞれ使用した。実験区としては、２．６×１０^５個の細胞に対して濃度が２００μｇ／ｍｌとなるように完全合成ペプチド（ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２）またはＮ末端のアスパラギン酸を欠いた不完全合成ペプチド（ＩＬＲＧ−ＮＨ_２）を細胞培地に添加したものを使用した。対照区と実験区のそれぞれについて、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で４８時間培養した。その後、トリパンブルーで処理し生細胞数を計測した。得られた結果を図６に示す。
【００４９】
図６に示したように、対照区のＰＢＳ（−）やＦＭＲＦ−ＮＨ_２では、生細胞数は１９．１〜１９．７×１０^５個のレベルであり、完全合成ペプチドの場合には７．７×１０^５個であり、細胞数で１桁異なる増殖抑制が確認された。しかし、Ｎ末端を欠いた不完全合成ペプチドの場合には８．４×１０^５個と完全合成ペプチドよりはやや増殖細胞数が多いが、十分な増殖抑制効果が認められた。従って、増殖抑制効果を発現するペプチドとしては、Ｃ末端がアミド化されていると共に、休眠制御物質のＮ末端のアスパラギン酸を欠いたＩＬＲＧでも効果的であることを明らかにすることができた。この結果は、４個から５個のアミノ酸配列をリード化合物としながら将来強力な細胞増殖抑制剤を開発するためにも重要な情報となり得る。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、有効成分としての生理活性物質であるペプチドは、５個のアミノ酸からなるペンタペプチド（分子量５７０．５９５）、又は４個のアミノ酸からなるペプチド（分子量４５６．５８）であるため、生体に投与しても抗原抗体反応が起こり難く、しかも抗ガン活性という特異的な機能を有している。このペプチドそのままでも種々の動物に直接投与できる。ヒトだけでなく、家畜等の高等動物においても、本ペプチドのように短い低分子のペプチドは抗原とはなり難いので、該ペプチドの生体外からの投与によって、抗ガン機能を発揮させることができるという利点を持っている。さらに本発明におけるペプチドは、抗原抗体反応を起こすことのない細胞増殖抑制効果のある新しい医薬剤となり得る。本発明における遺伝子Ａｎｙ−ＲＦを有する低分子量のペプチドは、副作用を伴なわずに効率的にガン細胞の増殖を阻害する機能を持ち、ヒトの子宮ガン、肝臓ガン、肺ガン、胃ガン、乳ガン等の細胞増殖を効率的に抑制し、ひいては生体細胞の細胞制御を効率的に行うことができる。従来の抗ガン剤が持つ正常細胞への悪影響（細胞死）問題を解消し、静止期にある多くの正常細胞へは影響なく、増殖細胞だけを抑制するという優れた働きを持つ。
【００５１】
蚕由来のセクロピンは分子量が約４ｋＤａ、モンシロチョウ由来のピエリシンは９８ｋＤａであるのに対し、本発明における生理活性物質は、０．５７１９５９ｋＤａという低分子量であることから、前記二つのものと比較して、抗原抗体反応が起こり難いのであり、抗ガン剤開発のリード化合物としても有望なものである。しかも、ガン細胞の生細胞を増加させない機能を保つ（図２、図３、および図４）とともに、生存するガン細胞に対して、ガン細胞の周期ステージを変化させ、一旦休止状態にさせる点に大きな特徴がある。この点において従来の如何なる抗ガン剤の作用機序とも異なっており、医薬品として実用化できる。すなわち、本発明の生理活性物質は、ＤＮＡ複製期に相当するＳ期間を減少させ、静止期のＧ０ならびに第１期に符合するＧ１期を延長させる機能を持つ。かくして、本発明の生理活性物質はガン細胞の増殖を効率的に阻害する。
【００５２】
これに対し、セクロピンにしろピエリシンにしろ、生細胞を減少せしめることによりガン細胞の増殖を抑制する機能を持ち、細胞死（アポトーシス）を引き起こすことによりガン細胞の増殖を阻害するに過ぎない。
【００５３】
一般に、細胞周期においてはＧ０期とＧ１期が最も長い時間を要するといわれている。その両ステージを増大するように作用する本発明における生理活性物質は、従来報告されている昆虫由来のガン細胞抑制効果物質とは根本的に異なっている。従来のものはアポトーシス（細胞死）に伴う核の凝縮や断片化を誘導し、その結果、生細胞数を減少せしめるものである。しかし、本発明の生理活性物質の機能は、細胞周期のＧ０とＧ１を増大しＳ期を減少させ、その結果、生細胞の細胞周期が長時間となり、最終的には増殖抑制をすることにある。従って、本発明の生理活性物質は、ガン細胞増殖において細胞死を誘導するのではなく、細胞周期を制御し細胞の増殖を抑制することで細胞数が増えないように作用している。
【００５４】
本発明の生理活性物質は、先願発明で述べたように、生理活性機能の一つとして、天蚕前幼虫の休眠を長く維持するように作用する。一般に生物の休眠とは、細胞の増殖が停止し低エネルギー状態を維持することが特徴と考えられている。従って、この物質の機能を多面的に応用する一例として、哺乳類のガン細胞増殖を制御する目的においても活用できる。さらに、多くの生物細胞の増殖を抑えると考えられるので、細胞レベル・個体レベルの長期保存剤としても利用できる。
【００５５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における生理活性物質の単離、精製プロセスを示すフローシート。
【図２】ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２またはＤＩＬＲＧ−ＣＯＯＨによるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の形態学的変化と増殖抑制を示す顕微鏡写真。
【図３】ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２またはＤＩＬＲＧ−ＣＯＯＨによるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の増殖抑制効果を、濃度と生細胞数との関係で示すグラフ。
【図４】ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２またはＰＢＳ（−）によるラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の増殖抑制効果を、培養時間と生細胞数との関係で示すグラフ。
【図５】（Ａ）ＰＢＳ（−）を添加した場合のラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の細胞周期変化を示すスペクトル（対照区）。
（Ｂ）ＲＦ−ＮＨ_２を添加した場合のラット肝ガン細胞（ｄＲＬｈ８４）の細胞周期変化を示すスペクトル（実験区）。
【図６】ＤＩＬＲＧ−ＮＨ_２によるラット肝がん細胞（ｄＲＬｈ８４）の増殖抑制効果を、他の物質による増殖抑制効果と比較して示すグラフ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present inventionIsCell growth inhibitor. This specificationDuring ~Then, a gene encoding a specific protein used in the present invention may be abbreviated as “gene Any-RF” as necessary.
[0002]
[Prior art]
There are as many as 1 million species of diverse insects on the earth that grow strongly and powerfully in every environment. Insects survive and adapt to almost the entire environment of the earth, from the tropics to temperate zones, coniferous forests, ice and snow, deserts, and even lakes. These phenomena are nothing but insects have acquired various functional characteristics to survive or survive in any environment. There is much we should learn from insects. Functional characteristics of insects include biological defense mechanisms, growth / development control mechanisms, extensive substance degradation, production functions, sharp sensory functions, behavioral regulation mechanisms, brain / neurological mechanisms, mediation functions, environmental adaptability, etc. It is. By analyzing the environmentally adaptive and energy-saving functions of these insects, in the future, valuable information will be obtained that will be useful for the construction of cutting-edge creative new technologies.
[0003]
Analyzing the functions of insects and developing a technology that uses insect-derived physiologically active substances with various functionalities is an extremely interesting research topic. Physiologically active substances isolated from insects and whose structure has been determined have important significance as the subject of applied research for technological development in the agricultural field and pharmaceutical field for high-quality and new products. .
[0004]
There are over 150 types of antibacterial peptides derived from insects and known as so-called biological defense substances, and many of them have been isolated and structurally determined. In this specification, since the target is a protein, which is a novel physiologically active substance derived from an insect having a cell-regulating function of a living cell, for example, a growth inhibition function of a cancer cell, that is, an antitumor function or an anticancer function, We will focus on cell growth inhibitory functional substances.
[0005]
Insect-derived anticancer substances include, for example, a peptide called cecropin. It has been isolated from Cecropia moth and its structure has been determined. After the structure has been determined, substances with similar structures have been isolated and identified from many insects. Such research analysis is based on the most recent research results. Cecropin has been reported to have antitumor effects on cultured cells of lymphoma and leukemia (Moore et al., 1994). It has been demonstrated that the cecropin gene is genetically modified into cultured cells derived from human bladder cancer, and the cells are injected into nude mice, thereby suppressing the growth of tumor cells (anti-cancer) (Winder et al.). al., 1998).
[0006]
In addition, a high molecular weight protein of 98 kDa isolated from a white butterfly cocoon has strong cytotoxicity against cancer cells such as human gastric cancer cells (TMK-1). It has a specific biological activity that suppresses the growth of cancer cells and ultimately induces apoptosis (cell death). This protein has been reported and has been named Pierisin (Koyayama et al, Jpn. J. Cancer Res., 87, 1259-1262, 1996; Kono et al., 1997; Watanabe et al., 1998).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The history of discovering new substances with antitumor activity derived from insects is short, and there is little knowledge about new substances.
[0008]
The isolated protein from cecropia cocoon (cecropin) and the isolated protein from moth white butterfly (piericin), which have been reported as an insect-derived tumor cell growth inhibitor or cancer cell growth inhibitor as described above, are about 4 kDa. Or high molecular weight of 98 kDa. These known physiologically active substances efficiently reduce cancer cells by inducing cell death in cancer cells, but they can reliably change the stage of the cancer cell cycle and put the cancer cells to a resting state. There is a problem that is impossible. In addition, even though it has been reported that cecropin can suppress the growth of human cancer cells, from a practical viewpoint, when applied to a living body, a high molecular weight protein causes an antigen-antibody reaction in the living body. Therefore, there is a problem that it is difficult to use cecropin or the like for a living body. Therefore, as a cancer cell growth inhibitory substance, it is an insect-derived physiologically active substance, has a cell control function of a living cell such as a cancer cell growth inhibitory function, and when administered to a living body, it causes an antigen-antibody reaction. The emergence of physiologically active substances that do not occur has been strongly desired.
[0009]
The present inventionIsPhysiologically active substances that have the ability to suppress cell growth and do not cause antigen-antibody reactions in vivoRuIt is an object of the present invention to provide a cell growth inhibitor.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In the previous application (Japanese Patent Application No. 11-152273; Japanese Patent No. 3023790) of the same applicant, the present inventors are lepidopterous insects such as a pre-larvae dormant type tengu, mussels, white butterflies, obikareha, kashiwamaimai, etc. And more than 40 species of insects, mainly straight-spotted insects (the pre-larvae dormant type of insects include Umeya Yoshiro, the egg overwintering phenomenon of insects seen from the overwintering eggs of the moths, the silk thread test site report, 12: 393-481 (1946) and Umetani Y., Studies on embryonic hibernation and diapause in insects, Proc. Jpn. Acad., 26, 1-9 (1950). Physiologically active substance with diapause control activity As a result of further research, it has been found that this physiologically active substance has an efficient regulatory activity of living cells, for example, an efficient growth-inhibiting activity of cancer cells. Has been completed. That is, the gene Any-RF in the invention of the prior application has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, Asp-Ile-Leu-Arg-Gly, the C-terminal is amidated, and the molecular weight is 570.959. The present inventors have found that this physiologically active substance has an activity of efficiently suppressing the growth of cancer cells, and thus has an activity of efficiently controlling living cells. Has been completed.
[0011]
Living cells of the present inventionThe mothA cell growth inhibitor is a peptide having the amino acid sequence Asp-Ile-Leu-Arg-Gly shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, an amidated C-terminus, and a molecular weight of 570.959. It is contained as an active ingredient. As described above, the physiologically active substance which is the active ingredient of the present invention is not a compound in which the amino acid sequence from the N-terminal to the fifth is Asp-Ile-Leu-Arg-Gly and the C-terminal is free oxidized. Are amidated. This active ingredient is, for example, a pulverized pre-larvae of a lepidopterous insect such as a antelope larva, etc., added to an acid methanol solution consisting of methanol: water: acetic acid, ground in a mortar, and then centrifuged. The obtained supernatant can be isolated and purified by introducing it into an HPLC system, or can be prepared according to a known method using a known peptide synthesizer.
This peptide also controls the cell cycle of living cells and suppresses the growth of cancer cells.
[0012]
In addition, the living cell of the present inventionThe mothThe cell growth inhibitor has the amino acid sequence Ile-Leu-Arg-Gly lacking N-terminal Asp from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, the C-terminal is amidated, and the molecular weight is The peptide which is 456.58 may be contained as an active ingredient.This peptide controls the cell cycle of living cells and suppresses the growth of cancer cells.
[0013]
The physiologically active substance in the present invention can effectively reduce, for example, live cancer cells, and can reliably change the stage of the cancer cell cycle and shift the cancer cells to a resting state. It is. A physiologically active substance having such a function is used as an effective cancer cell growth inhibitor, and thus may be practically used as an anticancer agent. It solves the problem of adverse effects on normal cells (cell death) of conventional anticancer drugs, has no effect on many normal cells in the stationary phase, and has an excellent function of suppressing only proliferating cells. In addition, this physiologically active substance is capable of reversibly controlling cell growth as a cell regulator of living cells. For example, this physiologically active substance can efficiently suppress the growth of cancer cells and has a low amino acid content of 5 amino acids. It is a pentapeptide with a molecular weight and is a novel substance in the biological world. Furthermore, this physiologically active substance has no structural similarity to the above-mentioned cecropin or piericin, and also has a mechanism for inhibiting cancer cells while at the same time efficiently inhibiting proliferation of mouse hepatoma cells, etc. A characteristic suppression mechanism not present in the prior art is shown. That is, it has the characteristic of modifying the cell cycle and can reversibly control cell growth. It is also a physiologically active substance useful for elucidating the mechanism of the cell cycle.
[0014]
In general, when a protein is actually applied to a living body, if its molecular weight is large, an antigen-antibody reaction occurs in the living body, which is a great obstacle. The cecropin derived from cocoon has a molecular weight of about 4 kDa, and Piericin derived from white butterfly is 98 kDa. Therefore, when administered to a living body, an antigen-antibody reaction is likely to occur. On the other hand, the physiologically active substance derived from the tengu in the present invention is a pentapeptide having a low molecular weight of 0.571959 kDa, and therefore has a characteristic that an antigen-antibody reaction hardly occurs even when administered to a living body. Therefore, this peptide having a specific function of anticancer activity can be directly administered to various animals as it is. Even in higher animals, a short low molecular weight peptide such as the present peptide is unlikely to be an antigen, and thus has the feature that an anticancer function can be exerted by administration of the peptide from outside the body.
[0015]
Furthermore, the peptide in the present invention does not cause an antigen-antibody reaction, has a cell growth inhibitory effect, and is also promising as a lead compound for the development of new drugs or anticancer agents. Moreover, while maintaining the function that does not increase the number of living cancer cells (FIGS. 2, 3, and 4), the cancer cell cycle stage is changed with respect to the surviving cancer cells, and cell proliferation is temporarily increased. It has a great feature of making it rest. This is different from the mechanism of action of any conventional anticancer drug. That is, the physiologically active substance of the present invention has a function of decreasing the S period corresponding to the DNA replication period and extending G0 in the stationary period and G1 corresponding to the first period. Thus, the physiologically active substance of the present invention efficiently inhibits the growth of cancer cells. On the other hand, whether it is cecropin or piericin, it has the function of suppressing the growth of cancer cells by reducing the number of living cells, and it only inhibits the growth of cancer cells by causing cell death (apoptosis). .
[0016]
In general, in the cell cycle, it is said that the G0 phase and the G1 phase require the longest time. The physiologically active substance in the present invention that acts to increase both stages is fundamentally different from the conventionally reported insect cell-derived cancer cell inhibitory substances. Conventional ones induce nuclear condensation and fragmentation associated with apoptosis (cell death), resulting in a decrease in the number of living cells. However, the function of the physiologically active substance of the present invention is to increase G0 and G1 of the cell cycle and decrease the S phase. As a result, the cell cycle of living cells becomes long and eventually suppresses proliferation. is there. Therefore, the physiologically active substance of the present invention does not induce cell death in cancer cell proliferation, but acts to control the cell cycle and suppress cell proliferation so that the number of cells does not increase.
[0017]
As described in the earlier application, the physiologically active substance in the present invention acts as one of the physiologically active functions so as to maintain the dormancy of pre-spider larvae for a long time. In general, dormancy of organisms is considered to be characterized by the fact that cell growth stops and a low energy state is maintained. Therefore, it can be utilized for the purpose of controlling the growth of cancer cells in mammals as an example of multifaceted application of the function of this substance. Furthermore, it is expected to suppress the growth of many biological cells, and can be used to develop long-term preservatives at the cell level and individual level.
[0018]
The low molecular weight peptide having the gene Any-RF in the present invention has a function of efficiently inhibiting the growth of cancer cells without causing side effects, and suppresses the growth of mouse hepatoma cells. There is an extremely high probability that cell proliferation of uterine cancer, liver cancer, lung cancer, stomach cancer, breast cancer, etc. is efficiently suppressed, and thus cell control of living cells is efficiently performed.
[0019]
As described above, the present invention revealed for the first time a physiologically active substance that is a cell regulatory factor of living cells, which is a substance that has never been known in insect endocrinology.
[0020]
Moreover, 5'-GAY-ATH-YTN-MGN-GGN-3 'is considered as a base sequence for the amino acid sequence Asp-Ile-Leu-Arg-Gly.
[0021]
In the present inventionCancer cell growth regulator (cancer cell growth inhibitor)In order to achieve this, as in the case of normal drugs, various known additives, excipients, and the like may be blended by a normal method to obtain a predetermined drug. The effective amount of the cell regulator of the present invention is generally 50 to 350 mg / kg, preferably 100 to 200 mg / kg, and any administration method can be used as long as it can be administered in vivo. For example, oral administration, intravenous injection, intraperitoneal administration, or the like may be used.
[0022]
The peptides, which are the physiologically active substances used in the present invention, had almost no side effects in vivo and no acute toxicity was observed compared to conventional cecropin and piericin. That is, 0.5 g / kg body weight of the peptide of the present invention was administered to rats and mice by the oral and transdermal methods, respectively, and toxicity tests were carried out by the prescribed method. No acute toxicity such as convulsions or vomiting was observed. Furthermore, the testis of the reproductive organs of each animal after the toxicity test was removed and the tissue was observed under a microscope, but no abnormality was observed. In addition, since the peptide of the present invention is a low molecular weight pentapeptide, an antigen-antibody reaction hardly occurs from the viewpoint of safety.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present inventors have clarified in the above-mentioned prior invention that the physiologically active substance used in the present invention has a function of maintaining insect dormancy. Prior to describing the contents of the present invention in detail, the outline of the invention of the prior application will first be repeatedly described in order to facilitate the flow of the story.
[0024]
First, the tengu from which the physiologically active substance is isolated will be described. Tengu (official Japanese name: Yamamayu, scientific name:Antherea yamamai  Guerin-Meneville) is based in Japan, has a long history with records of breeding since the Edo period, has recently been developed as an artificial feed, and is easy to breed larvae. Therefore, it has a lot of information on breeding and is easy to obtain. The silkworm larvae exclusively eat mulberry leaves, while the tengu eats leaves such as kunugi, konara, oak and abemaki. Whereas sericulture farmers raise larvae of rabbits, wild tengu larvae grow naturally. The ratio of hatching of tengu species is low, and the ratio (yarn walk) from silk to silk is very small. Moreover, since the operation | work which takes a string is difficult, it has the significance as a rare value. It is said that the price of 1 kg of tengu silk is 200,000 yen or 300,000 yen, and this is why it is so rare that it is called silk diamond. Silk fabric with an increased proportion of silkworm silk, which is a barbarian, is preferred because it can suppress the slippage of the yarn and improve the slip resistance of the seam. Therefore, it is highly expected that the field using the tengu, a large silk insect, will be developed in the future. Therefore, the importance of isolation and structure determination of physiologically active substances having various functions derived from Tendon is increasing.
[0025]
In the prior application invention, first, the number of dormant larvae, dormant arousal larvae, dead larvae and the dormant arousal rate of the pre-larvae of Tengu were examined. Injecting distilled water into dormant larvae of tengu-necked larvae, almost all of the larvae of tengu were in a state of dormancy. However, the peptide Asp-Ilu-Leu-Arg-Gly-NH2 in an amount of 100 pmol / 0.05 μl is compared with the case of a single injection in the pre-larvae larvae and the dormancy arousal rate is 53. It could be reduced from 3% to 30% and further reduced to 13.3% when injected three more times. Based on this, it was concluded that the physiologically active substance in the invention of the prior application is a factor for maintaining insect dormancy. In this way, a gene encoding a protein having a dormancy-controlling activity derived from Tendon and its function were clarified.
[0026]
Although the above-mentioned physiologically active substance derived from the tengu has no effect other than the function of maintaining dormancy, according to the present invention, it is revealed for the first time that the substance has a biological cell control function such as a cancer cell growth inhibitory function. It became. In addition to being useful as a cytoregulator of living cells, this substance is considered to be important as a lead compound for the development of new pharmaceuticals including cancer therapeutic agents in the future.
[0027]
As described above, the amino acid sequence structure of a peptide having a function of suppressing the growth of cancer cells is Asp-Ile-Leu-Arg-Gly-NH.₂It is. This pentapeptide is not known by computer search (BLAST and FASTA), and is a peptide having a novel anticancer function in the biological world. This was named Antherea yamamai-Repressive Factor (abbreviation Any-RF). This peptide in which the C-terminus of 5 amino acids is amidated has not been found in the biological world as a free existence mode until the present invention is completed. Among them, the same sequence --Asp-Ile-Leu-Agr-Gly --- can be seen. For example, according to computer search, the yeast hypothesis 22.1 KD protein (193 amino acids) sequence from 166 to 170, human leukemia inhibitory factor precursor (202 amino acids) from 142 to 146 The sequence is the same. However, the function of the amino acid sequence of this part has not been clarified at all. That is, even though the amino acid sequence is the same, no peptide having a physiological function in a free existence mode by interposing between the N-terminus and the C-terminus and amidating the C-terminus as in the present peptide has not been found.
[0028]
In the case of cancer cell growth, the cycle stage depends on the basic cell cycle, as in normal cell growth, but cell growth continues due to abnormalities in the checkpoint control system (here A checkpoint control system means a system that prevents mistakes in the cell cycle and prevents catastrophic genetic damage from occurring in the cell, and these functions can be used to control the cell cycle). On the other hand, cell division does not occur in the G0 phase (stationary phase) in cells that have completed growth and differentiation. In general, a growing cell develops the following cell cycle stages. That is, it proceeds from the G0 phase (stationary phase) to the G1 phase (DNA replication decision phase), then through the S phase (DNA replication phase), and then from the G2 phase (mitotic preparation phase) to the M phase (cell division phase). (In this specification, it is abbreviated as G2 / M phase). Thereafter, the process proceeds to the G0 period again, or may proceed directly to the G1 period (DNA replication determining period) (abbreviated as G0 / G1 period in the present specification) without going through the G0 period.
[0029]
The physiologically active substance of the present invention has a great feature in that it keeps the function of not increasing the number of cancer cells and greatly changes the cycle stage of the surviving cancer cells, reduces the S phase corresponding to the DNA replication phase, and It has the function of extending the G1 phase, which coincides with the G0 phase and the DNA replication decision phase. Thus, the physiologically active substance of the present invention effectively inhibits the proliferation of cancer cells. The fact that the bioactive substance derived from the tengu in the present invention effectively inhibits the proliferation of cancer cells is also apparent from the specific effects on specific cancer cell cycle stages as described above.
[0030]
The physiologically active substance that suppresses the growth of cancer cells according to the present invention can be isolated and determined from a dormant pre-larvae larva according to the method shown in FIG. The outline of isolation and purification is as follows.
[0031]
The pre-larvae were extracted from the dormant eggs of Tendon within 1 month after egg laying, immediately frozen in liquid nitrogen, and then stored at −80 ° C. until use. To about 1,500 heads (about 6 g) of pre-larvae, 10 times volume of acid methanol solution (for example, methanol: water: acetic acid = 90: 9: 1 (volume%)) is added and ground in a mortar. The supernatant was obtained by centrifugation at 1,000 g for 30 minutes. This operation was repeated three times, and the combined supernatant was concentrated with a centrifugal evaporator. The concentrate was heat treated at 100 ° C. for 10 minutes and centrifuged at 10,000 g for 15 minutes. To the supernatant thus obtained, cold acetone was added so that the final concentration of the supernatant was 80%, and centrifugation was performed at 10,000 g for 15 minutes to obtain a precipitate. Dissolve this precipitate in water, and elution twice through a filter (Millipore Millipore filter (SLLH RO4 NL, 0.5 μm) by high-performance liquid chromatography using a reverse phase column. Finally, a mixed separation mode column The purified product was isolated by high-performance liquid chromatography, and TSKgel ODS-80Ts (manufactured by Tosoh Corporation) was used as the column in the first reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) in this isolation method. In the second RP-HPLC system, the same column was used, and in the third HPLC system using a column having a reverse phase and an ion exchange mode, an RSpak NN-614 column (manufactured by Showa Denko KK) was used. In any system, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution While adding acetonitrile to (volume%), the concentration (%) gradient of acetonitrile was changed, and the active fraction was eluted using the concentration gradient, the absorbance was measured at 220 nm, and the flow rate was 1 ml / min or 0. 5 ml / min.
[0032]
The reason for using acetic acid in the acid methanol solution is as follows. This extraction method is also used when extracting peptide hormones of other insects, and by adding acetic acid, it is possible to suppress 90% or more of protease activity and suppress peptide degradation. The acid methanol solution is optimally methanol: water: acetic acid = 90: 9: 1 (volume%), but is not particularly limited to this range.
[0033]
The best way to remove the pre-larvae is to use dormant eggs within one month after egg laying as described above, for the following reasons. It is considered that the depth of dormancy is strong within 20 days after the start of dormancy from about 10 days after egg laying, but in general, the dormancy of insects becomes shallower as time passes. In the present invention, the amount of the physiologically active substance, which is a hormone-like substance finally obtained from 1,500 larvae of the tengu, is a very small amount of only 21.4 μg. However, Tengu has a high price of 5 to 20 yen per egg because no complete artificial feed has been developed compared to silkworms and egg laying techniques are difficult. Therefore, it is not efficient and economical to prepare the physiologically active substance in the present invention using a tengu.
[0034]
The structure of the isolated and purified product was determined as follows. That is, the N-terminal amino acid sequence of the isolated and purified product was analyzed by a peptide sequencer G1000A (manufactured by Hewlett Packard). As a result, the amino acid sequence was confirmed to be Asp-Ile-Leu-Agr-Gly. The substance is then amidated (—NH₂) Or free oxidation (—COOH), this isolated and purified product was analyzed by a mass spectrometer. A peptide having the above amino acid sequence, the C-terminal being amidated and the free-oxidized peptide was produced according to the following peptide synthesis method and used as a control. Using MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight mass spectrometer) (manufactured by Voyager PerSeptive Biosystems), each of the isolated purified substance and the synthetic peptide was analyzed by 0.5 μl. And saturate α-cyano-4-hydroxycinnamic acid in an equal amount of matrix (mixture of 0.1% TFA aqueous solution and acetonitrile in a ratio of 50:50 (volume%)). Mixed). After drying, the molecular weight was determined as a cationization matrix. In the isolated and purified product, two large peaks were observed at 571.858 and 572.8446, and it was considered that both types of amino acid sequences existed in vivo. Thus, those in which the C-terminal is amidated have cell regulatory activity. In addition, synthetic Asp-Ile-Leu-Agr-Gly-NH₂Showed a maximum peak at 571.959 and synthetic Asp-Ile-Leu-Agr-Gly-COOH showed a maximum peak at 573.045. Thus, the physiologically active substance of the present invention is a pentapeptide having a molecular weight of 571.959.
[0035]
The above pentapeptide may be found not only in the pre-larvae state dormancy of tengu but also in the larval stage and the dormancy period of other insects. This is because insect hormones have different functions even with the same structural substance if the insect species are different and the stages are different. In other words, insect dormancy is not only pre-larvae dormancy as in the case of tengu, but also embryo seed dormancy such as silkworms, larva dormancy species such as clover, and dormant dormancy species such as saxophones and white butterflies It is classified as an adult dormant species such as Namitentu and potato beetle. It can be naturally expected that the physiologically active substance in the present invention can be isolated from any dormant form. Thus, the same pentapeptide and its related substances can be identified from many insect species as cell regulators such as cancer cell growth inhibitors. The pentapeptide can be extracted from the whole individuals of such many insect species by the same method as the above-mentioned antelope larvae according to the method shown in FIG. When extracting directly from the body fluid, the body fluid is drained by incising a part of the living tissue such as the leg of the larva body, and the water portion of methanol: water: acetic acid = 90: 1: 1 in FIG. The 90% acid methanol solution prepared by substituting for is mixed in ice-cooling, and then extracted according to FIG.
[0036]
In general, the important factors in the extraction of hormone-like substances are the choice of raw materials for high recovery and the choice of column resins for efficient separation. If you can synthesize it, you can't go beyond that. However, as described above, since the amino acid sequence of the physiologically active substance in the present invention is known, the physiologically active substance having this sequence can be economically and efficiently produced by a conventional method using an existing amino acid synthesizer. Can be synthesized.
[0037]
The peptide in the present invention is a kind of oligopeptide consisting of 5 amino acids and is a low molecular weight peptide, and therefore has the characteristic that it is difficult to be an antigen in species other than insects. A purified peptide or a synthesized peptide can exert an effective effect. This is because the antigen-antibody reaction by vertebrate immunoglobulin does not become an antigen if it is a low molecular weight oligopeptide that enters from outside the body. Furthermore, there is also a feature that it is possible to easily conduct a test study on a possible function by administration of a synthetic peptide from outside the body.
[0038]
The physiologically active substance according to the present invention can be isolated and purified from the larvae of the tengu, but in the stage other than the larvae in the tengu or in the insects other than the tengu, for example, insects and other stages (tengu In other cases, it is possible that the physiologically active substance can be isolated from other savages such as saxan and cussan.
[0039]
The physiologically active substance that maintains the anticancer function in the present invention suppresses the growth of rat hepatoma cells, and thus exerts a growth-suppressing effect on all cancer cells such as human liver cancer, stomach cancer, lung cancer, and breast cancer. There is a high possibility of doing.
[0040]
【Example】
Next, although an example and a comparative example explain the present invention in detail, the present invention is not limited to these examples. In the following examples, various tests were performed using a synthetic peptide having the same sequence structure as the isolated peptide.
(1) Peptide synthesis
The cancer cell growth-inhibiting substance in the present invention is a novel substance derived from a tengu larva and is structurally composed of only 5 amino acids. Therefore, it can be produced in large quantities by peptide synthesis methods. Peptide Asp-Ile-Leu-Arg-Gly-NH by a usual method using a peptide synthesizer (PSSM-8, manufactured by Shimadzu Corporation)₂(DILRG-NH₂Or RF-NH₂And Asp-Ile-Leu-Arg-Gly-COOH (referred to as DILRG-COOH or RF-COOH). Purification was performed by connecting a reverse phase column ULTRON VX-ODS (20 mm × 250 mm, manufactured by Shinwa Kako Co., Ltd.) to an HPLC system (LC-10A, Shimadzu Corporation). Elution was performed with a gradient of acetonitrile (1-5% for 0-5 minutes, 5-60% for 5-35 minutes) in the presence of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) at a flow rate of 8 ml / min. The active fraction was eluted and the absorbance was measured at 220 nm. The purified peptide was mixed with an equal amount of matrix (saturated with 50% acetonitrile / 0.1% TFAα-CHCA) on a sample plate, dried, and then MALDI-TOF MS (manufactured by Voyager PerSeptive Biosystems). The purity was confirmed.
[0041]
According to the above method, DILRG-NH₂(Purity: 95% or more, assayed by HPLC and TOF-MS) and DILRG-COOH (Purity: 95% or more, assayed by HPLC and TOF-MS) were synthesized and used in the following examples.
(2) Cell and medium composition
Rat hepatoma cells (dRLh84) were used, and Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% newborn calf serum containing 4 mM glutamine, 50 U / ml penicillin and 100 μg / ml kanamachine was used for the culture of these cells. did. For the cells, 5% CO at 37 ° C₂The cells were cultured in a humid environment containing
(3) Cancer cell growth inhibition assay
The old medium of cells growing in a 100 mm dish (generally a petri dish) was removed, and the cells were washed once with PBS (-) (Ca ions and Mg ions were removed from a physiological phosphate buffer). After adding 1.5 ml of 10% trypsin solution and gently spreading over the whole dish so as to be uniform, it was kept at 37 ° C. for 5 minutes except for 1 ml, and it was confirmed that the cells were detached from the bottom with a microscope. . Next, 9.5 ml of fresh DEME medium was added, and the cells were separated and suspended by pipetting. This suspension was planted in a 100 mm dish (total volume 10 ml) at a 1/20 dilution ratio, placed in an incubator, and cultured for 24 hours. Each peptide was added to each dish to a predetermined concentration and cultured at 37 ° C. After 24 and 48 hours, the number of cells was measured using a hemocytometer, and the cell growth inhibitory function was achieved. investigated.
(4) Morphological observation
After the cells treated with each peptide were collected by centrifugation, 100 μl of ½ PBS (−) was added thereto and suspended. Next, two drops of Carnoy's fixative were added and suspended, and 1 ml of Carnoy's fixative was added and layered. The layered solution was gently stirred, allowed to stand at room temperature for 5 minutes and then centrifuged (4,000 rpm, 5 minutes). The supernatant was removed, and a small amount of Carnoy's fixative was added and suspended. One drop of this suspension was dropped on a slide glass and air-dried. Furthermore, 1 drop of fixative solution was dropped on the cells and air-dried again. This was overlaid with Giemsa staining solution, dyed at room temperature for 30 minutes, washed with water, air-dried and sealed. Nucleus changes were observed under a microscope.
(5) Flow cytometry (FACS) analysis
Cells treated with each peptide were fixed with 70% ethanol at 4 ° C. for 4 hours. The fixed cells were washed with PBS (−) and then treated with 2 mg / ml RNase A at 37 ° C. for 30 minutes to degrade RNA. Then, it dye | stained for 30 minutes or more with propidium iodide (25 microgram / ml), and filtered using the nylon mesh. The fluorescence intensity (DNA content per cell) of 10,000 cells was analyzed with a flow cytometer (Becton Dickinson, FACSVANTAGE).
Example 1 Inhibitory Effect of Pentapeptide on Growth of Rat Hepatoma Cells (dRLh84): The inhibitory effect of pentapeptide on the proliferation of cancer cells was examined as follows. As the cancer cells, rat hepatoma cells (dRLh84), which are relatively easily available and easy to culture, were used. The physiologically active substance of the present invention (RF-NH₂) And cancer cell proliferation in order to clarify the relationship between the cell culture medium with PBS (−) added as a control group and the experimental medium as a type of RF− in which the C-terminal is amidated. NH₂Culturing was carried out using 200 μg / ml of RF-COOH with free oxidation at the C-terminus. Number of cultured cells 3-5 × 10⁵And 5% CO with or without the addition of a predetermined amount of each peptide.₂In the presence of The morphological observation of cancer cells was directly performed under an inverted microscope with respect to the culture solution 24 hours and 48 hours after the culture. This micrograph is shown in FIG.
[0042]
As shown in FIG. 2, RF-NH₂In the experimental plots with the addition of sucrose, there was almost no increase compared to the number of cells at the start of culture (0 hour) at 24 hours and 48 hours, and after 48 hours, the cell shape changed from a spindle shape to a round shape. It was changing. Such a change in cell shape means that the cell division activity has changed from a cell division activity state to a cell division activity stop state. On the other hand, in the control group and the experimental group to which RF-COOH was added, both the number of cells at the start of the culture increased extremely remarkably after 24 hours and 48 hours. The result of FIG. 2 means that the proliferation of rat cancer cells is morphologically suppressed by adding the physiologically active substance in the present invention to the cultured cells.
(Example 2) Growth inhibition effect of rat hepatoma cells (dRLh84) by pentapeptide concentration:
3 × 10⁵Peptide (DILRG-NH) to a predetermined concentration (0, 50, 100, 200 μg / ml) for each dRLh84 cell₂Or DILRG-COOH) to the cell medium and 5% CO₂In the presence, the cells were cultured at 37 ° C. for 40 hours. Thereafter, the cells were treated with trypan blue and the number of viable cells was counted. The obtained results are shown in FIG.
[0043]
As shown in FIG. 3, in the case of RF-COOH in the experimental group, the number of viable cells was 14.6 × 10 even at a high concentration of 200 μg / ml.⁵There is almost no change in proliferative activity at the individual level. However, RF-NH₂In the added group, the number of viable cells was significantly reduced from the concentration of 50 μg / ml, and at a high concentration of 200 μg / ml, the number of viable cells was about 7.7 × 10, which was about half that of the control group.⁵Decreased to the level. From FIG. 3, RF-NH observed morphologically in Example 1₂It can be seen that the suppression of cancer cell proliferation caused by the decrease corresponds to the decrease in the number of living cells. In addition, the peptide in which the C-terminus is amidated with a physiologically active substance in the present invention has a remarkable cancer cell growth inhibitory effect, but the inhibitory effect is completely expressed in the type of peptide in which the C-terminus is free-oxidized. You can see that there wasn't.
(Example 3) Relationship between rat hepatoma cell (dRLh84) proliferation ability and culture time:
From the results of Examples 1 and 2, it was revealed that insect bioactive substances inhibit the growth of rat hepatoma cells. Further, the proliferation ability and culture time of cancer cells using the bioactive substances of the present invention In order to examine the relationship between the culture time and the culture time, the culture time was extended. The culture method was the same as in Example 2. The culture time was extended to 72 hours, PBS (-) was used as the control group, and 3 x 10 as the experimental group.⁵Peptide (DILRG-NH) to a concentration of 200 μg / ml per cell.₂) To the cell culture medium and add 5% CO₂In the presence, the cells were cultured at 37 ° C. for 24, 48, and 72 hours, respectively. Thereafter, the cells were treated with trypan blue and the number of viable cells was counted. The obtained results are shown in FIG.
[0044]
As shown in FIG. 4, the number of cells in the control group grew rapidly as the culture time increased to 72 hours after culturing, and the number of viable cells was 3 × 10.⁵From 60 × 10⁵It increased to 20 times or more. On the other hand, in the experimental group, the number of cells was 3 × 10 in 72 hours.⁵8x10 from⁵Only an increase of 2.7 times. This result means that the physiologically active substance of the present invention suppresses the cancer cell proliferation ability to 1 / 7.5 level. That is, it is clear that the physiologically active substance of the present invention exhibits an effect of suppressing cancer cell proliferation ability at a considerable level.
[0045]
Subsequently, only the cultured cells were transferred from the culture solution 48 hours after the culture of the peptide-added medium to a fresh medium and cultured under the same culture conditions as described above, and then the change in the amount of cancer cell growth was examined. As a result, the cancer cells whose growth was once suppressed started to grow rapidly in the same manner as in the case of adding PBS (−) in the control group. Therefore, this suggests that the presence of the peptide of the present invention is always indispensable for suppressing cancer cells, and that this cell can reversibly control cell growth of any organism.
(Example 4) Analysis of cell cycle change by addition of peptide:
Examples 1, 2, and 3 (FIGS. 2, 3, and 4) demonstrated that the physiologically active substance of the present invention suppresses the proliferation ability of rat cancer cells. Next, we decided to investigate the suppression mechanism. Peptide (DILRG-NH so that the concentration is 200 μg / ml₂) Was added to the medium under the same conditions as in Example 1, cultured, and the cells cultured for 48 hours were fixed with ethanol and stained with propidium iodide. Moreover, the same treatment was performed for the control group to which PBS (-) was added. The DNA content of the cells was analyzed using a flow cytometer. The obtained results are shown in FIG. For this purpose, flow cytometry analysis is used. This method is a method of measuring DNA content by staining with DNA binding fluorescent dye, prodium iodide, and is used for cell cycle control. Analysis is possible. In other words, biological cells proliferate while undergoing periodic changes to G0 / G1, S (DNA replication phase), and M phase (cell division phase) while dividing, but FIG. 5 shows the amount of DNA in individual cancer cells. It was measured and analyzed using a cytometer. As shown in FIG. 5, PBS (−) added control (FIG. 5 (A)) and RF-NH₂According to the cell cycle change in the experimental group of addition (FIG. 5B), it was speculated that the influence pattern on the rat hepatoma cell cycle differs depending on whether or not the peptide was added.
[0046]
Next, the pattern seen in FIG. 5 was measured in detail. In the G0 / G1 phase, the amount of DNA is 2n, whereas in the M phase, it is doubled to 4n. In the analysis of FIG. 5, the DNA amount of 2n corresponds to 360, and the DNA amount of 4n corresponds to a peak corresponding to 700 or a broad peak. Assuming that the analysis pattern of cell cycle changes shown in FIG. 5 is composed of linear combinations of peaks characteristic in the G0 / G1, S, and M phases, the ratio of cells in each stage is obtained by dividing into each component. The results obtained are listed in Table 1.
[0047]
[Table 1]

[0048]
As shown in Table 1, the cell ratio of the cell cycle stage G2 (preparation for mitosis) and M phase (cell division phase) (in the table, coincides with G2 / M phase) is 11. 92%, experimental area is 12.10%, both of which are almost the same, but the cell ratio of G0 phase (stationary phase) and G1 phase (DNA replication decision phase) (in the table, coincides with G0 / G1 phase) The control group was 50.53%, while the experimental group was 66.07%, more than 30% more than the control group. On the contrary, in the S phase (DNA replication phase), the experimental group was 21.84% compared to 37.55% in the control group, which was 40% or less less than the control group. Therefore, this result demonstrates that the physiologically active substance of the present invention acts to increase both the G0 and G1 stages of the cell cycle, thereby reducing the S phase and suppressing the proliferation of the number of living cells. To do.
(Example 5) Relationship between structure of physiologically active substance of the present invention and cell growth inhibitory effect:
From the results of Examples 1, 2, and 3, it was clarified that the insect physiologically active substance has a growth inhibitory effect on rat hepatoma cells. Furthermore, from the result of Example 4, it was able to show that suppression of cell proliferation was expressed by controlling the cell cycle as the mechanism. Therefore, it was decided to examine which part of the five amino acid sequences of this substance is structurally essential. The culture method was the same as in Example 1. However, the control group was composed of PBS (-) and four amino acids widely present from echinoderms to insects and mammals, and the C-terminal. FMRF-NH in which is amidated₂And were used respectively. As an experimental section, 2.6 × 10⁵Fully synthetic peptide (DILRG-NH) to a concentration of 200 μg / ml per cell.₂) Or incomplete synthetic peptide lacking N-terminal aspartic acid (ILRG-NH₂) Was added to the cell culture medium. 5% CO for each of the control and experimental zones₂In the presence, the cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours. Thereafter, the cells were treated with trypan blue and the number of viable cells was counted. The obtained result is shown in FIG.
[0049]
As shown in FIG. 6, the control PBS (-) and FMRF-NH₂Then, the number of living cells is 19.1-19.7 × 10.⁵In the case of fully synthetic peptides, 7.7 × 10⁵It was confirmed that the number of cells was one order of magnitude, and growth inhibition was different by one digit. However, in the case of incomplete synthetic peptides lacking the N-terminus, 8.4 × 10⁵Although the number of proliferating cells was slightly larger than that of individual and fully synthetic peptides, a sufficient growth inhibitory effect was observed. Therefore, it was clarified that ILRG lacking aspartic acid at the N-terminus of the dormancy control substance is effective as a peptide expressing a growth inhibitory effect as well as amidated at the C-terminus. This result can be important information for developing a powerful cell growth inhibitor in the future using 4 to 5 amino acid sequences as lead compounds.
[0050]
【The invention's effect】
According to the present invention, a peptide that is a physiologically active substance as an active ingredient is a pentapeptide consisting of 5 amino acids (molecular weight 570.595) or a peptide consisting of 4 amino acids (molecular weight 456.58). The antigen-antibody reaction hardly occurs even when administered to a living body and has a specific function of anticancer activity. This peptide can be directly administered to various animals. Not only in humans but also in higher animals such as livestock, a short low molecular weight peptide like this peptide is unlikely to become an antigen, so that anticancer function can be exerted by in vitro administration of the peptide. Has the advantage of. Furthermore, the peptide in the present invention can be a new pharmaceutical agent having a cell growth inhibitory effect without causing an antigen-antibody reaction. The low molecular weight peptide having the gene Any-RF in the present invention has a function of efficiently inhibiting the proliferation of cancer cells without causing side effects, and is a human uterine cancer, liver cancer, lung cancer, stomach cancer, breast cancer. Cell growth such as the above can be efficiently suppressed, and thus cell control of living cells can be performed efficiently. It solves the problem of adverse effects on normal cells (cell death) of conventional anticancer agents, and has an excellent function of suppressing only proliferating cells without affecting many normal cells in the stationary phase.
[0051]
The cecropin derived from cocoon has a molecular weight of about 4 kDa, and Piericin derived from white butterfly has 98 kDa, whereas the physiologically active substance in the present invention has a low molecular weight of 0.571959 kDa. Antigen-antibody reaction is unlikely to occur, and it is promising as a lead compound for developing anticancer agents. In addition, while maintaining the function of not increasing the number of living cancer cells (FIGS. 2, 3, and 4), the cancer cell cycle stage is changed with respect to the surviving cancer cells, and the cells are once brought to a resting state. There is a big feature. In this respect, it is different from the action mechanism of any conventional anticancer agent, and can be put into practical use as a pharmaceutical product. That is, the physiologically active substance of the present invention has a function of decreasing the S period corresponding to the DNA replication period and extending G0 in the stationary period and G1 corresponding to the first period. Thus, the physiologically active substance of the present invention efficiently inhibits the growth of cancer cells.
[0052]
On the other hand, whether it is cecropin or piericin, it has the function of suppressing the growth of cancer cells by reducing the number of living cells, and only inhibits the growth of cancer cells by causing cell death (apoptosis).
[0053]
In general, in the cell cycle, it is said that the G0 phase and the G1 phase require the longest time. The physiologically active substance in the present invention that acts to increase both stages is fundamentally different from the conventionally reported insect cell-derived cancer cell inhibitory substances. Conventional ones induce nuclear condensation and fragmentation associated with apoptosis (cell death), resulting in a decrease in the number of living cells. However, the function of the physiologically active substance of the present invention is to increase G0 and G1 of the cell cycle and decrease the S phase. As a result, the cell cycle of living cells becomes long and eventually suppresses proliferation. is there. Therefore, the physiologically active substance of the present invention does not induce cell death in cancer cell proliferation, but acts to control the cell cycle and suppress cell proliferation so that the number of cells does not increase.
[0054]
As described in the prior invention, the physiologically active substance of the present invention acts as one of the physiologically active functions so as to maintain the dormancy of pre-spider larvae for a long time. In general, dormancy of organisms is considered to be characterized by the fact that cell growth stops and a low energy state is maintained. Therefore, it can be utilized for the purpose of controlling the growth of cancer cells in mammals as an example of multifaceted application of the function of this substance. Furthermore, since it is considered to suppress the growth of many biological cells, it can be used as a long-term preservative at the cell level or individual level.
[0055]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a flow sheet showing a process for isolating and purifying a physiologically active substance in the present invention.
FIG. 2 DILRG-NH₂Or the microscope picture which shows the morphological change and proliferation suppression of a rat hepatoma cell (dRLh84) by DILRG-COOH.
FIG. 3 DILRG-NH₂Or the graph which shows the growth inhibitory effect of the rat hepatoma cell (dRLh84) by DILRG-COOH by the relationship between a density | concentration and the number of living cells.
FIG. 4 DILRG-NH₂Or the graph which shows the growth inhibitory effect of the rat hepatoma cell (dRLh84) by PBS (-) by the relationship between culture | cultivation time and the number of living cells.
FIG. 5A is a spectrum (control group) showing the cell cycle change of rat hepatoma cells (dRLh84) when PBS (−) is added.
(B) RF-NH₂Showing the cell cycle change of rat hepatoma cells (dRLh84) in the case of adding (Experimental group).
FIG. 6 DILRG-NH₂The graph which shows the growth inhibitory effect of the rat hepatoma cell (dRLh84) by Hs compared with the growth inhibitory effect by another substance.

Claims (5)

配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、Asp-Ile-Leu-Arg-Glyを有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が５７０．９５９であるペプチドを有効成分として含有することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, has an Asp-Ile-Leu-Arg- Gly, C -terminal has been amidated, characterized in that the molecular weight as an active ingredient the peptide is 570.959 A cancer cell proliferation inhibitor . 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、 Asp-Ile-Leu-Arg-Gly を有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が５７０．９５９であるペプチドを有効成分として含有し、このペプチドが生体細胞の細胞周期を制御し、ガン細胞の増殖を抑制することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。 A peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, Asp-Ile-Leu-Arg-Gly , having a C-terminal amidation and a molecular weight of 570.959 as an active ingredient, Suppresses cancer cell proliferation by controlling the cell cycle of living cells, and a cancer cell proliferation inhibitor . 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からＮ末端の Asp を欠いたアミノ酸配列、 Ile-Leu-Arg-Gly を有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が４５６．５８であるペプチドを有効成分として含有することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。 A peptide having an amino acid sequence Ile-Leu-Arg-Gly lacking Asp at the N-terminus from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, an amidated C-terminus, and a molecular weight of 456.58 A cancer cell proliferation inhibitor characterized by containing as an active ingredient . 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からＮ末端のAspを欠いたアミノ酸配列、Ile-Leu-Arg-Glyを有し、Ｃ末端がアミド化されており、分子量が４５６．５８であるペプチドを有効成分として含有し、このペプチドが生体細胞の細胞周期を制御し、ガン細胞の増殖を抑制することを特徴とするガン細胞増殖抑制剤。A peptide having an amino acid sequence Ile-Leu-Arg-Gly lacking Asp at the N-terminus from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, an amidated C-terminus, and a molecular weight of 456.58 A cancer cell growth inhibitor, comprising as an active ingredient , this peptide controls the cell cycle of living cells and suppresses the growth of cancer cells . 前記ペプチドが天蚕の前幼虫由来のものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のガン細胞増殖抑制剤。 The cancer cell proliferation inhibitor according to any one of claims 1 to 4, wherein the peptide is derived from a pre-larva of Tengu .

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