JP3579166B2

JP3579166B2 - Scanning laser microscope

Info

Publication number: JP3579166B2
Application number: JP2700996A
Authority: JP
Inventors: 修二中川
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2004-10-20
Anticipated expiration: 2016-02-14
Also published as: JPH09218355A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、画像の合焦点調整機能を有する走査型レーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、標本に対してレーザ光を走査するとともに、この走査に応じた標本像を画像化するものとして、走査型レーザ顕微鏡が知られている。このような走査型レーザ顕微鏡では、レーザ走査されている標本の透過光または反射光を光電子倍増管やフォトダイオードなどの光電変換器により光電変換信号に変換し、この光電変換信号をＡ／Ｄ変換回路で量子化した後、メモリに記憶するようにしている。また、このような走査型レーザ顕微鏡には、画像の合焦点調整を自動的に行う合焦点調整機能を有するものがあり、一例として、特開平４−６１３３４号公報に開示されるように、共焦点画像形成用のリニアイメージセンサを用い、このリニアイメージセンサに入射する光束の一部を受光して試料の焦点情報を検出する合焦検出装置を設けていて、この合焦検出装置の出力信号により対物レンズと試料との間の距離を合焦点に対して制御するようにしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、このように構成したものでは、共焦点画像形成用のリニアイメージセンサに入射する光束の一部を合焦検出装置に入射するようにしているため、共焦点画像形成用リニアイメージセンサへの光量が減少してしまい、例えば微弱な光の標本については標本像が見えなくなることがある。また、合焦調整を精度よく行うには、共焦点画像形成用リニアイメージセンサと合焦検出装置との光学的合焦位置の調整が必要で、この調整が不十分の場合は、標本像の合焦ができないことから、面倒な調整作業を強いられるなど、合焦点制御に手間と時間が掛かってしまう。さらに、レーザ走査による共焦点画像によりピント合せを行うことができるが、共焦点画像は、焦点深度が極端に浅いため、使いづらいばかりか、合焦位置が判断できずに、時として、対物レンズを標本にぶつけてしまう危険性がある。
【０００４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、合焦調整を精度よく、しかも速やかに行うことができる焦点調整機能を有する走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、標本に対してレーザ光を走査し、該走査に応じた標本像の共焦点検出と非共焦点検出を可能にした走査型レーザ顕微鏡において、前記標本像の非共焦点検出により広い範囲の合焦位置を求める非共焦点光検出手段と、この非共焦点光検出手段で求められた前記広い範囲の合焦位置の範囲内で、共焦点検出により狭い範囲の合焦位置を求める共焦点光検出手段とにより構成している。
【０００６】
請求項２記載の発明は、請求項１記載において、前記非共焦点光検出手段による非共焦点検出は、輝度出力が最大値で、一定レベルになる状態を検出し、前記共焦点光検出手段による共焦点検出は、輝度出力が最大値になる状態を検出するようにしている。
【０００７】
請求項３記載の発明は、請求項１または２記載において、複数の対物レンズと、前記非共焦点検出手段の前であって、前記対物レンズの焦点位置に配置した、穴径を変更可能な穴系変更手段とを備え、前記対物レンズの倍率に応じて前記穴径を変更するようにしている。
また、請求項４記載の発明は、請求項１または２記載において、複数の対物レンズと、前記非共焦点検出手段の前に設けた複数の受光エリアとを備え、前記対物レンズの倍率に応じて前記受光エリアを選択し、信号を取り出するようにしている。
また、請求項５記載の発明は、請求項１または２記載において、対物レンズと、前記標本と前記対物レンズとの相対距離を検出する相対距離検出手段と、広い範囲又は狭い範囲の合焦位置を検出する動作時に、前記相対距離検出手段からの信号により、前記標本と前記対物レンズが衝突しないように合焦位置を求める動作を停止する衝突防止手段とを備えている。
【０００８】
この結果、請求項１または２記載の発明によれば、まず、標本像の非共焦点検出により比較的広い範囲についての合焦位置を求め、この非共焦点検出で求めた合焦範囲内で、共焦点検出によりさらに狭い範囲の合焦位置を求めるようにしたので、所望する部分の合焦位置を精度よく、しかも速やかに検出することが可能になる。
また、請求項３記載の発明によれば、非共焦点光検出手段の前に配置した穴系変更手段を、対物レンズに合わせて大きめな穴系とすることにより大まかな合焦位置を求め、次に小さい穴系とすることにより狭い範囲での合焦位置を求めることで、所望する部分の合焦位置を速やかに、且つ精度良く検出することができる。
また、請求項４記載の発明によれば、非共焦点光検出手段の前に配置した複数の受光エリアにおいて、対物レンズ倍率が低倍の場合は上下画素を追加し、高倍時には上下画素の追加を最小限とすることにより、１つの光検出器で合焦位置を検出することができる。
また、請求項５記載の発明によれば、標本と対物レンズとの相対距離を検出しているので、これらが衝突しないことを確認しながら、合焦位置を求めることができる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
（第１の実施の形態）
図１は、第１の実施の形態の概略構成を示している。この場合、光源１とピンホール２によって点状光源を構成し、この点光源を収差のよく補正された対物レンズ３を通して観察試料４上に点状光として結像し、試料４を照明するようになっている。そして、試料４を透過した該試料４からの点状光を、収差のよく補正されたコンデンサレンズ５を通して光検出器７に与えるようにする。
【００１０】
なお、８は試料４を載置するステージである。
この場合、光検出器７の受光面の前面の結像位置にピンホール６を着脱可能に配置していて、ピンホール６を配置した状態では、コンデンサレンズ５からの点状光をピンホール６上に結像し、この結像された点状光をピンホール６を通して光検出器７で検出することで、共焦点を検出する共焦点センサとして動作させるようにし、また、ピンホール６を取り除いた状態では、コンデンサレンズ５からの点状光を直接光検出器７で検出することで、非共焦点を検出する非共焦点センサとして動作させるようにしている。
【００１１】
なお、ここでは試料４をラスター走査のように２次元走査することにより、２次元画像を得るようにしている。
しかして、まず、ピンホール６を結像位置から取り除き、試料４上の点光源が、コンデンサレンズ５により直接光検出器７に集光するように、対物レンズ３を光軸方向に移動しながら光検出器７の輝度出力により非共焦点を検出するようにする。
【００１２】
この場合、対物レンズ３の光軸方向の移動量と、輝度出力の変化の関係は、図２中ａに示すようになって、輝度出力分布が最大値で一定レベルを呈するようになると、合焦位置と判断するが、この合焦位置は比較的広い範囲で求められる。
【００１３】
そして、かかる合焦位置が求められた時点で、ピンホール６を結像位置に挿入する。この場合、図示実線の光路よりピンホール６上に結像された点状光を、ピンホール６を通して光検出器７で検出するが、対物レンズ３の集光位置よりずれた位置Ｌからの図示破線の光路による光は、ピンホール６を通過せず光検出器７に到達しないようにして、光検出器７からの輝度出力により共焦点を検出するようにする。
【００１４】
この場合、対物レンズ３の試料４方向への移動量と、輝度出力の変化の関係は、図２中ｂに示すようになって、輝度出力分布が最大値を呈すると合焦位置と判断するが、この合焦位置は、極めて狭い範囲で求められるようになる。
【００１５】
従って、このようにすれば、最初に、ピンホール６を結像位置から取り除いて、光検出器７より非共焦点を検出することで大まかな合焦位置を求め、この時点からピンホール６を光検出器７の受光面に配置して、非共焦点検出による大まかな合焦位置の範囲において、さらに光検出器７より共焦点を検出して、狭い範囲での合焦位置を求めるようにしたので、共焦点検出のみで合焦位置を求めるのと比べ、所望する部分の合焦位置を速やかに、且つ精度よく検出することができる。また、非共焦点検出と共焦点検出を組み合わせているので、微弱な光の標本についても正確に合焦位置を求めることができる。
（第２の実施の形態）
図３は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、ここでは、走査型共焦点顕微鏡に本発明を適用した例を示している。
【００１６】
図において、２１は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体２１は、レーザ光源２２、ミラー２３、ハーフミラー２４、２次元走査機構２５、レボルバ２６、対物レンズ２７、ステージ２８、試料２９、レンズ３０，ピンホール板３１、共焦点光検出器３２、ハーフミラー３８、レンズ３９および非共焦点光検出器４０などを有し、また、このような顕微鏡本体２１に対し画像メモリ３３Ａ、３３Ｂ、画像判定回路３３Ｃを有する画像処理ユニット３３、ＸＹ走査駆動制御回路３４、Ｚ走査駆動制御回路３５、コンピュータ３６、モニタ３７および共焦点／非共焦点用切り替えＳＷ４１を接続している。
【００１７】
この場合、レーザ光源２２は、試料２９の表面を走査するスポット光としてのレーザ光を発生するためのもので、このレーザ光源２２からのレーザ光をミラー２３により反射させ２次元走査機構２５に導くようにしている。２次元走査機構２５は、ミラー２３より与えられたレーザ光源２２からのレーザ光を試料２９上に２次元走査するためのもので、例えばＸ軸方向走査用のガルバノミラーとＹ軸方向走査用のガルバノミラーを有していて、ＸＹ走査駆動制御回路３４の制御によりスポット光をＸＹ方向に走査すべく、これらガルバノミラーをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることで対物レンズ２７に対するスポット光の光路をＸＹ方向に振らせるようになっている。レボルバ２６は、倍率の異なる複数の対物レンズ２７を保持するもので、レボルバ２６の切り替えにより、複数の対物レンズ２７のうち所望の倍率を持つものを顕微鏡の観察光路中に選択挿入するようにしている。
【００１８】
そして、この選択挿入された対物レンズ２７を通して２次元走査機構２５により２次元走査されたスポット光をステージ２８上の試料２９に照射するようにしている。
【００１９】
一方、試料２９からの反射光、蛍光、透過光などの観察情報光を、対物レンズ２７を通して２次元走査機構２５に戻し、この２次元走査機構２５を介してハーフミラー２４、３８に戻すようにしている。これらハーフミラ２４、３８は、２次元走査機構２５に対するレーザ光源２２の出射光路上に設けられた半透明鏡であって、２次元走査機構２５を介して与えられる試料２９からの反射光を光検出系に導くためのものである。
【００２０】
ハーフミラ２４を介して得た２次元走査機構２５からの例えば反射光をレンズ３０で集光し、ピンホール板３１に与えるようにしている。このピンホール板３１は、所定径のピンホールを開けたもので、共焦点光検出器３２の受光面の前面の結像位置に、そのピンホールを位置させるように配置している。また、共焦点光検出器３２は、ピンホール板３１のピンホールを介して得られる光をその光量対応の電気信号に変換する光検出素子からなっている。
【００２１】
一方、ハーフミラ３８を介して得た２次元走査機構２５からの反射光をレンズ３９で集光し、非共焦点光検出器４０の受光面に与えるようにしている。この非共焦点光検出器４０は、ピンホールを通さないで得られる光を、その光量対応の電気信号に変換するフォトマル、フォトダイオードなどの光検出素子からなっている。
【００２２】
Ｚ走査駆動制御回路３５は、コンピュータ３６または画像判定回路３３Ｃにより制御されるもので、倍率の異なる複数の対物レンズ２７を保持するレボルバ２６を、その高さ方向、すなわちＺ軸方向に基準幅単位で移動制御させるためのものである。また、Ｚ走査駆動制御回路３５は、レボルバ２６をＺ軸方向に基準幅単位で移動制御するごとにカウントを１づつ進める機能と、このカウント値を画像処理ユニット３３に与える機能をも有している。
【００２３】
画像処理ユニット３３の画像メモリ３３Ａ、３３Ｂは、それぞれ１フレーム分の容量を持つ画像メモリで、例えば５１２画素×５１２画素×８ビット（２５６階調）構成で１フレーム分としたメモリである。また、画像処理ユニット３３は、この１フレーム分の容量を持つ２つの画像メモリ３３Ａ，３３Ｂの他に、画像判定回路３３Ｃも有している。
【００２４】
そして、切り替えＳＷ４１を介して共焦点光検出器３２または共焦点光検出器４０からの出力信号を受けると、画像メモリ３３Ａ、３３Ｂのうち、画像メモリ３３Ａは、反射光の電気信号（輝度信号）を保存するようにしている。この場合、スポット光の現在のＸＹ走査位置に対応する画素位置に８ビットデータとして記憶保存するようにしている。この場合の記憶は、前回のその位置での輝度信号より今回の輝度信号のレベルが高い場合に、その画素位置の記憶情報として保存するようにして、高さの異なる画像の足し込みを可能にしている。また、画像メモリ３３Ｂには、スポット光の現在のＸＹ走査位置に対応する画素位置にＺ軸走査方向の情報、具体的にはＺ走査駆動制御回路３５からレボルバ２６が何回移動したかを数えた回数の値が与えられ、画像メモリ３３Ａの記憶データから前回のその位置での輝度信号より今回の輝度信号のレベルが高い場合に、画像メモリ３３Ｂに対して前記回数の値をデータとして更新、記憶保存するようにしている。このようにして画像メモリ３３Ｂでは、各画素位置において、その画素位置で最大輝度を示すデータがある時のレボルバ移動回数値をＺ走査方向の情報（この情報は高さ位置を示すことになる。）として記憶している。
【００２５】
なお、画像処理ユニット３３に対してのスポット光の現在のＸＹ層位置情報は、ＸＹ走査駆動制御回路３４より与えられている。
画像判定回路３３Ｃは、自動画像形成の際の自動範囲設定と、その設定値のコンピュータ３６への伝達とＺ走査駆動制御回路３５の制御を担うものである。
【００２６】
そして、画像処理ユニット３３は、これら画像メモリ３３Ａ、３３Ｂの記憶データを読み出してコンピュータ３６に与えるといった処理も行うようにしている。
【００２７】
コンピュータ３６は、これらＸＹ走査駆動制御回路３４、Ｚ走査駆動制御回路３５および画像処理ユニット３３の各制御を行うと共に、画像データの保存、再生、編集などを行うなどの制御や処理の中枢を担うものである。モニタ３７は、コンピュータ３６の画像表示端末であり、必要な情報の表示や画像の表示などに使用される。
【００２８】
また、コンピュータ３６は、画像処理ユニット３３に対する共焦点光検出器３２の出力と非共焦点光検出器４０の出力の切り替えを行う切り替えＳＷ４１の切り替え動作も制御するようにもしている。
【００２９】
しかして、このような構成において、合焦開始をコンピュータ３６が検出すると、図４に示すフローチャートが実行され、まず、切り替えＳＷ４１により非共焦点光検出器４０からの出力を画像処理ユニット３３に与えるように設定して、非共焦点光検出器４０を合焦用センサとして用いるようにする（ステップ４０１）。
【００３０】
そして、上述したようにレーザ光源２２からのレーザ光を２次元走査機構２５により２次元走査するとともに、このレーザ光をスポット光として対物レンズ２７を通してステージ２８上の試料２９に照射し、この試料２９からの反射光を対物レンズ２７を通し、ハーフミラー３８よりレンズ３９を介して非共焦点光検出器４０の受光面に集光することにより、非共焦点光検出器４０からの出力を画像データとして、画像処理ユニット３３に取り込み、画像メモリ３３Ａにデータを格納する。そして、任意のラインの画像データをコンピュータ３６に取り込み、該任意ラインの画像の輝度出力が最大となる画素位置を求める（ステップ４０２、４０３）。
【００３１】
この場合の任意の１ラインは、例えば画像中央付近やユーザの選択した任意のラインデータを取り込んでもよい。また、合焦用に必要なデータは１ラインなので、Ｙ軸方向スキャンを止め、ある１ラインのみのデータを画像メモリ３３Ａに取り込むようにしてもよい。
【００３２】
このようにして、モニタとなる１画素を決定したならば、非共焦点光検出器４０の出力が増加する方向に対物レンズ２７と試料２９との間を制御する（ステップ４０４）。つまり、非共焦点光検出器４０を合焦検出用センサとし、輝度出力が最大となるように対物レンズ２７と試料２９との間を制御する。
【００３３】
ここで１ラインの中の最大となる画素出力を求めず、１ラインの画素出力平均値が最大となるような対物レンズ２７と試料２９との間を制御してもよいし、また、１ラインの任意のブロックの画素平均値が最大となるように対物レンズ２７と試料２９との間を制御（Ｚレボ制御）してもよい。
【００３４】
このＺレボ制御する際に、試料２９と対物レンズ２７の位置関係をコンピュータ３６で演算し、試料２９と対物レンズ２７が衝突しないように制御することが必要である。
【００３５】
このような制御を以下のように実行される。
この場合の条件は、ステージ２８位置を任意の位置に固定し、Ｚレボ制御のみで合焦位置を求めるものとする。また、Ｚレボの初期位置を最上限として、この位置を基準位置とする。
【００３６】
そして、この基準位置からステージ２８の位置までの距離をｌとし、また、対物位置を、Ｚレボ原点位置からのＺレボ移動量とＺレボの長さと対物の長さの和により求め、この対物位置をｌｍとする。ここで、Ｚレボ位置は、Ｚレボ公差と対物の公差による誤差を含む。また、試料２９の厚みをｄとし、合焦のターゲットによりその厚みは変わる。このターゲットの厚みはユーザにより定義することとする。
【００３７】
これにより、試料２９と対物レンズ２７の間の距離は、
Ｗｄ＝ｌ−ｌｍ−ｄ
で求められる。この場合、それぞれの値は、公差による誤差を含んでいる。
【００３８】
そして、Ｗｄが負になる場合に、試料２９と対物レンズ２７の間で衝突が起きる可能性がある。
このようにして、試料２９と対物レンズ２７の位置関係をコンピュータ３６で演算しつつ、これらが衝突しないことを確認しながら、合焦位置を求める制御を続ける（ステップ４０５）。
【００３９】
ここで、ステップ４０５で、試料２９と対物レンズ２７が衝突する危険を判断すると、ステップ４０６で、ＡＦエラーを発生し、ＡＦ動作を停止すると同時に、モニタ３７上でユーザに警告を与えるようになる。
【００４０】
その後、非共焦点光検出器４０の輝度出力が最大となって、上述した図２のａに示すように一定の出力値に落ち着くようになれば、合焦位置が検出されたものと見做して、非共焦点光検出器４０による合焦位置検出を終了する（ステップ４０７）。
【００４１】
次に、切り替えＳＷ４１の切り替えにより共焦点光検出器３２からの出力を画像処理ユニット３３に与えるように設定して、共焦点光検出器３２を合焦用センサとして用いるようにする（ステップ４０８）。
【００４２】
そして、この場合も共焦点光検出器３２の出力が増加する方向に対物レンズ２７と試料２９との間を制御する（ステップ４０９）。つまり、共焦点光検出器３２を合焦検出用センサとし、輝度出力が最大となるように対物レンズ２７と試料２９との間を制御する。この制御には、山登り式を用い、共焦点光検出器３２が最大値を検出した後、出力値が減少方向に変化したことを検出すると、Ｚ方向の移動を逆移動して合焦位置を追い込むようにする。
【００４３】
この場合も試料２９と対物レンズ２７の位置関係をコンピュータ３６で演算しつつ、これらが衝突しないことを確認しながら、合焦位置を求める制御を続ける（ステップ４１０）。
【００４４】
ここでも、ステップ４１０で、試料２９と対物レンズ２７が衝突する危険を判断すると、ステップ４１１で、ＡＦエラーを発生し、ＡＦ動作を停止すると同時に、モニタ３７上でユーザに警告を与えるようになる。
【００４５】
その後、共焦点光検出器３２の輝度出力の最大値が、上述した図２のｂに示すように極めて狭い範囲で得られることで、合焦位置が検出されたものと見做して合焦位置検出を終了する（ステップ４１２、４１３）。
【００４６】
従って、このようにすれば、最初に非共焦点光検出器４０を合焦用センサとして用い、輝度出力が最大値となる広い範囲を大まかな合焦位置として求め、この状態から共焦点光検出器３２を合焦用センサとして切り替えて、大まかな合焦位置の範囲について、さらに輝度出力が最大値となる狭い範囲での合焦位置を求めるようにしたので、所望する部分の合焦位置を精度よく、しかも速やかに検出することができるようになる。また、非共焦点光検出器４０と共焦点光検出器３２により合焦用センサを切り替えており、これらセンサを組み合わせて用いているので、例え微弱な光の標本についても正確に合焦位置を求めることができる。
（第３の実施の形態）
この第３実施の形態では、レボルバ２６に取り付けられた複数の対物レンズ２７の倍率に応じたピンホールを有するピンホール板４２を非共焦点光検出器４０の手前に配置するようにしている。この場合、ピンホール板４２は、図５に示すように例えば３段階に径の異なるピンホール４２ａ、４２ｂ、４２ｃを有し、また、側縁に沿ってクリック４２ｄを設けて対物倍率に応じてピンホールを光軸上に選択挿入可能にしている。この場合のピンホール板４２の移動は、コンピュータ３６の指示により電動切り替えにより実行される。
【００４７】
次に、ピンホール径を変えた場合の効果について説明する。対物レンズの焦点深度は倍率が低くなるほど、焦点深度は大きくなることはよく知られている。図２の非共焦点光学系での光軸方向の強度分布ａについても同じようなことがいえ、対物レンズの倍率が低くなればなるほど、光軸方向の距離が大きくなる。また、共焦点についても同様である。
【００４８】
したがって、低倍の対物レンズを使用した場合、共焦点、非共焦点ともに光軸方向の幅が広がるが、場合によっては図６に示すようになる可能性がある。図６は、非共焦点の輝度が一定になっている範囲で、共焦点の輝度が零になっている範囲Ｘが存在するような状態である。このような関係になっていると、非共焦点光検出器４０の輝度出力が一定になったからといって、すぐに共焦点光検出器３２の出力を利用することができない。したがって、共焦点光検出器３２の輝度出力が発生するまでの間は、非共焦点光検出器４０の光出力を利用せざるを得ないが、出力が一定なので制御に時間がかかる。
【００４９】
図２から明らかなように、同じ対物レンズでもピンホールの有無によってその光軸方向の強度分布に大きな差を生じる。逆にこれは、ピンホールの径によって光軸方向の強度分布を変化させることができることを意味している。したがって、図６のような場合でも本実施の形態のように非共焦点側にピンホールを配置することで、非共焦点の光軸方向の強度分布を破線のように変化させることができる。この結果、問題となる範囲Ｘを無くすことができるため、素早い合焦が可能になる。
【００５０】
しかして、コンピュータ３６は、常時対物レンズ２７についての情報を認識しており、対物レンズ２７の倍率変更の要求を受けると、低倍時はピンホール径の小さなものを選択して輝度が一定になる範囲を狭まるようにし、高倍時はピンホール径の大きなものを選択して輝度が一定となる範囲を広げるようにしている。
【００５１】
このようにすれば、非共焦点光検出器４０側に径の異なるピンホール４２ａ、４２ｂ、４２ｃを有するピンホール板４２を配し、対物レンズ２７の倍率に応じてピンホール４２ａ、４２ｂ、４２ｃのうちの１つを選択するようにしたので、対物レンズ２７が低倍になっても、非共焦点光検出器４０により安定して合焦位置を検出することができるようになる。
【００５２】
この場合、ピンホール可変は、連続的に絞り径を可変可能にした手段を設けるようにしてもよい。
また、本実施の形態では、非共焦点側にピンホールを配置したが、逆に共焦点側に図５のようなピンホールを配置しても構わない。この場合は、はじめに図６の問題となる範囲Ｘが存在しないようにピンホールを大きくしておき、徐々に小さくして合焦の精度を上げるようにしていけばよい。
【００５３】
共焦点と非共焦点に適したピンホールを図５に示すように一枚の板に設けることができるならば、一つの光検出器を共焦点用、非共焦点用に兼用できる。
（第４の実施の形態）
この第４実施の形態では、図３に示す非共焦点光検出器４０について、ピンホール径を可変させずに受光エリアを可変できるようにしている。
【００５４】
この場合、非共焦点光検出器４０は、図７（ａ）に示すように受光エリアをＡ、Ｂ、Ｃの３分割とし、対物レンズ２７の倍率に応じて各受光エリアより取り出す信号を選択するようにしている。すなわち、同図（ｂ）に示すように対物レンズ２７が低倍の場合は、受光エリアをＡのみとし、対物レンズ２７が高倍であれば、受光エリアをＡ、Ｂ、Ｃを選択してＡ＋Ｂ＋Ｃの加算信号取り出すようにしている。
【００５５】
このようにすれば、非共焦点光検出器４０の受光エリアを対物レンズの倍率に応じて変化させるようにできるので、精度出力が最大になって、合焦位置の追い込み精度を上げることができる。
【００５６】
本実施の形態の場合も、上記第３の実施の形態と同様に共焦点側に配置することも可能であり、受光エリアとして共焦点と非共焦点を検出できるエリアを複数設定することにより、一つの光検出器で共焦点と非共焦点用に兼用することも可能である。
（第５の実施の形態）
この第５実施の形態では、図３と同一部分には同符号を付して示す図８に示すように非共焦点光検出器４０の光路中のミラー４３を駆動可能にし、合焦用センサを非共焦点光検出器４０から共焦点光検出器３２に切り替える際に他の位置まで駆動できるようにしている。つまり、ここでのミラー４３は、非共焦点光検出器４０の合焦位置算出の際は、標本像が非共焦点光検出器４０に入射する位置に移動し、その後、非共焦点光検出器４０での合焦位置を検出終了すると、ミラー４９を図示破線位置に移動させて共焦点光検出器３２に１００％標本像が入射するようにしている。このミラー４３の位置移動は、コンピュータ３６が管理し、電動切り替え可能である。
【００５７】
このようにすれば、非共焦点光検出器４０と共焦点光検出器３２のいずれにも、光量を落とさずに標本像を入射することができるので、光量の不足した標本に対しても十分合焦位置を求めることができるようになる。
【００５８】
なお、非共焦点検出系と共焦点検出系は、図３で述べた位置関係であってもよい。この場合は、ミラー２４が移動するようになる。
（第６の実施の形態）
この第６の実施の形態では、光検出器に２次元エリアセンサを使用し、取り込むエリアを可変することで、非共焦点用データと共焦点用データをそれぞれ検出できるようにしている。
【００５９】
図９（ａ）は、このような２次元エリアセンサを用いて実現した合焦検出のための回路構成図で、レーザ光源５１からのレーザ光をビームエクスパンダ５２よりＸ方向ガルバノ機構５３、Ｙ方向ガルバノ機構５５を通し、さらに対物レンズ５６を通して試料５７に入射し、この試料５７からの反射光をミラー５８を介して２次元エリアセンサ５４に与えるようにしている。
【００６０】
この場合、２次元エリアセンサ５４は、例えばＣＣＤからなるもので、同図（ｂ）に示すように複数の撮像素子を複数ライン分配置していて、共焦点用データは、２次元エリアセンサ４５の任意の１ライン（図示破線で示す部分）のうちの１画素相当の撮像素子からの輝度出力を取り込むことで検出するようにし、また、非共焦点用データは、２次元エリアセンサ４５の任意の１ライン（図示破線で示す部分）のうちの１画素相当の撮像素子からの輝度出力に、少なくとも該撮像素子の上下１画素に相当する撮像素子からの輝度出力を加えることで得るようにしている。つまり、対物レンズ５６の倍率に応じて、追加する上下画素に相当する撮像素子からの輝度出力を、例えば、対物倍率が低倍ならば上下画素を追加し、高倍時には上下画素の追加を最小単位とする。
【００６１】
このようにすれば、共焦点用データと非共焦点用データを求めて合焦位置を追い込むことにより、１つの光検出器で合焦位置を求めることができる。
この場合、当然のことながら、全ての画素を使う必要なく、任意の１画素を利用すればよい。上記の実施の形態では、ライン走査を想定しているが、スポットもしくは微小な２次元領域であっても可能である。
【００６２】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば標本像の非共焦点検出により比較的広い範囲についての合焦位置を求め、この非共焦点検出で求めた合焦範囲について、さらに共焦点検出により狭い範囲での合焦位置を求めることにより、所望する部分の合焦位置を精度よく、しかも速やかに検出することができる。
また、非共焦点光検出手段と共焦点光検出手段を選択的に切り替えることができるので、合焦位置を自動的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態を説明するための図。
【図３】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】第２の実施の形態の動作を説明するためのフローチャート。
【図５】本発明の第３の実施の形態に用いられるピンホール板の概略構成を示す図。
【図６】第３の実施の形態を説明するための図。
【図７】本発明の第４の実施の形態に用いられる非共焦点光検出器の概略構成を示す図。
【図８】本発明の第５の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図９】本発明の第６の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…光源、
２…ピンホール、
３…対物レンズ、
４…試料、
５…コンデンサレンズ、
６…ピンホール、
７…光検出器、
２１…顕微鏡本体、
２２…レーザ光源、
２３…ミラー、
２４…ハーフミラー、
２５…２次元走査機構、
２６…レボルバ、
２７…対物レンズ、
２８…ステージ、
２９…試料、
３０…レンズ、
３１…ピンホール板、
３２…共焦点光検出器、
３３…画像処理ユニット、
３３Ａ、３３Ｂ…画像メモリ、
３３Ｃ…画像判定回路、
３４…ＸＹ走査駆動制御回路、
３５…Ｚ走査駆動制御回路、
３６…コンピュータ、
３７…モニタ、
３８…ハーフミラー、
３９…レンズ、
４０…非共焦点光検出器、
４１…切り替えＳＷ、
４２…ピンホール板、
４３…ミラー、
５１…レーザ光源、
５２…ビームエクスパンダ、
５３…Ｘ方向ガルバノ機構、
５４…２次元エリアセンサ、
５５…Ｙ方向ガルバノ機構、
５６…対物レンズ、
５７…試料。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a scanning laser microscope having an image focusing function.
[0002]
[Prior art]
2. Description of the Related Art Conventionally, a scanning laser microscope has been known for scanning a sample with a laser beam and imaging a sample image corresponding to the scanning. In such a scanning laser microscope, transmitted light or reflected light of a sample being laser-scanned is converted into a photoelectric conversion signal by a photoelectric converter such as a photomultiplier tube or a photodiode, and this photoelectric conversion signal is A / D converted. After being quantized by a circuit, it is stored in a memory. Some of such scanning laser microscopes have an in-focus adjustment function for automatically adjusting the in-focus of an image. For example, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. A focus detection device that uses a linear image sensor for forming a focused image, receives a part of the light beam incident on the linear image sensor, and detects focus information of the sample, and an output signal of the focus detection device is provided. Controls the distance between the objective lens and the sample with respect to the focal point.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, in such a configuration, a part of the light beam incident on the linear image sensor for forming a confocal image is incident on the focus detection device. The amount of light decreases, and for example, a sample image of a weak light sample may not be seen. In addition, in order to perform the focus adjustment with high accuracy, it is necessary to adjust the optical focus position between the linear image sensor for forming a confocal image and the focus detection device. Since focusing cannot be performed, it takes time and effort to perform focusing control, such as forcing a troublesome adjustment operation. In addition, focusing can be performed using a confocal image obtained by laser scanning. However, the confocal image is extremely difficult to use because the depth of focus is extremely shallow, and the focus position cannot be determined. There is a risk of hitting the specimen.
[0004]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a scanning laser microscope having a focus adjustment function capable of performing focus adjustment accurately and promptly.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
According to a first aspect of the present invention, there is provided a scanning laser microscope which scans a sample with a laser beam and enables confocal detection and non-confocal detection of the sample image according to the scanning. By focus detectionWide rangeNon-confocal light detecting means for determining the in-focus position and the non-confocal light detecting meansWithin the range of the wide range of focus position, the focus range of the narrow range by confocal detectionAnd confocal light detection means for determining
[0006]
According to a second aspect of the present invention, in the first aspect, the non-confocal detection by the non-confocal light detecting means detects a state in which the luminance output reaches a maximum level and a constant level. Is to detect a state where the luminance output becomes the maximum value.
[0007]
The invention according to claim 3 is the invention according to claim 1 or 2,A plurality of objective lenses, and a hole system changing means arranged in front of the non-confocal detecting means and located at a focal position of the objective lens and capable of changing a hole diameter, according to a magnification of the objective lens Change the hole diameterLike that.
According to a fourth aspect of the present invention, in accordance with the first or second aspect, the apparatus further comprises a plurality of objective lenses and a plurality of light receiving areas provided in front of the non-confocal detection means, wherein the plurality of light receiving areas correspond to magnifications of the objective lenses. Thus, the light receiving area is selected to extract a signal.
According to a fifth aspect of the present invention, in the first or second aspect, an objective lens, relative distance detecting means for detecting a relative distance between the sample and the objective lens, and a focus position in a wide range or a narrow range. And an anti-collision means for stopping an operation for obtaining a focus position so that the sample and the objective lens do not collide with each other in a signal from the relative distance detecting means during the operation of detecting the distance.
[0008]
As a result, according to the first or second aspect of the present invention, first, a non-confocal detection of a sample image is used to determine a focus position over a relatively wide range, and a focus position within a focus range obtained by the non-confocal detection is determined. Since the focus position in a narrower range is obtained by the confocal detection, the focus position of a desired portion can be accurately and promptly detected.
According to the third aspect of the present invention, a rough focusing position is obtained by making the hole system changing means disposed before the non-confocal light detecting means a large hole system in accordance with the objective lens. By obtaining the focus position in a narrow range by using the next smaller hole system, the focus position of a desired portion can be detected quickly and accurately.
According to the fourth aspect of the present invention, upper and lower pixels are added when the magnification of the objective lens is low, and the upper and lower pixels are added when the magnification of the objective lens is high, in a plurality of light receiving areas arranged in front of the non-confocal light detecting means. Is minimized, the focus position can be detected by one photodetector.
According to the fifth aspect of the present invention, since the relative distance between the sample and the objective lens is detected, the in-focus position can be obtained while confirming that they do not collide.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
(First Embodiment)
FIG. 1 shows a schematic configuration of the first embodiment. In this case, a point light source is constituted by the light source 1 and the pinhole 2, and the point light source is imaged as point light on the observation sample 4 through the objective lens 3 whose aberration is well corrected so as to illuminate the sample 4. It has become. Then, the point light from the sample 4 that has passed through the sample 4 is given to the photodetector 7 through the condenser lens 5 whose aberration is well corrected.
[0010]
Reference numeral 8 denotes a stage on which the sample 4 is placed.
In this case, the pinhole 6 is detachably disposed at an image forming position on the front surface of the light receiving surface of the photodetector 7, and in a state where the pinhole 6 is disposed, the point light from the condenser lens 5 is transmitted to the pinhole 6. An image is formed on the top, and the formed point light is detected by a photodetector 7 through a pinhole 6 so as to operate as a confocal sensor for detecting a confocal point, and the pinhole 6 is removed. In this state, the point light from the condenser lens 5 is directly detected by the photodetector 7 to operate as a non-confocal sensor for detecting non-confocal.
[0011]
Here, the sample 4 is two-dimensionally scanned like a raster scan to obtain a two-dimensional image.
First, the pinhole 6 is removed from the image forming position, and the objective lens 3 is moved in the optical axis direction so that the point light source on the sample 4 is directly focused on the photodetector 7 by the condenser lens 5. The non-confocal point is detected based on the luminance output of the photodetector 7.
[0012]
In this case, the relationship between the amount of movement of the objective lens 3 in the optical axis direction and the change in luminance output is as shown in FIG.PowerWhen the distribution reaches a certain level at the maximum value, it is determined to be a focus position, but this focus position is obtained in a relatively wide range.
[0013]
Then, when the in-focus position is obtained, the pinhole 6 is inserted into the imaging position. In this case, the point light formed on the pinhole 6 from the optical path indicated by the solid line in the drawing is detected by the photodetector 7 through the pinhole 6, but is shown from a position L shifted from the condensing position of the objective lens 3. The light from the optical path indicated by the broken line does not pass through the pinhole 6 and does not reach the photodetector 7, and the confocal point is detected based on the luminance output from the photodetector 7.
[0014]
In this case, the relationship between the amount of movement of the objective lens 3 in the direction of the sample 4 and the change in the luminance output is as shown in FIG. 2B. When the luminance output distribution exhibits the maximum value, it is determined that the in-focus position exists. However, the in-focus position can be obtained in an extremely narrow range.
[0015]
Accordingly, in this case, first, the pinhole 6 is removed from the image forming position, and the non-confocal point is detected by the photodetector 7 to obtain a rough in-focus position. It is arranged on the light receiving surface of the photodetector 7 so that the confocal point is further detected by the photodetector 7 in the rough focus position range by the non-confocal detection, and the focus position in a narrow range is obtained. As a result, the in-focus position of a desired portion can be detected quickly and accurately compared to the case where the in-focus position is obtained only by confocal detection. In addition, since the non-confocal detection and the confocal detection are combined, the in-focus position can be accurately obtained even for a weak light sample.
(Second embodiment)
FIG. 3 shows a schematic configuration of the second embodiment of the present invention. Here, an example in which the present invention is applied to a scanning confocal microscope is shown.
[0016]
In the figure, reference numeral 21 denotes a microscope main body, which includes a laser light source 22, a mirror 23, a half mirror 24, a two-dimensional scanning mechanism 25, a revolver 26, an objective lens 27, a stage 28, a sample 29, a lens 30, a pinhole. It has a plate 31, a confocal photodetector 32, a half mirror 38, a lens 39, a non-confocal photodetector 40, and the like. Further, for such a microscope main body 21, image memories 33A and 33B and an image determination circuit 33C are provided. An image processing unit 33, an XY scan drive control circuit 34, a Z scan drive control circuit 35, a computer 36, a monitor 37, and a confocal / non-confocal switch SW41 are connected.
[0017]
In this case, the laser light source 22 is for generating laser light as spot light for scanning the surface of the sample 29, and the laser light from the laser light source 22 is reflected by the mirror 23 and guided to the two-dimensional scanning mechanism 25. Like that. The two-dimensional scanning mechanism 25 is for two-dimensionally scanning the laser light from the laser light source 22 given by the mirror 23 on the sample 29. For example, a galvano mirror for scanning in the X-axis direction and a scanning mirror for scanning in the Y-axis direction are provided. In order to scan the spot light in the X and Y directions under the control of the XY scanning drive control circuit 34, the optical path of the spot light with respect to the objective lens 27 is provided by swinging these galvanomirrors in the X and Y directions. In the X and Y directions. The revolver 26 holds a plurality of objective lenses 27 having different magnifications. By switching the revolver 26, a plurality of objective lenses 27 having a desired magnification are selectively inserted into the observation optical path of the microscope. I have.
[0018]
Then, a spot light two-dimensionally scanned by the two-dimensional scanning mechanism 25 through the selectively inserted objective lens 27 is applied to the sample 29 on the stage 28.
[0019]
On the other hand, observation information light such as reflected light, fluorescence, and transmitted light from the sample 29 is returned to the two-dimensional scanning mechanism 25 through the objective lens 27, and returned to the half mirrors 24 and 38 via the two-dimensional scanning mechanism 25. ing. The half mirrors 24 and 38 are semi-transparent mirrors provided on the emission optical path of the laser light source 22 to the two-dimensional scanning mechanism 25, and detect the reflected light from the sample 29 given through the two-dimensional scanning mechanism 25. It is for guiding to the system.
[0020]
For example, reflected light from the two-dimensional scanning mechanism 25 obtained through the half mirror 24 is condensed by the lens 30 and is provided to the pinhole plate 31. The pinhole plate 31 is provided with a pinhole having a predetermined diameter, and is arranged so that the pinhole is located at an image forming position on the front surface of the light receiving surface of the confocal light detector 32. Further, the confocal light detector 32 is composed of a light detection element that converts light obtained through the pinhole of the pinhole plate 31 into an electric signal corresponding to the light amount.
[0021]
On the other hand, the reflected light from the two-dimensional scanning mechanism 25 obtained through the half mirror 38 is condensed by the lens 39 and applied to the light receiving surface of the non-confocal light detector 40. The non-confocal light detector 40 is composed of a photodetector such as a photomultiplier or a photodiode that converts light obtained without passing through a pinhole into an electric signal corresponding to the light amount.
[0022]
The Z scanning drive control circuit 35 is controlled by the computer 36 or the image determination circuit 33C, and moves the revolver 26 holding the plurality of objective lenses 27 having different magnifications in the height direction, that is, the reference width unit in the Z axis direction. This is for controlling the movement. The Z-scan drive control circuit 35 also has a function of incrementing the count by one each time the revolver 26 is moved and controlled in the Z-axis direction in units of a reference width, and a function of giving the count value to the image processing unit 33. I have.
[0023]
Each of the image memories 33A and 33B of the image processing unit 33 is an image memory having a capacity of one frame, for example, a memory of 512 pixels × 512 pixels × 8 bits (256 gradations) for one frame. The image processing unit 33 has an image determination circuit 33C in addition to the two image memories 33A and 33B having a capacity of one frame.
[0024]
When an output signal from the confocal light detector 32 or the confocal light detector 40 is received via the switch SW41, the image memory 33A among the image memories 33A and 33B receives an electric signal (luminance signal) of the reflected light. Is to be saved. In this case, 8-bit data is stored and stored in a pixel position corresponding to the current XY scanning position of the spot light. In this case, when the level of the current luminance signal is higher than the previous luminance signal at that position, the information is stored as the storage information of the pixel position, so that images having different heights can be added. ing. Further, the image memory 33B counts information in the Z-axis scanning direction to the pixel position corresponding to the current XY scanning position of the spot light, specifically, how many times the revolver 26 has moved from the Z scanning drive control circuit 35. The value of the number of times is given, and when the level of the current luminance signal is higher than the luminance signal at the previous position from the data stored in the image memory 33A, the value of the number of times is updated as data in the image memory 33B. I try to save it. In this way, in the image memory 33B, at each pixel position, the value of the number of revolver movements when there is data indicating the maximum luminance at that pixel position is information in the Z scanning direction (this information indicates the height position. ).
[0025]
The current XY layer position information of the spot light for the image processing unit 33 is provided by the XY scanning drive control circuit 34.
The image determination circuit 33C is responsible for setting an automatic range during automatic image formation, transmitting the set value to the computer 36, and controlling the Z-scan drive control circuit 35.
[0026]
The image processing unit 33 also performs processing of reading the data stored in the image memories 33A and 33B and providing the data to the computer 36.
[0027]
Computer36Controls the XY scan drive control circuit 34, the Z scan drive control circuit 35, and the image processing unit 33, and plays a central role in control and processing such as storage, reproduction, and editing of image data. is there. The monitor 37 is an image display terminal of the computer 36, and is used for displaying necessary information and displaying images.
[0028]
In addition, the computer 36processingThe switching operation of the switching SW 41 for switching between the output of the confocal light detector 32 and the output of the non-confocal light detector 40 for the unit 33 is also controlled.
[0029]
In such a configuration, when the computer 36 detects the start of focusing, the flowchart shown in FIG. 4 is executed. First, the output from the non-confocal light detector 40 is given to the image processing unit 33 by the switch SW41. Then, the non-confocal light detector 40 is used as a focusing sensor (step 401).
[0030]
Then, as described above, the laser light from the laser light source 22 is two-dimensionally scanned by the two-dimensional scanning mechanism 25, and the laser light is irradiated as spot light onto the sample 29 on the stage 28 through the objective lens 27. The reflected light from the non-confocal photodetector 40 is condensed on the light receiving surface of the non-confocal photodetector 40 through the objective lens 27 and from the half mirror 38 via the lens 39 to the output from the non-confocal photodetector 40. And stores the data in the image memory 33A. Then, the image data of an arbitrary line is taken into the computer 36, and a pixel position at which the luminance output of the image of the arbitrary line is maximized is obtained (steps 402 and 403).
[0031]
In this case, the arbitrary one line may take in, for example, near the center of the image or arbitrary line data selected by the user. Further, since the data necessary for focusing is one line, the scanning in the Y-axis direction may be stopped and the data of only one certain line may be taken into the image memory 33A.
[0032]
After one pixel to be monitored is determined in this way, the space between the objective lens 27 and the sample 29 is controlled in the direction in which the output of the non-confocal light detector 40 increases (step 404). That is, the non-confocal light detector 40 is used as a focus detection sensor, and the space between the objective lens 27 and the sample 29 is controlled so that the luminance output is maximized.
[0033]
Here, the maximum pixel output in one line may not be obtained, and the distance between the objective lens 27 and the sample 29 may be controlled so that the average pixel output of one line is maximum. The control between the objective lens 27 and the sample 29 (Z-revo control) may be performed so that the average pixel value of an arbitrary block is maximized.
[0034]
When performing the Z-revo control, it is necessary to calculate the positional relationship between the sample 29 and the objective lens 27 by the computer 36 and to control the sample 29 and the objective lens 27 so as not to collide.
[0035]
Such control is performed as follows.
The condition in this case is that the position of the stage 28 is fixed at an arbitrary position, and the in-focus position is obtained only by the Z-revo control. Further, the initial position of the Z revo is set as the upper limit, and this position is set as the reference position.
[0036]
Then, the distance from the reference position to the position of the stage 28 is represented by l, and the objective position is obtained by the Z revolving movement amount from the Z revo origin position, the sum of the length of the Z revo, and the length of the objective. Let the position be Im. Here, the Z revo position includes an error due to the Z revo tolerance and the objective tolerance. In addition, the thickness of the sample 29 is d, and the thickness changes depending on the focus target. The thickness of this target is defined by the user.
[0037]
Thereby, the distance between the sample 29 and the objective lens 27 becomes
Wd = l-lm-d
Is required. In this case, each value includes an error due to tolerance.
[0038]
Then, when Wd becomes negative, a collision may occur between the sample 29 and the objective lens 27.
In this way, the computer 36 calculates the positional relationship between the sample 29 and the objective lens 27, and continues to obtain the in-focus position while confirming that they do not collide (step 405).
[0039]
Here, if it is determined in step 405 that there is a danger that the sample 29 and the objective lens 27 collide, an AF error is generated in step 406, the AF operation is stopped, and a warning is given to the user on the monitor 37 at the same time. .
[0040]
Thereafter, when the luminance output of the non-confocal light detector 40 reaches a maximum and reaches a constant output value as shown in FIG. 2A, it is considered that the in-focus position has been detected. Then, the in-focus position detection by the non-confocal light detector 40 ends (step 407).
[0041]
Next, setting is made so that the output from the confocal light detector 32 is given to the image processing unit 33 by switching the switch SW41, and the confocal light detector 32 is used as a focusing sensor (step 408). .
[0042]
In this case as well, the space between the objective lens 27 and the sample 29 is controlled in the direction in which the output of the confocal light detector 32 increases (step 409). That is, the confocal light detector 32 is used as a focus detection sensor, and the space between the objective lens 27 and the sample 29 is controlled so that the luminance output is maximized. For this control, a hill-climbing method is used. After the confocal photodetector 32 detects the maximum value and then detects that the output value has changed in the decreasing direction, the movement in the Z direction is reversed to move the focus position. Try to drive.
[0043]
In this case as well, the computer 36 calculates the positional relationship between the sample 29 and the objective lens 27, and while checking that they do not collide, the control for obtaining the in-focus position is continued (step 410).
[0044]
Here, if it is determined in step 410 that there is a danger that the sample 29 and the objective lens 27 collide, an AF error is generated in step 411, and the AF operation is stopped, and at the same time, a warning is given to the user on the monitor 37. .
[0045]
After that, the maximum value of the luminance output of the confocal photodetector 32 is obtained in an extremely narrow range as shown in FIG. 2B described above. The position detection ends (steps 412, 413).
[0046]
Accordingly, in this case, first, the non-confocal light detector 40 is used as a focusing sensor, and a wide range where the luminance output becomes the maximum value is obtained as a rough in-focus position. The focusing unit 32 is switched as a focusing sensor to obtain a focusing position in a narrow range where the luminance output reaches a maximum value for a rough focusing position range. Detection can be performed accurately and promptly. Further, the focusing sensor is switched by the non-confocal light detector 40 and the confocal light detector 32. Since these sensors are used in combination, the focusing position can be accurately determined even for a weak light sample. You can ask.
(Third embodiment)
In the third embodiment, the pinhole plate 42 having a pinhole corresponding to the magnification of the plurality of objective lenses 27 attached to the revolver 26 is arranged in front of the non-confocal photodetector 40. In this case, as shown in FIG. 5, the pinhole plate 42 has pinholes 42a, 42b, and 42c having different diameters in, for example, three stages, and a click 42d is provided along a side edge to correspond to the objective magnification. The pinhole can be selectively inserted on the optical axis. The movement of the pinhole plate 42 in this case is executed by electric switching according to an instruction from the computer 36.
[0047]
Next, the effect when the pinhole diameter is changed will be described. It is well known that the lower the magnification of the focal depth of the objective lens, the larger the focal depth. The same can be said for the intensity distribution a in the optical axis direction in the non-confocal optical system of FIG. 2, and the lower the magnification of the objective lens, the greater the distance in the optical axis direction. The same applies to the confocal point.
[0048]
Therefore, when a low-magnification objective lens is used, the width in the optical axis direction is increased for both confocal and non-confocal. FIG. 6 shows a state in which there is a range X where the non-confocal luminance is constant and a range X where the confocal luminance is zero. In such a relationship, the output of the confocal light detector 32 cannot be used immediately even if the luminance output of the non-confocal light detector 40 becomes constant. Therefore, until the luminance output of the confocal light detector 32 is generated, the light output of the non-confocal light detector 40 must be used, but since the output is constant, it takes time to control.
[0049]
As is apparent from FIG. 2, even with the same objective lens, a large difference occurs in the intensity distribution in the optical axis direction depending on the presence or absence of a pinhole. Conversely, this means that the intensity distribution in the optical axis direction can be changed by the diameter of the pinhole. Therefore, even in the case of FIG. 6, by disposing the pinhole on the non-confocal side as in the present embodiment, the intensity distribution of the non-confocal direction in the optical axis direction can be changed as shown by a broken line. As a result, the problematic range X can be eliminated, thereby enabling quick focusing.
[0050]
Thus, the computer 36 always recognizes information about the objective lens 27, and upon receiving a request to change the magnification of the objective lens 27, selects a pinhole having a small diameter at low magnification to maintain a constant luminance. The range is narrowed, and when the magnification is high, a pinhole having a large diameter is selected to widen the range where the luminance is constant.
[0051]
With this configuration, the pinhole plate 42 having pinholes 42a, 42b, and 42c having different diameters is disposed on the non-confocal photodetector 40 side, and the pinholes 42a, 42b, and 42c are provided in accordance with the magnification of the objective lens 27. Is selected, the in-focus position can be stably detected by the non-confocal light detector 40 even if the objective lens 27 is reduced in magnification.
[0052]
In this case, the variable pinhole may be provided with a means capable of continuously changing the aperture diameter.
Further, in the present embodiment, the pinhole is arranged on the non-confocal side, but a pinhole as shown in FIG. 5 may be arranged on the confocal side. In this case, first, the pinhole may be enlarged so that the problematic range X in FIG. 6 does not exist, and the pinhole may be gradually decreased to increase the focusing accuracy.
[0053]
If a pinhole suitable for confocal and non-confocal can be provided in one plate as shown in FIG. 5, one photodetector can be used for both confocal and non-confocal.
(Fourth embodiment)
In the fourth embodiment, the light receiving area of the non-confocal light detector 40 shown in FIG. 3 can be changed without changing the pinhole diameter.
[0054]
In this case, as shown in FIG. 7A, the non-confocal light detector 40 divides the light receiving area into A, B, and C, and selects a signal extracted from each light receiving area according to the magnification of the objective lens 27. I am trying to do it. That is, when the objective lens 27 has a low magnification, only the light receiving area is A, and when the objective lens 27 has a high magnification, the light receiving areas are A, B, and C to select A + B + C as shown in FIG. Is taken out.
[0055]
With this configuration, the light receiving area of the non-confocal light detector 40 can be changed in accordance with the magnification of the objective lens, so that the accuracy output is maximized and the focus position can be driven more accurately. .
[0056]
Also in the case of the present embodiment, it is possible to arrange on the confocal side similarly to the third embodiment, and by setting a plurality of areas that can detect confocal and non-confocal as light receiving areas, One photodetector can be used for both confocal and non-confocal.
(Fifth embodiment)
In the fifth embodiment, the same parts as in FIG. 3 are denoted by the same reference numerals, and as shown in FIG. 8, the mirror 43 in the optical path of the non-confocal photodetector 40 is made drivable, Can be driven to another position when switching from the non-confocal light detector 40 to the confocal light detector 32. That is, the mirror 43 here moves to a position where the sample image is incident on the non-confocal light detector 40 when the in-focus position of the non-confocal light detector 40 is calculated. When the detection of the in-focus position by the detector 40 is completed, the mirror 49 is moved to the position indicated by the broken line in the drawing so that the 100% sample image is incident on the confocal light detector 32. The movement of the position of the mirror 43 is managed by the computer 36 and can be electrically switched.
[0057]
With this configuration, the sample image can be incident on both the non-confocal light detector 40 and the confocal light detector 32 without reducing the light amount, and therefore, sufficient light can be applied to a sample with insufficient light amount. The focus position can be obtained.
[0058]
Note that the non-confocal detection system and the confocal detection system may have the positional relationship described with reference to FIG. In this case, the mirror 24 moves.
(Sixth embodiment)
In the sixth embodiment, a non-confocal data and a confocal data can be respectively detected by using a two-dimensional area sensor as a photodetector and changing an area to be captured.
[0059]
FIG. 9A is a circuit configuration diagram for focus detection realized using such a two-dimensional area sensor. The laser beam from the laser light source 51 is transmitted from the beam expander 52 to the X-direction galvanometer mechanism 53, Y The light enters the sample 57 through the directional galvanometer mechanism 55 and further passes through the objective lens 56, and the reflected light from the sample 57 is supplied to the two-dimensional area sensor 54 via the mirror 58.
[0060]
In this case, the two-dimensional area sensor 54 is composed of, for example, a CCD, and has a plurality of image sensors arranged for a plurality of lines as shown in FIG. Is detected by taking in a luminance output from an image sensor corresponding to one pixel in an arbitrary one line (portion indicated by a broken line in the drawing), and the non-confocal data is Of the one line (portion indicated by the broken line in the drawing) is obtained by adding at least the luminance output from the image sensor corresponding to one pixel above and below the image sensor corresponding to one pixel of the image sensor. I have. In other words, according to the magnification of the objective lens 56, the luminance output from the image sensor corresponding to the upper and lower pixels to be added is, for example, the upper and lower pixels are added when the objective magnification is low, and the upper and lower pixels are added when the objective magnification is high. And
[0061]
With this configuration, the in-focus position is obtained by obtaining the confocal data and the non-confocal data, whereby the in-focus position can be obtained by one photodetector.
In this case, it is needless to say that all the pixels need not be used, and any one pixel may be used. In the above embodiment, line scanning is assumed, but a spot or a minute two-dimensional area is also possible.
[0062]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, the in-focus position for a relatively wide range is obtained by the non-confocal detection of the sample image, and the in-focus range obtained by the non-confocal detection is further narrowed by the confocal detection. By obtaining the in-focus position within the range, the in-focus position of a desired portion can be accurately and promptly detected.
Further, since the non-confocal light detecting means and the confocal light detecting means can be selectively switched, the in-focus position can be automatically detected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining the first embodiment.
FIG. 3 is a diagram showing a schematic configuration of a second embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a flowchart for explaining the operation of the second embodiment.
FIG. 5 is a diagram showing a schematic configuration of a pinhole plate used in a third embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a diagram illustrating a third embodiment.
FIG. 7 is a diagram showing a schematic configuration of a non-confocal photodetector used in a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing a schematic configuration of a main part according to a fifth embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a diagram showing a schematic configuration of a main part according to a sixth embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1. Light source,
2. Pinhole,
3: Objective lens,
4 ... sample,
5 ... condenser lens,
6 ... pinhole,
7 ... photodetector,
21 ... microscope body,
22 laser light source,
23 ... Mirror,
24 ... half mirror,
25 two-dimensional scanning mechanism,
26 ... Revolver,
27 ... Objective lens,
28 ... stage,
29 ... sample,
30 ... Lens,
31 ... pinhole plate,
32 ... confocal photodetector,
33 ... Image processing unit,
33A, 33B ... image memory,
33C: image determination circuit
34 XY scanning drive control circuit
35 ... Z scan drive control circuit,
36 ... computer,
37 ... monitor,
38 ... half mirror,
39 ... lens,
40 ... non-confocal photodetector,
41 ... Switch SW,
42 ... pinhole plate,
43 ... Mirror,
51 ... Laser light source,
52 ... Beam expander,
53 ... X-direction galvanometer mechanism,
54 two-dimensional area sensor,
55 ... Y direction galvanometer mechanism,
56 ... objective lens
57 ... Sample.

Claims

標本に対してレーザ光を走査し、該走査に応じた標本像の共焦点検出と非共焦点検出を可能にした走査型レーザ顕微鏡において、
前記標本像の非共焦点検出により広い範囲の合焦位置を求める非共焦点光検出手段と、
この非共焦点光検出手段で求められた前記広い範囲の合焦位置の範囲内で、共焦点検出により狭い範囲の合焦位置を求める共焦点光検出手段とを具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。In a scanning laser microscope that scans a sample with laser light and enables confocal detection and non-confocal detection of a sample image according to the scanning,
Non-confocal light detection means for obtaining a wide range of focus position by non-confocal detection of the sample image,
Scanning means for obtaining a narrow focus position by confocal detection within a range of the wide focus position obtained by the non-confocal light detection means. Laser microscope.

前記非共焦点光検出手段による非共焦点検出は、輝度出力が最大値で、一定レベルになる状態を検出し、前記共焦点光検出手段による共焦点検出は、輝度出力が最大値になる状態を検出することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。Non-confocal detection by the non-confocal light detecting means detects a state in which the luminance output reaches a maximum value and a constant level, and confocal detection by the confocal light detecting means detects a state in which the luminance output reaches a maximum value. 2. The scanning laser microscope according to claim 1, wherein the laser beam is detected.

更に複数の対物レンズと、前記非共焦点検出手段の前であって、前記対物レンズの焦点位置に配置した、穴径を変更可能な穴系変更手段とを備え、前記対物レンズの倍率に応じて前記穴径を変更することを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザ顕微鏡。Furthermore, a plurality of objective lenses, and a hole system changing means which is located in front of the non-confocal detecting means and is located at a focal position of the objective lens and which can change a hole diameter, according to a magnification of the objective lens. The scanning laser microscope according to claim 1, wherein the diameter of the hole is changed by changing the diameter of the hole.

更に複数の対物レンズと、前記非共焦点検出手段の前に設けた複数の受光エリアとを備え、前記対物レンズの倍率に応じて前記受光エリアを選択し、信号を取り出すことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。The apparatus further comprises a plurality of objective lenses and a plurality of light receiving areas provided in front of the non-confocal detecting means, wherein the light receiving areas are selected according to a magnification of the objective lens, and a signal is taken out. Item 4. A scanning laser microscope according to Item 1.

更に対物レンズと、前記標本と前記対物レンズとの相対距離を検出する相対距離検出手段と、広い範囲又は狭い範囲の合焦位置を検出する動作時に、前記相対距離検出手段からの信号により、前記標本と前記対物レンズが衝突しないように合焦位置を求める動作を停止する衝突防止手段とを備えたことを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザ顕微鏡。Further, an objective lens, a relative distance detecting means for detecting a relative distance between the sample and the objective lens, and a signal from the relative distance detecting means during an operation of detecting a focus position in a wide range or a narrow range, 3. The scanning laser microscope according to claim 1, further comprising: collision prevention means for stopping an operation for obtaining a focus position so that the sample does not collide with the objective lens.