JP3576010B2 - 顆粒球コロニー刺激因子受容体の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は血液細胞または固形癌細胞表面などに発現されているＧ−ＣＳＦ レセプターの数を測定するものであり、癌細胞増殖の要因、治療上の指標として臨床検査の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に細胞表面に存在するホルモン、サイトカインなどのレセプターの個数および親和性は放射性同位元素で標識されたホルモン、サイトカインなどのレセプターへの結合量を測定し、スキャッチャード解析法（Ｇ． Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１， ６６０（１９４９）， Ｊ．Ｃ．Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｅｍ．Ｊ．，２１２，２５９ （１９８３））を用いて調べられている。顆粒球・コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ レセプター）においても、細胞表面にＧ−ＣＳＦ レセプターが存在するとその細胞がＧ−ＣＳＦ に応答し、増殖または分化することから、それの指標とするために放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いてレセプターの個数および親和性がスキャッチャード解析法で調べられている（Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，３１３（１９８５）， Ｌ．Ｍ．Ｂｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ，７４，２６６８（１９８９） ）。
【０００３】
このスキャッチャード解析法では放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いるが、生体内に存在する天然型Ｇ−ＣＳＦ と同じアミノ酸配列の遺伝子工学的に製造されたＧ−ＣＳＦ に１２５Ｉを標識するとＧ−ＣＳＦ の生物活性が失われることから、緩和な標識法での１２５Ｉ標識または遺伝子工学的に一部アミノ酸配列を変えて製造したＧ−ＣＳＦ に１２５Ｉ標識されている。これらの１２５Ｉ標識Ｇ−ＣＳＦ はレセプターへの親和性が天然型Ｇ−ＣＳＦ と異なる可能性が大きい。また、１２５Ｉ標識Ｇ−ＣＳＦ は細胞に非特異的吸着し、バックグランドが大きいため、その非特異的吸着が細胞表面に少量存在するＧ−ＣＳＦ レセプターの個数を調べる際に測定へ影響する。
【０００４】
このように、生物活性を保持した１２５Ｉ標識天然型Ｇ−ＣＳＦ の調製は不可能であり、スキャッチャード解析法での正確なレセプターの個数および親和性の測定は困難である。一方、スキャッチャード解析法に必要とする細胞数は１０８ 個であり、この細胞数を得るには多量の血液または骨髄液を採取しなければならないので、患者への負担が大きい。また、生きた細胞を用いるため、測定までの時間に制限があり、操作によるバラツキが非常に大く、レセプターの個数および親和性の測定は正確性に欠ける。
【０００５】
最近、これらを解決するため、蛍光物質標識Ｇ−ＣＳＦ を用いた自動細胞解析装置（フローサイトメトリー）でＧ−ＣＳＦ レセプターの個数を調べる方法が報告されている（Ｋ．Ｓｈｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ９１，７８３（１９９５） ）。この方法は使用細胞数が少量ですみ、患者への負担が小さく、放射性同位元素を用いないので特別な施設を必要とせず、生物活性を損なうことが少ない蛍光物質で標識されたＧ−ＣＳＦ を使用できる利点がある。Ｇ−ＣＳＦ レセプターの個数をフローサイトメトリーで測定する方法においては、細胞のＧ−ＣＳＦ レセプターに特異的に結合した蛍光標識Ｇ−ＣＳＦ の量により蛍光強度が増加するので、対照から蛍光強度が変化した量をＤ 値として算出し、そのＤ 値とＧ−ＣＳＦ レセプター数が直線関係にあるので、Ｄ 値からＧ−ＣＳＦ レセプター数を求めることができる。
【０００６】
しかし、得られたＤ 値からＧ−ＣＳＦ レセプター数を求める際、Ｄ 値とＧ−ＣＳＦ レセプター数の関係の検量線が必要であるが、常に一定のＧ−ＣＳＦ レセプター数を有する細胞あるいは一定量の蛍光物質を標識した微粒子を入手することは不可能である。そこで、健常人７ 名の好中球におけるＧ−ＣＳＦ レセプター数はスキャッチャード解析法で求めた結果、１ 細胞当たりのＧ−ＣＳＦ レセプター数は１００６〜２３０８個で、その平均が１ 細胞当たり１５０８個であり、そのときのＤ 値が０．７ を示したことから、健常人の好中球のＤ 値は１ 細胞当たり１５０８個のＧ−ＣＳＦ レセプター数とし、それを基に測定対象の細胞のＧ−ＣＳＦ レセプターを求める方法なので、 Ｇ−ＣＳＦレセプターの絶対数を測定できない。
【０００７】
一方、フローサイトメトリーを用いて蛍光標識されたＧ−ＣＳＦ レセプターに対する抗体で細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター検出する方法があるが、定量的測定法としては検量線作成が不可能などの問題から、正確なＧ−ＣＳＦ レセプター数の算出はできない。固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター発現量も、Ｇ−ＣＳＦ による癌細胞の増殖という観点から、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定する必要性があるが、上記のスキャッチャード解析法およびフローサイトメトリーで測定する場合、固型癌を１ 個づつの細胞に調製しないと測定できない。
【０００８】
そこで、癌組織の塊のトリプシンなどでの酵素的処理あるいは鋏やメッシュを用いた機械的処理が必要とするため、細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプターの分解、細胞表面の破壊など処理に伴うＧ−ＣＳＦ レセプター数の減少、標識体の非特異的吸着によるバックグランドの増加などがあり、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数は正確に測定できないのが現状である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来の細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数は放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いてのスキャッチャード解析法または蛍光標識Ｇ−ＣＳＦ を用いてのフローサイトメトリーで測定されているが、細胞採取後の測定までの時間が限定され、多量の細胞数を必要とし、測定精度にも問題がある。また、これらの方法は培養細胞、血液細胞および血液癌細胞のＧ−ＣＳＦ レセプター数は測定可能であるが、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定することは困難であるのが実状である。
【００１０】
本発明の目的は、細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数の測定方法としてＧ−ＣＳＦ レセプターのタンパク質量を測定するのではなく、細胞内のＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡを定量的に測定することにより、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの発現量を調べる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの発現量を知ろうとする細胞の試料からｍＲＮＡを抽出し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターをコードするｍＲＮＡを増幅して当該ｍＲＮＡの量を測定することによりＧ−ＣＳＦ レセプターの発現量を知ることができることを見出した。
【００１２】
従って本発明は、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの測定方法において、
（ａ）ＲＮＡ を含む試料を調製する工程、
（ｂ）該試料中のＲＮＡ に、または該ＲＮＡ を鋳型に作製したｃＤＮＡに、Ｇ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ に特異的なプライマーをハイブリダイズさせ、該Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子を増幅する工程、
（ｃ）増幅された遺伝子に、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子に特異的で且つ標識されたプローブをハイブリダイズさせて、増幅されたＧ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子を測定し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ を算出する工程、
（ｄ）同様にして測定して算出した内部標準のｍＲＮＡ 量と比較してＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ を定量する工程、
（ｅ）定量したＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ 量から細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数を求める工程、
を含んで成る方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては、Ｇ−ＣＳＦ レセプター分子中のＧ−ＣＳＦ 結合部位を含む領域をコードする遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を増幅する。Ｇ−ＣＳＦ 結合部位は配列番号：１及び２において、アミノ酸位置８５〜１９５ の領域であり、これは配列番号：１の塩基番号４９１ 〜８２３ に相当する。従って、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子増幅用の本発明のプライマーは、プライマー自体の配列も含めて、少なくとも塩基番号４９１ 〜８２３ の領域を増幅することができるプライマーが好ましい。しかしながら、必ずしもＧ−ＣＳＦ 結合部位の全長をコードする遺伝子を増幅する必要はなく、例えばＧ−ＣＳＦ 結合部位のＮ−末端及び／又はＣ−末端よりアミノ酸数個分短い領域をコードする遺伝子部分を増幅してもよい。
【００１４】
好ましい態様においては、上流側のプライマーとしては、配列番号：１に記載の塩基配列において、塩基番号２３８ 〜５００ の範囲のいずれかの部位に対応するものであり、下流側のプライマーとしては配列番号：１において塩基番号８１２ 〜１０９９の範囲のいずれかの部位に対応するものであることが好ましい。具体的なプライマーの例としては、５’−ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＴＣ−３’ （配列番号：３）（配列番号：１においてプラスセンス鎖の塩基番号４３８ 〜４５５ ）及び５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣ−３’（配列番号：４）（配列番号：１において、マイナスセンス鎖の塩基番号８３５ 〜８５４ ））を挙げることができる。
プライマーの長さは、１０〜４０塩基の範囲が好ましく、２０〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００１５】
次に、増幅された配列を検出するには、増幅された配列にハイブリダイズすることができる標識されたヌクレオチドプローブを用いることができる。プローブは、上記のプライマーにより増幅される核酸にハイブリダイズするものであればよい。例えば、上流プライマーとして配列番号：１の塩基２３８ から下流に延びるオリゴヌクレオチドを用い、下流プライマーとして塩基１０９９から上流に延びるオリゴヌクレオチドを使用すれば、およそ塩基２３８ 〜１０９９の範囲のいずれかの部位にハイブリダイズするものであればよい。
【００１６】
好ましくは、プローブは配列番号：１の塩基番号４９１ 〜８２３ の範囲のいずれかの部位とハイブリダイズするものである。好ましいプローブの１例としては、５’−ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＴ−３’ （配列番号：５）（配列番号：１中、プラスセンス鎖の塩基番号６１３ 〜６３６ に相当する）を挙げることができる。
プローブの長さとしては、通常１０〜４０塩基であり、好ましくは２０〜３０塩基の長さを有する。
【００１７】
プローブのための標識としては特に限定されず、プローブの標識として常用されているものであればよい。例えば、放射性同位元素、例えば３２Ｐ，３５Ｓ，３ Ｈ，１４Ｃなど；蛍光物質、例えばフルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体、クマリン誘導体、アクリジン誘導体、アントラセン誘導体、エオシン誘導体、ダンシル誘導体、エリスロシン誘導体、ピレン誘導体など；化学発光物質、例えばアクリジニウムエステル誘導体、ルミノール誘導体、キノキサリノン誘導体など；その他の標識、例えばビオチン、酵素、抗体など、使用することができる。プローブのオリゴヌクレオチドに上記の標識を結合させるには、オリゴヌクレオチドを標識するための常法を用いればよい。
【００１８】
目的とするＧ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子をプライマーを用いて増幅するには、試料中のＲＮＡ に基いて逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成した後、このｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅する方法（ＲＴ−ＰＣＲ 法）、試料中のＲＮＡ から対応する２本鎖ＤＮＡ を合成し、転写反応によりｍＲＮＡ を増幅する転写介在増幅法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ； ＴＭＡ） （Ｒ． Ｐｕｓｔｅｒｎｕｃｋ ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３５， ｐ．６７６ （１９９７） ； 特表平４−５００７５９号）、等を用いることができ、これらの増幅方法自体はすでに確立された技術である。
【００１９】
本発明に従ってｍＲＮＡを測定するには、精度及び結果の再現性を確保するために、内部標準鋳型とそれに対応するプライマー及びプローブを用いて、試料の処治と平行して増幅処理を行うのが好ましい。内部標準用核酸としてはβ−アクチンのｍＲＮＡ等を用いることができる。
【００２０】
内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡを用いる場合それを増幅するためのプライマーとしては、例えば５’−ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ−３’ （配列番号：６）（β−アクチン遺伝子のプラスセンス鎖の塩基番号７１４ 〜７３４ ）及び５’−ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＣＡ−３’ （配列番号：７）（β−アクチン遺伝子のマイナスセンス鎖の塩基番号９６８ 〜９８８ ）を用いることができる。また、増幅された配列を検出するためのプローブとしては、５’−ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＡ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＴＣ Ｃ−３’ （配列番号：８）（β−アクチンの遺伝子のプラスセンス鎖の塩基番号８６０ 〜８８４ ）を用いることができる。
内部標準についての提供は、Ｇ−ＣＳＦ レセプター遺伝子の増幅操作と同様に行えばよい。
【００２１】
本発明のＧ−ＣＳＦ レセプターの発現の測定の対象となる組織や細胞としては、癌組織、血液細胞、骨髄細胞、培養細胞株などが挙げられる。
癌組織、血液細胞、骨髄細胞および培養細胞株からのｍＲＮＡ抽出はそれぞれの材料を粉砕し、得られるライセートから全ＲＮＡ を抽出後にｍＲＮＡを単離する。
【００２２】
例えば、癌組織（０．０５〜２ ｇ ）は鋏で細かくし、組織１ ｇ に対して１０ ｍｌ の変性溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）を加え、ホモジナイザーまたはポリトロンでホモジネートを調製して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。末梢血液または骨髄液はその１０ ｍｌ にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）１０ ｍｌ を混和後、その５ｍｌをリンフォプレップ５ ｍｌに重層し、１２００ ｒｐｍ、２０分間、２５℃で遠心して単核球層の細胞を採取する。ＰＢＳ で該細胞を洗浄し、１ ×１０７ 〜１ ×１０８ 個の細胞に対して８ ｍｌの変性溶液を加え、攪拌して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。培養細胞株は培養液を遠心で除き、ＰＢＳ で洗浄後、１ ×１０７ 〜１ ×１０８ 個の細胞に対して８ ｍｌの変性溶液を加え、攪拌して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によりさらに詳しく本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
（１）プライマー及びプローブの調製
Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして、 Ｇ−ＣＳＦレセプターの４３８−４５５ 番目（プラスセンス鎖）および８５４−８７３ 番目（マイナスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプライマーを合成した。
５’−ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＴＣ−３’ （配列番号：３）
５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣ−３’（配列番号：４）
【００２４】
また、内部標準とするβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ 用プライマーとして、β−アクチンの７１４ 〜７３４ 番目（プラスセンス鎖）および９６８ 〜９８８ 番目（マイナスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプライマーを合成した。
５’−ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ−３’ （配列番号：６）
５’−ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＣＡ−３’ （配列番号：７）
さらに、得られるＰＣＲ 増幅産物検出のために、以下の遺伝子配列を有するプローブを合成した。この際に、アミノ基を有するリンカー・アームを特定の位置に挿入して、合成の後化学発光物質であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）を標識して検出用プローブとして用いた。
【００２５】
Ｇ−ＣＳＦ レセプター遺伝子増幅産物検出のためのプローブとして、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの６１３ 〜６３６ 番目（プラスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプローブを合成した。
５’−ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＣＴ ＃ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＴ−３’（配列番号：５）
（＃：リンカー・アーム挿入位置）
β−アクチン遺伝子増幅産物検出のためのプローブとして、β−アクチンの８６０ 〜８８４ 番目（プラスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプローブを合成した。
５’−ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＡ ＡＡＣ Ｔ＃ＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＴＣ Ｃ−３’（配列番号：８）
（＃：リンカー・アーム挿入位置）
【００２６】
（２）ＲＮＡ の抽出
急性骨髄性白血病患者の血液から次のようにして癌細胞を分離した。
ヘパリン採取した血液に、同量のリン酸緩衝生理食塩水を混和し、その５ｍｌをリンホプレップ５ｍｌに重層した後、２５℃、１２００ ｒｐｍで２０分間遠心した。 中間層 ある単核細胞分画を採取し、 その単核細胞分画１ｍｌに１０％ヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水９ｍｌを混和後、４℃、１５００ ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去 、沈殿した細胞に１０％ＦＢＳ を含むＩＭＤＭ１ｍｌを加え、細胞を懸濁して細胞数を求め、癌細胞試料とした。
【００２７】
全ＲＮＡ の抽出は全ＲＮＡ 抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて行った。すなわち、癌細胞試料にフェノールークロロホルム混液を加え、激しく１ 分間攪拌した後、氷中に５ 〜１５分間放置し、１００００ 〜１２０００ ×ｇ で５ 〜１５分間遠心した。上清の水層を別の試験管へ移し、水層容量の１／１０の酢酸ナトリウム溶液を加えて攪拌後、フェノールークロロホルム混液を加え、激しく１ 分間攪拌した。氷中に５ 〜１５分間放置し、１００００ 〜１２０００ ×ｇ で５ 〜１５分間遠心後、上清の水層を別の試験管へ移し、同量のイソプロパノールを加え、よく攪拌した。−２０ ℃で少なくとも０．５ 〜１ 時間放置し、ＲＮＡ を沈殿させた。１００００ 〜１２０００ ×ｇ で１５〜２０分間遠心して上清を除き、１０７ 個の細胞に対して０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ／Ｒｎａｓｅ 除去蒸留水５０〜１００ μｌ で懸濁し、７０℃で３ 分間または５５〜７０℃で１０〜２０分間加熱溶解後、２６０ ｎｍにおける吸光度を測定して抽出全ＲＮＡ 量を求めた。
【００２８】
ｍＲＮＡの単離はｍＲＮＡ単離キット（Ｎｏｖａｇｅｎ 社）を用いて行った。すなわち、オリゴｄＴ結合磁気粒子（ｍＲＮＡ ２．５μｇ に対して磁気粒子１ ｍｇ）が入った試験管に抽出した全ＲＮＡ 溶液０．２ ｍｌと溶解溶液／１Ｍ ＤＴＴ ０．８ ｍｌ を加え、室温５ 分間放置後、磁気粒子分離スタンドに立て、上清を除いた。溶解溶液／１Ｍ ＤＴＴで２ 回洗浄する。 ＲＮａｓｅ除去蒸留水５００ μｌ を加え、よく攪拌し、水浴中７０℃で１０分間加温後、磁気粒子分離スタンドに立て、上清を別の試験管に移した。イソプロパノール３３１ μｌ 、グリコーゲン２ μｌ および３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−８０ ℃で２ 時間以上放置後、１４０００ ｒｐｍ 、１０分間、４ ℃で遠心し、上清を除き、７０％ エタノール３００ μｌ を加え、１４０００ ｒｐｍ 、１０分間、４ ℃で遠心する。上清を除き、ＤＥＰＣ処理水５０μｌ で溶解する。２６０ ｎｍにおける吸光度を測定して単離したｍＲＮＡ量を求めた。
【００２９】
（３）ｍＲＮＡ からの核酸の増幅
ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡ ＰＣＲ キット（宝酒造（株））を用いて行った。すなわち、下記の組成に単離したｍＲＮＡを加え、サーマルサイクラーにて４２℃で３０分間、９９℃で５ 分間および５ ℃５ 分間反応させ、相補的ＤＮＡ を得た。
サンプル（ｍＲＮＡ １００ ｎｇ） １ μｌ
ＭｇＣｌ２ ２０μｌ
ＲＮＡ ＰＣＲ 緩衝液 １０μｌ
ＲＮａｓｅ 不含水 ４６．５μｌ
ｄＮＴＰ 混合物 １０μｌ
ＲＮａｓｅ インヒビター ２．５μｌ
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ダイマー ５μｌ
逆転写酵素 ５μｌ
合計 １００μｌ
【００３０】
上記で得られた相補的ＤＮＡ ２０μｌ およびプライマー（Ｇ−ＣＳＦ レセプターおよびβ−アクチンのｃＤＮＡ増幅用プライマー）を含む下記組成８０μｌ を混和後、サーマルサイクラーを用いて９４℃で２ 分間加温した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２ 分間の繰り返しを３０〜５０サイクル行い、４ ℃で保存した。
ＭｇＣｌ２ ６ μｌ
ＲＮＡ ＰＣＲ 緩衝液 ８ μｌ
Ｈ２Ｏ ６３．５ μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５ μｌ
プライマー （＋） １μｌ
プライマー （−） １μｌ
合計 ８０μｌ
【００３１】
（４）増幅産物の検出
ＰＣＲ 増幅産物を蒸留水にて２５倍に希釈し９７℃で１０分間熱変性した後、素早く氷冷し、サンプルとして用いる。ＡＥ標識プローブ溶液をハイブリダイズ用緩衝液にて１．２８×１０５ｒｌｕ／ｍｌ に調製し、その５０μｌを上記サンプル５０μｌに添加して全容を１００ μｌとした。反応チューブ内でサンプルとＡＥ標識プローブの混液を５０℃で３０分間水浴を用いて加温した。
【００３２】
上記チューブを水浴から取り出し、加水分解試薬 ３００μｌを添加、撹拌して更に５０℃で１５分間反応させた。上記チューブを５分間氷冷した後室温に戻し、化学発光検出装置Ｌｅａｄｅｒ ５０（中外診断科学）を用いて化学発光強度を測定した。上記ＰＣＲ 増幅産物のサンプル５０μｌとβ−アクチンＤＮＡ 検出用ＡＥ標識プローブを用いて上記と同様の操作を行い、β−アクチンのＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度に対する比として求めた。
【００３３】
（５）Ｇ−ＣＳＦ レセプター数の算出
細胞に発現されているＧ−ＣＳＦ レセプター数はＳｈｉｎｊｏらが報告しているフローサイトメトリー（Ｋ．Ｓｈｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ９１，７８３（１９９５） ）に従い測定した。すなわち、実施例２で末梢血液または骨髄液から得られた単核球層の細胞にビオチン標識Ｇ−ＣＳＦ を加え、氷中で１時間放置後、２％ ＦＣＳを含むＰＢＳ で細胞を洗浄する。ＲＥＤ６７０− アビジンを添加して氷中で１時間放置し、２％ ＦＣＳを含むＰＢＳ で細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ で細胞の蛍光強度を測定した。目的の細胞を５０００個選び、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ ｔｅｓｔ からＤ 値を計算し、そのＤ 値から細胞１ 個当たり発現しているＧ−ＣＳＦ レセプター数を求めた。
【００３４】
急性骨髄性白血病患者の血液から前記の方法で癌細胞を分離し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量（β−アクチンＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度に対するＧ−ＣＳＦ レセプターＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度の比）を求め、また、同じ癌細胞をフローサイトメトリーで細胞１個当たりのＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定した結果と対比したところ、第１図に示すように両者は直線的相関関係があった。このことから、細胞内Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量は細胞上にタンパクとして発現されているＧ−ＣＳＦ レセプターを表しており、細胞上のＧ−ＣＳＦ レセプター数はＧ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量を測定することにより推定できることが確認された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の測定方法は従来のＧ−ＣＳＦ レセプター数の測定方法に比べ簡便性、測定感度および精度において優れている上に、測定に必要とする細胞数が少ないことから採血量の低減など患者への負担が減少され、さらに血液細胞以外にも固型癌にも使用できる効果を有する。
【００３６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はフローサイトメトリー法により測定したＧ−ＣＳＦ レセプターの数と本発明の方法により測定したｍＲＮＡの量（β−アクチンｍＲＮＡの化学発光強度に対するＧ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡの化学発光強度の比）が直線関係を有することを示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は血液細胞または固形癌細胞表面などに発現されているＧ−ＣＳＦ レセプターの数を測定するものであり、癌細胞増殖の要因、治療上の指標として臨床検査の分野で利用される。
【０００２】
【従来の技術】
一般的に細胞表面に存在するホルモン、サイトカインなどのレセプターの個数および親和性は放射性同位元素で標識されたホルモン、サイトカインなどのレセプターへの結合量を測定し、スキャッチャード解析法（Ｇ． Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１， ６６０（１９４９）， Ｊ．Ｃ．Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｅｍ．Ｊ．，２１２，２５９ （１９８３））を用いて調べられている。顆粒球・コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ レセプター）においても、細胞表面にＧ−ＣＳＦ レセプターが存在するとその細胞がＧ−ＣＳＦ に応答し、増殖または分化することから、それの指標とするために放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いてレセプターの個数および親和性がスキャッチャード解析法で調べられている（Ｎ．Ａ．Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２４，３１３（１９８５）， Ｌ．Ｍ．Ｂｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ，７４，２６６８（１９８９） ）。
【０００３】
このスキャッチャード解析法では放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いるが、生体内に存在する天然型Ｇ−ＣＳＦ と同じアミノ酸配列の遺伝子工学的に製造されたＧ−ＣＳＦ に１２５Ｉを標識するとＧ−ＣＳＦ の生物活性が失われることから、緩和な標識法での１２５Ｉ標識または遺伝子工学的に一部アミノ酸配列を変えて製造したＧ−ＣＳＦ に１２５Ｉ標識されている。これらの１２５Ｉ標識Ｇ−ＣＳＦ はレセプターへの親和性が天然型Ｇ−ＣＳＦ と異なる可能性が大きい。また、１２５Ｉ標識Ｇ−ＣＳＦ は細胞に非特異的吸着し、バックグランドが大きいため、その非特異的吸着が細胞表面に少量存在するＧ−ＣＳＦ レセプターの個数を調べる際に測定へ影響する。
【０００４】
このように、生物活性を保持した１２５Ｉ標識天然型Ｇ−ＣＳＦ の調製は不可能であり、スキャッチャード解析法での正確なレセプターの個数および親和性の測定は困難である。一方、スキャッチャード解析法に必要とする細胞数は１０８ 個であり、この細胞数を得るには多量の血液または骨髄液を採取しなければならないので、患者への負担が大きい。また、生きた細胞を用いるため、測定までの時間に制限があり、操作によるバラツキが非常に大く、レセプターの個数および親和性の測定は正確性に欠ける。
【０００５】
最近、これらを解決するため、蛍光物質標識Ｇ−ＣＳＦ を用いた自動細胞解析装置（フローサイトメトリー）でＧ−ＣＳＦ レセプターの個数を調べる方法が報告されている（Ｋ．Ｓｈｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ９１，７８３（１９９５） ）。この方法は使用細胞数が少量ですみ、患者への負担が小さく、放射性同位元素を用いないので特別な施設を必要とせず、生物活性を損なうことが少ない蛍光物質で標識されたＧ−ＣＳＦ を使用できる利点がある。Ｇ−ＣＳＦ レセプターの個数をフローサイトメトリーで測定する方法においては、細胞のＧ−ＣＳＦ レセプターに特異的に結合した蛍光標識Ｇ−ＣＳＦ の量により蛍光強度が増加するので、対照から蛍光強度が変化した量をＤ 値として算出し、そのＤ 値とＧ−ＣＳＦ レセプター数が直線関係にあるので、Ｄ 値からＧ−ＣＳＦ レセプター数を求めることができる。
【０００６】
しかし、得られたＤ 値からＧ−ＣＳＦ レセプター数を求める際、Ｄ 値とＧ−ＣＳＦ レセプター数の関係の検量線が必要であるが、常に一定のＧ−ＣＳＦ レセプター数を有する細胞あるいは一定量の蛍光物質を標識した微粒子を入手することは不可能である。そこで、健常人７ 名の好中球におけるＧ−ＣＳＦ レセプター数はスキャッチャード解析法で求めた結果、１ 細胞当たりのＧ−ＣＳＦ レセプター数は１００６〜２３０８個で、その平均が１ 細胞当たり１５０８個であり、そのときのＤ 値が０．７ を示したことから、健常人の好中球のＤ 値は１ 細胞当たり１５０８個のＧ−ＣＳＦ レセプター数とし、それを基に測定対象の細胞のＧ−ＣＳＦ レセプターを求める方法なので、 Ｇ−ＣＳＦレセプターの絶対数を測定できない。
【０００７】
一方、フローサイトメトリーを用いて蛍光標識されたＧ−ＣＳＦ レセプターに対する抗体で細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター検出する方法があるが、定量的測定法としては検量線作成が不可能などの問題から、正確なＧ−ＣＳＦ レセプター数の算出はできない。固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター発現量も、Ｇ−ＣＳＦ による癌細胞の増殖という観点から、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定する必要性があるが、上記のスキャッチャード解析法およびフローサイトメトリーで測定する場合、固型癌を１ 個づつの細胞に調製しないと測定できない。
【０００８】
そこで、癌組織の塊のトリプシンなどでの酵素的処理あるいは鋏やメッシュを用いた機械的処理が必要とするため、細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプターの分解、細胞表面の破壊など処理に伴うＧ−ＣＳＦ レセプター数の減少、標識体の非特異的吸着によるバックグランドの増加などがあり、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数は正確に測定できないのが現状である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
このように従来の細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数は放射性同位元素で標識されたＧ−ＣＳＦ を用いてのスキャッチャード解析法または蛍光標識Ｇ−ＣＳＦ を用いてのフローサイトメトリーで測定されているが、細胞採取後の測定までの時間が限定され、多量の細胞数を必要とし、測定精度にも問題がある。また、これらの方法は培養細胞、血液細胞および血液癌細胞のＧ−ＣＳＦ レセプター数は測定可能であるが、固型癌のＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定することは困難であるのが実状である。
【００１０】
本発明の目的は、細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数の測定方法としてＧ−ＣＳＦ レセプターのタンパク質量を測定するのではなく、細胞内のＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡを定量的に測定することにより、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの発現量を調べる方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を行った結果、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの発現量を知ろうとする細胞の試料からｍＲＮＡを抽出し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターをコードするｍＲＮＡを増幅して当該ｍＲＮＡの量を測定することによりＧ−ＣＳＦ レセプターの発現量を知ることができることを見出した。
【００１２】
従って本発明は、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの測定方法において、
（ａ）ＲＮＡ を含む試料を調製する工程、
（ｂ）該試料中のＲＮＡ に、または該ＲＮＡ を鋳型に作製したｃＤＮＡに、Ｇ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ に特異的なプライマーをハイブリダイズさせ、該Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子を増幅する工程、
（ｃ）増幅された遺伝子に、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子に特異的で且つ標識されたプローブをハイブリダイズさせて、増幅されたＧ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子を測定し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ を算出する工程、
（ｄ）同様にして測定して算出した内部標準のｍＲＮＡ 量と比較してＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ を定量する工程、
（ｅ）定量したＧ−ＣＳＦ レセプターのｍＲＮＡ 量から細胞表面のＧ−ＣＳＦ レセプター数を求める工程、
を含んで成る方法を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の方法においては、Ｇ−ＣＳＦ レセプター分子中のＧ−ＣＳＦ 結合部位を含む領域をコードする遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を増幅する。Ｇ−ＣＳＦ 結合部位は配列番号：１及び２において、アミノ酸位置８５〜１９５ の領域であり、これは配列番号：１の塩基番号４９１ 〜８２３ に相当する。従って、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子増幅用の本発明のプライマーは、プライマー自体の配列も含めて、少なくとも塩基番号４９１ 〜８２３ の領域を増幅することができるプライマーが好ましい。しかしながら、必ずしもＧ−ＣＳＦ 結合部位の全長をコードする遺伝子を増幅する必要はなく、例えばＧ−ＣＳＦ 結合部位のＮ−末端及び／又はＣ−末端よりアミノ酸数個分短い領域をコードする遺伝子部分を増幅してもよい。
【００１４】
好ましい態様においては、上流側のプライマーとしては、配列番号：１に記載の塩基配列において、塩基番号２３８ 〜５００ の範囲のいずれかの部位に対応するものであり、下流側のプライマーとしては配列番号：１において塩基番号８１２ 〜１０９９の範囲のいずれかの部位に対応するものであることが好ましい。具体的なプライマーの例としては、５’−ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＴＣ−３’ （配列番号：３）（配列番号：１においてプラスセンス鎖の塩基番号４３８ 〜４５５ ）及び５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣ−３’（配列番号：４）（配列番号：１において、マイナスセンス鎖の塩基番号８３５ 〜８５４ ））を挙げることができる。
プライマーの長さは、１０〜４０塩基の範囲が好ましく、２０〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドがより好ましい。
【００１５】
次に、増幅された配列を検出するには、増幅された配列にハイブリダイズすることができる標識されたヌクレオチドプローブを用いることができる。プローブは、上記のプライマーにより増幅される核酸にハイブリダイズするものであればよい。例えば、上流プライマーとして配列番号：１の塩基２３８ から下流に延びるオリゴヌクレオチドを用い、下流プライマーとして塩基１０９９から上流に延びるオリゴヌクレオチドを使用すれば、およそ塩基２３８ 〜１０９９の範囲のいずれかの部位にハイブリダイズするものであればよい。
【００１６】
好ましくは、プローブは配列番号：１の塩基番号４９１ 〜８２３ の範囲のいずれかの部位とハイブリダイズするものである。好ましいプローブの１例としては、５’−ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＴ−３’ （配列番号：５）（配列番号：１中、プラスセンス鎖の塩基番号６１３ 〜６３６ に相当する）を挙げることができる。
プローブの長さとしては、通常１０〜４０塩基であり、好ましくは２０〜３０塩基の長さを有する。
【００１７】
プローブのための標識としては特に限定されず、プローブの標識として常用されているものであればよい。例えば、放射性同位元素、例えば３２Ｐ，３５Ｓ，３ Ｈ，１４Ｃなど；蛍光物質、例えばフルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体、クマリン誘導体、アクリジン誘導体、アントラセン誘導体、エオシン誘導体、ダンシル誘導体、エリスロシン誘導体、ピレン誘導体など；化学発光物質、例えばアクリジニウムエステル誘導体、ルミノール誘導体、キノキサリノン誘導体など；その他の標識、例えばビオチン、酵素、抗体など、使用することができる。プローブのオリゴヌクレオチドに上記の標識を結合させるには、オリゴヌクレオチドを標識するための常法を用いればよい。
【００１８】
目的とするＧ−ＣＳＦ レセプターの遺伝子をプライマーを用いて増幅するには、試料中のＲＮＡ に基いて逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成した後、このｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により増幅する方法（ＲＴ−ＰＣＲ 法）、試料中のＲＮＡ から対応する２本鎖ＤＮＡ を合成し、転写反応によりｍＲＮＡ を増幅する転写介在増幅法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ； ＴＭＡ） （Ｒ． Ｐｕｓｔｅｒｎｕｃｋ ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３５， ｐ．６７６ （１９９７） ； 特表平４−５００７５９号）、等を用いることができ、これらの増幅方法自体はすでに確立された技術である。
【００１９】
本発明に従ってｍＲＮＡを測定するには、精度及び結果の再現性を確保するために、内部標準鋳型とそれに対応するプライマー及びプローブを用いて、試料の処治と平行して増幅処理を行うのが好ましい。内部標準用核酸としてはβ−アクチンのｍＲＮＡ等を用いることができる。
【００２０】
内部標準としてβ−アクチンのｍＲＮＡを用いる場合それを増幅するためのプライマーとしては、例えば５’−ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ−３’ （配列番号：６）（β−アクチン遺伝子のプラスセンス鎖の塩基番号７１４ 〜７３４ ）及び５’−ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＣＡ−３’ （配列番号：７）（β−アクチン遺伝子のマイナスセンス鎖の塩基番号９６８ 〜９８８ ）を用いることができる。また、増幅された配列を検出するためのプローブとしては、５’−ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＡ ＡＡＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＴＣ Ｃ−３’ （配列番号：８）（β−アクチンの遺伝子のプラスセンス鎖の塩基番号８６０ 〜８８４ ）を用いることができる。
内部標準についての提供は、Ｇ−ＣＳＦ レセプター遺伝子の増幅操作と同様に行えばよい。
【００２１】
本発明のＧ−ＣＳＦ レセプターの発現の測定の対象となる組織や細胞としては、癌組織、血液細胞、骨髄細胞、培養細胞株などが挙げられる。
癌組織、血液細胞、骨髄細胞および培養細胞株からのｍＲＮＡ抽出はそれぞれの材料を粉砕し、得られるライセートから全ＲＮＡ を抽出後にｍＲＮＡを単離する。
【００２２】
例えば、癌組織（０．０５〜２ ｇ ）は鋏で細かくし、組織１ ｇ に対して１０ ｍｌ の変性溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）を加え、ホモジナイザーまたはポリトロンでホモジネートを調製して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。末梢血液または骨髄液はその１０ ｍｌ にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ）１０ ｍｌ を混和後、その５ｍｌをリンフォプレップ５ ｍｌに重層し、１２００ ｒｐｍ、２０分間、２５℃で遠心して単核球層の細胞を採取する。ＰＢＳ で該細胞を洗浄し、１ ×１０７ 〜１ ×１０８ 個の細胞に対して８ ｍｌの変性溶液を加え、攪拌して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。培養細胞株は培養液を遠心で除き、ＰＢＳ で洗浄後、１ ×１０７ 〜１ ×１０８ 個の細胞に対して８ ｍｌの変性溶液を加え、攪拌して、全ＲＮＡ 抽出試料とする。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例によりさらに詳しく本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
（１）プライマー及びプローブの調製
Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ用プライマーとして、 Ｇ−ＣＳＦレセプターの４３８−４５５ 番目（プラスセンス鎖）および８５４−８７３ 番目（マイナスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプライマーを合成した。
５’−ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＴＣ−３’ （配列番号：３）
５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＴＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣ−３’（配列番号：４）
【００２４】
また、内部標準とするβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ 用プライマーとして、β−アクチンの７１４ 〜７３４ 番目（プラスセンス鎖）および９６８ 〜９８８ 番目（マイナスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプライマーを合成した。
５’−ＣＡＡ ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＧＣＴ−３’ （配列番号：６）
５’−ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＣＧ ＧＣＡ−３’ （配列番号：７）
さらに、得られるＰＣＲ 増幅産物検出のために、以下の遺伝子配列を有するプローブを合成した。この際に、アミノ基を有するリンカー・アームを特定の位置に挿入して、合成の後化学発光物質であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）を標識して検出用プローブとして用いた。
【００２５】
Ｇ−ＣＳＦ レセプター遺伝子増幅産物検出のためのプローブとして、Ｇ−ＣＳＦ レセプターの６１３ 〜６３６ 番目（プラスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプローブを合成した。
５’−ＴＧＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＣＣＴ ＃ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＴＴ−３’（配列番号：５）
（＃：リンカー・アーム挿入位置）
β−アクチン遺伝子増幅産物検出のためのプローブとして、β−アクチンの８６０ 〜８８４ 番目（プラスセンス鎖）の遺伝子配列に相当する下記の遺伝子配列を有するプローブを合成した。
５’−ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＧＡ ＡＡＣ Ｔ＃ＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＣＴＣ Ｃ−３’（配列番号：８）
（＃：リンカー・アーム挿入位置）
【００２６】
（２）ＲＮＡ の抽出
急性骨髄性白血病患者の血液から次のようにして癌細胞を分離した。
ヘパリン採取した血液に、同量のリン酸緩衝生理食塩水を混和し、その５ｍｌをリンホプレップ５ｍｌに重層した後、２５℃、１２００ ｒｐｍで２０分間遠心した。 中間層 ある単核細胞分画を採取し、 その単核細胞分画１ｍｌに１０％ヒト血清を含むリン酸緩衝生理食塩水９ｍｌを混和後、４℃、１５００ ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去 、沈殿した細胞に１０％ＦＢＳ を含むＩＭＤＭ１ｍｌを加え、細胞を懸濁して細胞数を求め、癌細胞試料とした。
【００２７】
全ＲＮＡ の抽出は全ＲＮＡ 抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて行った。すなわち、癌細胞試料にフェノールークロロホルム混液を加え、激しく１ 分間攪拌した後、氷中に５ 〜１５分間放置し、１００００ 〜１２０００ ×ｇ で５ 〜１５分間遠心した。上清の水層を別の試験管へ移し、水層容量の１／１０の酢酸ナトリウム溶液を加えて攪拌後、フェノールークロロホルム混液を加え、激しく１ 分間攪拌した。氷中に５ 〜１５分間放置し、１００００ 〜１２０００ ×ｇ で５ 〜１５分間遠心後、上清の水層を別の試験管へ移し、同量のイソプロパノールを加え、よく攪拌した。−２０ ℃で少なくとも０．５ 〜１ 時間放置し、ＲＮＡ を沈殿させた。１００００ 〜１２０００ ×ｇ で１５〜２０分間遠心して上清を除き、１０７ 個の細胞に対して０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ／Ｒｎａｓｅ 除去蒸留水５０〜１００ μｌ で懸濁し、７０℃で３ 分間または５５〜７０℃で１０〜２０分間加熱溶解後、２６０ ｎｍにおける吸光度を測定して抽出全ＲＮＡ 量を求めた。
【００２８】
ｍＲＮＡの単離はｍＲＮＡ単離キット（Ｎｏｖａｇｅｎ 社）を用いて行った。すなわち、オリゴｄＴ結合磁気粒子（ｍＲＮＡ ２．５μｇ に対して磁気粒子１ ｍｇ）が入った試験管に抽出した全ＲＮＡ 溶液０．２ ｍｌと溶解溶液／１Ｍ ＤＴＴ ０．８ ｍｌ を加え、室温５ 分間放置後、磁気粒子分離スタンドに立て、上清を除いた。溶解溶液／１Ｍ ＤＴＴで２ 回洗浄する。 ＲＮａｓｅ除去蒸留水５００ μｌ を加え、よく攪拌し、水浴中７０℃で１０分間加温後、磁気粒子分離スタンドに立て、上清を別の試験管に移した。イソプロパノール３３１ μｌ 、グリコーゲン２ μｌ および３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、−８０ ℃で２ 時間以上放置後、１４０００ ｒｐｍ 、１０分間、４ ℃で遠心し、上清を除き、７０％ エタノール３００ μｌ を加え、１４０００ ｒｐｍ 、１０分間、４ ℃で遠心する。上清を除き、ＤＥＰＣ処理水５０μｌ で溶解する。２６０ ｎｍにおける吸光度を測定して単離したｍＲＮＡ量を求めた。
【００２９】
（３）ｍＲＮＡ からの核酸の増幅
ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡ ＰＣＲ キット（宝酒造（株））を用いて行った。すなわち、下記の組成に単離したｍＲＮＡを加え、サーマルサイクラーにて４２℃で３０分間、９９℃で５ 分間および５ ℃５ 分間反応させ、相補的ＤＮＡ を得た。
サンプル（ｍＲＮＡ １００ ｎｇ） １ μｌ
ＭｇＣｌ２ ２０μｌ
ＲＮＡ ＰＣＲ 緩衝液 １０μｌ
ＲＮａｓｅ 不含水 ４６．５μｌ
ｄＮＴＰ 混合物 １０μｌ
ＲＮａｓｅ インヒビター ２．５μｌ
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ ダイマー ５μｌ
逆転写酵素 ５μｌ
合計 １００μｌ
【００３０】
上記で得られた相補的ＤＮＡ ２０μｌ およびプライマー（Ｇ−ＣＳＦ レセプターおよびβ−アクチンのｃＤＮＡ増幅用プライマー）を含む下記組成８０μｌ を混和後、サーマルサイクラーを用いて９４℃で２ 分間加温した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２ 分間の繰り返しを３０〜５０サイクル行い、４ ℃で保存した。
ＭｇＣｌ２ ６ μｌ
ＲＮＡ ＰＣＲ 緩衝液 ８ μｌ
Ｈ２Ｏ ６３．５ μｌ
Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ ０．５ μｌ
プライマー （＋） １μｌ
プライマー （−） １μｌ
合計 ８０μｌ
【００３１】
（４）増幅産物の検出
ＰＣＲ 増幅産物を蒸留水にて２５倍に希釈し９７℃で１０分間熱変性した後、素早く氷冷し、サンプルとして用いる。ＡＥ標識プローブ溶液をハイブリダイズ用緩衝液にて１．２８×１０５ｒｌｕ／ｍｌ に調製し、その５０μｌを上記サンプル５０μｌに添加して全容を１００ μｌとした。反応チューブ内でサンプルとＡＥ標識プローブの混液を５０℃で３０分間水浴を用いて加温した。
【００３２】
上記チューブを水浴から取り出し、加水分解試薬 ３００μｌを添加、撹拌して更に５０℃で１５分間反応させた。上記チューブを５分間氷冷した後室温に戻し、化学発光検出装置Ｌｅａｄｅｒ ５０（中外診断科学）を用いて化学発光強度を測定した。上記ＰＣＲ 増幅産物のサンプル５０μｌとβ−アクチンＤＮＡ 検出用ＡＥ標識プローブを用いて上記と同様の操作を行い、β−アクチンのＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度に対する比として求めた。
【００３３】
（５）Ｇ−ＣＳＦ レセプター数の算出
細胞に発現されているＧ−ＣＳＦ レセプター数はＳｈｉｎｊｏらが報告しているフローサイトメトリー（Ｋ．Ｓｈｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ９１，７８３（１９９５） ）に従い測定した。すなわち、実施例２で末梢血液または骨髄液から得られた単核球層の細胞にビオチン標識Ｇ−ＣＳＦ を加え、氷中で１時間放置後、２％ ＦＣＳを含むＰＢＳ で細胞を洗浄する。ＲＥＤ６７０− アビジンを添加して氷中で１時間放置し、２％ ＦＣＳを含むＰＢＳ で細胞を洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ で細胞の蛍光強度を測定した。目的の細胞を５０００個選び、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ ｔｅｓｔ からＤ 値を計算し、そのＤ 値から細胞１ 個当たり発現しているＧ−ＣＳＦ レセプター数を求めた。
【００３４】
急性骨髄性白血病患者の血液から前記の方法で癌細胞を分離し、Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量（β−アクチンＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度に対するＧ−ＣＳＦ レセプターＰＣＲ 増幅産物の化学発光強度の比）を求め、また、同じ癌細胞をフローサイトメトリーで細胞１個当たりのＧ−ＣＳＦ レセプター数を測定した結果と対比したところ、第１図に示すように両者は直線的相関関係があった。このことから、細胞内Ｇ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量は細胞上にタンパクとして発現されているＧ−ＣＳＦ レセプターを表しており、細胞上のＧ−ＣＳＦ レセプター数はＧ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡ量を測定することにより推定できることが確認された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の測定方法は従来のＧ−ＣＳＦ レセプター数の測定方法に比べ簡便性、測定感度および精度において優れている上に、測定に必要とする細胞数が少ないことから採血量の低減など患者への負担が減少され、さらに血液細胞以外にも固型癌にも使用できる効果を有する。
【００３６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はフローサイトメトリー法により測定したＧ−ＣＳＦ レセプターの数と本発明の方法により測定したｍＲＮＡの量（β−アクチンｍＲＮＡの化学発光強度に対するＧ−ＣＳＦ レセプターｍＲＮＡの化学発光強度の比）が直線関係を有することを示すグラフである。
Claims (9)
- 顆粒球コロニー刺激因子受容体 (G-CSF レセプター）の測定方法において、
（ａ） RNA を含む試料を調製する工程；
（ｂ）上記試料中の G-CSF レセプターの mRNA を定量する工程；及び
（ｃ）上記（ｂ）で定量した G-CSF レセプターの mRNA 量から細胞表面の G-CSF レセプター数を求める工程；
を含んで成る方法。 - 顆粒球コロニー刺激因子受容体(G-CSFレセプター）の測定方法において、
（ａ）RNA を含む試料を調製する工程、
（ｂ）該試料中のRNA に、または該RNA を鋳型に作製したcDNAに、G-CSF レセプターのｍRNA に特異的なプライマーをハイブリダイゼさせ、該G-CSF レセプターの遺伝子を増幅する工程、
（ｃ）増幅された遺伝子に、G-CSF レセプターの遺伝子に特異的で且つ標識されたプローブをハイブリダイズさせて、増幅されたG-CSF レセプターの遺伝子を測定し、G-CSF レセプターのｍRNA を算出する工程、
（ｄ）同様にして測定して算出した内部標準のｍRNA 量と比較してG-CSF レセプターのｍRNA を定量する工程、および
（ｅ）定量したG-CSF レセプターのｍRNA 量から細胞表面のG-CSF レセプター数を求める工程、
を含んで成る方法。 - 前記遺伝子の増幅を、RT−PCR 法または TMA法で行う請求項２記載の方法。
- 前記標識を放射性同位元素、蛍光物質または発光物質で行う請求項２記載の方法。
- 前記プライマーが、G-CSF レセプターのG-CSF 結合部位を実質上含む領域を増幅するように選ばれる２つのプライマーからなる請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
- 前記プライマーが、配列番号：１に示すG-CSF レセプターのDNA の塩基配列第 491番から 823番を含む領域を増幅するように選ばれる２つのプライマーからなる請求項２記載の方法。
- 前記プライマーが、配列番号：１に示すそれぞれ、G-CSF レセプターのDNA の塩基配列第 238番から 500番までの間のいずれかの位置および塩基配列第 812番から1099番までの間のいずれかの位置に対応する２つのプライマーである請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
- プローブが、配列番号：１に示すG-CSF レセプターのDNA の塩基配列第 491番から 823番を含む領域から選択されるものである請求項２記載の方法。
- 細胞表面のG-CSF レセプター数を、予め作成しておいたG-CSF レセプターのｍRNA 量と細胞表面のG-CSF レセプター数との検量線から求めることからなる請求項１又は２記載の方法。
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