JP3566984B2 - Bone formation promoter - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨形成促進剤に関する。さらに詳細には、本発明はビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビスホスホン酸は、生体内に存在するピロ燐酸の誘導体で、強力な骨吸収抑制作用を有し〔Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ−ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ， Ｂｏｎｅ １９８７， ８（ｓｕｐｐｌ．１）； Ｓ２３−Ｓ２８〕、パジェット（Ｐａｇｅｔ’ｓ）病（Ｋａｎｉｓ ＪＡ． Ｄｒａｇｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ，Ｌｏｎｄｏｎ ，Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ．，１９９１，１５９，２１６ ）、がんの骨転移や悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症（Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ．， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｅｒｃａｌｃａｅｍｉｃ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｄｒｕｇｓ １９９１，４２，９１９−９４４） および骨粗鬆症（Ｗａｔｔｓ ＮＢ， Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｃｙｃｌｉｃａｌ ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９０，３２３，７３−７９等）における骨溶解の制御または骨量減少の抑制に効果的に使われてきた。
【０００３】
そのようなビスホスホン酸の一つである４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート）もまた強力な骨吸収抑制剤であることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｓａｔｏ Ｍ，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｏｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ ａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．，１９９０，５，３１−４０）、実験動物（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＤＤ，Ｓｅｅｄｅｒ ＪＧ，Ｑｕａｒｔｕｃｃｉｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｏｎｅ ｌｏｓｓ ｉｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｂａｂｏｏｎｓ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７，９５１−９６０等）、パジェット病（Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ ＤＰ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｔｉｎｄａｌｅ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｄａｉｌｙ １ｈ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ ｏｆ ｂｏｎｅ ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ． １９９２，７，８１−８７等、特公平２−１３６４５号公報、特開平４−２１１０１５号公報）、および骨粗鬆症患者（Ｈａｒｒｉｓ ＳＴ，Ｇｅｒｔｚ ＢＪ，Ｇｅｎａｎｔ ＨＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｒｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｏｎ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ．，１９９３，７６，１３９９−１４０６）において確認されている。
【０００４】
ビスホスホン酸は、骨吸収に対して重要な作用を有しているため、これまでその研究の多くはこの骨吸収抑制作用に焦点をあてたものであった（Ｓａｔｏ Ｍ．，Ｇｒａｓｓｅｒ Ｗ．，Ｅｎｄｏ Ｎ．，ｅｔ ａｌ， Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ａｃｔｉｏｎ： Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｒａｔ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ １９９１， ８８ ：２０９５−２１０５ ）
【０００５】
これに対して、ビスホスホン酸の骨形成に対する直接作用に関する報告として、骨芽細胞において骨形成抑制作用が認められたこと（Ｌｅｍｋｅｓ ＨＨＰＪ，Ｒｅｉｔｓｍａ ＰＨ，Ｆｒｉｊｌｉｎｋ Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ， Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｅｅｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｔｒｉａｌ ｉｎ Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．，１９７８，１０３，４５９−４６９）、骨芽細胞においてその機能の上昇作用が認められたこと（Ｆｅｌｉｘ Ｒ，Ｆｌｅｉｓｃｈ Ｈ． Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃａｌｖａｒｉａ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９７９，１８３，７３−８１等）があるが、その骨形成促進作用については何の記載もなされていない。
【０００６】
一方、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ ＨＣ，Ｔｏｒｏｎｔａｌｉ Ｍ．，Ｓｕｋｈｕ Ｂ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｎ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｂｏｎｅ，１９９２，１３，２４９−２５５ およびＨａｎｋｅｌ ＬＳ，ＭｃＢｒｉｄｅ ＤＪ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＪＲ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃｈｉｃｋ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（ａｂｓｔｒａｃｔ），Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９２，７（ｓｕｐｐｌ．１）ｓ７２２ では、いずれもニワトリの骨芽細胞において、ビスホスホン酸の骨形成に対する作用の検討を試みている。
【０００７】
しかしながら、Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ らでは、高濃度（３×１０^−８Ｍ以上）のパミドロネート、エチドロネートで石灰化の促進作用と抑制作用という相反する結果が得られているにすぎない。また、Ｈａｎｋｅｌらでは、高濃度のエチドロネート等で石灰化促進作用が認められたものの、コラーゲンには変化が認められておらず、これらの結果から、ビスホスホン酸に臨床的に骨形成促進作用が認められるというには、必ずしも十分とはいえない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、新規な骨形成促進剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ヒト骨芽細胞様細胞を用いて、ビスホスホン酸、特にアレンドロネートについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ石灰化および骨基質タンパク合成に対する影響を検討し、その結果、到達したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）
【００１１】
【化２】

〔式中、ＲはＨ_２ Ｎ−（ＣＨ_２ ）_ｎ −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ_３ −を表し、Ｒ^１ は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成促進剤である。
【００１２】
本発明の骨形成促進剤とは、例えば骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用に基づくものをいい、前者としては、例えば、類骨層へのカルシウムおよびリンの沈着を促進することにより、後者としては、例えば、骨基質タンパクであるオステオカルシンおよび／またはコラーゲンなどの合成を促進することによる。なかでも、骨芽細胞の石灰化促進作用および骨基質産生促進作用に基づく骨形成促進剤を好ましいものとして挙げることができる。
【００１３】
さらに、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３ のような骨芽細胞の石灰化を促進する因子（以下、骨形成促進因子と略する）の作用を促進および／またはこれと協調的に作用するという意味で、本発明の骨形成促進剤の骨形成促進が１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３ 依存性のものであるものも本発明の範囲に含まれる。すなわち、本発明の骨形成促進剤として好ましいものとして、この１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３ 依存性と上記骨芽細胞の石灰化促進作用および／または骨基質産生促進作用と組み合わされた作用に基づくものも挙げることができる。
【００１４】
前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸としては、例えば、６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−１，１−ビスホスホン酸、５−アミノ−１−ヒドロキシペンチリデン−１，１−ビスホスホン酸、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸（アレンドロネート：ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ）、３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミドロネート：ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ） が挙げられるが、これらのなかでも、アレンドロネート、パミドロネート、エチドロネートが好ましく、特に、アレンドロネートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１５】
本発明のビスホスホン酸の塩としては、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩等の無機酸塩、クエン酸、アミノ酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、なかでも水溶性に優れている点からアレンドロネートのモノナトリウム塩・トリハイドレートを好ましいものとして挙げることができる。
【００１６】
本発明の前記式（Ｉ）で示されるビスホスホン酸はいずれも公知化合物であって、例えば、特公平２−１３６４５号公報、特開昭６１−１０９７９４号公報、特開平３−１０１６８４号公報、特開平５−１３２４９２号公報、特開平４−２１１０１５号公報等に記載された方法によって、アレンドロネートまたはそのモノナトリウム塩・トリハイドレート、カリウム塩、カルシウム塩等の塩を得ることができ、また、例えば***特許第２１３０７９４号明細書、米国特許第４３２７０３９号明細書等に記載された方法によって、パミドロネートまたはその塩を、米国特許３４６８９３５号、第３４００１４７号、または第３４７５４８６号明細書等に記載された方法によって、エチドロネートまたはその塩を得ることができる。
【００１７】
本発明のビスホスホン酸またはその塩は、経口的、または注射剤等の非経口的投与用の適切な薬理学的単体のいずれかと共に投与することができる。投与量は、被投与者の年令、健康状態、体重、もし行っているとすれば併用療法の種類、治療の頻度および望まれる効果の種類に依存する。
【００１８】
一般に、活性成分化合物の全身的日量は、骨芽細胞レベルにおいて、１０^−１３ 〜１０^−７Ｍであり、約０．００１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは体重ｋｇ当たり、０．０１μｇ〜０．１ｍｇである。通常経口投与の場合、５０ｎｇ／日〜５０ｍｇ／日、非経口投与の場合、０．５ｎｇ／日〜０．５ｍｇ／日である。また、必要に応じて、例えば１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３ 〔１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 〕、１α−ヒドロキシビタミンＤ_３ 等の活性型ビタミンＤ_３ 類、エストロゲン等のホルモン剤と併用することもできる。
【００１９】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与の場合、錠剤、カプセル、粉末小包、液体溶液、懸濁液またはエリキシルのような投与形で、非経口的使用の場合、溶液または懸濁液のような処方用無菌液として使用することができる。
【００２０】
かかる場合の賦形剤としては、例えば、糖、例えば、サッカロース、グルコース、ラクトース、スターチ、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースなど、ゴム類、脂肪酸およびその塩、ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなど、タルク、芳香族エステル、水、生理食塩水、アルコール類、例えばエチルアルコール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル等と組み合わせて好適に製剤化される。
【００２１】
本発明の骨形成促進剤は単独で、あるいは本発明の目的に反しない限りにおいて、他の薬物を混合して、あるいは各別に製剤化、投与することができる。そのような他の薬物として、前記した骨形成促進因子、例えば、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３ やビタミンＫ、ＩＬ−４、ＩＧＦ−ＩまたはＴＧＦ−β等のサイトカインを挙げることができ、かかる場合のこれら因子の投与量としては、通常これらの因子を薬物として投与する場合の処方量の範囲を挙げることができる。
【００２２】
かくして本発明の骨形成促進剤が得られるが、本発明の骨形成促進剤は、前記のように石灰化促進作用、骨基質産生促進作用を有するので、例えば骨軟化症、骨形成不全症、骨粗鬆症、二次性副甲状腺機能亢進に基づく骨異栄養症、腎性骨異栄養症、歯周病の予防、治療および骨折の治療促進、歯科矯正に有用である。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２４】
なお、用いた骨芽細胞様細胞、測定法などは次のとおりである。
（１）細胞培養
ヒト骨膜由来骨芽細胞様細胞として、１０歳男児の大腿骨由来の細胞（東京都老人総合研究所、腰原康子博士より）を用いた。すなわち、α−グリセロ燐酸−２Ｎａ（α−ＧＰ）〔東京化成工業（株）製〕および１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ との培養により、高いアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）活性を示し、オステオカルシン（ＢＧＰ）産生および石灰化がおこるものである。
【００２５】
細胞の調製、培養法については、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４５，６５１−６５７ ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９８９，２５，３７−４３ ，Ｃｏｎｎｅｃｔ． Ｔｉｓｓ． ，１９９３，２４．２１７−２３１ （いずれも、Ｋｏｓｈｉｈａｒａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．， の著） に従って行った。具体的には、細胞集団倍化数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）１９（以下、１９ＰＤＬ）の細胞を６または１２−ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ） を用いて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（アービンサイエンテイフィック製）を含む Ｅａｇｌｅ’ｓ α−ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （α−ＭＥＭ）（ライフテクノロジーズ社製）中で培養（３７℃、５％ＣＯ_２ ／９５％ａｉｒ ）した。コンフルエント到達（２０ＰＤＬ）２〜３日後、２ｍＭのα−ＧＰ存在下に１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ を添加または非添加でさらに所定期間培養した。１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ はエタノール溶液として−２０℃で保存し、エタノールの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。ビスホスホン酸はそれぞれｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ （ＰＢＳ）溶液として４℃で保存し、ＰＢＳの最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）となるように培養系に添加した。培養液は週３回交換した。
【００２６】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
ヒト骨芽細胞様細胞よりｔｏｔａｌ ＲＮＡをＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６２，１５６−１５９）により調製した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ１μｇから、ｃＤＮＡを合成した（３７℃、６０分）。Ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子およびＢＧＰ遺伝子に対する特異的プライマーとして、それぞれＨＣＯＬＡ−１Ａ（５’−ＣＣＡ ＣＣＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣＡ−３’） およびＨＣＯＬＡ−１Ｂ（５’−ＧＣＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＡＧ−３’） とＨＢＧＰ−１Ａ（５’−ＣＣＴ ＣＡＣ ＡＣＴ ＣＣＴＣＧＣ ＣＣＴ ＡＴＴ−３’）およびＨＢＧＰ−１Ｂ（５’−ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＣ ＧＡＴ−３’）を用いて、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ ｏｖｅｎ （ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−１５０；ＭＪリサーチ製） 中でＰＣＲ増幅を行った。最初に２分間の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ） を行った後、９４℃、１分間の変性、５５℃（ＢＧＰ）または６０℃〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ〕、２分間のａｎｎｅａｌｉｎｇ 、７２℃、３分間のｅｘｔｅｎｓｉｏｎ を３０サイクル行った。アガロースゲル上で電気泳動後、ＰＣＲ産物をｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅで染色して写真に撮影した（Ｐｏｌａｒｏｉｄ ＡＣＭＥＬ Ｍ−０８５ Ａｕｔｏ）。
【００２７】
（３）カルシウム（Ｃａ） 、リン（Ｐｉ）、ＡＬＰ活性、ＢＧＰ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＤＮＡの定量
ＡＬＰ活性はＭａｉｏ ａｎｄ ｄｅ Ｃａｒｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ １９６２， １９６， ６００−６０１）の方法により、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート〔シグマ化学（株）製〕を基質として測定した。すなわち、培養終了後に細胞を生理食塩液で３回洗い、１０ｍＭｐ−ニトロフェニルフォスフェート−１ｍＭＭｇＣｌ_２ −０．１Ｍカーボネートバッファー（ｐＨ１０．０）を加えて１５〜２０分間反応させた。反応液を移し、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２８】
ＡＬＰ活性測定反応後の細胞を再度生理食塩液で洗った後、５％過塩素酸（ＰＣＡ）を加えてＣａおよびＰｉを抽出（氷水中で１５分間）する操作を２回繰り返して行った。ＣａおよびＰｉの含量はそれぞれｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｅｘｏｎｅ（ＯＣＰＣ）法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９６７， １８， ５２１−５３１） およびＣｈｅｎらの方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， １９５６，２８，１７５６−１７５８）で定量した。
【００２９】
ＢＣＰは細胞を２０％ギ酸中で超音波破砕して抽出し、凍結乾燥したのち測定まで−８０℃に保存した。測定は、Ｇｌａ−Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ 測定キット〔宝酒造（株）製〕を用いた酵素免疫測定法によった。
【００３０】
細胞層のｃｏｌｌａｇｅｎ量は６Ｎ塩酸で加水分解（オートクレーブ中、１３０℃、３０分間）したのち、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ らの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６７，１９，２４９−２５５） に従ってハイドロキシプロリンを測定して定量した。
【００３１】
ＤＮＡ含量は、ＰＣＡ抽出したのち、Ｂｕｒｔｏｎ法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９５６，６２，３１５−３２３）により測定した。
【００３２】
（実施例１）ビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図１に示した濃度（１０^−１２ Ｍ〜１０^−５Ｍ）のアレンドロネートまたはエチドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に７日間培養した。
【００３３】
対照例としては、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 単独のものを用い、前記カルシウム定量法に従って７日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量した。結果を図１に示した。図１において、各カラムは平均値±標準誤差（例数３）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３４】
図１から、アレンドロネートが１０^−１２ 〜１０^−７Ｍの濃度では、１００ｎｇ／ｍｌの１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 存在下で７日間培養したヒト骨芽細胞様細胞のＣａ沈着（石灰化）を促進し、１０^−６Ｍ以上の濃度ではこれを逆に抑制することが判る。石灰化促進作用は、１０^−９Ｍ付近で最大となったが、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ の非存在下ではこのような促進効果は認められなかった（データ示さず）。
【００３５】
エチドロネートも同様に、低濃度（１０^−１０ 〜１０^−８Ｍ）ではヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進し、１０^−６Ｍ以上ではこれを抑制した。石灰化促進作用におけるエチドロネートの最小有効濃度はアレンドロネートのそれに比べて少なくとも１００倍高かったが、高濃度側における石灰化抑制作用の発現濃度は両ビスホスホン酸でほとんど差がなかった。なお、データには示さないが、アレンドロネートおよびエチドロネートによるＰｉ含量の変化も石灰化促進作用と同様であった。
【００３６】
（実施例２）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、図２に示した濃度（１０^−１４ Ｍ〜１０^−９Ｍ）のアレンドロネートを添加し、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ （１００ｎｇ／ｍｌ）および２ｍＭα−ＧＰ存在下に１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 単独のものを用い、実施例１と同様にして１４日間培養後のヒト骨芽細胞様細胞層のＣａ含量を定量し、結果を図２に示す。図２において、各カラムは平均値±標準誤差（例数６）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１である。
【００３７】
図２から、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ （１００ｎｇ／ｍｌ）を加えて細胞を１４日間培養する条件下では、アレンドロネートによる石灰化促進作用は１０^−１４ Ｍではほとんど認められないが、１０^−１３ Ｍから明らかに発現することが判る。
【００３８】
（実施例３）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生および ｃｏｌｌａｇｅｎ 産生に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、アレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰ存在、かつ１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在または非存在下に１０日間培養した。対照例としてはアレンドロネート非添加のものを用い、前記の方法に従って細胞層のＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎ量を定量し、結果を図３および図４に示す。図３および４において、各カラムは平均値±標準誤差（例数４）を示す。対照との統計学的有意差は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１である。アレンドロネートは、石灰化促進作用における最小有効濃度（１０^−１３ Ｍ）および最大効果発現濃度以下の濃度（１０^−１１ Ｍ）を用いた。
【００３９】
図３から、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 存在下で顕著にＢＧＰ産生を促進することが判る。また、図４から、アレンドロネートがｃｏｌｌａｇｅｎ産生を１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 存在下で有意に促進することが判る。
【００４０】
（実施例４）アレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰおよび ｐｒｏ α１（Ｉ） ｃｏｌｌａｇｅｎ の遺伝子発現に及ぼす影響
コンフルエントに到達した２０ＰＤＬのヒト骨芽細胞様細胞に、実施例３で用いたのと同じ濃度のアレンドロネートを添加し、２ｍＭα−ＧＰおよび１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ （１０ｎｇ／ｍｌ）存在下に３、７または１４日間培養した。対照例としては１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 単独のものを用い、前記方法に従って細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＢＧＰおよびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現を検討した。結果を図５（ａ）（ＢＧＰ遺伝子発現）および（ｂ）〔ｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ遺伝子発現）に示す。
【００４１】
図５（ａ）からは、いずれの時点においてもアレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ によって強力に誘導されたＢＧＰ遺伝子発現をさらに促進するとは確認できなかったが、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 単独で既に強力にＢＧＰ遺伝子の発現が誘導されていることから、この測定系では、アレンドロネートによるそれ以上の発現を十分に検出できなかったものと考えられる。一方、図５（ｂ）からは、アレンドロネートが１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ によって誘導されたｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎの遺伝子発現をすべての時点で濃度依存的にさらに促進することが判る。
【００４２】
以上のとおり、これまでビスホスホン酸の作用としてよく知られている骨吸収抑制作用の発現濃度よりもさらに低濃度で、また、アレンドロネートおよびエチドロネートは、１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 存在下でヒト骨芽細胞様細胞の石灰化を促進した。アレンドロネートによる石灰化促進に骨基質タンパクであるＢＧＰおよびｃｏｌｌａｇｅｎの産生とｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎのｍＲＮＡ発現の促進を伴っていたことから、ビスホスホン酸の物理化学的性質によるものではないと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるビスホスホン酸のヒト骨芽細胞様細胞の石灰化に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞の石灰化促進作用を示すグラフである。
【図３】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のＢＧＰ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるアレンドロネートのヒト骨芽細胞様細胞のｃｏｌｌａｇｅｎ産生に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】実施例４におけるアレンドロネートのＢＧＰ（ａ）およびｐｒｏ α１（Ｉ）ｃｏｌｌａｇｅｎ（ｂ） 遺伝子発現に及ぼす影響を示す、電気泳動後の染色写真のバンドの位置を示す図である。
各レーンは以下のとおり：（０）ＢＲＬ１００塩基対ラダー、（１）、（２）、（３）無処置−３、７、１４日、（４）、（５）、（６）１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 単独−３、７、１４日、（７）、（８）、（９）１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 加アレンドロネート１０^−１３ Ｍ−３、７、１４日、（１０）、（１１）、（１２）１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ 加アレンドロネート１０^−１１ Ｍ−３、７、１４日[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a bone formation promoter. More specifically, the present invention relates to an osteogenesis promoter containing bisphosphonic acid or a salt thereof as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Bisphosphonic acid is a derivative of pyrophosphoric acid present in the living body and has a strong inhibitory action on bone resorption [Fleisch H. et al. , Bisphophonates-history and experimental basis, Bone 1987, 8 (suppl. 1); S23-S28], Paget's disease for the most frequent use of the disease (Kanis J.A.D. Dunitz Ltd., 1991, 159, 216), hypercalcemia associated with bone metastasis of cancer and malignant tumors (Fleisch H., Bisphosphonates: pharmacology and use in the treatment of continuation of a catalysis). s 1991, 42, 919-944) and osteoporosis (Watts NB, Harris ST, Genant HK, et al., Intermittent cyclic etironate treatment of postpostopausal osteo, N.E., Nepson osteopor. It has been used effectively to control osteolysis or to suppress bone loss in rats.
[0003]
One such bisphosphonic acid, 4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonic acid (alendronate), has also been shown to be a potent bone resorption inhibitor in vitro (Sato M, Grasser W., Effects of bisphosphonates on isolated rat osteoblasts as examined by reflected light microscopy, J. Bone Miner. Res., 1990, J. Bone Miner. Res., 1990, J. Bone Miner. Res. , The bisphosphonate, alendronate, presents bone loss in varietomized ba Oons, J. Bone Miner.Res., 1992, 7, 951-960, etc.), Paget's disease (O'Doherty DP, Gertz BJ, Tindale W, et al., Effects of five days infusion of foreign diseases). 1992, 7, 81-87, J. Bone Miner. Res., 1992, 7, 81-87, etc., JP-B-2-13645, JP-A-4-21015, and osteoporosis patients (Harris ST, Gertz BJ, Genant HK, et al., The effect of short term treatment with allowendate on vertebral densities and biochemi. al markers of bone remodeling in early postmenopausal women, J.Clin. Endocrinol. Metab., has been confirmed in 1993,76,1399-1406).
[0004]
Since bisphosphonic acid has an important effect on bone resorption, much of the research has so far focused on this bone resorption inhibiting effect (Sato M., Grasser W., Endo). N., et al, Bisphosphonate action: Alendronate localization inrat bone and effects on osteoblast ultrastructure, J. Clin.
[0005]
In contrast, as a report on the direct action of bisphosphonic acid on bone formation, an osteogenesis inhibitory action was observed in osteoblasts (Lemkes HHPJ, Reitsma PH, Frijlink W., et al., A new diphosphonate, Dissociation). Betheen effects on cells and mineral in rats and a preliminary trial in Page's disease, Adv. Exp. Med. Biol., 1978, 103, 459-469). (Felix R, Fleisch H. Increase in alkaline phosphatase activity in calv ria cells cultured with diphosphonates, Biochem. J., there are 1979,183,73-81 etc.), not been any description for their osteogenesis promoting action.
[0006]
On the other hand, Tenenbaum HC, Torontali M. Sukhu B., et al. , Effects of bisphosphonates and inorganic pyrophosphate on osteogenesis in vitro, Bone, 1992, 13, 249-255 and Hankel LS, McBride DJ, Shapiro. , Bisphosphonates enhancement minorization in a chicken osteoblast cell culture system (abstract), Bone Miner. Res. , 1992, 7 (suppl. 1) s722, all attempt to examine the effect of bisphosphonic acid on bone formation in chicken osteoblasts.
[0007]
However, according to Tenenbaum et al., High concentrations (3 × 10 ⁻⁸ M or more) of pamidronate and etidronate have only obtained contradictory results of promoting and inhibiting calcification. In Hankel et al., Although calcification promoting action was observed at a high concentration of etidronate and the like, no change was observed in collagen. From these results, bisphosphonic acid was found to have a clinical bone promoting action. Is not necessarily enough.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Then, an object of the present invention is to provide a novel bone formation promoting agent.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been achieved by using human osteoblast-like cells to examine the effects of bisphosphonic acid, particularly alendronate, on in vitro calcification and bone matrix protein synthesis.
[0010]
That is, the present invention relates to the following formula (I)
[0011]
Embedded image

Wherein, R represents _{H 2 N- (CH 2) n} - (n represents an integer of 2-5) or CH ₃ - represents, ^{R 1} represents a -OH. And a salt thereof as an active ingredient.
[0012]
The osteogenesis promoter of the present invention refers to, for example, those based on the action of promoting calcification of osteoblasts and / or the action of promoting the production of bone matrix. By promoting, for the latter, for example, by promoting the synthesis of bone matrix proteins such as osteocalcin and / or collagen. Among them, preferred is an osteogenesis promoter based on the action of promoting calcification of osteoblasts and the action of promoting the production of bone matrix.
[0013]
Furthermore, it promotes the action of factors that promote calcification of osteoblasts, such as 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ (hereinafter abbreviated as osteogenesis promoting factors), and / or acts in concert therewith. In a sense, the osteogenesis promoting agent of the present invention whose osteogenesis is dependent on 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ is also included in the scope of the present invention. That is, preferred as an osteogenesis promoting agent of the present invention is based on the combination of the 1α, 25-dihydroxyvitamin D ₃ dependency and the above-mentioned osteoblast calcification promoting action and / or bone matrix production promoting action. Things can also be mentioned.
[0014]
Examples of the bisphosphonic acid represented by the formula (I) include 6-amino-1-hydroxyhexylidene-1,1-bisphosphonic acid, 5-amino-1-hydroxypentylidene-1,1-bisphosphonic acid, 4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-bisphosphonic acid (alendronate), 3-amino-1-hydroxypropylidene-1,1-bisphosphonic acid (pamidronate: pamidronate), etidronate Of these, alendronate, pamidronate and etidronate are preferable, and alendronate is particularly preferable.
[0015]
As the salt of the bisphosphonic acid of the present invention, pharmaceutically acceptable salts, for example, alkali metal salts such as sodium and potassium, alkaline earth metal salts such as calcium, inorganic acid salts such as hydrochloride, citric acid, amino acid salt Among these, alendronate monosodium salt / trihydrate can be mentioned as a preferable one because of its excellent water solubility.
[0016]
The bisphosphonic acids of the present invention represented by the formula (I) are all known compounds, for example, Japanese Patent Publication No. 2-13645, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-109794, Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-101684, Alendronate or a salt thereof such as monosodium salt / trihydrate, potassium salt, calcium salt or the like can be obtained by the methods described in Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 5-132492, Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 4-21015, For example, pamidronate or a salt thereof is described in US Pat. No. 3,468,935, US Pat. No. 3,400,147, or US Pat. No. 3,475,486 by a method described in, for example, West German Patent No. 2130794 or US Pat. No. 4,327,039. According to the above method, etidronate or a salt thereof can be obtained.
[0017]
The bisphosphonic acids or salts thereof of the present invention can be administered either orally or with suitable pharmacological agents suitable for parenteral administration, such as injections. The dosage will depend on the age, health, and weight of the recipient, the type of combination therapy, if any, the frequency of treatment, and the type of effect desired.
[0018]
Generally, systemic per day of the active ingredient compound in osteoblasts level ^is 10 -13 ^{to 10 -7} M, about 0.001 [mu] g / kg to 1 mg / kg, preferably per body weight kg, 0.01 [mu] g to 0.1 mg. Usually, the dose is 50 ng / day to 50 mg / day for oral administration and 0.5 ng / day to 0.5 mg / day for parenteral administration. If necessary, for example l [alpha], 25-dihydroxyvitamin _{D 3 [1α, 25 (OH) 2 D} 3 ], 1.alpha.-activated vitamin _{D 3} such as hydroxy vitamin _{D 3,} in combination with hormonal agents such as estrogens You can also.
[0019]
The osteogenesis-promoting agent of the present invention may be administered in the form of tablets, capsules, powder packets, liquid solutions, suspensions or elixirs for oral administration, or as solutions or suspensions for parenteral use. It can be used as a sterile liquid for prescription.
[0020]
Examples of excipients in such a case include sugars, for example, saccharose, glucose, lactose, starch, cellulose and derivatives thereof, such as sodium carboxymethylcellulose, ethylcellulose, gums, fatty acids and salts thereof, polyols, such as propylene glycol, and the like. It is suitably formulated in combination with talc, aromatic ester, water, physiological saline, alcohols such as glycerin, sorbitol, mannitol, polyethylene glycol and the like, for example, ethyl alcohol, aliphatic alcohol, triglyceride, fatty acid ester and the like.
[0021]
The bone formation promoter of the present invention can be formulated and administered alone, or as a mixture of other drugs or separately, as long as the object of the present invention is not adversely affected. Such other drugs, the bone formation promoting factors, for example, l [alpha], 25-dihydroxyvitamin _{D 3} and vitamin K, can be mentioned IL-4, IGF-I or cytokines such as TGF-beta, such The dosage of these factors in such a case can be usually in the range of the prescribed amount when these factors are administered as a drug.
[0022]
Thus, the osteogenesis promoting agent of the present invention is obtained.The osteogenesis promoting agent of the present invention has a calcification promoting action and a bone matrix production promoting action as described above, for example, osteomalacia, osteogenesis imperfecta, It is useful for the prevention, treatment and promotion of bone fractures, osteoporosis based on secondary hyperparathyroidism, renal osteodystrophy, periodontal disease and bone fracture treatment, and orthodontic treatment.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
[0024]
In addition, the osteoblast-like cell used, the measuring method, etc. are as follows.
(1) Cell culture As a human osteoblast-like cell derived from human periosteum, a cell derived from a 10-year-old boy's femur (from Dr. Yasuko Koshihara, Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology) was used. That, alpha-glycerophosphate -2Na (α-GP) [Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.] and l [alpha], the culture with 25 _(OH) 2 _{D 3,} high alkaline phosphatase (alkaline phosphatase: ALP) show activity, Osteocalcin (BGP) production and calcification occur.
[0025]
For preparation and culture methods of cells, see Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1987, 145, 651-657, In Vitro Cell. Biol. , 1989, 25, 37-43, Connect. Tiss. , 1993, 24.217-231 (all written by Koshihara Y, et al.,). Specifically, the cells having a population doubling level (PDL) of 19 (hereinafter referred to as 19 PDL) were prepared using 10 or 6-well culture plates, and 10% fetal bovine serum (FBS) (Farbin Scientific) was used. (Α-MEM) (manufactured by Life Technologies) containing Eagle's α-minimum essential medium (manufactured by Life Technologies Inc.) at 37 ° C., 5% CO ₂ /95% air. Two to three days after reaching confluence (20 PDL), the cells were further cultured for a predetermined period in the presence or absence of 2 mM α-GP with or without the addition of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ . 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ was stored at −20 ° C. as an ethanol solution, and added to the culture system such that the final concentration of ethanol was 0.1% (v / v). Each bisphosphonic acid was stored as a phosphate-buffered saline (PBS) solution at 4 ° C. and added to the culture system such that the final concentration of PBS was 0.1% (v / v). The culture solution was changed three times a week.
[0026]
(2) RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)
Total RNA was prepared from human osteoblast-like cells by the AGPC method (Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159). cDNA was synthesized from 1 μg of total RNA (37 ° C., 60 minutes). As specific primers for the Pro α1 (I) collagen gene and the BGP gene, HCOLA-1A (5′-CCA CCG ACC AAG AAA CCA-3 ′) and HCOLA-1B (5′-GCT CAC CAG GAC GAC CAG-3, respectively) ') And HBGP-1A (5'-CCT CAC ACT CCTCGC CCT ATT-3') and HBGP-1B (5'-ATA GGC CTC CTG AAA GCC GAT-3 ') and thermocycler open (MiniCycle-PT150). ; MJ Research). After a 2 minute denaturation, denaturation was performed at 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. (BGP) or 60 ° C. [pro α1 (I) collagen], annealing for 2 minutes, 72 ° C. for 3 minutes. The extension was performed for 30 cycles. After electrophoresis on an agarose gel, the PCR product was stained with ethidium bromide and photographed (Polaroid ACMEL M-085 Auto).
[0027]
(3) Quantification of Calcium (Ca), Phosphorus (Pi), ALP Activity, BGP, Collagen, and DNA ALP activity was determined by the method of Maio and de Carli (Nature 1962, 196, 600-601) according to the method of p-nitrophenyl phosphate. [Sigma Chemical Co., Ltd.] was used as a substrate for measurement. That is, cells were washed 3 times with physiological saline, and reacted for 15-20 minutes by adding 10mMp- nitrophenylphosphate -1mMMgCl ₂ -0.1M carbonate buffer (pH 10.0) after completion of the culture. The reaction solution was transferred, and the absorbance at 415 nm was measured.
[0028]
After washing the cells after the ALP activity measurement reaction with physiological saline again, the operation of adding 5% perchloric acid (PCA) and extracting Ca and Pi (in ice water for 15 minutes) was repeated twice. The contents of Ca and Pi were quantified by the o-cresolphthalein compexone (OCPC) method (Anal. Biochem. 1967, 18, 521-531) and the method of Chen et al. (Anal. Chem., 1956, 28, 1756-1758), respectively. .
[0029]
BCP was extracted by sonicating the cells in 20% formic acid, lyophilized, and stored at -80 ° C until measurement. The measurement was performed by an enzyme immunoassay using a Gla-Osteocalcin measurement kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
[0030]
The amount of collagen in the cell layer is determined by hydrolyzing with 6N hydrochloric acid (in an autoclave at 130 ° C. for 30 minutes) and then measuring hydroxyproline according to the method of Kivirikko et al. (Anal. Biochem., 1967, 19, 249-255). did.
[0031]
The DNA content was measured by the Burton method (Biochem. J., 1956, 62, 315-323) after PCA extraction.
[0032]
(Example 1) in human osteoblast-like cells 20PDL reaching the impact <br/> confluence on calcification of human osteoblast-like cells of bisphosphonic acid, the concentration (10 ^-12 M to that shown in FIG. 1 ^10-5 M) alendronate or etidronate was added, and the cells were cultured for 7 days in the presence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (100 ng / ml) and 2 mM α-GP.
[0033]
As a control, 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ alone was used, and the Ca content of the human osteoblast-like cell layer after culturing for 7 days was determined according to the calcium determination method. The results are shown in FIG. In FIG. 1, each column shows the average value ± standard error (3 cases). The statistically significant differences from the control are *: P <0.05, **: P <0.01, ***: P <0.001.
[0034]
From FIG. 1, when alendronate is at a concentration of 10 ⁻¹² to 10 ⁻⁷ M, Ca deposition of human osteoblast-like cells cultured for 7 days in the presence of 100 ng / ml of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ ( It can be seen that calcification is promoted, and is suppressed at a concentration of 10 ⁻⁶ M or more. The calcification promoting effect was maximized at around 10 ⁻⁹ M, but such a promoting effect was not observed in the absence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (data not shown).
[0035]
Similarly, etidronate promoted calcification of human osteoblast-like cells at low concentrations (10 ⁻¹⁰ to 10 ⁻⁸ M), and suppressed it at 10 ⁻⁶ M or more. The minimum effective concentration of etidronate in promoting calcification was at least 100 times higher than that of alendronate, but the expression concentration of calcification-suppressing action on the higher concentration side was almost the same between both bisphosphonic acids. Although not shown in the data, the change in Pi content caused by alendronate and etidronate was similar to the calcification promoting action.
[0036]
(Example 2) to alendronate human osteoblast-like human osteoblast-like cells 20PDL reaching the impact <br/> confluence on calcification of cells, shown in FIG. 2 concentrations (10 ^-14 M (〜１０10 ⁻⁹ M) alendronate was added, and cultured for 14 days in the presence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (100 ng / ml) and 2 mM α-GP. As a control, 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ alone was used, and the Ca content of the human osteoblast-like cell layer after 14 days of culture was quantified in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. Show. In FIG. 2, each column shows the average value ± standard error (the number of cases is 6). The statistically significant difference from the control is *: P <0.05, ***: P <0.001.
[0037]
From FIG. 2, under the conditions of adding 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (100 ng / ml) and culturing the cells for 14 days, the calcification promoting effect of alendronate is hardly recognized at 10 ⁻¹⁴ M, , 10 ^-13 M.
[0038]
(Example 3) Effect of alendronate on BGP production and collagen production of human osteoblast-like cells Alendronate was added to 20PDL human osteoblast-like cells that reached confluence, and 2 mM α was added. The cells were cultured for 10 days in the presence of GP and in the presence or absence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (10 ng / ml). As a control, a sample to which alendronate was not added was used, and the amounts of BGP and collagen in the cell layer were quantified according to the method described above. The results are shown in FIGS. 3 and 4. In FIGS. 3 and 4, each column shows the average value ± standard error (Example number 4). The statistically significant differences from the control are *: P <0.05, **: P <0.01. Alendronate used the minimum effective concentration ( ^10-13 M) and the concentration ( ^10-11 M) below the maximum effect expression concentration in the calcification promoting action.
[0039]
FIG. 3 shows that alendronate significantly promotes BGP production in the presence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ . FIG. 4 also shows that alendronate significantly promotes collagen production in the presence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ .
[0040]
(Example 4) Alendronate human osteoblast-like cells of BGP and pro [alpha] 1 (I) of 20PDL reaching the impact <br/> confluence on collagen gene expression human osteoblast-like cells, Example The same concentration of alendronate as used in 3 was added, and the cells were cultured in the presence of ₂ mM α-GP and 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ (10 ng / ml) for 3, 7 or 14 days. As a control, 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ alone was used, the total RNA of the cells was extracted according to the method described above, and the gene expression of BGP and proα1 (I) collagen was examined. The results are shown in FIG. 5 (a) (BGP gene expression) and (b) [pro α1 (I) collagen gene expression).
[0041]
From FIG. 5 (a), it could not be confirmed that alendronate further promoted the BGP gene expression strongly induced by 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ at any time point, but 1α, 25 ( Since the expression of the BGP gene was already strongly induced by OH) ₂ D ₃ alone, it is considered that further measurement by alendronate could not be sufficiently detected in this measurement system. On the other hand, FIG. 5 (b), alendronate 1α, 25 _(OH) be concentration-dependent manner further promoted at all time points induced pro α1 (I) collagen gene expression by 2 _{D 3} I understand.
[0042]
As described above, alendronate and etidronate are present in the presence of 1α, 25 (OH) ₂ D ₃ at a concentration even lower than the expression concentration of the bone resorption inhibitory action which has been well known as the action of bisphosphonic acid. Promoted the calcification of human osteoblast-like cells. Alendronate promoted calcification was associated with the production of bone matrix proteins BGP and collagen and the promotion of mRNA expression of pro α1 (I) collagen. Was done.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the effect of bisphosphonic acid on calcification of human osteoblast-like cells in Example 1.
FIG. 2 is a graph showing the action of alendronate for promoting calcification of human osteoblast-like cells in Example 2.
FIG. 3 is a graph showing the effect of alendronate on BGP production of human osteoblast-like cells in Example 3.
FIG. 4 is a graph showing the effect of alendronate on collagen production of human osteoblast-like cells in Example 3.
FIG. 5 is a diagram showing the positions of bands in a stained photograph after electrophoresis, showing the effect of alendronate on BGP (a) and pro α1 (I) collagen (b) gene expression in Example 4.
Each lane is as follows: (0) BRL 100 base pair ladder, (1), (2), (3) untreated-3, 7, 14 days, (4), (5), (6) 1α, 25 _(OH) 2 _{D 3} alone - 3, 7, 14 days, (7), (8) , (9) 1α, 25 (OH) 2 D 3 pressurized alendronate ¹⁰ -13 M-3,7,14_Nichi , (10), (11) , (12) 1α, 25 (OH) 2 D 3 pressurized alendronate ¹⁰ -11 M-3,7,14_Nichi

Claims (9)

下記式（Ｉ）

〔式中、ＲはＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）_n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ₃−を表し、Ｒ¹は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨軟化症治療剤。The following formula (I)

Wherein, R represents _{H 2 N- (CH 2) n} - (n represents an integer of 2-5) or CH ₃ - represents, R ¹ represents a -OH. ] A therapeutic agent for osteomalacia comprising a bisphosphonic acid or a salt thereof as an active ingredient. 下記式（Ｉ）

〔式中、ＲはＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）_n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ₃−を表し、Ｒ¹は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする腎性骨異栄養症治療剤。The following formula (I)

Wherein, R represents _{H 2 N- (CH 2) n} - (n represents an integer of 2-5) or CH ₃ - represents, R ¹ represents a -OH. ] A remedy for renal osteodystrophy comprising the bisphosphonic acid or a salt thereof as an active ingredient. 下記式（Ｉ）

〔式中、ＲはＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）_n −（ｎは２〜５の整数を表す）またはＣＨ₃−を表し、Ｒ¹は−ＯＨを表す。〕で示されるビスホスホン酸またはその塩を有効成分とする骨形成不全症治療剤。The following formula (I)

Wherein, R represents _{H 2 N- (CH 2) n} - (n represents an integer of 2-5) or CH ₃ - represents, R ¹ represents a -OH. ] A therapeutic agent for osteogenesis imperfecta comprising the bisphosphonic acid or a salt thereof as an active ingredient. ＲがＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）₃ −、またはＣＨ ₃ −である請求項１記載の骨軟化症治療剤。R is _{H 2 N- (CH 2) 3} -, or CH ₃ - osteomalacia therapeutic agent according to claim 1 Symbol placement is. ＲがＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）₃ −、またはＣＨ ₃ −である請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。R is _{H 2 N- (CH 2) 3} -, or CH ₃ - renal osteodystrophy treating agent according to claim 2 Symbol placement is. ＲがＨ₂ Ｎ−（ＣＨ₂ ）₃ −、またはＣＨ ₃ −である請求項３記載の骨形成不全症治療剤。R is _{H 2 N- (CH 2) 3} -, or CH ₃ - osteogenesis imperfecta therapeutic agent according to claim 3 Symbol placement is. ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項１記載の骨軟化症治療剤。Bisphosphonic acid or salts thereof, 4-amino-1-osteomalacia therapeutic agent according to claim 1 Symbol placement is hydroxy-1,1-bisphosphonic acid mono Na salt, trihydrate. ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項２記載の腎性骨異栄養症治療剤。Bisphosphonic acid or salts thereof, 4-amino-1-hydroxybutylidene-1,1-renal osteodystrophy treating agent according to claim 2 Symbol placing a bisphosphonic acid mono Na salt, trihydrate. ビスホスホン酸またはその塩が、４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸モノＮａ塩・トリハイドレートである請求項３記載の骨形成不全症治療剤。Bisphosphonic acid or salts thereof, 4-amino-1-hydroxybutylidene osteogenesis imperfecta therapeutic agent according to claim 3 Symbol mounting a 1,1-bisphosphonic acid mono Na salt, trihydrate.

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