JP3553948B2 - 菌類感染藻類由来のα−１，４−グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物における発現 - Google Patents
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Description
本発明は酵素、特にα−1,4−グルカンリアーゼ（「GL」）酵素に関する。本発明はまた同酵素を抽出する方法に関する。本発明はまた、α−1,4−グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列に関する。
FR−Ａ−2617502およびBauteら、（Phytochemistry［1988］vol.27 No.11 pp3401−3403）はMorchella vulgarisにおける1,5−Ｄ−アンヒドロフルクトース（「AF」）の見かけの酵素反応による産生について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。可能な酵素反応に言及しているのにもかかわらず、これらの２つの文献は、ヌクレオチド配列の情報はもちろんのこと、いかなる酵素についてのアミノ酸配列も示していない。これらの文献は、AFが抗生物質ピロンミクロテシン（pyrone microthecin）の調製のための前駆体になり得ることを報告する。
Yuら、（Biochimica et Biophysica Acta［1993］vol 1156 pp313−320）は紅海藻からのGLの調製およびAFを生産するためにα−1,4−グルカンを分解するGLの使用について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。GL酵素に言及するのにも関わらず、この文献は同酵素をコードするヌクレオチド配列の情報はもちろんのことその酵素についてのいかなるアミノ酸配列データも示していない。この文献はGLの供給源は藻類であることも示唆している。
本発明では、菌類感染藻類から酵素を単離する工程を包含する、酵素α−1,4−グルカンリアーゼの調製方法が提供される。
好ましくは、この酵素を、同酵素により分解されないゲルを用いて単離および／またはさらに精製する。
好ましくはゲルはデキストリン、好ましくは、β−シクロデキストリン、またはその誘導体、好ましくはシクロデキストリン、より好ましくはβ−シクロ−デキストリンに基づく。
本発明では、本発明の方法により調製されたGL酵素も提供する。
好ましくは、酵素は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列、あるいはその任意の変異体を含む。
用語「その任意の変異体」は、その結果として生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、配列からの、あるいは配列に対しての、任意の少なくとも１アミノ酸の置換、多様性、修飾、置き換え、欠失、または付加を意味する。
本発明では、酵素α−1,4−グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列を提供する。好ましくはここで配列はその天然環境にはない（すなわち、酵素を発現する細胞生物の天然のゲノムの一部を形成しない）。
好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列である。
好ましくはDNA配列は、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同じ、または相補的、あるいは実質的相同性を有する、もしくは任意の適切なコドン置換を含む配列を包含する。
表現「実質的相同性」は、構造および／またはヌクレオチド成分および／または生物学的活性に関しての相同性を含有する。
表現「任意の適正なコドン置換を含む」は、生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、同じアミノ酸をコードする他のコドンとの任意のコドンの置き換えまたは置換、あるいはコドンの任意の付加または削除を包含する。
他の言葉で言えば、本発明はまた、その中で少なくとも１ヌクレオチドが欠失、置換または修飾される、あるいはその中で付加的な少なくとも１ヌクレオチドが挿入され、グルカンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、修飾されたDNA配列を含有する。好ましくは酵素は、増加したリアーゼ活性を有する。
本発明では、本発明のヌクレオチド配列を発現することを含む酵素α−1,4−グルカンリアーゼの調製方法も提供する。
本発明では酵素、好ましくはGLを精製するためのβ−シクロデキストリンの使用を提供する。
本発明では、少なくともDNA配列が、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または適切なコドン置換を含む配列を含む、ヌクレオチド配列を提供する。好ましくは配列は単離された形態である。
本発明の鍵となる局面は、GLが菌類感染藻類に由来するという認識である。GLをコードする核酸配列の決定に加え、GLのアミノ酸配列が決定されたのはこれが初めてである。それゆえ、本発明の鍵となる有利性は、GLが今や例えば組換えDNA技術により大量に生成し得、それゆえ、抗生物質ミクロテシンなどの化合物を容易に、そして大量に生成し得ることである。
この酵素は、好ましくは精製を容易にするように分泌されるべきである。そのために成熟酵素をコードするDNAを、選択した宿主由来のシグナル配列、プロモーターおよびターミネーターに融合させる。
Aspergillus nigerにおける発現のため、gpdA（Aspergillus nidulansのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来）プロモーターおよびシグナル配列を成熟リアーゼをコードするDNA（例えば配列番号３または配列番号４）の5'末端に融合する。A.nigerのtrpC遺伝子のターミネーター配列をその遺伝子の3'末端におく（Punt,P.J.ら、（1991）:J.Biotech.17,19−34）。この構築物をE.coliのための複製起点および選択オリジンならびにA.nigerのための選択マーカーを含むベクターに挿入する。A.nigerのための選択マーカーの例としては、amdS遺伝子、argB遺伝子、pyrG遺伝子、hygB遺伝子、BmlR遺伝子などがあり、すべて形質転換体の選択に用いられてきた。このプラスミドをA.nigerに形質転換し得、そして成熟リアーゼを形質転換体の培養液中から回収し得る。
この構築物を、培養液中でのリアーゼのタンパク質分解を減少させるためにプロテアーゼ欠損株に形質転換し得る（Archer D.B.ら、（1992）:Biotechnol.Lett.14,357−362）。
他の有利性は以下の記載により明らかになる。
それゆえ、本発明は、例えば、菌類感染藻類、好ましくは中国で収集可能であるタイプ（例えば、Gracilariopsis lemaneiformis）のような菌類感染紅藻類からの酵素α−1,4−グルカンリアーゼの単離に関する。菌類感染藻類の一例をブダペスト条約に従い寄託した（以下を参照のこと）。
インサイチュハイブリダイゼーション技術を用いることにより、酵素GLは菌類感染紅藻類Gracilariopsis lemaneiformis中で検出されることが確立された。この観察を支持する更なる証拠は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果により提供された。このようにGL酵素活性は、従来考えられていた藻類よりもむしろ、菌類感染藻類から得られ得る。
特に問題となるのは、各々がGLの特性を有する酵素をコードする２つの天然のDNA配列の発見である。これらのDNA核酸配列の塩基配列を決定し、これらを配列番号３および配列番号４に示す（後に考察し示す）。
最初の酵素精製はYuら（前出）に記載の方法により行い得る。しかし、最初の酵素精製が精製工程で分解しない固体支持体の使用を含むことが好ましい。このゲル支持体は、標準的な実験室のタンパク質精製設備と適合性であるという有利性を有する。この好ましい精製のプロセスの詳細は後述する。精製はタンパク質精製のための公知の標準的な方法により終結される。酵素の純度を補足的な電気泳動技術を用いて確立した。
精製したリアーゼは、pI、至適温度および至適pHにより特性づけられた。この点については、この酵素は以下のような特性を有する：アミロペクチンを使用した場合、至適基質特異性および至適pH3.5〜7.5;至適温度50℃およびpIは3.9。前記のように、本発明による酵素を（アミノ酸配列決定技術により部分的に）同定し、そのアミノ酸配列を後に提供する。同様に、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列（すなわちGL）を配列決定し、そのDNA塩基配列を後に提供する。
以下の試料をブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St.Machar Drive,Aberdeen,Scotland,United Kingdom,AB2 1RYに1994年６月20日に寄託した：
プラスミドpGL1保有E.coli（NCIMB 40652）−［参考DH5α−pGL1］；および
プラスミドpGL2保有E.coli（NCIMB 40653）−［参考DH5α−pGL2］。
以下の試料はブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe Culture Collection of Algae and Protozoa（CCAP）、Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3,Oban,Argyll,Scotland,United Kingdom,PA34 4ADに1994年10月11日に寄託の承認がされた。
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis（CCAP 1373/1）−［参考GLQ−１（Qingdao）］。
このように、本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物NCIMB 40652または寄託物NCIMB 40653の対象であるプラスミドに存在するGLコード配列の発現により取得し得るGL酵素；および寄託物CCAP 1373/1の対象である菌類感染藻類から取得し得るGL酵素を包含する。
本発明はここで実施例によってのみ記載される。
以下の実施例において、添付する以下の図に言及する：
図１は、染色した菌類感染藻類を示す；
図２は、染色した菌類感染藻類を示す；
図３は、菌類菌糸の切片を示す；
図４は、菌類感染藻類の切片を示す；
図５は、菌類感染藻類の切片を示す；
図６は、pGL1のプラスミド地図を示す；
図７は、pGL2のプラスミド地図を示す；
図８は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す；
図９は、配列番号１と配列番号２とのアライメント（alignment）を示す；
図10は、顕微鏡写真である。
より詳細には、図１は、Gracilariopsis lemaneiformisの上部および下部での菌類を表すCalcoflour White染色を示す（108×および294×）。
図２は、菌類を有するGracilariopsis lemaneiformisのPAS/Anilinblue Black染色を示す。菌類は顕著により高い炭水化物を含有する。
図３は、藻類細胞の厚い壁（ｗ）間で成長する二つの薄い壁の菌類菌糸（ｆ）の縦方向で表面付近の切片を示す顕微鏡写真である。藻類のクロロプラスト中のチラコイド膜に留意（矢印）。
図４は、クローン２プローブを用いたアンチセンス検出（上列）が、次の切片のCalcoflour White染色（下列）により示される菌類に、限定されるようであることを示す（46×および108×）。
図５は、クローン２プローブを用いた強いアンチセンス検出がGracilariopsis lemaneiformis内の菌類上に見出されたことを示す（294×）。
図６は、プラスミドpGL1の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.8kbのフラグメントを含有するpBluescript II KSである。このフラグメントはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
図７は、プラスミドpGL2の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.6kbのフラグメントを含有するpBluescript II SKである。このフラグメントはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
図９は、配列番号１（GL1）と配列番号２（GL2）とのアライメントを示す。GL1の総残基数は1088であり;GL2の総残基数は1091である。比較をするにあたって構造−遺伝子的マトリックス（structure−genetic matrix）を用いた（Open gapcost:10;Unit gap cost:2）図９中で、並べた二つの残基が同一であることを示す記号は「：」であり；並べた二つの残基が類似であることを示す記号は「．」である。「類似である」といわれるアミノ酸はA,S,T;D,E;N,Q;R,K;I,L,M,V;F,Y,Wである。全体で、同一が845アミノ酸（すなわち77.67％）存在し；類似が60アミノ酸（5.51％）存在する。GL1に挿入したギャップの数は３であり、GL2に挿入したギャップの数は２である。
図10は、藻類の壁（Ｗ）間で成長した菌糸（ｆ）の顕微鏡写真である。藻類細胞中の紅藻デンプン（ｓ）およびチラコイド（矢印）の粒子に留意。
以下の配列情報は後述のPCR反応のためのプライマーを生成するため、およびそれぞれのヌクレオチド配列により生成されたアミノ酸配列を検定するために用いた。
1. Gracilariopsis lemaneiformisの細胞学的検査
1.1.1 Gracilariopsis lemaneiformisにおける菌類感染の検出
中国で収集したGracilariopsis lemaneiformisの切片は手で切断するかまたはパラフィン包埋した試料から切断した。切片化した試料を光学顕微鏡で注意深く検査した。菌類菌糸はGracilariopsis lemaneiformis内に明確に検出された。
Gracilariopsis lemaneiformisの葉状体は、高度に整然として、ほぼ対象の特徴を示す細胞から成る。G.lemaneiformisの管状葉状体は大きい、無色の中心細胞、ならびにその周囲に伸長された、細長い楕円形の細胞、および小さい、丸い、赤く着色された周辺細胞から成る。全ての藻類細胞タイプは厚い細胞壁により特性づけられる。ほとんどの菌類菌糸は、大きな細胞の中心層および周辺層の中間相に見出される。これらの細胞は長く円筒形であるため藻類細胞と明確に区別し得る。菌糸の成長は、高度に整然とした藻類細胞の間の不規則性として観察された。最も頻繁な菌糸の方向は、藻類の葉状体の主軸に沿った向きである。中心および周辺に向かう側枝がいくつかの場合で検出される。菌糸は藻類の内性／着生第二世代と混同され得ない。
Calcofluor Whiteはキチンおよびセルロースを含有する組織を染色することが知られている。キチンとの反応は、４個の共有結合した末端のｎ−アセチルグルコサミン残基を要求する。セルロースは、いくつかの藻類では微量に存在し得るが、ほとんど高等植物に限定されていることが一般に受け入れられている。さらにキチンはGracilaria内には存在しないことが公知である。
Calcofluor Whiteは切片化したGracilariopsis lemaneiformisの試料中の菌類菌糸の細胞壁に相当する領域を染色することが見出された。
紫外線下で観察すると、菌糸はGracilaria組織の淡青色の背景に対して明確な白色を示す（図１を参照のこと）。キチンはGracilariaには存在しないが、ほとんどの菌類においては細胞壁の主成分である。これらの観察に基づき、本発明者らは検査した藻類は菌類に感染していると結論する。検査したGracilariopsis lemaneiformis切片の下部の40％は、菌類菌糸に感染していることが見出された。藻類の先端では検査したGracilariopsis lemaneiformisの切片の25％が感染していることが見出された。
Periodic acid Schiff（PAS）およびAniline blue blackでのGracilariopsis lemaneiformis切片の染色は、藻類細胞と比較して菌類細胞内の顕著に高い炭水化物含有を示した（図２を参照のこと）。Safranin OおよびMalachit Greenは、菌類に感染した高等植物に見出されるのと同じ菌類細胞の呈色反応を示した。
Acridin OrangeとGracilariopsis lemaneiformis切片との反応は、明確に菌類の不規則な成長を示した。
1.1.2 電子顕微鏡検査
Calcofluor Whiteを用いて菌類を検出した、15μｍの厚さの切片を有するスライドを２％ OsO4で固定し、水で洗浄し、そしてジメトキシプロパンと無水アルコールで脱水した。アセトンとSpurr樹脂の1:1混合液の一滴をガラススライド上の各々の切片に滴下し、そして１時間後純粋な樹脂の一滴で置き換えた。樹脂を充填したゼラチン包埋カプセルを切片の表面に静置し４℃で一晩放置した。55℃で８時間重合した後、樹脂ブロックに付着した厚い切片は、液体窒素に浸すことによりスライドから分離され得た。
ブロックの形を整え、ミクロトーム上でダイヤモンドナイフを用いて、100nmの厚さの切片を切断した。切片を酢酸ウラニル水溶液およびクエン酸鉛で染色した。切片を電子顕微鏡内で、80kVで検討した。
この検査は光学顕微鏡での観察を確認し、リアーゼを生産する中国の株のG.lemneiformisが菌類の寄生体あるいは共生体に感染しているというさらなる証拠を提供した。
菌類菌糸は、長さ50−100μｍおよび直径僅か数ミクロンの管状細胞から作られている。この細胞は隣接した細胞の間の隔壁で連続的に整列されている。時折分枝も見られる。菌糸は、壁を貫通したり細胞を損傷したりすることなく藻類葉状体の厚い細胞壁の間に成長する。このような共生関係（mycophycobiosisと呼ばれる）はいくつかの糸状海洋菌類および大きな海藻間で起こることが知られている（DonkおよびBruning,1992−藻類中、および藻類上での水生菌類の生態学。Reisser,W.（編）:Algae and Symbioses:Plants,Animals,Fungi,Viruses,Interactions Explored.Biopress Ltd.,Bristol.）
図10の顕微鏡写真を検討すると、藻類細胞および菌類細胞の間のいくつかの違いに気付き得る。藻類の数μｍの厚さの壁と対照的に、菌類の細胞壁は僅か100〜200nmの厚さである。チラコイド膜を有するクロロプラストおよび紅藻デンプン粒子のような植物に典型的なオルガネラが、藻類細胞内には見られ得るが、菌類内には見られない。
紅藻類の細胞間の連結は壁孔プラグ（pit plug）あるいは壁孔連絡と呼ばれる特異的な構造により特徴づけられる。この構造は突起した、電子密核（electron dense core）であり、それらは藻類分類学において重要な特徴である（Pueschel,C.M.:紅藻類の壁孔プラグの超構造の拡張した概観。J.Phycol.25,625（1989））。本発明者らの試料では、このような連絡は頻繁に藻類葉状体内で観察された。しかし、菌類の細胞の間には全く見られなかった。
1.2 インサイチュハイブリダイゼーション実験
インサイチュハイブリダイゼーション技術はアンチセンスリボヌクレオチド配列のmRNAへのハイブリダイゼーションの原理に基づく。この技術はmRNAが存在する顕微鏡切片中の領域を視覚化するために用いられる。この特定の場合、この技術をGracilariopsis lemaneiformis切片中の酵素α−1,4−グルカンリアーゼを局在化するために用いた。
1.2.1 インサイチュハイブリダイゼーションのための35S標識したプローブの調製
第３のPCR増幅からの238bpのPCRフラグメント（クローン２と呼ばれる（前記参照））をpGEM−3Zf（＋）ベクター（Promega）にクローン化した。アンチセンスRNAの転写はSP6プロモーターで駆動し、センスRNAの転写はT7プロモーターで駆動した。Ribonuclease protection assay kit（Ambion）を以下のとおり改変して使用した。転写産物を６％シーケンシングゲルで泳動して、取り込まれていないヌクレオチドを除去し、T7RNA polymerase in vitro Transcription Kit（Ambion）で提供される溶出緩衝液で溶出した。アンチセンス転写産物は23の非コードヌクレオチドを含み、一方センス転写産物は39の非コードヌクレオチドを含んでいた。ハイブリダイゼーションのために107cpm/mlの35S標識したプローブを用いた。
インサイチュハイブリダイゼーションは本質的にLangedaleら（1988）に記載のように実施した。ハイブリダイゼーションの温度は45℃が至適であることが見出された。45℃で洗浄した後、切片をKodaK K−5 photographic emulsionで覆い、３日間５℃で暗所に放置した（Langedale,J.A.,Rothermel,B.A.およびNelson,T.（1988）.Genes and development 2:106−115.Cold Spring Harbour Laboratoryを参照）。
α−1,4−グルカンリアーゼのmRNAに対するリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション実験は、Gracilariopsis lemaneiformis内に検出された菌類の菌糸の上面および周辺に強いハイブリダイゼーションを示した（図４および５参照）。これはα−1,4−グルカンリアーゼが生産されていることを示す強い証拠であると考えられる。弱いランダムなバックグラウンド反応を両方のGracilariopsis lemaneiformisの藻類組織で検出した。この反応は、センスおよびアンチセンス両方のプローブについて観察された。菌類菌糸の上面の強い染色はアンチセンスプローブを用いたときにのみ得られた。
これらの結果はハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程における45℃での標準的なハイブリダイゼーションの条件を用いて得られた。50℃では菌類の上面の染色は観察されなかったが、バックグラウンドの染色は同様であった。55℃に温度を上げることにより、センスおよびアンチセンスプローブの両方で、有意にかつ等しくバックグラウンドの染色が減衰した。
相補的染色手順を用いた細胞学的検査に基づき、Gracilariopsis lemaneiformisは菌類に感染していることが結論される。感染は、藻類組織の下部において最も顕著である。
切片化したGracilariopsis lemaneiformis試料において、インサイチュハイブリダイゼーションの結果は、ハイブリダイゼーションが菌類の感染が見い出される領域に限定されていることを明確に示す（図４参照）。この結果はα−1,4−グルカンリアーゼのmRNAがGracilariopsis lemaneiformisの菌類に感染した領域に限定されているように見えることを示す。
これらの観察に基づき、本発明者らは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis内にα−1,4−グルカンリアーゼ活性が検出されると結論する。
2. 酵素の精製と特徴付け
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼの精製は以下のように実施した。
2.1 材料と方法
藻類は濾過により回収し、0.9％ NaClで洗浄した。細胞をホモゲナイゼーションによって破壊し、次いで氷上で６×３分間、50mMクエン酸−NaOH pH6.2（緩衝液Ａ）中で超音波破砕した。細胞破片（debris）は25,000×ｇ、40分間遠心して取り除いた。この手順で得られた上清を無細胞抽出物とみなし、８〜25％の勾配ゲルで分離した後、活性染色およびウエスタンブロッティングに用いた。
2.2 β−シクロデキストリンSepharoseゲルによる分離
無細胞抽出物をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化したβ−シクロデキストリンSepharoseゲル4Bカラム（2.6×18cm）に直接かけた。このカラムを３倍量の緩衝液Ａおよび1M NaClを含む２倍量の緩衝液Ａで洗浄した。α−1,4−グルカンリアーゼを緩衝液Ａ中の２％デキストリンを用いて溶出した。活性のある画分をプールし、緩衝液を20mMビス−トリスプロパン−HCl（pH7.0,緩衝液Ｂ）に変えた。
活性のある画分をあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したMono Q HR 5/5カラムにかけた。菌類のリアーゼを0.3M NaClの直線勾配で緩衝液Ｂを用いて溶出した。
β−シクロデキストリンSepharoseクロマトグラフィーの後に得られたリアーゼ調製物は、あるいは150μｌに濃縮し、FPLC条件下で操作されたSuperose12カラムにかけた。
2.3 α−1,4−グルカンリアーゼ活性のアッセイならびに基質特異性、至適pH、および至適温度決定のための条件
α−1,4−グルカンリアーゼ活性のアッセイのための反応混合液は10mg/mlアミロペクチンおよび25mM Mes−NaOH（pH6.0）を含んだ。反応は30℃で30分間行い、3,5−デニトロサリチル酸試薬を加えて停止した。光学密度は、室温で10分間おいた後に550nmで測定した。
3. 菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼのアミノ酸配列決定
3.1 リアーゼのアミノ酸配列決定
リアーゼをClostridium histolyticum由来のエンドプロティナーゼArg−ＣまたはLysobacter enzymogenes由来のエンドプロティナーゼLys−Ｃのいずれかでで消化した。いずれも配列決定用グレードであり、Boehringer Mannhein,Germanyから購入した。エンドプロティナーゼArg−Ｃでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ（0.1mg）を50μｌの10M尿素、50mMメチルアミン、0.1M Tris−HCl、pH7.6に溶解した。N2で覆い、10μｌの50mM DTTおよび5mM EDTAを添加し、N2下50℃で10分間、タンパク質を変性および還元させた。続いて、10μｌの50mM Tris−HCl、pH8.0中の１μｇのエンドプロティナーゼArg−Ｃを添加し、N2で覆い、消化を37℃で６時間行った。次のシステインの誘導体化のために、12.5μｌの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下、暗所で室温、15分間インキュベートした。
エンドプロティナーゼLys−Ｃでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ（0.1mg）を50μｌの8M尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.4に溶解した。N2で覆い、５μｌの45mM DTTを添加した後、N2下50℃で15分間、タンパク質を変性および還元させた。室温まで冷却した後、５μｌの100mMヨードアセトアミドを添加して、N2下、暗所で室温、15分間システインを誘導体化した。
次に、90μｌの水および50μｌの50mM tricineおよび10mM EDTA、pH8.0中の５μｇのエンドプロティナーゼLys−Ｃを添加し、消化をN2下37℃24時間行った。
この結果生じたペプチドを溶媒Ａ（水中の0.1％ TFA）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の0.1％ TFA）を用いて、VYDAC C18カラム（0.46×15cm;10μm;The Separations Group;California）上の逆相HPLCに分離した。選択したペプチドをパルス化高速液体サイクル（pulsed−liquid fast cycles）を用いてApplied Biosystems 476Aシーケンサーによって配列決定する前に、Develosil C18カラム（0.46×10cm;3μm;Dr.Ole Schou,Novo Nordisk,Denmark）で再クロマトグラフした。
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の酵素からのアミノ酸配列情報を以下、特に配列番号１、および配列番号２に示す。
配列番号１は以下を有する：
アミノ酸残基数:1088
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
配列番号２は以下を有する：
アミノ酸残基数:1091
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
3.2 Ｎ−末端の分析
研究により天然のグルカンリアーゼ１のＮ−末端配列がブロックされていることが示された。脱ブロック化を本質的にLeGendreら（1993）［タンパク質およびペプチドのSDS−PAGEによる精製;Matsudaira,P.（編）A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing,第２版;Academic Press Inc.,San Diego;pp.74−101］に記載の方法に従い、PVDF膜にブロットされたグルカンリアーゼ１を無水TFAで40℃で30分間処理することにより達成した。得られた配列はTALSDKQTAであった。これはグルカンリアーゼ１のクローン由来の配列（配列番号１の51位〜59位の配列）と一致し、グルカンリアーゼ１のＮ−末端残基がＮ−アセチルスレオニンであることを示す。配列番号１の１位〜50位の配列はシグナル配列を表す。
4. 菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子のDNA配列決定
4.1 分子生物学のための方法
以下の改変を加えてSaunders（1993）に記載の方法のようにDNAを単離した：ポリサッカライドを、DNAからゲル精製のかわりにELUTIP−ｄ（Schleicher ＆ Schuell）精製により除去した（Saunders,G.W.（1993）．紅藻類ゲノムDNAのゲル精製:PCRに有用なDNAを単離するための、安価で迅速な方法。Journal of phycology 29（２）:251−254およびSchleicher ＆ Schuell:ELUTIP−d.DNAの精製および濃縮のための迅速な方法。を参照）。
4.2 PCR
目的のDNAの調製は、Gene Amp DNA Amplification Kit（Perkin Elmer Cetus,USA）を使用し、Taqポリメラーゼを後に加え（PCRサイクルを参照のこと）、温度サイクルを以下のように変更した以外は製造業者の使用説明書に従い行った：
PCRサイクル：
サイクル数 Ｃ 時間（分）
１ 98 ５
60 ５
Taqポリメラーゼおよび油の添加
35 94 １
47 ２
72 ３
１ 72 20
4.3 PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントは製造業者の使用説明書に従いpT7Blue（Novagen）にクローニングした。
4.4 DNA配列決定
二本鎖DNAはSangerら（1979）のジデオキシ法に本質的に従い、Auto Read Sequencing Kit（Pharmacia）およびPharmacia LKB A.L.F.DNAシーケンサー（参考:Sanger,F.,Nicklen,S.およびCoulson,A.R.（1979）。鎖終結インヒビターを用いたDNA配列の決定Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5497.）を用いて配列決定を行った。
配列を配列番号３および４として示す。ここで、
配列番号３は以下を有する：
総塩基数:3267。
DNA配列組成:850 A;761 C;871 G;785 T
配列番号４は以下を有する：
総塩基数:3276。
DNA配列組成:889 A;702 C;856 G;829 T
4.5 ライブラリーのスクリーニング
Stratageneより得た、λZapライブラリーのスクリーニングを、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを２×SSC、0.1％ SDS、10×Denhardt'sおよび100μg/ml変性サケ***DNA中で行った以外は製造者の使用説明に従って行った。ハイブリダイゼーション溶液に32Pで標識した変性プローブを添加した。ハイブリダイゼーションは55℃で一晩行った。フィルターを２×SSC、0.1％ SDS中で２回、および１×SSC、0.1％ SDS中で２回洗浄した。
4.6 プローブ
クローン化したPCRフラグメントを、適切な制限酵素を用いた消化により、pT7blueベクターから単離した。フラグメントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、フラグメントをAgarase（Boehringer Mannhein）によってアガロースから精製した。フラグメントはわずか90〜240bpの長さであったので、単離したフラグメントを、Prime−It random primer Kit（Stratagene）またはReady to Go DNA labelling kit（Pharmacia）を用いて32P−dCTPで標識する前にライゲーション反応に曝した。
4.7 結果
4.7.1 α−1,4−グルカンリアーゼをコードするPCR DNAフラグメントの生成
α−1,4−グルカンリアーゼ由来の、３つの重複するトリプシンペプチドのアミノ酸配列（下に示す）を、混合オリゴヌクレオチドを生成するために用いた。このオリゴヌクレオチドはPCRプライマーとして用いられ得た（前記の配列を参照）．
第１のPCR増幅において、プライマーA/B（前記参照）を上流のプライマーとして、プライマーＣ（前記参照）を下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは71塩基対である。
第２のPCR増幅において、プライマーA/Bを上流のプライマーとして、Ｅ（前記参照）を下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは161塩基対である。
第３のPCR増幅において、プライマーF1（前記参照）およF2（前記参照）を上流のプライマーとして、Ｅを下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは238塩基対である。このPCR産物を２％ LMTアガロースゲルで分析し、予想される長さのフラグメントをゲルから切り出して、Agarase（Boehringer Manheim）で処理し、そしてpT7buleベクター（Novagen）にクローン化して配列決定した。
第１および第２のPCR増幅由来のクローン化したフラグメントは、配列決定したペプチド（前記参照）に相当するアミノ酸をコードしていた。第３の増幅由来のクローン（前記参照）は配列決定したペプチドに対して約87％のみ相同であった。
4.7.2 クローン化したPCRフラグメントを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング。
前記したクローンを用いたライブラリーのスクリーニングにより２つのクローンを得た。１つのクローンは配列番号４（遺伝子２）のヌクレオチド配列を含有した。他のクローンは配列番号３の配列の一部を含有した（塩基対1065から下流）（遺伝子１）。
配列番号３の5'末端（すなわち塩基対1064から上流）はGibco BRLの5'race systemを用いたRACE（rapid amplification of cDNA ends）手順（Michael,A.F.,Michael,K.D.およびMartin,G.R.（1988）.Proc..Natl.Acad.Sci.USA 85:8998−99002）により得た。全RNAをCollingeら（Collinge,D.B.,Milligan D.E;,Dow,J.M.,Scofield,G.およびDaniels,M.J.（1987）.Plant Mol Biol 8:405−414）に従い単離した。5'raceは１μｇの全RNAを用いて製造業者のプロトコルに従い実施した。第２の増幅由来のPCR産物をNovagenのpT7blue vectorに製造業者のプロトコルに従いクローン化した。PCRエラーを補償するために３つの独立したPCRクローンを塩基配列決定した。
上で記載のクローンにATG開始コドンの直前のXba IおよびNde I制限部位を補足するために以下のオリゴヌクレオチドを上流のプライマーに用いて：
GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG、そして配列GL I（すなわち配列番号３）の塩基対1573−1593の相補配列を含むプライマーを下流のプライマーとして用いて、追加のPCRを実施した。
遺伝子１の完全な配列（すなわち配列番号３）はStratageneのpBluescript II KS＋ベクターに遺伝子の3'末端をゲノムクローン由来のBamH I−Hind IIIフラグメントとしてクローン化し、そしてさらにPCRにより生成した遺伝子の5'末端をXba I−BamH Iフラグメントとして3'末端の前にクローン化することにより生成した。
遺伝子２を、Hind III平滑末端化フラグメントとしてStratageneのpBluescript II KS＋ベクターのEcoR V部位にクローン化した。3'非転写配列の一部をSac I消化により除去し、次に再結合した。Hind IIIおよびHpa I制限部位を開始ATGの直前に、Hind IIIおよびNal I消化、および以下のアニールしたオリゴヌクレオチドの存在下での再結合により導入した。
配列決定したクローン内にイントロンを見出さなかった。
クローン１タイプ（配列番号３）は100％の同一性を示して、10のペプチド配列全てと（図８参照）並べ得る。菌類に感染した藻類Gracilariopsis lemaneiformisから単離された遺伝子によりコードされる二つのタンパク質の配列のアライメントは約78％の同一性を示した。これは両方の遺伝子がα−1,4−グルカンリアーゼをコードすることを示す。
5. 微生物におけるGL遺伝子の発現
（例えば、Pichiaのリアーゼ形質転換体およびAspergillusのリアーゼ形質転換体の分析）
GLをコードするDNA配列を微生物に導入し、高い比活性を有する酵素を大量に生産した。
これに関して、遺伝子１（すなわち配列番号３）をPichia pastorisで発現させるために（Invitrogenにより供給されるPichia Expression Kit中に記載のプロトコールに従って）Pichia発現ベクターpHIL−D2（AOX1プロモーターを含有する）をEcoR Iで消化し平滑末端化（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）したものに、Not I−Hind III平滑末端化（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）フラグメントとしてクローン化した。
別の実施態様では、MC遺伝子１すなわち配列番号３は、Aspergillus nigerで発現させるために（Pallら、（1993）Fungal Genet Newslett.vol40 pages 59−62）、Aspergillus発現ベクターpBARMTE1（Neuropera crassa由来のメチルトリプトファン耐性プロモーターを含有する）をSma Iで消化したものに、Not I−Hind III平滑末端化フラグメント（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）としてクローン化した。プロトプラストはDaboussiら（Curr Genet（1989）Vol 15 pp453−456）に従って溶解（lysing）酵素Sigma L−2773およびリティカーゼ（lyticase）Sigma L−8012を使用して調製した。プロトプラストの形質転換はBuxtonら（Gene（1985）vol37 pp207−214）に記載のプロトコルに従ったが、形質転換したプロトプラストのプレーティングに関しては、0.6％の浸透圧安定化トップアガロースを使用した以外はPuntら（Methods in Enzymology（1992）vol216 pp447−457）により立案されたプロトコールに従った。
結果は、形質転換したPichia pastorisおよびAspergillus nigerにおいてリアーゼ活性が観察されたことを示した。
5.1 一般的方法
無細胞抽出物の調製
細胞は9000rpm、５分間遠心することによって回収し、0.9％NaClで洗浄し、破砕（breaking）緩衝液（1mM EDTA、および５％グリセロール含有50mM K−リン酸、pH7.5）に再懸濁した。細胞はガラスビーズおよびボルテックス処理を用いて破砕した。破砕緩衝液は1mMのPMSF（プロテアーゼインヒビター）を含有した。リアーゼ抽出物（上清）を、9000rpmで５分間遠心し、次いで20,000×ｇで５分間遠心後得た。
アルカリ性3,5−ジニトロサリチル酸試薬（DNS）によるリアーゼ活性のアッセイ
リアーゼ抽出物の１倍量を等量の４％アミノペクチン溶液と混合した。反応混合液は制御された温度でインキュベートし、そして試料は特定の間隔で取り出しAFについて分析した。
リアーゼ活性はまた、放射活性方法を使用して分析した。
反応混合液は、10μｌの14C−デンプン溶液（１μCi;Sigma Chemicals Co.）および10μｌのリアーゼ抽出物を含有した。反応混合液は25℃で一晩おき、その後通常のTLC系で分析した。生成された放射活性AF産生量はInstant Imager（Pachard Instrument Co.,Inc.,Meriden,CT）を用いて検出した。
電気泳動およびウェスタンブロッティング
SDS−PAGEは８〜25％勾配ゲルおよびPhastSystem（Pharmacia）を使用して行った。ウェスタンブロッティングもPhastSystemのSemidry transfer unitで実施した。
Quindao（China）で採取された紅海藻から精製されたリアーゼに対して生じた１次抗体を1:100に希釈して使用した。アルカリホスファターゼ（Dako A/S,Glostrup,Denmark）に結合したブタ抗ウサギIgGを２次抗体として使用し、1:1000に希釈して使用した。
パートII、Aspergilus形質転換体
結果
I. リアーゼ活性は、５日間のインキュベーション（0.2％カゼイン酵素的加水分解産物を含む最少培地）の後、アルカリ性3,5−ジニトロサリチル酸試薬による分析で測定した。
１）培養培地のリアーゼ活性の分析
培養培地に含まれる0.2％アミロペクチンとともに増殖させた35の培養物の中で、AFは２つの培養物でのみ検出された。5.4＋および5.9＋の培養培地はそれぞれ0.13g AF/リットルおよび0.44g/リットルを含有していた。この結果は活性なリアーゼが細胞から分泌されていることを示した。リアーゼ活性はまた、無細胞抽出物中でもまた測定可能であった。
結果はGLの遺伝子１がA.nigerにおいて細胞内で発現したことを示す。
形質転換したE.coliを用いた実験は（QiagenのQia express vector kitのクローニングベクターpQE30を用いた）、酵素の発現を示し、この酵素は菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の精製した酵素に対する抗体により認識された。
宿主としてAspergillus nigerの代わりに、良好な発現系として公知の他の工業的に重要な微生物も使用され得る；それらの例としては以下が挙げられる。
Aspergills oryzae,Aspergillus sp.,Trichoderma sp.,Saccharomyces cerevisiae,Kluyveromyces sp.,Hansenula sp.,Pichia sp.,Bacillus subtilis,B.amyloliquefaciens,Bacillus sp.,Strepromyces sp.or E.coli.
本発明の他の好ましい実施態様は、以下のすべてを含む：本明細書に記載のDNA配列を導入した結果AF産生能力を有する形質転換された宿主生物；微生物であるこのような形質転換された宿主生物−好ましくはここで宿主生物は細菌、糸状菌、菌類および酵母からなる群から選択される；好ましくは宿主生物は以下の生物からなる群から選択される：
Saccharomyces,Kluyveromyces,Aspergillus,Trichoderma Hansenula,Pichia,Bacillus Streptomyces,Eschericia such as Aspergillus oryzae,Saccharomyces cerevisiae,bacillus sublilis,Bacillus amyloliquefascien,Eschericia coli.
；同上の配列をコードするヌクレオチド配列を含有する形質転換された宿主生物によて発現される酵素α−1,4−グルカンリアーゼとα−1,4−グルカン（例えばデンプン）の接触工程を包含する糖1,5−Ｄ−アンヒドロフルクトースの調製方法、好ましくは、ここでヌクレオチド配列はDNA配列であり、好ましくはここでDNA配列は、本明細書中で先に記載の配列の１つである；本明細書が先に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター、好ましくは、ここでベクターは複製ベクターである、好ましくは、ここでベクターはプロモーター配列から下流にヌクレオチド配列を含有する発現ベクターである、好ましくは、ベクターはマーカー（例えば耐性マーカー）を含有する；このようなベクターで形質転換された細胞性生物、または細胞系、；産物α−1,4−グルカンリアーゼを産生する方法あるいはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする任意のヌクレオチド配列、またはその部分、これは、このようなベクターで形質転換されたこのような生物（または細胞系由来の細胞）の培養および産物の回収を包含する。
本発明の他の修飾は、本発明の範囲内からそれることなく当業者に明白である。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ダニスコ エー／エス
（Ｂ）番地：ランゲブロガード
（Ｃ）市：コペンハーゲン
（Ｄ）州：コペンハーゲン ケー
（Ｅ）国：デンマーク
（Ｆ）郵便番号:DK−1001
（ii）発明の名称：菌類感染藻類由来のα−1,4−グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物における発現
（iii）配列数:20
（iv）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,バージョン＃1.25（EPO）
（ｖ）現在の出願データ：
出願番号:WO PCT/EP94/03399
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:1088アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号1:
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:1091アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号2:
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:3267塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号3:
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:3276塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号4:
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:90アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号5:
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（21,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号6:
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（21,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号7:
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（xi）配列：配列番号8:
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号9:
（２）配列番号10の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_diffe
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（xi）配列：配列番号10:
（２）配列番号11の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（xi）配列：配列番号11:
（２）配列番号12の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:71塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号12:
（２）配列番号13の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号13:
（２）配列番号14の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:160塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号14:
（２）配列番号15の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:54アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号15:
（２）配列番号16の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:238塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号16:
（２）配列番号17の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:79アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号17:
（２）配列番号18の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号18:
（２）配列番号19の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号19:
（２）配列番号20の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号20:
FR−Ａ−2617502およびBauteら、（Phytochemistry［1988］vol.27 No.11 pp3401−3403）はMorchella vulgarisにおける1,5−Ｄ−アンヒドロフルクトース（「AF」）の見かけの酵素反応による産生について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。可能な酵素反応に言及しているのにもかかわらず、これらの２つの文献は、ヌクレオチド配列の情報はもちろんのこと、いかなる酵素についてのアミノ酸配列も示していない。これらの文献は、AFが抗生物質ピロンミクロテシン（pyrone microthecin）の調製のための前駆体になり得ることを報告する。
Yuら、（Biochimica et Biophysica Acta［1993］vol 1156 pp313−320）は紅海藻からのGLの調製およびAFを生産するためにα−1,4−グルカンを分解するGLの使用について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。GL酵素に言及するのにも関わらず、この文献は同酵素をコードするヌクレオチド配列の情報はもちろんのことその酵素についてのいかなるアミノ酸配列データも示していない。この文献はGLの供給源は藻類であることも示唆している。
本発明では、菌類感染藻類から酵素を単離する工程を包含する、酵素α−1,4−グルカンリアーゼの調製方法が提供される。
好ましくは、この酵素を、同酵素により分解されないゲルを用いて単離および／またはさらに精製する。
好ましくはゲルはデキストリン、好ましくは、β−シクロデキストリン、またはその誘導体、好ましくはシクロデキストリン、より好ましくはβ−シクロ−デキストリンに基づく。
本発明では、本発明の方法により調製されたGL酵素も提供する。
好ましくは、酵素は配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列、あるいはその任意の変異体を含む。
用語「その任意の変異体」は、その結果として生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、配列からの、あるいは配列に対しての、任意の少なくとも１アミノ酸の置換、多様性、修飾、置き換え、欠失、または付加を意味する。
本発明では、酵素α−1,4−グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列を提供する。好ましくはここで配列はその天然環境にはない（すなわち、酵素を発現する細胞生物の天然のゲノムの一部を形成しない）。
好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列である。
好ましくはDNA配列は、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同じ、または相補的、あるいは実質的相同性を有する、もしくは任意の適切なコドン置換を含む配列を包含する。
表現「実質的相同性」は、構造および／またはヌクレオチド成分および／または生物学的活性に関しての相同性を含有する。
表現「任意の適正なコドン置換を含む」は、生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、同じアミノ酸をコードする他のコドンとの任意のコドンの置き換えまたは置換、あるいはコドンの任意の付加または削除を包含する。
他の言葉で言えば、本発明はまた、その中で少なくとも１ヌクレオチドが欠失、置換または修飾される、あるいはその中で付加的な少なくとも１ヌクレオチドが挿入され、グルカンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、修飾されたDNA配列を含有する。好ましくは酵素は、増加したリアーゼ活性を有する。
本発明では、本発明のヌクレオチド配列を発現することを含む酵素α−1,4−グルカンリアーゼの調製方法も提供する。
本発明では酵素、好ましくはGLを精製するためのβ−シクロデキストリンの使用を提供する。
本発明では、少なくともDNA配列が、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または適切なコドン置換を含む配列を含む、ヌクレオチド配列を提供する。好ましくは配列は単離された形態である。
本発明の鍵となる局面は、GLが菌類感染藻類に由来するという認識である。GLをコードする核酸配列の決定に加え、GLのアミノ酸配列が決定されたのはこれが初めてである。それゆえ、本発明の鍵となる有利性は、GLが今や例えば組換えDNA技術により大量に生成し得、それゆえ、抗生物質ミクロテシンなどの化合物を容易に、そして大量に生成し得ることである。
この酵素は、好ましくは精製を容易にするように分泌されるべきである。そのために成熟酵素をコードするDNAを、選択した宿主由来のシグナル配列、プロモーターおよびターミネーターに融合させる。
Aspergillus nigerにおける発現のため、gpdA（Aspergillus nidulansのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来）プロモーターおよびシグナル配列を成熟リアーゼをコードするDNA（例えば配列番号３または配列番号４）の5'末端に融合する。A.nigerのtrpC遺伝子のターミネーター配列をその遺伝子の3'末端におく（Punt,P.J.ら、（1991）:J.Biotech.17,19−34）。この構築物をE.coliのための複製起点および選択オリジンならびにA.nigerのための選択マーカーを含むベクターに挿入する。A.nigerのための選択マーカーの例としては、amdS遺伝子、argB遺伝子、pyrG遺伝子、hygB遺伝子、BmlR遺伝子などがあり、すべて形質転換体の選択に用いられてきた。このプラスミドをA.nigerに形質転換し得、そして成熟リアーゼを形質転換体の培養液中から回収し得る。
この構築物を、培養液中でのリアーゼのタンパク質分解を減少させるためにプロテアーゼ欠損株に形質転換し得る（Archer D.B.ら、（1992）:Biotechnol.Lett.14,357−362）。
他の有利性は以下の記載により明らかになる。
それゆえ、本発明は、例えば、菌類感染藻類、好ましくは中国で収集可能であるタイプ（例えば、Gracilariopsis lemaneiformis）のような菌類感染紅藻類からの酵素α−1,4−グルカンリアーゼの単離に関する。菌類感染藻類の一例をブダペスト条約に従い寄託した（以下を参照のこと）。
インサイチュハイブリダイゼーション技術を用いることにより、酵素GLは菌類感染紅藻類Gracilariopsis lemaneiformis中で検出されることが確立された。この観察を支持する更なる証拠は、サザンハイブリダイゼーション実験の結果により提供された。このようにGL酵素活性は、従来考えられていた藻類よりもむしろ、菌類感染藻類から得られ得る。
特に問題となるのは、各々がGLの特性を有する酵素をコードする２つの天然のDNA配列の発見である。これらのDNA核酸配列の塩基配列を決定し、これらを配列番号３および配列番号４に示す（後に考察し示す）。
最初の酵素精製はYuら（前出）に記載の方法により行い得る。しかし、最初の酵素精製が精製工程で分解しない固体支持体の使用を含むことが好ましい。このゲル支持体は、標準的な実験室のタンパク質精製設備と適合性であるという有利性を有する。この好ましい精製のプロセスの詳細は後述する。精製はタンパク質精製のための公知の標準的な方法により終結される。酵素の純度を補足的な電気泳動技術を用いて確立した。
精製したリアーゼは、pI、至適温度および至適pHにより特性づけられた。この点については、この酵素は以下のような特性を有する：アミロペクチンを使用した場合、至適基質特異性および至適pH3.5〜7.5;至適温度50℃およびpIは3.9。前記のように、本発明による酵素を（アミノ酸配列決定技術により部分的に）同定し、そのアミノ酸配列を後に提供する。同様に、本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列（すなわちGL）を配列決定し、そのDNA塩基配列を後に提供する。
以下の試料をブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited（NCIMB）、23 St.Machar Drive,Aberdeen,Scotland,United Kingdom,AB2 1RYに1994年６月20日に寄託した：
プラスミドpGL1保有E.coli（NCIMB 40652）−［参考DH5α−pGL1］；および
プラスミドpGL2保有E.coli（NCIMB 40653）−［参考DH5α−pGL2］。
以下の試料はブダペスト条約に従い承認された寄託機関であるThe Culture Collection of Algae and Protozoa（CCAP）、Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3,Oban,Argyll,Scotland,United Kingdom,PA34 4ADに1994年10月11日に寄託の承認がされた。
菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis（CCAP 1373/1）−［参考GLQ−１（Qingdao）］。
このように、本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物NCIMB 40652または寄託物NCIMB 40653の対象であるプラスミドに存在するGLコード配列の発現により取得し得るGL酵素；および寄託物CCAP 1373/1の対象である菌類感染藻類から取得し得るGL酵素を包含する。
本発明はここで実施例によってのみ記載される。
以下の実施例において、添付する以下の図に言及する：
図１は、染色した菌類感染藻類を示す；
図２は、染色した菌類感染藻類を示す；
図３は、菌類菌糸の切片を示す；
図４は、菌類感染藻類の切片を示す；
図５は、菌類感染藻類の切片を示す；
図６は、pGL1のプラスミド地図を示す；
図７は、pGL2のプラスミド地図を示す；
図８は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を示し、配列決定したペプチドフラグメントの位置を示す；
図９は、配列番号１と配列番号２とのアライメント（alignment）を示す；
図10は、顕微鏡写真である。
より詳細には、図１は、Gracilariopsis lemaneiformisの上部および下部での菌類を表すCalcoflour White染色を示す（108×および294×）。
図２は、菌類を有するGracilariopsis lemaneiformisのPAS/Anilinblue Black染色を示す。菌類は顕著により高い炭水化物を含有する。
図３は、藻類細胞の厚い壁（ｗ）間で成長する二つの薄い壁の菌類菌糸（ｆ）の縦方向で表面付近の切片を示す顕微鏡写真である。藻類のクロロプラスト中のチラコイド膜に留意（矢印）。
図４は、クローン２プローブを用いたアンチセンス検出（上列）が、次の切片のCalcoflour White染色（下列）により示される菌類に、限定されるようであることを示す（46×および108×）。
図５は、クローン２プローブを用いた強いアンチセンス検出がGracilariopsis lemaneiformis内の菌類上に見出されたことを示す（294×）。
図６は、プラスミドpGL1の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.8kbのフラグメントを含有するpBluescript II KSである。このフラグメントはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
図７は、プラスミドpGL2の地図を示す。これは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformisから作製したゲノムライブラリーから単離した3.6kbのフラグメントを含有するpBluescript II SKである。このフラグメントはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含有する。
図９は、配列番号１（GL1）と配列番号２（GL2）とのアライメントを示す。GL1の総残基数は1088であり;GL2の総残基数は1091である。比較をするにあたって構造−遺伝子的マトリックス（structure−genetic matrix）を用いた（Open gapcost:10;Unit gap cost:2）図９中で、並べた二つの残基が同一であることを示す記号は「：」であり；並べた二つの残基が類似であることを示す記号は「．」である。「類似である」といわれるアミノ酸はA,S,T;D,E;N,Q;R,K;I,L,M,V;F,Y,Wである。全体で、同一が845アミノ酸（すなわち77.67％）存在し；類似が60アミノ酸（5.51％）存在する。GL1に挿入したギャップの数は３であり、GL2に挿入したギャップの数は２である。
図10は、藻類の壁（Ｗ）間で成長した菌糸（ｆ）の顕微鏡写真である。藻類細胞中の紅藻デンプン（ｓ）およびチラコイド（矢印）の粒子に留意。
以下の配列情報は後述のPCR反応のためのプライマーを生成するため、およびそれぞれのヌクレオチド配列により生成されたアミノ酸配列を検定するために用いた。
1.1.1 Gracilariopsis lemaneiformisにおける菌類感染の検出
中国で収集したGracilariopsis lemaneiformisの切片は手で切断するかまたはパラフィン包埋した試料から切断した。切片化した試料を光学顕微鏡で注意深く検査した。菌類菌糸はGracilariopsis lemaneiformis内に明確に検出された。
Gracilariopsis lemaneiformisの葉状体は、高度に整然として、ほぼ対象の特徴を示す細胞から成る。G.lemaneiformisの管状葉状体は大きい、無色の中心細胞、ならびにその周囲に伸長された、細長い楕円形の細胞、および小さい、丸い、赤く着色された周辺細胞から成る。全ての藻類細胞タイプは厚い細胞壁により特性づけられる。ほとんどの菌類菌糸は、大きな細胞の中心層および周辺層の中間相に見出される。これらの細胞は長く円筒形であるため藻類細胞と明確に区別し得る。菌糸の成長は、高度に整然とした藻類細胞の間の不規則性として観察された。最も頻繁な菌糸の方向は、藻類の葉状体の主軸に沿った向きである。中心および周辺に向かう側枝がいくつかの場合で検出される。菌糸は藻類の内性／着生第二世代と混同され得ない。
Calcofluor Whiteはキチンおよびセルロースを含有する組織を染色することが知られている。キチンとの反応は、４個の共有結合した末端のｎ−アセチルグルコサミン残基を要求する。セルロースは、いくつかの藻類では微量に存在し得るが、ほとんど高等植物に限定されていることが一般に受け入れられている。さらにキチンはGracilaria内には存在しないことが公知である。
Calcofluor Whiteは切片化したGracilariopsis lemaneiformisの試料中の菌類菌糸の細胞壁に相当する領域を染色することが見出された。
紫外線下で観察すると、菌糸はGracilaria組織の淡青色の背景に対して明確な白色を示す（図１を参照のこと）。キチンはGracilariaには存在しないが、ほとんどの菌類においては細胞壁の主成分である。これらの観察に基づき、本発明者らは検査した藻類は菌類に感染していると結論する。検査したGracilariopsis lemaneiformis切片の下部の40％は、菌類菌糸に感染していることが見出された。藻類の先端では検査したGracilariopsis lemaneiformisの切片の25％が感染していることが見出された。
Periodic acid Schiff（PAS）およびAniline blue blackでのGracilariopsis lemaneiformis切片の染色は、藻類細胞と比較して菌類細胞内の顕著に高い炭水化物含有を示した（図２を参照のこと）。Safranin OおよびMalachit Greenは、菌類に感染した高等植物に見出されるのと同じ菌類細胞の呈色反応を示した。
Acridin OrangeとGracilariopsis lemaneiformis切片との反応は、明確に菌類の不規則な成長を示した。
1.1.2 電子顕微鏡検査
Calcofluor Whiteを用いて菌類を検出した、15μｍの厚さの切片を有するスライドを２％ OsO4で固定し、水で洗浄し、そしてジメトキシプロパンと無水アルコールで脱水した。アセトンとSpurr樹脂の1:1混合液の一滴をガラススライド上の各々の切片に滴下し、そして１時間後純粋な樹脂の一滴で置き換えた。樹脂を充填したゼラチン包埋カプセルを切片の表面に静置し４℃で一晩放置した。55℃で８時間重合した後、樹脂ブロックに付着した厚い切片は、液体窒素に浸すことによりスライドから分離され得た。
ブロックの形を整え、ミクロトーム上でダイヤモンドナイフを用いて、100nmの厚さの切片を切断した。切片を酢酸ウラニル水溶液およびクエン酸鉛で染色した。切片を電子顕微鏡内で、80kVで検討した。
この検査は光学顕微鏡での観察を確認し、リアーゼを生産する中国の株のG.lemneiformisが菌類の寄生体あるいは共生体に感染しているというさらなる証拠を提供した。
菌類菌糸は、長さ50−100μｍおよび直径僅か数ミクロンの管状細胞から作られている。この細胞は隣接した細胞の間の隔壁で連続的に整列されている。時折分枝も見られる。菌糸は、壁を貫通したり細胞を損傷したりすることなく藻類葉状体の厚い細胞壁の間に成長する。このような共生関係（mycophycobiosisと呼ばれる）はいくつかの糸状海洋菌類および大きな海藻間で起こることが知られている（DonkおよびBruning,1992−藻類中、および藻類上での水生菌類の生態学。Reisser,W.（編）:Algae and Symbioses:Plants,Animals,Fungi,Viruses,Interactions Explored.Biopress Ltd.,Bristol.）
図10の顕微鏡写真を検討すると、藻類細胞および菌類細胞の間のいくつかの違いに気付き得る。藻類の数μｍの厚さの壁と対照的に、菌類の細胞壁は僅か100〜200nmの厚さである。チラコイド膜を有するクロロプラストおよび紅藻デンプン粒子のような植物に典型的なオルガネラが、藻類細胞内には見られ得るが、菌類内には見られない。
紅藻類の細胞間の連結は壁孔プラグ（pit plug）あるいは壁孔連絡と呼ばれる特異的な構造により特徴づけられる。この構造は突起した、電子密核（electron dense core）であり、それらは藻類分類学において重要な特徴である（Pueschel,C.M.:紅藻類の壁孔プラグの超構造の拡張した概観。J.Phycol.25,625（1989））。本発明者らの試料では、このような連絡は頻繁に藻類葉状体内で観察された。しかし、菌類の細胞の間には全く見られなかった。
1.2 インサイチュハイブリダイゼーション実験
インサイチュハイブリダイゼーション技術はアンチセンスリボヌクレオチド配列のmRNAへのハイブリダイゼーションの原理に基づく。この技術はmRNAが存在する顕微鏡切片中の領域を視覚化するために用いられる。この特定の場合、この技術をGracilariopsis lemaneiformis切片中の酵素α−1,4−グルカンリアーゼを局在化するために用いた。
1.2.1 インサイチュハイブリダイゼーションのための35S標識したプローブの調製
第３のPCR増幅からの238bpのPCRフラグメント（クローン２と呼ばれる（前記参照））をpGEM−3Zf（＋）ベクター（Promega）にクローン化した。アンチセンスRNAの転写はSP6プロモーターで駆動し、センスRNAの転写はT7プロモーターで駆動した。Ribonuclease protection assay kit（Ambion）を以下のとおり改変して使用した。転写産物を６％シーケンシングゲルで泳動して、取り込まれていないヌクレオチドを除去し、T7RNA polymerase in vitro Transcription Kit（Ambion）で提供される溶出緩衝液で溶出した。アンチセンス転写産物は23の非コードヌクレオチドを含み、一方センス転写産物は39の非コードヌクレオチドを含んでいた。ハイブリダイゼーションのために107cpm/mlの35S標識したプローブを用いた。
インサイチュハイブリダイゼーションは本質的にLangedaleら（1988）に記載のように実施した。ハイブリダイゼーションの温度は45℃が至適であることが見出された。45℃で洗浄した後、切片をKodaK K−5 photographic emulsionで覆い、３日間５℃で暗所に放置した（Langedale,J.A.,Rothermel,B.A.およびNelson,T.（1988）.Genes and development 2:106−115.Cold Spring Harbour Laboratoryを参照）。
α−1,4−グルカンリアーゼのmRNAに対するリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション実験は、Gracilariopsis lemaneiformis内に検出された菌類の菌糸の上面および周辺に強いハイブリダイゼーションを示した（図４および５参照）。これはα−1,4−グルカンリアーゼが生産されていることを示す強い証拠であると考えられる。弱いランダムなバックグラウンド反応を両方のGracilariopsis lemaneiformisの藻類組織で検出した。この反応は、センスおよびアンチセンス両方のプローブについて観察された。菌類菌糸の上面の強い染色はアンチセンスプローブを用いたときにのみ得られた。
これらの結果はハイブリダイゼーションおよび洗浄の工程における45℃での標準的なハイブリダイゼーションの条件を用いて得られた。50℃では菌類の上面の染色は観察されなかったが、バックグラウンドの染色は同様であった。55℃に温度を上げることにより、センスおよびアンチセンスプローブの両方で、有意にかつ等しくバックグラウンドの染色が減衰した。
相補的染色手順を用いた細胞学的検査に基づき、Gracilariopsis lemaneiformisは菌類に感染していることが結論される。感染は、藻類組織の下部において最も顕著である。
切片化したGracilariopsis lemaneiformis試料において、インサイチュハイブリダイゼーションの結果は、ハイブリダイゼーションが菌類の感染が見い出される領域に限定されていることを明確に示す（図４参照）。この結果はα−1,4−グルカンリアーゼのmRNAがGracilariopsis lemaneiformisの菌類に感染した領域に限定されているように見えることを示す。
これらの観察に基づき、本発明者らは菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis内にα−1,4−グルカンリアーゼ活性が検出されると結論する。
2. 酵素の精製と特徴付け
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼの精製は以下のように実施した。
2.1 材料と方法
藻類は濾過により回収し、0.9％ NaClで洗浄した。細胞をホモゲナイゼーションによって破壊し、次いで氷上で６×３分間、50mMクエン酸−NaOH pH6.2（緩衝液Ａ）中で超音波破砕した。細胞破片（debris）は25,000×ｇ、40分間遠心して取り除いた。この手順で得られた上清を無細胞抽出物とみなし、８〜25％の勾配ゲルで分離した後、活性染色およびウエスタンブロッティングに用いた。
2.2 β−シクロデキストリンSepharoseゲルによる分離
無細胞抽出物をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化したβ−シクロデキストリンSepharoseゲル4Bカラム（2.6×18cm）に直接かけた。このカラムを３倍量の緩衝液Ａおよび1M NaClを含む２倍量の緩衝液Ａで洗浄した。α−1,4−グルカンリアーゼを緩衝液Ａ中の２％デキストリンを用いて溶出した。活性のある画分をプールし、緩衝液を20mMビス−トリスプロパン−HCl（pH7.0,緩衝液Ｂ）に変えた。
活性のある画分をあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したMono Q HR 5/5カラムにかけた。菌類のリアーゼを0.3M NaClの直線勾配で緩衝液Ｂを用いて溶出した。
β−シクロデキストリンSepharoseクロマトグラフィーの後に得られたリアーゼ調製物は、あるいは150μｌに濃縮し、FPLC条件下で操作されたSuperose12カラムにかけた。
2.3 α−1,4−グルカンリアーゼ活性のアッセイならびに基質特異性、至適pH、および至適温度決定のための条件
α−1,4−グルカンリアーゼ活性のアッセイのための反応混合液は10mg/mlアミロペクチンおよび25mM Mes−NaOH（pH6.0）を含んだ。反応は30℃で30分間行い、3,5−デニトロサリチル酸試薬を加えて停止した。光学密度は、室温で10分間おいた後に550nmで測定した。
3. 菌類感染Gracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼのアミノ酸配列決定
3.1 リアーゼのアミノ酸配列決定
リアーゼをClostridium histolyticum由来のエンドプロティナーゼArg−ＣまたはLysobacter enzymogenes由来のエンドプロティナーゼLys−Ｃのいずれかでで消化した。いずれも配列決定用グレードであり、Boehringer Mannhein,Germanyから購入した。エンドプロティナーゼArg−Ｃでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ（0.1mg）を50μｌの10M尿素、50mMメチルアミン、0.1M Tris−HCl、pH7.6に溶解した。N2で覆い、10μｌの50mM DTTおよび5mM EDTAを添加し、N2下50℃で10分間、タンパク質を変性および還元させた。続いて、10μｌの50mM Tris−HCl、pH8.0中の１μｇのエンドプロティナーゼArg−Ｃを添加し、N2で覆い、消化を37℃で６時間行った。次のシステインの誘導体化のために、12.5μｌの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下、暗所で室温、15分間インキュベートした。
エンドプロティナーゼLys−Ｃでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ（0.1mg）を50μｌの8M尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.4に溶解した。N2で覆い、５μｌの45mM DTTを添加した後、N2下50℃で15分間、タンパク質を変性および還元させた。室温まで冷却した後、５μｌの100mMヨードアセトアミドを添加して、N2下、暗所で室温、15分間システインを誘導体化した。
次に、90μｌの水および50μｌの50mM tricineおよび10mM EDTA、pH8.0中の５μｇのエンドプロティナーゼLys−Ｃを添加し、消化をN2下37℃24時間行った。
この結果生じたペプチドを溶媒Ａ（水中の0.1％ TFA）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の0.1％ TFA）を用いて、VYDAC C18カラム（0.46×15cm;10μm;The Separations Group;California）上の逆相HPLCに分離した。選択したペプチドをパルス化高速液体サイクル（pulsed−liquid fast cycles）を用いてApplied Biosystems 476Aシーケンサーによって配列決定する前に、Develosil C18カラム（0.46×10cm;3μm;Dr.Ole Schou,Novo Nordisk,Denmark）で再クロマトグラフした。
菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の酵素からのアミノ酸配列情報を以下、特に配列番号１、および配列番号２に示す。
配列番号１は以下を有する：
アミノ酸残基数:1088
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
アミノ酸残基数:1091
アミノ酸組成（シグナル配列を含む）
研究により天然のグルカンリアーゼ１のＮ−末端配列がブロックされていることが示された。脱ブロック化を本質的にLeGendreら（1993）［タンパク質およびペプチドのSDS−PAGEによる精製;Matsudaira,P.（編）A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing,第２版;Academic Press Inc.,San Diego;pp.74−101］に記載の方法に従い、PVDF膜にブロットされたグルカンリアーゼ１を無水TFAで40℃で30分間処理することにより達成した。得られた配列はTALSDKQTAであった。これはグルカンリアーゼ１のクローン由来の配列（配列番号１の51位〜59位の配列）と一致し、グルカンリアーゼ１のＮ−末端残基がＮ−アセチルスレオニンであることを示す。配列番号１の１位〜50位の配列はシグナル配列を表す。
4. 菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来のα−1,4−グルカンリアーゼをコードする遺伝子のDNA配列決定
4.1 分子生物学のための方法
以下の改変を加えてSaunders（1993）に記載の方法のようにDNAを単離した：ポリサッカライドを、DNAからゲル精製のかわりにELUTIP−ｄ（Schleicher ＆ Schuell）精製により除去した（Saunders,G.W.（1993）．紅藻類ゲノムDNAのゲル精製:PCRに有用なDNAを単離するための、安価で迅速な方法。Journal of phycology 29（２）:251−254およびSchleicher ＆ Schuell:ELUTIP−d.DNAの精製および濃縮のための迅速な方法。を参照）。
4.2 PCR
目的のDNAの調製は、Gene Amp DNA Amplification Kit（Perkin Elmer Cetus,USA）を使用し、Taqポリメラーゼを後に加え（PCRサイクルを参照のこと）、温度サイクルを以下のように変更した以外は製造業者の使用説明書に従い行った：
PCRサイクル：
サイクル数 Ｃ 時間（分）
１ 98 ５
60 ５
Taqポリメラーゼおよび油の添加
35 94 １
47 ２
72 ３
１ 72 20
4.3 PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントは製造業者の使用説明書に従いpT7Blue（Novagen）にクローニングした。
4.4 DNA配列決定
二本鎖DNAはSangerら（1979）のジデオキシ法に本質的に従い、Auto Read Sequencing Kit（Pharmacia）およびPharmacia LKB A.L.F.DNAシーケンサー（参考:Sanger,F.,Nicklen,S.およびCoulson,A.R.（1979）。鎖終結インヒビターを用いたDNA配列の決定Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463−5497.）を用いて配列決定を行った。
配列を配列番号３および４として示す。ここで、
配列番号３は以下を有する：
総塩基数:3267。
DNA配列組成:850 A;761 C;871 G;785 T
配列番号４は以下を有する：
総塩基数:3276。
DNA配列組成:889 A;702 C;856 G;829 T
4.5 ライブラリーのスクリーニング
Stratageneより得た、λZapライブラリーのスクリーニングを、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを２×SSC、0.1％ SDS、10×Denhardt'sおよび100μg/ml変性サケ***DNA中で行った以外は製造者の使用説明に従って行った。ハイブリダイゼーション溶液に32Pで標識した変性プローブを添加した。ハイブリダイゼーションは55℃で一晩行った。フィルターを２×SSC、0.1％ SDS中で２回、および１×SSC、0.1％ SDS中で２回洗浄した。
4.6 プローブ
クローン化したPCRフラグメントを、適切な制限酵素を用いた消化により、pT7blueベクターから単離した。フラグメントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、フラグメントをAgarase（Boehringer Mannhein）によってアガロースから精製した。フラグメントはわずか90〜240bpの長さであったので、単離したフラグメントを、Prime−It random primer Kit（Stratagene）またはReady to Go DNA labelling kit（Pharmacia）を用いて32P−dCTPで標識する前にライゲーション反応に曝した。
4.7 結果
4.7.1 α−1,4−グルカンリアーゼをコードするPCR DNAフラグメントの生成
α−1,4−グルカンリアーゼ由来の、３つの重複するトリプシンペプチドのアミノ酸配列（下に示す）を、混合オリゴヌクレオチドを生成するために用いた。このオリゴヌクレオチドはPCRプライマーとして用いられ得た（前記の配列を参照）．
第１のPCR増幅において、プライマーA/B（前記参照）を上流のプライマーとして、プライマーＣ（前記参照）を下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは71塩基対である。
第２のPCR増幅において、プライマーA/Bを上流のプライマーとして、Ｅ（前記参照）を下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは161塩基対である。
第３のPCR増幅において、プライマーF1（前記参照）およF2（前記参照）を上流のプライマーとして、Ｅを下流のプライマーとして用いた。予想されるPCR産物の長さは238塩基対である。このPCR産物を２％ LMTアガロースゲルで分析し、予想される長さのフラグメントをゲルから切り出して、Agarase（Boehringer Manheim）で処理し、そしてpT7buleベクター（Novagen）にクローン化して配列決定した。
第１および第２のPCR増幅由来のクローン化したフラグメントは、配列決定したペプチド（前記参照）に相当するアミノ酸をコードしていた。第３の増幅由来のクローン（前記参照）は配列決定したペプチドに対して約87％のみ相同であった。
4.7.2 クローン化したPCRフラグメントを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング。
前記したクローンを用いたライブラリーのスクリーニングにより２つのクローンを得た。１つのクローンは配列番号４（遺伝子２）のヌクレオチド配列を含有した。他のクローンは配列番号３の配列の一部を含有した（塩基対1065から下流）（遺伝子１）。
配列番号３の5'末端（すなわち塩基対1064から上流）はGibco BRLの5'race systemを用いたRACE（rapid amplification of cDNA ends）手順（Michael,A.F.,Michael,K.D.およびMartin,G.R.（1988）.Proc..Natl.Acad.Sci.USA 85:8998−99002）により得た。全RNAをCollingeら（Collinge,D.B.,Milligan D.E;,Dow,J.M.,Scofield,G.およびDaniels,M.J.（1987）.Plant Mol Biol 8:405−414）に従い単離した。5'raceは１μｇの全RNAを用いて製造業者のプロトコルに従い実施した。第２の増幅由来のPCR産物をNovagenのpT7blue vectorに製造業者のプロトコルに従いクローン化した。PCRエラーを補償するために３つの独立したPCRクローンを塩基配列決定した。
上で記載のクローンにATG開始コドンの直前のXba IおよびNde I制限部位を補足するために以下のオリゴヌクレオチドを上流のプライマーに用いて：
GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG、そして配列GL I（すなわち配列番号３）の塩基対1573−1593の相補配列を含むプライマーを下流のプライマーとして用いて、追加のPCRを実施した。
遺伝子１の完全な配列（すなわち配列番号３）はStratageneのpBluescript II KS＋ベクターに遺伝子の3'末端をゲノムクローン由来のBamH I−Hind IIIフラグメントとしてクローン化し、そしてさらにPCRにより生成した遺伝子の5'末端をXba I−BamH Iフラグメントとして3'末端の前にクローン化することにより生成した。
遺伝子２を、Hind III平滑末端化フラグメントとしてStratageneのpBluescript II KS＋ベクターのEcoR V部位にクローン化した。3'非転写配列の一部をSac I消化により除去し、次に再結合した。Hind IIIおよびHpa I制限部位を開始ATGの直前に、Hind IIIおよびNal I消化、および以下のアニールしたオリゴヌクレオチドの存在下での再結合により導入した。
クローン１タイプ（配列番号３）は100％の同一性を示して、10のペプチド配列全てと（図８参照）並べ得る。菌類に感染した藻類Gracilariopsis lemaneiformisから単離された遺伝子によりコードされる二つのタンパク質の配列のアライメントは約78％の同一性を示した。これは両方の遺伝子がα−1,4−グルカンリアーゼをコードすることを示す。
5. 微生物におけるGL遺伝子の発現
（例えば、Pichiaのリアーゼ形質転換体およびAspergillusのリアーゼ形質転換体の分析）
GLをコードするDNA配列を微生物に導入し、高い比活性を有する酵素を大量に生産した。
これに関して、遺伝子１（すなわち配列番号３）をPichia pastorisで発現させるために（Invitrogenにより供給されるPichia Expression Kit中に記載のプロトコールに従って）Pichia発現ベクターpHIL−D2（AOX1プロモーターを含有する）をEcoR Iで消化し平滑末端化（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）したものに、Not I−Hind III平滑末端化（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）フラグメントとしてクローン化した。
別の実施態様では、MC遺伝子１すなわち配列番号３は、Aspergillus nigerで発現させるために（Pallら、（1993）Fungal Genet Newslett.vol40 pages 59−62）、Aspergillus発現ベクターpBARMTE1（Neuropera crassa由来のメチルトリプトファン耐性プロモーターを含有する）をSma Iで消化したものに、Not I−Hind III平滑末端化フラグメント（Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用）としてクローン化した。プロトプラストはDaboussiら（Curr Genet（1989）Vol 15 pp453−456）に従って溶解（lysing）酵素Sigma L−2773およびリティカーゼ（lyticase）Sigma L−8012を使用して調製した。プロトプラストの形質転換はBuxtonら（Gene（1985）vol37 pp207−214）に記載のプロトコルに従ったが、形質転換したプロトプラストのプレーティングに関しては、0.6％の浸透圧安定化トップアガロースを使用した以外はPuntら（Methods in Enzymology（1992）vol216 pp447−457）により立案されたプロトコールに従った。
結果は、形質転換したPichia pastorisおよびAspergillus nigerにおいてリアーゼ活性が観察されたことを示した。
5.1 一般的方法
無細胞抽出物の調製
細胞は9000rpm、５分間遠心することによって回収し、0.9％NaClで洗浄し、破砕（breaking）緩衝液（1mM EDTA、および５％グリセロール含有50mM K−リン酸、pH7.5）に再懸濁した。細胞はガラスビーズおよびボルテックス処理を用いて破砕した。破砕緩衝液は1mMのPMSF（プロテアーゼインヒビター）を含有した。リアーゼ抽出物（上清）を、9000rpmで５分間遠心し、次いで20,000×ｇで５分間遠心後得た。
アルカリ性3,5−ジニトロサリチル酸試薬（DNS）によるリアーゼ活性のアッセイ
リアーゼ抽出物の１倍量を等量の４％アミノペクチン溶液と混合した。反応混合液は制御された温度でインキュベートし、そして試料は特定の間隔で取り出しAFについて分析した。
リアーゼ活性はまた、放射活性方法を使用して分析した。
反応混合液は、10μｌの14C−デンプン溶液（１μCi;Sigma Chemicals Co.）および10μｌのリアーゼ抽出物を含有した。反応混合液は25℃で一晩おき、その後通常のTLC系で分析した。生成された放射活性AF産生量はInstant Imager（Pachard Instrument Co.,Inc.,Meriden,CT）を用いて検出した。
電気泳動およびウェスタンブロッティング
SDS−PAGEは８〜25％勾配ゲルおよびPhastSystem（Pharmacia）を使用して行った。ウェスタンブロッティングもPhastSystemのSemidry transfer unitで実施した。
Quindao（China）で採取された紅海藻から精製されたリアーゼに対して生じた１次抗体を1:100に希釈して使用した。アルカリホスファターゼ（Dako A/S,Glostrup,Denmark）に結合したブタ抗ウサギIgGを２次抗体として使用し、1:1000に希釈して使用した。
結果
I. リアーゼ活性は、５日間のインキュベーション（0.2％カゼイン酵素的加水分解産物を含む最少培地）の後、アルカリ性3,5−ジニトロサリチル酸試薬による分析で測定した。
１）培養培地のリアーゼ活性の分析
培養培地に含まれる0.2％アミロペクチンとともに増殖させた35の培養物の中で、AFは２つの培養物でのみ検出された。5.4＋および5.9＋の培養培地はそれぞれ0.13g AF/リットルおよび0.44g/リットルを含有していた。この結果は活性なリアーゼが細胞から分泌されていることを示した。リアーゼ活性はまた、無細胞抽出物中でもまた測定可能であった。
形質転換したE.coliを用いた実験は（QiagenのQia express vector kitのクローニングベクターpQE30を用いた）、酵素の発現を示し、この酵素は菌類に感染したGracilariopsis lemaneiformis由来の精製した酵素に対する抗体により認識された。
宿主としてAspergillus nigerの代わりに、良好な発現系として公知の他の工業的に重要な微生物も使用され得る；それらの例としては以下が挙げられる。
Aspergills oryzae,Aspergillus sp.,Trichoderma sp.,Saccharomyces cerevisiae,Kluyveromyces sp.,Hansenula sp.,Pichia sp.,Bacillus subtilis,B.amyloliquefaciens,Bacillus sp.,Strepromyces sp.or E.coli.
本発明の他の好ましい実施態様は、以下のすべてを含む：本明細書に記載のDNA配列を導入した結果AF産生能力を有する形質転換された宿主生物；微生物であるこのような形質転換された宿主生物−好ましくはここで宿主生物は細菌、糸状菌、菌類および酵母からなる群から選択される；好ましくは宿主生物は以下の生物からなる群から選択される：
Saccharomyces,Kluyveromyces,Aspergillus,Trichoderma Hansenula,Pichia,Bacillus Streptomyces,Eschericia such as Aspergillus oryzae,Saccharomyces cerevisiae,bacillus sublilis,Bacillus amyloliquefascien,Eschericia coli.
；同上の配列をコードするヌクレオチド配列を含有する形質転換された宿主生物によて発現される酵素α−1,4−グルカンリアーゼとα−1,4−グルカン（例えばデンプン）の接触工程を包含する糖1,5−Ｄ−アンヒドロフルクトースの調製方法、好ましくは、ここでヌクレオチド配列はDNA配列であり、好ましくはここでDNA配列は、本明細書中で先に記載の配列の１つである；本明細書が先に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター、好ましくは、ここでベクターは複製ベクターである、好ましくは、ここでベクターはプロモーター配列から下流にヌクレオチド配列を含有する発現ベクターである、好ましくは、ベクターはマーカー（例えば耐性マーカー）を含有する；このようなベクターで形質転換された細胞性生物、または細胞系、；産物α−1,4−グルカンリアーゼを産生する方法あるいはα−1,4−グルカンリアーゼをコードする任意のヌクレオチド配列、またはその部分、これは、このようなベクターで形質転換されたこのような生物（または細胞系由来の細胞）の培養および産物の回収を包含する。
本発明の他の修飾は、本発明の範囲内からそれることなく当業者に明白である。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称：ダニスコ エー／エス
（Ｂ）番地：ランゲブロガード
（Ｃ）市：コペンハーゲン
（Ｄ）州：コペンハーゲン ケー
（Ｅ）国：デンマーク
（Ｆ）郵便番号:DK−1001
（ii）発明の名称：菌類感染藻類由来のα−1,4−グルカンリアーゼ、その精製、遺伝子クローニングおよび微生物における発現
（iii）配列数:20
（iv）コンピューター読み出し形態：
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用
（Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,バージョン＃1.25（EPO）
（ｖ）現在の出願データ：
出願番号:WO PCT/EP94/03399
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:1088アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号1:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:1091アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号2:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:3267塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号3:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:3276塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号4:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:90アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号5:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（21,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号6:
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（21,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号7:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（xi）配列：配列番号8:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:20塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（9,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（18,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＣまたはＴである”
（xi）配列：配列番号9:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_diffe
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡまたはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（12,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（xi）配列：配列番号10:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:17塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（3,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＴまたはＣである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（6,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（ix）配列の特徴：
（Ａ）特徴を表す記号:misc_difference
（Ｂ）存在位置：置換（15,""）
（Ｄ）他の情報:/記＝“ＮはＧまたはＡである”
（xi）配列：配列番号11:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:71塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号12:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:23アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号13:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:160塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号14:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:54アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号15:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:238塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号16:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:79アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号17:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:28塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号18:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:36塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号19:
（ｉ）配列の特色：
（Ａ）長さ:34塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（xi）配列：配列番号20:
Claims (13)
- 酵素α−1,4−グルカンリアーゼ（GL）の調製方法であって、該酵素を菌類感染藻類から単離する工程を包有し、該酵素が、α−1,4−グルカンリアーゼ活性を有する、配列番号１または配列番号２あるいは１個またはいくつかのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するそれらの変異体のアミノ酸配列を有する、方法。
- 前記酵素が、該酵素により分解されないゲルを用いて単離および／またはさらに精製される、請求項１に記載の方法。
- 前記ゲルが、デキストリンまたはその誘導体に基づく、請求項２に記載の方法。
- α−1,4−グルカンリアーゼ活性を有する、配列番号１または配列番号２あるいは１個またはいくつかのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するそれらの変異体のアミノ酸配列を有するGL酵素であって、該酵素が請求項１から３のいずれか１項に記載の方法により調製される、GL酵素。
- α−1,4−グルカンリアーゼ活性を有する、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列、あるいは１個またはいくつかのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するそれらの変異体を含む酵素。
- 請求項４または５に記載の酵素α−1,4−グルカンリアーゼをコードするヌクレオチド配列。
- 前記配列がDNA配列である、請求項６に記載のヌクレオチド配列。
- 前記DNA配列が、配列番号３または配列番号４に同一または相補的であるか、あるいは配列番号３または配列番号４のコドンのうちのいずれかについて適正なコドン置換を含む配列を含む、請求項７に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項６から８のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を発現させる工程を包含する、酵素α−1,4−グルカンリアーゼの調製方法。
- 前記藻類がGracilariopsis lemaneiformisである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
- DNA配列が、配列番号３または配列番号４に同一または相補的であるか、あるいは配列番号３または配列番号４のコドンのうちのいずれかについて適正なコドン置換を含む配列を含む、ヌクレオチド配列。
- 前記ゲルがシクロデキストリンに基づく、請求項３に記載の方法。
- 前記シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンである、請求項12に記載の方法。
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