JP3542181B2 - New protein - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規構造を有するタンパクを提供するものである。詳細には、一本のポリペプチド鎖中にＷＤ４０繰り返し構造領域と７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域とを同時に有するタンパク、および、さらにアクチン結合性および／または潜在的リン酸化部位を有するタンパクを提供する。
また本発明は、該タンパクのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞および該宿主細胞を培養することによる該タンパクの製造方法、および該タンパクまたはその断片に対して親和性を有する抗体を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヘテロ３量体ＧＴＰ結合タンパク〔Ｇタンパク、トランスデューシン（transducin) 〕のβサブユニットの構造中に見られるＷＤ４０リピートと称される繰り返し構造を有する多くのタンパクが報告されており、ＷＤ４０ファミリーと呼ばれている。これまで報告されたＷＤ４０ファミリーに属するタンパクはいずれも細胞内に見出され、細胞内の局在により大きく下記の３つのグループに分類されている〔FEBS, 307, (2), p131-134, (1992)〕。
【０００３】
第一のグループは「核内」に存在するものであり、例えば、酵母由来ＣＤＣ４（J. Mol. Biol., 195, 233-245, 1987, Yochem,J., et al ： Biochem. Biophys. Res. Commun, 172, 1324-1330, 1990, Choi,W.J., et al) 、酵母由来ＰＲＰ４（Cell, 58, 811-812, 1989, Dalrymple.M.A, et al ：Mol. Cell. Biol, 9, 3710-3719, 1989, Banrogunes,J., et al ： Trends. Gen, 7, 79-85, 1991, Ruby,S.W., et al) 、酵母由来ＴＵＰ１（Cell, 68, 709-719, 1992, Keleher,A.C., et al）およびショウジョウバエ由来のｄＴＡＦII８０等が知られている。
これらのタンパクは、遺伝子の転写、染色体の複製あるいは細胞の***および増殖に関与していると考えられている。
【０００４】
第二のグループは「細胞膜の内側の近接した位置」に存在するものであり、例えば、哺乳動物由来Ｇタンパクβサブユニット（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2162-2166, 1986, Fong,H.K.W., et al ： Science, 252, 802-808, 1991, Simon,M.I., et al)、ショウジョウバエ由来のＥｓｐ１（Cell, 55, 785-795, 1988, Hertley,D.A., et al）および酵母由来ＳＴＥ４（Cell, 56, 467-477, 1989, Whiteway,M., et al ）等が知られている。
これらのタンパクは、細胞外からの、および／あるいは細胞内での種々の情報伝達に関与していると考えられている。
【０００５】
第三のグループは「細胞の細胞骨格の構成要素」として存在するものであり、例えば、粘菌由来のコロニン（Coronin ）が知られている。このタンパクは、細胞運動の調節に関与するアクチンに結合性を有し、Ｇタンパクを介したｃＡＭＰレセプターからの走化性シグナルの皮質細胞骨格への伝達に関与すると考えられている〔EMBO J, 10(13), 4097-4104, 1991, E.L.de Hosts, et al〕。
【０００６】
これら以外にも、ＷＤ４０ファミリーに属するタンパクとして、酵母由来のＣＤＣ２０（Molecullar and Cellular Biology, 11 (11) 5592-5602, 1991）、ニワトリ由来の１２．３（Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 4594-4598, 1989）、酵母由来のＰＲＰ１７（Trends Gen, 7, 79-85, 1991）、酵母由来のＭＡＫ１１（J.Biol.Chem.,263, 1467-1475, 1988 ）、酵母由来のＳＫ１８（Yeast, 9, 43-51, 1993 ）等が知られており、これらは遺伝子の転写、染色体の複製、細胞の***および増殖、情報の伝達等に関与していると考えられている〔FEBS, 307, (2), 131-134, 1992, Loesje, von der. Voom, et al 〕。
【０００７】
また近年、ある種のＤＮＡ結合タンパクに、７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造からなるロイシンジッパー（leucine-zipper) 構造と呼ばれる特徴的な高次構造が共通して存在することが見出されている。そして、この構造領域はαヘリックスを形成する。さらに、当該タンパクは同様の構造を有する別のタンパクとともに、ファンデルワールス力，静電気的相互作用，疎水結合や水素結合等の物理化学的作用結合により、互いのヘリックスが平行に互いにねじれて重なりあうことによりコイルドコイル構造を形成し得ることが知られている（実験医学，Vol.12, No.14, pp.94-96, 1994 ）。
このような構造を有するタンパクとしては、例えば転写調節因子であるＣ／ＥＢＰ、ＣＲＥＢ、ＧＣＮ４、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ等が知られている〔実験医学、11 (8)，62-68, 1993, 今川正良〕。
【０００８】
さらに、アクチンに結合性を有するタンパクについては、これまで数多く知られており（蛋白質・核酸・酵素，39,3, 212-220, 1994 ）、例えばブタ由来ＡＳＰ−５６（FEBS Letters, 298, 149-153, 1992）、ヒト由来ＨＳＰ−９０（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 83, 8054-8058, 1986）、ＭＡＲＣＫＳ（Cell, 71, 713-716, 1992 ）、フオドリン（Physiol.Rev., 70, 1029-1065, 1990 ）等のアクチン結合性タンパクは、細胞***、細胞膜輸送、細胞運動、細胞周期の調節および細胞増殖において重要な役割を担っていることが知られている。
また、ゲルゾリン（Oncogene, 8, 2531-2536, 1993）、テンシン（Science,252,712-715, 1991 ）、メルリン（Cell, 72, 791-800, 1993 ）、トロポミオシン（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 90, 7039-7043, 1993）、α−アクチニン（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 90,383-387, 1993 ）、リポコルチンＩ（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 89,3571-3575, 1992 ）及びビンキュリン（J.Cell Biol., 119,427-438, 1992 ）等のアクチン結合性タンパクは、腫瘍形質抑制活性を示すことが知られている。さらに、プロフィリン（Science, 247, 1575-1578, 1990 ）、ゲルゾリン（J.Biol.Chem., 267, 11818-11823, 1992）、テンシン（Muscle Res.Cell Motility, 12, 136-144, 1991 ）、α−アクチニン（Cold Spring Harbor Laboratory Meeting, The Cytoskeleton and Cell Function, Cold Spring Harbor, 1993 ）、ビンキュリン（Nature, 359,150-152, 1992 ）等のアクチン結合性タンパクは、細胞内情報伝達系におけるイノシトールリン脂質代謝において役割を担っていることが知られている。
【０００９】
しかしながら、一本のポリペプチド鎖中に、上述のＷＤ４０繰り返し構造および７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造といった特徴的な構造を同時に有し、かつアクチンに結合するタンパクは、全く知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、一本のポリペプチド鎖中に、ＷＤ４０繰り返し構造および７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造の両方の構造を同時に有する新規タンパクを提供することである。
また近年、タンパク質の効率的かつ大量製造において遺伝子工学的手法による方法が必須になりつつある。従って、本発明は、上記の新規タンパクの製造に必要かつ有用な該タンパクのアミノ酸配列、該アミノ酸配列をコードする遺伝子、その発現系および遺伝子工学的な該タンパクの製造方法を提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、当該新規タンパクまたはその断片に親和性を有する抗体を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の目的を達成すべく鋭意研究したところ、哺乳動物の胸腺細胞から、一本のポリペプチド鎖中に、ＷＤ４０繰り返し構造と７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造とを同時に有する新規タンパクを見出し、該タンパクの一次構造およびその遺伝子の塩基配列を決定、取得することに成功した。
この知見をもとに、さらに研究を重ねたところ、該タンパクが細胞内での情報伝達系におけるエネルギー伝搬に関与する潜在的リン酸化部位を有し、さらに細胞運動の制御において重要な役割を担うアクチンに対して結合性を有するといった有用な性状を持っていることを確認して本発明を完成するに到った。
【００１２】
すなわち、本発明は次に述べるものである。
(1) 一本のポリペプチド鎖中に、ＷＤ４０繰り返し構造領域及び７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域を有することを特徴とするタンパク。
(2) 一本のポリペプチド鎖中、Ｃ末端領域に７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造を、該繰り返し構造領域よりＮ末端側領域にＷＤ４０繰り返し
構造を有することを特徴とするタンパク。
(3) アクチンに対して結合性を有する上記(1) または(2) に記載のタンパク。
(4) 一本鎖のポリプチド鎖中に、潜在的なリン酸化部位を有する上記(1) 〜(3) のいずれかに記載のタンパク。
(5) ＷＤ４０繰り返し構造領域が、配列表配列番号１，２，３，４又は５で示されるアミノ酸配列がＣ末端方向にこの順序で配置されてなるアミノ酸配列、就中配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するものである上記(1) 〜(4) のいずれかに記載のタンパク。
(6) ７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造が配列表配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする上記(1) 〜(5) のいずれかに記載のタンパク。
(7) ヒト由来のタンパクである(1) 〜(6) のいずれかに記載のタンパク。
(8) 配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する上記(1) 〜(7) のいずれかに記載のタンパク。
(9) 上記(1) 〜(8) のいずれかに記載のタンパクが、７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域において、７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域を有する別の一のタンパクと物理化学的に結合することによって形成される２量体タンパク。
(10)上記(1) 〜(8) のいずれかに記載のタンパクをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、好ましくは配列番号８記載の塩基配列中、塩基番号１００乃至１４８２で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
(11)上記(10)のＤＮＡを含有する組換えベクター。
(12)上記(11)の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
(13)上記(12)の宿主細胞を培養し、得られる培養物から採取されることを特徴とする上記(1) 〜(10)記載のタンパクの製造法。
(14)実質的に配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列の全部または一部を有するペプチドに親和性を示す抗体。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用られるアルファベットの三文字あるいは一文字は、次に示すアミノ酸を意味する。
（Ｇｌｙ／Ｇ）グリシン、（Ａｌａ／Ａ）アラニン、（Ｖａｌ／Ｖ）バリン、（Ｌｅｕ／Ｌ）ロイシン、（Ｉｌｅ／Ｉ）イソロイシン、（Ｓｅｒ／Ｓ）セリン、（Ｔｈｒ／Ｔ）スレオニン、（Ａｓｐ／Ｄ）アスパラギン酸、（Ｇｌｕ／Ｅ）グルタミン酸、（Ａｓｎ／Ｎ）アスパラギン、（Ｇｌｎ／Ｑ）グルタミン、（Ｌｙｓ／Ｋ）リジン、（Ａｒｇ／Ｒ）アルギニン、（Ｃｙｓ／Ｃ）システイン、（Ｍｅｔ／Ｍ）メチオニン、（Ｐｈｅ／Ｆ）フェニルアラニン、（Ｔｙｒ／Ｙ）チロシン、（Ｔｒｐ／Ｗ）トリプトファン、（Ｈｉｓ／Ｈ）ヒスチジン、（Ｐｒｏ／Ｐ）プロリン。
【００１４】
本発明のタンパク（以下、ｐ５７タンパクともいう）は、一本のポリペプチド鎖中に、ＷＤ４０繰り返し構造領域と７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域とを同時に有することを特徴とするタンパクである。好ましくは、一本のポリペプチド鎖中、Ｃ末端領域に７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造を有し、該繰り返し構造領域よりＮ末端側領域にＷＤ４０繰り返し構造を有することを特徴とするタンパクであり、より好ましくは、更に▲１▼アクチンに対して結合性を有する、及び／または▲２▼潜在的リン酸化部位を有する、ことを特徴とするタンパクである。
【００１５】
本発明でいう「ＷＤ４０繰り返し構造」とは、ＷＤリピートタンパクと称される真核生物由来のタンパクに高い割合で保存されている特徴的な繰り返し構造を意味し、その例としては、NATURE. VOL 371, 22 SEPTEMBER 1994 p297-300 、就中第298 頁図１および第299 頁表１、に記載の構造が挙げられる。
【００１６】
より具体的には、本発明でいう「ＷＤ４０繰り返し構造」は、下記一般式（Ｉ）：
で示されるアミノ酸配列、または当該一般式（Ｉ）を基準としてＸ1 以外のアミノ酸残基のミスマッチングが８個以下の範囲であるアミノ酸配列を“繰り返し単位配列”として、かかる“繰り返し単位配列”が少なくとも２回繰り返されてなるアミノ酸配列構造領域を意味する。なお、「ＷＤ４０繰り返し構造」を構成する“繰り返し単位配列”は、各々相互に同一のものであっても、異なるものであっても、またそれらの混合であっても特に制限されない。
また、本発明でいう「ＷＤ４０繰り返し構造」は、上記“繰り返し単位配列”が連続的に繰り返されるものであっても、他の任意のアミノ酸配列を介して非連続的に繰り返されるものであってもよい。
【００１７】
“繰り返し単位配列”の好適な例としては、配列表配列番号１〜５のいずれかに記載されるアミノ酸配列が挙げられる。また、本発明でいう「ＷＤ４０繰り返し構造領域」の好適な具体例としては、配列表配列番号１，２，３，４及び５で示されるアミノ酸配列がＣ末端方向にこの順序で配置されてなるアミノ酸配列を有するもの、より好ましくは配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する構造が挙げられる。
【００１８】
本発明でいう「７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域」とは、タンパク質の１次構造において、一般式（II）
（Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5-Ｙ6-Ｙ7 )n
（式中、Ｙ1 は Pro以外の任意の疎水性アミノ酸、Ｙ2,Ｙ3 およびＹ6 はPro 以外の任意のアミノ酸、Ｙ4 はLeu 、Ｙ5 およびＹ7 はPro 以外の任意のアミノ酸であって、好適には電荷を有するアミノ酸を表す。また、ｎは４以上の整数を表す。）
で表される連続した繰り返しアミノ酸配列構造を意味する。
本発明における好適な具体例としては、配列表配列番号７または１５で示されるアミノ酸配列を有する構造が例示される。
【００１９】
当該繰り返し構造領域は、タンパク質の二次構造として、前記一般式（II）中の疎水性アミノ酸であるＹ1 およびＹ4 (Leu) が同一面に配位される態様のαヘリックス構造を形成し得る。
【００２０】
また、「７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域」によって形成されるαヘリックスは、当該繰り返し構造と同様の構造を有する別のタンパク質とともに、３次構造としてコイルドコイル構造を形成しえる。
当該コイルドコイル構造は、Ｙ1 およびＹ4(Leu)の疎水性アミノ酸側鎖のファンデルワールス力、Ｙ5 及びＹ7 の電荷を有するアミノ酸側鎖の静電気的相互作用、および／またはＹ5 及びＹ7 以外の例えばアスパラギンやアルギニンのような大きな側鎖を有するアミノ酸同士の疎水結合や水素結合等により、該２つのαヘリックスが平行に互いにねじれて重なりあうことによって形成される。
【００２１】
従って、本発明でいう「７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域」を有するタンパクは、該繰り返し構造領域において、同様の繰り返し構造を有する別の一のタンパクと２量体を形成し得る。
本発明のタンパクは、かかる２量体の態様のタンパクをも包含するものである。また、本発明において、当該２量体は、同一のタンパクからなるホモダイマーであっても、相異なるタンパクからなるヘテロダイマーであってもよい。
【００２２】
本発明でいう「アクチンに対する結合性」とは、骨格筋構成細胞をはじめ、種々組織の細胞中に存在し、細胞運動の調節に関与するタンパク質であるアクチンと結合する性質を意味する。本発明のタンパクがアクチン結合性を示す一例として後述の実験例３を挙げる。
【００２３】
本発明でいう「潜在的リン酸化部位」とは、酵素によってリン酸化され得るアミノ酸配列部位を意味する。
例えば、カゼインキナーゼ、プロテインキナーゼＣおよびＥＧＦ受容体プロテインキナーゼ等のプロテインキナーゼのような酵素が働いて、ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸）のγ−リン酸基が転移することによってリン酸化され得るペプチド鎖上のセリン，スレオニンあるいはチロシン残基を含む特定のアミノ酸配列部位が挙げられる。
【００２４】
本発明における「潜在的リン酸化部位」の好適な具体例として、
▲１▼セリン残基あるいはスレオニン残基を含むアミノ酸配列部位については、例えば (i)ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによってリン酸化され得る一般式：
Arg-Xn-Ser *
（式中、X は任意のアミノ酸、n は１乃至２の整数を意味する。また、* が付されたアミノ酸残基はリン酸化されるアミノ酸残基を意味する。）で表されるアミノ酸配列部位、
(ii)ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼによってリン酸化され得る一般式：
（Arg/Lys)-Xn-(Ser */Thr* ) または (Ser * /Thr* )-X-（Arg/Lys)
（式中、n は１乃至３の整数、括弧内に /を用いて記載された２つのアミノ酸はそのどちらか一方であることを意味する。X および* は前記と同意義である。）で表されるアミノ酸配列部位、
(iii) プロテインキナーゼＣによってリン酸化され得る一般式：
(Ser * /Thr* )-X-（Lys/Arg)または（Lys/Arg)-Xn-(Ser * /Thr * )
（式中、n は１乃至２の整数を意味する。/ 、X および *は前記と同意義である。）で表されるアミノ酸配列部位、
(iv)カルモジュリン依存性プロテインキナーゼによってリン酸化され得る一般式
X-Arg-X-X-(Ser * /Thr* )
（式中、/ 、X 及び *は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位、
【００２５】
(v) カゼインキナーゼIIによってリン酸化され得る一般式
(Ser * /Thr* )-X-X-（Glu/Asp)-X
（式中、/ 、X 及び *は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位、
(vi)カゼインキナーゼＩによってリン酸化され得る一般式
Ser-X-X-(Ser * /Thr* )
（式中、/ 、X 及び *は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位、
(vii) グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３によってリン酸化され得る一般式
Ser * -X-X-X-Ser
（式中、X および* は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位、
(viii) 成長関連ヒストンＨ１キナーゼ（Growth-associated histone H1 kinase, ＭＰＦ、cdc2＋/CDC28プロテインキナーゼ）によってリン酸化され得る一般式
（Ser * /Thr* ）-Pro-X-(Lys/Arg), (Lys/Arg)-（Ser * /Thr* ）-Proまたは、（Ser * /Thr* ）-Pro-(Lys/Arg)
（式中、/ ，X 及び *は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位、
(ix)ホスフォリラーゼキナーゼによってリン酸化され得る一般式
（Lys/Arg)-X-X-Ser* -(Val/Ile)
（式中、/ ，X および *は前記と同意義。）で表されるアミノ酸配列部位を挙げることができる。
【００２６】
また、▲２▼チロシン残基を含むアミノ酸配列部位としては、例えば V-Ablと呼ばれる酵素の
Arg-Arg-Leu-Ile-Glu-Asp-Ala-Glu-Tyr * -Ala-Ala-Arg-Gly
で表されるアミノ酸配列部位を挙げることができる。
【００２７】
本発明のｐ５７タンパクは、真核生物由来のタンパク、好ましくは酵母あるいは哺乳動物由来のタンパクである。より好ましくはウシ、ヒト、マウス、ラットウサギ、イヌあるいはサル由来のタンパクであり、特に好ましくはウシまたはヒト由来のタンパクである。
また、本発明のタンパクは、前記哺乳動物における種々の組織細胞を構成するタンパクであり得、好ましくは、胸腺、脾臓あるいはリンパ節等の免疫系組織細胞または脳組織細胞に由来するものである。
【００２８】
本発明のｐ５７タンパクのより好ましい態様としては、実質的に配列表配列番号８または１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパクが挙げられる。
ここで「実質的に」とは、配列番号８または１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパクに特定されることなく、Ｃ末端領域に配列番号８に記載のアミノ酸番号４３３乃至４６１で示されるアミノ酸配列（配列表配列番号７）を有し、その領域よりＮ末端側領域に配列番号８に記載のアミノ酸番号７７乃至２９８で示されるアミノ酸配列（配列表配列番号６）を有しているか、あるいはＣ末端領域に配列番号１６に記載のアミノ酸番号４３３乃至４６１番目に示されるアミノ酸配列（配列表配列番号１５）を有し、その領域よりＮ末端側領域に配列番号１６に記載のアミノ酸番号７７乃至２９８で示されるアミノ酸配列（配列表配列番号１４）を有しており、かつアクチンに対して結合性を有している限り、他の領域に位置するアミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかについては、置換、欠失、修飾またはもしくは付加されていてもよいという趣旨である。
【００２９】
また、本発明のｐ５７タンパクの取得（製造）方法についても特に制限されず、後述する遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法など当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることができる。
【００３０】
本発明のｐ５７タンパクのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡとは、上記で詳述する一本のポリペプチド鎖中に、ＷＤ４０繰り返し構造領域と７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域とを同時に有するタンパクのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをいう。
当該ＤＮＡは、本発明のｐ５７タンパクをコードしうるものであればいかなる塩基配列を有するものでもよく、具体的には、Ｃ末端領域に配列番号７で示されるアミノ酸配列を有し、かつその領域よりＮ末端側領域に配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパクをコードするＤＮＡ、あるいはＣ末端領域に配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有し、かつその領域よりＮ末端側領域に配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するタンパクをコードするＤＮＡが挙げられる。好ましくは配列番号８または１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパクもしくはそれらと実質的に同等の構造及び性状を有するタンパクをコードするＤＮＡである。
【００３１】
より具体的には、配列番号８に記載の塩基配列中、塩基番号１００乃至１４８２で示される塩基配列を有するＤＮＡまたは配列番号１６記載の塩基配列中、塩基番号９３乃至１４７５で示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３２】
一般に、遺伝子組換えに係る技術分野では、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。従って、本発明のＤＮＡは、配列番号８に記載の塩基配列中、塩基番号１００乃至１４８２で示される塩基配列を、または配列番号１６記載に塩基配列中、塩基番号９３乃至１４７５で示される塩基配列を遺伝暗号に基づく置換によって変化された塩基配列を有するＤＮＡをも包含する。
【００３３】
また、本発明のＤＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成によって得られるＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅させて得られるＤＮＡおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。
【００３４】
本発明のｐ５７タンパクをコードするＤＮＡは、常法に従ってｐ５７タンパクのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法、ゲノムＤＮＡを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
(1) 例えば、ｐ５７タンパクのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、ｐ５７タンパクを発現・産生するＨＬ６０細胞などのリンパ球ないしは単球等を培養し、細胞を回収した後、その細胞から該ｐ５７タンパクをコードするｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法〔Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294 (1979) 〕、熱フェノール法もしくはＡＧＰＣ法等の公知の方法を用いて調製した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。次いで得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama,H.らの方法｛Okayama,H. et al., Mol.Cell.Biol., 2, 161 (1982) 及び同誌 3, 280 (1983)｝やGubler,U. とHoffman,B.J.の方法｛Gubler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263 (1983)｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行う。このｃＤＮＡをプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【００３５】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてｐＵＣ１１９，λｇｔ１０，λｇｔ１１等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内でｐ５７遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
【００３６】
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、例えば Maniatis, T. ら, モレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Cloning,A Laboratory Manual, second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989) に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunh,T. V. らの方法〔Hyunh,T.V., DNA Cloning, apractical approach,1,49(1985)〕などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１，ＤＨ５またはＭＣ１０６１／Ｐ３等）等の適当な宿主に導入する。
【００３７】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A LaboratoryManual, second edition), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989)に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製，アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
【００３８】
上記の方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、本発明のｐ５７タンパクをコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、別個にｐ５７タンパクのアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法〔Crunstein, M. and Hogness, D.S.: Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975) 〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spring Harbor Laboratory, 2.108 (1989)〕により、目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングする方法、ＰＣＲプライマーを作製しｐ５７タンパクの特定領域をＰＣＲ法により増幅し、該領域をコードするＤＮＡ断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。また、ｃＤＮＡを発現しうるベクター（例えば、λｇｔ１１ファージベクター）を用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを用いる場合には、ｐ５７抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、ＰＣＲ法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
【００３９】
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕あるいはファージＭ１３を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法〔Sanger, f.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977) 〕によって決定することができる。ｐ５７遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【００４０】
(2) また、ＨＬ６０等の哺乳動物に由来する細胞のゲノムＤＮＡからｐ５７タンパクをコードするＤＮＡを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。ＨＬ６０細胞を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたＤＮＡプローブを用いる方法等により検出し、該クローンからｐ５７遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【００４１】
(3) また、化学的合成による本発明のＤＮＡの製造は、配列番号８に記載の塩基配列中、塩基番号１００乃至１４８２で示される塩基配列または配列番号１６の塩基配列中、塩基番号９３乃至１４７５で示される塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【００４２】
さらに本発明は、上述のｐ５７タンパクをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。本発明の組換えベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される。
当該組換えベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドＤＮＡおよびバクテリアファージＤＮＡ）に本発明のｐ５７タンパクをコードするＤＮＡを常法により連結することによって調製することができる。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322, pBR325, pUC12, pUC13など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19, pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110, pTP5, pC194 などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス〔pVL1393 （インビトロゲン社製) 〕が例示される。
【００４３】
ｐ５７遺伝子を発現させｐ５７タンパクを生産させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でｐ５７遺伝子を発現し、これら蛋白質を生産する機能を有するものであれば特に制限されない。好ましくは、大腸菌（pGEX-5X-1), あるいはSV-40 由来の発現ベクターである。
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域，開始コドン，本発明ｐ５７タンパクをコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター，開始コドン，本発明ｐ５７タンパクをコードするＤＮＡ，終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明ｐ５７遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域，スプライシング接合部，ポリアデニレーション部位，選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【００４４】
細菌中で本発明のｐ５７タンパクを発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレーターおよび Shine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモーター，ｔａｃプロモーターなどを含むものが例示される。酵母中で本発明のｐ５７タンパクを発現させるためのプロモーターとしては、ＰＨ０５プロモーター，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、ＳＬ０１プロモーター，ＳＰ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモーター，ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、ＳＶ−４０，レトロウイルスである。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【００４５】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡをいい、天然のプラスミド，人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198, プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145,プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224,プラスミドpSV2neo ATCC
37149等があげられる。
【００４６】
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００４７】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン，アンピシリン，またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
【００４８】
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター，開始コドン，本発明のｐ５７タンパクをコードするＤＮＡ，終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリクションサイトなど）を用いることができる。
【００４９】
本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞〔例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌），酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など），動物細胞または昆虫細胞など〕が例示される。
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大腸菌（ＤＨ５，ＨＢ１０１等）、マウス由来細胞（ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１またはＮＩＨ3 Ｔ3 等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（ＢＨＫおよびＣＨＯ等）、サル由来細胞（ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１およびＶｅｌｏ等）およびヒト由来細胞（Ｈｅｌａ、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびＮａｍａｌｗａ等）などが例示される。
【００５０】
発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転換（形質移入）〕は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（E.coli, Bacillus subtilis 等）の場合は、例えばCohen らの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法〔Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979) 〕やコンピテント法〔J. Mol. Biol., 56,209 (1971) 〕によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927 (1978)〕やリチウム法〔J. Bacteriol., 153, 163 (1983)〕によって、動物細胞の場合は、例えばGrahamの方法〔Virology, 52, 456 (1973)〕、昆虫細胞の場合は、例えばSummers らの方法〔Mol. Cell. Biol.3, 2156-2165 (1983) 〕によってそれぞれ形質転換することができる。
【００５１】
本発明のｐ５７タンパクは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
【００５２】
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度，培地のｐＨおよび培養時間は、ｐ５７タンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
【００５３】
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。
宿主がE. coli の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地〔Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)〕等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気，攪拌をしながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。
【００５４】
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気，攪拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培地〔Bostian. K. L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980) 〕が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５５】
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science, 122, 501 (1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology, 8, 396 (1959) 〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967) 〕，１９９培地〔proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５６】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's 培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985) 〕等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００５７】
本発明のｐ５７タンパクは、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得できる。
すなわち、本発明のｐ５７タンパクが、培養物のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って該ｐ５７タンパクを精製、単離する。
単離，精製方法としては、例えば塩析，溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析，限外濾過，ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００５８】
一方、本発明ｐ５７タンパクが培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法でｐ５７タンパクを含有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離，精製することができる。
【００５９】
また、本発明は、上述のｐ５７タンパクまたはそのアミノ酸配列の一部を有するペプチドに親和性を有する抗体に関する。本発明の抗体は、上記性質を有するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を共に包含する。また、当該モノクローナル抗体には、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥなるいずれのイムノグロブリンクラスに属するモノクローナル抗体をも包含し、好適には、ＩｇＧまたはＩｇＭイムノグロブリンクラスモノクローナル抗体が挙げられる。
【００６０】
本発明の抗体は常法に従って取得することができる（続生化学実験講座５、免疫生化学研究法、日本生化学会編：東京化学同人発行、等）。
【００６１】
例えば、本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ（融合細胞）から製造することができる。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫系細胞から融合ハイブリドーマを形成し、当該ハイブリドーマをクローン化し、本発明のｐ５７タンパクのアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポリ）ペプチドを抗原として、それに対して特異的親和性を示す抗体を生産するクローンを選択することによって製造される。その操作は免疫抗原として本発明のｐ５７タンパクのアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポリ）ペプチドを使用する以外は、従来既知の手段を用いることができる。
【００６２】
免疫抗原は、例えばｐ５７タンパクのアミノ酸配列の一部または全部を有する（ポリ）ペプチドと完全フロインドアジュバンドとを混和して調製される。免疫化の対象として用いられる動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスが例示される。免疫は、これらの哺乳動物の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパット内あるいは腹腔内に１乃至数回注射することにより行われる。
通常、初回免疫から約１〜２週間毎に１〜４度免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行って、該最終免疫より約３〜５日後に免疫感作された動物から抗体産生細胞が採取される。
【００６３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, pp.495-497, 1975)及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくは同種のマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒトの骨髄腫系細胞（ミエローマ）との融合により得られる融合細胞（ハイブリドーマ）を培養することにより調製される。培養は、インビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターもしくはウサギ等の哺乳動物、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行うことができ、抗体はそれぞれ該培養上清、または哺乳動物の腹水から取得することができる。
【００６４】
細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8、P3/NSI/1-Ag4-1、P3/X63-Ag8.U1 、SP2/O-Ag14、FOあるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag1.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2 、UC729-6 、CEM-AGR 、D1R11 あるいはCEM-T15 を挙げることができる。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体を産生する融合細胞クローンのスクリーニングは、融合細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウエルの培養上清の抗原に対する反応性を、例えばＲＩＡやＥＬＩＳＡ等の酵素抗体法によって測定することにより行うことができる。
モノクローナル抗体の精製、単離は、上述のような方法によって取得される本発明のモノクローナル抗体を含有する血清、腹水あるいは培養上清を、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付することにより行うことができる。
【００６６】
本発明の「モノクローナル抗体」は、上述の製造方法に限定されることなく、いかなる方法で得られたものであってもよい。また、通常「モノクローナル抗体」は、免疫感作を施す哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる構造の糖鎖を有するが、本発明における「モノクローナル抗体」は該糖鎖の構造差異により限定されるものではなく、あらゆる哺乳動物由来のモノクローナル抗体をも包含するものである。さらに、例えばヒトイムノグロブリン遺伝子を組み込むことにより、ヒト型抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたトランスジェニックマウスを用いて得られるヒト型モノクローナル抗体、あるいは、遺伝子組換え技術により、ある哺乳動物由来のモノクローナル抗体の定常領域（Ｆｃ領域）をヒトモノクローナル抗体のＦｃ領域と組み換えたキメラモノクローナル抗体、さらには抗原と相補的に直接結合し得る相補性決定部位（ＣＤＲ：complementarity-determining residue)以外、全領域をヒトモノクローナル抗体抗体の対応領域と組換えたキメラモノクローナル抗体も本発明の「モノクローナル抗体」に包含される。
【００６７】
【発明の効果】
本発明は、哺乳動物に由来する新規タンパクｐ５７を提供するものである。すなわち、本発明は１本のポリペプチド鎖中にＷＤ４０繰り返し構造領域と７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域とを同時に有するという特徴的な構造を有するタンパクを初めて提供し、さらにそのアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を明らかにするものである。また、当該新規タンパクに親和性を有する抗体を提供するものである。
さらに、本発明のｐ５７タンパクは、上記のような特徴的な構造に加え、アクチンに対する結合性を有し、またそれのみならず潜在的リン酸化部位を有しており、このような構造的および生物学的特徴から、細胞内での情報（シグナル）伝達，細胞運動の制御，細胞の***および複製あるいは細胞の増殖等、生物学的機能発現において重要な役割を担う新規タンパクであると考えられる。
【００６８】
従って、本発明による新規タンパクの一次構造さらにはその遺伝子の塩基配列の提供は、該タンパクの分子レベルあるいは遺伝子レベルでの物理化学的性状の解明はもとより、該タンパクが細胞内で担う生物学的機能の解明、該タンパクと結合あるいは相互作用する情報伝達因子や転写因子等の新規タンパクの探索、該タンパクの分子レベルあるいは遺伝子レベルでの機能不全または産生不均衡等に起因する各種疾患の原因究明、その知見に基づく各種疾患に対する治療薬を開発するための試薬として有用である。
【００６９】
このような治療薬に開発において、本発明のタンパクが、例えば細胞***において役割を担うタンパクである可能性を有することから、本発明のタンパクを標的として、***時に必須なチューブリンの重合あるいは脱重合を阻害する薬剤として知られているコルヒチンやタキソールのような強力な抗癌剤を開発することが可能である点で有用である。また、本発明のタンパクは、免疫担当細胞である白血球に見られるような細胞内情報伝達を介した細胞の走化性の誘導において役割を担うタンパクである可能性を有することから、本発明のタンパクを標的として、該細胞の走化性を制御することによる抗炎症剤や免疫抑制剤を開発することが可能である点で有用である。さらにまた、本発明のタンパクは、転写因子等のＤＮＡ結合タンパクと相互作用するようなものとして役割を担うタンパクである可能性を有することから、本発明のタンパクを標的として、ＨＩＶプロモーターＤＮＡ結合タンパクとして知られているＮＦκＢを標的とした抗ＨＩＶ阻害薬のような抗ウイルス剤を開発することが可能である点で有用である。
【００７０】
また、このような本発明のタンパクを標的とした例えば抗癌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤あるいは抗ウイルス剤の開発が可能な一方で、本発明の上述のような性状から、本発明のタンパクあるいはそれをコードするＤＮＡ、その断片、それらの誘導体あるいはアンチセンスＤＮＡ自身も、該ＤＮＡを疾患部位特異的に外科的、電気的あるいは科学的に生体細胞内に導入することによる、例えば抗癌剤、抗炎症剤、免疫抑制剤あるいは抗ウイルス剤となり得る点で有用である。
特に、本発明のｐ５７タンパクは、アクチンに対して結合性を有することから、これまでに腫瘍形質抑制に活性を有するアクチン結合タンパクとして知られているゲルゾリン、メルリン、テンシン、トロポミオシン、α−アクチニン、リポコルチンＩあるいはビンキュリン等と同様に、それ自身抗腫瘍剤となりうる可能性を有する。
【００７１】
さらに、本発明のタンパクを用いれば、該タンパクに親和性を有する抗体を製造することが可能であり、それらの抗体は、該タンパクを精製するための試薬として用いることができることは勿論のこと、該タンパクに体内の種々組織細胞における発現分布及び発現レベルを測定するための試薬として用いることが可能である点で有用であり、該発現分布あるいは発現レベルを測定することにより本発明のタンパクに分子レベルあるいは遺伝子レベルでの機能不全または産生不均衡等に起因する各種疾患の原因部位あるいは状態を解明することが可能である。
【００７２】
本発明の実施例において用いるプラスミド，制限酵素等の酵素，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及び他の物質は市販のものであり、常法に従って使用することできる。ｃＤＮＡのクローニング，塩基配列の決定，宿主細胞の形質転換，形質転換細胞の培養，得られる培養物からのｐ５７タンパクの採取，精製等および抗体の取得に用いられた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
また、本発明の実施例で得られたｐＢIIλ６−４は、平成６年１０月６日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に「ＰＢＪＴ−ＢＡ−６」（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４８２５）として国際寄託されている。
【００７３】
【実施例・参考例】
以下、本発明を具体的に説明するため実施例および参考例を示すが、本発明はこれら実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００７４】
実施例１ ウシｐ５７タンパクの単離・精製
（１）細胞質画分の調製
下記の全工程は０〜４℃の下で行った。新鮮な子ウシ胸腺組織（約６０ｇ）を細かく切断し、５倍量の１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，０．０２％ ＮａＮ3 溶液を加えてワーリングブレンダーでホモジナイズした。該ホモジネートをガーゼで濾過した後、３００×ｇで２０分間遠心し、その上清を６０００×ｇで１０分間遠心し、さらにその上清を１０，５００×ｇで１時間遠心して、得られた上清を細胞質画分とした。
【００７５】
（２）精製
下記の操作はすべて０〜４℃の下で行った。またｐ５７タンパクの検出は、フォスフォリパーゼＣ活性（ＰＬＣ活性）およびＧＴＰγＳ結合活性を測定することにより行った（参考例１および２）。また、タンパク質の定量は、全て２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。
【００７６】
▲１▼ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー
（１）で得られた細胞質画分を直接、緩衝液Ａ〔１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，０．０２％ ＮａＮ3 〕で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（６×１３．５ｃｍ：ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌ濃度勾配法（０Ｍ−１Ｍ，１２時間、２０００ｍｌ）により溶出を行った。活性画分として、ＰＬＣ活性画分をひとまとめにして、約０．３５〜０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出画分を収集した（図１）。
【００７７】
▲２▼ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー
▲１▼で得られた活性画分を透析チューブにいれ、ポリエチレングリコール２００００を用いて濃縮後、緩衝液Ａで透析し、同緩衝液で平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２．３×１５ｃｍ：ファルマシア社製）にかけ、同緩衝液に洗浄した後、ＮａＣｌ濃度勾配法（０Ｍ−１Ｍ、１０時間、５００ｍｌ）により溶出を行った。活性画分として、ＰＬＣ活性画分をひとまとめにして、約０．５８〜０．９Ｍ ＮａＣｌ溶出画分を収集した（図２）。
【００７８】
▲３▼セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィー
▲２▼で得られた活性画分を透析チューブにいれ、ポリエチレングリコール２００００を用いて濃縮後、緩衝液Ａで平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂカラム（３×１１２ｃｍ：ファルマシア社製）にかけゲル濾過を行い、活性が見られた画分のうち、低分子量の方の活性画分を収集した（図３）。
【００７９】
▲４▼ＭｏｎｏＳカラムクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
▲３▼で得られた活性画分を透析チューブにいれ、ポリエチレングリコール２００００を用いて濃縮後、緩衝液Ｂ〔１０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ ＰＭＳＦ〕に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５カラム（ファルマシア社製）を備えたＦＰＬＣ（Fast Protein Liquid Chromatography System 、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ）にかけ、該カラムを同緩衝液で洗浄後、ＮａＣｌ濃度勾配法（０Ｍ−０．４Ｍ、４０分間、４０ｍｌ）により溶出を行った。活性画分として、より比活性の高い、ＧＴＰγＳ結合活性のない約０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分を収集した（図４）。
【００８０】
▲５▼Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
▲４▼で得られた活性画分をセントリコン１０（アミコン社製）で濃縮した後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（ファルマシア社製）を備えたＦＰＬＣ（流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）にかけた。図５に示すように、活性画分が２つのピークとして検出された。
そこで、各ピークの画分を回収して、それぞれを２−メルカプトエタノールで処理した後、１０％ １ｍｍ厚のゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉの方法〔Nature, 227, p680- (1970)〕に従って、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。分離したバンドを銀染色（２Ｄ−銀染色試薬II「第一」：第一化学）した結果、後半のピーク（フラクション番号２３〜２７）について５７ｋＤａ付近に単一バンドとして検出され（図６参照）、またクロマトグラムのＰＬＣ活性ピークと２８０ｎｍの吸光度ピークが一致していることから、このバンドが本発明のｐ５７タンパクであると判断された。本タンパクを以下、ウシｐ５７タンパクと呼ぶ。
【００８１】
精製工程全般においていえることは、多数のピークに活性が認められることである。このことは、一つにはｐ５７タンパク同士あるいは他のタンパクとの会合体を形成しやすいこと、もう一つには、プロテアーゼによる分解を受けやすく、その分解産物にも活性が認められる場合があること等によって説明される。
【００８２】
（３）部分アミノ酸配列の決定
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムクロマトグラフィーによる精製画分をトリクロロ酢酸で沈殿処理し、二次元電気泳動（一次元目は等電点電気泳動、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、クーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ Ｒ−２５０）を用いて染色した。染色された部分を切り出して、それを細断し、イソプロパノールで３回、メタノールで３回洗浄し、凍結乾燥した。ついで、それを水１５０μｌを加えて砕き、緩衝液を加えて５００μｌとし、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを０．５μｌ（５０ｎｇ）加え、一晩３７℃で反応させた。酵素消化後、逆相ＨＰＬＣ（カラム：マイクロボンダスフェアー，５μ，Ｃ18, 100 Å, ３．９×１５０ｍｍ，日本ミリポア社製）により各ペプチドフラグメントを分離回収した。逆相ＨＰＬＣの条件は、カラムを０．０５％ ＴＦＡ−水で平衡化した後、直線的濃度勾配により、６０分間で０．０５％ ＴＦＡ−イソプロパノール／アセトニトリル〔７：３（Ｖ／Ｖ）〕液の濃度を６０％まで上昇させた。カラム温度は４０℃、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、波長２２０ｎｍでモニターした。
ピークとして検出されるフラグメントの各フラクションは、遠心エバポレーターにて乾燥後、０．１％ ＳＤＳ溶液３０μｌに溶解し、気相プロテインシークエンサー（島津製作所、ＰＳＱ−１）にかけて、アミノ酸分析を行い、各ペプチド断片の部分アミノ酸配列を決定した。表１にその結果を示す。
【００８３】
【表１】
また、さらに分析を行った結果、実施例１で得られたウシｐ５７タンパクは、配列表配列番号９乃至１３でそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＷＤ４０繰り返し構造を有していることが明らかになった。また、同時に、Ｃ末端領域には、配列表配列番号１５で示されるアミノ酸配列、すなわち７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造を有していることが明らかとなった（配列表配列番号１６）。
【００８５】
これらの“ＷＤ４０繰り返し構造”、“７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造”は、各々、細胞内での情報（シグナル）伝達、細胞運動の制御、遺伝子の転写あるいは細胞の***および複製等といった生物学的機能において重要な役割を担うと考えられている真核生物由来の種々のタンパクに共通して見られる構造である。
したがって、これら２つの構造を同時に有する本発明のウシｐ５７タンパクもまた、上述の生物学的機能に関して有用な作用・機能を担うものと考えられる。
【００８６】
参考例１ ＰＬＣ活性測定
１０ｎＣｉ〔3 Ｈ〕ＰＩ（１６．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシャム社製）および２．５μｇ ＰＩ（シグマ社製）を基質として用いて、これをＮ2 によりエバポレートし、１５０μｌの０．１Ｍ Tris−マレイン酸塩−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．０８３％コール酸ナトリウム溶液を加え、２０秒間激しく攪拌した後、試料液１０μｌおよび水９０μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、０．３ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ，５ｍＭ ＥＧＴＡ溶液および１ｍｌのクロロホルム／メタノール／濃塩酸（１００／１００／０．６）混合液を加え、攪拌した後、７５０×ｇで５分間遠心した。上層（水相）０．８ｍｌをシンチレーションバイアルに分取し、８０℃で１５分間有機溶媒をとばした後、３．５ｍｌのトライトントルエン・シンチレーターを加えて放射活性を測定し、酵素活性を算出する。
【００８７】
参考例２ ＧＴＰγＳ結合活性測定
Northup らのフィルター結合法〔J. Biol. Chem.,257, p11416 (1982) 〕に
ほぼ従って行った。すなわち、試料液（２０μｌ），０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（１μｌ），１Ｍ ＤＴＴ（０．１μｌ），４Ｍ ＮａＣｌ（２．５μｌ），１ＭＭｇＣｌ2 （２．５μｌ），１ｍＭ ＧＴＰγＳ（０．１μｌ），５ｍＣｉ／ｍｌ 〔35Ｓ〕ＧＴＰγＳ（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（０．８μｌ），水（４６μｌ）を混合し、３０℃で１時間インキュベーションし、全量を２．５ｃｍのニトロセルロースフィルター（孔径０．４５μｍ）上に移し、洗浄液〔２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８），２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液〕２ｍｌで該フィルターを３回洗浄し、バイアルにフィルターを入れ、８０℃で乾燥後、トルエンシンチレーターを入れて、35Ｓの放射活性を測定する。
【００８８】
実施例２ ウシｐ５７ｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンス
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
▲１▼組織からのｍＲＮＡの抽出
ウシ脾臓組織約２０ｇをグアニジン溶液（６Ｍ guanidium thiocyanate, ５Ｍ sodium citrate, 0.5 % ＳＤＳａ溶液をＮａＯＨでｐＨ７．０にあわせたものに０．１Ｍになるように２−メルカプトエタノールを加えたもの。用時調製）２００ｍｌに加え、ポリトロンを使用してホモジナイズし、１８Ｇ注射針に通すことによってＤＮＡを切断した後、ＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）上に重層し、一晩ベックマン遠心機（ローター８Ｗ４１、２３，０００ｒｐｍ、２０℃）で遠心し、ＲＮＡを沈殿として回収した。この全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ Purification Kit （ファルマシア製) を用いてｍＲＮＡを精製した。
【００８９】
▲２▼ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーの作製
▲１▼で調製したｍＲＮＡのうち５μｇから、オリゴｄＴをプライマーにしてｃＤＮＡ Synthesis Kit（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。そして後のスクリーニングの効率を上げるため、ＥｃｏＲＩアダプターを付加した後、アガロースゲル〔１％アガロース（SEA KEM GTG (FMC))〕電気泳動して１ｋｂｐ以上のｃＤＮＡを GENECLEAN II Kit (BIO 101) を用いて回収し、λgt 10 ベクターに連結した。パッケージングには GIGAPACK II GOLD PACKAGING EXTRACT （ストラタジーン社製）を用いた。
【００９０】
（２）ＤＮＡプローブの作製
配列表配列番号１７で示される３３ｍｅｒのＤＮＡを鋳型とし、さらにこの配列の３’末端に相補的な８ｍｅｒのＤＮＡ（５’ＣＴＧＧＧＡＧＡ ３’）をプライマーとして用いて、Taq polymeraseでα−32Ｐ−ｄＣＴＰを取り込ませてプローブとした。
【００９１】
▲１▼ＤＮＡの合成
ＤＮＡプローブ作製のための鋳型は、配列表配列番号１７で示される３３ｍｅｒのＤＮＡを固相法により合成した。
また、プライマーとして、この鋳型ＤＮＡの塩基配列の３’末端領域に相補的な８ｍｅｒのＤＮＡ（５’ＣＴＧＧＧＡＧＡ ３’）を合成した。
固相法で合成された未処理ＤＮＡにアンモニア水１ｍｌを加え室温で１時間ボルテックス処理することを２回繰り返しシリカの担体から切り出した後、５５℃で一晩処理して保護基をはずした。その後、遠心エバポレーターでアンモニア水をとばしてから１５分間、８０％酢酸中で反応させた。水を加えて２０％酢酸とし、Ｃ１８カラムを用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。溶出条件は、Ａ液（酢酸約５．８ｍｌ、トリエチルアミン約１４ｍｌ／１Ｌ水、ｐＨ７〜７．５）９５％、Ｂ液（アセトニトリル）５％の初期条件から直線的濃度勾配により２０分でＢ液を３０％にまで上げた。流速は、１ｍｌ／分とし、波長３００ｎｍでモニターし、分取した。
【００９２】
▲２▼プローブの作製
次の組成からなる反応溶液（全量 27.2 μl)を下記の条件で反応することにより、プローブを調製した。
反応溶液：
α−32P-dCTP（3 kCi/mmol、10ci/l アマシャム社製) 22 μl
10×ＰＣＲ緩衝液 2.7 μl
250 μM dATP, dGTP, dTTP混合溶液 1 μl
20 ng/μl 33mer合成DNA(鋳型 DNA) 0.5 μl
300ng/μl 8 mer合成DNA(プライマー) 0.5 μl
AmpliTaq DNA polymerase(5units/ μl) 0.5 μl
なお、１０×ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、Ampli Taq DNA ｐolymerase は、パーキンエルマー・シータス社の製品を、反応における温度調節は、PROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700を用いて行った。
反応条件：下記の反応を１５サイクル行った。
９０℃，３０秒の後、５０℃まで最速で遷移
５０℃から２０℃まで４５分で遷移
２０℃ ３０秒の後、２２℃まで最速で遷移
２２℃ ４５分
【００９３】
以上の方法によって得た反応終了液をセファデックスＧ５０ ＤＮＡグレイド（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過し、標識されたＤＮＡプローブを得た。
【００９４】
（３）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
▲１▼スクリーニング用フィルターの作製
ウシ脾臓ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｃ６００ｈｆｌに感染させた（３７℃、３０分）後、プレートにトップアガー（バクトトリプトン１ｇ、バクトイースト抽出物０．５ｇ、ＮａＣｌ １ｇ、バクトアガー０．８ｇ／１００ｍｌ：オートクレーブで滅菌し、使用時に加熱・溶解して調製。）を加えて直ちにＬＢ−寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、バクトアガー１５ｇ／１Ｌ水：オートクレーブで滅菌した後、プレートに分注。）にまいて（１０ｋｐｆｕ／ｌ５０ｍｍ径プレート）、３７℃で一晩培養した。培養後、４℃まで冷却し、スクリーニング用ナイロンメンブレンフィルター（BIODINE A, PALL)を培地に３０秒間のせてファージを吸着させて針で位置をマークし、剥がした。さらに同じプレートをもう１枚、１分間のせてマークして剥がした。そのフィルターをアルカリ処理（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）、中和処理（０．５Ｍトリス塩酸、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ １７５．３ｇ、trisodium citrate 2H2O ８８．２ｇ／１Ｌ水，ｐＨ７）した後、８０℃処理１時間、紫外線処理５分間を行い、ファージＤＮＡをフィルターに固定した。このフィルターを３×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳａ中で６５℃、３０分間洗って混在するタンパク質などを除去した。
【００９５】
▲２▼フィルターのハイブリダイゼーション
▲１▼で作製したフィルターにプレハイブリダイゼーション溶液〔１×Denhaldt（５×Denhaldt：1 % ポリビニルピロリドン 25 、1 % ＢＳＡフラクションＶ、1 % Ficol1 400 ／水）、６×NET （20×NET ：3 M NaCl、20 mM EDTA pH8.0、0.3 M トリス塩酸 pH7.5 ／水）、0.5 % SDSa、carrier DNA ( 100 μg/ml E.coli DNA 、300 μg/ml salmon sperm DNA)〕を加え、４０℃で約３時間ビニールのバック中でプレハイブリダイゼーションを行った。続いてハイブリダイゼーションでは、上記のプレハイブリダイゼーション溶液に標識したプローブを最終濃度約２００万ｃｐｍ／ｍｌになるように入れたものをハイブリダイゼーション溶液として加え５０℃で一晩反応させた。ハイブリダイゼーション後のフィルターは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳａ中で室温２回、６５℃で３０分間２回洗浄してから Kodak XAR-5フィルムを用いて、オートラジオグラフィーを行った。
【００９６】
▲３▼ポジティブクローンの単離とファージＤＮＡの回収
オートラジオグラフィーの結果、２枚のフィルターについてポジティブなシグナルであると確認されたプレートの位置を培地毎にかぎとり、大腸菌に感染させてから寒天培地にまいてセカンドスクリーニングを行った。セカンドスクリーニングにおいてもポジティブであったクローンをシングルプラークで単離して再び大腸菌に感染させ１５ｃｍ寒天培地プレート（バクトトリプトン１０ｇ、バクトイースト抽出物５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、SEA KEM ME(FMC) １５ｇ／１Ｌ水：オートクレーブで滅菌した後、プレートに分注。）１枚に一面にプラークができるようにまき、そのλgt 10 ファージＤＮＡを回収した。ファージＤＮＡの回収法の詳細については、Maniatisらの方法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition 2.64 (1989)〕を参照した。
【００９７】
▲４▼ｃＤＮＡインサートの確認
回収したファージＤＮＡをＥｃｏＲＩ処理してｃＤＮＡインサートして切り出した後、一部についてアガロースゲル〔１％アガロース（SEA KEM ME) 〕電気泳動を行いインサートの長さを確認した。電気泳動後はサザンらの方法〔J.Mol.Biol., 98, p503 (1975)〕に従ってＤＮＡをナイロン膜〔HybondN （アマシャム社製）〕に移した。そしてスクリーニングの時と同様にハイブリダイゼーションを行った。
【００９８】
▲５▼ポジティブクローンのサブクローニング
ＥｃｏＲＩ処理したファージＤＮＡをアガロースゲル〔１％アガロース（SEA KEM GTG)〕電気泳動し、GENECLEAN II Kitを用いてインサートＤＮＡを回収した。そして、Ｔ４リガーゼによってインサートＤＮＡをＢＡＰ処理したＭ１３ｍｐ１８のＥｃｏＲＩサイトに組み込んだ。そのライゲーション溶液を用いてコンピテント大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。すなわち、全量７μｌのライゲーション溶液にコンピテント大腸菌０．３ｍｌを加えて氷上で数時間放置後、４２℃で３分間熱刺激を加え、氷上に戻し、４０μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノサイド）、５０μｌの２％ Ｘ−ＧＡＬ、２００μｌの新鮮ＪＭ１０９、３ｍｌのＬＢ−トップアガーを加え９ｃｍ ＬＢ−寒天培地プレートに注ぎ３７℃で一晩保温した。生えてきた白色のシングルコロニーを採取し、１．５ｍｌ ＬＢ−培地に入れ、５時間振盪培養した。遠心した沈殿からアルカリ法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition 1.25 (1989)〕によってＭ１３ ＲＦ−ＤＮＡを調製し、一部ＥｃｏＲＩ消化してアガロースゲル〔１％アガロース (SEA KEM ME) 〕電気泳動でインサートを確認した。また、一部についてはＨｉｎｃII消化し、アガロースゲル〔２％アガロース（SEA KEM ME）〕電気泳動のパターンによりインサートの向きを判断した。一方、遠心して完全に沈殿を除いた培養上清は塩基配列の決定に供した。
【００９９】
（４）デレーションミュータントの作製
▲１▼前述のＭ１３ ＲＦ−ＤＮＡのインサートとその向きを確認した大腸菌クローン二種類（両向き）をそれぞれＬＢ−培地２００ｍｌで３７℃で一晩培養した。アルカリ法で粗Ｍ１３ ＲＦ−ＤＮＡを調製し、ＣｓＣｌ−エチジウムブロマイドグラジェント法により精製した。
▲２▼デレーションミュータントの作製
▲１▼で得られたＭ１３ ＲＦ−ＤＮＡを材料にキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造社製）を用いて様々な長さのデレーションミュータントを作製した。
【０１００】
（５）塩基配列の決定
（３）▲５▼および（４）▲２▼で得られた培養上清から一本鎖ＤＮＡを以下の方法で回収した。
培養上清１ｍｌに２００μｌの２０％ ＰＥＧ６０００、２．５Ｍ ＮａＣｌを加えボルテックスし、室温で１５分間静置後、１．５ｍｌチューブ用遠心機で遠心し（１２，０００ｒｐｍ、５分間）、上清を完全に除いた。沈殿を１００μｌ ＴＥ（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ：ｐＨ７．４）に溶解し、５０μｌ ＴＥ飽和フェノールを加え激しくボルテックスをして室温で５分間静置後、再度ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。９０μｌの水層を分取し、エタノール沈殿、リンス、乾燥後、２０μｌの水に溶かした。１／１０量をアガロースゲル〔１％アガロース（SEA KEM ME) 〕電気泳動にかけ一本鎖ＤＮＡの回収率をみた。
このようにして得た両方向のデレーションおよび非デレーションの一本鎖ＤＮＡについて、蛍光プライマー・サイクルシークエンシング・キット（アプライドバイオシステムズ社製）およびＡＢＩ ３７３ＡＤＮＡシークエンサーを用いてｄｉｄｅｏｘｙ法により塩基配列を決定した（配列表配列番号１６）。
【０１０１】
また、当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、実施例１で得られたウシｐ５７タンパクのアミノ酸配列と一致し、Ｃ末端領域に配列番号１５で示される７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域を、またそのＮ側領域には配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＷＤ４０繰り返し構造領域を有していた。
【０１０２】
実施例３ ヒトｐ５７ｃＤＮＡのクローニング
（１）プローブの作成
▲１▼ＨＬ６０細胞から全ＲＮＡの抽出
ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）を培養した後（約１×１０6 細胞／ｍＬ）、２，０００ｇで５分間４℃で遠心して、沈殿した細胞をＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて懸濁し、クロロホルムで振盪抽出して上清を回収した。得られた水層（上清）にイソプロパノールを添加して−２０℃で１時間放置した後、１２，０００ｇ、２０分間４℃で遠心し、ＲＮＡを沈殿させる。沈殿したＲＮＡをエタノールで洗浄した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。この結果、約９００μｇの全ＲＮＡを得た。
【０１０３】
▲２▼ＰＣＲ
(i) ＰＣＲ鋳型の調製
▲１▼で抽出した全ＲＮＡを鋳型として、１st strand cDNA synthesis kit（GIBCO BRL 社製）を用いて、すなわち oligo dT プライマーとramdom hexamerプライマーを鋳型ＲＮＡにアニールさせて逆転写酵素により第１ストランドｃＤＮＡを合成した。
(ii)プライマーの作成
実施例２でクローニングおよびシークエンスしたウシｐ５７遺伝子の塩基配列を基準として、そのコーディング領域の５’末端領域と３’末端領域に相当する配列を有するプライマーをデザインして、ＤＮＡ合成機（ミリジェン、ミリポア社製）を用いて合成した。合成した５’末端領域のプライマーａの配列を配列表配列番号１８に、３’末端領域のプライマーｂの配列を配列表配列番号１９に示す。
(iii) ＰＣＲの実施
(i) で得られた第１ストランドｃＤＮＡを鋳型とし、(ii)で合成した両プライマーを用いて、下記の手順でＰＣＲを行った（Biochem. Biophys. Res. Commun.178, 1479-1484)。すなわち、Gene AmpTM DNA増幅試薬キット（パーキン・エルマー・シータス社製）を用いて、鋳型ｃＤＮＡに両プライマー４００ｎＭを加えて行った。反応はＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー・シータス社製）を用いて、９４℃で１分、５６℃で２分、７２℃で３分を３０回繰り返すことにより行った。増幅したＤＮＡをアガロース電気泳動で泳動して精製し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
【０１０４】
▲３▼増幅されたＰＣＲ産生物のサブクローニングおよびシークエンス
回収したＤＮＡ断片を TA cloning kit （インビトロゲン社製) を用いてベクターｐＣＲII（インビトロゲン社製) にライゲーションした。得られたサブクローンをミニスケールで培養後、プラスミドを回収して、ＥｃｏＲＩで消化した後、アガロース電気泳動によりＤＮＡのサイズを調べ、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片と同一のサイズのＤＮＡについて、BecaBestシークエンシングキット（宝酒造社製）を用いて配列解析を行った。得られたＤＮＡ配列を、実施例２で得られたウシｐ５７のＤＮＡ配列と比較した結果、当該ＤＮＡフラグメントはウシｐ５７のヒトホモログ（ヒトｐ５７）をコードしていることが確認された。
なお、配列解析の際、用いられたデレーションニュータントは、キロシークエンスデレーションキット（宝酒造社製）を用いて、常法により作成した。
【０１０５】
▲４▼プローブの調製
上記により得られたＤＮＡ断片（約１．４ｋｂ）をＢｓｔＸＩで消化して、ヒトｐ５７のコーディング領域の５’領域を含む約３００ｂｐのＤＮＡを切り出し、アガロースゲル電気泳動により分離した。分離したＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ（キアゲン社製）を用いて精製し、Ready-To-Go DNA 標識キット（ファルマシア社製）を用いて、該ＤＮＡ断片を32Ｐで標識した。 この標識ＤＮＡ断片をプラークハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。
【０１０６】
（２）ヒトｐ５７ｃＤＮＡライブラリーの作成
(i) ｃＤＮＡライブラリー作成用の鋳型ｍＲＮＡの調製
ｃＤＮＡの鋳型としてＨＬ６０細胞のｍＲＮＡを用いた。
実施例３（１）▲１▼で調製したＨＬ６０細胞の全ＲＮＡより Oligotex-dT30(Super) （宝酒造社製）を用いて、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（ポリＡ付加ｍＲＮＡ）を Oligo(dT)- ラテックスビーズによりバッチ法を用いて、エタノール沈殿させることにより分離、精製した〔Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 7.3 (1989) 〕。
(ii)ｃＤＮＡの合成
得られたポリ（Ａ）+ ＲＮＡを鋳型として、Time Saver cDNA synthesis kit （ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。すなわち、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡを変性処理した後、random hexamerプライマー、４種類のｄＮＴＰおよび逆転写酵素を用いて第１ストランドｃＤＮＡを合成した。得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ duplex をＲＮａｓｅＨ処理して、ＲＮＡ鎖を分断して、ＤＮＡポリメラーゼで第２ストランドを合成して、２重鎖ｃＤＮＡを作成した〔Gubler & Hoffman, Gubler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263 (1983)〕。ついで、Time SavercDNA synthesis kit （ファルマシア社製）に含まれる反応系でｃＤＮＡを平滑末端化し、ＥｃｏＲＩアダプターと該ｃＤＮＡを接続して、スパンカラムにより寸法分画した。
(iii) ベクターへの組み込み及びパッケージング
上記で得られたＥｃｏＲＩ末端を有するｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで処理したλｇｔ１０（アマシャム社製）に組み込んだ〔Huynh, T.V., DNA Cloning, a practical approach, 1, 49 (1985)〕。これを GIGA PACKII GOLD （ストラタジーン社製）を用いてインビトロパッケージングした後、得られたファージ粒子を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭ５１４を宿主として組換えファージを含有するプラークからなるｃＤＮＡライブラリーを作成した。
【０１０７】
（３）プラークハイブリダイゼーションによるヒトｐ５７のスクリーニング
ハイブリダイゼーション、プレハイブリダイゼーションは、アマシャム社ｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０に付いているインストラクションに従って行った。概要すれば、上記で調製したＨＬ６０細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを寒天プレートに９．０×１０4 程まき、ナイロン・メンブラン（アマシャム社製）でレプリカを調製し、実施例３（１）▲４▼で作成した32Ｐ標識プローブを用いて常法に従って、プラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングを行った。
第１スクリーニングから第２スクリーニングまでで、合計５つのポジティブなクローンが得られたので、各々をシングル化した。これを液体培養することによりファージＤＮＡを調製し、クローニングサイトであるＥｃｏＲＩで消化してアガロースゲル電気泳動に供して分離した。分離したＤＮＡサンプルについて実施例３（１）▲４▼で作成したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。また、平行して実施例３（１）▲２▼で調製した５’末端領域配列を有するプライマーａおよび３’末端領域配列を有するプライマーｂを用いて、得られたＤＮＡ断片にコーディング領域全長が含まれているかを調べた。その結果、１つにクローンについてヒトｐ５７のｃＤＮＡを含むことが認められたので、このクローンに由来するＥｃｏＲＩ消化ｃＤＮＡ断片を pBluescriptII SK(-)にサブクローニングし、得られたｐＢIIλ６−４について、ファルマシアＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサーを使用して塩基配列の決定を行った。この結果、得られたｃＤＮＡはヒトｐ５７の全長をコードする領域を含むことが確認された。
なお、後記配列表配列番号８に得られたヒトｐ５７遺伝子の塩基配列、およびその配列から演繹されるアミノ酸配列を示す。
【０１０８】
これからわかるように、得られたヒトｐ５７タンパクは、実施例１および２で取得したウシｐ５７タンパクと同様に、そのアミノ酸配列中、配列表配列番号１乃至５でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む配列番号６記載のアミノ酸配列を有するＷＤ４０繰り返し構造領域を有していた。また、同時にＣ末端領域に配列表配列番号７で示されるアミノ酸配列、すなわち７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域を有していた。
したがって、本発明のヒトｐ５７タンパクは、ウシｐ５７タンパクと同様に、細胞内での情報伝達、細胞運動の制御、遺伝子の転写あるいは細胞の***および複製等といった生物学的機能に関して有用な作用・機能を担うものと考えられる。
【０１０９】
実施例４ プラスミドｐＧＥＸ／ｈｐ５７の構築
（１）アダプターの作成方法
ベクター（ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ファルマシア社製）に連結するためのＢａｍＨＩ部位およびヒトｐ５７遺伝子のコーディング領域の５’末端領域と連結するためのＰｍａＣＩ部位を含むアダプターａとベクター（ｐＧＥＸ−５Ｘ−１）に連結するためのＳａｌＩ部位およびヒトｐ５７遺伝子のコーディング領域の３’末端側領域に連結するためのＳａｃＩ部位を含むアダプターｂを調製した（図７参照）。
詳細には、まず配列表配列番号２０乃至２３に記載の４つのオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザー（ミリジェン：ミリポア社製）を用いて合成した。これら各オリゴヌクレオチドを２．５μｇずつを１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、これに１０μｌの３ＭＮａＯＡｃと２５０μｌのエタノールを加え、−８０℃で冷却し、オリゴヌクレオチドを沈殿させた。沈殿したオリゴヌクレオチドを７５％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１００μｌのアニーリング緩衝液（１０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２００ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解した。次いで該溶液を７０℃で１時間加熱し、徐々に室温まで冷却した。
【０１１０】
（２）プラスミドの構築方法
実施例３（３）で得られたプラスミドｐＢIIλ６−４を用いてＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５を形質転換した。ついで、該形質転換体を培養後、形質転換体から単離したｐＢIIλ６−４をＰｍａＣＩおよびＳａｃＩで消化して、約１．３ｋｂのヒトｐ５７遺伝子の一部分を切り出し、電気泳動により精製した。切り出されたＤＮＡフラグメント２５ｎｇと（１）で調製したアダプターａおよびｂの各２５ｎｇをライゲーションキット（宝酒造社製) を用いて１６℃で１時間反応させ、アダプターａ，ｂおよびＤＮＡフラグメントを連結させた。この反応液に、ＢａｍＨＩとＳａｌＩにより線状化したベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）２５ｎｇを加え、１６℃で一晩反応させた。この反応生成物を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換したアンピシリン耐性コロニーを１０個解析した。プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理し、正しい制限フラグメントを有するプラスミドをｐＧＥＸ／ｈｐ５７（図８）と称した。
【０１１１】
実施例５ 融合タンパク質の発現およびヒトｐ５７タンパク質の取得
ｐＧＥＸ／ｈｐ５７は、イソプロピルチオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ：isopropylthiogalactopyranoside）の誘導下、大腸菌内でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合した態様でヒトｐ５７タンパクを発現する。上記で得られたアンピシリン耐性コロニーを単一コロニーとして同定し、この単一コロニー１エーゼを５ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬブロスに懸濁し、３７℃で８時間培養した。培養後、この培養液を１ｍｌとり、２０ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬブロスに加え、３７℃で終夜培養した。ついで１８０ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬブロスに、２０ｍｌの終夜培養した培養液を加え、３７℃で２時間培養した後、０．１Ｍ ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、更に３７℃で２時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を回収した。回収した菌体を１０ｍｌの１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳに懸濁し、超音波により菌体を破壊した。この懸濁液を遠心後、上清を回収し、この上清にグルタチオン−アガロース ビーズ（ファルマシア社製）を５０％ｖ／ｖの割合で１％ トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ中に懸濁したものを１ｍｌ加えた。４℃で１時間攪拌し、遠心後、沈殿したビーズを１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで４回洗浄した。このビーズに発現されたＧＳＴ融合ヒトｐ５７タンパクが結合している。このビーズを５ｍＭ グルタチオンを含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）で処理することにより、発現されたＧＳＴ融合ヒトｐ５７タンパクが溶出された。
【０１１２】
当該タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＧＳＴ（分子量26〜27 kDa) とｐ５７タンパク（分子量 57 kDa)の分子量の総和に相当する83〜84kDa 付近にシングルバンドが確認された（図９、レーン４）。
なお、得られたＧＳＴ融合ヒトｐ５７タンパクのアミノ酸配列を配列表配列番号２４に示す。また、ＧＳＴ融合タンパク中のヒトｐ５７タンパク部分のアミノ酸配列は、配列表配列番号８に示されるアミノ酸配列と一致した。
【０１１３】
実施例６ ポリクローナル抗体の作成
（１）免疫ペプチド抗原の調製
実施例３（３）で決定したヒトｐ５７遺伝子の塩基配列（配列表配列番号８）のうち、塩基番号１４４４乃至１４７９に対応する１２アミノ酸残基（Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Glu-Glu-Thr-Val-Gln-Ala)からなるペプチドを、ペプチドシンセサイザー（モデル９０５０、日本ミリポア社製）を用いてＦｍｏｃ固相合成法により合成した。合成が終わった樹脂を塩化メチレン３．６ｍｌで洗浄、乾燥した後、ｍ−クレゾール０．６ｍｌ、チオアニソール３．６ｍｌ、トリフルオロ酢酸２５．８ｍｌを加え、室温で２時間反応させた。その後、溶解しているペプチドをエーテルを加え沈殿として回収した。得られたペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラム：マイクロボンダスフェアー５μＣ１８−１００Å、3.9 ×150 mm；ウォーターズ社製）により精製した。
精製したペプチドを同逆相高速液体クロマトグラフィーにより純度検定を行ったところ８９％であった。また、プロテインシークエンサー（モデル４７３Ａ、アプライドバイオシステムズ・ジャパン社製）を用いて、得られたペプチドが上記の１２アミノ酸残基であることを確認した。
上記の合成ペプチド５ｍｇを０．２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加えた。この混合溶液を攪拌しながら、０．０２Ｍ グルタールアルデヒド１．３ｍｌを少しずつ滴下して加え、さらに遮光しながら室温で５時間攪拌を続けた。該反応液をＰＢＳに対して透析した。
【０１１４】
その後、ペプチド・ＢＳＡ複合体とＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）をそれぞれ連結用止め金付ガラス注射器を用いて混和した。当該操作は本エマルジョンが水に１滴落としても四散しなくなるまで行った。また、同様な操作で、ペプチド・ＢＳＡ複合体とＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント）との混和物を調製した。
【０１１５】
（２）ポリクローナル抗体の調製
ウサギ（日本エスコルジー株式会社、ニュージーランドホワイト、１１〜１３週齢、雌、３羽）にペプチド・ＢＳＡ複合体−ＦＣＡ混和物を０．４ｍｇ／ｋｇの割合で１回皮下注射した。その後、４週間間隔でペプチド・ＢＳＡ複合体−ＦＩＡ混和物を同様に皮下注射して、追加免疫を行った。２回めの追加免疫後、１週間めの採血（３．５ｍｌ）した血清を参考例３に記載するドットプロット法により抗体価を測定した。得られた抗血清は、ペプチド特異的に反応し、さらにペプチド１．５μｇの６４倍希釈物においても反応した。
本発明のポリクローナル抗体は、該ウサギ抗ｈｐ５７血清から抗ｈｐ５７／ＩｇＧをプロテインＡ セファロース ４Ｂ（バイオラッド社製）を用いることにより精製、取得された。
【０１１６】
（３）ｐ５７タンパクに対する反応性の確認
ヒト由来ＨＬ６０細胞およびマウス由来ＬＡＷ２６４．７、またネガティブコントロールとしてサル腎臓由来ＣＯＳ細胞の各々を、可溶化バッファー〔１％
ＮＰ−４０，５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％ ＮａＮ3 ，１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌアプロチニン〕で可溶化し、遠心（14,000 rpm, ２０分間）して、各々の遠心上清を細胞質画分として取得した。
得られた各々の細胞質画分を 1.0×107 細胞／ｍｌに調製し、さらにこれを1.0 ×105 細胞／レーンとなるように各々10μｌを分取し、ＳＤＳサンプルバッファー（10μｌ、第一化学社製）を加え、１００℃で５分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）に電気的にブロッティングして、先の（２）で得られたポリクローナル抗体を用いて常法によりウエスタンブロッティングアッセイを行った。
【０１１７】
また、ポリクローナル抗体の抗原に対する特異性を確かめるために、抗原として用いたペプチドを使い、抗体の吸収実験を行った。
結果を図１０に示す。これからわかるように、本発明の抗ヒトｐ５７ポリクローナル抗体は、ヒトｐ５７タンパクおよびマウスｐ５７タンパクに反応性を示した。また、当該ポリクローナル抗体とｐ５７タンパクとの反応は、免疫ペプチドを加えることにより阻害されることが確認され、本発明のポリクローナル抗体は、免疫ペプチドにも反応性を示すことがわかった。さらに、本発明のポリクローナル抗体はサル腎臓由来ＣＯＳ細胞の細胞質画分に対して反応性を示さなかったことから、本発明のｐ５７タンパクは非免疫系細胞には発現していない（存しない）ことが示唆された。
【０１１８】
参考例３ ドットプロット法
▲１▼ペプチド・ＢＳＡ複合体、▲２▼コントロールとして、ＫＬＨ（Keyhole Limpets Hemocyanin）を担体として同様に作成したペプチド・ＫＬＨ複合体、および▲３▼ＢＳＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を段階的にＰＢＳで希釈したものを、ニトロセルロース膜に２μｌずつスポットし、乾燥させた。
これを５％スキムミルク及び１０％ＦＣＳ（Fetal Calf Serum) を含有するＰＢＳ溶液と１時間反応させ、非特異的な吸着を除いた後に、得られた血清およびコントロールとして、非免疫ウサギの血清をそれぞれ２０倍に希釈したものを１時間反応させた。その後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ抗体（バイオ・ラッド社製）と１時間反応させて、これを４−クロロ−１−ナフトールにより発色させ、抗体価が上昇していることを確認する。
【０１１９】
実験例１
本発明のヒトｐ５７タンパクおよびウシｐ５７タンパクの各々のアミノ酸配列を比較したところ、約９５％の相同性を有していることがわかった（図１１）。更に、ヒトｐ５７タンパクおよびウシｐ５７タンパクのアミノ酸配列それぞれを、粘菌のコロニンのアミノ酸配列と比較したところ、ともに約４０％の相同性を有していることが分かった。図１２にヒトｐ５７タンパクと粘菌のコロニンのアミノ配列を比較した図を、図１３にウシｐ５７タンパクと粘菌のコロニンのアミノ配列を比較した図を示す。
【０１２０】
当該コロニンは、ＷＤ４０繰り返し構造を有するＷＤ４０ファミリーの１グループに属する粘菌由来の、細胞***の制御等の細胞骨格系を動かすタンパクである。また、当該タンパクはアクチンに結合性を有し、Ｇタンパクを介したｃＡＭＰレセプターからの走化性シグナルの皮質細胞骨格への伝達に関与すると考えられている〔EMBO J, 10(13), 4097-4104, 1991 〕。このことから、本発明のｐ５７タンパクも同様に、ＷＤ４０ファミリーに属する新たなタンパクとして、細胞***等の細胞骨格系の制御および／または走化性等の情報伝達に関与すると考えられる。
【０１２１】
このような構造活性相関の探索は、新規タンパクの生理的意義を解明し、ひいいては新たな医薬品等の研究開発のために重要なものであるが、かかる探索は、タンパクの一次構造が明らかになることにより初めて成しえるものである。従って、ｐ５７タンパクの一次構造を初めて開示する本発明は、研究の分野のみならず産業上においても極めて重要な意義を有する。
【０１２２】
実験例２ 潜在的リン酸化部位の解析
（１）コンピューター解析
実施例３で得られたヒトｐ５７のアミノ酸配列（配列表配列番号８）をもとに、プロテインモチーフ検索ソフト（ＧＥＮＥ ＷＯＲＫＳ−ＰＲＯＳＩＴＥ−）を用いて、潜在的リン酸化部位のコンピューター解析を行った。結果を図１４に示すが、これからわかるように、本発明のヒトｐ５７タンパクは、プロテインキナーゼＣおよびカゼインキナーゼIIによる潜在的リン酸化部位を有していた。
【０１２３】
（２）インビトロアッセイ
▲１▼被験タンパクの調製
本アッセイに用いるため、ＷＤ４０繰り返し構造領域のみを有する部分タンパク〔以下、ＧＳＴ／ヒトｐ５７（１─４）と称する。〕および７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域のみを有する部分タンパク〔以下、ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３─５）と称する。〕を実施例３乃至実施例５と同様にして調製した。
具体的には、ＧＳＴ／ヒトｐ５７（１−４）は、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで線状化したプラスミドｐＧＥＸ−５Ｘ−１に、プラスミドｐＢIIλ６−４をＰｍａＣＩおよびＢｇｌＩで消化して得られたヒトｐ５７（１−４）をコードするｃＤＮＡを挿入することによってプラスミドｐＧＥＸ／ヒトｐ５７（１−４）を構築し、ＧＳＴとの融合タンパクとして調製した。
なお、線状化ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ切断末端とヒトｐ５７（１−４）をコードするｃＤＮＡのＰｍａＣＩ切断末端との連結には、実施例４（１）で作成したアダプターａを用い、線状化ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＳａｌＩ切断末端とヒトｐ５７（１−４）をコードするｃＤＮＡのＢｇｌＩ切断末端との連結には、実施例４と同様にＤＮＡシンセサイザーを用いて作成した２つの合成ヌクレオチド（配列表配列番号２５および２６）からなるアダプターｃを用いた（図１５▲１▼参照）。
当該部分タンパクＧＳＴ／ヒトｐ５７（１−４）をコードするＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素地図を図１６▲１▼に示す。
【０１２４】
ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）は、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで線状化したプラスミドｐＧＥＸ−５Ｘ−１に、プラスミドｐＢIIλ６−４をＢｇｌＩおよびＳａｃＩで消化して得られたヒトｐ５７（３−５）をコードするｃＤＮＡを挿入することによってプラスミドｐＧＥＸ／ヒトｐ５７（３−５）を構築し、ＧＳＴとの融合タンパクとして調製した。
なお、線状化ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＢａｍＨＩ切断末端とヒトｐ５７（３−５）をコードするｃＤＮＡのＢｇｌＩ切断末端との連結には、ＤＮＡシンセサイザーを用いて作成した２つの合成ヌクレオチド（配列表配列番号２７および２８）からなるアダプターｄを用い、線状化ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のＳａｌＩ切断末端とヒトｐ５７（３−５）をコードするｃＤＮＡのＳａｃＩ切断末端との連結には、実施例４（１）で作成したアダプターｂを用いた（図１５▲２▼参照）。
当該部分タンパクＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）をコードするＤＮＡを含むプラスミドの制限酵素地図を図１６▲２▼に示す。
得られたプラスミドｐＧＥＸ／ヒトｐ５７（１−４）、プラスミドｐＧＥＸ／ヒトｐ５７（３−５）各々でＥ．ｃｏｌｉＤＨ５を形質転換し、実施例５と同様にいて各々の融合タンパクを取得し、各々の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を図９（レーン３、２）に示す。
【０１２５】
▲２▼アッセイ
▲１▼で得られたＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクを用いて、下記のリン酸化反応および免疫沈降法により本発明のヒトｐ５７タンパクがプロテインキナーゼＣ（以下、ＰＫＣともいう）によってリン酸化されることを確認した。
まず、マイクロチューブに Tris (25mM, pH 7.0)、MgCl2 (10mM)、[ γ−32P]- ATP (1×10-5 M) 、CaCl2 (0.5mM) 、フォスファチジルセリン(0.05 μg/μl)、および 2- メルカプトエタノール (10mM) を含むキナーゼバッファー(200μl)を加え、ついでプロテインキナーゼＣ (0.225 μg/ml、プロメガ社製) および先の▲１▼で得られたＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパク〔各々（１−４）および（３−５）〕が免疫沈殿しているセファロースビーズ（25μg/ml) を加え、３０℃で２０分間反応させた。反応後、反応物を遠心し（15000rpm、４℃、２分間) 、沈殿物を回収した。回収物をＰＢＳ／０．１％トライトンＸ−１００（ナカライテスク社製）で２回洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー（40μl 、第一化学社製）を加え、１００℃で５分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った結果を図１７に示す。リン酸化されればバンドとして検出される。図１７中、８０ｋＤａ付近に見られるバンドはＰＫＣがＰＫＣによって自己リン酸化されたことを示すものである。この結果から、ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）タンパクのみがその分子量（３７ｋＤａ）に相当する部分にバンドが認められ、リン酸化されていることが確認された。
【０１２６】
実験例３ アクチンに対する結合性
実施例５で得られたＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクを用いて、共沈降法（Cosedimentation assay)により本発明のヒトｐ５７タンパクがアクチンに結合することを確認した。
Tris (20mM, pH 8.0)、CaCl2 (0.1mM) 、ATP (0.2mM) 及びKCl (160mM) からなるバッファー(200μl)が入ったマイクロチューブに、Ｇ−アクチン（0.15μg/μl 、シグマ社製）を加え、次いでＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクを加え、２５℃で１時間反応させた。反応物を超遠心し（100000×G 、４℃で１時間）、沈殿物を回収した。超遠心前のサンプル，超遠心後の上清および沈殿物をそれぞれＨＥＰＥＳバッファー（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸塩、100 μl)に溶解し、ＳＤＳサンプルバッファー（100 μl 、第一化学社製）を加え、１００℃で５分間煮沸した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図１８）。
対照実験として、ＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクをＧ−アクチンを加えない系で同様に処理して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図１９）。
【０１２７】
アクチンは、Ｆアクチンとした後、超遠心処理をすると沈殿する性質がある。従って、Ｆ−アクチンに結合するタンパクは、該アクチンと共に超遠心すると、Ｆ−アクチンと共沈し、沈殿側に検出されるようになる。
上記実験の結果、アクチンを共存させない対照実験においては、ＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクのバンド（83〜84ｋＤａ）は沈殿側に検出されなかったのに対して（図１９レーン４）、アクチンを共存させるとＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパク（83〜84ｋＤａ）のバンドはアクチン（42ｋＤａ）と共に沈殿側に検出された。
また、コントロール被験タンパクとしてＧＳＴ／ヒトｐ５７融合タンパクの代わりにＧＳＴタンパク（26〜27 KDa）を用いて同様の実験を行った場合には、遠心後沈殿物について、ＧＳＴのバンドが現れなかった（ＧＳＴは共沈しなかった）。このことから、本発明のヒトｐ５７タンパクは、アクチンに対して結合性を有することが確認された。
【０１２８】
実験例４ ｐ５７タンパクの発現の組織分布
下記の方法により、本発明のｐ５７タンパクの組織分布を調べた。
ＢＡＬＢ／ｃマウスから、外科的手術により脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、胃、腸、腎臓、胸腺、骨髄、リンパ節（脇窩および腸間膜）および大腿骨骨格筋を各々摘出し、ＰＢＳで洗浄した後、各々細切し、ホモジナイゼーションバッファー〔10mM Tris-HCl (pH7.4) 、5mM EGTA、0.1mM DTT 、0.1mM DFP 、5 μg/mlロイペプチン〕中に加えホモジナイザーを用いてホモジナイズした。各々のホモジネートを遠心（14000rpm、４℃、20分間) し、細胞質画分を抽出した。得られた各々の抽出液のタンパク定量をＢＣＡタンパクアッセイキット（ピアス社製）を用いて行い、各々２mg/ml のタンパク濃度になるように調製した。
各々7.5 μl を分取し、ＳＤＳサンプルバッファー（7.5 μl 、第一化学社製）を加え、１００℃で５分間煮沸した後、各々15μg/レーンとなるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。その後、ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社製）に電気的にブロッティングを行い、実施例６で得た抗血清を用いて常法によりウエスタンブロティングアッセイを行った。
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスから取得した脾臓由来Ｔ細胞、脾臓由来Ｂ細胞、および腹膜由来マクロファージ、ならびに健常ヒト由来末梢血リンパ球および好中球の各々の細胞質画分についても同様にして試験を行った。
【０１２９】
結果を図２０〜図２３に示す。この結果、本発明のｐ５７タンパクは、脳（図20, レーン１）、胸腺（図20, レーン２）、脾臓（図21, レーン２）および骨髄（図21, レーン５）で特異的に発現が見られ、さらにリンパ球（図22）、単球およびマクロファージ系の細胞（図23）で発現されることが分かった。一方、脳、胸腺、脾臓および骨髄以外の組織では有意な発現が確認できなかったことから、本発明のｐ５７タンパクは免疫系組織および脳において特異的に発現されることがわかった。
【０１３０】
以上、本発明者らによる研究の結果をまとめると、本発明のｐ５７タンパクは下記のような構造的特徴および生物学的性状を有している。
▲１▼細胞運動の制御において重要な役割を担うアクチン結合性を有している。
▲２▼粘菌の走化性および細胞***に関与するアクチン結合性タンパクであるコロニンと約４０％のホモロジーを有している。
▲３▼細胞内での情報（シグナル）伝達、細胞運動の制御、細胞の***および複製あるいは遺伝子の転写といった生物学的機能の発現において重要な役割を担うと考えられている、ヘテロ３量体Ｇタンパク（トランスデューシン）のβサブユニットをはじめとする真核生物由来の種々の細胞内タンパクの構造中に共通して見られるＷＤ４０繰り返し構造領域を有している。
▲４▼細胞内での情報伝達におけるエネルギー伝搬に必要とされる潜在的リン酸化部位を有している。
▲５▼種々のＤＮＡ結合タンパクに共通して見られる、７つのアミノ酸ごとのロイシン残基の繰り返し構造領域を有し、この特徴的構造領域においてαヘリックスを形成し得る。
【０１３１】
▲６▼哺乳動物においては、免疫系組織および脳に特異的に発現が見られる。
【０１３２】
一方、今日、外的刺激に対する細胞内での情報伝達に深く関わるホスフォリパーゼＣや低分子量Ｇタンパクを介したシグナルは、例えば染色体の***ひいては細胞***のような細胞骨格系（細胞運動）の調節に連関すること、アクチン結合タンパク質は、細胞***、細胞増殖、細胞膜輸送、細胞運動、イノシトールリン脂質代謝において重要な役割を担うこと、またそれら自身腫瘍形質抑制作用を有すること、および遺伝的にアクチンに異常を有すると免疫系細胞の活性化に支障をきたしウイルス等の感染しやすくなること等が判明している。
【０１３３】
さらに、本発明のＰ５７タンパクは、それが有する上記特徴▲１▼〜▲６▼から、当該分野において今まで得られている情報等に基づいて考察するに、生体内において、外的刺激に対する細胞内情報伝達系を介した細胞骨格系（細胞運動）の制御に係る役割を担っているものと推測される。
細胞運動のうち、例えば、細胞***において何らかの役割を担うタンパクであるならば、本発明のタンパクを標的として、***時に必須なチューブリンの重合あるいは脱重合を阻害する薬剤として知られているコルヒチンやタキソールのような強力な抗癌剤を開発することができる。
【０１３４】
また、本発明のｐ５７タンパクが、例えば、免疫担当細胞である白血球に見られるような、細胞内情報伝達を介した細胞の走化性の誘導において役割を担うタンパクであるならば、本発明のタンパクを標的として、該細胞の走化性を制御することによる抗炎症剤や免疫抑制剤を開発することが可能である。
さらに、本発明のｐ５７タンパクが、例えば、転写因子等のＤＮＡ結合タンパクと相互作用するようなものとして役割を担うタンパクであるならば、本発明のタンパクを標的として、ＨＩＶプロモーターＤＮＡ結合タンパクとして知られているＮＦκＢを標的とした抗ＨＩＶ阻害薬のような抗ウイルス剤を開発することが可能である。
【０１３５】
このような有用な薬剤の開発において、本発明のタンパクの体内分布が免疫系組織と脳に特異的であることから、例えば上述のコルヒチンやタキソール等のような組織非特異的な薬剤とは異なり、疾患部位特異的に作用し、副作用の少ない医薬品の開発の標的となりうる点で非常に有用である。
【０１３６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】子ウシ胸腺組織の細胞質画分をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにかけたクロマトグラムを示す図である。
【図２】ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにより分画したＰＬＣ活性成分をヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにかけたクロマトグラムを示す図である。
【図３】ヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにより分画したＰＬＣ活性成分をセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにかけたクロマトグラムを示す図である。
【図４】セファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーにより分画したＰＬＣ活性成分をＭｏｎｏＳカラムクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）にかけたクロマトグラムを示す図である。
【図５】ＭｏｎｏＳカラムクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により分画したＧＴＰγＳ活性のない画分をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムクロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）にかけたクロマトグラムを示す図である。
【図６】Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２により分取した各フラクション（フラクション番号１５〜２８）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）に供して銀染色した結果を示す図面にかわる写真である。尚、図中、Ｍは分子量マーカーを示す。
【図７】〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターａ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（PmaCI 〜 SacI)の断片／アダプターｂ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕の構造を模式的に記載した図である。
【図８】〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターａ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（PmaCI 〜 SacI)の断片／アダプターｂ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕が導入されたプラスミドｐＧＥＸ／ｈｐ５７の制限酵素マップを示す図である。
【図９】ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７融合タンパク，ＧＳＴ／ヒトｐ５７（１−４）およびＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）の発現を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動像を示す図面に代わる写真である。
レーン１：ＧＳＴタンパク
レーン２：ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）タンパク
レーン３：ＧＳＴ／ヒトｐ５７（１−４）タンパク
レーン４：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７融合タンパク
レーン５：分子量マーカー
【図１０】抗ヒトｐ５７ポリクローナル抗体の反応性を確認するためのウエスタンブロッティングの結果を示す図面に代わる写真（電気泳動写真）である。
レーン１〜３は、免疫原ペプチド非添加の系での結果を示す。
レーン１：ヒト由来ＨＬ６０細胞質画分
レーン２：マウス由来ＬＡＷ２６４．７の細胞質画分
レーン３：サル腎臓由来ＣＯＳ細胞の細胞質画分
レーン４〜６は、免疫原ペプチドを添加し、免疫原ペプチドでポリクローナル抗体を吸着させた場合の結果を示す
レーン４：ヒト由来ＨＬ６０細胞質画分
レーン５：マウス由来ＬＡＷ２６４．７の細胞質画分
レーン６：サル腎臓由来ＣＯＳ細胞の細胞質画分
【図１１】ヒトｐ５７タンパクのアミノ酸配列（一文字表記：上段）とウシｐ５７タンパクのアミノ酸配列（一文字表記：下段）を比較し、相同性をみた図である。なお、＊は相互に同じアミノ酸であることを示す。
【図１２】ヒトｐ５７タンパクのアミノ酸配列（一文字表記：下段）と粘菌のコロニンのアミノ酸配列（一文字表記：上段）を比較し、相同性をみた図である。なお、＊は相互に同じアミノ酸であることを示す。
【図１３】ウシｐ５７タンパクのアミノ酸配列（一文字表記：下段）と粘菌のコロニンのアミノ酸配列（一文字表記：上段）を比較し、相同性をみた図である。なお、＊は相互に同じアミノ酸であることを示す。
【図１４】ヒトｐ５７の潜在的リン酸化部位のコンピューター解析アミノ酸配列図（一文字表記）を示す。ＰＫＣとはプロテインキナーゼＣを、ＣＫIIとはカゼインキナーゼIIを意味する。□で囲まれるアミノ酸配列部分が、酵素で認識される部分であり、↑で示されるアミノ酸がリン酸化をうけるアミノ酸である。
【図１５】▲１▼は〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターａ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（PmaCI 〜 BglI)の断片（ヒトｐ５７（１−４）をコードするＤＮＡ）／アダプターｃ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕の構造を模式的に記載した図であり、▲２▼は〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターｄ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（BglI〜SacI) の断片（ヒトｐ５７（３−５）をコードするＤＮＡ）／アダプターｂ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕の構造を模式的に記載した図である。
【図１６】▲１▼は〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターａ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（PmaCI 〜 BglI)の断片（ヒトｐ５７（１−４）をコードするＤＮＡ）／アダプターｃ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕が導入されたプラスミドｐＧＥＸ／ｈｐ５７（１−４）の制限酵素マップを示す図であり、▲２▼は〔ｐＧＥＸ−５Ｘ−１／ＧＳＴ／アダプターｄ／ヒトｐ５７遺伝子コーディング領域（BglI〜SacI) の断片（ヒトｐ５７（３−５）をコードするＤＮＡ）／アダプターｂ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１〕が導入されたプラスミドｐＧＥＸ／ｈｐ５７（３−５）の制限酵素マップを示す図である。
【図１７】プロテインキナーゼＣによって、ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）タンパクがリン酸化されることを確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動像を示す図面に代わる写真である。
レーン１：ＧＳＴ／ヒトｐ５７（３−５）タンパク、
レーン２：ＧＳＴ／ヒトｐ５７（１−４）タンパク、
レーン３：ＧＳＴ（コントロール）、
レーン４：被験タンパクを加えないでＰＫＣのみを加えたサンプル
レーン５のドット：分子量マーカー
【図１８】ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクのアクチン結合性を示す図面に代わるＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（電気泳動写真）である。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクとＧアクチンを混和後、超遠心する
前のサンプル
レーン３：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクとＧアクチンを混和後、超遠心した
後のサンプル上清
レーン４：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクとＧアクチンを混和後、超遠心した
後のサンプル残渣（沈殿物）
【図１９】アクチンを含有させない系で実験例３と同一の実験を行った（対照実験）結果を示す図面に代わるＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真（電気泳動写真）である。
レーン１：分子量マーカー
レーン２：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクを超遠心する前のサンプル
レーン３：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクを超遠心した後のサンプル上清
レーン４：ＧＳＴ／全長ヒトｐ５７タンパクを超遠心した後のサンプル残渣（沈
殿物）
【図２０】ｐ５７タンパクの、マウスにおける組織分布（電気泳動像として）を示す図面に代わる写真である。レーン１及び６：脳、レーン２及び７：胸腺、レーン３及び８：肺、レーン４及び９：心臓、レーン５及び10：肝臓
なお、レーン１乃至５は抗ｐ５７ポリクローナル抗体とブロッティングさせたもの、レーン６乃至10はネガティブコントロールを示す。
【図２１】ｐ５７タンパクの、マウスにおける組織分布（電気泳動像として）を示す図面に代わる写真である。レーン１及び６：胃、レーン２及び７：脾臓、レーン３及び８：腎臓、レーン４及び９：筋肉、レーン５及び10：骨髄
なお、レーン１乃至５は抗ｐ５７ポリクローナル抗体とブロッティングさせたもの、レーン６乃至10はネガティブコントロールを示す。
【図２２】ｐ５７タンパクの、マウスにおける組織分布（電気泳動像として）を示す図面に代わる写真である。レーン１及び６：腸間膜リンパ節、レーン２及び７：腋窩リンパ節。
なお、レーン１乃至２は抗ｐ５７ポリクローナル抗体とブロッティングさせたもの、レーン６乃至７はネガティブコントロールを示す。
【図２３】ｐ５７タンパクの、マウス及びヒトにおける細胞分布（電気泳動像として）を示す図面に代わる写真である。
レーン１及び６：ヒト末梢血のリンパ球細胞、レーン２及び７：ヒト好中球、レーン３及び８：マウス脾臓Ｔ細胞、レーン４及び９：マウス脾臓Ｂ細胞、レーン５及び10：マウス腹膜由来マクロファージ。
なお、レーン１乃至５は抗ｐ５７ポリクローナル抗体とブロッティングさせたもの、レーン６乃至10はネガティブコントロールを示す。[0001]
[Industrial applications]
The present invention provides a protein having a novel structure. Specifically, a protein having a WD40 repeating structural region and a repeating structural region of leucine residues every seven amino acids simultaneously in a single polypeptide chain, and further comprising an actin-binding and / or potential phosphorylation site To provide a protein having
The present invention also provides a DNA encoding the amino acid sequence of the protein, a vector containing the DNA, a host cell transformed with the vector, a method for producing the protein by culturing the host cell, and a method for producing the protein or An antibody having an affinity for the fragment is provided.
[0002]
[Prior art]
Heretofore, many proteins having a repeating structure called WD40 repeat found in the structure of the β subunit of a heterotrimeric GTP binding protein [G protein, transducin] have been reported. Called family. All of the proteins belonging to the WD40 family reported so far are found in cells and are roughly classified into the following three groups according to their subcellular localization [FEBS, 307, (2), p131-134, (1992)].
[0003]
The first group is "in the nucleus", for example, yeast-derived CDC4 (J. Mol. Biol., 195, 233-245, 1987, Yochem, J., et al: Biochem. Biophys. Res. Commun, 172, 1324-1330, 1990, Choi, WJ, et al), yeast-derived PRP4 (Cell, 58, 811-812, 1989, Dalrymple. MA, et al: Mol. Cell. Biol, 9, 3710-). 3719, 1989, Banrogunes, J., et al: Trends. Gen, 7, 79-85, 1991, Ruby, SW, et al), yeast-derived TUP1 (Cell, 68, 709-719, 1992, Keleher, AC, et al) and dTAFII80 derived from Drosophila are known.
These proteins are thought to be involved in gene transcription, chromosome replication, or cell division and proliferation.
[0004]
The second group is those that are present at “adjacent positions inside the cell membrane” and include, for example, a mammalian G-protein β subunit (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2162-2166, 1986, Fong, HKW, et al: Science, 252, 802-808, 1991, Simon, MI, et al), Esp1 from Drosophila (Cell, 55, 785-795, 1988, Hertley, DA, et al) and yeast STE4 (Cell, 56, 467-477, 1989, Whiteway, M., et al) and the like are known.
These proteins are thought to be involved in various signal transmissions from outside the cell and / or inside the cell.
[0005]
A third group exists as "a component of the cytoskeleton of a cell". For example, slime mold-derived coronin is known. This protein has binding properties to actin involved in the regulation of cell motility and is thought to be involved in the transmission of chemotactic signals from cAMP receptors to the cortical cytoskeleton via G protein [EMBO J, 10 (13), 4097-4104, 1991, ELde Hosts, et al].
[0006]
In addition, as proteins belonging to the WD40 family, CDC20 derived from yeast (Molecullar and Cellular Biology, 11 (11) 5592-5602, 1991), and 12.3 derived from chicken (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4594-4598, 1989), yeast-derived PRP17 (Trends Gen, 7, 79-85, 1991), yeast-derived MAK11 (J. Biol. Chem., 263, 1467-1475, 1988), yeast-derived SK18 (Yeast, 9, 43-51, 1993) and the like are known and are considered to be involved in gene transcription, chromosome replication, cell division and proliferation, information transmission, etc. [ FEBS, 307, (2), 131-134, 1992, Loesje, von der. Voom, et al].
[0007]
Also, in recent years, it has been found that a characteristic higher-order structure called a leucine-zipper structure consisting of a repeating structure of leucine residues every seven amino acids is commonly present in certain types of DNA-binding proteins. Have been. This structural region forms an α-helix. Further, the helix of the protein and another protein having the same structure are mutually twisted in parallel to each other due to van der Waals force, electrostatic interaction, physicochemical bonding such as hydrophobic bonding and hydrogen bonding, and overlap with each other. It is known that a coiled coil structure can be formed by such a method (Experimental Medicine, Vol. 12, No. 14, pp. 94-96, 1994).
As proteins having such a structure, for example, transcriptional regulators such as C / EBP, CREB, GCN4, myc, fos, and jun are known [Experimental Medicine, 11 (8), 62-68, 1993, Masayoshi Imagawa].
[0008]
Furthermore, many proteins having actin-binding properties are known so far (proteins, nucleic acids, and enzymes, 39, 3, 212-220, 1994), and for example, ASP-56 derived from pig (FEBS Letters, 298, 149). -153, 1992), human-derived HSP-90 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 8054-8058, 1986), MARCKS (Cell, 71, 713-716, 1992), fuodrine (Physiol. Rev. Actin-binding proteins such as., 70, 1029-1065, 1990) are known to play important roles in cell division, cell membrane trafficking, cell motility, cell cycle regulation and cell proliferation.
Gelsolin (Oncogene, 8, 2531-2536, 1993), tensin (Science, 252, 712-715, 1991), merlin (Cell, 72, 791-800, 1993), tropomyosin (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90, 7039-7043, 1993), α-actinin (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90, 383-387, 1993), lipocortin I (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 3571). Actin-binding proteins such as J.-3575, 1992) and vinculin (J. Cell Biol., 119,427-438, 1992) are known to exhibit tumor trait suppressive activity. Furthermore, profilin (Science, 247, 1575-1578, 1990), gelsolin (J. Biol. Chem., 267, 11818-11823, 1992), and tensin (Muscle Res. Cell Motility, 12, 136-144, 1991). Actin-binding proteins such as α-actinin (Cold Spring Harbor Laboratory Meeting, The Cytoskeleton and Cell Function, Cold Spring Harbor, 1993) and vinculin (Nature, 359, 150-152, 1992) are inositolulins in the intracellular signal transduction system. It is known to play a role in lipid metabolism.
[0009]
However, proteins that simultaneously have characteristic structures such as the above-described WD40 repeating structure and the repeating structure of leucine residues every seven amino acids in one polypeptide chain and bind to actin are completely known. Absent.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a novel protein having both a WD40 repeating structure and a repeating structure of leucine residues every seven amino acids simultaneously in one polypeptide chain.
In recent years, a method using a genetic engineering technique has become essential for efficient and mass production of proteins. Accordingly, an object of the present invention is to provide an amino acid sequence of the protein necessary and useful for the production of the above-mentioned novel protein, a gene encoding the amino acid sequence, an expression system thereof, and a genetic engineering method for producing the protein. And Still another object of the present invention is to provide an antibody having an affinity for the novel protein or a fragment thereof.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above-mentioned object. As a result, from a mammalian thymocyte, in one polypeptide chain, a WD40 repeating structure and a repeating structure of leucine residues every seven amino acids were found. Was found, and the primary structure of the protein and the nucleotide sequence of its gene were successfully determined and obtained.
Based on this finding, further studies have revealed that the protein has a potential phosphorylation site involved in energy transmission in the signal transduction system in cells and plays an important role in the control of cell motility The present invention has been completed by confirming that it has useful properties such as binding to actin.
[0012]
That is, the present invention is as follows.
(1) A protein comprising a single polypeptide chain having a WD40 repeating structure region and a repeating structure region of leucine residues for every seven amino acids.
(2) In one polypeptide chain, a repeating structure of leucine residues for every seven amino acids is repeated at the C-terminal region and WD40 is repeated at the N-terminal side of the repeating structural region.
A protein having a structure.
(3) The protein according to the above (1) or (2), which has a binding property to actin.
(4) The protein according to any one of the above (1) to (3), which has a potential phosphorylation site in a single polypeptide chain.
(5) An amino acid sequence in which the WD40 repeating structural region is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5 arranged in the C-terminal direction in this order, particularly represented by SEQ ID NO: 6 The protein according to any one of the above (1) to (4), which has an amino acid sequence.
(6) The protein according to any one of the above (1) to (5), wherein the repeating structure of leucine residues for every seven amino acids has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing. .
(7) The protein according to any one of (1) to (6), which is a human-derived protein.
(8) The protein according to any one of the above (1) to (7), having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
(9) The protein according to any one of (1) to (8) above, wherein the protein has a repetitive structural region of leucine residues every seven amino acids, A dimeric protein formed by physicochemically binding to one protein.
(10) a DNA having a base sequence encoding the protein according to any one of the above (1) to (8), preferably a base sequence represented by
(11) A recombinant vector containing the DNA of (10) above.
(12) A host cell transformed with the recombinant vector of (11).
(13) The method for producing a protein according to the above (1) to (10), wherein the host cell of the above (12) is cultured and collected from the obtained culture.
(14) An antibody which has an affinity for a peptide substantially or entirely having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing.
[0013]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present specification and drawings, three or one letters of the alphabet used to represent amino acids mean the following amino acids.
(Gly / G) glycine, (Ala / A) alanine, (Val / V) valine, (Leu / L) leucine, (Ile / I) isoleucine, (Ser / S) serine, (Thr / T) threonine, (Asp / D) aspartic acid, (Glu / E) glutamic acid, (Asn / N) asparagine, (Gln / Q) glutamine, (Lys / K) lysine, (Arg / R) arginine, (Cys / C) cysteine, (Met / M) methionine, (Phe / F) phenylalanine, (Tyr / Y) tyrosine, (Trp / W) tryptophan, (His / H) histidine, (Pro / P) proline.
[0014]
The protein of the present invention (hereinafter also referred to as p57 protein) is characterized by having a WD40 repeating structural region and a repeating structural region of leucine residues for every seven amino acids simultaneously in one polypeptide chain. It is. Preferably, a single polypeptide chain has a repeating structure of leucine residues every seven amino acids in the C-terminal region, and has a WD40 repeating structure in the N-terminal region from the repeating structure region. It is a protein, more preferably, further characterized by (1) binding to actin and / or (2) having a potential phosphorylation site.
[0015]
The term “WD40 repeating structure” as used in the present invention means a characteristic repeating structure that is conserved in a high proportion in eukaryotic proteins called WD repeat proteins, and examples thereof include NATURE. VOL. 371, 22 SEPTEMBER 1994 p297-300, especially the structure described in FIG. 1 on page 298 and Table 1 on page 299.
[0016]
More specifically, the “WD40 repeating structure” in the present invention is represented by the following general formula (I):
Or an amino acid sequence in which the mismatch of amino acid residues other than X1 in the range of 8 or less based on the general formula (I) is referred to as a "repeated unit sequence". It means an amino acid sequence structural region that is repeated at least twice. The “repeating unit sequences” constituting the “WD40 repeating structure” are not particularly limited, even if they are identical to each other, different from each other, or a mixture thereof.
Further, the “WD40 repeating structure” in the present invention is a structure wherein the above “repeating unit sequence” is repeated continuously, but is discontinuously repeated via any other amino acid sequence. Is also good.
[0017]
Preferred examples of the “repeat unit sequence” include the amino acid sequences described in any of SEQ ID NOs: 1 to 5 in the Sequence Listing. Further, as a preferred specific example of the “WD40 repeating structure region” in the present invention, the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 in the Sequence Listing are arranged in this order in the C-terminal direction. A structure having an amino acid sequence, more preferably a structure having an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing, may be mentioned.
[0018]
The “repeated structural region of leucine residues for every seven amino acids” as used in the present invention is defined by the general formula (II) in the primary structure of a protein.
(Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7) n
(Wherein, Y1 is any hydrophobic amino acid other than Pro, Y2, Y3 and Y6 are any amino acids other than Pro, Y4 is Leu, Y5 and Y7 are any amino acids other than Pro, and And n represents an integer of 4 or more.)
Means a continuous repeating amino acid sequence structure represented by
As a preferred specific example in the present invention, a structure having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 15 in the Sequence Listing is exemplified.
[0019]
The repeating structural region can form, as a secondary structure of the protein, an α-helical structure in which the hydrophobic amino acids Y1 and Y4 (Leu) in the general formula (II) are coordinated on the same plane.
[0020]
The α-helix formed by the “repeated structure region of leucine residues for every seven amino acids” can form a coiled coil structure as a tertiary structure together with another protein having the same structure as the repeated structure.
The coiled-coil structure may include van der Waals forces of the hydrophobic amino acid side chains of Y1 and Y4 (Leu), electrostatic interactions of the amino acid side chains having the charges of Y5 and Y7, and / or non-Y5 and Y7 such as asparagine and The two α-helices are formed by twisting and overlapping each other in parallel due to a hydrophobic bond or a hydrogen bond between amino acids having a large side chain such as arginine.
[0021]
Therefore, a protein having a “repeated structure region of leucine residues for every seven amino acids” according to the present invention can form a dimer with another protein having a similar repeated structure in the repeated structure region. .
The protein of the present invention also includes such a dimeric protein. In the present invention, the dimer may be a homodimer composed of the same protein or a heterodimer composed of different proteins.
[0022]
The term “actin-binding property” as used in the present invention means the property of binding to actin, a protein that is present in cells of various tissues including skeletal muscle constituent cells and is involved in regulation of cell motility. An example in which the protein of the present invention exhibits actin binding property is described in Experimental Example 3 described later.
[0023]
The term "potential phosphorylation site" as used in the present invention means an amino acid sequence site that can be phosphorylated by an enzyme.
For example, an enzyme such as protein kinase such as casein kinase, protein kinase C and EGF receptor protein kinase acts to transfer the γ-phosphate group of ATP (adenosine-5′-triphosphate) to phosphorylate the protein. Specific amino acid sequence sites containing serine, threonine or tyrosine residues on the peptide chain that can be used.
[0024]
As preferred specific examples of the “potential phosphorylation site” in the present invention,
{Circle around (1)} For the amino acid sequence site containing a serine residue or threonine residue, for example, (i) a general formula which can be phosphorylated by cAMP-dependent protein kinase:
Arg-Xn-Ser*
(Wherein, X represents an arbitrary amino acid, and n represents an integer of 1 or 2.*Amino acid residues marked with "" mean amino acid residues to be phosphorylated. ), The amino acid sequence site represented by
(ii) General formula that can be phosphorylated by cGMP-dependent protein kinase:
(Arg / Lys) -Xn- (Ser*/ Thr*) Or (Ser*/ Thr*) -X- (Arg / Lys)
(Wherein, n is an integer of 1 to 3, and the two amino acids described using / in parentheses are either one of them. X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(iii) a general formula that can be phosphorylated by protein kinase C:
(Ser*/ Thr*) -X- (Lys / Arg) or (Lys / Arg) -Xn- (Ser* / Thr*)
(Wherein, n represents an integer of 1 or 2. /, X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(iv) General formula that can be phosphorylated by calmodulin-dependent protein kinase
X-Arg-X-X- (Ser*/ Thr*)
(Where, /, X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
[0025]
(v) General formula that can be phosphorylated by casein kinase II
(Ser*/ Thr*) -X-X- (Glu / Asp) -X
(Where, /, X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(vi) General formula that can be phosphorylated by casein kinase I
Ser-X-X- (Ser*/ Thr*)
(Where, /, X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(vii) a general formula capable of being phosphorylated by glycogen synthase kinase-3
Ser*-X-X-X-Ser
(Where X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(viii) General formula that can be phosphorylated by Growth-associated histone H1 kinase (MPF, cdc2 + / CDC28 protein kinase)
(Ser*/ Thr*) -Pro-X- (Lys / Arg), (Lys / Arg)-(Ser*/ Thr*) -Pro or (Ser*/ Thr*) -Pro- (Lys / Arg)
(Where, /, X and*Is as defined above. ), The amino acid sequence site represented by
(ix) General formula that can be phosphorylated by phosphorylase kinase
(Lys / Arg) -X-X-Ser*-(Val / Ile)
(Where, /, X and*Is as defined above. )).
[0026]
(2) The amino acid sequence site containing a tyrosine residue includes, for example, an enzyme called V-Abl.
Arg-Arg-Leu-Ile-Glu-Asp-Ala-Glu-Tyr*-Ala-Ala-Arg-Gly
And the amino acid sequence site represented by
[0027]
The p57 protein of the present invention is a protein derived from a eukaryote, preferably a protein derived from yeast or a mammal. More preferred are proteins derived from bovine, human, mouse, rat rabbit, dog or monkey, and particularly preferred are proteins derived from bovine or human.
Further, the protein of the present invention may be a protein constituting various tissue cells in the mammal, and is preferably derived from an immune system tissue cell such as thymus, spleen or lymph node, or a brain tissue cell.
[0028]
A more preferred embodiment of the p57 protein of the present invention includes a protein having substantially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 16 in the Sequence Listing.
Here, “substantially” refers to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 433 to 461 described in SEQ ID NO: 8 in the C-terminal region without being specified by the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or 16. (SEQ ID NO: 6) in the N-terminal region of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6), or the amino acid sequence represented by
[0029]
In addition, the method for obtaining (producing) the p57 protein of the present invention is not particularly limited, and in addition to the gene recombination technique described later, a known method known in the technical field such as a chemical synthesis method, a cell culture method, or a method thereof. Modification methods can be used as appropriate.
[0030]
The DNA having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the p57 protein of the present invention refers to a WD40 repeating structure region and a repeating structure region of leucine residues every seven amino acids in one polypeptide chain described in detail above. And a DNA having a base sequence encoding an amino acid sequence of a protein having both
The DNA may have any nucleotide sequence as long as it can encode the p57 protein of the present invention. Specifically, the DNA has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the C-terminal region, and DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the N-terminal region, or having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 in the C-terminal region, and SEQ ID NO: DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by No. 14. It is preferably a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 16, or a DNA encoding a protein having substantially the same structure and properties as those thereof.
[0031]
More specifically, in the base sequence of SEQ ID NO: 8, a DNA having the base sequence of
[0032]
In general, in the technical field related to genetic recombination, it is possible to replace at least one base of a DNA sequence of a gene with another base without changing the amino acid sequence of a protein produced from the gene according to the degeneracy of the genetic code. it can. Therefore, the DNA of the present invention comprises a base sequence represented by
[0033]
The DNA of the present invention may be obtained by any method. For example, complementary DNA (cDNA) prepared from mRNA, DNA prepared from genomic DNA, DNA obtained by chemical synthesis, DNA obtained by amplifying by PCR using RNA or DNA as a template, and appropriately combining these methods It also encompasses all DNAs constructed by the above method.
[0034]
The DNA encoding the p57 protein of the present invention can be obtained by a method of cloning cDNA from p57 protein mRNA, a method of isolating and splicing genomic DNA, a method of chemically synthesizing, and the like according to a conventional method.
(1) For example, as a method of cloning cDNA from mRNA of p57 protein, the following method is exemplified.
First, lymphocytes or monocytes such as HL60 cells expressing and producing p57 protein are cultured, and the cells are collected. Then, mRNA encoding the p57 protein is prepared from the cells. For preparation of mRNA, total RNA prepared by a known method such as a guanidine thiocyanate method [Chirgwin, JM et al., Biochem., 18, 5294 (1979)], a hot phenol method or an AGPC method is oligo (dT ) Affinity chromatography using cellulose or poly-U-sepharose can be carried out. Next, a known method such as, for example, using reverse transcriptase using the obtained mRNA as a template [for example, the method of Okayama, H. et al. ｛Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982) ) And 3,280 (1983) in the same journal and the method of Gubler, U. and Hoffman, BJ {Gubler, H. and Hoffman, BJ, Gene, 25, 263 (1983)}. ] To convert a cDNA into a double-stranded cDNA. This cDNA is incorporated into a plasmid vector or a phage vector and transformed into Escherichia coli, or after in vitro packaging, transfected into Escherichia coli to prepare a cDNA library.
[0035]
The plasmid vector used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host, and any phage vector can be used as long as it can be propagated in the host. Examples of cloning vectors used in a conventional manner include pUC119, λgt10, λgt11 and the like. However, when subjected to the immunological screening described below, a vector having a promoter capable of expressing the p57 gene in a host is preferable.
[0036]
Methods for incorporating cDNA into a plasmid include, for example, the method described in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989). Is mentioned. As a method of incorporating cDNA into a phage vector, the method of Hyunh, T.V. et al. [Hyunh, T.V., DNA Cloning, apractical approach, 1, 49 (1985)] and the like can be mentioned. For convenience, a commercially available ligation kit (for example, Takara Shuzo) can be used. The thus obtained recombinant plasmid or phage vector is introduced into an appropriate host such as a prokaryotic cell (for example, E. coli HB101, DH5 or MC1061 / P3).
[0037]
As a method for introducing a plasmid into a host, the calcium chloride method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1.74 (1989), Maniatis, T. et al. Alternatively, a calcium chloride / rubidium chloride method, an electroporation method and the like can be mentioned. Examples of a method for introducing a phage vector into a host include a method in which phage DNA is packaged in vitro and then introduced into a grown host. In vitro packaging can be easily performed by using a commercially available in vitro packaging kit (for example, manufactured by Stratagene, Amersham).
[0038]
The method of isolating the cDNA encoding the p57 protein of the present invention from the cDNA library prepared by the above method can be performed by combining general cDNA screening methods.
For example, after separately synthesizing an oligonucleotide that is considered to correspond to the amino acid sequence of p57 protein,32Labeled with P to form a probe, a known colony hybridization method [Crunstein, M. and Hogness, DS: Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975)] or a plaque hybridization method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2.108 (1989)], a method for screening a clone containing the cDNA of interest, preparing PCR primers, amplifying a specific region of p57 protein by PCR, and And a method of selecting a clone having a DNA fragment encoding When a cDNA library prepared using a vector capable of expressing cDNA (for example, λgt11 phage vector) is used, a target clone can be selected by utilizing an antigen-antibody reaction using a p57 antibody. . When a large number of clones are processed, it is preferable to use a screening method using a PCR method.
[0039]
The nucleotide sequence of the DNA thus obtained was determined by the Maxam-Gilbert method [Maxam, AM and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)] or phage M13. It can be determined by the method of terminating the dideoxynucleotide synthesis chain [Sanger, f. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)]. The p57 gene can be obtained by cutting out all or part of the p57 gene from the clone obtained as described above using restriction enzymes and the like.
[0040]
(2) As a preparation method by isolating DNA encoding p57 protein from genomic DNA of cells derived from mammals such as HL60, the following method is exemplified. The HL60 cells are preferably lysed using SDS or proteinase K, and the DNA is deproteinized by repeating extraction with phenol. The RNA is digested, preferably by ribonuclease. The obtained DNA is partially digested with an appropriate restriction enzyme, and the obtained DNA fragment is amplified with an appropriate phage or cosmid to prepare a library. Then, a clone having the target sequence is detected by, for example, a method using a radiolabeled DNA probe, etc., and all or part of the p57 gene is cut out from the clone with a restriction enzyme or the like and obtained.
[0041]
(3) In the production of the DNA of the present invention by chemical synthesis, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8, the nucleotide sequence represented by
[0042]
Further, the present invention relates to a recombinant vector containing a DNA encoding the above-mentioned p57 protein. The recombinant vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate and maintain or self-proliferate in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes plasmid vectors and phage vectors.
The recombinant vector can be easily prepared by ligating a DNA encoding the p57 protein of the present invention to a vector for recombination (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art in a conventional manner. . Specific examples of the recombination vector used include, for example, pBR322, pBR325, pUC12, and pUC13 as plasmids derived from Escherichia coli, pSH19 and pSH15 as plasmids derived from yeast, and pUB110, pTP5, and pC194 as plasmids derived from Bacillus subtilis. Is exemplified. Examples of the phage include bacteriophage such as λ phage, and animal and insect viruses [pVL1393 (manufactured by Invitrogen)] such as retrovirus, vaccinia virus, and nucleopolyhedrovirus.
[0043]
For the purpose of expressing the p57 gene and producing the p57 protein, an expression vector is useful. The expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing the p57 gene in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells and producing these proteins. Preferably, it is an expression vector derived from Escherichia coli (pGEX-5X-1) or SV-40.
When a bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector generally comprises at least a promoter-operator region, an initiation codon, DNA encoding the p57 protein of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit.
When yeast, animal cells or insect cells are used as a host, the expression vector preferably contains at least a promoter, an initiation codon, a DNA encoding the p57 protein of the present invention, and a termination codon. It may also contain a DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, 5 'and 3' untranslated regions of the p57 gene of the present invention, a splicing junction, a polyadenylation site, a selectable marker region or a replicable unit. Good. Further, it may contain a gene amplification gene (marker) usually used depending on the purpose.
[0044]
The promoter-operator-region for expressing the p57 protein of the present invention in bacteria includes a promoter, an operator and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG). For example, when the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, those containing a Trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a λPL promoter, an lpp promoter, a tac promoter and the like are preferably exemplified. Examples of a promoter for expressing the p57 protein of the present invention in yeast include a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, and an ADH promoter. Is mentioned. When the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell, examples thereof include an SV40-derived promoter, a retroviral promoter, and a heat shock promoter. Preferably, it is SV-40, a retrovirus. However, it is not particularly limited to these. Use of an enhancer is also an effective method for expression.
[0045]
A suitable initiation codon is, for example, a methionine codon (ATG).
Examples of the stop codon include common stop codons (eg, TAG, TGA, etc.).
As the terminator region, a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
A replicable unit refers to DNA capable of replicating its entire DNA sequence in a host cell, including natural plasmids, artificially modified plasmids (DNA fragments prepared from natural plasmids) and Includes synthetic plasmids and the like. Suitable plasmids include plasmid pBR322 in E. coli or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), yeast in the case of yeast 2μ plasmid, or yeast chromosomal DNA; In mammalian cells, plasmid pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224, plasmid pSV2neo ATCC
37149 and the like.
[0046]
As the enhancer sequence, polyadenylation site and splicing junction site, those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, for example, can be used.
[0047]
As the selection marker, a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples thereof include antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin.
Examples of the gene amplification gene include a dihydrofolate reductase (DHFR) gene, a thymidine kinase gene, a neomycin resistance gene, a glutamate synthase gene, an adenosine deaminase gene, an ornithine decarboxylase gene, a hygromycin-B-phosphotransferase gene, and an aspartate transcarbamylase gene. And the like.
[0048]
The expression vector of the present invention is prepared by ligating at least the above-described promoter, initiation codon, DNA encoding the p57 protein of the present invention, a termination codon, and a terminator region to an appropriate replicable unit in a continuous and circular manner. Can be. At this time, if desired, an appropriate DNA fragment (for example, a linker or another restriction site) can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
[0049]
The transformed cell of the present invention can be prepared by introducing the above-described expression vector into a host cell.
The host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-mentioned expression vector and can be transformed, and natural cells or artificially established cells usually used in the technical field of the present invention are used. Various cells such as recombinant cells [eg, bacteria (Escherichia, Bacillus), yeast (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells or insect cells, etc.] are exemplified.
Escherichia coli or animal cells are preferred, and specifically, Escherichia coli (DH5, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3 T3, etc.), rat-derived cells, hamster-derived cells Examples include cells (such as BHK and CHO), monkey-derived cells (such as COS1, COS3, COS7, CV1 and Velo) and human-derived cells (such as cells derived from Hela and diploid fibroblasts, myeloma cells and Namalwa), and the like. Is done.
[0050]
Introduction (transformation (transfection)) of an expression vector into a host cell can be performed by a conventionally known method.
For example, in the case of bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), for example, the method of Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)], the protoplast method [Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)) or the competent method (J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)), in the case of Saccharomyces cerevisiae, for example, the method of Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1927 (1978)) or the lithium method (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)), in the case of animal cells, for example, in the case of Graham's method (Virology, 52, 456 (1973)), in the case of insect cells Can be respectively transformed by the method of Summers et al. [Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165 (1983)].
[0051]
The p57 protein of the present invention can be produced by culturing a transformed cell containing the expression vector prepared as described above (hereinafter, used to encompass the transfectant) in a nutrient medium.
The nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant). Examples of the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose. Examples of the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, and the like. Examples include soybean meal and potato extract. If desired, it may contain other nutrients (eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.)). .
[0052]
The culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions such as temperature, medium pH and culture time are appropriately selected so that p57 protein is produced in large quantities.
Specific examples of the culture medium and culture conditions used according to the host cell are shown below, but the invention is not limited thereto.
[0053]
When the host is a bacterium, actinomycete, yeast, or filamentous fungus, for example, a liquid medium containing the above-mentioned nutrients is suitable. Preferably, the medium has a pH of 5 to 8.
When the host is E. coli, preferred mediums include LB medium and M9 medium [Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. In such a case, the cultivation can be carried out usually at 14 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and stirring as necessary.
[0054]
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours, if necessary, with aeration and stirring.
When the host is yeast, examples of the medium include Burkholder minimal medium [Bostian. KL et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], and the pH is 5 to 8. Is desirable. The cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
[0055]
When the host is an animal cell, for example, MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [ J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], 199 medium [proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] and the like can be used. The pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
[0056]
When the host is an insect cell, for example, a Grace's medium containing fetal bovine serum [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)] and the like can be mentioned, and its pH is preferably about 5 to 8. . The cultivation is usually performed at about 20 to 40 ° C. for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
[0057]
The p57 protein of the present invention can be obtained as follows from the culture obtained by the above culture.
That is, when the p57 protein of the present invention is present in the culture solution of the culture, the obtained culture is filtered or centrifuged to obtain a culture filtrate (supernatant). Alternatively, the p57 protein is purified and isolated according to a commonly used method for purifying and isolating a synthetic protein.
Examples of the isolation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, methods using molecular weight differences such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Methods using charge such as ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, methods using difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, isoelectric A method utilizing the difference between isoelectric points, such as point electrophoresis, may be used.
[0058]
On the other hand, when the p57 protein of the present invention is present in the periplasm or cytoplasm of the cultured transformant, the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells, and an appropriate buffer After disrupting the cell wall and / or cell membrane of cells or the like by, for example, ultrasound, lysozyme, freeze-thawing, or the like, a membrane fraction containing p57 protein is obtained by a method such as centrifugation or filtration. The membrane fraction is solubilized using a surfactant such as Triton-X100 to obtain a crude solution. Then, the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
[0059]
The present invention also relates to an antibody having an affinity for the above-described p57 protein or a peptide having a part of the amino acid sequence thereof. The antibodies of the present invention include both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies having the above properties. The monoclonal antibodies include monoclonal antibodies belonging to any of the immunoglobulin classes of IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, and preferably include IgG or IgM immunoglobulin class monoclonal antibodies.
[0060]
The antibody of the present invention can be obtained according to a conventional method (Seizoku
[0061]
For example, the monoclonal antibody of the present invention can be produced from a hybridoma (fused cell) produced by so-called cell fusion. That is, a fusion hybridoma is formed from an antibody-producing cell and a myeloma cell line, the hybridoma is cloned, and a (poly) peptide having a part or all of the amino acid sequence of the p57 protein of the present invention is used as an antigen and specific to it It is produced by selecting a clone that produces an antibody exhibiting a high affinity. Conventionally known means can be used for the operation, except that a (poly) peptide having a part or all of the amino acid sequence of the p57 protein of the present invention is used as an immunizing antigen.
[0062]
The immunizing antigen is prepared, for example, by mixing a (poly) peptide having a part or all of the amino acid sequence of p57 protein with complete Freund's adjuvant. Examples of the animal used as a subject for immunization include mammals such as mice, rats, guinea pigs, hamsters and rabbits, preferably mice or rats, and more preferably mice. Immunization is performed by subcutaneous, intramuscular, intravenous, hood pad or intraperitoneal injection of these mammals one or several times.
Normally, immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 2 weeks after the initial immunization, and further, final immunization is performed about 1 to 4 weeks later, and from animals immunized about 3 to 5 days after the final immunization, The antibody producing cells are collected.
[0063]
Preparation of a hybridoma that secretes a monoclonal antibody can be performed according to the method of Koehler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, pp. 495-497, 1975) and a modification method analogous thereto. That is, the monoclonal antibody of the present invention is obtained from an animal immunized as described above, such as spleen, lymph node, bone marrow or tonsils, preferably antibody-producing cells contained in the spleen, preferably a mouse or rat of the same species It is prepared by culturing a fusion cell (hybridoma) obtained by fusion with a mammal such as guinea pig, hamster, rabbit or human, more preferably mouse, rat or human myeloma cell line (myeloma). The culture can be performed in vitro or in vivo in a mammal such as a mouse, rat, guinea pig, hamster or rabbit, preferably in a mouse or rat, more preferably in ascites of a mouse. Alternatively, it can be obtained from ascites of a mammal.
[0064]
Examples of myeloma cells used for cell fusion include, for example, mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8, P3 / NSI / 1-Ag4-1, P3 / X63-Ag8.U1, SP2 / O-Ag14, FO or BW5147, Rat-derived myeloma 210RCY3-Ag1.2.3., Human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 or CEM-T15.
[0065]
Screening of a fused cell clone producing the monoclonal antibody of the present invention is performed by culturing the fused cells in, for example, a microtiter plate, and measuring the reactivity of the culture supernatant of the well in which proliferation has been observed with the antigen, for example, RIA or ELISA. The measurement can be performed by the enzyme antibody method.
Purification and isolation of the monoclonal antibody can be performed using the serum containing the monoclonal antibody of the present invention obtained by the method described above, ascites orThe culture supernatant isIt can be carried out by subjecting it to affinity column chromatography such as ion exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), anti-immunoglobulin column or protein A column.
[0066]
The “monoclonal antibody” of the present invention is not limited to the above-described production method, and may be obtained by any method. Further, usually, the `` monoclonal antibody '' has a sugar chain having a different structure depending on the type of mammal to be immunized, but the `` monoclonal antibody '' in the present invention is not limited by the structural difference of the sugar chain. And any mammal-derived monoclonal antibody. Furthermore, for example, by incorporating a human immunoglobulin gene, a humanized monoclonal antibody obtained by using a transgenic mouse genetically engineered to produce a humanized antibody, Other than chimeric monoclonal antibodies in which the constant region (Fc region) of an animal-derived monoclonal antibody is recombined with the Fc region of a human monoclonal antibody, and also complementarity-determining residues (CDRs) capable of directly binding complementarily to an antigen A chimeric monoclonal antibody in which the entire region is recombined with the corresponding region of a human monoclonal antibody is also encompassed in the "monoclonal antibody" of the present invention.
[0067]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel protein p57 derived from mammals. That is, the present invention provides, for the first time, a protein having a characteristic structure in which a single polypeptide chain has a WD40 repeating structure region and a repeating structure region of leucine residues every seven amino acids simultaneously, The sequence and the nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid sequence are clarified. Another object of the present invention is to provide an antibody having an affinity for the novel protein.
Further, the p57 protein of the present invention has, in addition to the above-mentioned characteristic structure, a binding property to actin, and also a potential phosphorylation site, and Based on its biological characteristics, it is considered to be a novel protein that plays an important role in the expression of biological functions such as intracellular signal (signal) transmission, control of cell motility, cell division and replication, and cell growth. .
[0068]
Therefore, the provision of the primary structure of the novel protein and the nucleotide sequence of the gene according to the present invention not only elucidate the physicochemical properties of the protein at the molecular level or the gene level, but also the biological functions of the protein in the cell. Elucidation of functions, search for novel proteins such as signal transduction factors and transcription factors that bind or interact with the protein, and investigation of causes of various diseases caused by dysfunction or production imbalance at the molecular or gene level of the protein, etc. It is useful as a reagent for developing therapeutic agents for various diseases based on the findings.
[0069]
In the development of such therapeutic agents, the protein of the present invention has a possibility of being a protein that plays a role in cell division, for example, so that the protein of the present invention is targeted to polymerize or depolymerize tubulin essential during division. It is useful in that it is possible to develop powerful anticancer agents such as colchicine and taxol which are known as agents inhibiting polymerization. In addition, the protein of the present invention has a possibility of being a protein that plays a role in inducing chemotaxis of cells through intracellular signal transmission as seen in leukocytes, which are immunocompetent cells. The present invention is useful in that it is possible to develop an anti-inflammatory agent or an immunosuppressant by controlling chemotaxis of the cell by targeting a protein. Furthermore, since the protein of the present invention may have a role of interacting with a DNA-binding protein such as a transcription factor, the protein of the present invention may be targeted to the HIV promoter DNA-binding protein. This is useful in that it is possible to develop an antiviral agent such as an anti-HIV inhibitor targeting NFκB known as NFκB.
[0070]
In addition, while it is possible to develop an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, an immunosuppressant or an antiviral agent targeting such a protein of the present invention, from the above-mentioned properties of the present invention, the protein of the present invention or The DNA encoding it, its fragments, their derivatives, or the antisense DNA itself can also be obtained by introducing the DNA into living cells surgically, electrically or scientifically in a disease site-specific manner, for example, as an anticancer agent or an anti-inflammatory drug. It is useful in that it can be an agent, immunosuppressant or antiviral agent.
In particular, since the p57 protein of the present invention has a binding property to actin, gelsolin, merlin, tensin, tropomyosin, α-actinin, which are known as actin-binding proteins having activity in tumor trait suppression, Like lipocortin I or vinculin, it has the potential to be an antitumor agent by itself.
[0071]
Furthermore, by using the protein of the present invention, it is possible to produce antibodies having affinity for the protein, and it is needless to say that those antibodies can be used as reagents for purifying the protein. The protein is useful in that it can be used as a reagent for measuring the expression distribution and expression level in various tissue cells in the body, and by measuring the expression distribution or expression level, the protein of the present invention can be used as a molecule. It is possible to elucidate the site or state of various diseases caused by dysfunction or production imbalance at the level or gene level.
[0072]
The plasmids, enzymes such as restriction enzymes, T4 DNA ligase and other substances used in the examples of the present invention are commercially available and can be used in accordance with ordinary methods. Those skilled in the art also know the procedures used for cloning cDNA, determining the nucleotide sequence, transforming host cells, culturing transformed cells, collecting and purifying p57 protein from the resulting culture, and obtaining antibodies. Or can be found in the literature.
In addition, pBIIλ6-4 obtained in the example of the present invention was submitted to “PBJT-BA-6” (accession number FERM BP- 4825).
[0073]
[Examples / Reference Examples]
Hereinafter, Examples and Reference Examples will be shown to specifically explain the present invention, but the present invention is not limited by these Examples and the like.
[0074]
Example 1 Isolation and purification of bovine p57 protein
(1) Preparation of cytoplasmic fraction
All the following steps were performed at 0 to 4 ° C. Fresh calf thymus tissue (approximately 60 g) is minced, and 5 volumes of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.02% NaNThreeThe solution was added and homogenized with a Waring blender. The homogenate was filtered through gauze, centrifuged at 300 × g for 20 minutes, the supernatant was centrifuged at 6000 × g for 10 minutes, and the supernatant was further centrifuged at 10,500 × g for 1 hour. The supernatant was used as a cytoplasmic fraction.
[0075]
(2) Purification
The following operations were all performed at 0 to 4 ° C. The p57 protein was detected by measuring phospholipase C activity (PLC activity) and GTPγS binding activity (Reference Examples 1 and 2). In addition, protein quantification was performed by measuring absorbance at 280 nm.
[0076]
(1) DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography
The cytoplasmic fraction obtained in (1) was directly transferred to buffer A [10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.02% NaNThree], And washed with the same buffer, followed by elution by a NaCl concentration gradient method (0M-1M, 12 hours, 2000 ml). Was. As the active fraction, the PLC active fractions were combined and the fraction eluted with about 0.35 to 0.5 M NaCl was collected (FIG. 1).
[0077]
(2) Heparin-Sepharose CL-6B column chromatography
The active fraction obtained in <1> was placed in a dialysis tube, concentrated using polyethylene glycol 20000, dialyzed against buffer A, and equilibrated with the same buffer to a heparin-Sepharose CL-6B column (2.3). × 15 cm: manufactured by Pharmacia), washed with the same buffer, and eluted by a NaCl concentration gradient method (0 M-1 M, 10 hours, 500 ml). As the active fraction, the PLC active fractions were combined and the fraction eluted with about 0.58 to 0.9M NaCl was collected (FIG. 2).
[0078]
(3) Sepharose CL-6B column chromatography
The active fraction obtained in (2) was placed in a dialysis tube, concentrated using polyethylene glycol 20,000, and then applied to a Sepharose CL-6B column (3 × 112 cm: Pharmacia) equilibrated with buffer A to perform gel filtration. An active fraction having a lower molecular weight was collected from fractions in which activity was observed (FIG. 3).
[0079]
(4) MonoS column chromatography (FPLC)
The active fraction obtained in (3) was put into a dialysis tube, concentrated using polyethylene glycol 20000, and then concentrated against buffer B [10 mM MES-NaOH (pH 6.5), 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF]. It was dialyzed and subjected to FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography System, flow rate: 1 ml / min) equipped with a MonoS HR5 / 5 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with the same buffer, and the column was washed with the same buffer. Elution was performed by a concentration gradient method (0M-0.4M, 40 minutes, 40 ml). As the active fraction, a fraction having a higher specific activity and eluted with about 0.2 M NaCl without GTPγS binding activity was collected (FIG. 4).
[0080]
5) Superose 12 column chromatography (FPLC)
The active fraction obtained in step (4) was concentrated with Centricon 10 (manufactured by Amicon), and then FPLC equipped with a Superose 12 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with buffer B containing 0.15 M NaCl (flow rate: 0.5 ml / min). As shown in FIG. 5, the active fraction was detected as two peaks.
Therefore, fractions of each peak were collected, each was treated with 2-mercaptoethanol, and then 10% 1 mm thick gel was used to dodecyl according to the method of Laemmli [Nature, 227, p680- (1970)]. It was subjected to sodium sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The separated band was subjected to silver staining (2D-silver staining reagent II "first": first chemistry). As a result, the latter peak (fraction numbers 23 to 27) was detected as a single band near 57 kDa (see FIG. 6). Since the PLC activity peak in the chromatogram and the absorbance peak at 280 nm coincided with each other, this band was determined to be the p57 protein of the present invention. This protein is hereinafter referred to as bovine p57 protein.
[0081]
What can be said throughout the purification process is that activity is observed in many peaks. This is because, on the one hand, p57 proteins are apt to form aggregates with each other or with other proteins, and on the other hand, they are susceptible to degradation by proteases, and their degradation products are sometimes active. It is explained by things.
[0082]
(3) Determination of partial amino acid sequence
The fraction purified by
Each fraction of the fragment detected as a peak was dried with a centrifugal evaporator, dissolved in 30 μl of a 0.1% SDS solution, subjected to a gas phase protein sequencer (Shimadzu Corporation, PSQ-1), and subjected to amino acid analysis. The partial amino acid sequence of the fragment was determined. Table 1 shows the results.
[0083]
[Table 1]
Further, as a result of further analysis, the bovine p57 protein obtained in Example 1 had a WD40 repeating structure having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 9 to 13, respectively. It became clear that they had. At the same time, it was revealed that the C-terminal region has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, that is, a repeating structure of leucine residues every seven amino acids (SEQ ID NO: 16). ).
[0085]
These “WD40 repeating structure” and “repeating structure of leucine residue for every seven amino acids” respectively represent information (signal) transmission in cells, control of cell motility, gene transcription or cell division and replication, etc. It is a structure that is commonly found in various eukaryotic proteins that are thought to play an important role in biological functions.
Therefore, the bovine p57 protein of the present invention having these two structures at the same time is also considered to play a useful action and function with respect to the above-mentioned biological functions.
[0086]
Reference Example 1 PLC activity measurement
10 nCi [ThreeH] PI (16.3 Ci / mmol, Amersham) and 2.5 μg PI (Sigma) as substrates,TwoAnd 150 μl of 0.1 M Tris-maleate-NaOH buffer (pH 6.0), 5
[0087]
Reference Example 2 Measurement of GTPγS binding activity
Northup et al., J. Biol. Chem., 257, p11416 (1982).
Almost followed. That is, a sample solution (20 μl), 0.1 mM EDTA (1 μl), 1 M DTT (0.1 μl), 4 M NaCl (2.5 μl), 1 M MgClTwo(2.5 μl), 1 mM GTPγS (0.1 μl), 5 mCi / ml [35S] GTPγS (1000 Ci / mmol) (0.8 μl) and water (46 μl) were mixed and incubated at 30 ° C. for 1 hour. The whole amount was transferred onto a 2.5 cm nitrocellulose filter (pore size 0.45 μm), and the washing solution was washed. [20 mM Tris-HCl (pH 8), 25 mM MgClTwo, 100 mM NaCl solution], the filter was washed three times with 2 ml, the filter was placed in a vial, dried at 80 ° C., and a toluene scintillator was placed therein.35The radioactivity of S is measured.
[0088]
Example 2 Cloning and sequencing of bovine p57 cDNA
(1) Preparation of cDNA library
(1) Extraction of mRNA from tissue
About 20 g of bovine spleen tissue was prepared by adding 2-mercaptoethanol to 0.1 M to a guanidine solution (6 M guanidium thiocyanate, 5 M sodium citrate, 0.5% SDSa solution adjusted to pH 7.0 with NaOH). Preparation) Add 200 ml, homogenize using a polytron, cut the DNA by passing it through an 18G injection needle, and layer on a CsCl solution (5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA, pH 7.5). The mixture was centrifuged in a Beckman centrifuge (rotor 8W41, 23,000 rpm, 20 ° C.) overnight to collect RNA as a precipitate. From this total RNA, mRNA was purified using mRNA Purification Kit (Pharmacia).
[0089]
(2) Preparation of cDNA library from mRNA
From 5 μg of the mRNA prepared in (1), cDNA was synthesized using a cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) with oligo dT as a primer. Then, in order to increase the efficiency of subsequent screening, after adding an EcoRI adapter, agarose gel [1% agarose (SEA KEM GTG (FMC))] was electrophoresed, and cDNA of 1 kbp or more was purified using GENECLEAN II Kit (BIO 101). And ligated into the λgt10 vector. GIGAPACK II GOLD PACKAGING EXTRACT (Stratagene) was used for packaging.
[0090]
(2) Preparation of DNA probe
Using a 33-mer DNA represented by SEQ ID NO: 17 as a template and an 8-mer DNA (5 'CTGGGAGA 3') complementary to the 3 'end of this sequence as a primer, α-32P-dCTP was incorporated and used as a probe.
[0091]
(1) DNA synthesis
As a template for preparing a DNA probe, a 33-mer DNA represented by SEQ ID NO: 17 in the Sequence Listing was synthesized by a solid phase method.
As a primer, an 8-mer DNA (5'CTGGGAGA 3 ') complementary to the 3'-terminal region of the base sequence of the template DNA was synthesized.
1 ml of aqueous ammonia was added to the untreated DNA synthesized by the solid phase method, and vortexing at room temperature for 1 hour was repeated twice. The cutout was cut out from the silica carrier, followed by overnight treatment at 55 ° C. to remove the protecting group. Thereafter, the reaction was carried out in 80% acetic acid for 15 minutes after the ammonia water was blown off by a centrifugal evaporator. Water was added to 20% acetic acid and purified by reverse phase HPLC using a C18 column. The elution conditions are as follows: From the initial conditions of 95% of solution A (about 5.8 ml of acetic acid, about 14 ml of triethylamine / 1 L water,
[0092]
(2) Preparation of probe
A probe was prepared by reacting a reaction solution having the following composition (total amount: 27.2 μl) under the following conditions.
Reaction solution:
α-32P-dCTP (3 kCi / mmol, 10 ci / l Amersham) 22 μl
2.7 μl of 10 × PCR buffer
250 μM dATP, dGTP, dTTP
20 ng / μl 33mer synthetic DNA (template DNA) 0.5 μl
300 ng /
AmpliTaq DNA polymerase (5 units / μl) 0.5 μl
The 10 × PCR buffer, dNTP, and Ampli Taq DNA polymerase were PerkinElmer Cetus products, and the temperature of the reaction was controlled using PROGRAM TEMP CONTROL SYSTEM PC-700.
Reaction conditions: The following reaction was performed for 15 cycles.
After 30 seconds at 90 ° C, the fastest transition to 50 ° C
Transition from 50 ° C to 20 ° C in 45 minutes
After 30 seconds at 20 ° C, the fastest transition to 22 ° C
22 °
[0093]
The reaction-terminated liquid obtained by the above method was subjected to gel filtration using Sephadex G50 DNA Grade (manufactured by Pharmacia) to obtain a labeled DNA probe.
[0094]
(3) Screening of cDNA library
(1) Preparation of filter for screening
After infecting E. coli C600hfl with the bovine spleen cDNA library (37 ° C., 30 minutes), the top agar (1 g of bactotryptone, 0.5 g of bactoeast extract, 1 g of NaCl, 1 g of Bactoagar, 0.8 g of bactoaggar / 100 ml) was autoclaved. LB-agar medium (10 g of bactotryptone, 5 g of bactoeast extract, 10 g of NaCl, 15 g of bactoagar / 1 L water: sterilized in an autoclave, and then sterilized in an autoclave. (10 kpfu /
[0095]
(2) Hybridization of filters
Pre-hybridization solution [1 × Denhaldt (5 × Denhaldt: 1
[0096]
(3) Isolation of positive clones and recovery of phage DNA
As a result of autoradiography, the position of the plate, which was confirmed to be a positive signal for the two filters, was sampled for each medium, infected with Escherichia coli, and then spread on an agar medium for second screening. A clone which was positive in the second screening was isolated with a single plaque, infected again with Escherichia coli, and infected with a 15 cm agar medium plate (10 g of bactotryptone, 5 g of bactoeast extract, 10 g of NaCl, 15 g of SEA KEM ME (FMC) / 1 L water). : Sterilized in an autoclave and dispensed into a plate.) The λgt10 phage DNA was recovered by sowing plaque on one side of each sheet. For details of the method for recovering phage DNA, reference was made to the method of Maniatis et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition 2.64 (1989)].
[0097]
(4) Confirmation of cDNA insert
After the recovered phage DNA was cut out by EcoRI treatment and cDNA insertion, a part of the phage DNA was subjected to agarose gel [1% agarose (SEA KEM ME)] electrophoresis to confirm the length of the insert. After electrophoresis, the DNA was transferred to a nylon membrane [HybondN (Amersham)] according to the method of Southern et al. [J. Mol. Biol., 98, p503 (1975)]. Hybridization was performed in the same manner as in the screening.
[0098]
5) Subcloning of positive clones
The EcoRI-treated phage DNA was subjected to agarose gel [1% agarose (SEA KEM GTG)] electrophoresis, and the insert DNA was recovered using a GENECLEAN II Kit. Then, the insert DNA was incorporated into the EcoRI site of M13mp18, which had been BAP-treated with T4 ligase. Using the ligation solution, competent E. coli JM109 was transformed. That is, 0.3 ml of competent Escherichia coli was added to a total volume of 7 μl of the ligation solution, left on ice for several hours, heat-stimulated at 42 ° C. for 3 minutes, returned to ice, and returned to 40 μl of 100 mM IPTG (isopropylthiogalactopyranoside). Then, 50 μl of 2% X-GAL, 200 μl of fresh JM109 and 3 ml of LB-top agar were added, and the mixture was poured into a 9 cm LB-agar plate and incubated at 37 ° C. overnight. A single white colony that had grown was collected, placed in 1.5 ml of LB-medium, and cultured with shaking for 5 hours. M13 RF-DNA was prepared from the centrifuged precipitate by an alkaline method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition 1.25 (1989)], partially digested with EcoRI, and subjected to agarose gel [1% agarose (SEA KEM ME)] electrophoresis. The insert was confirmed with. A part was digested with HincII, and the orientation of the insert was determined by the pattern of agarose gel [2% agarose (SEA KEM ME)] electrophoresis. On the other hand, the culture supernatant from which the precipitate was completely removed by centrifugation was subjected to nucleotide sequence determination.
[0099]
(4) Production of deletion mutant
{Circle around (1)} The above-mentioned M13 RF-DNA insert and two types of Escherichia coli clones (both directions) whose orientation was confirmed were cultured overnight at 37 ° C. in 200 ml of LB-medium. Crude M13 RF-DNA was prepared by an alkali method, and purified by a CsCl-ethidium bromide gradient method.
(2) Production of deletion mutant
Using the M13 RF-DNA obtained in <1> as a material, deletion mutants of various lengths were prepared using a kilo sequence delation kit (Takara Shuzo).
[0100]
(5) Determination of base sequence
Single-stranded DNA was recovered from the culture supernatant obtained in (3) (5) and (4) (2) by the following method.
200 μl of 20% PEG6000, 2.5 M NaCl was added to 1 ml of the culture supernatant, vortexed, allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then centrifuged with a 1.5 ml tube centrifuge (12,000 rpm, 5 minutes). Completely removed. The precipitate was dissolved in 100 μl TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA: pH 7.4), 50 μl TE-saturated phenol was added, vortexed vigorously, allowed to stand at room temperature for 5 minutes, vortexed again, and centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes. . 90 μl of the aqueous layer was separated, precipitated with ethanol, rinsed and dried, and then dissolved in 20 μl of water. The 1/10 amount was subjected to agarose gel [1% agarose (SEA KEM ME)] electrophoresis to determine the recovery of single-stranded DNA.
The nucleotide sequence of the thus obtained single-stranded DNA in both directions of delation and non-delation is determined by the didoxy method using a fluorescent primer cycle sequencing kit (manufactured by Applied Biosystems) and an ABI 373A DNA sequencer. (SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing).
[0101]
In addition, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence matches the amino acid sequence of bovine p57 protein obtained in Example 1, and the C-terminal region has a repeat of leucine residue for every seven amino acids represented by SEQ ID NO: 15. It had a structural region, and a WD40 repeat structural region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 in its N-side region.
[0102]
Example 3 Cloning of human p57 cDNA
(1) Creating a probe
(1) Extraction of total RNA from HL60 cells
After culturing HL60 cells (ATCC CCL-240) (about 1 × 106(Cells / mL), and centrifuged at 2,000 g for 5 minutes at 4 ° C., and the precipitated cells were suspended using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) and extracted by shaking with chloroform to recover the supernatant. Isopropanol is added to the obtained aqueous layer (supernatant), left at -20 ° C for 1 hour, and centrifuged at 12,000 g for 20 minutes at 4 ° C to precipitate RNA. After washing the precipitated RNA with ethanol, it was dissolved in a TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). As a result, about 900 μg of total RNA was obtained.
[0103]
(2) PCR
(i) Preparation of PCR template
Using the 1st strand cDNA synthesis kit (GIBCO BRL) as a template with the total RNA extracted in <1> as a template, ie, an oligo dT primer and a ramdom hexamer primer are annealed to the template RNA, and the first strand cDNA is transcribed with a reverse transcriptase. Was synthesized.
(ii) Preparation of primer
Based on the base sequence of the bovine p57 gene cloned and sequenced in Example 2, primers having sequences corresponding to the 5'-terminal region and the 3'-terminal region of the coding region were designed, and a DNA synthesizer (Milligen, Millipore) was used. (Made by the company). The sequence of the synthesized primer 5a in the 5 'terminal region is shown in SEQ ID NO: 18 in the Sequence Listing, and the sequence of the primer b in the 3' terminal region is shown in SEQ ID NO: 19 in the Sequence Listing.
(iii) Performing PCR
Using the first strand cDNA obtained in (i) as a template and both primers synthesized in (ii), PCR was performed according to the following procedure (Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 1479-1484). . That is, Gene AmpTM Using a DNA amplification reagent kit (manufactured by Perkin-Elmer Cetus), 400 nM of both primers were added to the template cDNA. The reaction was carried out using a DNA thermal cycler (manufactured by Perkin-Elmer Cetus) at 94 ° C. for 1 minute, 56 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. for 3
[0104]
(3) Subcloning and sequencing of the amplified PCR product
The recovered DNA fragment was ligated to a vector pCRII (Invitrogen) using a TA cloning kit (Invitrogen). After culturing the obtained subclone on a mini scale, the plasmid was recovered, digested with EcoRI, the size of the DNA was examined by agarose electrophoresis, and the DNA having the same size as the DNA fragment obtained by PCR was used for BecaBest. Sequence analysis was performed using a sequencing kit (Takara Shuzo). Comparison of the obtained DNA sequence with the DNA sequence of bovine p57 obtained in Example 2 confirmed that the DNA fragment encoded a human homolog of bovine p57 (human p57).
The deletion nutant used in the sequence analysis was prepared by a conventional method using a kilosequence deletion kit (Takara Shuzo).
[0105]
(4) Preparation of probe
The DNA fragment (about 1.4 kb) obtained above was digested with BstXI to cut out about 300 bp of DNA containing the 5 'region of the coding region of human p57, and separated by agarose gel electrophoresis. The separated DNA fragment was purified using QIAEX (manufactured by Qiagen), and the DNA fragment was purified using a Ready-To-Go DNA labeling kit (manufactured by Pharmacia).32Labeled with P. This labeled DNA fragment was used as a probe for plaque hybridization.
[0106]
(2) Preparation of human p57 cDNA library
(i) Preparation of template mRNA for preparing cDNA library
HL60 cell mRNA was used as a cDNA template.
Poly (A) was prepared from total RNA of HL60 cells prepared in Example 3 (1) (1) using Oligotex-dT30 (Super) (Takara Shuzo).+RNA (poly A-added mRNA) was separated and purified by batch precipitation with ethanol using Oligo (dT) -latex beads [Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring]. Harbor Laboratory, 7.3 (1989)].
(ii) cDNA synthesis
Poly (A) obtained+Using RNA as a template, cDNA was synthesized using Time Saver cDNA synthesis kit (Pharmacia). That is, poly (A)+After denaturing the RNA, a first-strand cDNA was synthesized using a random hexamer primer, four types of dNTPs and reverse transcriptase. The obtained RNA-cDNA duplex was treated with RNase H to cleave the RNA strand, and a second strand was synthesized with DNA polymerase to prepare a double-stranded cDNA [Gubler & Hoffman, Gubler, H. and Hoffman, BJ, Gene, 25, 263 (1983)]. Then, the cDNA was blunt-ended in a reaction system included in a Time Saverc DNA synthesis kit (manufactured by Pharmacia), and the EcoRI adapter was connected to the cDNA, followed by size fractionation using a span column.
(iii) Integration into vector and packaging
The cDNA having an EcoRI end obtained above was incorporated into EcoRI-treated λgt10 (Amersham) [Huynh, T.V., DNA Cloning, a practical approach, 1, 49 (1985)]. This was packaged in vitro using GIGA PACKII GOLD (manufactured by Stratagene), and E. coli was obtained using the obtained phage particles. Using E. coli NM514 as a host, a cDNA library consisting of plaques containing the recombinant phage was prepared.
[0107]
(3) Screening of human p57 by plaque hybridization
Hybridization and prehybridization were performed according to the instructions attached to Amersham cDNA cloning system λgt10. Briefly, the cDNA library derived from HL60 cells prepared above was added to an agar plate at 9.0 × 10 4FourApproximately, a replica was prepared using a nylon membrane (manufactured by Amersham) and prepared in Example 3 (1) (4).32Screening was performed by plaque hybridization using a P-labeled probe according to a conventional method.
Since a total of five positive clones were obtained from the first screening to the second screening, each was cloned into a single. This was cultured in liquid to prepare phage DNA, digested with EcoRI as a cloning site, and subjected to agarose gel electrophoresis to separate. Southern hybridization was performed on the separated DNA sample using the probe prepared in Example 3 (1) (4). In parallel, using the primer a having the 5 'terminal region sequence and the primer b having the 3' terminal region sequence prepared in Example 3 (1) {2}, the entire coding region was I checked whether it was included. As a result, it was confirmed that one of the clones contained cDNA of human p57. The EcoRI digested cDNA fragment derived from this clone was subcloned into pBluescriptII SK (-), and the resulting pBIIλ6-4 was subjected to Pharmacia A . L. F. The nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer. As a result, it was confirmed that the obtained cDNA contained a region encoding the full length of human p57.
In addition, the nucleotide sequence of the human p57 gene obtained in SEQ ID NO: 8 shown below and the amino acid sequence deduced from the sequence are shown.
[0108]
As can be seen, the obtained human p57 protein had the same amino acid sequence as the bovine p57 protein obtained in Examples 1 and 2 in the amino acid sequence containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 5 in the Sequence Listing, respectively. 6. It had a WD40 repeating structural region having the amino acid sequence described in No. 6. At the same time, it had an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the C-terminal region, that is, a repeating structural region of leucine residues for every seven amino acids.
Therefore, the human p57 protein of the present invention, like bovine p57 protein, has useful actions and functions regarding biological functions such as intracellular signal transmission, control of cell motility, gene transcription or cell division and replication, etc. It is thought to be responsible.
[0109]
Example 4 Construction of plasmid pGEX / hp57
(1) How to create an adapter
An adapter a containing a BamHI site for ligation to a vector (pGEX-5X-1, manufactured by Pharmacia) and a PmaCI site for ligation to the 5 ′ end region of the coding region of the human p57 gene, and a vector (pGEX-5X-1) ) And an adapter b containing a SacI site for ligation to the 3 ′ end region of the coding region of the human p57 gene for ligation (see FIG. 7).
Specifically, first, four oligonucleotides described in SEQ ID NOs: 20 to 23 in the Sequence Listing were synthesized using a DNA synthesizer (Milligen: manufactured by Millipore). 2.5 μg of each of these oligonucleotides was dissolved in 100 μl of TE buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA), 10 μl of 3 M NaOAc and 250 μl of ethanol were added, and the mixture was cooled at −80 ° C. The nucleotides were precipitated. The precipitated oligonucleotide was washed with 75% ethanol, dried, and 100 μl of annealing buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 5
[0110]
(2) Plasmid construction method
Using the plasmid pBIIλ6-4 obtained in Example 3 (3), E. coli coli
DH5 was transformed. Then, after culturing the transformant, pBIIλ6-4 isolated from the transformant was digested with PmaCI and SacI to cut out a part of the human p57 gene of about 1.3 kb and purified by electrophoresis. 25 ng of the excised DNA fragment and 25 ng of each of the adapters a and b prepared in (1) were reacted at 16 ° C. for 1 hour using a ligation kit (manufactured by Takara Shuzo) to ligate the adapters a, b and the DNA fragment. . To this reaction solution, 25 ng of vector pGEX-5X-1 (Pharmacia) linearized with BamHI and SalI was added, and reacted at 16 ° C. overnight. Using this reaction product, E. coli. E. coli DH5 was transformed. Ten transformed ampicillin-resistant colonies were analyzed. Plasmid DNA was treated with BamHI and SalI and the plasmid with the correct restriction fragments was designated pGEX / hp57 (FIG. 8).
[0111]
Example 5 Expression of fusion protein and acquisition of human p57 protein
pGEX / hp57 expresses human p57 protein in a manner fused with glutathione S-transferase (GST) in Escherichia coli under the induction of isopropylthiogalactopyranoside (IPTG). The ampicillin-resistant colony obtained above was identified as a single colony, and the single colony 1ase was suspended in 5 ml of L broth containing 50 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. for 8 hours. After the culture, 1 ml of the culture was taken, added to 20 ml of L broth containing 50 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight. Then, 20 ml of the culture solution cultured overnight was added to 180 ml of L broth containing 50 μg / ml ampicillin, cultured at 37 ° C. for 2 hours, then 1 ml of 0.1 M IPTG was added, and further cultured at 37 ° C. for 2 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation. The collected cells were suspended in 10 ml of PBS containing 1% Triton X-100, and the cells were disrupted by ultrasonic waves. After the suspension was centrifuged, the supernatant was recovered, and glutathione-agarose beads (manufactured by Pharmacia) were suspended in the supernatant at a ratio of 50% v / v in PBS containing 1% Triton X-100. 1 ml was added. After stirring at 4 ° C. for 1 hour and centrifugation, the precipitated beads were washed four times with PBS containing 1% Triton X-100. The GST-fused human p57 protein expressed is bound to the beads. By treating the beads with a 50 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 5 mM glutathione, the expressed GST-fused human p57 protein was eluted.
[0112]
When the protein was subjected to SDS-PAGE, a single band was confirmed at around 83 to 84 kDa corresponding to the sum of the molecular weights of GST (molecular weight 26 to 27 kDa) and p57 protein (
The amino acid sequence of the obtained GST-fused human p57 protein is shown in SEQ ID NO: 24 in the Sequence Listing. The amino acid sequence of the human p57 protein in the GST fusion protein was identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing.
[0113]
Example 6 Preparation of polyclonal antibody
(1) Preparation of immunopeptide antigen
In the nucleotide sequence of the human p57 gene determined in Example 3 (3) (SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing), 12 amino acid residues corresponding to nucleotide numbers 1444 to 1479 (Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu- Glu-Glu-Thr-Val-Gln-Ala) was synthesized by a Fmoc solid phase synthesis method using a peptide synthesizer (Model 9050, manufactured by Nippon Millipore). After the synthesized resin was washed with 3.6 ml of methylene chloride and dried, 0.6 ml of m-cresol, 3.6 ml of thioanisole and 25.8 ml of trifluoroacetic acid were added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, the dissolved peptide was recovered by adding ether to precipitate. The obtained peptide was purified by reversed-phase high performance liquid chromatography (column:
When the purity of the purified peptide was determined by the same reversed-phase high performance liquid chromatography, the purity was 89%. In addition, it was confirmed that the obtained peptide had the above 12 amino acid residues using a protein sequencer (Model 473A, manufactured by Applied Biosystems Japan).
5 mg of the above synthetic peptide was dissolved in 1 ml of 0.2 M ammonium acetate (pH 7.0), and 1 ml of a bovine serum albumin (BSA) solution (10 mg / ml) was added. While stirring this mixed solution, 1.3 ml of 0.02 M glutaraldehyde was added dropwise little by little, and further stirring was continued at room temperature for 5 hours while shielding light. The reaction was dialyzed against PBS.
[0114]
Thereafter, the peptide / BSA complex and FCA (complete Freund's adjuvant) were mixed using a glass syringe with a stopper for connection. This operation was carried out until the emulsion did not scatter even if one drop was dropped on water. In a similar manner, a mixture of the peptide / BSA complex and FIA (Incomplete Freund's adjuvant) was prepared.
[0115]
(2) Preparation of polyclonal antibody
Rabbits (Japan Escorgi Co., Ltd., New Zealand White, 11-13 weeks old, female, 3 birds) were subcutaneously injected once with the peptide / BSA complex-FCA mixture at a rate of 0.4 mg / kg. Thereafter, the peptide / BSA complex-FIA mixture was similarly injected subcutaneously at 4-week intervals to perform booster immunization. After the second booster immunization, the antibody titer of the serum collected for the first week (3.5 ml) was measured by the dot plot method described in Reference Example 3. The obtained antiserum reacted specifically with the peptide, and also reacted with a 64-fold dilution of 1.5 μg of the peptide.
The polyclonal antibody of the present invention was obtained by purifying anti-hp57 / IgG from the rabbit anti-hp57 serum by using Protein A Sepharose 4B (manufactured by Bio-Rad).
[0116]
(3) Confirmation of reactivity to p57 protein
Human-derived HL60 cells and mouse-derived LAW 264.7, and monkey kidney-derived COS cells as a negative control were each dissolved in a solubilization buffer [1%
NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 0.02% NaNThree, 100 μg / ml PMSF, 1 μg / ml aprotinin], and centrifuged (14,000 rpm, 20 minutes) to obtain each centrifuged supernatant as a cytoplasmic fraction.
Each obtained cytoplasmic fraction was 1.0 × 107Cells / ml and add this to 1.0 x 10Five10 μl each of the cells was collected to give cells / lane, SDS sample buffer (10 μl, manufactured by Daiichi Kagaku) was added, and the mixture was boiled at 100 ° C. for 5 minutes and then subjected to SDS-PAGE. Then, it was electrically blotted on a PVDF membrane (manufactured by Millipore), and a Western blotting assay was performed by a conventional method using the polyclonal antibody obtained in the above (2).
[0117]
In order to confirm the specificity of the polyclonal antibody for the antigen, an antibody absorption experiment was performed using the peptide used as the antigen.
The results are shown in FIG. As can be seen, the anti-human p57 polyclonal antibody of the present invention showed reactivity with human p57 protein and mouse p57 protein. In addition, it was confirmed that the reaction between the polyclonal antibody and the p57 protein was inhibited by the addition of the immunizing peptide, and it was found that the polyclonal antibody of the present invention also showed reactivity with the immunizing peptide. Furthermore, since the polyclonal antibody of the present invention did not show reactivity with the cytoplasmic fraction of COS cells derived from monkey kidney, the p57 protein of the present invention was not expressed (absent) in non-immune cells. Was suggested.
[0118]
Reference Example 3 Dot plot method
(1) Peptide / BSA complex, (2) As a control, a peptide / KLH complex similarly prepared using KLH (Keyhole Limpets Hemocyanin) as a carrier, and (3) BSA solution (10 mg / ml) in PBS stepwise. 2 μl was diluted onto a nitrocellulose membrane and dried.
This was reacted with a PBS solution containing 5% skim milk and 10% FCS (Fetal Calf Serum) for 1 hour to remove non-specific adsorption. Then, the obtained serum and non-immune rabbit serum were used as controls, respectively. A 20-fold dilution was reacted for 1 hour. Then, it is allowed to react with an HRP-labeled goat anti-rabbit antibody (manufactured by Bio-Rad) for 1 hour, and the color is developed with 4-chloro-1-naphthol to confirm that the antibody titer has increased.
[0119]
Experimental example 1
Comparison of the amino acid sequences of the human p57 protein and bovine p57 protein of the present invention revealed that they had about 95% homology (FIG. 11). Furthermore, when the amino acid sequences of human p57 protein and bovine p57 protein were compared with the amino acid sequence of slime mold coronin, it was found that both had about 40% homology. FIG. 12 shows a diagram comparing the amino sequences of human p57 protein and slime mold coronin, and FIG. 13 shows a diagram comparing the amino sequences of bovine p57 protein and slime mold coronin.
[0120]
The coronin is a protein derived from a slime mold belonging to a group of the WD40 family having a WD40 repeating structure and which moves a cytoskeleton system such as control of cell division. In addition, the protein has a binding property to actin and is considered to be involved in transmission of a chemotactic signal from a cAMP receptor to a cortical cytoskeleton via G protein [EMBO J, 10 (13), 4097]. -4104, 1991]. From this, it is considered that the p57 protein of the present invention is also a new protein belonging to the WD40 family and is involved in the control of cytoskeletal system such as cell division and / or the transmission of information such as chemotaxis.
[0121]
Searching for such a structure-activity relationship is important for the elucidation of the physiological significance of new proteins and, ultimately, for the research and development of new drugs, etc., but this search reveals the primary structure of the protein. Can be achieved for the first time. Therefore, the present invention, which discloses the primary structure of p57 protein for the first time, has extremely important significance not only in the field of research but also in industry.
[0122]
Experimental example 2 Analysis of potential phosphorylation site
(1) Computer analysis
Based on the amino acid sequence of human p57 obtained in Example 3 (SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing), computer analysis of potential phosphorylation sites was performed using protein motif search software (GENE WORKS-PROSITE-). . The results are shown in FIG. 14. As can be seen, the human p57 protein of the present invention had potential phosphorylation sites by protein kinase C and casein kinase II.
[0123]
(2) In vitro assay
(1) Preparation of test protein
For use in this assay, a partial protein having only the WD40 repeat structural region [hereinafter referred to as GST / human p57 (1─4)]. And a partial protein having only a repeating structural region of a leucine residue for every seven amino acids [hereinafter referred to as GST / human p57 (3─5). ] Were prepared in the same manner as in Examples 3 to 5.
Specifically, GST / human p57 (1-4) is obtained by digesting plasmid pBIIλ6-4 with PmaCI and BglI into plasmid pGEX-5X-1 linearized with BamHI and SalI, and Plasmid pGEX / human p57 (1-4) was constructed by inserting cDNA encoding 1-4) and prepared as a fusion protein with GST.
The adapter a created in Example 4 (1) was used to ligate the BamHI-cut end of linearized pGEX-5X-1 to the PmaCI-cut end of cDNA encoding human p57 (1-4). For ligation of the SalI-cut end of linearized pGEX-5X-1 with the BglI-cut end of cDNA encoding human p57 (1-4), two syntheses prepared using a DNA synthesizer as in Example 4 were used. Adapter c consisting of nucleotides (SEQ ID NOS: 25 and 26 in the Sequence Listing) was used (see FIG. 15 (1)).
A restriction enzyme map of the plasmid containing the DNA encoding the partial protein GST / human p57 (1-4) is shown in FIG.
[0124]
GST / human p57 (3-5) is obtained by digesting human p57 (3-5) obtained by digesting plasmid pBIIλ6-4 with BglHI and SacI into plasmid pGEX-5X-1 linearized with BamHI and SalI. Plasmid pGEX / human p57 (3-5) was constructed by inserting the encoding cDNA, and was prepared as a fusion protein with GST.
The BamHI-cut end of the linearized pGEX-5X-1 and the BglI-cut end of cDNA encoding human p57 (3-5) were ligated using two synthetic nucleotides (sequence listing) prepared using a DNA synthesizer. Using adapter d consisting of SEQ ID NOs: 27 and 28), ligation of the SalI-cut end of linearized pGEX-5X-1 with the SacI-cut end of cDNA encoding human p57 (3-5) was performed using Example 4. The adapter b prepared in (1) was used (see FIG. 15 (2)).
A restriction enzyme map of a plasmid containing the DNA encoding the partial protein GST / human p57 (3-5) is shown in FIG.
The resulting plasmid pGEX / human p57 (1-4) and plasmid pGEX / human p57 (3-5) were each used for E. coli. E. coli DH5 was transformed, each fusion protein was obtained in the same manner as in Example 5, and the results of each expression confirmed by SDS-PAGE are shown in FIG. 9 (
[0125]
(2) Assay
Using the GST / human p57 fusion protein obtained in <1>, the human p57 protein of the present invention is phosphorylated by protein kinase C (hereinafter also referred to as PKC) by the following phosphorylation reaction and immunoprecipitation method. It was confirmed.
First, Tris (25 mM, pH 7.0), MgClTwo(10 mM), [γ-32P]-ATP (1 × 10-Five M), CaClTwo(0.5 mM), phosphatidylserine (0.05 μg / μl), and kinase buffer (200 μl) containing 2-mercaptoethanol (10 mM), and then protein kinase C (0.225 μg / ml, Promega) and Sepharose beads (25 µg / ml) immunoprecipitated with the GST / human p57 fusion protein [(1-4) and (3-5), respectively] obtained in (1) above were added and reacted at 30 ° C for 20 minutes. I let it. After the reaction, the reaction product was centrifuged (15000 rpm, 4 ° C., 2 minutes), and the precipitate was collected. The collected product was washed twice with PBS / 0.1% Triton X-100 (manufactured by Nacalai Tesque), added with SDS sample buffer (40 μl, manufactured by Daiichi Kagaku), and boiled at 100 ° C. for 5 minutes. -PAGE. The gel was dried, and the results of autoradiography are shown in FIG. If phosphorylated, it is detected as a band. In FIG. 17, the band observed around 80 kDa indicates that PKC was autophosphorylated by PKC. From this result, it was confirmed that only GST / human p57 (3-5) protein had a band at a portion corresponding to its molecular weight (37 kDa), and it was confirmed that the protein was phosphorylated.
[0126]
Experimental Example 3 Binding to actin
Using the GST / human p57 fusion protein obtained in Example 5, it was confirmed by co-precipitation (Cosedimentation assay) that the human p57 protein of the present invention binds to actin.
Tris (20mM, pH 8.0), CaClTwoG-actin (0.15 μg / μl, Sigma) was added to a microtube containing a buffer (200 μl) consisting of (0.1 mM), ATP (0.2 mM) and KCl (160 mM), followed by GST / human p57 fusion. The protein was added and reacted at 25 ° C. for 1 hour. The reaction was ultracentrifuged (100,000 × G, 1 hour at 4 ° C.) and the precipitate was collected. The sample before ultracentrifugation, the supernatant after ultracentrifugation, and the precipitate were each dissolved in HEPES buffer (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonate, 100 μl), and the mixture was dissolved in SDS sample buffer (100 μl). μl, manufactured by Daiichi Kagaku Co., Ltd.), and the mixture was boiled at 100 ° C. for 5 minutes and subjected to SDS-PAGE (FIG. 18).
As a control experiment, the GST / human p57 fusion protein was similarly treated in a system without G-actin and subjected to SDS-PAGE (FIG. 19).
[0127]
Actin has the property of precipitating when subjected to ultracentrifugation after being made into F-actin. Therefore, when the protein that binds to F-actin is ultracentrifuged together with the actin, the protein is co-precipitated with F-actin and detected on the precipitation side.
As a result of the above experiment, in the control experiment without actin, the band of GST / human p57 fusion protein (83 to 84 kDa) was not detected on the precipitate side (
When a similar experiment was performed using GST protein (26 to 27 KDa) instead of GST / human p57 fusion protein as a control test protein, no GST band appeared in the precipitate after centrifugation ( GST did not co-precipitate). From this, it was confirmed that the human p57 protein of the present invention has a binding property to actin.
[0128]
Experimental Example 4 Tissue distribution of p57 protein expression
The tissue distribution of the p57 protein of the present invention was examined by the following method.
From BALB / c mice, brain, lung, liver, heart, spleen, stomach, intestine, kidney, thymus, bone marrow, lymph nodes (fovea and mesentery) and femoral skeletal muscle were isolated by surgical operation, respectively. After washing with PBS, each was cut into small pieces, added to a homogenization buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EGTA, 0.1 mM DTT, 0.1 mM DFP, 5 μg / ml leupeptin) and added to the mixture using a homogenizer. Homogenized. Each homogenate was centrifuged (14000 rpm, 4 ° C., 20 minutes) to extract a cytoplasmic fraction. The protein of each of the obtained extracts was quantified using a BCA protein assay kit (manufactured by Pierce), and each extract was prepared to have a protein concentration of 2 mg / ml.
7.5 μl of each was taken, SDS sample buffer (7.5 μl, manufactured by Daiichi Kagaku) was added, and the mixture was boiled at 100 ° C. for 5 minutes, and then subjected to SDS-PAGE so that the concentration became 15 μg / lane. Thereafter, a PVDF membrane (manufactured by Millipore) was electrically blotted, and a western blotting assay was performed by a conventional method using the antiserum obtained in Example 6.
In addition, tests were similarly performed on spleen-derived T cells, spleen-derived B cells, and peritoneal-derived macrophages obtained from BALB / c mice, and cytoplasmic fractions of healthy human-derived peripheral blood lymphocytes and neutrophils. Was.
[0129]
The results are shown in FIGS. As a result, the p57 protein of the present invention was specifically expressed in brain (FIG. 20, lane 1), thymus (FIG. 20, lane 2), spleen (FIG. 21, lane 2) and bone marrow (FIG. 21, lane 5). And was found to be expressed in lymphocytes (FIG. 22), monocytes and cells of the macrophage lineage (FIG. 23). On the other hand, no significant expression was confirmed in tissues other than brain, thymus, spleen and bone marrow, indicating that the p57 protein of the present invention is specifically expressed in immune system tissues and brain.
[0130]
As described above, the results of the studies by the present inventors are summarized. The p57 protein of the present invention has the following structural characteristics and biological properties.
{Circle around (1)} Actin-binding plays an important role in controlling cell movement.
{Circle around (2)} It has about 40% homology with coronin, an actin-binding protein involved in slime mold chemotaxis and cell division.
(3) Heterotrimer, which is thought to play an important role in the expression of biological functions such as intracellular signal transmission, cell movement control, cell division and replication or gene transcription. It has a WD40 repeat structural region commonly found in the structures of various intracellular proteins derived from eukaryotes including the β subunit of G protein (transducin).
(4) It has a potential phosphorylation site required for energy transmission in signal transduction in cells.
(5) It has a repetitive structural region of leucine residues every seven amino acids, which is commonly found in various DNA-binding proteins, and can form an α-helix in this characteristic structural region.
[0131]
{Circle around (6)} In mammals, expression is found specifically in the immune system tissue and brain.
[0132]
On the other hand, today, signals via phospholipase C and low-molecular-weight G protein, which are deeply involved in intracellular signal transmission to external stimuli, are transmitted by cytoskeletal system (cell motility) such as chromosome division and thus cell division. Actin-binding proteins play important roles in cell division, cell proliferation, cell membrane trafficking, cell motility, inositol phospholipid metabolism, and have their own It has been found that an abnormality in actin impairs activation of immune system cells and facilitates infection with a virus or the like.
[0133]
Further, the P57 protein of the present invention is characterized in that, based on the above-mentioned characteristics (1) to (6), based on the information and the like obtained so far in the field, the P57 protein has a It is presumed to play a role related to the control of the cytoskeletal system (cell movement) via the internal information transmission system.
Among cell motility, for example, if the protein plays a role in cell division, targeting the protein of the present invention, colchicine, which is known as a drug that inhibits the polymerization or depolymerization of tubulin essential during division, Potent anticancer agents such as taxol can be developed.
[0134]
In addition, if the p57 protein of the present invention is a protein that plays a role in inducing chemotaxis of cells through intracellular signal transmission, for example, as seen in leukocytes that are immunocompetent cells, It is possible to develop anti-inflammatory agents and immunosuppressants by controlling chemotaxis of the cells by targeting proteins.
Furthermore, if the p57 protein of the present invention is a protein that plays a role as interacting with a DNA binding protein such as a transcription factor, the protein of the present invention is targeted and known as an HIV promoter DNA binding protein. It is possible to develop antiviral agents such as anti-HIV inhibitors targeting NFκB.
[0135]
In the development of such useful drugs, since the biodistribution of the protein of the present invention is specific to the immune system tissue and brain, it differs from the non-tissue-specific drugs such as colchicine and taxol described above. It is very useful in that it acts in a disease site-specific manner and can be a target for the development of drugs with few side effects.
[0136]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting the cytoplasmic fraction of calf thymus tissue to DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.
FIG. 2 is a view showing a chromatogram obtained by subjecting a PLC active component fractionated by DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography to heparin-Sepharose CL-6B column chromatography.
FIG. 3 shows a chromatogram obtained by subjecting a PLC active component fractionated by heparin-Sepharose CL-6B column chromatography to Sepharose CL-6B column chromatography.
FIG. 4 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting a PLC active component fractionated by Sepharose CL-6B column chromatography to MonoS column chromatography (FPLC).
FIG. 5 is a diagram showing a chromatogram obtained by subjecting a fraction without GTPγS activity fractionated by MonoS column chromatography (FPLC) to Superose 12 column chromatography (FPLC).
FIG. 6 is a photograph instead of a drawing showing the result of subjecting each fraction (
FIG. 7 is a diagram schematically illustrating the structure of [pGEX-5X-1 / GST / adaptor a / fragment of human p57 gene coding region (PmaCI to SacI) / adaptor b / pGEX-5X-1].
FIG. 8: Restriction enzyme map of plasmid pGEX / hp57 into which [pGEX-5X-1 / GST / adaptor a / fragment of human p57 gene coding region (PmaCI to SacI) / adaptor b / pGEX-5X-1] has been introduced. FIG.
FIG. 9 is a photograph instead of a drawing showing an electrophoresis image by SDS-PAGE confirming expression of GST / full-length human p57 fusion protein, GST / human p57 (1-4) and GST / human p57 (3-5). is there.
Lane 1: GST protein
Lane 2: GST / human p57 (3-5) protein
Lane 3: GST / human p57 (1-4) protein
Lane 4: GST / full length human p57 fusion protein
Lane 5: molecular weight marker
FIG. 10 is a photograph (electrophoresis photograph) instead of a drawing showing the result of Western blotting for confirming the reactivity of the anti-human p57 polyclonal antibody.
Lanes 1-3 show the results in the system without the immunogenic peptide.
Lane 1: human-derived HL60 cytoplasmic fraction
Lane 2: mouse-derived LAW264.7 cytoplasmic fraction
Lane 3: monkey kidney-derived COS cell cytoplasmic fraction
Lanes 4-6 show the results when the immunogenic peptide was added and the polyclonal antibody was adsorbed with the immunogenic peptide.
Lane 4: human-derived HL60 cytoplasmic fraction
Lane 5: cytoplasmic fraction of mouse-derived LAW264.7
Lane 6: cytoplasmic fraction of COS cells derived from monkey kidney
FIG. 11 is a diagram comparing the amino acid sequence of human p57 protein (one letter code: upper row) and the amino acid sequence of bovine p57 protein (one letter code: lower row) to see homology. * Indicates that they are the same amino acid.
FIG. 12 is a diagram comparing the amino acid sequence of human p57 protein (single letter notation: lower row) with the amino acid sequence of slime mold coronin (single letter notation: upper row) to see homology. * Indicates that they are the same amino acid.
FIG. 13 is a diagram comparing the amino acid sequence of bovine p57 protein (single-letter code: lower row) with the amino acid sequence of slime mold coronin (single-letter code: upper row) to see homology. * Indicates that they are the same amino acid.
FIG. 14 shows a computer-analyzed amino acid sequence diagram (one letter code) of potential phosphorylation sites of human p57. PKC means protein kinase C, and CKII means casein kinase II. The amino acid sequence portion enclosed by □ is the portion recognized by the enzyme, and the amino acid indicated by Δ is the phosphorylated amino acid.
FIG. 15 (1) shows [pGEX-5X-1 / GST / adaptor a / fragment of human p57 gene coding region (PmaCI to BglI) (DNA encoding human p57 (1-4)) / adapter c / pGEX FIG. 2 schematically shows the structure of [-5G-1], and {circle around (2)} indicates a fragment of [pGEX-5X-1 / GST / adaptor d / human p57 gene coding region (BglI to SacI) (human p57 (3 FIG. 5 is a diagram schematically illustrating the structure of (DNA encoding -5)) / adaptor b / pGEX-5X-1].
FIG. 16 is a fragment of [pGEX-5X-1 / GST / adaptor a / fragment of human p57 gene coding region (PmaCI to BglI) (DNA encoding human p57 (1-4)]) / adaptor c / pGEX FIG. 2 shows a restriction map of plasmid pGEX / hp57 (1-4) into which -5X-1] was introduced, and {circle around (2)} indicates [pGEX-5X-1 / GST / adaptor d / human p57 gene coding region ( FIG. 7 is a diagram showing a restriction enzyme map of plasmid pGEX / hp57 (3-5) into which a fragment (DNA encoding human p57 (3-5)) / adaptor b / pGEX-5X-1] was introduced. is there.
FIG. 17 is a photograph instead of a drawing showing an electrophoresis image by SDS-PAGE confirming that GST / human p57 (3-5) protein is phosphorylated by protein kinase C.
Lane 1: GST / human p57 (3-5) protein,
Lane 2: GST / human p57 (1-4) protein
Lane 3: GST (control),
Lane 4: sample to which only PKC was added without adding the test protein
FIG. 18 is an SDS-PAGE photograph (electrophoretic photograph) instead of a drawing showing the actin binding property of GST / full-length human p57 protein.
Lane 1: molecular weight marker
Lane 2: GST / full-length human p57 protein mixed with G-actin and then ultracentrifuged
Previous sample
Lane 3: GST / full-length human p57 protein mixed with G-actin, followed by ultracentrifugation
Later sample supernatant
Lane 4: GST / full length human p57 protein and G-actin were mixed and then ultracentrifuged
Sample residue afterwards (sediment)
FIG. 19 is an SDS-PAGE photograph (electrophoresis photograph) showing a result of performing the same experiment as in Experimental Example 3 (control experiment) in a system not containing actin, instead of the drawing.
Lane 1: molecular weight marker
Lane 2: GST / sample before ultracentrifugation of full-length human p57 protein
Lane 3: GST / sample supernatant after ultracentrifugation of full-length human p57 protein
Lane 4: GST / sample residue after ultracentrifugation of full-length human p57 protein (sediment
Artifact)
FIG. 20 is a photograph instead of a drawing showing the tissue distribution (as an electrophoretic image) of p57 protein in mice.
FIG. 21 is a photograph instead of a drawing, showing the tissue distribution (as an electrophoretic image) of p57 protein in mice.
FIG. 22 is a photograph instead of a drawing showing the tissue distribution (as an electrophoretic image) of p57 protein in mice.
FIG. 23 is a photograph instead of a drawing, showing the cell distribution (as an electrophoretic image) of p57 protein in mice and humans.
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