JP3525393B2 - 脂質及び例えばリポソーム中でのその使用 - Google Patents
脂質及び例えばリポソーム中でのその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は脂質化合物及び、例えば細胞における生物活
性物質や分子の輸送のためのその使用に関するものであ
る。
性物質や分子の輸送のためのその使用に関するものであ
る。
リポソームは脂質二重層からなる球形の自己閉鎖構造
で、それらが浮遊している溶媒の一部をその内部に封入
している。リポソームは一以上の同心状の膜からなり
得、そのサイズは数nmから数十μｍの範囲に及ぶ。
で、それらが浮遊している溶媒の一部をその内部に封入
している。リポソームは一以上の同心状の膜からなり
得、そのサイズは数nmから数十μｍの範囲に及ぶ。
リポソームは、多くは同一分子上に親水基（極性頭部
と呼ばれることが多い）と疎水基（非極性尾部）とを有
することを特徴とする両親媒性分子からなる。また殆ど
の場合、リポソームを形成する分子は水に不溶性であ
る。しかし、ある状況の下ではコロイド状分散物を形成
する。
と呼ばれることが多い）と疎水基（非極性尾部）とを有
することを特徴とする両親媒性分子からなる。また殆ど
の場合、リポソームを形成する分子は水に不溶性であ
る。しかし、ある状況の下ではコロイド状分散物を形成
する。
リポソームには大きなものから小さいものがあり、一
から数百の同心の二重層からなり得る。リポソームは、
サイズ及び層（ラメラ）の性質に関して、マルチラメラ
ベシクル（MLV）、スモールユニラメラベシクル（SU
V）、及びラージユニラメラベシクル（LUV）に分類する
ことができる。
から数百の同心の二重層からなり得る。リポソームは、
サイズ及び層（ラメラ）の性質に関して、マルチラメラ
ベシクル（MLV）、スモールユニラメラベシクル（SU
V）、及びラージユニラメラベシクル（LUV）に分類する
ことができる。
SUVは、20〜600nmの直径を有し、内部の水性区画を取
り囲む単一の脂質二重層からなる。LUVは、600〜30000n
mの直径を有する。MLVは、サイズが最大10000nmまでの
広い範囲にわたり、二以上の脂質二重層を含み、従って
その構造が多重区画型である。
り囲む単一の脂質二重層からなる。LUVは、600〜30000n
mの直径を有する。MLVは、サイズが最大10000nmまでの
広い範囲にわたり、二以上の脂質二重層を含み、従って
その構造が多重区画型である。
リポソームはさまざまな方法で生成することができ
る。いわゆる「薄膜水和」法により主にMLVの不均一な
分散物が形成される。荷電脂質組成物を用いることによ
り、LUVの部分をある程度大きくすることができる。前
記分散物をさらに処理して（機械的、電気的、あるいは
化学的）、SUVの溶液を生成することができる。これら
の方法においては多くの場合、異なる直径の細孔を有す
るフィルタを通す押し出し、あるいは超音波処理を使用
する。
る。いわゆる「薄膜水和」法により主にMLVの不均一な
分散物が形成される。荷電脂質組成物を用いることによ
り、LUVの部分をある程度大きくすることができる。前
記分散物をさらに処理して（機械的、電気的、あるいは
化学的）、SUVの溶液を生成することができる。これら
の方法においては多くの場合、異なる直径の細孔を有す
るフィルタを通す押し出し、あるいは超音波処理を使用
する。
あるいは凍結乾燥によりリポソームを製造することが
でき、この場合、脂質薄膜を揮発性溶媒（例えばｔ−ブ
チルアルコール）に溶解し、次いで凍結して凍結乾燥す
る。
でき、この場合、脂質薄膜を揮発性溶媒（例えばｔ−ブ
チルアルコール）に溶解し、次いで凍結して凍結乾燥す
る。
リポソーム製造のための様々な方法が、例えばSzoka
及びPapahadjopoulos、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9,467
−508（1980）や、米国特許第4,229,360号、第4,241,04
6号、第4,235,871号等の定期刊行物や特許文書に記載さ
れている。
及びPapahadjopoulos、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9,467
−508（1980）や、米国特許第4,229,360号、第4,241,04
6号、第4,235,871号等の定期刊行物や特許文書に記載さ
れている。
リポソームの最も重要な特徴は、リポソームが親水性
分子または疎水性分子を溶解し、保護し、かつ運搬する
能力を有することである。ある種のタンパク質を含む、
負に荷電した薬物には正に荷電したリポソームを用いる
ことができる。正に荷電したリポソームが有毒であり得
るという公知の事実にもかからず、治療を改善するもの
であった。
分子または疎水性分子を溶解し、保護し、かつ運搬する
能力を有することである。ある種のタンパク質を含む、
負に荷電した薬物には正に荷電したリポソームを用いる
ことができる。正に荷電したリポソームが有毒であり得
るという公知の事実にもかからず、治療を改善するもの
であった。
この二十年間に様々なDNAトランスフェクション法が
開発されてきた。このような方法としては、リン酸カル
シウム沈降法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレー
ション法、マイクロインジェクション、レセプター媒介
エンドサイトーシス、リポソーム及びウイルスベクター
を用いる方法がある。しかし、このような方法の多くは
重大な欠点を有する。すなわちこれらの方法は、非効率
的過ぎ、あるいは毒性が強すぎ、あるいは複雑で時間が
かかり過ぎ（tedious）、in vitro及びin vivo両方での
生物学的及び治療的プロトコルに有効に適合させられな
い。例えば、最もよく用いられるin vitroリン酸カルシ
ウム沈降法は効率が悪過ぎる（平均トランスフェクショ
ン頻度は104個の細胞につき１回）。エレクトロポレー
ションはリン酸カルシウム法よりずっと効率的である。
しかしこの方法は攻撃的過ぎ（約50％の細胞死で最大効
率が得られる）、さらにこの方法には特殊な装置が必要
である。マイクロインジェクションは効率的であるが、
時間がかかり過ぎて実用的でない。またこのような方法
はいずれもin vivoでは使用することができない。
開発されてきた。このような方法としては、リン酸カル
シウム沈降法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレー
ション法、マイクロインジェクション、レセプター媒介
エンドサイトーシス、リポソーム及びウイルスベクター
を用いる方法がある。しかし、このような方法の多くは
重大な欠点を有する。すなわちこれらの方法は、非効率
的過ぎ、あるいは毒性が強すぎ、あるいは複雑で時間が
かかり過ぎ（tedious）、in vitro及びin vivo両方での
生物学的及び治療的プロトコルに有効に適合させられな
い。例えば、最もよく用いられるin vitroリン酸カルシ
ウム沈降法は効率が悪過ぎる（平均トランスフェクショ
ン頻度は104個の細胞につき１回）。エレクトロポレー
ションはリン酸カルシウム法よりずっと効率的である。
しかしこの方法は攻撃的過ぎ（約50％の細胞死で最大効
率が得られる）、さらにこの方法には特殊な装置が必要
である。マイクロインジェクションは効率的であるが、
時間がかかり過ぎて実用的でない。またこのような方法
はいずれもin vivoでは使用することができない。
レセプター媒介エンドサイトーシス法では、DNAの相
互作用及びパッケージングのための塩基性ポリマーとし
てポリリシンを用いる。ポリリシンは、修飾タンパク質
−DNA複合体を細胞表面のレセプターに向かわせるため
に、種々のリガンド（トランスフェリン、インスリン、
アシアロオロソムコイド、あるいはガラクトース）で修
飾される（Wu,G.Y.ら、J.Biol.Chem.（1987）262:4429
−4432、Cotten,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1
990）87:4033−4037、Huckett,B.ら、Biochem.Pharmaco
l.（1990）40:253−263、及びPlank,C.ら、Bioconjugat
e Chem.（1992）,533−539）。この方法は、不活性化ア
デノウイルスを用いてエンドソームからのDNAの放出を
促進することにより著しく改善された。Wagner,E.ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1992）89:6099−6103、Ch
ristiano,R.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（199
3）90:2122−2126参照。上述の方法の主な欠点は、タン
パク質抱合化学反応の調節、及びこのような抱合物を再
生可能な形で製造することが本来的に不可能なことであ
る。
互作用及びパッケージングのための塩基性ポリマーとし
てポリリシンを用いる。ポリリシンは、修飾タンパク質
−DNA複合体を細胞表面のレセプターに向かわせるため
に、種々のリガンド（トランスフェリン、インスリン、
アシアロオロソムコイド、あるいはガラクトース）で修
飾される（Wu,G.Y.ら、J.Biol.Chem.（1987）262:4429
−4432、Cotten,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1
990）87:4033−4037、Huckett,B.ら、Biochem.Pharmaco
l.（1990）40:253−263、及びPlank,C.ら、Bioconjugat
e Chem.（1992）,533−539）。この方法は、不活性化ア
デノウイルスを用いてエンドソームからのDNAの放出を
促進することにより著しく改善された。Wagner,E.ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1992）89:6099−6103、Ch
ristiano,R.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（199
3）90:2122−2126参照。上述の方法の主な欠点は、タン
パク質抱合化学反応の調節、及びこのような抱合物を再
生可能な形で製造することが本来的に不可能なことであ
る。
現在、in vitro及びin vivoの両方で最良のトランス
フェクション効率はレトロウイルス、アデノウイルス等
を用いることにより得られている。例えば、Kerr,W.G.
及びMule,J.J.、J.Leucocyte Biol.（1994）56:210−21
4、Hwu,P.及びRosenberg,S.A.、Cancer Detect.Preven
t.（1994）18:43−50、Rosenfeld,M.A.ら、Cell（199
2）68:143−155を参照。しかし、ウイルスベクターを使
用することは、過剰な細胞培養操作の必要性、ある種の
ウイルス系の低い力価、ウイルスの細胞指向性等のいく
つかの考慮すべき事項を残している。さらに、ウイルス
ベクターに対する免疫反応性も問題を起こすことがあ
る。最も重要な点は、ウイルスベクターの使用に伴う安
全性の問題が現在までのところ完全に解決されていない
ということである。
フェクション効率はレトロウイルス、アデノウイルス等
を用いることにより得られている。例えば、Kerr,W.G.
及びMule,J.J.、J.Leucocyte Biol.（1994）56:210−21
4、Hwu,P.及びRosenberg,S.A.、Cancer Detect.Preven
t.（1994）18:43−50、Rosenfeld,M.A.ら、Cell（199
2）68:143−155を参照。しかし、ウイルスベクターを使
用することは、過剰な細胞培養操作の必要性、ある種の
ウイルス系の低い力価、ウイルスの細胞指向性等のいく
つかの考慮すべき事項を残している。さらに、ウイルス
ベクターに対する免疫反応性も問題を起こすことがあ
る。最も重要な点は、ウイルスベクターの使用に伴う安
全性の問題が現在までのところ完全に解決されていない
ということである。
また、in vitro及びin vivo両方において細胞にDNAを
導入するためにリポソームが用いられてきた。最も成功
しているリポソーム系は、ジオレイルオキシプロピルト
リメチルアンモニウム（DOTMA、ホスファチジルエタノ
ールアミン（PE）と組み合わせて試薬を形成する）、ジ
オレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムメチ
ルスルフェート（DOTAP）、ジメチルアミノエタンカル
バモイルコレステロール、ジオクタデシルアミドグリシ
ルスペルミン、2,3−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２−
（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−N,N−ジメ
チル−１−プロパンアミン（DOSPA）（PEを組み合わせ
て試薬を形成する）のような種々のカチオン性脂質を用
いるものである。Felgner,P.L、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1987）84:7413−7417、米国特許第5,208,036
号、Leventis,R.及びSilvius,J.R.、Biochimica et Bio
physica Acta（1990）,124−132、Gao,X.及びHuang,
L.、Biochem.Biophys.Res.Commun.（1991）179:280−28
5、Behr,J.−P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（198
9）86:6982−6986を参照。
導入するためにリポソームが用いられてきた。最も成功
しているリポソーム系は、ジオレイルオキシプロピルト
リメチルアンモニウム（DOTMA、ホスファチジルエタノ
ールアミン（PE）と組み合わせて試薬を形成する）、ジ
オレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムメチ
ルスルフェート（DOTAP）、ジメチルアミノエタンカル
バモイルコレステロール、ジオクタデシルアミドグリシ
ルスペルミン、2,3−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２−
（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−N,N−ジメ
チル−１−プロパンアミン（DOSPA）（PEを組み合わせ
て試薬を形成する）のような種々のカチオン性脂質を用
いるものである。Felgner,P.L、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1987）84:7413−7417、米国特許第5,208,036
号、Leventis,R.及びSilvius,J.R.、Biochimica et Bio
physica Acta（1990）,124−132、Gao,X.及びHuang,
L.、Biochem.Biophys.Res.Commun.（1991）179:280−28
5、Behr,J.−P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（198
9）86:6982−6986を参照。
上述の化合物を使用することの利点は、カチオン性リ
ポソームが単純にDNAと混合され、細胞に加えられると
いう点である。トランスフェクション効率は通常、他の
物理的DNA移入方法より高い。DNAのデリバリーの他、mR
NA及びタンパク質の培養細胞へのデリバリーのために特
別な化合物が用いられている。Malone,R.ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）（1989）86:6077−6081及びDebs,R.
ら、J.Biol.Chem.（1990）265,10189−10193を参照。上
述の化合物の中には、リポーター遺伝子または治療的に
使用される遺伝子をin vivoでトランスフェトするため
に用いられるものもある。Nabel,G.J.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.（USA）（1993）90:11307−11311、Zhu,N.ら、S
cience（1993）261:209−211を参照。さらには、環状カ
チオン性ペプチドグラミシジンＳ及びPEを利用したDNA
トランスフェクションプロトコルが開発されている。Le
gendre,J.−Y.及びSzoka,F.C.、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1993）,90:893−897を参照。上述の系はグラ
ミシジンＳのDNA結合能及び膜不安定化特性を利用して
いる。
ポソームが単純にDNAと混合され、細胞に加えられると
いう点である。トランスフェクション効率は通常、他の
物理的DNA移入方法より高い。DNAのデリバリーの他、mR
NA及びタンパク質の培養細胞へのデリバリーのために特
別な化合物が用いられている。Malone,R.ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.（USA）（1989）86:6077−6081及びDebs,R.
ら、J.Biol.Chem.（1990）265,10189−10193を参照。上
述の化合物の中には、リポーター遺伝子または治療的に
使用される遺伝子をin vivoでトランスフェトするため
に用いられるものもある。Nabel,G.J.ら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.（USA）（1993）90:11307−11311、Zhu,N.ら、S
cience（1993）261:209−211を参照。さらには、環状カ
チオン性ペプチドグラミシジンＳ及びPEを利用したDNA
トランスフェクションプロトコルが開発されている。Le
gendre,J.−Y.及びSzoka,F.C.、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1993）,90:893−897を参照。上述の系はグラ
ミシジンＳのDNA結合能及び膜不安定化特性を利用して
いる。
カチオン性リポソームの主たる不利な点として、その
細胞毒性が比較的高いことがある。さらに上述の化合物
の多くは血清の存在下で不活性であるか、あるいは著し
く低い活性を示す。これらの化合物の殆どはPEの使用を
必要とするが、これは膜融合を促進する膜内脂質中間体
をPEが形成し得るためであると考えられる。カチオン性
脂質を用いるトランスフェクションに係わるメカニズム
については現在まで十分に研究されてこなかった。従っ
て、生物学的分子の、生細胞の細胞質及び核への、毒性
が少なく非感染性でより効率的なデリバリーに対する必
要性が存在している。
細胞毒性が比較的高いことがある。さらに上述の化合物
の多くは血清の存在下で不活性であるか、あるいは著し
く低い活性を示す。これらの化合物の殆どはPEの使用を
必要とするが、これは膜融合を促進する膜内脂質中間体
をPEが形成し得るためであると考えられる。カチオン性
脂質を用いるトランスフェクションに係わるメカニズム
については現在まで十分に研究されてこなかった。従っ
て、生物学的分子の、生細胞の細胞質及び核への、毒性
が少なく非感染性でより効率的なデリバリーに対する必
要性が存在している。
本発明の目的は、現状の技術の上述した欠点及びその
他の欠点を克服することである。第一の形態として、膜
を通しての生物活性物質や分子の輸送、従って細胞また
は細胞オルガネラへの輸送を改善することを可能とする
ために提供されるべき脂質化合物がある。
他の欠点を克服することである。第一の形態として、膜
を通しての生物活性物質や分子の輸送、従って細胞また
は細胞オルガネラへの輸送を改善することを可能とする
ために提供されるべき脂質化合物がある。
この目的は主として請求項１に記載の化合物により解
決される。好ましい化合物は従属請求項２〜11に記載す
る。本発明の新規な化合物の誘導生成物及び用途につい
ては、請求項12〜24（複合体）、請求項25及び26（複合
体の製造方法）、請求項27（リポソーム）、請求項28〜
32（リポソーム製剤）、及び請求項33〜42（膜を通して
の物質または薬剤の輸送方法）に記載する。これらの全
ての請求項の記載内容を引用により本明細書に含める。
決される。好ましい化合物は従属請求項２〜11に記載す
る。本発明の新規な化合物の誘導生成物及び用途につい
ては、請求項12〜24（複合体）、請求項25及び26（複合
体の製造方法）、請求項27（リポソーム）、請求項28〜
32（リポソーム製剤）、及び請求項33〜42（膜を通して
の物質または薬剤の輸送方法）に記載する。これらの全
ての請求項の記載内容を引用により本明細書に含める。
本発明の化合物は下記の式Ｉによって示される。
式中、R1及びR2は同一であるかあるいは異なってもよ
く、６〜24個の炭素原子を含むアルキル基、アルケニル
基、またはアルキニル基であり、 R3、R4及びR5は同一であるかあるいは異なってもよ
く、水素、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、もし
くはアルキルアミン、またはアミノ酸、アミノ酸誘導
体、ペプチド、あるいはペプチド誘導体であり、 Ｗは水素、カルボキシル基、またはアミノ酸、アミノ
酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体の側鎖であ
り、 Ｙは少なくとも一個の水素以外の原子を有する連結
基、特に−CO−、−（CH2）mCO−、−（CH2−）ｍ、−
（CHOHCH2−）ｍ（ｍは１〜20である）、−CH2−Ｓ−CH
2−、−CH2−SO−CH2−、−CH2−SO2−CH2−、−CH2−S
O2−または−SO2−であり、 Ｚは、エステル、エーテル、またはアミド結合であ
り、 ｎは、１〜８であり、 Ｘは、アニオン、特に医薬上許容されるアニオンであ
る。
く、６〜24個の炭素原子を含むアルキル基、アルケニル
基、またはアルキニル基であり、 R3、R4及びR5は同一であるかあるいは異なってもよ
く、水素、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基、もし
くはアルキルアミン、またはアミノ酸、アミノ酸誘導
体、ペプチド、あるいはペプチド誘導体であり、 Ｗは水素、カルボキシル基、またはアミノ酸、アミノ
酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体の側鎖であ
り、 Ｙは少なくとも一個の水素以外の原子を有する連結
基、特に−CO−、−（CH2）mCO−、−（CH2−）ｍ、−
（CHOHCH2−）ｍ（ｍは１〜20である）、−CH2−Ｓ−CH
2−、−CH2−SO−CH2−、−CH2−SO2−CH2−、−CH2−S
O2−または−SO2−であり、 Ｚは、エステル、エーテル、またはアミド結合であ
り、 ｎは、１〜８であり、 Ｘは、アニオン、特に医薬上許容されるアニオンであ
る。
本発明の化合物は、脂質（洗剤、界面活性剤）を含
み、その主要な性質は周知のものである。式Ｉの構造を
有する化合物は、その光学異性体（Ｒ−またはＳ−配
置）、またはその混合物の形態で存在し得る。
み、その主要な性質は周知のものである。式Ｉの構造を
有する化合物は、その光学異性体（Ｒ−またはＳ−配
置）、またはその混合物の形態で存在し得る。
式Ｉによれば、前記脂質化合物はイオン性塩基の形態
で製造される。これは、それ自体中性の化合物は（水）
溶液中でイオンとして存在するということによる。本発
明が対応する中性の化合物もその範囲に包含することは
いうまでもない。式Ｉの化合物は、置換基を適当に選択
することによりさらに荷電し得る。例えばアミノ酸の側
鎖を適当に選択することにより置換基Ｗにおいてさらに
荷電し得る。
で製造される。これは、それ自体中性の化合物は（水）
溶液中でイオンとして存在するということによる。本発
明が対応する中性の化合物もその範囲に包含することは
いうまでもない。式Ｉの化合物は、置換基を適当に選択
することによりさらに荷電し得る。例えばアミノ酸の側
鎖を適当に選択することにより置換基Ｗにおいてさらに
荷電し得る。
請求の範囲及び明細書の理解を助けるために、以下、
用語の定義について記す。
用語の定義について記す。
アルキルは、分岐または直鎖の完全飽和炭素鎖ラジカ
ルをいう。
ルをいう。
アルケニルは、分岐または直鎖の１以上の二重結合を
有する不飽和炭素鎖ラジカルをいう。
有する不飽和炭素鎖ラジカルをいう。
アルキニルは、分岐または直鎖の１以上の三重結合を
有する不飽和炭素鎖ラジカルをいう。
有する不飽和炭素鎖ラジカルをいう。
アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質のモノマー単位をいう。20種のタンパク質アミノ酸
（Ｌ異性体）は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、
アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイ
ン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グ
リシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン
（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン
（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セ
リン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン
（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）である。本
明細書で使用する「アミノ酸」の用語は、タンパク質ア
ミノ酸の類似体、タンパク質アミノ酸のＤ異性体、β
−、γ−、及び他のアミノ酸、非天然のアミノ酸、及び
それらの類似体も包含する。
質のモノマー単位をいう。20種のタンパク質アミノ酸
（Ｌ異性体）は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、
アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイ
ン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、グ
リシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン
（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン
（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セ
リン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン
（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及びバリン（Ｖ）である。本
明細書で使用する「アミノ酸」の用語は、タンパク質ア
ミノ酸の類似体、タンパク質アミノ酸のＤ異性体、β
−、γ−、及び他のアミノ酸、非天然のアミノ酸、及び
それらの類似体も包含する。
生物活性物質とは、in vitro及び／またはin vivoで
生物学的効果を発揮する任意の分子、分子の混合物また
は複合体をいい、医薬品、薬剤、タンパク質、ステロイ
ド、ビタミン、ポリアニオン、ヌクレオシド、ヌクレオ
チド、ポリヌクレオチド等を含む。
生物学的効果を発揮する任意の分子、分子の混合物また
は複合体をいい、医薬品、薬剤、タンパク質、ステロイ
ド、ビタミン、ポリアニオン、ヌクレオシド、ヌクレオ
チド、ポリヌクレオチド等を含む。
本明細書でいうバッファーには、Hepes、PBS、トラン
スフェクションバッファー、トリスが含まれ、Hepesは
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−２−エタン
スルホン酸であって、pHが約７のバッファーとして使用
され、PBSはリン酸緩衝食塩水であって、10mMリン酸塩
及び0.9重量％NaClであり、pH7.4の等張の生理的バッフ
ァーとして使用され、トランスフェクションバッファー
は、10mM Hepes及び0.9重量％NaClであり、pHが約7.4の
バッファーとして使用され、トリスはトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンであって、これもpHが約７のバ
ッファーとして使用される。
スフェクションバッファー、トリスが含まれ、Hepesは
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−２−エタン
スルホン酸であって、pHが約７のバッファーとして使用
され、PBSはリン酸緩衝食塩水であって、10mMリン酸塩
及び0.9重量％NaClであり、pH7.4の等張の生理的バッフ
ァーとして使用され、トランスフェクションバッファー
は、10mM Hepes及び0.9重量％NaClであり、pHが約7.4の
バッファーとして使用され、トリスはトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンであって、これもpHが約７のバ
ッファーとして使用される。
細胞に適用される細胞を指向する（cell−targeted）
複合体またはリポソームは、例えばその表面上に、前記
指向細胞の表面上の成分を認識できる分子をさらに含
む。細胞認識成分としては、細胞表面レセプターに対す
るリガンド、細胞表面抗原に対する抗体等がある。
複合体またはリポソームは、例えばその表面上に、前記
指向細胞の表面上の成分を認識できる分子をさらに含
む。細胞認識成分としては、細胞表面レセプターに対す
るリガンド、細胞表面抗原に対する抗体等がある。
電荷遮蔽された（charge−masked）複合体またはリポ
ソームは、正に荷電した、例えばリポソーム表面をカバ
ーする結合ポリマー及び式Ｉの化合物を含むものとして
理解されるべきものである。ポリマーはリポソームを形
成する任意の脂質に共有結合し得、あるいはその表面に
吸着され得る。
ソームは、正に荷電した、例えばリポソーム表面をカバ
ーする結合ポリマー及び式Ｉの化合物を含むものとして
理解されるべきものである。ポリマーはリポソームを形
成する任意の脂質に共有結合し得、あるいはその表面に
吸着され得る。
複合体は、二以上の成分の混合により生成される生成
物として定義される。このような複合体は、二以上の成
分間の非共有結合性の相互作用（イオン性、親水性、疎
水性等）を特徴とする。
物として定義される。このような複合体は、二以上の成
分間の非共有結合性の相互作用（イオン性、親水性、疎
水性等）を特徴とする。
DNAは、非天然のヌクレオチドを含み得るデオキシリ
ボ核酸を表す。DNAは、一本鎖または二本鎖のものであ
り得る。
ボ核酸を表す。DNAは、一本鎖または二本鎖のものであ
り得る。
薬剤は、ヒトや動物の疾病の予防、診断、緩和、処
置、または治療において使用される任意の予防的あるい
は治療的な化合物をいう。
置、または治療において使用される任意の予防的あるい
は治療的な化合物をいう。
リポソーム製剤は、診断的用途、生物学的用途、治療
的用途、あるいはその他の用途のための物質を内包した
リポソームを含む物質の組成物である。
的用途、あるいはその他の用途のための物質を内包した
リポソームを含む物質の組成物である。
任意の共存脂質（optional co−lipid）とは、それの
みかあるいは他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソ
ームを生成することができる化合物と理解されるべきも
のである。任意の共存脂質の例としては、レシチン、ホ
スファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン
（DOPC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セフ
ァリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸（phosphat
ic acid）、セレブロシド、ジセチルホスフェート等の
リン脂質関連物質や、ステロイド及びテルペンのような
非リン含有脂質が挙げられる。別の非リン含有脂質とし
ては、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキ
サデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロール
リシノレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロ
ピルミリステート、ジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、両性ポリマー、トリエタノールアミンラウリルスル
フェート、及び前述のカチオン性脂質等が挙げられる。
みかあるいは他の脂質成分と組み合わせて安定なリポソ
ームを生成することができる化合物と理解されるべきも
のである。任意の共存脂質の例としては、レシチン、ホ
スファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン
（DOPC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セフ
ァリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸（phosphat
ic acid）、セレブロシド、ジセチルホスフェート等の
リン脂質関連物質や、ステロイド及びテルペンのような
非リン含有脂質が挙げられる。別の非リン含有脂質とし
ては、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキ
サデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロール
リシノレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロ
ピルミリステート、ジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、両性ポリマー、トリエタノールアミンラウリルスル
フェート、及び前述のカチオン性脂質等が挙げられる。
医薬上許容されるイオンは、それ自体無毒性のイオン
である。
である。
ポリアニオンは、ポリマーの二単位以上が負の電荷を
有し、ポリマーの正味の電荷が負であるようなポリマー
構造である。
有し、ポリマーの正味の電荷が負であるようなポリマー
構造である。
ポリカチオンは、ポリマーの二単位以上が正の電荷を
有し、ポリマーの正味の電荷が正であるようなポリマー
構造である。
有し、ポリマーの正味の電荷が正であるようなポリマー
構造である。
ポリヌクレオチドとは、二以上のヌクレオチドを含む
DNAまたはRNAである。ポリヌクレオチドは、環状ヌクレ
オチド及び非天然ヌクレオチドを含むことを意図するも
のであり、化学的方法、組換え技術、あるいはその両方
により製造できる。
DNAまたはRNAである。ポリヌクレオチドは、環状ヌクレ
オチド及び非天然ヌクレオチドを含むことを意図するも
のであり、化学的方法、組換え技術、あるいはその両方
により製造できる。
ポリペプチドは、共有結合で結合された二以上のアミ
ノ酸の配列と理解されるべきものである。
ノ酸の配列と理解されるべきものである。
RNAは、非天然のヌクレオチドを含み得るリボ核酸を
表す。RNAは一本鎖あるいは二本鎖であってよい。
表す。RNAは一本鎖あるいは二本鎖であってよい。
上記の式Ｉの化合物は、Ｙとしてカルボニル基、すな
わち−CO−を含んでいるのが好ましい。これにより、ペ
プチド結合型、すなわち−CO−Ｎ＜の結合が生じる。
わち−CO−を含んでいるのが好ましい。これにより、ペ
プチド結合型、すなわち−CO−Ｎ＜の結合が生じる。
式Ｉの脂質化合物において、Ｚ基は、エステル結合、
すなわち−Ｏ−CO−基を含むのが好ましい。
すなわち−Ｏ−CO−基を含むのが好ましい。
さらに好ましい態様においては、R1及びR2は、10〜20
個の炭素原子、好ましくは12〜18個の炭素原子のアルキ
ルまたはアルケニル基を含む。基R1及びR2は同じもので
あることが好ましい。前述の好ましい基のなかではアル
ケニル基が好ましい。従って、基R1及びR2は、パルミチ
ン基あるいはステアリル基の他、好ましくはオレイル基
あるいはリノール酸の部分を含む。
個の炭素原子、好ましくは12〜18個の炭素原子のアルキ
ルまたはアルケニル基を含む。基R1及びR2は同じもので
あることが好ましい。前述の好ましい基のなかではアル
ケニル基が好ましい。従って、基R1及びR2は、パルミチ
ン基あるいはステアリル基の他、好ましくはオレイル基
あるいはリノール酸の部分を含む。
式Ｉにおいて、ｎは２であるのが好ましい。さらに基
Ｗは塩基性アミノ酸の側鎖、特にリシンまたはオルチニ
ンの側鎖であることが好ましい。
Ｗは塩基性アミノ酸の側鎖、特にリシンまたはオルチニ
ンの側鎖であることが好ましい。
基R3、R4、及びR5は、１〜８個の炭素原子を有するア
ルキル基、特にメチル基であり得る。このR3、R4、及び
R5の３つの基は同じものであることが好ましい。特に好
ましい態様では、R3、R4、及びR5が水素である。
ルキル基、特にメチル基であり得る。このR3、R4、及び
R5の３つの基は同じものであることが好ましい。特に好
ましい態様では、R3、R4、及びR5が水素である。
一般に、考えられるアニオンはいずれも対イオンＸと
して用いることができ、本発明の殆どの用途については
医薬上許容されるアニオンが好ましい。好ましくは、Ｘ
はハライドアニオン、特にクロリドイオンとすることが
できる。
して用いることができ、本発明の殆どの用途については
医薬上許容されるアニオンが好ましい。好ましくは、Ｘ
はハライドアニオン、特にクロリドイオンとすることが
できる。
好ましい式Ｉの化合物は請求項10に記載されており、
特にこれを引用する。特に好ましい化合物は、Ｌ−リシ
ン−ビス−（O,O'−シス−９−オクタデセノイル−β−
ヒドロキシエチル）アミド−ジヒドロクロリドあるいは
その光学異性体である。
特にこれを引用する。特に好ましい化合物は、Ｌ−リシ
ン−ビス−（O,O'−シス−９−オクタデセノイル−β−
ヒドロキシエチル）アミド−ジヒドロクロリドあるいは
その光学異性体である。
式Ｉの定義に包含され、本発明の好ましい化合物は、
以下に記載のカップリング： を用いて対応する化合物を調製することにより製造でき
る。
以下に記載のカップリング： を用いて対応する化合物を調製することにより製造でき
る。
このように製造できる化合物は以下に記載する用途に
特に適している。前記化合物は特に、同様な用途に使用
されるこれまでに知られた脂質化合物よりもその毒性が
かなり低いことを特徴としている。
特に適している。前記化合物は特に、同様な用途に使用
されるこれまでに知られた脂質化合物よりもその毒性が
かなり低いことを特徴としている。
上記の脂質化合物の他、本発明は、前記した新規な化
合物により製造される複合体を包含する。「複合体」と
いう表現は上記の定義の意味で理解されるべきものであ
る。これは必ずしも完全に形成されたリポソームである
必要はない。しかし、複合体形成の正確なメカニズムは
判明していないので、最初に脂質からリポソームが形成
され、これがポリアニオン、ポリカチオン、及びその複
合体と複合体を形成する場合は本発明から排除されるも
のではない。
合物により製造される複合体を包含する。「複合体」と
いう表現は上記の定義の意味で理解されるべきものであ
る。これは必ずしも完全に形成されたリポソームである
必要はない。しかし、複合体形成の正確なメカニズムは
判明していないので、最初に脂質からリポソームが形成
され、これがポリアニオン、ポリカチオン、及びその複
合体と複合体を形成する場合は本発明から排除されるも
のではない。
本発明の複合体の特徴は請求の範囲に記載されてお
り、請求項12〜17、及び請求項18〜24にそれぞれ記載さ
れている。これらの請求項を明示的に引用する。複合体
の形成は、本発明の化合物が正に荷電しているという事
実に本質的に基づくものである。
り、請求項12〜17、及び請求項18〜24にそれぞれ記載さ
れている。これらの請求項を明示的に引用する。複合体
の形成は、本発明の化合物が正に荷電しているという事
実に本質的に基づくものである。
脂質化合物と複合体の他の成分との比率、すなわち
（二成分の）ポリアニオン−脂質複合体中のポリアニオ
ンと脂質化合物との比率は、所望の用途に応じて広範囲
に変化させることができる。脂質化合物からみてこの比
率は1:1より大きくし（荷電を考慮して）、複合体が正
の総荷電あるいは正味の荷電を有して負に荷電した生物
学的膜の表面と単純な形態で相互作用できるようにする
のが好ましい。必要ならば特に有利な比率を実験的に求
める。すなわち、例えばDNAのトランスフェクションに
おいては、トランスフェクトDNAの最適な発現が得られ
るようなDNAと脂質化合物との比率を実験により求め
る。
（二成分の）ポリアニオン−脂質複合体中のポリアニオ
ンと脂質化合物との比率は、所望の用途に応じて広範囲
に変化させることができる。脂質化合物からみてこの比
率は1:1より大きくし（荷電を考慮して）、複合体が正
の総荷電あるいは正味の荷電を有して負に荷電した生物
学的膜の表面と単純な形態で相互作用できるようにする
のが好ましい。必要ならば特に有利な比率を実験的に求
める。すなわち、例えばDNAのトランスフェクションに
おいては、トランスフェクトDNAの最適な発現が得られ
るようなDNAと脂質化合物との比率を実験により求め
る。
一般に、本発明の複合体は全ての分子を負に荷電させ
たものとして実現することができる。好ましいのは、ポ
リアニオンとしてポリヌクレオチドを用いた複合体であ
る。
たものとして実現することができる。好ましいのは、ポ
リアニオンとしてポリヌクレオチドを用いた複合体であ
る。
請求項18〜24に記載した三元複合体では、ポリカチオ
ンがポリペプチドであるのが好ましい。一般に、同様に
本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチド−ポリペプチ
ド−脂質三元複合体の形成のために中性ポリペプチドを
用いることが可能である。
ンがポリペプチドであるのが好ましい。一般に、同様に
本発明の範囲に含まれるポリヌクレオチド−ポリペプチ
ド−脂質三元複合体の形成のために中性ポリペプチドを
用いることが可能である。
驚くべきことに、三元複合体形成の際に例えばポリペ
プチドを用いることにより、ポリヌクレオチドのトラン
スフェクションがポリヌクレオチド−脂質複合体を使用
した場合と比較して著しく増加することが見出された。
好ましくは請求項23に記載のペプチド配列を用いること
ができる。この請求項の記載を明示的に引用する。第一
の配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の核タンパク質の
Ｃ末端部分を示す。現時点では最終的な科学的説明がな
されていないが、三元複合体におけるこれらのペプチド
配列の有用な効果と、該配列における塩基性アミノ酸の
比較的高い割合とは相関性を有し得るようである。
プチドを用いることにより、ポリヌクレオチドのトラン
スフェクションがポリヌクレオチド−脂質複合体を使用
した場合と比較して著しく増加することが見出された。
好ましくは請求項23に記載のペプチド配列を用いること
ができる。この請求項の記載を明示的に引用する。第一
の配列は、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）の核タンパク質の
Ｃ末端部分を示す。現時点では最終的な科学的説明がな
されていないが、三元複合体におけるこれらのペプチド
配列の有用な効果と、該配列における塩基性アミノ酸の
比較的高い割合とは相関性を有し得るようである。
特定の用途のための上記の複合体は、所望に応じて電
荷遮蔽し、あるいは特定の細胞または細胞オルガネラと
の相互作用のために細胞を指向するものとし得る。
荷遮蔽し、あるいは特定の細胞または細胞オルガネラと
の相互作用のために細胞を指向するものとし得る。
さらに本発明は、請求項25及び26に記載の、本発明の
複合体の製造方法を含む。製造及びそれにおける接触は
当業者に周知の通常の方法により行う。すなわち、例え
ば二成分の複合体の製造においては、ポリアニオンと脂
質化合物とをそれぞれ含むバッファー溶液を合せる。こ
れに相当する方法で三元複合体の製造も行い、この場
合、最初にバッファー溶液中にポリアニオン−ポリカチ
オン複合体を得、その後このバッファー溶液を脂質化合
物を含むバッファー溶液と合せる。
複合体の製造方法を含む。製造及びそれにおける接触は
当業者に周知の通常の方法により行う。すなわち、例え
ば二成分の複合体の製造においては、ポリアニオンと脂
質化合物とをそれぞれ含むバッファー溶液を合せる。こ
れに相当する方法で三元複合体の製造も行い、この場
合、最初にバッファー溶液中にポリアニオン−ポリカチ
オン複合体を得、その後このバッファー溶液を脂質化合
物を含むバッファー溶液と合せる。
さらに本発明は、本発明の脂質化合物の少なくとも一
種から製造できる、あるいは製造されたリポソームを包
含する。リポソームの製造は現在の技術において周知の
慣用的な方法で行う。
種から製造できる、あるいは製造されたリポソームを包
含する。リポソームの製造は現在の技術において周知の
慣用的な方法で行う。
さらに本発明は、少なくとも一種の生物活性物質（物
質または分子等）及び一種の脂質成分を含む水溶液中の
リポソーム製剤を包含する。この場合、脂質化合物は少
なくとも一種の本発明の脂質化合物を含む。生物活性物
資及び脂質成分の他に、リポソーム製剤は水溶液の通常
の溶液成分を含み、該水溶液は、純水、あるいは好まし
くは慣用のバッファー溶液であり得る。
質または分子等）及び一種の脂質成分を含む水溶液中の
リポソーム製剤を包含する。この場合、脂質化合物は少
なくとも一種の本発明の脂質化合物を含む。生物活性物
資及び脂質成分の他に、リポソーム製剤は水溶液の通常
の溶液成分を含み、該水溶液は、純水、あるいは好まし
くは慣用のバッファー溶液であり得る。
請求項28に記載したように、単一の式Ｉの化合物ある
いはそのような化合物の混合物を脂質成分として用いる
ことができる。さらに、本発明の化合物の一種以上を、
前に定義した別の共存脂質、例えば混合物としたPE、PO
PEとともに用いることが可能である。
いはそのような化合物の混合物を脂質成分として用いる
ことができる。さらに、本発明の化合物の一種以上を、
前に定義した別の共存脂質、例えば混合物としたPE、PO
PEとともに用いることが可能である。
リポソームの製造が可能である限り生物活性物質の量
は一般的に重要ではない。通常、生物活性物質はリポソ
ーム製剤中に10重量％まで存在させる。下限としては、
例えば0.01重量％という数値が挙げられる。１〜５重量
％の生物活性物質の濃度範囲が好ましい。
は一般的に重要ではない。通常、生物活性物質はリポソ
ーム製剤中に10重量％まで存在させる。下限としては、
例えば0.01重量％という数値が挙げられる。１〜５重量
％の生物活性物質の濃度範囲が好ましい。
本発明の化合物は、好ましくは前記脂質成分の１％〜
100％の量とし得る。リポソーム製剤の好ましい態様に
おいては、一種以上の共存脂質が存在し、そのような共
存脂質が脂質成分の30〜70％の量を占めるものである。
100％の量とし得る。リポソーム製剤の好ましい態様に
おいては、一種以上の共存脂質が存在し、そのような共
存脂質が脂質成分の30〜70％の量を占めるものである。
生物活性物質が薬剤である場合、その量は所望の治療
に従い、慣用的なものとして選択し得る。好ましくはリ
ポソーム製剤中に１〜５重量％の薬剤が存在するものと
する。生物活性物質として適用される薬剤の場合には、
リポソーム製剤中に医薬上許容される賦形剤を含めるこ
とができる。
に従い、慣用的なものとして選択し得る。好ましくはリ
ポソーム製剤中に１〜５重量％の薬剤が存在するものと
する。生物活性物質として適用される薬剤の場合には、
リポソーム製剤中に医薬上許容される賦形剤を含めるこ
とができる。
上記したように、本発明の複合体とともに、本発明の
リポソームあるいはリポソーム製剤は、任意に電荷遮蔽
し、あるいは特定の細胞と相互作用するように細胞を指
向するものとし得る。
リポソームあるいはリポソーム製剤は、任意に電荷遮蔽
し、あるいは特定の細胞と相互作用するように細胞を指
向するものとし得る。
さらに本発明は、ポリアニオンあるはポリカチオンを
移入する方法、あるいは一般的に生物膜を通して生物活
性物質を移入する方法、特に細胞または細胞オルガネラ
に移入する方法を包含する。この点については特にそれ
ぞれ請求項33〜38、及び39〜42を引用する。本発明の方
法には、本発明の化合物自体、あるいはそのような化合
物を含む組成物を使用し得る。
移入する方法、あるいは一般的に生物膜を通して生物活
性物質を移入する方法、特に細胞または細胞オルガネラ
に移入する方法を包含する。この点については特にそれ
ぞれ請求項33〜38、及び39〜42を引用する。本発明の方
法には、本発明の化合物自体、あるいはそのような化合
物を含む組成物を使用し得る。
in vivoでのインキュベーションにより前記方法を実
施する間に、例えばポリエチレングリコールのような追
加的な安定剤を含めてもよい。
施する間に、例えばポリエチレングリコールのような追
加的な安定剤を含めてもよい。
本発明の方法をさらに詳細に以下に記載する。
本発明の化合物及びその他の部分は種々の利点を有す
る。本明細書に記載した化合物の一つの利点は、便利な
プロトコールによりポリアニオン性物質を100％まで封
入させ得るということである。一方、正の荷電を有する
複合体を負の荷電を有する細胞表面とインキュベーショ
ンすると、特にポリアニオン性物質及びその他の一般的
な生物活性物質の迅速で良好な取り込みが起こる。後者
によれば、複合化あるいは包含された例えばDNAのよう
なポリアニオン性の物質をそのような細胞についてこれ
まで知られていなかったような量で導入することが可能
となる。
る。本明細書に記載した化合物の一つの利点は、便利な
プロトコールによりポリアニオン性物質を100％まで封
入させ得るということである。一方、正の荷電を有する
複合体を負の荷電を有する細胞表面とインキュベーショ
ンすると、特にポリアニオン性物質及びその他の一般的
な生物活性物質の迅速で良好な取り込みが起こる。後者
によれば、複合化あるいは包含された例えばDNAのよう
なポリアニオン性の物質をそのような細胞についてこれ
まで知られていなかったような量で導入することが可能
となる。
本明細書に記載した化合物の特別な利点は以下の通り
である。第一に、これらの化合物は新規なリポソーム形
成脂質である。式Ｉの化合物における両方の脂質鎖の形
状によりそれらが安定な二重層構造に構成されることが
可能となる。極性頭部（例えばアミノ酸）は用途により
変更することができる。これにより、例えばアミノ基、
側鎖あるいは結合に対する種々の修飾を容易に導入する
ことが可能となる。本明細書に記載したカチオン性化合
物の殆どのものの細胞毒性は、その他のカチオン性両親
媒性化合物について報告されたものより有利なものであ
る。式Ｉに示された全ての結合は細胞中で容易に加水分
解され、非毒性の化合物が形成される。
である。第一に、これらの化合物は新規なリポソーム形
成脂質である。式Ｉの化合物における両方の脂質鎖の形
状によりそれらが安定な二重層構造に構成されることが
可能となる。極性頭部（例えばアミノ酸）は用途により
変更することができる。これにより、例えばアミノ基、
側鎖あるいは結合に対する種々の修飾を容易に導入する
ことが可能となる。本明細書に記載したカチオン性化合
物の殆どのものの細胞毒性は、その他のカチオン性両親
媒性化合物について報告されたものより有利なものであ
る。式Ｉに示された全ての結合は細胞中で容易に加水分
解され、非毒性の化合物が形成される。
さらに、式Ｉの正に帯電した脂質は、現状の技術によ
るその他のカチオン性脂質に比較して、血清の存在下で
改良されたトランスフェクション効率を有する。定常的
に血清が存在する中で細胞をトランスフェクトする能力
は多くの理由から有利であり、すなわちより容易により
時間をかけずにトランスフェクションが生じ、媒体ある
いは血清についての要件が減じられ、細胞の機能や生存
性を害し得る細胞における血清の枯渇を起こすことがな
い。
るその他のカチオン性脂質に比較して、血清の存在下で
改良されたトランスフェクション効率を有する。定常的
に血清が存在する中で細胞をトランスフェクトする能力
は多くの理由から有利であり、すなわちより容易により
時間をかけずにトランスフェクションが生じ、媒体ある
いは血清についての要件が減じられ、細胞の機能や生存
性を害し得る細胞における血清の枯渇を起こすことがな
い。
開示されている現状の技術に対する第二のユニークな
利点は、三元複合体にポリヌクレオチド（特にDNA）を
導入する新規な方法により得られる。この複合体は特に
式Ｉの正の荷電を有する脂質及びポリヌクレオチドとポ
リペプチドとから形成された複合体から形成される。前
記方法によれば、ポリヌクレオチド−カチオン性ポリペ
プチドからなる第一の複合体が形成され、これはその後
の段階で正の荷電を有する式Ｉの脂質と複合化される。
組成を正確に制御することにより最終的な複合体の生物
活性が決まる。
利点は、三元複合体にポリヌクレオチド（特にDNA）を
導入する新規な方法により得られる。この複合体は特に
式Ｉの正の荷電を有する脂質及びポリヌクレオチドとポ
リペプチドとから形成された複合体から形成される。前
記方法によれば、ポリヌクレオチド−カチオン性ポリペ
プチドからなる第一の複合体が形成され、これはその後
の段階で正の荷電を有する式Ｉの脂質と複合化される。
組成を正確に制御することにより最終的な複合体の生物
活性が決まる。
現状の技術において公知のトランスフェクション段階
に対するこの方法の利点は、例えば、この新規な方法に
より300倍高いトランスフェクション効率が得られると
いうことでる。さらに、この新規な方法を使用すること
により、トランスフェクションの検出（例えば発現され
たタンパク質の検出）は、トランスフェクションの開始
から２時間未満で容易に記録される。さらにこの新規な
方法では細胞トランスフェクションの「微小スケール」
での作業（例えば96ウェルサイズ）が可能となり、これ
は多数のサンプルのスクリーニングに要望されるもので
あり全体の工程を自動化することを可能とする。
に対するこの方法の利点は、例えば、この新規な方法に
より300倍高いトランスフェクション効率が得られると
いうことでる。さらに、この新規な方法を使用すること
により、トランスフェクションの検出（例えば発現され
たタンパク質の検出）は、トランスフェクションの開始
から２時間未満で容易に記録される。さらにこの新規な
方法では細胞トランスフェクションの「微小スケール」
での作業（例えば96ウェルサイズ）が可能となり、これ
は多数のサンプルのスクリーニングに要望されるもので
あり全体の工程を自動化することを可能とする。
式Ｉの化合物はリポソームの製造に特に有用である
が、カチオン性脂質が用いられるその他の用途にも使用
できる。例えば、工業的な用途に使用できる。特に重要
なのは、医薬製剤（クリーム、ペースト、ゲル、コロイ
ド状分散物等）及び／または化粧用組成物（メイクアッ
プ、リップスティック、ポリッシュ、ボディローショ
ン、モイスチャライジングクリーム、シャンプー等）に
許容されるカチオン性脂質と組み合わせた前記化合物の
用途である。
が、カチオン性脂質が用いられるその他の用途にも使用
できる。例えば、工業的な用途に使用できる。特に重要
なのは、医薬製剤（クリーム、ペースト、ゲル、コロイ
ド状分散物等）及び／または化粧用組成物（メイクアッ
プ、リップスティック、ポリッシュ、ボディローショ
ン、モイスチャライジングクリーム、シャンプー等）に
許容されるカチオン性脂質と組み合わせた前記化合物の
用途である。
式Ｉの化合物を含む製剤は、ポリヌクレオチド、ペプ
チド、タンパク質、ステロイド及びその他の天然あるい
は合成化合物の所望の細胞内デリバリーを得るのに有利
である。この細胞内デリバリーは、細胞質、核、あるい
はその両方の中へのものとし得る。この細胞内デリバリ
ーは、細胞培養中（in vitro）で得ることができ、例え
ば細胞に所望のポリヌクレオチド（例えばDNA）をトラ
ンスフェクトすること、タンパク質のデリバリー等に使
用し得る。
チド、タンパク質、ステロイド及びその他の天然あるい
は合成化合物の所望の細胞内デリバリーを得るのに有利
である。この細胞内デリバリーは、細胞質、核、あるい
はその両方の中へのものとし得る。この細胞内デリバリ
ーは、細胞培養中（in vitro）で得ることができ、例え
ば細胞に所望のポリヌクレオチド（例えばDNA）をトラ
ンスフェクトすること、タンパク質のデリバリー等に使
用し得る。
式Ｉの化合物を含む製剤はex vivo治療においても使
用でき、その場合、生物から単離された細胞をin vitro
でトランスフェクトし、その後生物に移植する。この用
途の例は骨髄細胞のトランスフェクションである。
用でき、その場合、生物から単離された細胞をin vitro
でトランスフェクトし、その後生物に移植する。この用
途の例は骨髄細胞のトランスフェクションである。
また細胞内デリバリーは、生物全体（in vivo）にお
いても得ることができ、従って、遺伝子治療、アンチセ
ンス及びアンチ遺伝子治療のようないくつかの用途に有
用であり得る。またin vivoにおける細胞内デリバリー
は、所望のタンパク質に対する免疫反応（体液性及び／
または細胞性）を誘発する目的のDNAワクチン接種のた
めに使用し得る。
いても得ることができ、従って、遺伝子治療、アンチセ
ンス及びアンチ遺伝子治療のようないくつかの用途に有
用であり得る。またin vivoにおける細胞内デリバリー
は、所望のタンパク質に対する免疫反応（体液性及び／
または細胞性）を誘発する目的のDNAワクチン接種のた
めに使用し得る。
式Ｉの化合物を使用する細胞内デリバリーは、抗癌及
び抗ウイルス化合物、抗生物質等のデリバリーにも有用
である。
び抗ウイルス化合物、抗生物質等のデリバリーにも有用
である。
例えばベシクルの表面に抗体、細胞表面レセプターに
対するリガンドのような細胞認識化合物を導入すること
により細胞選択性を得ることができる。ポリマー及び中
性あるいは負に帯電した脂質のような電荷隠蔽性の適当
な天然あるいは合成化合物でリポソームベシクルを被覆
することによりさらに高い安定性と別の選択性が得られ
る。
対するリガンドのような細胞認識化合物を導入すること
により細胞選択性を得ることができる。ポリマー及び中
性あるいは負に帯電した脂質のような電荷隠蔽性の適当
な天然あるいは合成化合物でリポソームベシクルを被覆
することによりさらに高い安定性と別の選択性が得られ
る。
式Ｉの化合物を含むリポソームベシクルは、リポソー
ム中に導入した対象とする抗原に対する特異的な免疫反
応を誘発するために使用し得る。Ｎ−パルミトイル−Ｓ
−（2,3−ビス（パルミトイルオキシ）−（2RS）−プロ
ピル）−Ｒ−システイン（Pam3Cys）あるいはＮ−アセ
チル−ミラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン
（MDP）及びその誘導体等のような付加的な化合物が特
に有用であり得る。
ム中に導入した対象とする抗原に対する特異的な免疫反
応を誘発するために使用し得る。Ｎ−パルミトイル−Ｓ
−（2,3−ビス（パルミトイルオキシ）−（2RS）−プロ
ピル）−Ｒ−システイン（Pam3Cys）あるいはＮ−アセ
チル−ミラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン
（MDP）及びその誘導体等のような付加的な化合物が特
に有用であり得る。
式Ｉの化合物は、ポリマー、特にペプチドに親油性部
分を導入して細胞によるその取り込みを増強すること、
あるいは脂質含有ベシクル等への導入を増強することに
有用である。活性化された式Ｉの化合物はタンパク質を
修飾するのにも使用できる。
分を導入して細胞によるその取り込みを増強すること、
あるいは脂質含有ベシクル等への導入を増強することに
有用である。活性化された式Ｉの化合物はタンパク質を
修飾するのにも使用できる。
これまで示してきた本発明の構成のさらに詳細は、製
造方法、脂質化合物及びその用途の例についての以下の
記載から明らかであろう。各実施例の記載においては添
付の図面を引用する。
造方法、脂質化合物及びその用途の例についての以下の
記載から明らかであろう。各実施例の記載においては添
付の図面を引用する。
選択された式Ｉの化合物の製造方法
当業者であれば、周知の方法を使用して、容易に付
加、欠失あるいは置換を生成し、好ましいポリペプチド
アミノ酸配列を増加もしくは減少させ、あるいは単に異
なるカチオン性ポリペプチドをコードする別の配列を使
用できるが、そのような変形は本発明の範囲内にあるも
のと理解されなければならない。また以下の実施例は説
明の目的のためのみのものであって、いかなる意味にお
いても本発明を限定するものと解してはならない。
加、欠失あるいは置換を生成し、好ましいポリペプチド
アミノ酸配列を増加もしくは減少させ、あるいは単に異
なるカチオン性ポリペプチドをコードする別の配列を使
用できるが、そのような変形は本発明の範囲内にあるも
のと理解されなければならない。また以下の実施例は説
明の目的のためのみのものであって、いかなる意味にお
いても本発明を限定するものと解してはならない。
この反応スキームは、Ｚがエステル結合でありｎが２
である式Ｉの好ましい化合物の合成に使用できる。この
反応スキームにおいて、P1及びP2は保護基であり、同一
でも異なってもよく、Ｗはアミノ酸の側鎖であり、R1及
びR2は同一で６〜24の炭素原子を有するアルキルまたは
アルケニルである。
である式Ｉの好ましい化合物の合成に使用できる。この
反応スキームにおいて、P1及びP2は保護基であり、同一
でも異なってもよく、Ｗはアミノ酸の側鎖であり、R1及
びR2は同一で６〜24の炭素原子を有するアルキルまたは
アルケニルである。
式（Ａ）の化合物は、光学的に純粋な形態のものが市
販品として入手可能である。式（Ｂ）の化合物の形成を
行うために、式（Ａ）のアミノ酸のカルボキシル基を適
当な試薬で活性化し、次いでジエタノールアミンのイミ
ノ基と反応させる。アミノ酸の活性化方法は当分野で知
られている。例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド
/N−ヒドロキシスクシンイミド法を、保護アミノ酸のエ
ピマー化を生じないアミド化に使用できる。
販品として入手可能である。式（Ｂ）の化合物の形成を
行うために、式（Ａ）のアミノ酸のカルボキシル基を適
当な試薬で活性化し、次いでジエタノールアミンのイミ
ノ基と反応させる。アミノ酸の活性化方法は当分野で知
られている。例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド
/N−ヒドロキシスクシンイミド法を、保護アミノ酸のエ
ピマー化を生じないアミド化に使用できる。
式（Ｂ）のアミドは、式（Ａ）のアミノ酸及び予め形
成したＮ−ヒドロキシスクシンイミドの塩及びジエタノ
ールアミンを例えばジメチルホルムアミドのような適当
な極性溶媒中に溶解することにより製造できる。混合物
を０℃に冷却し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミ
ドの溶液を加える。この反応は、溶液を０℃で１時間室
温で８時間攪拌することにより行うことができる。その
後得られる式（Ｂ）のアミドは何らかの標準的な分離手
段により回収する。
成したＮ−ヒドロキシスクシンイミドの塩及びジエタノ
ールアミンを例えばジメチルホルムアミドのような適当
な極性溶媒中に溶解することにより製造できる。混合物
を０℃に冷却し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミ
ドの溶液を加える。この反応は、溶液を０℃で１時間室
温で８時間攪拌することにより行うことができる。その
後得られる式（Ｂ）のアミドは何らかの標準的な分離手
段により回収する。
式（Ｃ）の化合物を形成するためには、式（Ｂ）のア
ミドを適当な溶媒（例えばジクロロメタン）に溶解す
る。これに適当な三級アミン、例えばトリエチルアミン
を過剰モル量で加える。混合物を約０℃に冷却する。所
望の鎖長と不飽和度を有するアルキル化剤を過剰モル
量、好ましくは式（Ｂ）のアミドの約３倍〜約４倍の量
で加える。例えば、オレオイルクロリドを使用して９−
オクタデカノイル基の付加を行うことができる。次いで
この混合物をN2雰囲気下に室温で約３時間攪拌する。そ
の後式（Ｃ）の生成物を抽出する。
ミドを適当な溶媒（例えばジクロロメタン）に溶解す
る。これに適当な三級アミン、例えばトリエチルアミン
を過剰モル量で加える。混合物を約０℃に冷却する。所
望の鎖長と不飽和度を有するアルキル化剤を過剰モル
量、好ましくは式（Ｂ）のアミドの約３倍〜約４倍の量
で加える。例えば、オレオイルクロリドを使用して９−
オクタデカノイル基の付加を行うことができる。次いで
この混合物をN2雰囲気下に室温で約３時間攪拌する。そ
の後式（Ｃ）の生成物を抽出する。
次いで式（Ｃ）の化合物を、使用した保護基に応じて
適当な方法で脱保護し、抽出し、クロマトグラフィー手
段によりさらに精製する。
適当な方法で脱保護し、抽出し、クロマトグラフィー手
段によりさらに精製する。
実施例１
Ｌ−リシン−ビス（0,0'−オレオイル−βヒドロキシエ
チル）アミドジヒドロクロリド（１） Boc−Lys（Boc）−OH ＊DCHA（2.63g、5mmol）をエチル
アセテートに懸濁し、氷温の2M H2SO4を用いて遊離酸に
転換した。エチルアセテート中のBoc−Lys（Boc）−OH
をMgSO4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残りの油
は1.1g（5mmol）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドの予
備的に準備された塩及びジエタノールアミド（HOSu＊Ｎ
（EtOH）２）を含有する約15mlのジメチルホルムアミド
（DMF）に溶解され氷水中で０℃で冷却された。かき混
ぜている間に、DMF 5ml中のジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）1.13g（5.5mmol）が混合物に添加され、
０℃で１時間、室温で８時間継続して攪拌された。混合
物は真空乾燥により濃縮された。エチルアセテート約50
mlを残りに添加した後、ジシクロヘキシル尿素（DCU）
の大部分は沈殿され、濾過される。エチルアセテート相
は0.1M NaCl中NaHCO3（５％）クエン酸（５％）水溶液
により洗浄され、MgSO4により乾燥され、乾燥蒸発によ
り1.7gの無色油の未精製生成物を得た。
チル）アミドジヒドロクロリド（１） Boc−Lys（Boc）−OH ＊DCHA（2.63g、5mmol）をエチル
アセテートに懸濁し、氷温の2M H2SO4を用いて遊離酸に
転換した。エチルアセテート中のBoc−Lys（Boc）−OH
をMgSO4で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残りの油
は1.1g（5mmol）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドの予
備的に準備された塩及びジエタノールアミド（HOSu＊Ｎ
（EtOH）２）を含有する約15mlのジメチルホルムアミド
（DMF）に溶解され氷水中で０℃で冷却された。かき混
ぜている間に、DMF 5ml中のジシクロヘキシルカルボジ
イミド（DCC）1.13g（5.5mmol）が混合物に添加され、
０℃で１時間、室温で８時間継続して攪拌された。混合
物は真空乾燥により濃縮された。エチルアセテート約50
mlを残りに添加した後、ジシクロヘキシル尿素（DCU）
の大部分は沈殿され、濾過される。エチルアセテート相
は0.1M NaCl中NaHCO3（５％）クエン酸（５％）水溶液
により洗浄され、MgSO4により乾燥され、乾燥蒸発によ
り1.7gの無色油の未精製生成物を得た。
ジクロロメタン（DCM）50ml中のBoc−Lys（Boc）−Ｎ
（EtOH）２溶液1.7g（3.92mmol）、テトラアミン1.64ml
及びオレオイルクロリド3.93mol（それぞれ11.7mmol）
を０℃で30分間、N2存在下、暗室中、室温で４時間攪拌
した。混合物は、メタノールにより冷却され、真空で濃
縮され、ヘキサン中で再溶解され、０℃でメタノール／
水（1:1体積）中の0.1M KOHで３回、0.1M水性NaClで１
回洗浄された。ヘキサン相は真空で濃縮され、残りは50
mlのトリフロロ酢酸（TFA）/DCM（1:1体積）で40分間室
温で処理された。混合物は、繰り返しトルエンと混合さ
れ、真空で再濃縮され、その後シリカゲル60のカラムの
クロロフォルムに添加された。カラムは、クロロフォル
ム中のメタノールの上昇勾配で溶出され、純粋化合物
（2.3g、収率62％）が約20％メタノールで溶出された。
生成物をHClガスで飽和された乾燥エチルアセテートに
溶解し、乾燥により蒸発させてヒドロクロリドを調製し
た。、（分析:ES−MS Mol.測定質量＝762（計算値＝76
2）；エチルアセテート：酢酸：水＝（4:1:1）中TLC:Rf
＝0.69;HPLC:Rt＝14.19分；カラム ヌクレオシルC2 4.
0 x 100mm、0.1％のTFAが入った水のアセトニトリル30
から90％の勾配を20分間で）。
（EtOH）２溶液1.7g（3.92mmol）、テトラアミン1.64ml
及びオレオイルクロリド3.93mol（それぞれ11.7mmol）
を０℃で30分間、N2存在下、暗室中、室温で４時間攪拌
した。混合物は、メタノールにより冷却され、真空で濃
縮され、ヘキサン中で再溶解され、０℃でメタノール／
水（1:1体積）中の0.1M KOHで３回、0.1M水性NaClで１
回洗浄された。ヘキサン相は真空で濃縮され、残りは50
mlのトリフロロ酢酸（TFA）/DCM（1:1体積）で40分間室
温で処理された。混合物は、繰り返しトルエンと混合さ
れ、真空で再濃縮され、その後シリカゲル60のカラムの
クロロフォルムに添加された。カラムは、クロロフォル
ム中のメタノールの上昇勾配で溶出され、純粋化合物
（2.3g、収率62％）が約20％メタノールで溶出された。
生成物をHClガスで飽和された乾燥エチルアセテートに
溶解し、乾燥により蒸発させてヒドロクロリドを調製し
た。、（分析:ES−MS Mol.測定質量＝762（計算値＝76
2）；エチルアセテート：酢酸：水＝（4:1:1）中TLC:Rf
＝0.69;HPLC:Rt＝14.19分；カラム ヌクレオシルC2 4.
0 x 100mm、0.1％のTFAが入った水のアセトニトリル30
から90％の勾配を20分間で）。
同じようにして、但し出発物質を適する物質に代えて、
以下の化合物を調製した： Ｌ−リシン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（２） Ｌ−リシン−ビス−（0,0'−ミリストイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（３） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−ミリストイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（４） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒド
ロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（５） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（６） Ｌ−アルギニン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒド
ロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（７） Ｌ−アルギニン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミド−ジヒドロクロリド（８） Ｌ−セリン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミドジヒドロクロリド（９） グリシン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミドジヒドロクロリド（10） サルコジン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（11） Ｌ−ヒスチジン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（12） Ｌ−グルタミン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（13） 実施例２ Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
酸−α−N'−ビス（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミド（Boc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２（14）
及び Ｎ−α−フロオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸−α−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−
β−ヒドロキシエチル）アミド（Fmoc−Asp−Ｎ（EtOPa
lm）２（15）の合成 Boc−Lys（Boc）−Ｎ（EtOH）２を調製するために、化
合物Boc−Asp（OBzl）−Ｎ（EtOH）２が上記と同様に調
製された。化合物Boc−Lys（Boc）−Ｎ（EtOOL）２の小
さな変性と同様にして化合物Boc−Asp（OBzl）−Ｎ（Er
OPalm）２が調製された。反応は終夜行なわれ、混合物
はエチルアセテートで希釈し、そしてNaHCO3の飽和水溶
液へ注入して、残ったパルミトイルクロリド及び沈殿パ
ルミン酸（palmitate）ナトリウムを破壊した。沈殿は
濾過除去され、有機相は乾燥蒸発され、熱いメタノール
で再溶解された。生成物は冷たいメタノールで沈殿さ
れ、濾過により収率55％で収集された（クロロフォル
ム：メタノール＝100:2中、TLC:Rf＝0.64）。15mlDMF中
の調製されたばかりのPdブラック（約0.1g）の存在下、
NH4COOH（0.65g）で終夜処理することにより、ベンジル
−保護基は生成物（1.5g）から除去される。Pdブラック
は、濾過初去され、混合物は真空で蒸発された。残りは
メタノール／水溶液により沈殿され、望む生成物Boc−A
sp−Ｎ（EtOPalm）２（14）が収率85％で得られた。
（分析:ES−MS:Mol.測定質量＝796,5（計算値＝796）；
クロロフォルム：エチルアセテート：メタノール＝9:3:
1中、TLC:Rf＝0.4） 0.5g（0.62mmol）のBoc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２は、TFA
/DCM＝1:1の混合物で30分間室温で処理された。混合物
は再度トルエンで蒸発された。残りは10mlのDMFに溶解
され、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）で中和さ
れ、1.2倍量の９−フルオレニルメチル−サクシンイミ
ジル−カルボネイト（Fmoc−OSu）と２時間反応させ
た。反応混合物は蒸発され、メタノールで再溶解され
た。望む化合物のFmoc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２（15）は
沈殿され、収率77％で0.44gの化合物が得られた。（分
析：クロロフォルム：エチルアセテート：メタノール＝
9:3:1中でTLC:Rf＝0.4） 同様の手順を用いて、但し出発物質を適する物質に代え
て、以下の化合物を調製した： Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸
−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シルエチル）アミドBoc−Glu（Ｎ（EtOPalm）２）−OH
（16） Ｎ−α−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミン酸−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β
−ヒドロキシルエチル）アミドFmoc−Glu（Ｎ（EtOPal
m）２）OH（17） Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
酸−β−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシルエチル）アミドBoc−Asp（Ｎ（EtOPalm）２）OH
（18） 加えて、これらの合成または上記合成の中間体はリポソ
ームの調製に使用することができる： Ｌ−グルタミン酸−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイ
ル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Glu（Ｎ（EtOPa
lm）２）−OH（19） Ｌ−アスパラギン酸−β−N'−ビス−（0,0'−パルミト
イル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Asp（Ｎ（EtO
Palm）２）−OH（20） Ｌ−アスパラギン酸−α−N'−ビス−（0,0'−パルミト
イル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Asp（Ｎ（EtO
Palm）２）（21） DNA及び化合物（１）から作られた複合体の調製及び特
徴 実施例３ 蛍光研究。蛍光測定が1cmの光パッチ細胞で励起及び放
射のためのスリット幅10nmとして、アミンコ（Aminco）
SPF−1000Scスペクトロフォトメーターにより行なわれ
た、核酸に対する（１）の結合は、DNAベースペア間の
挿入（インターカレーション）において蛍光プローブの
役目を果たすエチジウムボロミドの置換により観察され
た、エチジウムブロミド（５μg/ml子牛の胸腺DNA、8 x
10-6M bp（ベースペア）；ヘペス10mM、150mM NaCl、p
H7.4中、臭化エチジウム1:50bp）と複合されたDNAに
（１）の増加分量を添加後、蛍光は即座に測定された。
臭化エチジウム置換は、DNAから解離した時に起るエチ
ジウムブロミド蛍光（励起＝540nm、放射＝600nm）の低
減によりモニターされた（図１）。蛍光強度は、カチオ
ン性脂質の濃度の増加と共に徐々に低減した。蛍光の消
滅がこれ以上起らない（１）及びDNA間の比は約6:1（W/
W）であった。得られた比は約3.5:1充填比に対応してい
た。
以下の化合物を調製した： Ｌ−リシン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（２） Ｌ−リシン−ビス−（0,0'−ミリストイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（３） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−ミリストイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（４） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒド
ロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（５） Ｌ−オルニチン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（６） Ｌ−アルギニン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒド
ロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（７） Ｌ−アルギニン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミド−ジヒドロクロリド（８） Ｌ−セリン−ビス−（0,0'−オレオイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミドジヒドロクロリド（９） グリシン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミドジヒドロクロリド（10） サルコジン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシエチル）アミドジヒドロクロリド（11） Ｌ−ヒスチジン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（12） Ｌ−グルタミン−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリド（13） 実施例２ Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
酸−α−N'−ビス（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シエチル）アミド（Boc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２（14）
及び Ｎ−α−フロオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸−α−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−
β−ヒドロキシエチル）アミド（Fmoc−Asp−Ｎ（EtOPa
lm）２（15）の合成 Boc−Lys（Boc）−Ｎ（EtOH）２を調製するために、化
合物Boc−Asp（OBzl）−Ｎ（EtOH）２が上記と同様に調
製された。化合物Boc−Lys（Boc）−Ｎ（EtOOL）２の小
さな変性と同様にして化合物Boc−Asp（OBzl）−Ｎ（Er
OPalm）２が調製された。反応は終夜行なわれ、混合物
はエチルアセテートで希釈し、そしてNaHCO3の飽和水溶
液へ注入して、残ったパルミトイルクロリド及び沈殿パ
ルミン酸（palmitate）ナトリウムを破壊した。沈殿は
濾過除去され、有機相は乾燥蒸発され、熱いメタノール
で再溶解された。生成物は冷たいメタノールで沈殿さ
れ、濾過により収率55％で収集された（クロロフォル
ム：メタノール＝100:2中、TLC:Rf＝0.64）。15mlDMF中
の調製されたばかりのPdブラック（約0.1g）の存在下、
NH4COOH（0.65g）で終夜処理することにより、ベンジル
−保護基は生成物（1.5g）から除去される。Pdブラック
は、濾過初去され、混合物は真空で蒸発された。残りは
メタノール／水溶液により沈殿され、望む生成物Boc−A
sp−Ｎ（EtOPalm）２（14）が収率85％で得られた。
（分析:ES−MS:Mol.測定質量＝796,5（計算値＝796）；
クロロフォルム：エチルアセテート：メタノール＝9:3:
1中、TLC:Rf＝0.4） 0.5g（0.62mmol）のBoc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２は、TFA
/DCM＝1:1の混合物で30分間室温で処理された。混合物
は再度トルエンで蒸発された。残りは10mlのDMFに溶解
され、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）で中和さ
れ、1.2倍量の９−フルオレニルメチル−サクシンイミ
ジル−カルボネイト（Fmoc−OSu）と２時間反応させ
た。反応混合物は蒸発され、メタノールで再溶解され
た。望む化合物のFmoc−Asp−Ｎ（EtOPalm）２（15）は
沈殿され、収率77％で0.44gの化合物が得られた。（分
析：クロロフォルム：エチルアセテート：メタノール＝
9:3:1中でTLC:Rf＝0.4） 同様の手順を用いて、但し出発物質を適する物質に代え
て、以下の化合物を調製した： Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸
−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキ
シルエチル）アミドBoc−Glu（Ｎ（EtOPalm）２）−OH
（16） Ｎ−α−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グ
ルタミン酸−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β
−ヒドロキシルエチル）アミドFmoc−Glu（Ｎ（EtOPal
m）２）OH（17） Ｎ−α−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン
酸−β−N'−ビス−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロ
キシルエチル）アミドBoc−Asp（Ｎ（EtOPalm）２）OH
（18） 加えて、これらの合成または上記合成の中間体はリポソ
ームの調製に使用することができる： Ｌ−グルタミン酸−γ−N'−ビス−（0,0'−パルミトイ
ル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Glu（Ｎ（EtOPa
lm）２）−OH（19） Ｌ−アスパラギン酸−β−N'−ビス−（0,0'−パルミト
イル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Asp（Ｎ（EtO
Palm）２）−OH（20） Ｌ−アスパラギン酸−α−N'−ビス−（0,0'−パルミト
イル−β−ヒドロキシエチル）アミドＨ−Asp（Ｎ（EtO
Palm）２）（21） DNA及び化合物（１）から作られた複合体の調製及び特
徴 実施例３ 蛍光研究。蛍光測定が1cmの光パッチ細胞で励起及び放
射のためのスリット幅10nmとして、アミンコ（Aminco）
SPF−1000Scスペクトロフォトメーターにより行なわれ
た、核酸に対する（１）の結合は、DNAベースペア間の
挿入（インターカレーション）において蛍光プローブの
役目を果たすエチジウムボロミドの置換により観察され
た、エチジウムブロミド（５μg/ml子牛の胸腺DNA、8 x
10-6M bp（ベースペア）；ヘペス10mM、150mM NaCl、p
H7.4中、臭化エチジウム1:50bp）と複合されたDNAに
（１）の増加分量を添加後、蛍光は即座に測定された。
臭化エチジウム置換は、DNAから解離した時に起るエチ
ジウムブロミド蛍光（励起＝540nm、放射＝600nm）の低
減によりモニターされた（図１）。蛍光強度は、カチオ
ン性脂質の濃度の増加と共に徐々に低減した。蛍光の消
滅がこれ以上起らない（１）及びDNA間の比は約6:1（W/
W）であった。得られた比は約3.5:1充填比に対応してい
た。
細胞のトランスフェクション
実施例４
細胞培養組織及びプラズミド
HeLa（CCL2、上皮癌、ヒト）、COS−７（CRL 1651、腎
臓、SV−40形質転換体、アフリカ緑猿）、HT−29（HTB3
8、腺癌、結腸、ヒト）、CV−１（CCL 70、腎臓、アフ
リカ緑猿）、818−４（腺癌、膵臓、ヒト）H4IIE（CRL
1548;肝細胞癌、ラット）、K562（CCL 243;慢性骨髄白
血病、ヒト）、HL−60（CCL 240;前骨髄球白血病、ヒ
ト）、は５％CO2で37℃で、プラスチック細胞培養フラ
スコ中のRPMI 1640または子牛血清が添加されたDMEMで
培養され、H4IIE細胞には、100単位/mlのペニシリン、1
00μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン及び
0.1μＭのデキサメタソンが補足された。
臓、SV−40形質転換体、アフリカ緑猿）、HT−29（HTB3
8、腺癌、結腸、ヒト）、CV−１（CCL 70、腎臓、アフ
リカ緑猿）、818−４（腺癌、膵臓、ヒト）H4IIE（CRL
1548;肝細胞癌、ラット）、K562（CCL 243;慢性骨髄白
血病、ヒト）、HL−60（CCL 240;前骨髄球白血病、ヒ
ト）、は５％CO2で37℃で、プラスチック細胞培養フラ
スコ中のRPMI 1640または子牛血清が添加されたDMEMで
培養され、H4IIE細胞には、100単位/mlのペニシリン、1
00μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン及び
0.1μＭのデキサメタソンが補足された。
プラズミドpCMVL及びpCMV β−galはルシファーゼ（luc
iferase）及びβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をそれぞ
れコードしており、それらの発現はカイトメガロウイル
ス（CMV）瞬間アーリープロモーター（immediate−earl
y promoter）により制御されている。プラズミドpZeoSV
及びpZeoSVLacZはZeocinTM（登録商標）に対するSh−bl
e抵抗タンパクをコードしており、原核及び真核細胞の
どちらの選択も可能にする。
iferase）及びβ−ガラクトシダーゼの遺伝子をそれぞ
れコードしており、それらの発現はカイトメガロウイル
ス（CMV）瞬間アーリープロモーター（immediate−earl
y promoter）により制御されている。プラズミドpZeoSV
及びpZeoSVLacZはZeocinTM（登録商標）に対するSh−bl
e抵抗タンパクをコードしており、原核及び真核細胞の
どちらの選択も可能にする。
真核発現はCMVプロモーターの制御下にある。更にpZeoS
VLacZはSV40アーリー増幅−プロモーターの制御下にあ
るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている。プラ
ズミドDNAsは、QIAGENTMプラズミド精製手順を用いて、
QIAGENTM（登録商標）カラム上で精製された。
VLacZはSV40アーリー増幅−プロモーターの制御下にあ
るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしている。プラ
ズミドDNAsは、QIAGENTMプラズミド精製手順を用いて、
QIAGENTM（登録商標）カラム上で精製された。
組織培養細胞のトランスフェクション。細胞の調製、ト
ランスフェクションプロトコール及びトランスフェクシ
ョン効率のためのアッセイ。個々のトランスフェクショ
ンの詳細は以下の結果部分に示されている。
ランスフェクションプロトコール及びトランスフェクシ
ョン効率のためのアッセイ。個々のトランスフェクショ
ンの詳細は以下の結果部分に示されている。
ａ） 粘着細胞。トランスフェクションの24時間前に、
ほぼ融合した細胞物単層（monolayer）がトリプシン化
された。細胞は新鮮な培養液に再懸濁され、24−ウェル
プレート（5 x 104細胞／ウェル）または６−ウェルプ
レート（２−2.5 x 104細胞／ウェル）のいずれかに入
れられる。トランスフェクションの直前に、細胞は10％
FCSが入っていない、または入っている新鮮は培養液に
入れられる。一般的には、細胞は融合性50から70％でト
ランスフェクトされる。トランスフェクションの24時間
後、細胞は３回PBS 2mlで洗浄され、100μｌ（24−ウェ
ルプレート）または200μｌ（６−ウェルプレート）の
溶解バッファー（77mM K2HPO4、23mM KH2PO4、0.2％ト
リトン（Triton）Ｘ−100、1mMジチオトレイトール（di
thiotreitol）、pH7.8）で溶解された。細胞破片は遠心
（14000rpmで２分間）により除去された。通常は、酵素
活性（以下、参照）を細胞溶解の直後に測定する。しか
し、溶解物は−20℃で活性の低下なしに保存することが
可能である。
ほぼ融合した細胞物単層（monolayer）がトリプシン化
された。細胞は新鮮な培養液に再懸濁され、24−ウェル
プレート（5 x 104細胞／ウェル）または６−ウェルプ
レート（２−2.5 x 104細胞／ウェル）のいずれかに入
れられる。トランスフェクションの直前に、細胞は10％
FCSが入っていない、または入っている新鮮は培養液に
入れられる。一般的には、細胞は融合性50から70％でト
ランスフェクトされる。トランスフェクションの24時間
後、細胞は３回PBS 2mlで洗浄され、100μｌ（24−ウェ
ルプレート）または200μｌ（６−ウェルプレート）の
溶解バッファー（77mM K2HPO4、23mM KH2PO4、0.2％ト
リトン（Triton）Ｘ−100、1mMジチオトレイトール（di
thiotreitol）、pH7.8）で溶解された。細胞破片は遠心
（14000rpmで２分間）により除去された。通常は、酵素
活性（以下、参照）を細胞溶解の直後に測定する。しか
し、溶解物は−20℃で活性の低下なしに保存することが
可能である。
ｂ）細胞懸濁液。トランスフェクションの24時間前に、
細胞は新鮮な完全成長培養液に入れられる。トランスフ
ェクションの直前に、細胞は回収され、10％FCSの入れ
ないまたは入った新鮮な培養液に0.25 x 106細胞/mlで
再懸濁され、24−ウェルプレートに2mlづつ入れられ
た。
細胞は新鮮な完全成長培養液に入れられる。トランスフ
ェクションの直前に、細胞は回収され、10％FCSの入れ
ないまたは入った新鮮な培養液に0.25 x 106細胞/mlで
再懸濁され、24−ウェルプレートに2mlづつ入れられ
た。
細胞は通常トランスフェクションの24時間後に収集され
（収集する時間は重要な変性因子であり、効果的に利用
するべきである）、遠心で回収され、そしてPBS 10mlに
再懸濁され、細胞ペレットは1.5mlのエッペンドルフチ
ューブにPBS 1mlと共に移動される。細胞はエッペンド
ルフ遠心（14000rpmで20秒間）で遠心され、得られた細
胞は100μｌの溶解バッファー（上記に記載）に溶解さ
れた。サンプルはその後遠心（14000rpmで２分間）さ
れ、上清が注意深く新鮮な遠心チューブに移動された。
（収集する時間は重要な変性因子であり、効果的に利用
するべきである）、遠心で回収され、そしてPBS 10mlに
再懸濁され、細胞ペレットは1.5mlのエッペンドルフチ
ューブにPBS 1mlと共に移動される。細胞はエッペンド
ルフ遠心（14000rpmで20秒間）で遠心され、得られた細
胞は100μｌの溶解バッファー（上記に記載）に溶解さ
れた。サンプルはその後遠心（14000rpmで２分間）さ
れ、上清が注意深く新鮮な遠心チューブに移動された。
ｃ）トランスフェクションの手順
化合物（１）を用いた細胞のトランスフェクション。プ
ラズミドDNA（濃度約1mg/mlのストック溶液から）及び
カチオン性脂質（濃度１から2mg/mlのストック溶液か
ら）は、1.5mlエッペンドルフチューブ中の10mM Hepe
s、0.9％NaClバッファー、pH7.4により最終体積が100μ
ｌになるように別々に希釈された。カチオン性脂質の量
は０から20μg/100μｌの間で変化した。２つの溶液はD
NA脂質溶液を形成するために混合された。室温で10分間
インキュベートした後、得られたDNA脂質溶液は細胞培
養物に添加され、上記のとうりに培養され、ゆるやかに
混合された。代わりに、DNA脂質溶液を適当な培養液
（＋／−FCS）800μｌ（24−から６−ウェルプレート）
で希釈し混合した。希釈溶液はその後、細胞の上に塗抹
れ、適する培養液で濯がれた。複合体は、１から24時間
細胞と共にインキュベイトされた。血清を含まない場
合、慣例のインキュベイション時間は４時間である。ト
ランスフェクション培養液はその後、完全成長培養液に
置換された。血清が存在する場合、トランスフェクショ
ン培養液は通常置換されず、細胞は実験が終了するまで
複合体Gaの存在下で培養が継続される（１段階トランス
フェクション）。24時間後、細胞は上記のとうりに処理
される。
ラズミドDNA（濃度約1mg/mlのストック溶液から）及び
カチオン性脂質（濃度１から2mg/mlのストック溶液か
ら）は、1.5mlエッペンドルフチューブ中の10mM Hepe
s、0.9％NaClバッファー、pH7.4により最終体積が100μ
ｌになるように別々に希釈された。カチオン性脂質の量
は０から20μg/100μｌの間で変化した。２つの溶液はD
NA脂質溶液を形成するために混合された。室温で10分間
インキュベートした後、得られたDNA脂質溶液は細胞培
養物に添加され、上記のとうりに培養され、ゆるやかに
混合された。代わりに、DNA脂質溶液を適当な培養液
（＋／−FCS）800μｌ（24−から６−ウェルプレート）
で希釈し混合した。希釈溶液はその後、細胞の上に塗抹
れ、適する培養液で濯がれた。複合体は、１から24時間
細胞と共にインキュベイトされた。血清を含まない場
合、慣例のインキュベイション時間は４時間である。ト
ランスフェクション培養液はその後、完全成長培養液に
置換された。血清が存在する場合、トランスフェクショ
ン培養液は通常置換されず、細胞は実験が終了するまで
複合体Gaの存在下で培養が継続される（１段階トランス
フェクション）。24時間後、細胞は上記のとうりに処理
される。
（１）の三元複合体を用いた細胞のトランスフェクショ
ン プラズミドDNAは、適当なペプチドを含有する（例え
ば、請求項23）10mM Hepes、0.9％NaClバッファー（pH
7.4）により、最終体積が100μｌになるように希釈され
た。ペプチドの量は、０から20μg/100μｌの間で変化
した。慣例の濃度は、ペプチド２から５μg/バッファー
100μｌであった。10分間のインキュベイションの後、
得られた溶液は100μｌのカチオン性脂質溶液と混合さ
れ、全ての手順が上記のとうりに継続された。
ン プラズミドDNAは、適当なペプチドを含有する（例え
ば、請求項23）10mM Hepes、0.9％NaClバッファー（pH
7.4）により、最終体積が100μｌになるように希釈され
た。ペプチドの量は、０から20μg/100μｌの間で変化
した。慣例の濃度は、ペプチド２から５μg/バッファー
100μｌであった。10分間のインキュベイションの後、
得られた溶液は100μｌのカチオン性脂質溶液と混合さ
れ、全ての手順が上記のとうりに継続された。
ｄ）酵素アッセイ
ルシフェラーゼアッセイ。細胞抽出物中のルシフェラー
ゼ活性はベルソルドルーマット機器（Berthold Lumat）
（LB 9501）を用いてアッセイされた。ルシフェラーゼ
アッセイは、５から10μｌの細胞抽出物を添加して行わ
れた。サンプルは、LB 9501に設置され、機器は自動的
にサンプルに100μｌのインジェクションバッファー（2
0mMトリシン、1.07mM（MgCO3）4Mg（OH）２、2.67mM Mg
SO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、270μＭコエンザイム
Ａ、470μＭルシフェリン、530μM ATP、pH7.8）を塗布
し、光放射を測定し、その最初の10秒間の光生成物につ
いての積分値を表示した。
ゼ活性はベルソルドルーマット機器（Berthold Lumat）
（LB 9501）を用いてアッセイされた。ルシフェラーゼ
アッセイは、５から10μｌの細胞抽出物を添加して行わ
れた。サンプルは、LB 9501に設置され、機器は自動的
にサンプルに100μｌのインジェクションバッファー（2
0mMトリシン、1.07mM（MgCO3）4Mg（OH）２、2.67mM Mg
SO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、270μＭコエンザイム
Ａ、470μＭルシフェリン、530μM ATP、pH7.8）を塗布
し、光放射を測定し、その最初の10秒間の光生成物につ
いての積分値を表示した。
β−ガラクトシダーゼアッセイ。細胞抽出物のβガラク
トシダーゼ活性が96−ウェルプレート上で測定された。
細胞抽出物10μｌが、「β−Gal」バッファー（33mM Na
H2PO4、66mM Na2HPO4、2mM MgSO4、40mM β−メカプト
エタノール）70μｌ及びONPG溶液（β−Galバッファー
中、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
4mg/ml）25μｌで希釈された。混合物は、37℃で30分間
から１時間保存され、1Mナトリウムバイカルボネイト15
0μｌの添加により反応を終了した。吸収は405nmで測定
された。
トシダーゼ活性が96−ウェルプレート上で測定された。
細胞抽出物10μｌが、「β−Gal」バッファー（33mM Na
H2PO4、66mM Na2HPO4、2mM MgSO4、40mM β−メカプト
エタノール）70μｌ及びONPG溶液（β−Galバッファー
中、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
4mg/ml）25μｌで希釈された。混合物は、37℃で30分間
から１時間保存され、1Mナトリウムバイカルボネイト15
0μｌの添加により反応を終了した。吸収は405nmで測定
された。
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（Ｘ−Gal）による細胞の染色。濯が
れた細胞は、0.1Mリン酸ナトリウム、1mM MgCl2バッフ
ァー（pH7.0）中の１％のグルタルアルデヒド溶液によ
り15分間室温で固定された。固定用溶液は除去され、細
胞は３回PBSで洗浄され、染色溶液（0.2％Ｘ−Gal、10m
Mリン酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM MgCl2、3.3mM K4
Fe（CN）６及び3.3mM K3Fe（CN）６、pH7.0）が細胞に
塗抹され、１から８時間37℃でインキュベイトされた。
培養容器又はカバーガラスの染色された細胞は、それぞ
れ転化（Inverted）又は相コントラスト顕微鏡を用いて
視覚化された。
ラクトピラノシド（Ｘ−Gal）による細胞の染色。濯が
れた細胞は、0.1Mリン酸ナトリウム、1mM MgCl2バッフ
ァー（pH7.0）中の１％のグルタルアルデヒド溶液によ
り15分間室温で固定された。固定用溶液は除去され、細
胞は３回PBSで洗浄され、染色溶液（0.2％Ｘ−Gal、10m
Mリン酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM MgCl2、3.3mM K4
Fe（CN）６及び3.3mM K3Fe（CN）６、pH7.0）が細胞に
塗抹され、１から８時間37℃でインキュベイトされた。
培養容器又はカバーガラスの染色された細胞は、それぞ
れ転化（Inverted）又は相コントラスト顕微鏡を用いて
視覚化された。
タンパク質の測定。上清のタンパク質成分はローリー法
（Bio−Radタンパク質分析キット）の技術を用いてアッ
セイされた。
（Bio−Radタンパク質分析キット）の技術を用いてアッ
セイされた。
サイトトキシンの測定は、MTT（３−（4,5−ジメチルジ
アゾ−２−リル）−2,5−ジフェニル−テトラゾリウム
ブロミド）アッセイにより行なわれた。
アゾ−２−リル）−2,5−ジフェニル−テトラゾリウム
ブロミド）アッセイにより行なわれた。
結果
吸着細胞
ａ）化合物（１）。血清の存在下または無しで、化合物
（１）のトランスフェクションのHela細胞の効率は、DO
TAPと比較された。完全RPMI 1640 1ml中の5 x 104細胞
／ウェル（24−ウェルプレート）の細胞がトランスフェ
クションの１日前に塗抹された。トランスフェクション
の直前に培養液は除去され、細胞は1mlの血清の入った
または入らない新鮮な培養液を与えられた。カチオン性
脂質及びDNA間の光学比を得るために、トランスフェク
ションバッファー中の両方の脂質の多様な分量が100μ
ｌの１μｇのpCMVL含有DNA溶液と混合された（最終体積
100μｌ）。10分間室温でインキュベイションの後、0.5
μｇのプラズミド及び標記分量の脂質を含有するこの混
合物100μｌがそれぞれのウェルに添加された。血清の
存在下では、プレートは培養液の置換無しに24時間イン
キュベイトされた。血清無しでは、４時間後にトランス
フェクション培養液を除去し、細胞に1mlの新鮮な血清
補足培養液を与えた。
（１）のトランスフェクションのHela細胞の効率は、DO
TAPと比較された。完全RPMI 1640 1ml中の5 x 104細胞
／ウェル（24−ウェルプレート）の細胞がトランスフェ
クションの１日前に塗抹された。トランスフェクション
の直前に培養液は除去され、細胞は1mlの血清の入った
または入らない新鮮な培養液を与えられた。カチオン性
脂質及びDNA間の光学比を得るために、トランスフェク
ションバッファー中の両方の脂質の多様な分量が100μ
ｌの１μｇのpCMVL含有DNA溶液と混合された（最終体積
100μｌ）。10分間室温でインキュベイションの後、0.5
μｇのプラズミド及び標記分量の脂質を含有するこの混
合物100μｌがそれぞれのウェルに添加された。血清の
存在下では、プレートは培養液の置換無しに24時間イン
キュベイトされた。血清無しでは、４時間後にトランス
フェクション培養液を除去し、細胞に1mlの新鮮な血清
補足培養液を与えた。
細胞は、ルシフェラーゼアッセイのために24時間のトラ
ンスフェクションの後、上記のように収集された。結果
は、１μg pCMVLごとのカチオン性脂質の合計量とし
て、図２に示されている。血清存在下で細胞がトランス
フェクトされた場合、ルシフェラーゼ活性の光学評価
は、10:1（W/W）のDOTAP/DNA比及び化合物（１）/DNAの
5:1（W/W）比を用いてそれぞれ得られた。血清なしの場
合、両方の脂質のルシフェラーゼ活性の光学評価は、脂
質/DNAの5:1（W/W）比を用いて得られた。化合物（１）
を媒介したトランスフェクションは、DOTAPトランスフ
ェクションと比較して、血清の存在下またはなしで、そ
れぞれ12倍及び６倍高かった。
ンスフェクションの後、上記のように収集された。結果
は、１μg pCMVLごとのカチオン性脂質の合計量とし
て、図２に示されている。血清存在下で細胞がトランス
フェクトされた場合、ルシフェラーゼ活性の光学評価
は、10:1（W/W）のDOTAP/DNA比及び化合物（１）/DNAの
5:1（W/W）比を用いてそれぞれ得られた。血清なしの場
合、両方の脂質のルシフェラーゼ活性の光学評価は、脂
質/DNAの5:1（W/W）比を用いて得られた。化合物（１）
を媒介したトランスフェクションは、DOTAPトランスフ
ェクションと比較して、血清の存在下またはなしで、そ
れぞれ12倍及び６倍高かった。
ｂ）三元複合化合物（１）。完全RPMI 1640の1ml中の5
x 104細胞／ウェルはトランスフェクションの１日前に
塗抹された。トランスフェクションの直前に、培養液は
除去され、細胞は血清入りまたは無しの新鮮な培養液1m
lで満たされた。HBVペプチドの影響をHeLa細胞において
評価するため、多様な量のペプチドは１μｇのpCMVLに
混合され、最終体積100μｌにされ、10分間インキュベ
イトされた。そして、7.5μｇの化合物（１）を含有す
る溶液100μｌが攪拌しながら添加された。10分間の更
なるインキュベイションの後、トランスフェクション溶
液100μｌ（0.5μｇのDNA及び3.75μｇの化合物（１）
を含有する）が細胞に添加された。４時間後、トランス
フェクション培養液は1mlの新鮮な完全成長培養液に置
換された。
x 104細胞／ウェルはトランスフェクションの１日前に
塗抹された。トランスフェクションの直前に、培養液は
除去され、細胞は血清入りまたは無しの新鮮な培養液1m
lで満たされた。HBVペプチドの影響をHeLa細胞において
評価するため、多様な量のペプチドは１μｇのpCMVLに
混合され、最終体積100μｌにされ、10分間インキュベ
イトされた。そして、7.5μｇの化合物（１）を含有す
る溶液100μｌが攪拌しながら添加された。10分間の更
なるインキュベイションの後、トランスフェクション溶
液100μｌ（0.5μｇのDNA及び3.75μｇの化合物（１）
を含有する）が細胞に添加された。４時間後、トランス
フェクション培養液は1mlの新鮮な完全成長培養液に置
換された。
トランスフェクション細胞が溶解された24時間後、細胞
抽出物は上記の様に遺伝子発現の為に分析された。トラ
ンスフェクションレベルは（血清存在下でのトランスフ
ェクションにより）DOTAPトランスフェクションにより
得られたパーセント値として図３に示されている。結果
は、これらの実験のペプチドの光学的分量は５μｇであ
り、ルシフェラーゼ活性の発現は化合物（１）及びDOTA
Pトランスフェクションにより達成されたものよりもそ
れぞれ14倍及び200倍であることが示された。血清なし
の条件でトランスフェクションが行なわれた場合、ペプ
チドの光学的分量は同じであり、それぞれルシフェラー
ゼ活性の発現は化合物（１）により達成されたものより
も約10倍高かく、DOTAPトランスフェクションによるよ
りも150倍高かった（データーは示されていない）。
抽出物は上記の様に遺伝子発現の為に分析された。トラ
ンスフェクションレベルは（血清存在下でのトランスフ
ェクションにより）DOTAPトランスフェクションにより
得られたパーセント値として図３に示されている。結果
は、これらの実験のペプチドの光学的分量は５μｇであ
り、ルシフェラーゼ活性の発現は化合物（１）及びDOTA
Pトランスフェクションにより達成されたものよりもそ
れぞれ14倍及び200倍であることが示された。血清なし
の条件でトランスフェクションが行なわれた場合、ペプ
チドの光学的分量は同じであり、それぞれルシフェラー
ゼ活性の発現は化合物（１）により達成されたものより
も約10倍高かく、DOTAPトランスフェクションによるよ
りも150倍高かった（データーは示されていない）。
ｃ）時間依存。1mlの完全RPMI1640中のウェルごとの5 x
104HeLa細胞はトランスフェクションの１日前に塗抹さ
れた。トランスフェクションの直前に、培養液は除去さ
れ、細胞は1mlの新鮮な培養液で満たされた。0.25μｇ
のpCMVLuc、0.5μｇのHBV−ペプチド、1.87μｇの化合
物（１）を含有する50μｌのトランスフェクション溶液
を攪拌しながらそれぞれのウェルに添加した。トランス
フェクションの２時間後、培養液は1mlの新鮮な完全成
長培養液により置換された。上記に示された表示時間に
おいてルシフェラーゼアッセイのために細胞は収集され
た。結果はウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として
図2cに示されている。示されたとおり、ルシフェラーゼ
活性は急激に増加し、12から16時間で最大に達した。２
時間後に既に、4.5 x 104光単位が得られた。化合物
（１）を介したトランスフェクションでは同じルシフェ
ラーゼ活性は３時間後に観察され、DOTAPを介したトラ
ンスフェクションの５から６時間のみ後であった。
104HeLa細胞はトランスフェクションの１日前に塗抹さ
れた。トランスフェクションの直前に、培養液は除去さ
れ、細胞は1mlの新鮮な培養液で満たされた。0.25μｇ
のpCMVLuc、0.5μｇのHBV−ペプチド、1.87μｇの化合
物（１）を含有する50μｌのトランスフェクション溶液
を攪拌しながらそれぞれのウェルに添加した。トランス
フェクションの２時間後、培養液は1mlの新鮮な完全成
長培養液により置換された。上記に示された表示時間に
おいてルシフェラーゼアッセイのために細胞は収集され
た。結果はウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として
図2cに示されている。示されたとおり、ルシフェラーゼ
活性は急激に増加し、12から16時間で最大に達した。２
時間後に既に、4.5 x 104光単位が得られた。化合物
（１）を介したトランスフェクションでは同じルシフェ
ラーゼ活性は３時間後に観察され、DOTAPを介したトラ
ンスフェクションの５から６時間のみ後であった。
細胞の懸濁
α）化合物（１）。血清存在下でのK562細胞における化
合物（１）のトランスフェクション効率がDOTAPと比較
された。カチオン性脂質とDNA間の最適比を評価するた
めに、多様な値で両方の脂質は一定量のpCMVL（ウェル
ごとに１μｇ、または完全RPMI 1640の2ml中0.5 x 106
細胞、24ウェルプレート）に添加された。200μｌのト
ランスフェクション混合物はそれぞれのウェルに添加さ
れ、プレートは24時間37℃でインキュベイトされた（１
段階トランスフェクション）。上記のとおりに細胞は溶
解された。結果は、１μg DNAごとのカチオン性脂質の
量に対するウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として
図４に示されている。ルシフェラーゼ活性の最高発現
は、DOTAP/DNA比5:1（W/W）、化合物（１）/DNA比7.5:1
（W/W）を使用した時に得られた。得られた比は、それ
ぞれの脂質DNAにおける充填比約2:1及びDOTAPと化合物
（１）において5:1であった。（１μｇのDNAが3.1nmリ
ン酸アニオン充填を含有すると推定した場合）。化合物
（１）を介したトランスフェクションはDOTAPを介して
得られるよりも10倍高いかった。
合物（１）のトランスフェクション効率がDOTAPと比較
された。カチオン性脂質とDNA間の最適比を評価するた
めに、多様な値で両方の脂質は一定量のpCMVL（ウェル
ごとに１μｇ、または完全RPMI 1640の2ml中0.5 x 106
細胞、24ウェルプレート）に添加された。200μｌのト
ランスフェクション混合物はそれぞれのウェルに添加さ
れ、プレートは24時間37℃でインキュベイトされた（１
段階トランスフェクション）。上記のとおりに細胞は溶
解された。結果は、１μg DNAごとのカチオン性脂質の
量に対するウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として
図４に示されている。ルシフェラーゼ活性の最高発現
は、DOTAP/DNA比5:1（W/W）、化合物（１）/DNA比7.5:1
（W/W）を使用した時に得られた。得られた比は、それ
ぞれの脂質DNAにおける充填比約2:1及びDOTAPと化合物
（１）において5:1であった。（１μｇのDNAが3.1nmリ
ン酸アニオン充填を含有すると推定した場合）。化合物
（１）を介したトランスフェクションはDOTAPを介して
得られるよりも10倍高いかった。
β）化合物（１）の三元複合体
K562細胞のトランスフェクションにおけるペプチド濃度
の影響を評価するため、多様な値のHBV−ペプチドが最
終体積100μｌになるように１μｇのpCMVLに添加され、
10分間インキュベイトされた。そして10μｇの化合物
（１）を含有する溶液100μｌが攪拌しながら添加され
た。更に10分間インキュベイトした後、トランスフェク
ション溶液（200μｌ）は、細胞に塗布された。他の全
ての条件は前実験とまったく同じである。結果は、図５
に添加されたペプチドの（１μg DNAごとの）量に対す
るウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として示されて
いる。結果はペプチドの最適量は２μｇであると示して
おり、ルシフェラーゼ活性の発現は、それぞれ化合物
（１）により達するものよりも３倍殻４倍高く、DOTAP
によるトランスフェクションよりも30倍から40倍高かっ
た。
の影響を評価するため、多様な値のHBV−ペプチドが最
終体積100μｌになるように１μｇのpCMVLに添加され、
10分間インキュベイトされた。そして10μｇの化合物
（１）を含有する溶液100μｌが攪拌しながら添加され
た。更に10分間インキュベイトした後、トランスフェク
ション溶液（200μｌ）は、細胞に塗布された。他の全
ての条件は前実験とまったく同じである。結果は、図５
に添加されたペプチドの（１μg DNAごとの）量に対す
るウェルごとの合計ルシフェラーゼ活性として示されて
いる。結果はペプチドの最適量は２μｇであると示して
おり、ルシフェラーゼ活性の発現は、それぞれ化合物
（１）により達するものよりも３倍殻４倍高く、DOTAP
によるトランスフェクションよりも30倍から40倍高かっ
た。
γ）分量依存
保存溶液が、最終体積が200μｌになるように１μｇのp
CNVL、２μｇのHBV−ペプチド及び10μｇの化合物
（１）から作られた。DNA分量依存は、この溶液５から2
00μｌを細胞に添加することによる１段階トランスフェ
クションにより確認された。この実験の結果が図６に示
されている。ルシフェラーゼ活性の発現は添加されたDN
Aの量に依存しており、０から0.25μｇのDNAの範囲では
正比例の関係にあった。理論的には、これらの条件下で
は、0.5ng程の小さいレセプターDNA（キャリアDNAなし
で）を検出することができる。得られた結果は、更に一
度形成されたらこれらの三元複合体はとても安定であ
り、希釈によっても分離しないことを示している。
CNVL、２μｇのHBV−ペプチド及び10μｇの化合物
（１）から作られた。DNA分量依存は、この溶液５から2
00μｌを細胞に添加することによる１段階トランスフェ
クションにより確認された。この実験の結果が図６に示
されている。ルシフェラーゼ活性の発現は添加されたDN
Aの量に依存しており、０から0.25μｇのDNAの範囲では
正比例の関係にあった。理論的には、これらの条件下で
は、0.5ng程の小さいレセプターDNA（キャリアDNAなし
で）を検出することができる。得られた結果は、更に一
度形成されたらこれらの三元複合体はとても安定であ
り、希釈によっても分離しないことを示している。
オリゴヌクレオチドの細胞内導入
実施例５
フルオレセイン（fluorescein）標識されたフォスフォ
チオエート（phosphotioate）オリゴヌクレオチド（5'A
CT TGG ATA CGC ACG−フルオレセイン−3'）は、化合物
（１）の存在下及び無しでの、細胞内でのデリバリー及
びオリゴヌクレオチドの分布を評価するために使用され
た。
チオエート（phosphotioate）オリゴヌクレオチド（5'A
CT TGG ATA CGC ACG−フルオレセイン−3'）は、化合物
（１）の存在下及び無しでの、細胞内でのデリバリー及
びオリゴヌクレオチドの分布を評価するために使用され
た。
HeLa細胞（実験の１日前に、ウェルごとに2 x 105細
胞、６−ウェルプレート）が、ガラス顕微鏡スライド上
の10％FCSで補足された2mlのRPMI 1640において培養さ
れた。実験の前に、培養液は血清を含まないRPMI 1640
により置換された。
胞、６−ウェルプレート）が、ガラス顕微鏡スライド上
の10％FCSで補足された2mlのRPMI 1640において培養さ
れた。実験の前に、培養液は血清を含まないRPMI 1640
により置換された。
オリゴヌクレオチド−化合物（１）複合体の形成は、以
下のとおりに行なわれた。10μｇのフォスフォチオネイ
トオリゴヌクレオチドを90μｌのトランスフェクション
バッファーに溶解した。16μｇ及び50μｇの化合物
（１）はトランスフェクションバッファーにより希釈さ
れ、最終体積100μｌとされた。２つの溶液は混合さ
れ、10分間インキュベイトされた。化合物（１）を含ま
ないオリゴヌクレオチド溶液は、100μｌのトランスフ
ェクションバッファーで希釈された。得られた溶液（ウ
ェルごとに200μｌ）は、培養細胞に添加された（オリ
ゴヌクレオチドの最終濃度は約１μＭ、化合物（１）は
８μＭ及び25μＭ）。複合体は細胞と共に４時間インキ
ュベイトされた。培養液はその後、完全成長培養液に置
換された。
下のとおりに行なわれた。10μｇのフォスフォチオネイ
トオリゴヌクレオチドを90μｌのトランスフェクション
バッファーに溶解した。16μｇ及び50μｇの化合物
（１）はトランスフェクションバッファーにより希釈さ
れ、最終体積100μｌとされた。２つの溶液は混合さ
れ、10分間インキュベイトされた。化合物（１）を含ま
ないオリゴヌクレオチド溶液は、100μｌのトランスフ
ェクションバッファーで希釈された。得られた溶液（ウ
ェルごとに200μｌ）は、培養細胞に添加された（オリ
ゴヌクレオチドの最終濃度は約１μＭ、化合物（１）は
８μＭ及び25μＭ）。複合体は細胞と共に４時間インキ
ュベイトされた。培養液はその後、完全成長培養液に置
換された。
４から24時間後、細胞は３回PBSにより洗浄され、15分
間１％グルタルアルデヒド溶液により固定された。固定
の後、細胞は３回PBSにより洗浄され、グリセロール固
定（mount）溶液（10mMリン酸、150mM NaCl、70％グリ
セロール、pH7.5）により固定された。フルオレセイン
標識されたフォスフォチオネートオリゴヌクレオチド
は、ゼイス（Zeiss）フルオレセイン顕微鏡を用いて、
フルオレセイン顕微鏡で観察された。
間１％グルタルアルデヒド溶液により固定された。固定
の後、細胞は３回PBSにより洗浄され、グリセロール固
定（mount）溶液（10mMリン酸、150mM NaCl、70％グリ
セロール、pH7.5）により固定された。フルオレセイン
標識されたフォスフォチオネートオリゴヌクレオチド
は、ゼイス（Zeiss）フルオレセイン顕微鏡を用いて、
フルオレセイン顕微鏡で観察された。
１μＭのフルオロセイン標識オリゴヌクレオチドによる
細胞のインキュベイションによって、４及び24時間の両
方で、弱い蛍光を結果として得た。比較として、化合物
（１）の存在下、１μＭフルオロセイン標識オリゴヌク
レオチドと共にインキュベイトされた全ての細胞は、細
胞質でとても明るい弱い（punktate）蛍光を有してい
た。24時間後、細胞はとてもはっきりした弱い蛍光を細
胞質で示した。蛍光強度は25μＭ化合物の（１）の存在
下で高かった。
細胞のインキュベイションによって、４及び24時間の両
方で、弱い蛍光を結果として得た。比較として、化合物
（１）の存在下、１μＭフルオロセイン標識オリゴヌク
レオチドと共にインキュベイトされた全ての細胞は、細
胞質でとても明るい弱い（punktate）蛍光を有してい
た。24時間後、細胞はとてもはっきりした弱い蛍光を細
胞質で示した。蛍光強度は25μＭ化合物の（１）の存在
下で高かった。
血清存在下で行なわれた実験では、総合蛍光及びフルオ
ロセイン標識オリゴヌクレオチドの分布は変化しなかっ
た。
ロセイン標識オリゴヌクレオチドの分布は変化しなかっ
た。
アニオンポリペプチドの細胞内導入
実施例６
フルオロセイン標識アニオンポリペプチド（フルオロセ
イン−ポリGlu）21）は化合物（１）の存在下及びなし
で、アニオンポリペプチドと細胞内デリバリー及び分布
を評価するため使用された。実験の条件は前実験と全く
同じである。
イン−ポリGlu）21）は化合物（１）の存在下及びなし
で、アニオンポリペプチドと細胞内デリバリー及び分布
を評価するため使用された。実験の条件は前実験と全く
同じである。
１μＭのフルオロセイン標識ポリ−（Glu）21と細胞の
インキュベイションでは、４時間または24時間いずれに
おいても蛍光を結果として得ることができなかった。比
較として、化合物（１）25μＭの存在下、１μＭのフル
オロセイン標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベイ
トされた全ての細胞は、45分後既に明るい細胞質の弱い
蛍光を有していた。蛍光粒子の分布はフルオロセイン標
識オリゴヌクレオチドにおいて観察されたものと異なっ
ていた。24時間後、細胞はとても明るい弱い蛍光を細胞
質に有し、同じ構造内に適当に分布していた。
インキュベイションでは、４時間または24時間いずれに
おいても蛍光を結果として得ることができなかった。比
較として、化合物（１）25μＭの存在下、１μＭのフル
オロセイン標識オリゴヌクレオチドと共にインキュベイ
トされた全ての細胞は、45分後既に明るい細胞質の弱い
蛍光を有していた。蛍光粒子の分布はフルオロセイン標
識オリゴヌクレオチドにおいて観察されたものと異なっ
ていた。24時間後、細胞はとても明るい弱い蛍光を細胞
質に有し、同じ構造内に適当に分布していた。
実施例７
リポソーム処方
以下の部分は、生物活性試薬からなる処方における本発
明の化合物の使用を説明している： 7.1 慣例の処方は、酢酸プレドニソロン0.25mg（21−
アセトキシ−1,4−プレグナジエン−11β,17a−ジオー
ル−3,20−ジオン）及び50mgのＬ−リシン−ビス−（0,
0'−オレイル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロ
クロリドをジクロロメタン：エタノール（1:1）溶液2ml
に溶解することにより調製された。溶媒は窒素流下で蒸
発された。フィルム混合物は終夜真空下に置かれ、残り
の溶媒を完全に蒸発させた。乾燥フィルムは、その後0.
9％NaCl溶液2mlに懸濁された。
明の化合物の使用を説明している： 7.1 慣例の処方は、酢酸プレドニソロン0.25mg（21−
アセトキシ−1,4−プレグナジエン−11β,17a−ジオー
ル−3,20−ジオン）及び50mgのＬ−リシン−ビス−（0,
0'−オレイル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロ
クロリドをジクロロメタン：エタノール（1:1）溶液2ml
に溶解することにより調製された。溶媒は窒素流下で蒸
発された。フィルム混合物は終夜真空下に置かれ、残り
の溶媒を完全に蒸発させた。乾燥フィルムは、その後0.
9％NaCl溶液2mlに懸濁された。
7.2 （＋）−α−トコフェノール（5,7,8−トリメチル
トコ，ビタミンＥ）及びＬ−リシン−ビス−（0,0'−オ
レイル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリ
ド100mgがジクロロメタン：エタノール（1:1）溶液5ml
に溶解された。溶媒は窒素流下で蒸発され、残りは真空
下で蒸発された。乾燥フィルムはその後10mM Hepes、0.
9％NaCl、pH7.4、4mlえ懸濁され、視覚的に透明になる
まで超音波処理された。
トコ，ビタミンＥ）及びＬ−リシン−ビス−（0,0'−オ
レイル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリ
ド100mgがジクロロメタン：エタノール（1:1）溶液5ml
に溶解された。溶媒は窒素流下で蒸発され、残りは真空
下で蒸発された。乾燥フィルムはその後10mM Hepes、0.
9％NaCl、pH7.4、4mlえ懸濁され、視覚的に透明になる
まで超音波処理された。
7.3 レチノール（3,7−ジメチル−９−（2,6,6−トリ
メチル−１−シクロヘキシル）−2,4,6,8−ノンアテト
レイン（nonnatetraen）−１−オール）20mg及びＬ−リ
シン−ビス−（0,0'−ミストイル−β−ヒドロキシエチ
ル）アミドジヒドロクロリド80mgがジクロロメタン：エ
タノール（1:1）溶液5mlに溶解された。溶媒は蒸発さ
れ、乾燥フィルムは終夜、真空下に置かれた。フィルム
はその後10mM Tris、0.9％NaCl、pH7.4、5mlに懸濁され
た。
メチル−１−シクロヘキシル）−2,4,6,8−ノンアテト
レイン（nonnatetraen）−１−オール）20mg及びＬ−リ
シン−ビス−（0,0'−ミストイル−β−ヒドロキシエチ
ル）アミドジヒドロクロリド80mgがジクロロメタン：エ
タノール（1:1）溶液5mlに溶解された。溶媒は蒸発さ
れ、乾燥フィルムは終夜、真空下に置かれた。フィルム
はその後10mM Tris、0.9％NaCl、pH7.4、5mlに懸濁され
た。
7.4 Ｎ−パルミトイル−Ｓ（2,3−ビス（パルミトイル
−オキシ）−（2RS）−プロピル−Ｒ−システイン3mg及
びＬ−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキシエチル）
アミドジヒドロクロリド25mgがジクロロメタン：エタノ
ール（1:1）溶液5mlに溶解され、真空下で乾燥するまで
蒸発された。得られたフィルムは蒸留水1mlに懸濁さ
れ、超音波で透明になるまで処理された。
−オキシ）−（2RS）−プロピル−Ｒ−システイン3mg及
びＬ−（0,0'−パルミトイル−β−ヒドロキシエチル）
アミドジヒドロクロリド25mgがジクロロメタン：エタノ
ール（1:1）溶液5mlに溶解され、真空下で乾燥するまで
蒸発された。得られたフィルムは蒸留水1mlに懸濁さ
れ、超音波で透明になるまで処理された。
これまでに説明されたものに加えて、本発明は、これら
の方法で製造されたペプチド及びリポペプチドへの、本
発明の脂質化合物の親油性部分の導入に於ける使用も含
んでいる。更なる詳細は以下に説明される。： ペプチドの合成 一般的方法： 自動化ペプチド合成機ABI 350または多ペプチド合成機
を用いた、Ｃ−端末またはＮ−末端、またはその両方、
または鎖の中に親油性変性を有するペプチドの合成は全
−段階ごとの（all−stepwise）固相Fmocに基づく合成
方法によりなし遂げられる。
の方法で製造されたペプチド及びリポペプチドへの、本
発明の脂質化合物の親油性部分の導入に於ける使用も含
んでいる。更なる詳細は以下に説明される。： ペプチドの合成 一般的方法： 自動化ペプチド合成機ABI 350または多ペプチド合成機
を用いた、Ｃ−端末またはＮ−末端、またはその両方、
または鎖の中に親油性変性を有するペプチドの合成は全
−段階ごとの（all−stepwise）固相Fmocに基づく合成
方法によりなし遂げられる。
ペプチドは通常リンク（Rink）アミドMBHAレジン（４−
（2',4'−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）
フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンゾ
ヒドリルアミン、レジン、ノババイオケム（Novabioche
m））またはトリチルレジン（２−クロロトリチルクロ
リドレジン、ノババイオケム）上に集められる。
（2',4'−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）
フェノキシアセトアミド−ノルロイシル−メチルベンゾ
ヒドリルアミン、レジン、ノババイオケム（Novabioche
m））またはトリチルレジン（２−クロロトリチルクロ
リドレジン、ノババイオケム）上に集められる。
Fmoc−アミノ酸（過剰10モル）のカップリングは、DMF
中のＮ−N'−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）及
び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を用いて
１時間行なわれた。親油性アミノ酸−ビス−ヒドロキシ
エチルアミドのカップリングはそれらの３つの過剰モル
を用いてDIC/HOBt活性法と同じ方法で達成され、カップ
リングに必要な時間は約３時間である。カップリングの
完了は、ニヒドリン試験により検出された。Fmoc群は、
ピペリジン:DMF＝1:2で15以内に除去された。
中のＮ−N'−ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）及
び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を用いて
１時間行なわれた。親油性アミノ酸−ビス−ヒドロキシ
エチルアミドのカップリングはそれらの３つの過剰モル
を用いてDIC/HOBt活性法と同じ方法で達成され、カップ
リングに必要な時間は約３時間である。カップリングの
完了は、ニヒドリン試験により検出された。Fmoc群は、
ピペリジン:DMF＝1:2で15以内に除去された。
切断及び最終脱保護はｎ−クレゾール：ジメチルスルフ
ィド：エタンジオール:TFA＝3:3:3:91の混合物により２
時間室温で行なわれた。濾過した後、ペプチドは混合物
から沈殿され、数回ジエチルエーテルにより洗浄され
た。生成ペプチドはセミプレパラティブ（半準備型）ヌ
クレオシル（Nucleosil）C2カラム（8 x 250mm）及びそ
れぞれ0.1％のTFAを含有する水中のアセトニトリルの上
昇勾配により精製された。精製ペプチドは、tert−ブチ
ルアルコール：水＝4:1の混合物から親油化され、−４
℃で保存された。それらの均一性がアミノ酸分析、分析
的HPLC及びエレクトロスプレイ−イオン化質量計により
測定された。
ィド：エタンジオール:TFA＝3:3:3:91の混合物により２
時間室温で行なわれた。濾過した後、ペプチドは混合物
から沈殿され、数回ジエチルエーテルにより洗浄され
た。生成ペプチドはセミプレパラティブ（半準備型）ヌ
クレオシル（Nucleosil）C2カラム（8 x 250mm）及びそ
れぞれ0.1％のTFAを含有する水中のアセトニトリルの上
昇勾配により精製された。精製ペプチドは、tert−ブチ
ルアルコール：水＝4:1の混合物から親油化され、−４
℃で保存された。それらの均一性がアミノ酸分析、分析
的HPLC及びエレクトロスプレイ−イオン化質量計により
測定された。
この手順により、リポペプチドは調製された：
GLFGAIAAGFIENGWEGLIDG−Ｄ（Ｎ（EtOPalm）２）−NH2
Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２）−MQRGNFRNQRKMVKGGRAPRKKG
Ｅ（Ｎ（EtOMyr）２）−MQRGNFRNQRKMVKGGRAPRKKGGRGDS
PGSG−Ｄ（Ｎ（EtOPalm）２）−NH2 Acetyl−GRGDSPGSG−Ｄ（Ｎ（EtOPalm）２）−NH2 YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−NH2 Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL−Ｅ
（Ｎ（EtOPalm）2NH2 YPS−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−PDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYI
NLITRQRY−NH2 更に本発明は、この方法で製造されたペプチド及びグリ
コ−リポペプチドへのグリコ−親油性部分の導入のため
の本発明の脂質化合物の使用を含んでいる。更なる詳細
は以下に示されている： グリコ−リポペプチドの合成 Lys（NH−Asn（ラクトシル））４−Lys2−Lys−Acx−bA
la−Acx−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−NH2 Ｄ（＋）−ラクトースモノヒドレート1.8g（5mmol）wo
飽和NH4HCO340mlと６日間30℃で反応させた。過剰NH4HC
O3を除去するために、反応混合物は、水（20ml）で希釈
され、真空で前体積の半分まで濃縮された。この手順が
６階繰り返された。最終的に、水は親油化により除去さ
れた。得られたそのままのアミノラクトースは、更なる
精製なしにFmoc−Asn（ラクトース）−OtBu誘導体の合
成に使用された。Fmoc−Asp−OtBu 480mg（1.17mmol）
及びHOBt 228mg（1.52mmol）は、DMF（5ml）に溶解さ
れ、４℃に冷却された後、DIC 205mg（1.63mmol）が添
加された。15分間４℃で、20分間25℃で攪拌した後、１
−アミノラクトース5.85mmolはDMF:H2O＝2:1、6ml中の
活性化エステルに添加された。６時間攪拌した後、溶媒
は真空で蒸発され、ジエチルエーテルが添加された。沈
殿された精製物は濾過され、冷たいエーテル及び冷たい
水により洗浄された。TBu保護基は水中の70％TFAにより
（20分間室温で）切断された。TFA/水混合物を真空下で
蒸発した後、精製物はtert−ブチルアルコール：水＝4:
1に溶解され、親油化された。そのままのFmoc−Asn（ラ
クトース）−OHは逆相クロマトグラフィー（リクロプレ
ップ（Lichroprep）C18カラム25 x 310mm、アセトニト
リル30％／−水/TFA0.1％でイソクラテック（Isocrati
c）溶出）で精製され、280mg HPLC純Fmoc−Asn（ラクト
ース）−OHを得た（Fmoc−Asp−AtBuから計算して収率3
5％、分析：＋FAB−MS（MH＋）＝679（計算値＝679）、
ヌクレオシルC18 4 x 150mmでRt＝6.59分、勾配30から1
00％のアセトニトリル／水中0.1％TFA/0.1％TFA 30
分）。
PGSG−Ｄ（Ｎ（EtOPalm）２）−NH2 Acetyl−GRGDSPGSG−Ｄ（Ｎ（EtOPalm）２）−NH2 YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−NH2 Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL−Ｅ
（Ｎ（EtOPalm）2NH2 YPS−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−PDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYI
NLITRQRY−NH2 更に本発明は、この方法で製造されたペプチド及びグリ
コ−リポペプチドへのグリコ−親油性部分の導入のため
の本発明の脂質化合物の使用を含んでいる。更なる詳細
は以下に示されている： グリコ−リポペプチドの合成 Lys（NH−Asn（ラクトシル））４−Lys2−Lys−Acx−bA
la−Acx−Ｅ（Ｎ（EtOPalm）２−NH2 Ｄ（＋）−ラクトースモノヒドレート1.8g（5mmol）wo
飽和NH4HCO340mlと６日間30℃で反応させた。過剰NH4HC
O3を除去するために、反応混合物は、水（20ml）で希釈
され、真空で前体積の半分まで濃縮された。この手順が
６階繰り返された。最終的に、水は親油化により除去さ
れた。得られたそのままのアミノラクトースは、更なる
精製なしにFmoc−Asn（ラクトース）−OtBu誘導体の合
成に使用された。Fmoc−Asp−OtBu 480mg（1.17mmol）
及びHOBt 228mg（1.52mmol）は、DMF（5ml）に溶解さ
れ、４℃に冷却された後、DIC 205mg（1.63mmol）が添
加された。15分間４℃で、20分間25℃で攪拌した後、１
−アミノラクトース5.85mmolはDMF:H2O＝2:1、6ml中の
活性化エステルに添加された。６時間攪拌した後、溶媒
は真空で蒸発され、ジエチルエーテルが添加された。沈
殿された精製物は濾過され、冷たいエーテル及び冷たい
水により洗浄された。TBu保護基は水中の70％TFAにより
（20分間室温で）切断された。TFA/水混合物を真空下で
蒸発した後、精製物はtert−ブチルアルコール：水＝4:
1に溶解され、親油化された。そのままのFmoc−Asn（ラ
クトース）−OHは逆相クロマトグラフィー（リクロプレ
ップ（Lichroprep）C18カラム25 x 310mm、アセトニト
リル30％／−水/TFA0.1％でイソクラテック（Isocrati
c）溶出）で精製され、280mg HPLC純Fmoc−Asn（ラクト
ース）−OHを得た（Fmoc−Asp−AtBuから計算して収率3
5％、分析：＋FAB−MS（MH＋）＝679（計算値＝679）、
ヌクレオシルC18 4 x 150mmでRt＝6.59分、勾配30から1
00％のアセトニトリル／水中0.1％TFA/0.1％TFA 30
分）。
Fmoc−Asn（ラクトース）−OH 32.5mg（0.048mmol）及
びHOBt7.25mg（0.05mmol）がDMF 200μｌに溶解され、D
IC 6.31mg（0.05mmol）が添加された。30分間攪拌した
後、形成された活性化エステルは終夜、Boc−（Lys（NH
2））４−Lys2−Lys−Acx−bAla−Acx E（Ｎ（EtOPal
m）２）−ペプチジルレジン30mg（0.016mmol）とカップ
リングされた。レジンは注意深く洗浄され、Fmoc群は20
％ピペリジン処理により除去された。グリコペプチドは
切断され、脱保護化され、同じ条件下で上記のとおり用
意された。用意したものはセミプレパラティブHPLCによ
り精製し、Ｎ−ラクトシル化リポペプチド10.6mgを得
た。
びHOBt7.25mg（0.05mmol）がDMF 200μｌに溶解され、D
IC 6.31mg（0.05mmol）が添加された。30分間攪拌した
後、形成された活性化エステルは終夜、Boc−（Lys（NH
2））４−Lys2−Lys−Acx−bAla−Acx E（Ｎ（EtOPal
m）２）−ペプチジルレジン30mg（0.016mmol）とカップ
リングされた。レジンは注意深く洗浄され、Fmoc群は20
％ピペリジン処理により除去された。グリコペプチドは
切断され、脱保護化され、同じ条件下で上記のとおり用
意された。用意したものはセミプレパラティブHPLCによ
り精製し、Ｎ−ラクトシル化リポペプチド10.6mgを得
た。
図１の付随する図解は、添加された化合物（１）の量の
機能としての蛍光強度を示している。
機能としての蛍光強度を示している。
図２は、HeLa細胞のトランスフェクションへのDOTAP/DN
A比及び化合物（１）/DNA比の影響を示している。トラ
ンスフェクション化合物（１）は、血清の存在下（■）
及び無しで（□）示されている。DOTAPトランスフェク
ションは、血清の存在下（●）及び無しで（○）示され
ている。トランスフェクションレベルは50000細胞ごと
の全光単位として示されている。それぞれの点は、３段
階トランスフェクションの平均±SDを示すものである。
A比及び化合物（１）/DNA比の影響を示している。トラ
ンスフェクション化合物（１）は、血清の存在下（■）
及び無しで（□）示されている。DOTAPトランスフェク
ションは、血清の存在下（●）及び無しで（○）示され
ている。トランスフェクションレベルは50000細胞ごと
の全光単位として示されている。それぞれの点は、３段
階トランスフェクションの平均±SDを示すものである。
図３は、HeLa細胞へのペプチド強化遺伝子輸送を示して
いる。トランスフェクションレベルはDOTAPトランスフ
ェクションにより得られた値の％で示され、３段階トラ
ンスフェクションの平均を表している。
いる。トランスフェクションレベルはDOTAPトランスフ
ェクションにより得られた値の％で示され、３段階トラ
ンスフェクションの平均を表している。
図４は、K562細胞におけるDOTAP（●）/DNA比及び化合
物（１）（■）/DNA比の影響を示している。トランスフ
ェクションレベルは、500000細胞ごとの全光単位として
表されている。それぞれの点は、３段階トランスフェク
ションの平均±SDを表している。
物（１）（■）/DNA比の影響を示している。トランスフ
ェクションレベルは、500000細胞ごとの全光単位として
表されている。それぞれの点は、３段階トランスフェク
ションの平均±SDを表している。
図５はK562細胞におけるペプチド強化遺伝子輸送を示し
ている。トランスフェクションレベルは、500000細胞ご
との全光単位として示され、３段階トランスフェクショ
ンの平均±SDを示している。
ている。トランスフェクションレベルは、500000細胞ご
との全光単位として示され、３段階トランスフェクショ
ンの平均±SDを示している。
図６は、添加されたDNA量に対するトランスフェクショ
ンレベルを示している。トランスフェクションレベルは
500000細胞ごとの全光単位として示され、３段階トラン
スフェクションの平均±SDを示している。
ンレベルを示している。トランスフェクションレベルは
500000細胞ごとの全光単位として示され、３段階トラン
スフェクションの平均±SDを示している。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
15/09 5/00 Ｂ
(56)参考文献 特開 平２−135092（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−340598（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−37892（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−228564（ＪＰ，Ａ)
特表 平３−502796（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (47)
- 【請求項１】式 （式中、R1及びR2は同一であるかあるいは異なってもよ
く、６〜24個の炭素原子を含むアルキル基、アルケニル
基、またはアルキニル基であり、 R3は水素、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基もしく
はアルキルアミン、または、アラニン（Ａ）、アルギニ
ン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸
（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタ
ミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イ
ソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メ
チオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン
（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトフ
ァン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、それらの
Ｄ異性体、それらのβ−およびγ−型からなる群から選
ばれるアミノ酸であり、 R4及びR5は同一であるかあるいは異なってもよく、水
素、１〜８個の炭素原子を含むアルキル基またはアルキ
ルアミンであり、 Ｗは塩基性アミノ酸の側鎖基であり、 Ｙは−CO−、−（CH2）mCO−、−（CH2−）ｍ、−（CHO
HCH2−）ｍ（ｍは１〜20である）、−CH2−Ｓ−CH2−、
−CH2−SO−CH2−、−CH2−SO2−CH2−、−CH2−SO2−
または−SO2−であり、 Ｚは、エステル、エーテル、またはアミド結合であり、 ｎは、１〜８であり、 Ｘは、アニオン）によって示される化合物またはその光
学異性体。 - 【請求項２】Ｙがカルボニル基、すなわち−CO−である
請求項１に記載の化合物。 - 【請求項３】Ｚがエステル結合である請求項１または２
に記載の化合物。 - 【請求項４】R1及びR2が、10〜20個の炭素原子の炭素原
子を有するアルキルまたはアルケニル基である請求項１
〜３のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項５】R1及びR2が12〜18個の炭素原子を有するア
ルキルまたはアルケニル基である請求項４に記載の化合
物。 - 【請求項６】R1及びR2が同一である請求項１〜５のいず
れかに記載の化合物。 - 【請求項７】R1及びR2がアルケニル基である請求項１〜
６のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項８】ｎが２である請求項１〜７のいずれかに記
載の化合物。 - 【請求項９】Ｗがリシンまたはオルニチンの側鎖基であ
る請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１０】R3、R4、及びR5が水素である請求項１〜
９のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１１】Ｘが医学上許容されるアニオンである請
求項１〜10のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１２】Ｘがクロリドアニオンである請求項１〜
11のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１３】化合物が Ｌ−リシン−ビス−（O,O'−シス−９−オクタデセノイ
ル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリドあ
るいはその光学異性体、 Ｌ−リシン−ビス−（O,O'−ヘキサデカノイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリドあるいはその
光学異性体、 Ｌ−オルニチン−ビス−（O,O'−シス−９−オクタデセ
ノイル−β−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリ
ドあるいはその光学異性体、 Ｌ−オルニチン−ビス−（O,O'−ヘキサデカノイル−β
−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリドあるいは
その光学異性体、 Ｌ−リシン−ビス−（O,O'−テトラデセノイル−β−ヒ
ドロキシエチル）アミドジヒドロクロリドあるいはその
光学異性体、 Ｌ−オルニチン−ビス−（O,O'−テトラデセノイル−β
−ヒドロキシエチル）アミドジヒドロクロリドあるいは
その光学異性体から選択される請求項１〜12のいずれか
に記載の化合物。 - 【請求項１４】化合物がＬ−リシン−ビス−（O,O'−シ
ス−９−オクタデセノイル−β−ヒドロキシエチル）ア
ミドジヒドロクロリドあるいはその光学異性体である請
求項１〜13のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１５】ポリアニオン及び少なくとも一種の請求
項１〜14のいずれかに記載の化合物からなるポリアニオ
ン−脂質複合体。 - 【請求項１６】正の全電荷あるいは正味の電荷を有する
請求項15に記載の複合体。 - 【請求項１７】ポリアニオンがポリヌクレオチドである
請求項15または16に記載の複合体。 - 【請求項１８】ポリアニオンがDNAまたはRNAである請求
項17に記載の複合体。 - 【請求項１９】ポリアニオンがポリペプチドである請求
項15または16に記載の複合体。 - 【請求項２０】脂質が請求項14に記載の化合物あるいは
その光学異性体である請求項15〜19のいずれかに記載の
複合体。 - 【請求項２１】ポリアニオン、ポリカチオン及び少なく
とも一種の請求項１〜14のいずれかに記載の化合物から
なるポリアニオン−ポリカチオン性脂質三元複合体。 - 【請求項２２】正の全電荷あるいは正味の電荷を有する
請求項21に記載の複合体。 - 【請求項２３】ポリアニオンがポリヌクレオチドである
請求項21または22に記載の複合体。 - 【請求項２４】ポリアニオンがDNAまたはRNAである請求
項22に記載の複合体。 - 【請求項２５】ポリカチオンがポリペプチドである請求
項21〜24のいずれかに記載の複合体。 - 【請求項２６】ポリペプチドが以下のアミノ酸配列 プロタミン配列、 ヒストン配列 の少なくとも一種を含む請求項25に記載の複合体。
- 【請求項２７】脂質が請求項14に記載の化合物あるいは
その光学異性体である請求項21〜26のいずれかに記載の
複合体。 - 【請求項２８】少なくとも一種の正の荷電を有する請求
項１〜14のいずれかに記載の化合物あるいはそのような
化合物の少なくとも一種を含む組成物をポリアニオンと
接触させる、請求項15〜20のいずれかに記載の複合体の
製造方法。 - 【請求項２９】ポリアニオンをポリカチオンと接触さ
せ、生成するポリアニオン−ポリカチオン性複合体を少
なくとも一種の正の荷電を有する請求項１〜14のいずれ
かに記載の化合物あるいはその化合物を含む組成物と接
触させる、請求項21〜27のいずれかに記載の複合体の製
造方法。 - 【請求項３０】少なくとも一種の請求項１〜14のいずれ
かに記載の化合物あるいはそのような化合物の少なくと
も一種を含む組成物を使用して製造されたリポソーム。 - 【請求項３１】少なくとも一種の生物活性物質、及び 少なくとも一種の請求項１〜14のいずれかに記載の化合
物を含む脂質成分を含むリポソーム製剤。 - 【請求項３２】生物活性物質が10重量％までの量で存在
する請求項31に記載のリポソーム製剤。 - 【請求項３３】脂質成分が１〜20重量％までの量で存在
する請求項31または32に記載のリポソーム製剤。 - 【請求項３４】脂質成分中の前記化合物が前記成分の１
％〜100％を構成する請求項31〜33のいずれかに記載の
リポソーム製剤。 - 【請求項３５】生物活性物質が薬剤である請求項31〜34
のいずれかに記載のリポソーム製剤。 - 【請求項３６】ポリアニオンまたはポリカチオンを生物
膜を通して輸送する方法（但し、人体への適用を除く）
であって、少なくとも一種の請求項１〜14のいずれかに
記載の化合物を使用してポリアニオンまたはポリカチオ
ンを複合化し、形成された複合体を前記膜と接触させ
る、前記方法。 - 【請求項３７】前記輸送が、ポリアニオンまたはポリカ
チオンを細胞中に導入するためのものであり、かつ、細
胞を複合体とインキュベートする、請求項36に記載の方
法。 - 【請求項３８】複合体が正の全電荷あるいは正味の電荷
を有する請求項36または37に記載の方法。 - 【請求項３９】複合体が請求項15〜20のいずれかに従っ
て形成された複合体である請求項35〜37のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項４０】複合体が請求項21〜27のいずれかに従っ
て形成された複合体である請求項36〜38のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項４１】接触がin vitroで行われる請求項36〜40
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４２】接触がin vivoで行われる請求項36〜40
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４３】生物活性物質を生物膜を通して輸送する
方法（但し、人体への適用を除く）であって、少なくと
も一種の請求項１〜14のいずれかに記載の化合物及び生
物活性物質からリポソームを形成し、このリポソームを
前記膜と接触させる前記方法。 - 【請求項４４】前記輸送が、生物活性物質を細胞中に導
入するためのものであり、かつ、細胞をリポソームとイ
ンキュベートする、請求項43に記載の方法。 - 【請求項４５】生物活性物質が薬剤である請求項43また
は44に記載の方法。 - 【請求項４６】接触がin vitroで行われる請求項43〜45
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４７】接触がin vivoで行われる請求項43〜45
のいずれかに記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| PCT/EP1997/000629 WO1997030024A2 (de) | 1996-02-13 | 1997-02-12 | Lipidverbindungen und deren verwendung z.b. in liposomen |
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|---|---|---|---|
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| DE (2) | DE19605175A1 (ja) |
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| ES (1) | ES2183133T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US20050074747A1 (en) * | 2000-09-08 | 2005-04-07 | Wadih Arap | Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands (brasil) |
| US7452964B2 (en) | 2001-09-07 | 2008-11-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues |
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| US20040048243A1 (en) * | 2001-09-07 | 2004-03-11 | Wadih Arap | Methods and compositions for in vitro targeting |
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