JP3516682B2 - アミノ酸輸送体，プラスミド，細菌，酵母菌および輸送体を有する植物のｄｎａ配列およびその使用 - Google Patents
アミノ酸輸送体，プラスミド，細菌，酵母菌および輸送体を有する植物のｄｎａ配列およびその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、アミノ酸輸送体のコーディング領域を有す
るDNA配列、該DNA配列の植物ゲノム中への導入が、形質
転換された植物、プラスミド、細菌、酵母菌および該DN
A配列を有する植物中の代謝物の輸送を改善するDNA配
列、並びにその使用に関する。
るDNA配列、該DNA配列の植物ゲノム中への導入が、形質
転換された植物、プラスミド、細菌、酵母菌および該DN
A配列を有する植物中の代謝物の輸送を改善するDNA配
列、並びにその使用に関する。
多くの植物種について、細胞壁を通過して師部へ、エ
ネルギーの豊富な化合物を運搬することが、細胞中いた
るところで行われることは知られている。植物細胞壁を
通過してアミノ酸を浸透させる輸送体分子は、知られて
いない。
ネルギーの豊富な化合物を運搬することが、細胞中いた
るところで行われることは知られている。植物細胞壁を
通過してアミノ酸を浸透させる輸送体分子は、知られて
いない。
細菌の場合、多数のアミノ酸輸送系が特徴付けられて
いた。芳香族アミノ酸については、フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの１つを輸送することが
でき、他方、他のものは、個々のアミノ酸について特異
性である５個の異なる輸送体が記載されていた。（Sars
ero他、1991年、J Bacteriol第173巻：第3231〜3234頁
を見よ）。一定速度の輸送過程は、特異的輸送がより少
ない効率であることを示している。多数の輸送体蛋白質
については、相応する遺伝子がクローン化されていた。
このことは、発現ベクター中での挿入断片としてのDNA
フラグメントを用いる形質転換後にその輸送能力のため
に選択されていた輸送欠失突然変異体を用いて達成され
た。（ワラース（Wallace）他、1990年、J Bacteriol第
172巻:3214〜3220頁を見よ）。前記突然変異体は、該突
然変異体が、アミノ酸の毒性類似体を取り込むことはで
きず、従って傷つけられることはないので、該アミノ酸
の毒性類似体の存在下での成長のためのその能力に応じ
て選択されていた。
いた。芳香族アミノ酸については、フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの１つを輸送することが
でき、他方、他のものは、個々のアミノ酸について特異
性である５個の異なる輸送体が記載されていた。（Sars
ero他、1991年、J Bacteriol第173巻：第3231〜3234頁
を見よ）。一定速度の輸送過程は、特異的輸送がより少
ない効率であることを示している。多数の輸送体蛋白質
については、相応する遺伝子がクローン化されていた。
このことは、発現ベクター中での挿入断片としてのDNA
フラグメントを用いる形質転換後にその輸送能力のため
に選択されていた輸送欠失突然変異体を用いて達成され
た。（ワラース（Wallace）他、1990年、J Bacteriol第
172巻:3214〜3220頁を見よ）。前記突然変異体は、該突
然変異体が、アミノ酸の毒性類似体を取り込むことはで
きず、従って傷つけられることはないので、該アミノ酸
の毒性類似体の存在下での成長のためのその能力に応じ
て選択されていた。
相応する相補性研究は、真核性の酵母菌、サッカロミ
セス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisiae）を用
いて実施されていた。タナカ（Tanaka）およびフィンク
（Fink）（1985年、Gene第38巻：第205〜214頁）は、突
然変異体の相補性によって同定されたヒスチジン輸送体
を記載している。バンデンボル（Vandenbol）他（1989
年、Gene第83巻:153〜159頁）は、サッカロミセス・セ
レビシェーのためのプロリン輸送体を記載している。該
酵母菌は、プロリンのための２つの異なる輸送体を有す
る。１つの輸送体は、低い効率を有し、かつ他のアミノ
酸のために使用することもでき、もう１つの輸送体は、
プロリン特異性であり、高い親和性をもって作用する。
プロリン特異性の輸送体は、put4遺伝子からコードされ
ていた。該輸送体は、6kDaの分子量を有するペプチドの
ためのオープンリーディングフレーム（open reading f
rame）を有する。該蛋白質は、12個の膜透過領域を有す
るが、しかし、分泌のための如何なるＮ−末端信号配列
をも有していない。これは、内在性膜蛋白質の典型的な
性質である。該輸送体は、酵母菌からのアルギニンおよ
びヒスチジン輸送体の同族を有するが、しかし、大腸菌
（Escherichia coli）からのプロリン輸送体の同族を有
してはいない。
セス・セレビシェー（Saccharomyces cerevisiae）を用
いて実施されていた。タナカ（Tanaka）およびフィンク
（Fink）（1985年、Gene第38巻：第205〜214頁）は、突
然変異体の相補性によって同定されたヒスチジン輸送体
を記載している。バンデンボル（Vandenbol）他（1989
年、Gene第83巻:153〜159頁）は、サッカロミセス・セ
レビシェーのためのプロリン輸送体を記載している。該
酵母菌は、プロリンのための２つの異なる輸送体を有す
る。１つの輸送体は、低い効率を有し、かつ他のアミノ
酸のために使用することもでき、もう１つの輸送体は、
プロリン特異性であり、高い親和性をもって作用する。
プロリン特異性の輸送体は、put4遺伝子からコードされ
ていた。該輸送体は、6kDaの分子量を有するペプチドの
ためのオープンリーディングフレーム（open reading f
rame）を有する。該蛋白質は、12個の膜透過領域を有す
るが、しかし、分泌のための如何なるＮ−末端信号配列
をも有していない。これは、内在性膜蛋白質の典型的な
性質である。該輸送体は、酵母菌からのアルギニンおよ
びヒスチジン輸送体の同族を有するが、しかし、大腸菌
（Escherichia coli）からのプロリン輸送体の同族を有
してはいない。
植物細胞については、タバコ懸濁液培養基についての
研究によって、アルギニン、アスパラギン、フェニルア
ラニンおよびヒスチジンの輸送が、pHおよびエネルギー
に左右されることが見出された。ロイシンの1000倍の過
剰量は、他のアミノ酸の輸送を阻害するので、従って、
全てが同じ輸送体であると仮定することができる（McDa
niel他、1982年、Plant Physio第69巻：第246〜249
頁）。LiおよびBush（1991年、Plant Physiol第96巻：
第1338〜1344頁）は、脂肪族の、中性アミノ酸につい
て、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）からの原形
質膜小胞中での２つの輸送系を決定した。一方で、アラ
ニン、メチオニン、グルタミンおよびロイシンは、それ
ぞれ互いに輸送体蛋白質の上で置き代わり、他方、イソ
ロイシン、バリンおよびトレオニンは、相互に拮抗的な
作用を有する。拮抗速度論的研究（Li ＆ Bush、1990
年、Plant Physiol第94巻：第268〜277頁）の場合、４
つの異なる輸送系が分類された。低い親和性をもって作
用する全ての中性アミノ酸のための輸送体以外に、高い
親和性のタイプが存在するが、しかし、イソロイシン、
トレオニン、バリンおよびプロリンに対する低い親和性
を有する。他の輸送体は、塩基性アミノ酸のためと同様
に酸のために存在する。
研究によって、アルギニン、アスパラギン、フェニルア
ラニンおよびヒスチジンの輸送が、pHおよびエネルギー
に左右されることが見出された。ロイシンの1000倍の過
剰量は、他のアミノ酸の輸送を阻害するので、従って、
全てが同じ輸送体であると仮定することができる（McDa
niel他、1982年、Plant Physio第69巻：第246〜249
頁）。LiおよびBush（1991年、Plant Physiol第96巻：
第1338〜1344頁）は、脂肪族の、中性アミノ酸につい
て、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）からの原形
質膜小胞中での２つの輸送系を決定した。一方で、アラ
ニン、メチオニン、グルタミンおよびロイシンは、それ
ぞれ互いに輸送体蛋白質の上で置き代わり、他方、イソ
ロイシン、バリンおよびトレオニンは、相互に拮抗的な
作用を有する。拮抗速度論的研究（Li ＆ Bush、1990
年、Plant Physiol第94巻：第268〜277頁）の場合、４
つの異なる輸送系が分類された。低い親和性をもって作
用する全ての中性アミノ酸のための輸送体以外に、高い
親和性のタイプが存在するが、しかし、イソロイシン、
トレオニン、バリンおよびプロリンに対する低い親和性
を有する。他の輸送体は、塩基性アミノ酸のためと同様
に酸のために存在する。
植物輸送体蛋白質のための輸送体分子または遺伝子
は、知られていない。
は、知られていない。
ところで、植物アミノ酸輸送体のコーディング領域を
有し、かつ該DNA配列のヌクレオチド配列中に含まれた
情報を植物ゲノム中へ組み込むことによって、新しいア
ミノ酸の輸送活性が、植物細胞中に導入できるかまたは
内在性アミノ酸輸送活性が発現できるRNAを形成できる
ようにするDNA配列が記載されている。
有し、かつ該DNA配列のヌクレオチド配列中に含まれた
情報を植物ゲノム中へ組み込むことによって、新しいア
ミノ酸の輸送活性が、植物細胞中に導入できるかまたは
内在性アミノ酸輸送活性が発現できるRNAを形成できる
ようにするDNA配列が記載されている。
アミノ輸送体という用語は、例えばアラビドプシス・
タリアーナ（Arabidopsis thaliana）からのアミノ輸送
体をコードするcDNA配列のことである。
タリアーナ（Arabidopsis thaliana）からのアミノ輸送
体をコードするcDNA配列のことである。
アミノ酸輸送体のコーディング領域の同定は、酵母菌
サッカロミセス・セレビシェーの特異性突然変異体中で
の発現を用いて輸送体分子をコードする植物DNA配列を
単離させる方法によって実施される。このためには、適
当な酵母菌突然変異体が提供されなければならず、該酵
母菌突然変異体は、輸送体分子のコーディング領域が植
物遺伝子ライブラリーから単離されなければならない物
質を取り込むことはできない。
サッカロミセス・セレビシェーの特異性突然変異体中で
の発現を用いて輸送体分子をコードする植物DNA配列を
単離させる方法によって実施される。このためには、適
当な酵母菌突然変異体が提供されなければならず、該酵
母菌突然変異体は、輸送体分子のコーディング領域が植
物遺伝子ライブラリーから単離されなければならない物
質を取り込むことはできない。
唯一の窒素源としてのプロリンまたはシトルリンを有
する培地中で成長できない突然変異体は、Jauniaux他
（（1987年）、Eur J Biochem第164巻：第601〜606頁）
によって記載されている。
する培地中で成長できない突然変異体は、Jauniaux他
（（1987年）、Eur J Biochem第164巻：第601〜606頁）
によって記載されている。
植物アミノ酸輸送体を同定するために使用することが
できる酵母菌菌株の製造のために、唯一の窒素源として
のプロリンおよび／またはシトルリンを有する培地中で
成長することができない酵母菌突然変異体は、例えば挿
入断片として、アラビドプシス・タリアーナからのcDNA
ライブラリーからのcDNAフラグメントを有するpFL61プ
ラスミドを用いて形質転換される。
できる酵母菌菌株の製造のために、唯一の窒素源として
のプロリンおよび／またはシトルリンを有する培地中で
成長することができない酵母菌突然変異体は、例えば挿
入断片として、アラビドプシス・タリアーナからのcDNA
ライブラリーからのcDNAフラグメントを有するpFL61プ
ラスミドを用いて形質転換される。
更に、ヒスチジン合成（his 4）の場合およびヒスチ
ジン取り込み（hip 1）の場合の欠失を有する二重突然
変異体JT16（Tanaka ＆ Fink、1985年、Gene第38巻:205
〜214頁）は、記載されたpFL61プラスミドを用いて形質
転換され、かつヒスチジンの添加により培地中で培養さ
れる。
ジン取り込み（hip 1）の場合の欠失を有する二重突然
変異体JT16（Tanaka ＆ Fink、1985年、Gene第38巻:205
〜214頁）は、記載されたpFL61プラスミドを用いて形質
転換され、かつヒスチジンの添加により培地中で培養さ
れる。
ところで、驚異的なことに、酵母菌細胞の形質転換の
場合に、特定の植物cDNAが、酵母菌突然変異を補足でき
ることが見出された。cDNAからのコードされた蛋白質の
性質の分析によって、該突然変異の補足について、コー
ディング領域により、広い固有のスペクトルを有する植
物アミノ酸輸送体をコードすることを示すことができ
る。（例３を見よ）。
場合に、特定の植物cDNAが、酵母菌突然変異を補足でき
ることが見出された。cDNAからのコードされた蛋白質の
性質の分析によって、該突然変異の補足について、コー
ディング領域により、広い固有のスペクトルを有する植
物アミノ酸輸送体をコードすることを示すことができ
る。（例３を見よ）。
この種のアミノ酸輸送体のコーディング領域は、例え
ば以下のヌクレオチド配列の１つによって示される： 1.配列（Seq.ID No.1）： 2.配列（Seq.ID No.2）： 形質転換された酵母菌菌株、例えば配列Seq.No.1およ
びSeq.No.2を用いて同定された本発明のDNA配列は、プ
ラスミド中に導入することができ、このことによって、
真核性細胞中での発現のための舵取り要素（steering e
lements）と結び付けることができる（例４を見よ）。
この舵取り要素は、一方では、転写プロモータであり、
他方では、転写ターミネーターである。該プラスミドを
用いた場合、真核性細胞は、細胞中でのアミノ酸輸送体
の合成を可能にする翻訳可能なmRNAの発現を意図するか
または細胞中での内在性アミノ酸輸送体の合成を阻止す
る翻訳不可能なRNAの発現を意図して、形質転換させる
ことができる。植物アミノ酸輸送体の本発明の配列に相
応するRNAの発現の場合、植物酸代謝物の変性は、全体
的な窒素代謝物と同様に可能であり、その経済的重要性
は明白である。窒素は、主として成長を制限を担う栄養
素である。生殖系列の存続能力並びに種子の発芽能力
は、貯蔵組織の窒素含量に直接的に左右される。高い蛋
白質含量を有する高い価値の食物材料の形成は、十分な
窒素供給に左右される。窒素は殊にアミノ酸の形で輸送
される。従って、植物の収穫された部分へのアミノ酸の
運搬の改善は、農作物の収穫量を増大させることができ
る。個々の器官中でアミノ酸を吸収させる方法は、利用
過程による要求のために、少量の窒素を含有するような
器官、例えば、澱粉の生産のために成長させられるジャ
ガイモを質的に改善させる。この他にも、個々の組織、
例えば葉の成長を緩慢にし、他方、収穫された部分の成
長を増大させることによる完全植物の変性がある。これ
については、１つは、貯蔵物質の増大された形成を生じ
る栽培植物の栄養期の延長が想像できる。
ば以下のヌクレオチド配列の１つによって示される： 1.配列（Seq.ID No.1）： 2.配列（Seq.ID No.2）： 形質転換された酵母菌菌株、例えば配列Seq.No.1およ
びSeq.No.2を用いて同定された本発明のDNA配列は、プ
ラスミド中に導入することができ、このことによって、
真核性細胞中での発現のための舵取り要素（steering e
lements）と結び付けることができる（例４を見よ）。
この舵取り要素は、一方では、転写プロモータであり、
他方では、転写ターミネーターである。該プラスミドを
用いた場合、真核性細胞は、細胞中でのアミノ酸輸送体
の合成を可能にする翻訳可能なmRNAの発現を意図するか
または細胞中での内在性アミノ酸輸送体の合成を阻止す
る翻訳不可能なRNAの発現を意図して、形質転換させる
ことができる。植物アミノ酸輸送体の本発明の配列に相
応するRNAの発現の場合、植物酸代謝物の変性は、全体
的な窒素代謝物と同様に可能であり、その経済的重要性
は明白である。窒素は、主として成長を制限を担う栄養
素である。生殖系列の存続能力並びに種子の発芽能力
は、貯蔵組織の窒素含量に直接的に左右される。高い蛋
白質含量を有する高い価値の食物材料の形成は、十分な
窒素供給に左右される。窒素は殊にアミノ酸の形で輸送
される。従って、植物の収穫された部分へのアミノ酸の
運搬の改善は、農作物の収穫量を増大させることができ
る。個々の器官中でアミノ酸を吸収させる方法は、利用
過程による要求のために、少量の窒素を含有するような
器官、例えば、澱粉の生産のために成長させられるジャ
ガイモを質的に改善させる。この他にも、個々の組織、
例えば葉の成長を緩慢にし、他方、収穫された部分の成
長を増大させることによる完全植物の変性がある。これ
については、１つは、貯蔵物質の増大された形成を生じ
る栽培植物の栄養期の延長が想像できる。
双子葉植物および単子葉植物の遺伝子変性の過程は既
に知られている（例えば、Gasser,C.S.、Fraley,R.T.、
1989年、Science第244巻：第1293〜1299頁;Potrykus、1
991年、Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol第42
巻：第205〜225頁を見よ）。植物中での発現のために
は、コーディング配列は、転写調節要素と結合しなけれ
ばならない。プロモーターと呼称されるこの種の要素
は、公知である（欧州特許第375091号明細書）。
に知られている（例えば、Gasser,C.S.、Fraley,R.T.、
1989年、Science第244巻：第1293〜1299頁;Potrykus、1
991年、Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol第42
巻：第205〜225頁を見よ）。植物中での発現のために
は、コーディング配列は、転写調節要素と結合しなけれ
ばならない。プロモーターと呼称されるこの種の要素
は、公知である（欧州特許第375091号明細書）。
更に、このコーディング領域は、正しく転写させるこ
とができる転写終結信号を提供しなければならない。ま
た、この種の要素は記載されている（Gielen他、1989
年、EMBO J第８巻：第23〜29頁を見よ）。転写開始領域
は、異種および／または異型であると同様に天然および
／または同類の双方であることができる。望ましい場合
には、終結領域は、互いに交換可能である。転写開始領
域および終結領域のDNA配列は、合成により製造できる
かまたは天然により得ることができるかまたは合成DNA
および天然DNA成分の混合物から得ることができる。よ
り高度な植物中への異種遺伝子の導入のためには、E.co
liのための複製信号および形質転換された細胞を選択で
きるようにする遺伝マーカーを含有する多数のクローニ
ングベクターが利用できる。この種のベクターの例は、
pBR322、pUC−列、M13mp−列、pACYC184等である。植物
中への望ましい遺伝子の導入方法に応じて、他のDNA配
列は適当である。Ti−プラスミドおよびRi−プラスミド
が、例えば植物細胞の形質転換に使用されなければなら
ない場合には、Ti−プラスミドおよびRi−プラスミド
Ｔ−DNAの少なくとも右側境界で、しかししばしば、右
側境界および左側境界の双方で、フランキング領域とし
て、導入されるべき遺伝子に結び付けられている。植物
細胞の形質転換のためのＴ−DNAの使用は、集中的に研
究され、欧州特許第120516号明細書;Hoekama:The Binar
y Plant Vector System、Offset−drukkerij Kanters
B.V.Alblasserdam、（1985年）、第Ｖ章;Fraley他、Cri
t.Rev.Plant Sci.、第４巻：第１〜46頁およびAn他、
（1985年）EMBO J.第４巻：第277〜287頁に詳細に記載
されている。一度、導入されたDNAは、ゲノム中に組み
込まれ、規定通りに、該ゲノム中に安定し、かつまた原
型の形質転換細胞の子孫中に残る。一般に、形質転換さ
れた植物細胞中での生物致死剤または抗生物質、例えば
カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシ
ンまたはホスフィノトリシン等に抗する耐性を誘導する
選択マーカーを有する。従って、採用された個々のマー
カーは、導入されたDNAを欠失する細胞から形質転換さ
れた細胞を選択できるようにしなければならない。
とができる転写終結信号を提供しなければならない。ま
た、この種の要素は記載されている（Gielen他、1989
年、EMBO J第８巻：第23〜29頁を見よ）。転写開始領域
は、異種および／または異型であると同様に天然および
／または同類の双方であることができる。望ましい場合
には、終結領域は、互いに交換可能である。転写開始領
域および終結領域のDNA配列は、合成により製造できる
かまたは天然により得ることができるかまたは合成DNA
および天然DNA成分の混合物から得ることができる。よ
り高度な植物中への異種遺伝子の導入のためには、E.co
liのための複製信号および形質転換された細胞を選択で
きるようにする遺伝マーカーを含有する多数のクローニ
ングベクターが利用できる。この種のベクターの例は、
pBR322、pUC−列、M13mp−列、pACYC184等である。植物
中への望ましい遺伝子の導入方法に応じて、他のDNA配
列は適当である。Ti−プラスミドおよびRi−プラスミド
が、例えば植物細胞の形質転換に使用されなければなら
ない場合には、Ti−プラスミドおよびRi−プラスミド
Ｔ−DNAの少なくとも右側境界で、しかししばしば、右
側境界および左側境界の双方で、フランキング領域とし
て、導入されるべき遺伝子に結び付けられている。植物
細胞の形質転換のためのＴ−DNAの使用は、集中的に研
究され、欧州特許第120516号明細書;Hoekama:The Binar
y Plant Vector System、Offset−drukkerij Kanters
B.V.Alblasserdam、（1985年）、第Ｖ章;Fraley他、Cri
t.Rev.Plant Sci.、第４巻：第１〜46頁およびAn他、
（1985年）EMBO J.第４巻：第277〜287頁に詳細に記載
されている。一度、導入されたDNAは、ゲノム中に組み
込まれ、規定通りに、該ゲノム中に安定し、かつまた原
型の形質転換細胞の子孫中に残る。一般に、形質転換さ
れた植物細胞中での生物致死剤または抗生物質、例えば
カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシ
ンまたはホスフィノトリシン等に抗する耐性を誘導する
選択マーカーを有する。従って、採用された個々のマー
カーは、導入されたDNAを欠失する細胞から形質転換さ
れた細胞を選択できるようにしなければならない。
植物宿主細胞中へのDNAの導入のために、アグロバク
テリア（Agrobacteria）を用いる形質転換以外に、多く
の他の技術が利用できる。前記の技術には、衝撃法（ba
llistic methods）およびウイルス注射法と同様に原形
質体の融合法、DNAの微量注射法（microinjection）お
よび電気穿孔法（electroporation）が含まれる。形質
転換された材料から、完全な植物が、選択ための抗生物
質または生物致死剤を含有する適当な媒体中で再生する
ことができる。次に、生じた植物は、導入されたDNAの
存在について試験することができる。注射法および電気
穿孔法の場合のプラスミドに、特別な要求はされていな
い。単純プラスミド、例えばpUC−誘導体を使用するこ
とができる。しかしながら、完全な植物が、この種の形
質転換された細胞から再生されなければならない場合に
は、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。該
形質転換された細胞は、植物中で常法により成長する
（McCormick他、（1986年）Plant Cell Reports第５
巻：第81〜84頁も見よ）。前記植物は、正常に成長で
き、かつ同じかまたは異なる形質転換された遺伝子を有
する植物と交配されて成長できる。生じたハイブリッド
の個々のものは、相応する表現型の能力を有する。
テリア（Agrobacteria）を用いる形質転換以外に、多く
の他の技術が利用できる。前記の技術には、衝撃法（ba
llistic methods）およびウイルス注射法と同様に原形
質体の融合法、DNAの微量注射法（microinjection）お
よび電気穿孔法（electroporation）が含まれる。形質
転換された材料から、完全な植物が、選択ための抗生物
質または生物致死剤を含有する適当な媒体中で再生する
ことができる。次に、生じた植物は、導入されたDNAの
存在について試験することができる。注射法および電気
穿孔法の場合のプラスミドに、特別な要求はされていな
い。単純プラスミド、例えばpUC−誘導体を使用するこ
とができる。しかしながら、完全な植物が、この種の形
質転換された細胞から再生されなければならない場合に
は、選択可能なマーカー遺伝子の存在が必要である。該
形質転換された細胞は、植物中で常法により成長する
（McCormick他、（1986年）Plant Cell Reports第５
巻：第81〜84頁も見よ）。前記植物は、正常に成長で
き、かつ同じかまたは異なる形質転換された遺伝子を有
する植物と交配されて成長できる。生じたハイブリッド
の個々のものは、相応する表現型の能力を有する。
また、本発明のDNA配列は、プラスミド中に導入する
ことができ、このことによって、原核性細胞中での発現
のための舵取り要素と結び付けることができる。細菌か
らの真核性アミノ酸輸送体の翻訳可能なRNA配列の形成
は、原核生物および真核生物の膜構造における重大な相
違にもかかわらず、更に驚異的に原核生物が、特定の基
質のための特異性を有する真核性のアミノ酸輸送体を使
用することができることを意味する。このことは、細菌
菌株の基質と同様に、輸送体の性質の研究のために使用
することができ、細菌菌株の生産を可能にする。
ことができ、このことによって、原核性細胞中での発現
のための舵取り要素と結び付けることができる。細菌か
らの真核性アミノ酸輸送体の翻訳可能なRNA配列の形成
は、原核生物および真核生物の膜構造における重大な相
違にもかかわらず、更に驚異的に原核生物が、特定の基
質のための特異性を有する真核性のアミノ酸輸送体を使
用することができることを意味する。このことは、細菌
菌株の基質と同様に、輸送体の性質の研究のために使用
することができ、細菌菌株の生産を可能にする。
また、本発明は、本発明のプラスミドを有する細菌に
も関する。
も関する。
また、本発明のDNA配列は、原核性系または真核性系
中でのDNA配列の組換えにより、突然変異または配列変
性できるようにするプラスミド中に導入することもでき
る。こうして、アミノ酸輸送体の特異性は、変性するこ
とができる。従って、該輸送体の特異性は、変更するこ
とができる。
中でのDNA配列の組換えにより、突然変異または配列変
性できるようにするプラスミド中に導入することもでき
る。こうして、アミノ酸輸送体の特異性は、変性するこ
とができる。従って、該輸送体の特異性は、変更するこ
とができる。
また、本発明は、本発明のDNA配列を有し、かつ原核
性細胞および真核性細胞の形質転換に使用することがで
きるプラスミドの誘導体またはプラスミドの一部分に関
する。
性細胞および真核性細胞の形質転換に使用することがで
きるプラスミドの誘導体またはプラスミドの一部分に関
する。
標準的な方法を用いる場合（Sambrook他、1989年、Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、NY、USAを見よ）。
塩基交換は実施できるかまたは天然または合成の配列は
添加することができる。１つの別のアダプターまたはリ
ンカーとの結合DNAフラグメントについては、フラグメ
ント上に導入することができる。更に、適当な制限分割
側面が得られるかまたは過剰量のDNAまたは制限分割部
位を除去する操作が実施できる。挿入、欠失または置
換、例えばトランジションまたはトランスバージョンが
実施される場合、試験管内突然変異、プライマー修復、
制限または連鎖反応を使用することができる。分析の方
法については、一般に、配列分析、制限分析および他の
生化学の分子生物学的方法を使用することができる。そ
れぞれの操作後に、使用されたDNA配列は、分割するこ
とができ、かつ別のDNA配列と結合させることができ
る。それぞれのプラスミド配列は、同じプラスミドまた
は異なるプラスミド中でクローン化することができる。
lecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、Cold
Spring Harbor Laboratory Press、NY、USAを見よ）。
塩基交換は実施できるかまたは天然または合成の配列は
添加することができる。１つの別のアダプターまたはリ
ンカーとの結合DNAフラグメントについては、フラグメ
ント上に導入することができる。更に、適当な制限分割
側面が得られるかまたは過剰量のDNAまたは制限分割部
位を除去する操作が実施できる。挿入、欠失または置
換、例えばトランジションまたはトランスバージョンが
実施される場合、試験管内突然変異、プライマー修復、
制限または連鎖反応を使用することができる。分析の方
法については、一般に、配列分析、制限分析および他の
生化学の分子生物学的方法を使用することができる。そ
れぞれの操作後に、使用されたDNA配列は、分割するこ
とができ、かつ別のDNA配列と結合させることができ
る。それぞれのプラスミド配列は、同じプラスミドまた
は異なるプラスミド中でクローン化することができる。
また、本発明のDNA配列およびプラスミドの誘導体ま
たは一部は、原核性細胞および真核性細胞の形質転換に
使用することもできる。更に、本発明のDNA配列は、標
準的な方法により、種々の種の植物のゲノム上の同じ配
列の単離のために使用することができ、該配列は、アミ
ノ酸または他のオリゴ糖輸送体分子のためにもコードす
る。前記配列を用いて、形質転換のための構造体を得る
ことができ、該構造体は、形質転換された植物中の植物
細胞の輸送過程を変更する。
たは一部は、原核性細胞および真核性細胞の形質転換に
使用することもできる。更に、本発明のDNA配列は、標
準的な方法により、種々の種の植物のゲノム上の同じ配
列の単離のために使用することができ、該配列は、アミ
ノ酸または他のオリゴ糖輸送体分子のためにもコードす
る。前記配列を用いて、形質転換のための構造体を得る
ことができ、該構造体は、形質転換された植物中の植物
細胞の輸送過程を変更する。
記載されたDNA配列を特異性にするために、まず、植
物型の遺伝子中の内容または植物型中での遺伝子の発現
を代表する遺伝子ライブラリーが得られなければならな
い。前者はゲノムライブラリーであり、他方、後者は、
cDNAライブラリーである。これらから、記載された配列
は、試料としての本発明のDNA配列を用いて単離すると
ができる。一度、記載された遺伝子は、同定され、かつ
単離され、前記配列の決定およびこの配列からコードさ
れた蛋白質の性質の分析は可能である。
物型の遺伝子中の内容または植物型中での遺伝子の発現
を代表する遺伝子ライブラリーが得られなければならな
い。前者はゲノムライブラリーであり、他方、後者は、
cDNAライブラリーである。これらから、記載された配列
は、試料としての本発明のDNA配列を用いて単離すると
ができる。一度、記載された遺伝子は、同定され、かつ
単離され、前記配列の決定およびこの配列からコードさ
れた蛋白質の性質の分析は可能である。
本発明の基礎を形成する実施例を理解するために、前
記試験のために必要かつそれ自体知られている全ての方
法は、まず第一に記載される： 1.クローニング過程 E.coli中でのクローニングのために、ベクターpBlues
criptSK（Short他、1988年、Nucl Acids Res第16巻：第
7583〜7600頁）を使用した。
記試験のために必要かつそれ自体知られている全ての方
法は、まず第一に記載される： 1.クローニング過程 E.coli中でのクローニングのために、ベクターpBlues
criptSK（Short他、1988年、Nucl Acids Res第16巻：第
7583〜7600頁）を使用した。
酵母菌の形質転換のために、ベクターpFL61（Minet
＆ Lacroute、1990年、Curr Genet第18巻：第287〜291
頁）を使用した。
＆ Lacroute、1990年、Curr Genet第18巻：第287〜291
頁）を使用した。
植物形質転換のために、二分ベクターpBIN−Hyg中の
遺伝子構造体をクローン化した。
遺伝子構造体をクローン化した。
2.細菌菌株および酵母菌菌株
pBluescriptSKベクター並びにPBinAR構造体のため
に、E.coli菌株XL1blue（Bullock他、1987年、Biotechn
iques、第５巻、第376〜378頁）を使用した。
に、E.coli菌株XL1blue（Bullock他、1987年、Biotechn
iques、第５巻、第376〜378頁）を使用した。
酵母菌中のcDNAライブラリーの発現のための出発菌株
として、酵母菌菌株22574d（Jauniaux他、1987年、Eur
J Biochm第164巻：第601〜606頁）を使用した。
として、酵母菌菌株22574d（Jauniaux他、1987年、Eur
J Biochm第164巻：第601〜606頁）を使用した。
ジャガイモ植物中のプラスミドの形質転換を、アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）菌株LBA4404（Bevan（1984年）Nucl.Acids Re
s第12巻：第8711〜8720頁）を用いて実施した。
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）菌株LBA4404（Bevan（1984年）Nucl.Acids Re
s第12巻：第8711〜8720頁）を用いて実施した。
3.アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換
アグロバクテリア中のDNAの転移を、Hoefgen ＆ Will
mitzerの方法（1988年、Nucleic Acids Res第16巻：第9
877頁）による直接的な形質転換によって実施した。形
質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNAを、B
irnboimおよびDolyの方法（1979年）（Nucl Acids Res
第７巻：第1513〜1523頁）により単離し、かつ適当な制
限分割後にゲル電気泳動によって分析した。
mitzerの方法（1988年、Nucleic Acids Res第16巻：第9
877頁）による直接的な形質転換によって実施した。形
質転換されたアグロバクテリウムのプラスミドDNAを、B
irnboimおよびDolyの方法（1979年）（Nucl Acids Res
第７巻：第1513〜1523頁）により単離し、かつ適当な制
限分割後にゲル電気泳動によって分析した。
4.植物形質転換
滅菌されたジャガイモ培養基の、メスで傷つけられた
10枚の小さな葉を、選択しながら一晩培養基を成長させ
たアグロバクテリウム・ツメファシエンス30〜50μｌを
含有し、２％のスクロースを有するMS培地10ml中に置い
た。３〜５分間の穏和な振盪後に、葉を、1.6％のグル
コース、ゼアチン リボース2mg/l、酢酸ナフチル0.02m
g/l、ジベレリン酸0.02mg/l、クラホラン（claforan）5
00mg/l、カナマイシン50mg/lおよび0.8％のバクト寒天
（bacto agar）のMS培地の上に置いた。25℃および3000
ルクスで一週間の培養後に、培地中のクラホラン濃度
は、半減した。
10枚の小さな葉を、選択しながら一晩培養基を成長させ
たアグロバクテリウム・ツメファシエンス30〜50μｌを
含有し、２％のスクロースを有するMS培地10ml中に置い
た。３〜５分間の穏和な振盪後に、葉を、1.6％のグル
コース、ゼアチン リボース2mg/l、酢酸ナフチル0.02m
g/l、ジベレリン酸0.02mg/l、クラホラン（claforan）5
00mg/l、カナマイシン50mg/lおよび0.8％のバクト寒天
（bacto agar）のMS培地の上に置いた。25℃および3000
ルクスで一週間の培養後に、培地中のクラホラン濃度
は、半減した。
寄託物
次のプラスミドおよび酵母菌菌株は、1992年12月６日
にドイツ連邦共和国のブラウンシュバイク（Braunschwe
ig）在のドイッチェン ザンムルング フォン ミクロ
オルガニスメン（Deutschen Sammlung von Mikroorgans
ismen）（DSM）に寄託されていた（寄託番号）： プラスミド pPP1−20 （DSM 7129） プラスミド pBinPPP1−20 （DSM7130） 図面について 図１は、配列Seq−ID No.1を有するプラスミドpPP1−20
を示す。細く描かれた線は、pBluescriptSKからの配列
に相応する。太く描かれた線は、cDNA挿入物を表わす。
該挿入物の分割位置が示されている。
にドイツ連邦共和国のブラウンシュバイク（Braunschwe
ig）在のドイッチェン ザンムルング フォン ミクロ
オルガニスメン（Deutschen Sammlung von Mikroorgans
ismen）（DSM）に寄託されていた（寄託番号）： プラスミド pPP1−20 （DSM 7129） プラスミド pBinPPP1−20 （DSM7130） 図面について 図１は、配列Seq−ID No.1を有するプラスミドpPP1−20
を示す。細く描かれた線は、pBluescriptSKからの配列
に相応する。太く描かれた線は、cDNA挿入物を表わす。
該挿入物の分割位置が示されている。
図２は、培地からの14C−プロリンの取り込みを示す。
なし ＝競合体（competitor）を用いない取り込み
の期間 プロリン ＝標識されていないプロリンの４倍の過剰量
を用いる期間 シトルリン＝標識されていないシトルリンの４倍の過剰
量を用いる期間 GABA ＝γ−アミノブチル酸の４倍の過剰量を用い
る期間 時間 ＝秒での時間 cpm ＝毎分の計数された崩壊 図３は、配列Seq−ID No.2を有するプラスミドpAAP2を
示す。細く描かれた線は、pBluescriptSKからの配列に
相応する。太く描かれた線は、cDNA挿入物を表わす。該
挿入物の分割位置が示されている。
の期間 プロリン ＝標識されていないプロリンの４倍の過剰量
を用いる期間 シトルリン＝標識されていないシトルリンの４倍の過剰
量を用いる期間 GABA ＝γ−アミノブチル酸の４倍の過剰量を用い
る期間 時間 ＝秒での時間 cpm ＝毎分の計数された崩壊 図３は、配列Seq−ID No.2を有するプラスミドpAAP2を
示す。細く描かれた線は、pBluescriptSKからの配列に
相応する。太く描かれた線は、cDNA挿入物を表わす。該
挿入物の分割位置が示されている。
図４は、酵母菌列22574::AAP2を用いる競合試験を示
し、この場合、培地からの14C標識されたＬ−プロリン
の取り込みは、他のアミノ酸またはその類縁物の４倍の
過剰量の存在下に測定される。三文字コードでのアミノ
酸の標準的な略号の代わりに、以下のものも使用され
る： Cit＝シトルリン;D−Pro＝Ｄ−プロリン;OH−Pro＝ヒド
ロキシプロリンおよびA2C＝アゼチジン−２−カルボン
酸 図５は、酵母菌列JT16::AAP2を用いる競合試験を示し、
この場合、培地からの14C標識されたＬ−ヒスチジンの
取り込みは、他のアミノ酸またはその類縁物の10倍の存
在下に測定される。三文字コードでのアミノ酸の標準的
な略号の代わりに、以下のものも使用される： Cit＝シトルリン;Orn＝オルニチン;Can＝カナバニン；
およびNH4＝アンモニウム 以下の実施例は、植物アミノ酸輸送体のクローニング
および同定並びに機能および使用を記載する。
し、この場合、培地からの14C標識されたＬ−プロリン
の取り込みは、他のアミノ酸またはその類縁物の４倍の
過剰量の存在下に測定される。三文字コードでのアミノ
酸の標準的な略号の代わりに、以下のものも使用され
る： Cit＝シトルリン;D−Pro＝Ｄ−プロリン;OH−Pro＝ヒド
ロキシプロリンおよびA2C＝アゼチジン−２−カルボン
酸 図５は、酵母菌列JT16::AAP2を用いる競合試験を示し、
この場合、培地からの14C標識されたＬ−ヒスチジンの
取り込みは、他のアミノ酸またはその類縁物の10倍の存
在下に測定される。三文字コードでのアミノ酸の標準的
な略号の代わりに、以下のものも使用される： Cit＝シトルリン;Orn＝オルニチン;Can＝カナバニン；
およびNH4＝アンモニウム 以下の実施例は、植物アミノ酸輸送体のクローニング
および同定並びに機能および使用を記載する。
例 １
植物アミノ酸輸送体のcDNAのクローニング
酵母菌菌株22574d（Jauniaux他、1987年、Eur J Bioc
hem第164巻：第601〜606頁）のプロリン輸送突然変異お
よび／またはヒスチジン合成および菌株JT16（Tanaka
＆ Fink、1985年、Gene第38頁：第205〜214頁）の輸送
突然変異の相補性について、アラビドプシス・タリアー
ナ（２葉段階）からの若い生殖系列のcDNAが、Minet（M
inet他、1992年、Plant J第２巻：第417〜422頁）によ
って利用できるようにされた酵母菌発現ベクターpFL61
（Minet ＆ Lacroute、1990年、Curr Genet第18巻：第2
87〜291頁）中で使用された。cDNA−挿入物を有するベ
クター約１μｇを、酵母菌菌株22574dおよび／またはJT
16中で、Dohmen他の方法（1991年、Yeast第７巻：第691
〜692頁）によって形質転換された。ゾル状窒素源とし
てのプロリン4mMを有する培地中またはヒスチジン6mMを
有する培地中で成長させることができた酵母菌形質転換
細胞を繁殖させた。この線から、プラスミド−DNAを、
標準的方法によって得た。特殊な突然変異を補足するこ
とができたクローン化は、cDNA挿入物の同じ制限型を有
するプラスミドを有していた。これは1.6〜1.7kbの間の
大きさで変動した。
hem第164巻：第601〜606頁）のプロリン輸送突然変異お
よび／またはヒスチジン合成および菌株JT16（Tanaka
＆ Fink、1985年、Gene第38頁：第205〜214頁）の輸送
突然変異の相補性について、アラビドプシス・タリアー
ナ（２葉段階）からの若い生殖系列のcDNAが、Minet（M
inet他、1992年、Plant J第２巻：第417〜422頁）によ
って利用できるようにされた酵母菌発現ベクターpFL61
（Minet ＆ Lacroute、1990年、Curr Genet第18巻：第2
87〜291頁）中で使用された。cDNA−挿入物を有するベ
クター約１μｇを、酵母菌菌株22574dおよび／またはJT
16中で、Dohmen他の方法（1991年、Yeast第７巻：第691
〜692頁）によって形質転換された。ゾル状窒素源とし
てのプロリン4mMを有する培地中またはヒスチジン6mMを
有する培地中で成長させることができた酵母菌形質転換
細胞を繁殖させた。この線から、プラスミド−DNAを、
標準的方法によって得た。特殊な突然変異を補足するこ
とができたクローン化は、cDNA挿入物の同じ制限型を有
するプラスミドを有していた。これは1.6〜1.7kbの間の
大きさで変動した。
例 ２
プラスミドpFL61−ppp1−20のcDNA挿入物の配列分析
22574d突然変異は、唯一の窒素源としてのプロリンを
用いて成長させることができたとしても、例１と同様の
方法で得られた酵母菌列PPP1−20から、プラスミドpFL6
1−ppp1−20を単離し、そのcDNA挿入物をNot Iフラグメ
ントとして得、かつベクターpBluescriptSK中にクロー
ン化した。こうして、プラスミドpPPP1−20が得られた
（図１を見よ）。合成オリゴヌクレオチドを用いた場
合、該挿入物を、Sanger他の方法（1977年、Proc Natl
Acad Sci USA第74巻：第5463〜5467頁）によって配列さ
せた。この配列は、上記してある。
用いて成長させることができたとしても、例１と同様の
方法で得られた酵母菌列PPP1−20から、プラスミドpFL6
1−ppp1−20を単離し、そのcDNA挿入物をNot Iフラグメ
ントとして得、かつベクターpBluescriptSK中にクロー
ン化した。こうして、プラスミドpPPP1−20が得られた
（図１を見よ）。合成オリゴヌクレオチドを用いた場
合、該挿入物を、Sanger他の方法（1977年、Proc Natl
Acad Sci USA第74巻：第5463〜5467頁）によって配列さ
せた。この配列は、上記してある。
同様の方法で、his 4/hip 1二重突然変異ではある
が、ヒスチジン添加物を有する培地中で成長させること
ができた酵母菌列から、プラスミドpFL61−aap2を、単
離し、その挿入物も、Not IフラグメントとしてpBluesc
riptSK中にクローン化した。生じたプラスミドpAAP2
を、配列させ、かつこの配列（Seq ID−No.2）は、上記
してある。該プラスミドpAAP2は、pPPP1−20（図１を見
よ）と同様の構造を有するが、挿入物Seq−No.1の代わ
りに、挿入物Seq−No.2を有する（図３を見よ）。
が、ヒスチジン添加物を有する培地中で成長させること
ができた酵母菌列から、プラスミドpFL61−aap2を、単
離し、その挿入物も、Not IフラグメントとしてpBluesc
riptSK中にクローン化した。生じたプラスミドpAAP2
を、配列させ、かつこの配列（Seq ID−No.2）は、上記
してある。該プラスミドpAAP2は、pPPP1−20（図１を見
よ）と同様の構造を有するが、挿入物Seq−No.1の代わ
りに、挿入物Seq−No.2を有する（図３を見よ）。
例 ３14
C標識された蛋白質を用いる酵母菌列PPP1−20およびA
AP2中への取り込み試験 例１と同様の方法で得られた酵母菌列22574d::PPP1−
20を、液体培地中で、培養基が対数期に達するまで成長
させた。この培養基を遠心分離後に、該細胞を洗浄し、
かつ100mmのトリス/HClpH4.5、2mMのMgCl2および0.6Mの
ソルビトール中に取り込んだ。懸濁液約100μＩを、0.5
mMのＬ−プロリンと、同じ緩衝液100μＩ中の１μCiの
14C標識されたＬ−プロリンとの溶液に添加した。標識
されたアミノ酸の取り込みを、Cirilloによって記載さ
れた方法（1989年、Meth Enzymol第174巻：第617〜622
頁）によって測定した。標識されたアミノ酸の取り込み
は、一方で、蛋白質装飾質、ベータ・ブルガリスからの
膜小胞中でのアミノ酸輸送の阻害剤であるジエチルピロ
カルボネートと一緒の同時恒温保持の場合および他方
で、他の蛋白質修飾物質と一緒の同時恒温保持の場合を
比較した。計算された還元は、表Ｉおよび／またはIII
中に示されている。輸送体の特異性が種々のアミノ酸お
よびその類縁物を用いて読み取ることができた競合試験
は、PPP1−20については表II中に、AAP2については図４
に示されている。列JT16::AAP2中へのヒスチジン取り込
みについての競合が試験された同様の試験は、例５中に
記載されている。PPP1−20についての期間は、図２中に
示されている。
AP2中への取り込み試験 例１と同様の方法で得られた酵母菌列22574d::PPP1−
20を、液体培地中で、培養基が対数期に達するまで成長
させた。この培養基を遠心分離後に、該細胞を洗浄し、
かつ100mmのトリス/HClpH4.5、2mMのMgCl2および0.6Mの
ソルビトール中に取り込んだ。懸濁液約100μＩを、0.5
mMのＬ−プロリンと、同じ緩衝液100μＩ中の１μCiの
14C標識されたＬ−プロリンとの溶液に添加した。標識
されたアミノ酸の取り込みを、Cirilloによって記載さ
れた方法（1989年、Meth Enzymol第174巻：第617〜622
頁）によって測定した。標識されたアミノ酸の取り込み
は、一方で、蛋白質装飾質、ベータ・ブルガリスからの
膜小胞中でのアミノ酸輸送の阻害剤であるジエチルピロ
カルボネートと一緒の同時恒温保持の場合および他方
で、他の蛋白質修飾物質と一緒の同時恒温保持の場合を
比較した。計算された還元は、表Ｉおよび／またはIII
中に示されている。輸送体の特異性が種々のアミノ酸お
よびその類縁物を用いて読み取ることができた競合試験
は、PPP1−20については表II中に、AAP2については図４
に示されている。列JT16::AAP2中へのヒスチジン取り込
みについての競合が試験された同様の試験は、例５中に
記載されている。PPP1−20についての期間は、図２中に
示されている。
例 ４
アミノ酸輸送体のコーディング領域の過剰発現（over−
expression）のための構造を有する植物の形質転換 挿入物として、アラビドプシスからのアミノ酸輸送体
のためのcDNAを含有するプラスミドpPPP1−20から挿入
物の内在性フラグメントを、BamH I分割後に単離し、ま
ず、酵素BamH Iを用いて線状にされたpAJからの分割位
置中にクローン化した。次に、該cDNAを、EcoR I/Hind
IIIフラグメントとしてpA7から製造し、かつベクターpB
IN−HYG中にクローン化した。アグロバクテリアによる
形質転換後に、これをタバコおよびジャガイモの葉セグ
メントの感染のために挿入した。
expression）のための構造を有する植物の形質転換 挿入物として、アラビドプシスからのアミノ酸輸送体
のためのcDNAを含有するプラスミドpPPP1−20から挿入
物の内在性フラグメントを、BamH I分割後に単離し、ま
ず、酵素BamH Iを用いて線状にされたpAJからの分割位
置中にクローン化した。次に、該cDNAを、EcoR I/Hind
IIIフラグメントとしてpA7から製造し、かつベクターpB
IN−HYG中にクローン化した。アグロバクテリアによる
形質転換後に、これをタバコおよびジャガイモの葉セグ
メントの感染のために挿入した。
手を付けずに転位していないキメラ遺伝子の存在をサ
ザンブロット分析を用いて証明された10個の独立に得ら
れた形質転換細胞をアミノ酸の変更および窒素含量につ
いて試験した。この他に、アミノ酸合成、光合成率およ
び輸送を試験した。
ザンブロット分析を用いて証明された10個の独立に得ら
れた形質転換細胞をアミノ酸の変更および窒素含量につ
いて試験した。この他に、アミノ酸合成、光合成率およ
び輸送を試験した。
例 ５
酵母菌列AAP2中への14C標識されたヒスチジンの取り込
みの研究 例１と同様の方法で得られた酵母菌列JT16::AAP2を、
液体培地中で、培養基が対数期に達するまで成長させ
た。この培養基を遠心分離後に、該細胞を洗浄し、かつ
100mmのトリス/HClpH4.5、2mmのMgCl2および0.6Mのソル
ビトール中に取り込んだ。懸濁液約100mlを、0.5mmのＬ
−ヒスチジンと、同じ緩衝液100μＩ中の１μCiの14C標
識されたＬ−ヒスチジンとの溶液に添加した。標識され
たアミノ酸の取り込みを、Cirilloによって記載された
方法（1989年、Meth Enzymol第174巻：第617〜622頁）
によって測定した。標識されたアミノ酸の取り込みを、
競合試験の場合に、10倍の過剰量での異なるアミノ酸お
よび類縁物からのものと比較した。この関係は、図５中
に示されている。
みの研究 例１と同様の方法で得られた酵母菌列JT16::AAP2を、
液体培地中で、培養基が対数期に達するまで成長させ
た。この培養基を遠心分離後に、該細胞を洗浄し、かつ
100mmのトリス/HClpH4.5、2mmのMgCl2および0.6Mのソル
ビトール中に取り込んだ。懸濁液約100mlを、0.5mmのＬ
−ヒスチジンと、同じ緩衝液100μＩ中の１μCiの14C標
識されたＬ−ヒスチジンとの溶液に添加した。標識され
たアミノ酸の取り込みを、Cirilloによって記載された
方法（1989年、Meth Enzymol第174巻：第617〜622頁）
によって測定した。標識されたアミノ酸の取り込みを、
競合試験の場合に、10倍の過剰量での異なるアミノ酸お
よび類縁物からのものと比較した。この関係は、図５中
に示されている。
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
A01H 5/00
C12N 1/19
C12N 1/21
C12N 5/10
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (10)
- 【請求項１】植物アミノ酸輸送体のコーディング領域を
有するDNAにおいて、 （ａ）Seq−ID No.1又はSeq−ID No.2で記載したヌクレ
オチド分子； からなることを特徴とする、植物アミノ酸輸送体のコー
ディング領域を有するDNA。 - 【請求項２】植物アミノ酸輸送体のコーディング領域を
有するDNAにおいて、 （ｂ）Seq−ID No.1又はSeq−ID No.2で記載したアミノ
酸配列をエンコードするヌクレオチド分子；又は （ｃ）Seq−ID No.1又はSeq−ID No.2のアミノ酸配列を
エンコードするヌクレオチド配列において単独アミノ酸
が交換、欠失及び／又は挿入されたヌクレオチド配列を
有し、植物アミノ酸輸送体の活性を有する蛋白質をエン
コードするヌクレオチド分子 からなることを特徴とする、植物アミノ酸輸送体のコー
ディング領域を有するDNA。 - 【請求項３】植物アミノ酸輸送体のコーディング配列か
らなるプラスミドにおいて、（ａ）、（ｂ）及び／又は
（ｃ）： （ａ）請求項１又は２に記載のDNA; （ｂ）プラスミドpPPP1−20（DSM7129）； （ｃ）プラスミドpBin PPP1−20（DSM7130） によって特徴付けられる、植物アミノ酸輸送体のコーデ
ィング配列からなるプラスミド。 - 【請求項４】請求項１又は２に記載のDNAまたは請求項
３に記載のプラスミドを細胞中に導入する工程を含むこ
とを特徴とする、細胞の形質転換法。 - 【請求項５】請求項１又は２に記載の組み換えDNA又は
請求項３に記載のプラスミドを含むことを特徴とする、
遺伝子導入双子葉植物細胞または双子葉植物。 - 【請求項６】請求項１又は２に記載のDNAまたは請求項
３に記載のプラスミドを含むことを特徴とする、細菌細
胞。 - 【請求項７】酵母菌菌株において、請求項１又は２に記
載のDNAまたは請求項３に記載のプラスミドを含むこと
を特徴とする、酵母菌菌株。 - 【請求項８】アミノ酸輸送体をエンコードする植物のゲ
ノムからのヌクレオチド配列を単離する方法において、
請求項１又は２に記載のDNAまたは請求項３に記載のプ
ラスミドを用いる工程を含むことを特徴とする、ヌクレ
オチド配列の単離法。 - 【請求項９】原核細胞および／または真核細胞中でのア
ミノ酸輸送体の合成を可能にする翻訳可能なmRNAの発現
のための方法において、本質的に、前記細胞中への請求
項１又は２に記載のDNAまたは請求項３に記載のプラス
ミドの組み込み工程を含むことを特徴とする、原核細胞
および／または真核細胞中でのアミノ酸輸送体の合成を
可能にする翻訳可能なmRNAの発現法。 - 【請求項１０】変化したアミノ酸および窒素代謝物を有
する双子葉植物細胞または双子葉植物を得るための方法
において、前記双子葉植物細胞または双子葉植物中への
請求項１または２に記載のDNAまたは請求項３記載のプ
ラスミドの導入工程を含むことを特徴とする、変化した
アミノ酸および窒素代謝物を有する双子葉植物細胞また
は双子葉植物を得る方法。
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| DE4222315A1 (de) | 1992-07-05 | 1994-01-13 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter |
| DE4343527A1 (de) * | 1993-12-16 | 1995-06-22 | Schering Ag | Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit potentieller herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung mittels pflanzlicher Transporterproteine, Verwendung der Transporterproteine sowie Substanzen mit herbizider und wachstumsregulatorischer Wirkung |
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| DE19907209A1 (de) * | 1999-02-19 | 2000-08-24 | Frommer Wolf Bernd | Pflanzlicher Nukleobasentransporter |
| AU6795000A (en) | 1999-08-18 | 2001-03-13 | Curagen Corporation | Defense-related signaling genes and methods of use |
| US7413536B1 (en) | 1999-09-14 | 2008-08-19 | Xenoport, Inc. | Substrates and screening methods for transport proteins |
| US6770750B2 (en) * | 1999-11-18 | 2004-08-03 | Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. | Small and cysteine rich antifungal defensin and thionin-like protein genes highly expressed in the incompatible interaction |
| US7741049B2 (en) * | 2001-03-15 | 2010-06-22 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Analysis of agonist-activity and antagonist-activity to cytokinin receptor |
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| DE10221224A1 (de) * | 2002-05-13 | 2003-12-04 | Frommer Wolf Bernd | Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit verändertem Stofftransport |
| US20050035264A1 (en) * | 2003-01-03 | 2005-02-17 | Joel Marks | Anchor device for weak substrates |
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-
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