JP3507856B2 - Ｄｎａフラグメント、組み換えｄｎａ、形質転換植物 - Google Patents
Ｄｎａフラグメント、組み換えｄｎａ、形質転換植物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トウモロコシ、イネ等
の耐冷性品種などを作出するのに好適なＤＮＡフラグメ
ント、組み換えＤＮＡ、および形質転換植物に関するも
のである。
の耐冷性品種などを作出するのに好適なＤＮＡフラグメ
ント、組み換えＤＮＡ、および形質転換植物に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】植物の耐冷性と、生体膜を構成する脂肪
酸の不飽和度との間には有為な相関があることが、これ
までの研究で指摘されてきた。本発明者は、形質転換タ
バコ植物体において、シロイヌナズナ由来の脂肪酸不飽
和化酵素遺伝子ＦＡＤ７を高発現させることにより、低
温に対して一層耐性となることを、実験的に示した。
酸の不飽和度との間には有為な相関があることが、これ
までの研究で指摘されてきた。本発明者は、形質転換タ
バコ植物体において、シロイヌナズナ由来の脂肪酸不飽
和化酵素遺伝子ＦＡＤ７を高発現させることにより、低
温に対して一層耐性となることを、実験的に示した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】一方、植物細胞で、あ
る蛋白質を生産しようとする際には、従来は構成的に発
現し、かつプロモーター活性の強いものが使われてき
た。こうしたプロモーターは絶えず機能するため、植物
にとっての経済学上は不利益なことも起こっていた。
る蛋白質を生産しようとする際には、従来は構成的に発
現し、かつプロモーター活性の強いものが使われてき
た。こうしたプロモーターは絶えず機能するため、植物
にとっての経済学上は不利益なことも起こっていた。
【０００４】例えば、植物に耐冷性を付与するようなタ
ンパク質を形質発現させる場合にも、構成的プロモータ
ーを用いているので、植物は、常温時においては不必要
な、耐冷性を付与するための遺伝子の発現を強いられる
結果となり、好ましいことではない。
ンパク質を形質発現させる場合にも、構成的プロモータ
ーを用いているので、植物は、常温時においては不必要
な、耐冷性を付与するための遺伝子の発現を強いられる
結果となり、好ましいことではない。
【０００５】このような背景から、部位特異的、誘導的
プロモーターの開発が求められていた。特に、脂肪酸不
飽和化酸素遺伝子やその他の耐冷性に寄与するタンパク
質遺伝子等を低温誘導的に発現する育種中間母本を作出
するために、あるいは不安定機能タンパク質を、植物細
胞を用いて生産できるようにするために、特定遺伝子の
発現を低温時にのみ強化する必要がある。
プロモーターの開発が求められていた。特に、脂肪酸不
飽和化酸素遺伝子やその他の耐冷性に寄与するタンパク
質遺伝子等を低温誘導的に発現する育種中間母本を作出
するために、あるいは不安定機能タンパク質を、植物細
胞を用いて生産できるようにするために、特定遺伝子の
発現を低温時にのみ強化する必要がある。
【０００６】本発明の課題は、脂肪酸不飽和化酸素遺伝
子、その他の耐冷性に寄与するタンパク質遺伝子の発現
を、低温に応答して強化できるようなプロモーターを提
供することである。
子、その他の耐冷性に寄与するタンパク質遺伝子の発現
を、低温に応答して強化できるようなプロモーターを提
供することである。
【０００７】また、本発明の課題は、前記のプロモータ
ーを利用して、耐冷性品種を作出できるようにすること
である。また、本発明の課題は、植物細胞における低温
時特異的な機能タンパク質の誘導生産系に対して、本プ
ロモーターを利用することである。
ーを利用して、耐冷性品種を作出できるようにすること
である。また、本発明の課題は、植物細胞における低温
時特異的な機能タンパク質の誘導生産系に対して、本プ
ロモーターを利用することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）または
（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、ＤＮ
Ａフラグメントに係るものである。 （ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−３７９４で表される塩基配列 （ｂ）（ａ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、ＤＮ
Ａフラグメントに係るものである。 （ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−３７９４で表される塩基配列 （ｂ）（ａ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
【０００９】また、本発明は、前記のＤＮＡフラグメン
トを含む組み換えＤＮＡ、および、前記のＤＮＡフラグ
メントを含む組み換えＤＮＡが導入されている、耐冷性
を有する形質転換植物に係るものである。
トを含む組み換えＤＮＡ、および、前記のＤＮＡフラグ
メントを含む組み換えＤＮＡが導入されている、耐冷性
を有する形質転換植物に係るものである。
【００１０】また、本発明は、低温応答性のプロモータ
ー活性を示す、（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列から
なることを特徴とする、ＤＮＡフラグメントに係るもの
である。 （ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２７９７で表される塩基配列 （ｄ）（ｃ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
ー活性を示す、（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列から
なることを特徴とする、ＤＮＡフラグメントに係るもの
である。 （ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２７９７で表される塩基配列 （ｄ）（ｃ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
【００１１】また、本発明は、（ｃ）または（ｄ）に示
す塩基配列からなるＤＮＡフラグメントを含む組み換え
ＤＮＡ、および、この組み換えＤＮＡが導入されてい
る、低温に応答して特定のタンパク質を形質発現する形
質転換植物に係るものである。
す塩基配列からなるＤＮＡフラグメントを含む組み換え
ＤＮＡ、および、この組み換えＤＮＡが導入されてい
る、低温に応答して特定のタンパク質を形質発現する形
質転換植物に係るものである。
【００１２】また、本発明は、低温応答性のプロモータ
ー活性を示す、以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配
列からなることを特徴とする、ＤＮＡフラグメントに係
るものである。 （ｅ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２２７１で表される塩基配列 （ｆ）（ｅ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
ー活性を示す、以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配
列からなることを特徴とする、ＤＮＡフラグメントに係
るものである。 （ｅ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２２７１で表される塩基配列 （ｆ）（ｅ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列
【００１３】イネ低温誘導性遺伝子ｌｉｐ１９及びトウ
モロコシ低温誘導性遺伝子ｍｌｉｐ１５は、ＤＮＡ結合
因子をコードすることから、低温ストレス時に誘導ある
いは抑制される他の遺伝子群の転写を左右する遺伝子で
はないかと考えられている。本発明者は、トウモロコシ
ｍｌｉｐ１５遺伝子の低温誘導性プロモーターの機能単
位を明らかにし、かつこの機能部分が形質転換植物にお
いても機能することを明らかにした。
モロコシ低温誘導性遺伝子ｍｌｉｐ１５は、ＤＮＡ結合
因子をコードすることから、低温ストレス時に誘導ある
いは抑制される他の遺伝子群の転写を左右する遺伝子で
はないかと考えられている。本発明者は、トウモロコシ
ｍｌｉｐ１５遺伝子の低温誘導性プロモーターの機能単
位を明らかにし、かつこの機能部分が形質転換植物にお
いても機能することを明らかにした。
【００１４】本発明者は、トウモロコシｍｌｉｐ１５遺
伝子のゲノムクローンを、通常の方法により単離した。
塩基配列決定により、当該遺伝子は、イントロンを含ま
ないことが明かとなった（配列表の配列番号１を参
照）。
伝子のゲノムクローンを、通常の方法により単離した。
塩基配列決定により、当該遺伝子は、イントロンを含ま
ないことが明かとなった（配列表の配列番号１を参
照）。
【００１５】ｍｌｉｐ１５ゲノム遺伝子の２．８ｋｂの
ゲノム配列（ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡの５′−非翻訳領域
０．６ｋｂと左記配列に連なる上流の２．２ｋｂのゲノ
ム配列）と、２．２ｋｂの（２．８ｋｂゲノム断片より
上述の０．６ｋｂの５′−非翻訳領域を除いた）ゲノム
配列とを、レポーター遺伝子であるβ−グルクロニダー
ゼ遺伝子にそれぞれ連結し，各組み換えＤＮＡを構築し
た。これらの各組み換えＤＮＡを、イネはい盤に由来す
るカルスに対して、パーティクルガン装置を用いて導入
したところ、前者では低温に対する反応性が保持されて
いたが、０．６ｋｂの５′−非翻訳領域を除いた２．２
ｋｂ断片のみでは、低温反応性が失われていた。従っ
て、５′−非翻訳領域０．６ｋｂを含む２．８ｋｂ断片
に、低温応答性のプロモーター機能があることが明らか
となった。
ゲノム配列（ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡの５′−非翻訳領域
０．６ｋｂと左記配列に連なる上流の２．２ｋｂのゲノ
ム配列）と、２．２ｋｂの（２．８ｋｂゲノム断片より
上述の０．６ｋｂの５′−非翻訳領域を除いた）ゲノム
配列とを、レポーター遺伝子であるβ−グルクロニダー
ゼ遺伝子にそれぞれ連結し，各組み換えＤＮＡを構築し
た。これらの各組み換えＤＮＡを、イネはい盤に由来す
るカルスに対して、パーティクルガン装置を用いて導入
したところ、前者では低温に対する反応性が保持されて
いたが、０．６ｋｂの５′−非翻訳領域を除いた２．２
ｋｂ断片のみでは、低温反応性が失われていた。従っ
て、５′−非翻訳領域０．６ｋｂを含む２．８ｋｂ断片
に、低温応答性のプロモーター機能があることが明らか
となった。
【００１６】本発明において、組み換えＤＮＡを作製す
る際のベクターとしては、例えばプラスミドを使用でき
る。また、組み換えＤＮＡを導入するための植物として
は、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、粟、
ひえ等の単子葉有用栽培植物が好ましい。また、前記の
各ＤＮＡフラグメントの塩基配列においては、一個また
は数個の塩基について、欠失、置換、付加が行われて
も、本発明のプロモーター機能を損なうものでない限
り、本発明の範囲内である。また、本発明のプロモータ
ー機能によって生産が誘導されるタンパク質としては、
オメガ−３脂肪酸不飽和化酵素等かある。
る際のベクターとしては、例えばプラスミドを使用でき
る。また、組み換えＤＮＡを導入するための植物として
は、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、粟、
ひえ等の単子葉有用栽培植物が好ましい。また、前記の
各ＤＮＡフラグメントの塩基配列においては、一個また
は数個の塩基について、欠失、置換、付加が行われて
も、本発明のプロモーター機能を損なうものでない限
り、本発明の範囲内である。また、本発明のプロモータ
ー機能によって生産が誘導されるタンパク質としては、
オメガ−３脂肪酸不飽和化酵素等かある。
【００１７】
【実施例】（ｍｌｉｐ１５ゲノムクローンの単離、およ
び、塩基配列の決定） トウモロコシ（品種；ハニーバンタム）より調製したゲ
ノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化した後、
ショ糖密度勾配遠心法により分離し、９．７−２２ｋｂ
の鎖長のＤＮＡ分画を得た。このＤＮＡ画分を、ラムダ
ＥＭＢＬ３をＢａｍＨＩで消化したものに連結した後、
Ｇｉｇａ−ｐａｃｋＧｏｌｄIIｋｉｔを用いてファージ
粒子とした。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＡ（Ｐ２）を
宿主として検定したところ、ｌｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌの
ライブラリーを得た。ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡ全長をプロ
ーブとして、このライブラリーを選抜し、３つのポジテ
ィブクローンを得た。このうち、「ラムダＨ１」と名付
けたクローンは、ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡと、その５′上
流側に５ｋｂと、その３′下流側に５ｋｂとを含む、１
１．５ｋｂの断片を含んでいた。
び、塩基配列の決定） トウモロコシ（品種；ハニーバンタム）より調製したゲ
ノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分消化した後、
ショ糖密度勾配遠心法により分離し、９．７−２２ｋｂ
の鎖長のＤＮＡ分画を得た。このＤＮＡ画分を、ラムダ
ＥＭＢＬ３をＢａｍＨＩで消化したものに連結した後、
Ｇｉｇａ−ｐａｃｋＧｏｌｄIIｋｉｔを用いてファージ
粒子とした。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＡ（Ｐ２）を
宿主として検定したところ、ｌｘ１０７ｐｆｕ／ｍｌの
ライブラリーを得た。ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡ全長をプロ
ーブとして、このライブラリーを選抜し、３つのポジテ
ィブクローンを得た。このうち、「ラムダＨ１」と名付
けたクローンは、ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡと、その５′上
流側に５ｋｂと、その３′下流側に５ｋｂとを含む、１
１．５ｋｂの断片を含んでいた。
【００１８】配列表１には、ｍｌｉｐ１５ｃＤＮＡの全
長を含む、３，７９４ｂｐからなるＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片の塩基配列を示す。なお、ｍｌｉｐ１５タンパ
ク質をコードする領域の推定アミノ酸配列は、１文字表
記で遺伝子配列の下に記した。この推定アミノ酸配列に
対応する塩基番号は、２７９８−３２０４である。この
塩基配列の終止コドンは、「米」印で示した。予想され
た「ＴＡＴＡ ｂｏｘ」配列には下線を施し、併せて表
記した。ｍｌｉｐ１５の転写開始点は、白抜き文字
（Ｔ、塩基番号２２７２）で表わした。
長を含む、３，７９４ｂｐからなるＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片の塩基配列を示す。なお、ｍｌｉｐ１５タンパ
ク質をコードする領域の推定アミノ酸配列は、１文字表
記で遺伝子配列の下に記した。この推定アミノ酸配列に
対応する塩基番号は、２７９８−３２０４である。この
塩基配列の終止コドンは、「米」印で示した。予想され
た「ＴＡＴＡ ｂｏｘ」配列には下線を施し、併せて表
記した。ｍｌｉｐ１５の転写開始点は、白抜き文字
（Ｔ、塩基番号２２７２）で表わした。
【００１９】（イネカルスへ導入するためのＤＮＡ組換
え体の構築） トウモロコシｍｌｉｐ１５ゲノムクローンを鋳型とし、
配列番号１の塩基番号１−２７９７の断片と、１−２２
７１の断片とを、それぞれＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖
反応法）で増幅した。塩基番号１−２７９７の断片は、
前述した２．８ｋｂのゲノム配列であり、ｍｌｉｐ１５
ｃＤＮＡの５′−非翻訳領域０．６ｋｂと、５′−非翻
訳領域０．６ｋｂに連なる上流の２．２ｋｂのゲノム配
列とからなる。塩基番号２７９８−３２０４は、ｍｌｉ
ｐ１５タンパク質をコードする領域である。塩基番号１
−２２７１の断片は、前述した２．２ｋｂのゲノム配列
であり、２．８ｋｂゲノム断片から、５′−非翻訳領域
０．６ｋｂを除いたものである。
え体の構築） トウモロコシｍｌｉｐ１５ゲノムクローンを鋳型とし、
配列番号１の塩基番号１−２７９７の断片と、１−２２
７１の断片とを、それぞれＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖
反応法）で増幅した。塩基番号１−２７９７の断片は、
前述した２．８ｋｂのゲノム配列であり、ｍｌｉｐ１５
ｃＤＮＡの５′−非翻訳領域０．６ｋｂと、５′−非翻
訳領域０．６ｋｂに連なる上流の２．２ｋｂのゲノム配
列とからなる。塩基番号２７９８−３２０４は、ｍｌｉ
ｐ１５タンパク質をコードする領域である。塩基番号１
−２２７１の断片は、前述した２．２ｋｂのゲノム配列
であり、２．８ｋｂゲノム断片から、５′−非翻訳領域
０．６ｋｂを除いたものである。
【００２０】増幅の際の酵素は、校正活性を持つＬＡＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた。なお、その際、各断
片において、塩基数１から６までがＨｉｎｄ III部位
（ＡＡＧＣＴＴ）になるように、塩基数２７９２−２７
９７と、２２６６−２２７１とか、それぞれ、ＢａｍＨ
Ｉ部位（ＧＧＡＴＣＣ）になるように、各プライマーを
設計した。
ａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた。なお、その際、各断
片において、塩基数１から６までがＨｉｎｄ III部位
（ＡＡＧＣＴＴ）になるように、塩基数２７９２−２７
９７と、２２６６−２２７１とか、それぞれ、ＢａｍＨ
Ｉ部位（ＧＧＡＴＣＣ）になるように、各プライマーを
設計した。
【００２１】各増幅断片を、大腸菌用ベクターｐＵＣ１
８のＢａｍＨＩとＨｉｎｄ III部位との間に組み込み、
各塩基配列の確認を行った。各塩基配列を確認した各プ
ラスミドより、２７９７ｂｐと２２７１ｂｐからなる各
Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ断片を再度調製して、ｐＢＩ
２２１のＨｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ間に組み込んだ。得
られた各組換えプラスミドを、ｐＢＩｍｐ２８（ｍｌｉ
ｐ１５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ２．８ｋｂ領域を含むによ
る）とｐＢＩｍｐ２２（ｍｌｉｐ１５ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ ２．２ｋｂ領域を含むによる）と名付けた。
８のＢａｍＨＩとＨｉｎｄ III部位との間に組み込み、
各塩基配列の確認を行った。各塩基配列を確認した各プ
ラスミドより、２７９７ｂｐと２２７１ｂｐからなる各
Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ断片を再度調製して、ｐＢＩ
２２１のＨｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ間に組み込んだ。得
られた各組換えプラスミドを、ｐＢＩｍｐ２８（ｍｌｉ
ｐ１５ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ２．８ｋｂ領域を含むによ
る）とｐＢＩｍｐ２２（ｍｌｉｐ１５ ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ ２．２ｋｂ領域を含むによる）と名付けた。
【００２２】図１に、ｍｌｉｐ１５プロモーター領域を
模式的に表わした。＋１は転写開始点を表しており（塩
基番号２２７２）、鍵矢印は転写の向きを表しており、
「ＡＴＧ」は翻訳開始コドンの位置を示す（塩基番号２
７９８）。上記した組換えプラスミドが含むｍｌｉｐ１
５プロモーターの部分を図示した。レポーター遺伝子と
して、ベータ・グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳと略
記）を用いているが、図１のＧＵＳ遺伝子の部分は、表
記が定規どおりではない。
模式的に表わした。＋１は転写開始点を表しており（塩
基番号２２７２）、鍵矢印は転写の向きを表しており、
「ＡＴＧ」は翻訳開始コドンの位置を示す（塩基番号２
７９８）。上記した組換えプラスミドが含むｍｌｉｐ１
５プロモーターの部分を図示した。レポーター遺伝子と
して、ベータ・グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳと略
記）を用いているが、図１のＧＵＳ遺伝子の部分は、表
記が定規どおりではない。
【００２３】（導入プラスミドの低温反応性）
イネ（品種、ノトヒカリ）胚盤由来カルスに、パーティ
クル・ガン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、上記の各
プラスミドを導入した。導入後、摂氏２５度暗所にてカ
ルスを２４時間培養した後、均等に２分割した。一方を
２５度で、他方を５度でさらに２４時間培養し、ＧＵＳ
検定を行った。ＧＵＳ活性は、Ｘ−Ｇｌｕｃを基質とし
て行い、胚盤あたりの青スポットの数の５度／２５度の
比から低温反応性の有無を判定した（表１）。両プラス
ミドについて３度の繰り返し実験を行った。この結果を
表１に示す。
クル・ガン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、上記の各
プラスミドを導入した。導入後、摂氏２５度暗所にてカ
ルスを２４時間培養した後、均等に２分割した。一方を
２５度で、他方を５度でさらに２４時間培養し、ＧＵＳ
検定を行った。ＧＵＳ活性は、Ｘ−Ｇｌｕｃを基質とし
て行い、胚盤あたりの青スポットの数の５度／２５度の
比から低温反応性の有無を判定した（表１）。両プラス
ミドについて３度の繰り返し実験を行った。この結果を
表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】ｐＢＩｍｐ２８を導入した場合には、高度
のＧＵＳ活性が得られた。これに比べると、ｐＢＩｍｐ
２２を導入した場合には、ＧＵＳ活性は劣っていた。こ
の結果から、次のことが分かる。 （ａ）トウモロコシｍｌｉｐ１５ゲノムクローンの塩基
番号１−３７９４の塩基番号のＤＮＡフラグメントが、
低温応答性のプロモーター領域を、ｍｌｉｐ１５タンパ
ク質をコードする領域の推定アミノ酸配列の上流側に有
している。 （ｂ）塩基番号１−２７９７が低温応答性のプロモータ
ー領域を含んでいる。 （ｃ）塩基番号１−２２７１がプローモーターとして作
用するはずであるが、これは単独では低温に対する応答
性が低く，塩基番号２２７２−２７９７の断片が低温に
対して応答性を有しており、プロモーターの発現に関与
している。
のＧＵＳ活性が得られた。これに比べると、ｐＢＩｍｐ
２２を導入した場合には、ＧＵＳ活性は劣っていた。こ
の結果から、次のことが分かる。 （ａ）トウモロコシｍｌｉｐ１５ゲノムクローンの塩基
番号１−３７９４の塩基番号のＤＮＡフラグメントが、
低温応答性のプロモーター領域を、ｍｌｉｐ１５タンパ
ク質をコードする領域の推定アミノ酸配列の上流側に有
している。 （ｂ）塩基番号１−２７９７が低温応答性のプロモータ
ー領域を含んでいる。 （ｃ）塩基番号１−２２７１がプローモーターとして作
用するはずであるが、これは単独では低温に対する応答
性が低く，塩基番号２２７２−２７９７の断片が低温に
対して応答性を有しており、プロモーターの発現に関与
している。
【００２６】
【配列表】出願人氏名：九州大学長
発明の名称：ＤＮＡフラグメント、組み換えＤＮＡ、形
質転換植物 配列の数：１ 配列番号：１ 配列の長さ：３７９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 起源：トウモロコシ ハニーバンタム種 ｍｌｉｐ１５遺伝子のゲノム 配列：mlip15のゲノム配列 1 GAATTCCGAATAACGCGCCCCGCATGCAACCAGATAGCGGATCTTTCGGCGCTAAACTCA 60 61 GAGGGAAGCAATTGCCGGAAGAGTCGGCGTGCAAGAATAACATAAGTAGATAAGATTTCA 120 121 CGATCTATAAAAGGATATCTCCCTAGTCGGCTATATAAGGCTAGGGAGGTACCCAAACAA 180 181 AACGAATCACTCTCTTTCACCACCATAACGCCCACTAGTAGACTAATATGAGATCTCATC 240 241 CACCGTCACCCGCGAATCATCTGTAACCCAAGCAAACTCAATACCCAACATCACACATGA 300 301 CTTAGGGTATTACGCATTTAGGCGACCCGAACCTGTATAATTTTCTTGTGTTTCAACGTG 360 361 CACCTGCACGTACCATCGAGTTGCGATTAACGTCGCCGTCCTCCCAAAAATACTGGTGGT 420 421 CCTCCCAAAAACTCGACCGGACGATAGAAATAGTGTATGGCTAAGTAGAGCAAGGTGGCG 480 481 TTTGGTCCGCGGCTATGATGAGAATCCAGTAGACTGAATCCACGTGCTAAACCAAACATC 540 541 ACTGGTTTTGGCTGCATCTTCTCGGATTACGTGTGTTGTGCAAATTCTCATAATCCACGG 600 601 CAACCAGACGGGGGCGCAACCAATTGGTGTTTCTTAGGAAGCCCCCGCGTTACATTGGAT 660 661 CATAGGATGATTCAAGGGTTATGATTTTTTAGCTACTAATTGGTTGTCATCATGGTTTAT 720 721 AGGTGAAGATTGTTATTCAATCAAAGGGCGACATATCCCTCCGCGTTTAGAGACTTGCGT 780 781 GTAGTGTAAACATGGATGTAATTGTGCTACCTTTAATAGAGTCCCTTAGCTCTTCAAAAA 840 841 CAAATCTTATTATATATTAATTACTAGTCCATCCATTTTATTCTAATTTAGTTTCGAAAT 900 901 TACTAAATATAGAAAATAAAATAGAGTTTTAGTAGCAATTATGAAAACTGAAATATAGTT 960 961 TTAATTTCCGTATTTAGTGATTTAAATACTAAAATATAATAAAATGGAGAGACTAAAAAC 1020 1021 TAGTCCCTATAAACCAAACATTCTTTAAATAAAGCCCCGTGGCTAGGACAATGACCTATT 1080 1081 TTTTTCTCGCAACCGGAAGAATAAAAAATTCACCGTAACTTTCTTTCTTTCTTCTTTTTA 1140 1141 TGCGAAAGAAGATAGTTGCAAGACGAATCCAGAGTTTATCTGGAAGAAGAAAGTTCCTAA 1200 1201 TCCTCCTCCTTCCCTGTAGATATTATCAGCAAGGCAAGCGTGTCACGGCTTCTTGCTTGA 1260 1261 GTAATCCGCTCCTATTTTTTTTTTTGGGAGGGCGCCTTCCTACCGGCTTCGCTTCTAAAC 1320 1321 GGTGGGCAAATTTGGTACGATAAAGAAAAAAGAGGAGGACGAGTGGGAGGGCACTTCTGG 1380 1381 AAAAAACTTTTTAATGAGCTGGACCAAGCAGCTGGGCAAGCTGTCACTAGGACTGGACAA 1440 1441 AATACTCGTGGCTCGATAACTCGCTCGACTCGGCTCGTTAGTAGCTCAGCTCGACTCGGC 1500 1501 TCGTTTTAATTTTGTAGCGAGCCAAGCTAGCATTCTAGCTCGATTCTCTAATGAGCCAGC 1560 1561 TCGGGTTAGCTCGTGAGCTAGCTCGCGAGCCAAACGAGCTAAGCCACAACACAAATTTGT 1620 1621 CTAGTCATTGATGTCGTCTCATCTCTCATAGTCTTGTTTTCTCGTAGTTATGATCTGTGA 1680 1681 TATGGACATGTGTGGATGTGCCATGTGCTTAAATATTTATATTATTGCATGGCTACATGT 1740 1741 TTGTAGTGTTAAATACTTAAAATATAATTTTTCGGTTATAAATATATTTATGTACATAGA 1800 1801 TATTTATATTTAGTTGTGTGGCTCACGAGCCTAACGAGCTGGCTCGAGCTTCCTAACGAG 1860 1861 CCGAGCCGAGCCAGCTATTTAGCTCGTTAGTATAACGAGCCGAGCCGAGCTGGCTCGTTA 1920 1921 TAGTAACGAGCCATAACGAGCCGAGCCATAACGAGCCAAGCTGGTTCGATATCCACCCCT 1980 1981 AGCTGTCACCGTCGCCCAGTCCGCTTCGTTCGGTCAGCGGGCCCCACCTCATCTGCATTC 2040 2041 TTCCATTCTCGTCCTCCGACCTCATCTGCATTTTCCCAGCCAAGTAGTAGGTAAACTAGT 2100 2101 GGCGGTCCCGTGGCCGTGGCATCAGGAAAAGAATATGCCGTCCCAGCCCACCATCCCCCC 2160 2161 ACCGTCCCGAAATTCCAGAACTACCCTCGGCTCCAGCTATAAATAGCCGCCCCCGGGAGA 2220 putative TATA box 2221 CGTTCGAAACCTTCCCCATCTCCGGATAAAAGATAAGGAGTGTCTCTCCTCTCTTTCAGC 2280 cDNA start site 2281 TAAGTCCCTGCTCCCTCTCTTTTTCTTACATTCAGGTCCTCGCAGCTCCTCTCTTTTTTC 2340 2341 TTGTTTCTTTCTTTCGATCTGCGAGCCGTCCAGGTCCAGTACTCTCCTTTCCGTGAAGGA 2400 2401 ACTCTTGCAGCCGGCCCCTCTGGTTTCCTCGAATTCTTGTTCCCCGGTCCCTCCTCCTGT 2460 2461 CCCCGCGTAGATCCGTCCGTCCGAGGAGCACACCGTCCCCACCCCCATGTTTACCCACCA 2520 2521 GTTCCTCTGACGGCCGCCGTGCTCCGATGAAGCTGAGCGTGCTCCGTATCCGCCGCTCCC 2580 2581 ACTCCTTCTCCGTCGCCTTCCTCTACTGGTTCTACGTCTTCTCATGAACGCATCGCCCCT 2640 2641 CTCCACCTGCTGATCCTTCGCCATCTCTCCATCTCTCTTTCTCTCTGAGATAGTCTTTCG 2700 2701 AATCCATCTCTAGGGCTCTTGTTTCTCCCCATCCTCCCCCCACCCCACCCCCCACCAAAC 2760 2761 ACAAGTCCCCTTGTTCAATCCGACAAGACAAGCATCCATGTCGTCGTCACGCCGGAGCTC 2820 M S S S R R S S 2821 GAGCCCCGACAGCAACGACACGACGGACGAGCGCAAGCGGAAGCGGATGCTGTCCAACAG 2880 S P D S N D T T D E R K R K R M L S N R 2881 GGAGTCGGCGCGGCGGTCGCGCGCGCGGAAGCAGCAGCGGCTGGAGGAGCTGGTGGCGGA 2940 E S A R R S R A R K Q Q R L E E L V A E 2941 GGTGGCCCGCCTGCAGGCGGAGAACGCGGCGACGCAGGCCCGCACCGCGGCGCTGGAGCG 3000 V A R L Q A E N A A T Q A R T A A L E R 3001 CGACCTGGGCAGGGTGGACGGCGACAACGCGGTCGTGCGCGCCCGCCACGCCGAGCTGGC 3060 D L G R V D G D N A V V R A R H A E L A 3061 CGGCCGCCTGCAGTCGCTGGGCGGCGTCCTCGAGGTGCTCCAGATGGCCGGCGCCGCCGT 3120 G R L Q S L G G V L E V L Q M A G A A V 3121 CGACATCCCGGAGATGGTCACCGACGACCCCATGCTCCGCCCCTGGCAGCCGTCCTTCCC 3180 D I P E M V T D D P M L R P W Q P S F P 3181 CCCGATGCAGCCCATCGGGTTCTGAGAATCTGAGCCTCAGCCGGCGGGAGAGAGCCAATT 3240 P M Q P I G F * 3241 TCTGTCGTCGTGCCGCTGTCTATCTCGTATTGGTATATCTATTCATAAATCATCCTTGTC 3300 3301 ATGGTTTGCTCTTCTTGTTCAGTGTTATAAATTTGCTTCTTGTTAGTGTTATAAATTTGG 3360 3361 CCATCGGAAAGGATGTGTTTGTAGTTGTAATATCTTGTTTGGAGTTGTAATATCTTATCT 3420 3421 TGCTTATGAAATCGAATATGCCTATATATATATGTTATGCTGTACGAGTATGTGGCTCCA 3480 polyA additional site 3481 AATTTGTGAGCCTTCTGTCTGTTATGGTGAGGCGATGAATCCAATTTGTGAGCACACATG 3540 3541 AATCAATTTCGAGATTCGACATGTCAAGTTGATCGTTGCAGGAAGGACGGTTTTTGTATG 3600 3601 GACGGACATACCAAGTTACTGCATTTTACTTAAAATATCTCACTTATTTTTTAGATCGGC 3660 3661 ATTTCTCCACTCGTTAGATTTCTTGTTCTTGAGTCAGAAGATAACTACAGCATGTCATAT 3720 3721 CTCAATTGGAATACCATTAGGGTCCCTCATCTTAACCTATTTCATCTCTTTTAATACGTA 3780 3781 GATTTTTTGGATCC 3794
質転換植物 配列の数：１ 配列番号：１ 配列の長さ：３７９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 起源：トウモロコシ ハニーバンタム種 ｍｌｉｐ１５遺伝子のゲノム 配列：mlip15のゲノム配列 1 GAATTCCGAATAACGCGCCCCGCATGCAACCAGATAGCGGATCTTTCGGCGCTAAACTCA 60 61 GAGGGAAGCAATTGCCGGAAGAGTCGGCGTGCAAGAATAACATAAGTAGATAAGATTTCA 120 121 CGATCTATAAAAGGATATCTCCCTAGTCGGCTATATAAGGCTAGGGAGGTACCCAAACAA 180 181 AACGAATCACTCTCTTTCACCACCATAACGCCCACTAGTAGACTAATATGAGATCTCATC 240 241 CACCGTCACCCGCGAATCATCTGTAACCCAAGCAAACTCAATACCCAACATCACACATGA 300 301 CTTAGGGTATTACGCATTTAGGCGACCCGAACCTGTATAATTTTCTTGTGTTTCAACGTG 360 361 CACCTGCACGTACCATCGAGTTGCGATTAACGTCGCCGTCCTCCCAAAAATACTGGTGGT 420 421 CCTCCCAAAAACTCGACCGGACGATAGAAATAGTGTATGGCTAAGTAGAGCAAGGTGGCG 480 481 TTTGGTCCGCGGCTATGATGAGAATCCAGTAGACTGAATCCACGTGCTAAACCAAACATC 540 541 ACTGGTTTTGGCTGCATCTTCTCGGATTACGTGTGTTGTGCAAATTCTCATAATCCACGG 600 601 CAACCAGACGGGGGCGCAACCAATTGGTGTTTCTTAGGAAGCCCCCGCGTTACATTGGAT 660 661 CATAGGATGATTCAAGGGTTATGATTTTTTAGCTACTAATTGGTTGTCATCATGGTTTAT 720 721 AGGTGAAGATTGTTATTCAATCAAAGGGCGACATATCCCTCCGCGTTTAGAGACTTGCGT 780 781 GTAGTGTAAACATGGATGTAATTGTGCTACCTTTAATAGAGTCCCTTAGCTCTTCAAAAA 840 841 CAAATCTTATTATATATTAATTACTAGTCCATCCATTTTATTCTAATTTAGTTTCGAAAT 900 901 TACTAAATATAGAAAATAAAATAGAGTTTTAGTAGCAATTATGAAAACTGAAATATAGTT 960 961 TTAATTTCCGTATTTAGTGATTTAAATACTAAAATATAATAAAATGGAGAGACTAAAAAC 1020 1021 TAGTCCCTATAAACCAAACATTCTTTAAATAAAGCCCCGTGGCTAGGACAATGACCTATT 1080 1081 TTTTTCTCGCAACCGGAAGAATAAAAAATTCACCGTAACTTTCTTTCTTTCTTCTTTTTA 1140 1141 TGCGAAAGAAGATAGTTGCAAGACGAATCCAGAGTTTATCTGGAAGAAGAAAGTTCCTAA 1200 1201 TCCTCCTCCTTCCCTGTAGATATTATCAGCAAGGCAAGCGTGTCACGGCTTCTTGCTTGA 1260 1261 GTAATCCGCTCCTATTTTTTTTTTTGGGAGGGCGCCTTCCTACCGGCTTCGCTTCTAAAC 1320 1321 GGTGGGCAAATTTGGTACGATAAAGAAAAAAGAGGAGGACGAGTGGGAGGGCACTTCTGG 1380 1381 AAAAAACTTTTTAATGAGCTGGACCAAGCAGCTGGGCAAGCTGTCACTAGGACTGGACAA 1440 1441 AATACTCGTGGCTCGATAACTCGCTCGACTCGGCTCGTTAGTAGCTCAGCTCGACTCGGC 1500 1501 TCGTTTTAATTTTGTAGCGAGCCAAGCTAGCATTCTAGCTCGATTCTCTAATGAGCCAGC 1560 1561 TCGGGTTAGCTCGTGAGCTAGCTCGCGAGCCAAACGAGCTAAGCCACAACACAAATTTGT 1620 1621 CTAGTCATTGATGTCGTCTCATCTCTCATAGTCTTGTTTTCTCGTAGTTATGATCTGTGA 1680 1681 TATGGACATGTGTGGATGTGCCATGTGCTTAAATATTTATATTATTGCATGGCTACATGT 1740 1741 TTGTAGTGTTAAATACTTAAAATATAATTTTTCGGTTATAAATATATTTATGTACATAGA 1800 1801 TATTTATATTTAGTTGTGTGGCTCACGAGCCTAACGAGCTGGCTCGAGCTTCCTAACGAG 1860 1861 CCGAGCCGAGCCAGCTATTTAGCTCGTTAGTATAACGAGCCGAGCCGAGCTGGCTCGTTA 1920 1921 TAGTAACGAGCCATAACGAGCCGAGCCATAACGAGCCAAGCTGGTTCGATATCCACCCCT 1980 1981 AGCTGTCACCGTCGCCCAGTCCGCTTCGTTCGGTCAGCGGGCCCCACCTCATCTGCATTC 2040 2041 TTCCATTCTCGTCCTCCGACCTCATCTGCATTTTCCCAGCCAAGTAGTAGGTAAACTAGT 2100 2101 GGCGGTCCCGTGGCCGTGGCATCAGGAAAAGAATATGCCGTCCCAGCCCACCATCCCCCC 2160 2161 ACCGTCCCGAAATTCCAGAACTACCCTCGGCTCCAGCTATAAATAGCCGCCCCCGGGAGA 2220 putative TATA box 2221 CGTTCGAAACCTTCCCCATCTCCGGATAAAAGATAAGGAGTGTCTCTCCTCTCTTTCAGC 2280 cDNA start site 2281 TAAGTCCCTGCTCCCTCTCTTTTTCTTACATTCAGGTCCTCGCAGCTCCTCTCTTTTTTC 2340 2341 TTGTTTCTTTCTTTCGATCTGCGAGCCGTCCAGGTCCAGTACTCTCCTTTCCGTGAAGGA 2400 2401 ACTCTTGCAGCCGGCCCCTCTGGTTTCCTCGAATTCTTGTTCCCCGGTCCCTCCTCCTGT 2460 2461 CCCCGCGTAGATCCGTCCGTCCGAGGAGCACACCGTCCCCACCCCCATGTTTACCCACCA 2520 2521 GTTCCTCTGACGGCCGCCGTGCTCCGATGAAGCTGAGCGTGCTCCGTATCCGCCGCTCCC 2580 2581 ACTCCTTCTCCGTCGCCTTCCTCTACTGGTTCTACGTCTTCTCATGAACGCATCGCCCCT 2640 2641 CTCCACCTGCTGATCCTTCGCCATCTCTCCATCTCTCTTTCTCTCTGAGATAGTCTTTCG 2700 2701 AATCCATCTCTAGGGCTCTTGTTTCTCCCCATCCTCCCCCCACCCCACCCCCCACCAAAC 2760 2761 ACAAGTCCCCTTGTTCAATCCGACAAGACAAGCATCCATGTCGTCGTCACGCCGGAGCTC 2820 M S S S R R S S 2821 GAGCCCCGACAGCAACGACACGACGGACGAGCGCAAGCGGAAGCGGATGCTGTCCAACAG 2880 S P D S N D T T D E R K R K R M L S N R 2881 GGAGTCGGCGCGGCGGTCGCGCGCGCGGAAGCAGCAGCGGCTGGAGGAGCTGGTGGCGGA 2940 E S A R R S R A R K Q Q R L E E L V A E 2941 GGTGGCCCGCCTGCAGGCGGAGAACGCGGCGACGCAGGCCCGCACCGCGGCGCTGGAGCG 3000 V A R L Q A E N A A T Q A R T A A L E R 3001 CGACCTGGGCAGGGTGGACGGCGACAACGCGGTCGTGCGCGCCCGCCACGCCGAGCTGGC 3060 D L G R V D G D N A V V R A R H A E L A 3061 CGGCCGCCTGCAGTCGCTGGGCGGCGTCCTCGAGGTGCTCCAGATGGCCGGCGCCGCCGT 3120 G R L Q S L G G V L E V L Q M A G A A V 3121 CGACATCCCGGAGATGGTCACCGACGACCCCATGCTCCGCCCCTGGCAGCCGTCCTTCCC 3180 D I P E M V T D D P M L R P W Q P S F P 3181 CCCGATGCAGCCCATCGGGTTCTGAGAATCTGAGCCTCAGCCGGCGGGAGAGAGCCAATT 3240 P M Q P I G F * 3241 TCTGTCGTCGTGCCGCTGTCTATCTCGTATTGGTATATCTATTCATAAATCATCCTTGTC 3300 3301 ATGGTTTGCTCTTCTTGTTCAGTGTTATAAATTTGCTTCTTGTTAGTGTTATAAATTTGG 3360 3361 CCATCGGAAAGGATGTGTTTGTAGTTGTAATATCTTGTTTGGAGTTGTAATATCTTATCT 3420 3421 TGCTTATGAAATCGAATATGCCTATATATATATGTTATGCTGTACGAGTATGTGGCTCCA 3480 polyA additional site 3481 AATTTGTGAGCCTTCTGTCTGTTATGGTGAGGCGATGAATCCAATTTGTGAGCACACATG 3540 3541 AATCAATTTCGAGATTCGACATGTCAAGTTGATCGTTGCAGGAAGGACGGTTTTTGTATG 3600 3601 GACGGACATACCAAGTTACTGCATTTTACTTAAAATATCTCACTTATTTTTTAGATCGGC 3660 3661 ATTTCTCCACTCGTTAGATTTCTTGTTCTTGAGTCAGAAGATAACTACAGCATGTCATAT 3720 3721 CTCAATTGGAATACCATTAGGGTCCCTCATCTTAACCTATTTCATCTCTTTTAATACGTA 3780 3781 GATTTTTTGGATCC 3794
【図１】 ｍｌｉｐ１５プロモーター領域を模式的に表
す図である。
す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｄｅｎｅｔ
（1995），Ｖｏｌ．248，Ｎｏ．５，ｐ.
507−517
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｄｅｎｅｔ
（1993），Ｖｏｌ．240，Ｎｏ．１，ｐ.
１−８
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）に示す塩基配
列からなることを特徴とする、ＤＮＡフラグメント。 （ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−３７９４で表される塩基配列 （ｂ）（ａ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列 - 【請求項２】 トウモロコシの低温誘導性遺伝子ｍｌｉ
ｐ１５を含むことを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ
フラグメント。 - 【請求項３】 低温応答性のプロモーター活性を示す、
以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなること
を特徴とする、ＤＮＡフラグメント。 （ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２７９７で表される塩基配列 （ｄ）（ｃ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列 - 【請求項４】 低温応答性のプロモーター活性を示す、
以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配列からなること
を特徴とする、ＤＮＡフラグメント。 （ｅ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基
番号１−２２７１で表される塩基配列 （ｆ）（ｅ）の塩基配列の１個または数個が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列 - 【請求項５】 請求項１に記載のＤＮＡフラグメントを
含む組み換えＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項３に記載のＤＮＡフラグメントを
含む組み換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１に記載のＤＮＡフラグメントを
含む組み換えＤＮＡが導入されている、耐冷性を有する
形質転換植物。 - 【請求項８】 請求項３に記載のＤＮＡフラグメントを
含む組み換えＤＮＡが導入されている、低温に応答して
特定のタンパク質を形質発現する形質転換植物。
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| AU92366/98A AU709385B1 (en) | 1998-06-10 | 1998-11-12 | DNA fragment, recombinant DNA, and transformed plant |
| US09/192,434 US6479734B2 (en) | 1998-06-10 | 1998-11-16 | DNA fragment responsive to low temperatures and a plant transformed with the DNA fragment |
| CA002253641A CA2253641A1 (en) | 1998-06-10 | 1998-12-02 | Dna fragment, recombinant dna, and transformed plant |
| FR9815199A FR2779739A1 (fr) | 1998-06-10 | 1998-12-02 | Fragment d'adn, adn recombine et plantes transformees les contenant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16218698A JP3507856B2 (ja) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Ｄｎａフラグメント、組み換えｄｎａ、形質転換植物 |
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