JP3506672B2 - Sulfated-fucose-containing polysaccharide - Google Patents
Sulfated-fucose-containing polysaccharideInfo
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品として利用
可能なアポトーシス誘発剤、制がん剤及び発がん予防剤
に関する。また、本発明はアポトーシス機構解明、アポ
トーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトー
シス誘発方法を提供する。更に本発明により純化された
フコース硫酸含有多糖及びその分解物が提供され、フコ
ース硫酸含有多糖分解物の製造や、構造究明に有用なフ
コース硫酸含有多糖分解酵素が提供される。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an apoptosis-inducing agent, a carcinostatic agent and a carcinogenic preventive agent, which can be used as pharmaceuticals. The present invention also provides a method for inducing apoptosis useful for elucidating the mechanism of apoptosis, screening for apoptosis induction inhibitors, and the like. Further, according to the present invention, a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide and a degradation product thereof are provided, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme useful for producing a degraded product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide and for investigating the structure is provided.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、細胞組織の死に関し、アポトーシ
ス(apoptosis 、アポプトーシスともいう;自爆死ある
いは細胞自滅)と言う様式が注目されている。2. Description of the Related Art In recent years, with respect to the death of cell tissues, a mode called apoptosis (also referred to as "apoptosis"; suicide bombing or cell suicide) has attracted attention.
【0003】このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれて
いる死であると考えられている。すなわち何らかの外部
的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプロ
グラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプロ
グラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したプロ
グラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至
ると考えられている。Unlike necrosis, which is a pathological cell death, this apoptosis is considered to be a death that is originally integrated in the gene of the cell itself. That is, some external or internal factor is triggered to activate a gene that programs apoptosis, and a programmed death gene protein is biosynthesized based on this gene, and the generated programmed death protein decomposes the cell itself to cause death. Is believed to reach.
【0004】このようなアポトーシスを所望の組織、細
胞で発現せしめることができれば、不要若しくは病原細
胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極
めて意義深いものである。If such apoptosis can be expressed in a desired tissue or cell, unnecessary or pathogenic cells can be eliminated from the living body in a natural form, which is extremely significant.
【0005】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アポ
トーシスを誘発する作用を有する安全性の高い化合物を
開発し、該化合物を含有するアポトーシス誘発剤、制が
ん剤、発がん予防剤、及び該化合物を有効成分として使
用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。ま
た本発明の化合物の分解物の製造に有用な該化合物分解
酵素を提供することにある。The object of the present invention is to develop a highly safe compound having an action of inducing apoptosis, and to induce an apoptosis inducer, a carcinostatic agent, a carcinogenic preventive agent containing the compound, and An object of the present invention is to provide a method for inducing apoptosis using the compound as an active ingredient. Another object of the present invention is to provide a compound-degrading enzyme useful for producing a decomposed product of the compound of the present invention.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明はアポトーシス誘発剤に関し、フコー
ス硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有することを
特徴とする。Means for Solving the Problems To outline the present invention, the first invention of the present invention relates to an apoptosis inducer, which is characterized by containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof.
【0007】本発明の第2の発明はアポトーシス誘発方
法に関し、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物
を有効成分として使用することを特徴とする。The second invention of the present invention relates to a method for inducing apoptosis, which is characterized by using a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product as an active ingredient.
【0008】本発明の第3の発明は制がん剤に関し、本
発明の第5又は第6の発明のフコース硫酸含有多糖及び
/又はその分解物を含有することを特徴とする。A third invention of the present invention relates to a carcinostatic agent, which is characterized by containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the fifth or sixth invention of the present invention and / or its degradation product.
【0009】本発明の第4の発明は発がん予防剤に関
し、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を含有
することを特徴とする。A fourth invention of the present invention relates to a carcinogen preventive agent, which is characterized by containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof.
【0010】 本発明の第5の発明は下記理化学的性質
を有する、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖に関
する。
(1)構成糖:ウロン酸を含有する。
(2)フラボバクテリウム(Flavobacteri
um)sp. SA−0082(FERM BP−54
02)の生産するフコイダン分解酵素により低分子化
し、少なくとも下記式(I)、(II)、(III)で
表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成
する。A fifth invention of the present invention relates to a sulfated-fucose-containing polysaccharide derived from Gagome kombu having the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains uronic acid. (2) Flavobacterium
um) sp. SA-0082 (FERM BP-54
The fucoidan-degrading enzyme produced in 02) lowers the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III).
【化学式4】 [Chemical formula 4]
【化学式5】 [Chemical formula 5]
【化学式6】 [Chemical formula 6]
【0011】本発明の第6の発明は下記理化学的性質を
有するフコース硫酸含有多糖に関する。
(1)構成糖:ウロン酸を実質的に含有しない。
(2)フラボバクテリウム(Flavobacterium)sp.
SA−0082(FERM BP−5402)の生産す
るフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。The sixth invention of the present invention relates to a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (2) Flavobacterium sp.
The fucodine-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.
【0012】本発明の第7の発明は本発明の第5の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のあ
る薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含すること
を特徴とする。A seventh aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an agent capable of aggregating acidic polysaccharides in the presence of salts, It is characterized by including a step of removing a precipitate.
【0013】本発明の第8の発明は本発明の第5の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を、2価の陽イオンの混在下に陰イオ
ン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含
することを特徴とする。An eighth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation. Then, the step of collecting the desired polysaccharide is included.
【0014】本発明の第9の発明は本発明の第5の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第
5の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存
する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基
を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特
徴とする。A ninth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, which is a coexisting coloring property when producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention. The method is characterized by including the step of removing the substance using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group.
【0015】本発明の第10の発明は本発明の第6の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、ウロン酸を含むフコース硫酸含
有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解酵
素をもつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を
包含することを特徴とする。A tenth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, in which a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is decomposed to decompose a sulfated-fucose-containing polysaccharide containing uronic acid. The method is characterized by including a step of collecting the target polysaccharide by treating with an enzyme or a microorganism having the degrading enzyme.
【0016】本発明の第11の発明は本発明の第6の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能
のある薬剤で目的の多糖を沈殿させる工程を包含するこ
とを特徴とする。The eleventh aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is used as a drug having an ability to aggregate acidic polysaccharides in the presence of salts. It is characterized by including the step of precipitating a polysaccharide.
【0017】本発明の第12の発明は本発明の第6の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、2価の陽イオンの混在下に陰イ
オン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包
含することを特徴とする。A twelfth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation. Then, the step of collecting the desired polysaccharide is included.
【0018】本発明の第13の発明は本発明の第6の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の
第6の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共
存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換
基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを
特徴とする。The thirteenth invention of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention, wherein the coexisting coloring property is present when the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention is produced. The method is characterized by including the step of removing the substance using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group.
【0019】本発明の第14の発明はフコース硫酸含有
多糖混合物の製造方法に関し、海藻から本発明の第7、
8、10、11又は12の発明に使用するフコース硫酸
含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオンとカルシウ
ムイオンを共存させることを特徴とする。A fourteenth invention of the present invention relates to a method for producing a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, which comprises the steps of:
When extracting the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture used in the invention of 8, 10, 11 or 12, acetate ion and calcium ion are made to coexist.
【0020】本発明の第15の発明は下記の理化学的性
質を有することを特徴とするエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素に関する。
(i)作用:下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化
させる。
(a)構成糖:ウロン酸を実質的に含有しない。
(b)フラボバクテリウム(Flavobacterium) sp.
SA−0082(FERM BP−5402)の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用
しない。
(c)構成糖:ウロン酸を含有する。
(d)フラボバクテリウム(Flavobacterium) sp.
SA−0082(FERM BP−5402)の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式(I)、(II)、(III)で表される化合物より選
択される一種以上の化合物が生成する。The fifteenth invention of the present invention relates to an endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme having the following physicochemical properties. (I) Action: It acts on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties to lower the molecular weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. (A) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (B) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.
It does not act on sulfated-fucose-containing polysaccharides having the following physicochemical properties. (C) Constituent sugar: Contains uronic acid. (D) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) reduces the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III). .
【化7】 [Chemical 7]
【化8】 [Chemical 8]
【化9】
(ii)至適pH:本酵素の至適pHは7〜8付近にあ
る。
(iii)至適温度:本酵素の至適温度は30〜35℃付
近である。[Chemical 9] (Ii) Optimum pH: The optimum pH of this enzyme is around 7-8. (Iii) Optimum temperature: The optimum temperature of this enzyme is around 30 to 35 ° C.
【0021】本発明の第16の発明はカルシウム源と本
発明の第15の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素を含有する酵素組成物に関する。The sixteenth invention of the present invention relates to an enzyme composition containing a calcium source and the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention.
【0022】本発明の第17の発明は本発明の第15の
発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の製造方
法に関し、本発明の第15の発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテロモナス属細
菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特
徴とする。A seventeenth invention of the present invention relates to a method for producing an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention, which has an ability to produce an endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention. Is characterized by culturing a bacterium belonging to the genus Alteromonas and having the enzyme collected from the culture.
【0023】本発明の第18の発明はフコース硫酸含有
多糖の低分子化物に関し、本発明の第15の発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を本発明の第6の発
明のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるも
のであることを特徴とする。The eighteenth invention of the present invention relates to a low molecular weight product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide, wherein the endo-fucose-sulfate-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention is the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention. It is characterized by being obtained by acting on.
【0024】本発明者らは様々な純化されたフコース硫
酸含有多糖やその分解物を得ることに成功し、次いでそ
れらの生物活性を検討し、それらの物質ががん細胞に対
してアポトーシスを誘発させること及び強い制がん作用
を示すことを見出した。またフコース硫酸含有多糖及び
/又はその分解物が強い発がん抑制作用を示すことを見
い出した。更に本発明の分解物の調製に有用なフコース
硫酸含有多糖分解酵素の単離に成功し、本発明を完成さ
せた。The present inventors succeeded in obtaining various purified sulfated-fucose-containing polysaccharides and degradation products thereof, and then examined their biological activities, and these substances induce apoptosis in cancer cells. It was found that the substance has a strong anticancer effect. It was also found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product has a strong carcinogenic inhibitory action. Furthermore, we succeeded in isolating a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme useful for the preparation of the degraded product of the present invention, and completed the present invention.
【0025】[0025]
【発明の実施の形態】以下、本発明に関して具体的に説
明する。本発明に使用されるフコース硫酸含有多糖はガ
ゴメ昆布由来の物である。また本発明にはフコース硫酸
含有多糖の分解物も使用することができる。フコース硫
酸含有多糖の分解方法としては酸処理等の化学的に分解
する方法、超音波処理など物理的に分解する方法、ある
いは酵素的に分解する方法等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be specifically described below. The sulfated-fucose-containing polysaccharide used in the present invention is derived from Gagome kombu. Further, a decomposed product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide can also be used in the present invention. Examples of the method for decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide include a chemical decomposition method such as acid treatment, a physical decomposition method such as ultrasonic treatment, and an enzymatic decomposition method.
【0026】本発明者らは、上記のような様々なフコー
ス硫酸含有多糖及び/又はその分解物をがん細胞の培養
液に添加したところ添加後1日から数日で癌細胞がアポ
トーシスを起こすことを見出した。また、正常細胞に対
しては毒性を示さないことも確認した。The present inventors have added various sulfated-fucose-containing polysaccharides and / or their degradation products as described above to the culture medium of cancer cells, and the cancer cells undergo apoptosis 1 to several days after the addition. I found that. It was also confirmed that it did not show toxicity to normal cells.
【0027】本発明において、フコース硫酸含有多糖と
は、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に
限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されて
いる〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式
会社、昭和30年12月15日発刊、多糖類化学、第3
19頁、第321頁〕。なお褐藻植物由来のフコース硫
酸含有多糖はフコイダン、フコイジン、フカンと通称さ
れ、いくつかの分子種があることが知られているがこれ
らは総称的にフコイダンと呼ばれることが多い。例え
ば、市販シグマ社製のフコイダンを13種もの分子種に
分けたという報告があり〔カーボハイドレート リサー
チ(Carbohydrate Research)、第255巻、第213〜
224頁(1994)〕、その中にはフコースを主成分
とする一群と、ウロン酸を数%含み構成糖にフコースや
マンノースを多く含む一群の分子種がある。その生物活
性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗
凝血等様々なものが報告されているが、フコース硫酸含
有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種に
あるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精
製して調べる必要があった。フコース硫酸含有多糖に
は、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコー
スのものと、ウロン酸を数%含み構成糖にフコースやマ
ンノースを含むもの等がある。以下、本明細書において
はウロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多
糖−Fとし、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフ
コース硫酸含有多糖−Uとし、両者の混合物をフコース
硫酸含有多糖混合物と記載する。In the present invention, the sulfated-fucose-containing polysaccharides are polysaccharides containing sulfated-fucose in the molecule and are not particularly limited, but are contained in, for example, brown algae plants, sea cucumbers and the like [supervised by Tokuro Shirota and Fujio Egami. Editorial, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., published December 15, 1955, Polysaccharide Chemistry, No. 3
19, p. 321]. Note that the sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from brown algae plants are commonly called fucoidan, fucoidin, and fucan, and it is known that there are several molecular species, but these are often generically called fucoidan. For example, there is a report that a commercially available Sigma fucoidan was divided into 13 kinds of molecular species [Carbohydrate Research, Vol. 255, No. 213-].
224 (1994)], and there are a group of molecular species containing fucose as a main component and a group of molecular species containing a few% of uronic acid and a large amount of fucose and mannose in the constituent sugars. Regarding its biological activity, various things such as enhancement of macrophage activity, suppression of cancer metastasis, anticoagulation, etc. have been reported. Since there are molecular species in sulfated-fucose-containing polysaccharides, it is investigated which molecular species is responsible for the activity. Therefore, it was necessary to separate and purify the sulfated-fucose-containing polysaccharide. The sulfated-fucose-containing polysaccharides include those in which uronic acid is not substantially contained and the main constituent sugar is fucose, and those in which uronic acid is contained in several percent and fucose and mannose are contained in the constituent sugars. Hereinafter, in the present specification, the one substantially free of uronic acid is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, the sulfated-fucose-containing polysaccharide containing uronic acid is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and a mixture of both is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide. Described as a mixture.
【0028】これまでに知られているフコース硫酸含有
多糖−Fやフコース硫酸含有多糖−Uを分離する方法は
分子量分画や陰イオン交換樹脂による分離であり、その
分離は不充分なため薬品や機能性食品として大量調製が
困難なものであった。The known methods for separating the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are molecular weight fractionation and separation by an anion exchange resin. It was difficult to prepare a large amount of functional food.
【0029】また、フコース硫酸含有多糖から着色性物
質を完全に除去することは困難なことが知られており、
市販のフコイダン等にも着色性物質が含まれている。通
常この着色性物質はポリフェノールが重合したものであ
り極めて反応性が強く様々な酵素反応を阻害したり細胞
の生育を阻害したり、また、例えば接した樹脂や樹脂性
の容器等に不可逆的に吸着することがある。そのためフ
コース硫酸含有多糖の生物活性を正確に調べるため、ま
た、容器や樹脂等の汚染を防ぐためにはフコース硫酸含
有多糖から反応性の強い着色性物質を除去する必要があ
った。Further, it is known that it is difficult to completely remove the coloring substance from the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
Commercially available fucoidan and the like also contain coloring substances. Usually, this coloring substance is a polymer of polyphenol and is extremely reactive and inhibits various enzyme reactions and cell growth, and it is irreversibly attached to, for example, a resin or a resin container in contact therewith. May be adsorbed. Therefore, in order to accurately investigate the biological activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide and to prevent the contamination of the container, the resin and the like, it was necessary to remove the highly reactive coloring substance from the sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0030】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する
際に可溶性の酢酸バリウムや塩化バリウムや塩化カルシ
ウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができ
るため、後の精製が有利であることが知られているが、
可溶性のバリウム塩は廃液の処理などが容易ではなく、
また塩化カルシウムは海藻と混合するとpHが変動する
ため非分解性のフコース硫酸含有多糖を得るにはpH調
整が必要である。このpH調整の際に海藻粉末が粘性を
帯びて凝集することがあるため、その後の抽出効率が低
下したり固液分離とりわけろ過が困難となることがあ
る。When soluble barium acetate, barium chloride or calcium chloride is used to extract a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides from brown algae or alcoholic residues of brown algae, the mixture of alginic acid can be suppressed. Is known to be advantageous,
Soluble barium salt is not easy to treat waste liquid,
Further, when calcium chloride is mixed with seaweed, the pH changes, so that pH adjustment is necessary to obtain a non-degradable sulfated-fucose-containing polysaccharide. During this pH adjustment, the seaweed powder may be viscous and aggregate, which may reduce the subsequent extraction efficiency and make solid-liquid separation, especially filtration difficult.
【0031】すなわち、現在フコース硫酸含有多糖の産
業上の有用性が期待されているにも関わらず、分子種的
に分別が充分なフコース硫酸含有多糖−Fやフコース硫
酸含有多糖−Uの市販品もなく、またその効率的な製造
方法に関する報告もない。更には市販のフコース硫酸含
有多糖には上記のように反応性の強い着色性物質が含ま
れている。That is, although the fucose sulfate-containing polysaccharides are currently expected to be industrially useful, commercially available products of the fucose sulfate-containing polysaccharide-F and the fucose sulfate-containing polysaccharide-U which are sufficiently separated in terms of molecular species. There is also no report on its efficient production method. Furthermore, commercially available sulfated-fucose-containing polysaccharides contain a highly reactive coloring substance as described above.
【0032】フコース硫酸含有多糖には様々な活性があ
るが、前述のごとくその分別調製が困難であるためいま
だに実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Fやフコ
ース硫酸含有多糖−Uは得られていなかった。Although the sulfated-fucose-containing polysaccharide has various activities, it is still difficult to fractionate and prepare it as described above, and thus the substantially purified fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide-F and fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide-U have been obtained. There wasn't.
【0033】しかしながら本発明により、実質上純化さ
れたフコース硫酸含有多糖−U、その簡便な抽出方法及
びフコース硫酸含有多糖−Uの製造方法が提供された。
また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除
去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性
の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖−U
が提供された。However, the present invention provides a substantially purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, a simple extraction method thereof and a method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
In addition, according to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U obtained by removing a highly reactive coloring substance that is usually difficult to remove from a sulfated-fucose-containing polysaccharide and causes enzyme reaction inhibition, resin contamination, etc.
Was provided.
【0034】更に本発明により、実質上純化されたフコ
ース硫酸含有多糖−F、その簡便な抽出方法及びフコー
ス硫酸含有多糖−Fの製造方法が提供された。Furthermore, the present invention provides a substantially purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, a simple extraction method thereof and a method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
【0035】また本発明により、通常、フコース硫酸含
有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をも
たらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸
含有多糖−Fが提供された。Further, the present invention provides a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F from which a highly reactive coloring substance which is usually difficult to remove from a sulfated-fucose-containing polysaccharide and which causes enzyme reaction inhibition and resin contamination is removed.
【0036】本発明に使用するフコース硫酸含有多糖と
しては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含
有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、
またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含
有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良
い。フコース硫酸含有多糖抽出液の調製方法、抽出液か
らの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はな
い。As the sulfated-fucose-containing polysaccharide used in the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing substance such as brown algae, sea cucumber and the like may be used, for example, by directly drying and crushing.
Further, a sulfated-fucose-containing polysaccharide extract from a sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing product, or a purified product from the extract may be used. A method for preparing the sulfated-fucose-containing polysaccharide extract and a method for purifying the extract from the extract may be known methods and are not particularly limited.
【0037】また、本発明に使用する、フコース硫酸含
有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的
方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるも
のであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学
的方法を使用することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide degradation product used in the present invention is obtained by degrading a sulfated-fucose-containing polysaccharide by an enzymatic chemical method, a chemical method or a physical method. Enzymatic chemical methods, chemical methods, physical methods can be used.
【0038】また、本発明に使用するフコース硫酸含有
多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許
容される塩を包含する。Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and the sulfated-fucose-containing polysaccharide degradation product used in the present invention include pharmaceutically acceptable salts thereof.
【0039】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物
としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、
昭和52年発刊の原色日本海藻図鑑、第22〜52頁に
記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ(Fucus evan
escens) 、ガゴメ昆布(Kjellmaniella crassifolia)、
マ昆布(Laminaria japonica) 、ワカメ(Undaria pinn
atifida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製する
ことができる。Examples of brown algae plants containing sulfated-fucose-containing polysaccharides include, for example, Yukio Yamada, Sokichi Segawa, nursery company,
There are brown algae plants described on pages 22 to 52 of the Primary Seaweed Illustrated Book published in 1977, and, for example, Hiba Mata (Fucus evan
escens), Gagome kelp (Kjellmaniella crassifolia),
Mackerel (Laminaria japonica), seaweed (Undaria pinn)
atifida) etc. can be used to prepare a sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0040】フコース硫酸含有多糖を含有するナマコと
しては、例えば、特開平4−91027号公報記載のナ
マコがあり、例えばマナマコ(Stichopus japonicus)、
ニセクロナマコ(Holothuria leucospilota)等を使用す
ることができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含
有多糖を調製することができる。Examples of sea cucumbers containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide include sea cucumbers described in Japanese Patent Laid-Open No. 4-91027, for example, sea cucumber (Stichopus japonicus),
Frozen sea cucumber (Holothuria leucospilota) and the like can be used, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide can be prepared by the method described in the publication.
【0041】フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に
有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。
これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩に
なった状態が安定であり、通常ナトリウム及び/又はカ
リウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩は
ダウエックス50W等の陽イオン交換樹脂で処理するこ
とによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれら
の分解物に導くことが可能である。また、これらは、更
に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の塩
に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それ
らの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用い
られ、例えばカリウム、ナトリウム等のアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ
土類金属塩、ピリジニウム等の有機塩基との塩、及びア
ンモニウム塩等が挙げられる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide has a sulfate group in the molecule, and this group reacts with various bases to form a salt.
These sulfated-fucose-containing polysaccharides and their decomposition products are stable in a salt state, and are usually isolated in the form of salts such as sodium and / or potassium. Salts of these substances can be converted into free sulfated-fucose-containing polysaccharides and free degradation products thereof by treating with a cation exchange resin such as Dowex 50W. Further, these may be exchanged with various desired salts by performing publicly known and commonly used salt exchange, if necessary. As the sulfated-fucose-containing polysaccharides and salts of their decomposition products, pharmaceutically acceptable salts are used, for example, alkali metal salts such as potassium and sodium, alkaline earth metal salts such as calcium, magnesium and barium, pyridinium and the like. Examples thereof include salts with organic bases, ammonium salts, and the like.
【0042】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植
物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フ
コース硫酸含有多糖含有粉体を調製することができる。A brown algae plant, a sea cucumber, etc., containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide can be dried and then pulverized to prepare a powder containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0043】フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽
出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖
抽出液を調製することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide extract can be prepared by performing hot water extraction and dilute acid extraction from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing powder.
【0044】フコ−ス硫酸含有多糖含有物からの抽出温
度、時間としては0〜200℃、1〜360分の範囲か
ら目的に応じ選択すれば良いが、通常10〜150℃、
5〜240分、好適には50〜130℃、10〜180
分の範囲より選択して行うのが良い。The extraction temperature and time from the fucoose-sulfuric acid-containing polysaccharide-containing material may be selected according to the purpose from the range of 0 to 200 ° C. and 1 to 360 minutes, but usually 10 to 150 ° C.
5 to 240 minutes, preferably 50 to 130 ° C, 10 to 180
It is better to select from the range of minutes.
【0045】フコース硫酸含有多糖含有率を高めるため
の抽出物精製手段としては、塩化カルシウム、酢酸バリ
ウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化
セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコー
ス硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝
集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応
じこれらを組合せて、精製を行うことができる。As the extract purification means for increasing the content of sulfated-fucose-containing polysaccharides, a method for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides using calcium chloride, barium acetate or the like, or an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride was used. There are methods for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides, methods for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides using an acidic polysaccharide flocculant in the presence of salts, gel filtration, ion exchange chromatography, etc. It can be carried out.
【0046】フコース硫酸含有多糖の分解方法として
は、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸
分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸
含有多糖分解方法として公知の方法を使用することがで
き、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。As a method for decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide, a method known as a method for decomposing a sulfated-fucose-containing polysaccharide, such as a method using a sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme, a method of decomposing an acid or a method of sonication is used. The degradation product can be purified by the above method.
【0047】 通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸
含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種
類はガゴメ昆布である。Normally, a plurality of types of sulfated-fucose-containing polysaccharides are present in brown algae, but the type of brown algae used in the present invention is gagome kelp.
【0048】フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐
藻類の水系溶媒による抽出液を得る。To produce the sulfated-fucose-containing polysaccharide, first, an extract of brown algae with an aqueous solvent is obtained.
【0049】また、抽出に供する海藻は生海藻でも良い
が、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にし
たり、60〜100%のアルコールやアセトン等で洗浄
したり、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけ
ばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に
減少するため有利である。The seaweed to be extracted may be raw seaweed, but before the extract is obtained, the brown algae is dried, made into a dry powder, washed with 60 to 100% alcohol, acetone or the like, formaldehyde or acetaldehyde. Soaking in an aqueous solution containing glutaraldehyde, ammonia, etc. is advantageous because it greatly reduces the mixing of coloring substances into the sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0050】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可
溶性の酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウ
ムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができる
ため後の精製が有利であるが上述した理由により抽出の
際には、1mM〜1M程度の酢酸カルシウム溶液で50
〜130℃で抽出するのが好ましい。When soluble barium acetate, barium chloride, or calcium chloride is used for extracting the sulfated-fucose-containing polysaccharide from brown algae or alcohol washed residues of brown algae, the mixture of alginic acid can be suppressed. Purification is advantageous, but for the reason described above, 50 mM of calcium acetate solution of about 1 mM to 1 M is used for extraction.
Extraction at ~ 130 ° C is preferred.
【0051】海藻が厚手で粉末(粒子)が大きい場合、
最初から0.2M以上の酢酸カルシウムを用いると抽出
効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したもの
に、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿
を除去すれば良い。When the seaweed is thick and the powder (particles) is large,
If 0.2M or more of calcium acetate is used from the beginning, the extraction efficiency may deteriorate. Therefore, calcium acetate may be added to the water-extracted product to remove the formed alginic acid precipitate.
【0052】しかしながらフコース硫酸含有多糖をアル
ギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解
したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限
定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネ
シウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クエン酸、リ
ン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液
が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液の
pHや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、
一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱
いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分
子化が進行し易い。加熱温度、時間、pH等を調整する
ことにより、任意の分解物を調製することができ、例え
ばゲルろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の
平均分子量、分子量分布等を調整することができる。However, the solvent and extraction conditions are not particularly limited in the case where it is desired to extract the sulfated-fucose-containing polysaccharide simultaneously with alginic acid, or to obtain a product which is decomposed to some extent at the time of extraction, and water, salt, magnesium chloride, etc. are not particularly limited. Various neutral salt aqueous solutions of various concentrations, acidic aqueous solutions of various concentrations such as citric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, alkaline aqueous solutions of various concentrations such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. can be used. You may add. The pH, extraction temperature, extraction time, etc. of the extract are not particularly limited,
In general, sulfated-fucose-containing polysaccharides are weak against acids and alkalis, so that when an acidic solution or an alkaline solution is used, lowering of the molecular weight tends to proceed. Arbitrary degradation products can be prepared by adjusting the heating temperature, time, pH, etc., for example, adjusting the average molecular weight, molecular weight distribution, etc. of the degradation products by gel filtration treatment, molecular weight fractionation membrane treatment, etc. You can
【0053】すなわち本発明のフコース硫酸含有多糖−
U及びフコース硫酸含有多糖−Fの分子量及び糖組成は
フコース硫酸含有多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方
法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸
含有多糖の抽出時の加熱条件、pH条件等により異な
る。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解さ
れ、アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低
分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース
硫酸含有多糖−U、フコース硫酸含有多糖−Fの分子
量、分子量分布はその1例にすぎず、フコース硫酸含有
多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易
に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で100℃、1
時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ300の分子ふる
い膜を使用すれば、分子量分布1000から1万程度の
フコース硫酸含有多糖−U、フコース硫酸含有多糖−F
が調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子
量分布の本発明のフコース硫酸含有多糖−U及びフコー
ス硫酸含有多糖−Fを調製できる。That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention-
The molecular weights and sugar compositions of U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F differ depending on the harvest time of the raw material of the sulfated-fucose-containing polysaccharide, the drying method of the raw material, the method of storing the raw material, and the heating conditions during the extraction of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. Depends on pH conditions and the like. For example, a sulfated-fucose-containing polysaccharide is hydrolyzed by an acid, and under alkaline conditions, β-elimination of uronic acid causes a reduction in molecular weight. Therefore, the molecular weight and molecular weight distribution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in the present specification are only one example, and the molecular weight and the molecular weight distribution can be easily changed depending on the treatment conditions of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. Can be changed. For example, weakly alkaline at 100 ℃, 1
When a molecular sieve membrane having a pore size of 300 is used for desalting after heating for an hour, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having a molecular weight distribution of 1,000 to 10,000 are used.
According to the conditions used, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention having an arbitrary molecular weight and molecular weight distribution can be prepared.
【0054】前記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中
性糖等を除くためには、例えば0.2〜0.6Mの濃度
の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくな
るまで塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を加
え、沈殿を集めれば良い。In order to remove alginic acid, neutral sugars and the like from the above-mentioned brown alga extract, for example, in the presence of salts such as sodium chloride at a concentration of 0.2 to 0.6 M, salification is continued until precipitation does not occur. The precipitate may be collected by adding an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium.
【0055】必要に応じてこの沈殿を0.2〜0.6M
の濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セ
チルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、
フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られた
フコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、こ
の沈殿を溶解後陰イオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理
したり限外ろ過等を行ってもよい。また脱塩後凍結乾燥
すれば乾燥標品を得ることもできる。If necessary, this precipitate is added to 0.2 to 0.6M.
After washing with a salt solution such as sodium chloride at a concentration of, the cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with salt-saturated alcohol,
A sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is obtained. In order to remove the dye from the thus-obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, the precipitate may be dissolved and then treated with an anion exchange resin or a polysaccharide resin or subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting.
【0056】本発明者らは0.6〜3Mの1種類又は2
種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多
糖−Fと本発明のフコース硫酸含有多糖−Uが酸性多糖
凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことを見出した。The present inventors used one type or two of 0.6 to 3M.
It was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention behaved completely differently with respect to the acidic polysaccharide flocculant in the presence of more than one salt.
【0057】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Uを分離することができる。For example, the method of the present invention can be used to separate the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention from an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture.
【0058】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に1種又は2種以上の塩類を添加しその総濃度を0.6
〜2Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。First, one or more salts are added to an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture to give a total concentration of 0.6.
~ 2M. Salts to be added are sodium chloride,
It is not particularly limited to calcium chloride and the like.
【0059】通常本発明のフコース硫酸含有多糖−Fと
本発明のフコース硫酸含有多糖−Uを分離する場合1.
5M程度の塩濃度で目的は達成できる(後記する図1の
説明参照)。 例えば上記塩類の塩濃度を1.5Mに調
整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を
これ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫
酸含有多糖−Fが沈殿を形成するので、沈殿を除去する
と本発明のフコース硫酸含有多糖−Uの溶液が得られ
る。必要に応じてこの溶液を濃縮後、4倍量のエタノー
ルなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖−Uを沈殿さ
せ、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコ
ールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−U
を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Uか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。Usually, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention are separated: 1.
The purpose can be achieved with a salt concentration of about 5 M (see the description of FIG. 1 below). For example, when the salt concentration of the above-mentioned salts is adjusted to 1.5 M and then an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride is added until precipitation does not occur any more, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F forms a precipitate. A solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is obtained. If necessary, this solution is concentrated, and then the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U in the solution is precipitated with 4-fold amount of ethanol or the like, and cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with a salt-saturated alcohol to obtain the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention. -U
To get In order to remove the dye from the thus obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the precipitate may be dissolved and then subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting. In addition, a preservative and the like may be added during the process.
【0060】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Fの
みを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニウ
ム等で凝集させる際に、0.2〜0.6Mの塩濃度では
なく、例えば2Mの塩濃度にすれば沈殿は本発明のフコ
ース硫酸含有多糖−Fのみを含む。Next, when it is desired to efficiently produce only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention, when aggregating with cetylpyridinium chloride or the like, a salt concentration of, for example, 2M is used instead of a salt concentration of 0.2 to 0.6M. In terms of salt concentration, the precipitate contains only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention.
【0061】本発明者らは、フコース硫酸含有多糖を陰
イオン交換樹脂で精製する際に2価の陽イオンが共存す
ると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量
が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなること
も見出した。すなわち、本発明の方法を用いて本発明の
フコース硫酸含有多糖−Uを製造する際には、まずフコ
ース硫酸含有多糖混合物に2価の陽イオン源となる薬品
を好ましくは1mM以上添加する。次に、陰イオン交換
樹脂を2価の陽イオンを好ましくは1mM以上含む液で
平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させ
る。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄
後、例えば塩化ナトリウムのグラジエントによりフコー
ス硫酸含有多糖を溶出させる。本方法を用いる場合、添
加する2価陽イオンの濃度は1mM以上ならばよいが、
本発明のフコース硫酸含有多糖−Uをカラムに吸着させ
る目的の時は0.5M未満が望ましい。また本方法に用
いる2価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリ
ウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定される
ものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使
用することができる。The present inventors have found that when a sulfated-fucose-containing polysaccharide is purified with an anion exchange resin, the coexistence of a divalent cation increases the amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide adsorbed per unit amount of resin, resulting in the addition of a sulfated-fucose-containing polysaccharide. It was also found that the separation of polysaccharides is improved. That is, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is produced by using the method of the present invention, first, a divalent cation source chemical, preferably 1 mM or more, is added to the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. Next, the anion exchange resin is equilibrated with a solution containing a divalent cation, preferably 1 mM or more, to adsorb the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After sufficient washing with an equilibrated liquid of this anion exchange resin, the sulfated-fucose-containing polysaccharide is eluted with a gradient of sodium chloride, for example. When this method is used, the concentration of the divalent cation added may be 1 mM or more,
For the purpose of adsorbing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention on a column, less than 0.5M is desirable. In addition, the chemicals used as the divalent cation source used in the present method are particularly excellent in their effects, but calcium salts and barium salts are not particularly limited, and magnesium sulfate, manganese chloride, etc. can also be used. .
【0062】また、褐藻類から通常の方法でフコース硫
酸含有多糖混合物を製造すると上述のように反応性の強
い着色性物質が混入し、それらが接する樹脂や樹脂性容
器を汚染したり、酵素反応や細胞生育を阻害したりす
る。この着色性物質は多糖性の物質あるいは陰イオン交
換基を有する物質に結合あるいは吸着させれば容易に除
去できることを見出した。すなわち、フコース硫酸含有
多糖を含む溶液に例えば、セルロファイン、GCL−2
000(生化学工業社製)や、セファクリルS−50
0、セファデッスクG−200、セファロースCL−2
B(共にファルマシア社製)等の多糖性の樹脂あるい
は、DEAE−セルロファインA−800(生化学工業
社製)、DEAE−セファロースFF、DEAE−セフ
ァデックスA−50、QAE−セファデックスA−5
0、DEAE−セファセル(共にファルマシア社製)、
TSK−ゲルDEAE−トヨパール650、TSK−ゲ
ルDEAEトヨパール550(トーソー社製)、アンバ
ーライト系の陰イオン交換樹脂(オルガノ社販売)キト
パール系の陰イオン交換樹脂(富士紡績社製)等の陰イ
オン交換基を有する物質を添加かくはん後除去したり、
あるいはこれらを充てんしたカラムにフコース硫酸含有
多糖を含む溶液を通過させればこの反応性の強い着色性
物質は容易に除去できる。但し、陰イオン交換樹脂の場
合フコース硫酸含有多糖も結合し得るので、着色性物質
を吸着させる時に塩濃度を2M程度にしておくことが好
ましい。In addition, when a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is produced from brown algae by a usual method, a highly reactive coloring substance is mixed in as described above, which contaminates the resin or resin container with which they are in contact, or the enzymatic reaction. And inhibits cell growth. It has been found that this coloring substance can be easily removed by binding or adsorbing it to a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group. That is, for example, in a solution containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide, cellulofine, GCL-2
000 (manufactured by Seikagaku Corporation) and Sephacryl S-50
0, Sephadex G-200, Sepharose CL-2
Polysaccharide resins such as B (both manufactured by Pharmacia) or DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation), DEAE-Sepharose FF, DEAE-Sephadex A-50, QAE-Sephadex A-5.
0, DEAE-Sephacell (both made by Pharmacia),
Anions such as TSK-gel DEAE-Toyopearl 650, TSK-gel DEAE Toyopearl 550 (manufactured by Tosoh Corporation), amberlite-based anion exchange resin (sold by Organo), and chitopearl-based anion exchange resin (manufactured by Fuji Spinning Co., Ltd.) Addition of substances with exchange groups, removal after stirring,
Alternatively, if a solution containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide is passed through a column filled with these, this highly reactive coloring substance can be easily removed. However, in the case of an anion exchange resin, since a sulfated-fucose-containing polysaccharide can also be bound, it is preferable to keep the salt concentration at about 2M when adsorbing the coloring substance.
【0063】本発明のフコース硫酸含有多糖−Uは例え
ば実施例6に記載のように調製することができる。以
下、このフコース硫酸含有多糖−Uの理化学的性質を示
すが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Uはこの例に限
定されるものではない。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention can be prepared, for example, as described in Example 6. The physicochemical properties of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are shown below, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is not limited to this example.
【0064】本発明のフコース硫酸含有多糖−U、及び
実施例8で得た本発明のフコース硫酸含有多糖−Fの各
塩化ナトリウム濃度における、過剰量の塩化セチルピリ
ジニウム存在下における沈殿形成性を図1に示す。The sulfate-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention obtained in Example 8 at various sodium chloride concentrations were examined for their precipitation-forming properties in the presence of an excessive amount of cetylpyridinium chloride. Shown in 1.
【0065】図1の縦軸は沈殿形成率(%)を示し、横
軸は塩化ナトリウム濃度(M)を示す。図中、実線及び
白丸は本発明のフコース硫酸含有多糖−Uの各塩化ナト
リウム濃度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三
角は本発明のフコース硫酸含有多糖−Fの各塩化ナトリ
ウム濃度(M)での沈殿形成率を示す。The vertical axis in FIG. 1 represents the precipitation formation rate (%), and the horizontal axis represents the sodium chloride concentration (M). In the figure, the solid line and the white circles show the precipitation formation rate of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention at each sodium chloride concentration, and the dotted line and the white triangles in the figure are the sodium chloride of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention. The precipitation formation rate at the concentration (M) is shown.
【0066】沈殿形成率の測定は、溶液温度37℃に
て、以下のように行った。本発明のフコース硫酸含有多
糖−U及びフコース硫酸含有多糖−Fをそれぞれ2%の
濃度で水及び4Mの塩化ナトリウムに溶解し、これらを
様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナト
リウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−U及びフコー
ス硫酸含有多糖−F溶液を各125μlずつ調製した。
次に、塩化セチルピリジニウムを2.5%の濃度で水及
び4Mの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合するこ
とにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した1.2
5%の塩化セチルピリジニウム溶液を調製した。The precipitation formation rate was measured at a solution temperature of 37 ° C. as follows. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention were dissolved in water and 4M sodium chloride at a concentration of 2%, respectively, and these were mixed at various ratios to give various concentrations of sodium chloride. 125 μl each of the dissolved sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solutions were prepared.
Next, cetylpyridinium chloride was dissolved in water and 4M sodium chloride at a concentration of 2.5% and dissolved in various concentrations of sodium chloride by mixing them.
A 5% cetylpyridinium chloride solution was prepared.
【0067】水に溶解している2%の本発明のフコース
硫酸含有多糖−U及びフコース硫酸含有多糖−Fを1.
25%の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿させるに
は容量で3.2倍必要であった。そこで、各濃度の塩化
ナトリウムに溶解した2%のフコース硫酸含有多糖−U
及びフコース硫酸含有多糖−Fの各125μlに対して
各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解した塩化セチルピリ
ジニウム溶液を400μl添加後、充分かくはんし、3
0分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−
硫酸法〔アナリティカル ケミストリー(Analytical C
hemistry) 、第28巻、第350頁(1956)〕によ
り測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸
含有多糖の沈殿形成率を算出した。2% of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention dissolved in water were 1.
3.2 times by volume was required for complete precipitation with 25% cetylpyridinium chloride. Therefore, 2% sulfated-fucose-containing polysaccharide-U dissolved in each concentration of sodium chloride
And to 125 μl of each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, 400 μl of a cetylpyridinium chloride solution dissolved in each concentration of sodium chloride was added, followed by thorough stirring.
After leaving it for 0 minutes, it was centrifuged to measure the sugar content in the supernatant with phenol-
Sulfuric acid method [Analytical C
hemistry), Vol. 28, p. 350 (1956)], and the precipitation formation rate of each sulfated-fucose-containing polysaccharide under each sodium chloride concentration was calculated.
【0068】得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−
Uの分子量をセファクリルS−500を用いたゲルろ過
法により求めたところ、約19万を中心とした分子量分
布を示した(図2参照)。なお、図2において、縦軸は
フェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を4
80nmの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバ
ーを示す。The obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention-
When the molecular weight of U was determined by a gel filtration method using Sephacryl S-500, a molecular weight distribution centered on about 190,000 was shown (see FIG. 2). In Fig. 2, the vertical axis represents the sugar content in the sample measured by the phenol-sulfuric acid method.
The absorbance is shown at 80 nm, and the horizontal axis shows the fraction number.
【0069】なお、ゲルろ過の条件を下記に示す。
カラムサイズ:3.08×162.5cm
溶媒:0.2Mの塩化ナトリウムと10%のエタノール
を含む10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
0)
流速:1.5ml/分
サンプル濃度:0.25%
サンプル液量:20ml
分子量標準物質:Shodex STANDARD P-82(昭和電工社
製)The conditions for gel filtration are shown below. Column size: 3.08 × 162.5 cm Solvent: 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.times.) Containing 0.2 M sodium chloride and 10% ethanol.
0) Flow rate: 1.5 ml / min Sample concentration: 0.25% Sample liquid amount: 20 ml Molecular weight standard substance: Shodex STANDARD P-82 (manufactured by Showa Denko KK)
【0070】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Uの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biologica
l Chemistry)、第175巻、第595頁(1948)の
記載に従いフコース量を定量した。Next, the components of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention were analyzed. First of all, Journal of
Biological chemistry (Journal of Biologica
Chemistry), 175, 595 (1948).
【0071】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−U
の乾燥標品を1規定の塩酸に0.5%の濃度で溶解し、
110℃で2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ(GlycoTAG) 及びグライコタッグ
リージェント キット(GlycoTAG Reagent Kit) (共に
宝酒造社製)を用いて加水分解して得られた単糖の還元
性末端をピリジル−(2)−アミノ化(PA化)し、H
PLCにより構成糖の比率を調べた。なお、HPLCの
条件は下記によった。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:パルパックタイプA(4.6mm×150m
m:宝酒造社製)
溶離液:700mMホウ酸緩衝液(pH9.0):アセ
トニトリル=9:1
検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて
励起波長310nm、蛍光波長380nmで検出
流速:0.3ml/分
カラム温度:65℃Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U
Dissolve the dried sample of 1 in 1N hydrochloric acid at a concentration of 0.5%,
It was treated at 110 ° C. for 2 hours and hydrolyzed into constituent monosaccharides. Next, GlycoTAG and GlycoTag
The reducing end of the monosaccharide obtained by hydrolysis using GlycoTAG Reagent Kit (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) is pyridyl- (2) -aminated (PA-modified) and H
The ratio of constituent sugars was examined by PLC. The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm x 150 m
m: Takara Shuzo Co., Ltd.) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9.0): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) Excitation wavelength 310 nm, Fluorescence wavelength 380 nm : 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C
【0072】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry)、第4巻、第330頁
(1962)の記載に従いウロン酸量を定量した。Next, the amount of uronic acid was quantified according to the description in Analytical Biochemistry, Volume 4, p. 330 (1962).
【0073】次に、バイオケミカル ジャーナル(Bioc
hemical Journal)、第84巻、第106頁(1962)
の記載に従い硫酸含量を定量した。Next, the Biochemical Journal (Bioc
hemical Journal), Vol. 84, p. 106 (1962).
The sulfuric acid content was quantified as described in.
【0074】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Uの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトー
ス、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸で
あった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかっ
た。また、主要成分のフコース:マンノース:ガラクト
ース:ウロン酸:硫酸基はモル比で約10:7:4:
5:20であった。As a result, the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U were fucose, mannose, galactose, glucose, rhamnose, xylose and uronic acid. It was substantially free of other neutral sugars. In addition, the main component fucose: mannose: galactose: uronic acid: sulfate groups are in a molar ratio of about 10: 7: 4 :.
It was 5:20.
【0075】次に、フコース硫酸含有多糖−Uのカルシ
ウム塩のIRスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計
JIR−DIAMOND20(日本電子社製)により
測定したところ図3に示すスペクトルが得られた。な
お、図3において縦軸は透過率(%)、横軸は波数(c
m−1)を示す。Next, the IR spectrum of the calcium salt of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was measured with a Fourier transform infrared spectrophotometer JIR-DIAMOND20 (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 3 was obtained. In FIG. 3, the vertical axis represents the transmittance (%) and the horizontal axis represents the wave number (c
m- 1 ) is shown.
【0076】次に、本発明のフコース硫酸含有多糖−U
のカルシウム塩のNMRスペクトルを500MHzの核
磁気共鳴装置JNM−α500型核磁気共鳴装置(日本
電子社製)により測定したところ図4に示すスペクトル
が得られた。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention
The NMR spectrum of the calcium salt was measured by a 500 MHz nuclear magnetic resonance apparatus JNM-α500 type nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 4 was obtained.
【0077】図4中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化
学シフト値(ppm)を示す。なお、 1H−NMRで
の化学シフト値はHODの化学シフト値を4.65pp
mとして表した。1
H−NMR(D2 O)
δ5.27(マンノースの1位のH)、5.07(フコ
ースの1位のH)、4.49(フコースの3位のH)、
4.37(グルクロン酸の1位のH)、4.04(フコ
ースの4位のH)、3.82(フコースの2位のH)、
3.54(グルクロン酸の3位のH)、3.28(グル
クロン酸の2位のH)、1.09(フコースの5位のC
H3 のH)In FIG. 4, the vertical axis represents signal intensity and the horizontal axis represents chemical shift value (ppm). The chemical shift value in 1 H-NMR is 4.65 pp as the chemical shift value in HOD.
Expressed as m. 1 H-NMR (D 2 O) δ 5.27 (H at 1st position of mannose), 5.07 (H at 1st position of fucose), 4.49 (H at 3rd position of fucose),
4.37 (H at position 1 of glucuronic acid), 4.04 (H at position 4 of fucose), 3.82 (H at position 2 of fucose),
3.54 (H at the 3-position of glucuronic acid), 3.28 (H at the 2-position of glucuronic acid), 1.09 (C at the 5-position of fucose)
H of H 3 )
【0078】この本発明のフコース硫酸含有多糖−Uの
凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計SEPA−
300(堀場製作所製)により測定したところ、−5
3.6度であった。The specific optical rotation of the freeze-dried product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention was measured with a high-speed and high-sensitivity polarimeter SEPA-
-5 when measured by 300 (manufactured by Horiba Ltd.)
It was 3.6 degrees.
【0079】本発明者らは、以下に述べるごとく得られ
た本発明のフコース硫酸含有多糖−Uの構造を決定し
た。The present inventors have determined the structure of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention obtained as described below.
【0080】フコース硫酸含有多糖−Uを分解する能力
を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Uの分
解及び分解物の精製
精製したフコース硫酸含有多糖−Uに下記のエンド型フ
コイダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。Decomposition of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U by a degrading enzyme capable of degrading sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and purification of the decomposed product The purified endo-fucoidan-degrading enzyme described below is caused to act on the purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. The decomposition product was purified.
【0081】すなわち、1%のフコース硫酸含有多糖−
U溶液16mlと、50mMのリン酸緩衝液(pH8.
0)12mlと4Mの塩化ナトリウム4mlと32mU
/mlのエンド型フコイダン分解酵素溶液8mlを混合
し、25℃で48時間反応させた。反応の進行と共に2
30nmの吸光度が増加することを確認し、本酵素によ
りフコース硫酸含有多糖−Uが分解されていることが判
明した。この反応液をマイクロアシライザーG3(旭化
成社製)により脱塩後、DEAE−セファロースFFに
より3つの画分(a)、(b)、及び(c)に分離精製
した。That is, a polysaccharide containing 1% sulfuric acid fucose-
16 ml of U solution and 50 mM phosphate buffer (pH 8.
0) 12 ml and 4 M sodium chloride 4 ml and 32 mU
/ Ml of endo-fucoidan degrading enzyme solution (8 ml) was mixed and reacted at 25 ° C for 48 hours. 2 as the reaction progresses
It was confirmed that the absorbance at 30 nm increased, and it was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was decomposed by this enzyme. The reaction solution was desalted with Micro Acylyzer G3 (manufactured by Asahi Kasei Corp.), and then separated and purified into three fractions (a), (b), and (c) by DEAE-Sepharose FF.
【0082】なお、上記のエンド型フコイダン分解酵素
は以下の方法により調製される。The above endo-type fucoidan degrading enzyme is prepared by the following method.
【0083】該エンド型フコイダン分解酵素の生産に用
いる菌株としては、該エンド型フコイダン分解酵素生産
能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体
例としては例えば、フラボバクテリウム(Flavobacteri
um)sp. SA−0082株(FERM BP−54
02)が挙げられる。The strain used for the production of the endo-fucoidan-degrading enzyme may be any strain as long as it has the ability to produce the endo-fucoidan-degrading enzyme. Specific examples include, for example, Flavobacterium (Flavobacteri).
um) sp. SA-0082 strain (FERM BP-54
02).
【0084】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。
1.フラボバクテリウム sp. SA−0082株
a.形態的性質
(1)本菌は短かん菌である。
幅 0.8〜1.0μm
長さ 1.0〜1.2μm
(2)胞子の有無 なし
(3)グラム染色性 陰性
b.生理的性質
(1)生育の温度範囲
37℃以下で生育できる。好適な生育温度は15〜28
℃である。
(2)酸素に対する態度 好気性
(3)カタラーゼ 陽性
(4)オキシダーゼ 陽性
(5)ウレアーゼ 弱陽性
(6)酸の生成
D−グルコース 陽性
ラクトース 陽性
マルトース 陽性
D−マンニトール 陽性
スクロース 陰性
トレハロース 陰性
(7)加水分解
デンプン 陰性
ゼラチン 陽性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
(8)硝酸塩の還元 陰性
(9)インドールの生成 陰性
(10)硫化水素の生成 陰性
(11)ミルクの凝固 陰性
(12)ナトリウムの要求性 陽性
(13)塩類要求性
0%食塩培地での生育 陰性
1%食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
(14)キノン系 メナキノン6
(15)菌体内DNAのGC含量 32%
(16)OF−テスト O
(17)集落の色調 黄色系
(18)運動性 なし
(19)滑走性 なしThe present strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. 1. Flavobacterium sp. SA-0082 strain a. Morphological properties (1) This bacterium is a short bacterium. Width 0.8 to 1.0 μm Length 1.0 to 1.2 μm (2) Presence or absence of spores (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) It can grow in the temperature range of growth of 37 ° C or lower. Suitable growth temperature is 15-28
℃. (2) Attitude toward oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase positive (5) Urease Weak positive (6) Acid generation D-glucose positive lactose positive maltose positive D-mannitol positive sucrose negative trehalose negative (7) water Degraded starch Negative gelatin Positive casein Negative esculin Positive (8) Nitrate reduction Negative (9) Indole formation Negative (10) Hydrogen sulfide formation Negative (11) Milk coagulation Negative (12) Sodium requirement positive (13) Salts Requirement Growth in 0% saline medium Negative Growth in 1% saline medium Negative Growth in seawater medium Positive (14) Quinone menaquinone 6 (15) GC content of intracellular DNA 32% (16) OF-test O ( 17) Color of the village Yellowish (18) No mobility (19) No gliding
【0085】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー(Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology) 、第1巻(198
4)、及びバージーズ マニュアル オブ ディターミ
ネイティブ バクテリオロジー (Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology)、第9巻(1994)に記
載のフラボバクテリウム アクアタイル(Flavobacteri
um aquatile)、及びフラボバクテリウム メニンゴセプ
チカム(Flavobacterium meningosepticum) の類縁細菌
と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形
成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを
分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが
陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できな
い点、37℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株
をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバ
クテリウム sp. SA−0082と命名した。This strain is based on the Bergies Manual of Cysticatic Bacteriology (Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology), Volume 1 (198
4), and the Burgies Manual of Derminative Bacteriology (Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology), Volume 9 (1994).
um aquatile) and Flavobacterium meningosepticum (Flavobacterium meningosepticum), but the former does not assimilate sucrose to form an acid, cannot decompose casein, and can decompose esculin. The difference is that gelatin can be liquefied and urease is positive, and the latter is different in that casein cannot be decomposed and that it grows slowly at 37 ° C. Therefore, this strain was identified as a bacterium belonging to Flavobacterium and flavobacterium sp. It was named SA-0082.
【0086】なお、上記菌株は Flavobacterium sp.
SA−0082と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目
1番3号(郵便番号305)]に平成7年3月29日よ
りFERM P−14872として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERMB
P−5402(国際寄託への移管請求日: 平成8年2
月15日)として寄託されている。The above strain was Flavobacterium sp.
SA-0082 is displayed, and it is displayed on the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [1-3-1-3 Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305)] from March 29, 1995. Deposited as 14872, FERMB in the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry
P-5402 (Request for transfer to international deposit: 1996 1996)
(15th of a month).
【0087】本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌
株が利用し、エンド型フコイダン分解酵素を生産するも
のであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海
藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニト
ール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラク
トース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母
エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が
適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩
類を加えてもよい。The nutrient source added to the culture medium of this strain may be any one that can be utilized by the strain to be used and produces an endo-type fucoidan-degrading enzyme. Examples of the carbon source include fucoidan, seaweed powder, alginic acid, fucose, glucose and mannitol. , Glycerol, saccharose, maltose, lactose, starch and the like can be used, and as nitrogen sources, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract, defatted soybean, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.
【0088】本エンド型フコイダン分解酵素の生産菌を
培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、
一般に培養温度は、15℃〜30℃、培地のpHは5〜
9がよく、5〜72時間の通気かくはん培養で本エンド
型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条
件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本エンド型フコ
イダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するの
は当然のことである。In culturing the bacterium producing the endo-type fucoidan-degrading enzyme, the production amount varies depending on the culture conditions.
Generally, the culture temperature is 15 ° C to 30 ° C, and the pH of the medium is 5 ° C.
9 is the best, and the production amount of the present endo-type fucoidan-degrading enzyme reaches the maximum after aeration and agitation culture for 5 to 72 hours. It is natural that the culture conditions are set so as to maximize the production of the endo-fucoidan-degrading enzyme according to the strain used, the composition of the medium, and the like.
【0089】本エンド型フコイダン分解酵素は菌体中に
も培養物上清中にも存在する。The endo-type fucoidan-degrading enzyme is present in both bacterial cells and culture supernatant.
【0090】上記のフラボバクテリウム sp. SA
−0082株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、
通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理など
で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。The above-mentioned Flavobacterium sp. SA
-0082 strain is cultivated in an appropriate medium, the bacterial cells are collected,
A cell-free extract can be obtained by disrupting the cells by a commonly used cell disruption means such as ultrasonication.
【0091】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本エンド型フコイダン
分解酵素を得ることができる。Then, a purified enzyme preparation can be obtained from this extract by a commonly used purification means. For example, purification can be performed by salting out, ion exchange column chromatography, hydrophobic binding column chromatography, gel filtration, etc. to obtain a purified endo-fucoidan degrading enzyme free of other fucoidan degrading enzymes.
【0092】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素(菌体外酵素)が大量に存在する
ので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製すること
ができる。Since the enzyme (extracellular enzyme) is present in a large amount in the supernatant of the culture solution obtained by removing the cells from the above-mentioned culture solution, it can be purified by the same purification means as the intracellular enzyme. it can.
【0093】エンド型フコイダン分解酵素の精製例を示
す。An example of purification of endo-fucoidan degrading enzyme will be shown.
【0094】フラボバクテリウム sp. SA−00
82(FERM BP−5402)をグルコース0.2
5%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.05%を含む
人工海水(ジャマリンラボラトリー製)pH7.5から
なる培地600mlを分注して殺菌した(120℃、2
0分)2リットルの三角フラスコに接種し、24℃で2
4時間培養して種培養液とした。グルコース0.25
%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.05%、及び消
泡剤(信越化学工業製KM70)0.01%を含む人工
海水(ジャマリンラボラトリー製)pH7.5からなる
培地20リットルを30リットル容のジャーファーメン
ターに入れ120℃で20分殺菌した。冷却後、上記の
種培養液600mlを接種し、24℃で24時間、毎分
10リットルの通気量と毎分125回転のかくはん速度
の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して
菌体を得た。Flavobacterium sp. SA-00
82 (FERM BP-5402) with glucose 0.2
600 ml of a medium consisting of artificial seawater (manufactured by Jamarin Laboratory) pH 7.5 containing 5%, peptone 1.0% and yeast extract 0.05% was dispensed and sterilized (120 ° C, 2
(0 min) Inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask and mix at 2
The cells were cultured for 4 hours to obtain a seed culture solution. Glucose 0.25
%, Peptone 1.0%, yeast extract 0.05%, and antifoaming agent (Shin-Etsu Chemical KM70) 0.01% artificial seawater (Jamarine Laboratory) pH 7.5 containing 20 liters of medium 30 It was put in a liter fermenter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, 600 ml of the above seed culture was inoculated and cultured at 24 ° C. for 24 hours under the conditions of an aeration rate of 10 liters per minute and a stirring speed of 125 rpm. After the completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain bacterial cells.
【0095】この菌体を、200mMの食塩を含む20
mMの酢酸−リン酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、超
音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体
抽出液中の本エンド型フコイダン分解酵素の活性を測定
したところ、培地1ml中に5mUの活性が検出され
た。The cells were treated with 20 mM sodium chloride.
The cells were suspended in mM acetic acid-phosphate buffer (pH 7.5), ultrasonically disrupted, and then centrifuged to obtain a cell extract. When the activity of the endo-type fucoidan degrading enzyme in this bacterial cell extract was measured, an activity of 5 mU was detected in 1 ml of the medium.
【0096】本抽出液に、終濃度が90%飽和となるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離
し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、5
0mMの食塩を含む20mMの酢酸−リン酸緩衝液(p
H7.5)で充分透析した。透析により生じた沈殿を遠
心分離により除去後、あらかじめ50mMの食塩を含む
20mMの酢酸−リン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化
したDEAE−セファロースFFのカラムに吸着させ、
吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、50mMから600
mMの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を
集めた。次にこの活性画分に終濃度が4Mとなるように
食塩を加え、あらかじめ4Mの食塩を含む20mMのリ
ン酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したフェニルセファ
ロースCL−4Bのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝
液で充分洗浄後、4Mから1Mの食塩のグラジエントに
より溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を
限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ50mM食塩を含む1
0mMリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル S−3
00でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分
子量をセファクリル S−300の保持時間から求めた
ところ約46万であった。次にこの活性画分を250m
Mの食塩を含む10mMのリン酸緩衝液(pH7)で透
析した。この酵素液を、あらかじめ250mMの食塩を
含む10mMのリン酸緩衝液(pH7)で平衡化したモ
ノ(Mono)Q HR5/5のカラムに吸着させ、吸着物
を同緩衝液で充分洗浄後、250mMから450mMの
食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集め、
精製酵素を得た。以上の精製工程を表1に示す。Ammonium sulfate was added to this extract to a final concentration of 90% saturation, and the mixture was stirred and dissolved, followed by centrifugation, and the precipitate was suspended in the same buffer solution as the above-mentioned bacterial cell extract.
20 mM acetate-phosphate buffer containing 0 mM sodium chloride (p
It was dialyzed thoroughly with H7.5). After removing the precipitate generated by dialysis by centrifugation, the precipitate was adsorbed on a column of DEAE-Sepharose FF equilibrated with 20 mM acetic acid-phosphate buffer (pH 7.5) containing 50 mM sodium chloride in advance,
After thoroughly washing the adsorbate with the same buffer, from 50 mM to 600
The active fraction was collected by elution with a gradient of mM NaCl. Next, sodium chloride was added to this active fraction so that the final concentration was 4 M, and it was adsorbed on a phenyl sepharose CL-4B column equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 4 M sodium chloride in advance. The adsorbate was thoroughly washed with the same buffer and then eluted with a 4 M to 1 M sodium chloride gradient to collect active fractions. Next, this active fraction was concentrated with an ultrafilter and then pre-contained with 50 mM sodium chloride.
Sephacryl S-3 equilibrated with 0 mM phosphate buffer
Gel filtration was performed at 00 to collect active fractions. The molecular weight of this enzyme was about 460,000 when determined from the retention time of Sephacryl S-300. Next, this active fraction is 250 m
It was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7) containing M sodium chloride. This enzyme solution was adsorbed to a column of Mono (Mono) Q HR5 / 5, which had been equilibrated with a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7) containing 250 mM sodium chloride in advance, and the adsorbed material was thoroughly washed with the same buffer solution and then 250 mM. To a 450 mM sodium chloride gradient to collect the active fractions,
A purified enzyme was obtained. Table 1 shows the above purification steps.
【0097】[0097]
【表1】 [Table 1]
【0098】本酵素の活性測定は下記の様に行う。The activity of this enzyme is measured as follows.
【0099】2.5%のガゴメ昆布由来のフコイダン溶
液50μlと、10μlの本酵素と、60μlの667
mM塩化ナトリウムを含む83mMリン酸緩衝液pH
7.5を混合し、37℃、3時間反応させた後、反応液
105μlと水2mlを混合かくはんし、その230n
mにおける吸光度(AT)を測定する。対照として、本
酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみを
用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン
溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意
し、それぞれ同様に吸光度を測定する(AB1及びAB
2)。50 μl of a 2.5% fucoidan solution derived from Gagome kelp, 10 μl of the present enzyme, and 60 μl of 667
83 mM phosphate buffer pH containing mM sodium chloride
7.5 was mixed and reacted at 37 ° C. for 3 hours, then 105 μl of the reaction mixture and 2 ml of water were mixed and stirred, and
The absorbance (AT) at m is measured. As a control, instead of this enzyme, prepared was one that was reacted under the same conditions using only the above buffer solution in which this enzyme was dissolved, and one that was reacted using only water instead of the fucoidan solution. , And the absorbance is measured in the same manner (AB1 and AB
2).
【0100】1単位の酵素は、上記反応系において1分
間に1μmolのマンノースとウロン酸の間のグリコシ
ド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結
合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミ
リモル分子吸光係数を5.5として計算し行う。なお、
酵素の活性は下記式により求める。
(AT−AB1−AB2)×2.105×120/5.
5×105×0.01×180=U/ml
2.105:吸光度を測定するサンプルの液量(ml)
120:酵素反応液の液量(μl)
5.5:不飽和ウロン酸の230nmにおけるミリモル
分子吸光係数(/mM)
105:希釈に用いる反応液の液量(μl)
0.01:酵素液量(ml)
180:反応時間(分)One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the glycosidic bond between 1 μmol of mannose and uronic acid in one minute in the above reaction system. The quantification of the cleaved bond is carried out by calculating the millimolar molecular extinction coefficient of unsaturated uronic acid produced during the elimination reaction as 5.5. In addition,
The enzyme activity is calculated by the following formula. (AT-AB1-AB2) x 2.105 x 120/5.
5 × 105 × 0.01 × 180 = U / ml 2.105: Volume of sample for measuring absorbance (ml) 120: Volume of enzyme reaction solution (μl) 5.5: Unsaturated uronic acid at 230 nm Millimolar extinction coefficient (/ mM) 105: volume of reaction solution used for dilution (μl) 0.01: volume of enzyme solution (ml) 180: reaction time (minutes)
【0101】タンパク質の定量は、酵素液の280nm
の吸光度を測定することにより行う。その際1mg/m
lのタンパク質溶液の吸光度を1.0として計算する。The protein was quantified by measuring the enzyme solution at 280 nm.
It is performed by measuring the absorbance. At that time 1 mg / m
The absorbance of 1 of the protein solution is calculated as 1.0.
【0102】なお基質のガゴメ昆布由来のフコイダンは
次の様に調製した。The fucoidan derived from the substrate Gagome kelp was prepared as follows.
【0103】乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機M−2型(奈
良機械製作所製)により粉砕し、10倍量の85%メタ
ノール中で70℃、2時間処理後、ろ過し、残渣を10
倍量のメタノール中で70℃、2時間処理し、ろ過す
る。残渣に20倍量の水を加え、100℃、3時間処理
しろ過により抽出液を得る。抽出液の塩濃度を400m
Mの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジ
ニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離する。その沈殿を、エタノールで充分洗浄
し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できた
ら、限外ろ過器(ろ過膜の排除分子量10万)(アミコ
ン社製)により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じ
た沈殿を遠心分離により除去する。この上清を凍結乾燥
して精製ガゴメ昆布フコイダンを得る。The dried gagome kelp was crushed by a free crusher M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), treated with 10 times amount of 85% methanol at 70 ° C. for 2 hours, filtered, and the residue 10
It is treated at 70 ° C. for 2 hours in a double amount of methanol and filtered. 20 times amount of water is added to the residue, treated at 100 ° C. for 3 hours and filtered to obtain an extract. The salt concentration of the extract is 400m
After making the same as the M sodium chloride solution, cetylpyridinium chloride is added until no more precipitation occurs, and the mixture is centrifuged. The precipitate was thoroughly washed with ethanol, and when cetylpyridinium chloride could be completely removed, desalting and removal of low-molecular weight components were carried out using an ultrafilter (the molecular weight excluded from the filtration membrane was 100,000) (Amicon). The precipitate formed is removed by centrifugation. The supernatant is freeze-dried to obtain purified Gagome kelp fucoidan.
【0104】酵素反応生成物の構造解析
上記のエンド型フコイダン分解酵素は、フコース硫酸含
有多糖−U中に存在するD−マンノースとD−グルクロ
ン酸の間のα1→4結合を脱離的に分解する酵素であ
り、得られたフコース硫酸含有多糖−Uに作用させると
下記式(I)、(II)、及び(III)の構造を有するオ
リゴ糖が生成した。Structural Analysis of Enzymatic Reaction Product The endo-fucoidan-degrading enzyme described above detachably decomposes the α1 → 4 bond between D-mannose and D-glucuronic acid present in the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. When the resulting sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is an enzyme, the oligosaccharides having the structures of the following formulas (I), (II) and (III) are produced.
【化10】 [Chemical 10]
【化11】 [Chemical 11]
【化12】 [Chemical 12]
【0105】以下、詳細に説明する。The details will be described below.
【0106】上記のDEAE−セファロースFFで分離
精製した3つの画分(a)、(b)、及び(c)をそれ
ぞれ一部だけグライコタッグ及びグライコタッグ リー
ジェント キットを用いて還元性末端を、ピリジル−
(2)−アミノ化(PA化)し、各PA化糖(PA−
a)、(PA−b)、及び(PA−c)を得た。(PA
−a)、(PA−b)、及び(PA−c)をHPLCに
より分析した。[0106] A portion of each of the three fractions (a), (b), and (c) separated and purified by the DEAE-Sepharose FF described above was used in part by using Glycotag and Glycotag Regent kit to remove the reducing end from pyridyl. −
(2) -Amination (PA-ization), and each PA-modified sugar (PA-
a), (PA-b), and (PA-c) were obtained. (PA
-A), (PA-b), and (PA-c) were analyzed by HPLC.
【0107】なお、HPLCの条件は下記によった。The HPLC conditions were as follows.
【0108】(ア)分子量分画カラムを用いたHPLC
分析
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:SHODEX SB−803(4.6×250
mm)(昭和電工社製)
溶離液:0.2M塩化ナトリウム:ジメチルスルホキシ
ド=9:1
検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて
励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出
流速:1ml/分
カラム温度:50℃(A) HPLC using a molecular weight fractionation column
Analytical apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: SHODEX SB-803 (4.6 x 250)
mm) (manufactured by Showa Denko KK) Eluent: 0.2 M sodium chloride: dimethylsulfoxide = 9: 1 Detection: fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi Ltd.) excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm detection flow rate: 1 ml / Min Column temperature: 50 ℃
【0109】(イ)逆相カラムを用いたHPLC分析
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:L−カラム(4.6×250mm)〔(財)化
学薬品検査協会〕
溶離液:50mM酢酸−トリエチルアミン(pH5.
5)
検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて
励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出
流速:1ml/分
カラム温度:40℃(A) HPLC analyzer using reverse phase column: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: L-column (4.6 × 250 mm) [Chemicals Inspection Society of Japan] Eluent: 50 mM Acetic acid-triethylamine (pH 5.
5) Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) with excitation wavelength 320 nm and fluorescence wavelength 400 nm, detection flow rate: 1 ml / min Column temperature: 40 ° C.
【0110】図5、6、及び7には各々ピリジル−
(2)−アミノ化糖化合物(PA−a)、(PA−
b)、及び(PA−c)のHPLCの各溶出パターンを
示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間
(分)を示す。Pyridyl- is shown in FIGS. 5, 6 and 7, respectively.
(2) -aminated sugar compound (PA-a), (PA-
b) and (PA-c) HPLC elution patterns are shown, in which the vertical axis represents relative fluorescence intensity and the horizontal axis represents retention time (minutes).
【0111】下記に式(I)、式(II)、及び式(II
I)で表される化合物、すなわち(a)、(b)、及び
(c)の物性を示す。The formula (I), formula (II), and formula (II
The physical properties of the compound represented by I), that is, (a), (b), and (c) are shown.
【0112】図8に(a)の、図9に(b)の、図10
に(c)のマスのスペクトルを示し、図11に(a)
の、図12に(b)の、図13に(c)のマスマスのス
ペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度(%)、
横軸はm/z値を示す。FIG. 8A, FIG. 9B, FIG.
The spectrum of the mass of (c) is shown in FIG.
FIG. 12 (b) and FIG. 13 (c) show mass spectrums, where the vertical axis represents relative intensity (%),
The horizontal axis represents m / z value.
【0113】更に図14は(a)の、図15は(b)
の、図16は(c)の 1H−NHRスペクトルを示
し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シ
フト値(ppm)を示す。Further, FIG. 14 shows (a) and FIG. 15 shows (b).
16 shows the 1 H-NHR spectrum of (c), and in each figure, the vertical axis shows the signal intensity and the horizontal axis shows the chemical shift value (ppm).
【0114】なお、 1H−NHRでの化学シフト値は
HODの化学シフト値を4.65ppmとして表した。The chemical shift value for 1 H-NHR was expressed by setting the chemical shift value of HOD to 4.65 ppm.
【0115】(a)の物性
分子量 564
MS m/z 563〔M−H+ 〕−
MS/MS m/z 97〔HSO4 〕− 、157
〔不飽和D−グルクロン酸−H2 O−H+ 〕− 、
175〔不飽和D−グルクロン酸−H+ 〕−、225
〔L−フコース硫酸−H2 O−H+ 〕− 、243
〔L−フコース硫酸−H+ 〕− 、319〔不飽和D
−グルクロン酸とD−マンノースが結合したもの−H
2 O−H+ 〕− 、405〔M−不飽和D−グルク
ロン酸−H + 〕− 、483〔M−SO3 −
H+ 〕− 1
H−NMR(D2 O)
δ5.78(1H,d,J=3.7Hz,4″−H)、
5.26(1H,d,J=1.2Hz,1−H)、5.
12(1H,d,J=4.0Hz,1′−H)、5.0
3(1H,d,J=6.1Hz,1″−H)、4.47
(1H,d−d,J=3.4,10.4Hz,3′−
H)、4.21(1H,br−s,2−H)、4.12
(1H,m,5′−H)、4.10(1H,d−d,J
=3.7,5.8Hz,3″−H)、4.03(1H,
d,J=3.4Hz,4′−H)、3.86(1H,
m,3−H)、3.83(1H,d−d,J=4.0,
10.4Hz,2′−H)、3.72(1H,m,4−
H)、3.72(1H,m,5−H)、3.70(2
H,m,5−CH2 のH2 )、3.65(1H,d
−d,J=5.8,6.1Hz,2″−H)、1.08
(3H,d,J=6.7Hz,5′−CH3 の
H3 )
糖組成 L−フコース:不飽和D−グルクロン酸:D−
マンノース=1:1:1(各1分子)
硫酸塩 1分子(L−フコースの3位)
なお、 1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下
記式(IV)の通りである。Physical properties of (a)
Molecular weight 564
MS m / z 563 [MH+]−
MS / MS m / z 97 [HSOFour]−157
[Unsaturated D-glucuronic acid-HTwoOH+]−,
175 [unsaturated D-glucuronic acid-H+]−225
[L-fucose sulfate-HTwoOH+]−243
[L-fucose sulfate-H+]−319 [Unsaturated D
-Glucuronic acid bound to D-mannose-H
TwoOH+]−, 405 [M-unsaturated D-gluc
Lonic acid-H +]−, 483 [M-SOThree−
H+]− 1
H-NMR (DTwoO)
δ 5.78 (1H, d, J = 3.7Hz, 4 ″ -H),
5.26 (1H, d, J = 1.2Hz, 1-H), 5.
12 (1H, d, J = 4.0Hz, 1'-H), 5.0
3 (1H, d, J = 6.1Hz, 1 "-H), 4.47
(1H, d-d, J = 3.4, 10.4Hz, 3'-
H), 4.21 (1H, br-s, 2-H), 4.12
(1H, m, 5'-H), 4.10 (1H, dd, J
= 3.7, 5.8 Hz, 3 ″ -H), 4.03 (1H,
d, J = 3.4 Hz, 4'-H), 3.86 (1H,
m, 3-H), 3.83 (1H, d-d, J = 4.0,
10.4Hz, 2'-H), 3.72 (1H, m, 4-
H), 3.72 (1H, m, 5-H), 3.70 (2
H, m, 5-CHTwoHTwo) 3.65 (1H, d
-D, J = 5.8, 6.1 Hz, 2 "-H), 1.08
(3H, d, J = 6.7Hz, 5'-CHThreeof
HThree)
Sugar composition L-fucose: unsaturated D-glucuronic acid: D-
Mannose = 1: 1: 1 (1 molecule each)
1 molecule of sulfate (3rd position of L-fucose)
In addition,1The number assigned to the peak in 1 H-NMR is as follows.
It is as shown in expression (IV).
【化13】 [Chemical 13]
【0116】(b)の物性
分子量 724
MS m/z 723〔M−H+ 〕− 、361〔M
−2H+ 〕2−
MS/MS m/z 97〔HSO4 〕− 、175
〔不飽和D−グルクロン酸−H+ 〕− 、243〔L
−フコース硫酸−H+ 〕− 、321〔M−SO3
−2H+〕2−、405〔M−不飽和D−グルクロン酸
−2SO3−H+ 〕− 、417(M−L−フコース
−2SO3 −H+ 〕− 1
H−NMR(D2 O)
δ5.66(1H,d,J=3.4Hz,4″−H)、
5.27(1H,d,J=7.3Hz,1″−H)、
5.22(1H,d,J=1.8Hz,′−H)、5.
21(1H,d,J=3.7Hz,1′−H)、4.5
0(1H,d,J=3.1Hz,4′−H)、4.32
(1H,q,J=6.7Hz,5′−H)、4.27
(1H,d−d,J=3.7,10.4Hz,2′−
H)、4.21(1H,d−d,J=3.4,6.7H
z,3″−H)、4.18(1H,d−d,J=1.
8,11.0Hz,5−CHのH)、4.15(1H,
br−s,2−H)、4.10(1H,d−d,J=
5.8,11.0Hz、5−CHのH)、3.99(1
H,d−d,J=3.1,10.4Hz,3′−H)、
3.90(1H,m,5−H)、3.82(1H,m,
3−H)、3.82(1H,m,4−H)3.54(1
H,br−t,J=7.3Hz,2″−H)、1.11
(3H,d,J=6.7Hz,5′−CH3 の
H3 )
糖組成 L−フコース:不飽和D−グルクロン酸:D−
マンノース=1:1:1(各1分子)
硫酸塩 3分子(L−フコースの2位と4位及びD−マ
ンノースの6位)
なお、 1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下
記式(V)の通りである。Physical properties of (b) Molecular weight 724 MS m / z 723 [MH + ] - , 361 [M
-2H +] 2- MS / MS m / z 97 [HSO 4] -, 175
[Unsaturated D-glucuronic acid-H + ] - , 243 [L
- fucose -H +] -, 321 [M-SO 3
-2H +] 2-, 405 [M- unsaturated D- glucuronic acid -2SO 3 -H +] -, 417 (M-L- fucose -2SO 3 -H +] - 1 H-NMR (D 2 O) δ5.66 (1H, d, J = 3.4Hz, 4 ″ -H),
5.27 (1H, d, J = 7.3 Hz, 1 ″ -H),
5.22 (1H, d, J = 1.8Hz, '-H), 5.
21 (1H, d, J = 3.7Hz, 1'-H), 4.5
0 (1H, d, J = 3.1Hz, 4'-H), 4.32
(1H, q, J = 6.7Hz, 5'-H), 4.27
(1H, d-d, J = 3.7, 10.4Hz, 2'-
H), 4.21 (1H, dd, J = 3.4, 6.7H)
z, 3 "-H), 4.18 (1H, d-d, J = 1.
8,11.0 Hz, 5-CH H), 4.15 (1H,
br-s, 2-H), 4.10 (1H, dd, J =
5.8, 11.0 Hz, 5-CH H), 3.99 (1
H, dd, J = 3.1, 10.4 Hz, 3'-H),
3.90 (1H, m, 5-H), 3.82 (1H, m,
3-H), 3.82 (1H, m, 4-H) 3.54 (1
H, br-t, J = 7.3 Hz, 2 ″ -H), 1.11.
(3H, d, J = 6.7Hz , H 3 of the 5'-CH 3) Sugar composition L- fucose: unsaturated D- glucuronic acid: D-
Mannose = 1: 1: 1 (1 molecule each) Sulfate 3 molecules (2nd and 4th positions of L-fucose and 6th position of D-mannose) In addition, the number of peak assignment in 1 H-NMR is represented by the following formula ( V).
【化14】 [Chemical 14]
【0117】(c)の物性
分子量 1128
MS m/z 1127〔M−H+ 〕−
MS/MS m/z 97〔HSO4 〕− 、175
〔不飽和D−グルクロン酸−H+ 〕− 、225〔L
−フコース硫酸−H2 O−H+ 〕− 、243〔L
−フコース硫酸−H+ 〕− 、371〔M−不飽和D
−グルクロン酸−L−フコース−SO3 −2H+ 〕
2−、405〔硫酸化L−フコースとD−マンノースが
結合したもの−H+ 〕− 、721〔M−D−マンノ
ース−L−フコース−SO3 −H2 O−H+ 〕− 1
H−NMR(D2 O)
δ5.69(1H,d,J=3.7Hz,(4)″−
H)、5.34(1H,s,(1)−H)、5.16
(1H,s,1−H)、5.10(1H,d,J=4.
0Hz,(1)′−H)、5.50(1H,d,J=
3.7Hz,1′−H)、4.93(1H,d,J=
6.4Hz,(1)″−H)、4.50(1H,d−
d,J=3.4,10.7Hz,3′−H)、4.47
(1H,d−d,J=3.4,10.4Hz,(3)′
−H)、4.39(1H,d,J=7.9Hz,1″−
H)、4.33(1H,br−s,(2)−H)、4.
14(1H,m,2−H)、4.12(1H,m,
(3)″−H)、4.12(1H,m,5′−H)、
4.12(1H,m,(5)′−H)、4.04(1
H,m,4′−H)、4.03(1H,m,(4)′−
H),3.85(1H,m,2′−H)、3.85(1
H,m,(2)′−H)、3.82(1H,m,3−
H)、3.82(1H,m,(3)−H)、3.73
(1H,m,4−H)、3.73(1H,m,5−
H)、3.73(1H,m,(4)−H)、3.70
(2H,m,5−CH2 のH2 )、3.70(2
H,m,(5)−CH2 のH2 )、3.67(1
H,m,5″−H)、3.62(1H,m,4″−
H)、3.62(1H,m,(2)″−H)、3.62
(1H,m,(5)−H)、3.51(1H,t,J=
8.9Hz,3″−H)、3.28(1H,t,J=
7.9Hz,2″−H)、1.09(3H,d,J=
6.7Hz,(5)′−CH3 のH3 )、1.07
(1H,d,J=6.7Hz,5′−CH3 の
H3 )
糖組成 L−フコース:不飽和D−グルクロン酸:D−
グルクロン酸:D−マンノース=2:1:1:2(L−
フコースとD−マンノース各2分子と不飽和D−グルク
ロン酸とD−グルクロン酸各1分子)
硫酸塩 2分子(各L−フコースの3位)
なお、 1H−NMRにおけるピークの帰属の番号は下
記式(VI)の通りである。Physical properties of (c) molecular weight 1128 MS m / z 1127 [MH + ] - MS / MS m / z 97 [HSO 4 ] - , 175
[Unsaturated D-glucuronic acid-H + ] - , 225 [L
- fucose -H 2 O-H +] -, 243 [L
-Fucose sulfuric acid-H + ] - , 371 [M-unsaturated D
- glucuronic acid -L- fucose -SO 3 -2H +]
2, 405 [-H + that sulfated L- fucose and D- mannose bound] -, 721 [M-D- mannose -L--fucose -SO 3 -H 2 O-H +] - 1 H- NMR (D 2 O) δ 5.69 (1H, d, J = 3.7Hz, (4) ″-
H), 5.34 (1H, s, (1) -H), 5.16.
(1H, s, 1-H), 5.10 (1H, d, J = 4.
0 Hz, (1) '-H), 5.50 (1H, d, J =
3.7 Hz, 1'-H), 4.93 (1H, d, J =
6.4 Hz, (1) "-H), 4.50 (1H, d-
d, J = 3.4, 10.7 Hz, 3'-H), 4.47
(1H, dd, J = 3.4, 10.4Hz, (3) '
-H), 4.39 (1H, d, J = 7.9Hz, 1 "-
H), 4.33 (1H, br-s, (2) -H), 4.
14 (1H, m, 2-H), 4.12 (1H, m,
(3) ″-H), 4.12 (1H, m, 5′-H),
4.12 (1H, m, (5) '-H), 4.04 (1
H, m, 4'-H), 4.03 (1H, m, (4) '-
H), 3.85 (1H, m, 2'-H), 3.85 (1
H, m, (2) '-H), 3.82 (1H, m, 3-
H), 3.82 (1H, m, (3) -H), 3.73.
(1H, m, 4-H) 3.73 (1H, m, 5-
H), 3.73 (1H, m, (4) -H), 3.70.
(2H, m, of 5-CH 2 H 2), 3.70 (2
H, m, (5) H 2 in -CH 2), 3.67 (1
H, m, 5 "-H), 3.62 (1H, m, 4"-
H), 3.62 (1H, m, (2) ″-H), 3.62
(1H, m, (5) -H), 3.51 (1H, t, J =
8.9 Hz, 3 ″ -H), 3.28 (1H, t, J =
7.9 Hz, 2 ″ -H), 1.09 (3H, d, J =
6.7Hz, (5) '- CH 3 of H 3), 1.07
(1H, d, J = 6.7Hz , H 3 of the 5'-CH 3) Sugar composition L- fucose: unsaturated D- glucuronic acid: D-
Glucuronic acid: D-mannose = 2: 1: 1: 2 (L-
Fucose and D-mannose (2 molecules each), unsaturated D-glucuronic acid and D-glucuronic acid (1 molecule each), sulfate 2 molecules (3rd position of each L-fucose), and the number of the peak assignment in 1 H-NMR is It is as in the following formula (VI).
【化15】 [Chemical 15]
【0118】得られたフコース硫酸含有多糖−Uに上記
エンド型フコイダン分解酵素を作用させると反応の進行
と共に脱離反応が起こって230nmの吸光度が増加す
るが、脱離反応の生成物となる不飽和ヘキスロン酸基が
主要反応生成物のすべてにあることから得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Uの分子内にヘキスロン酸とマンノー
スが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られた
フコース硫酸含有多糖−Uの構成糖の多くはフコースで
あるためフコース硫酸含有多糖−Uは一般の多糖より酸
に分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結
合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らは
ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存
在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している
糖鎖中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカー
ボハイドレート リサーチ、第125巻、第283〜2
90頁(1984)の方法を参考にして、まずフコース
硫酸含有多糖混合物を0.3Mのシュウ酸に溶解し10
0℃、3時間処理したものを分子量分画し、分子量が3
000以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により
吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後4Nの塩酸で酸
加水分解し、pH8に調整後、PA化し、HPLCによ
りウロン酸の分析を行った。なおHPLCの条件は下記
によった。When the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is allowed to act on the endo-fucoidan-degrading enzyme, the elimination reaction occurs with the progress of the reaction and the absorbance at 230 nm increases, but a product of the elimination reaction is obtained. The presence of a sugar chain in which hexuronic acid and mannose were alternately bound in the molecule of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U obtained from the fact that saturated hexuronic acid groups were present in all the main reaction products was suggested. Since many of the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are fucose, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is more easily decomposed into an acid than general polysaccharides. On the other hand, it is known that the bond between hexuronic acid and mannose is relatively strong against acid. In order to clarify the kind of hexuronic acid in a sugar chain in which hexuronic acid and mannose present in the molecule of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture of Gagome kelp are alternately bound, the present inventors have studied Carbohydrate Research, Volume 125, No. 283-2
Referring to the method on page 90 (1984), first, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was dissolved in 0.3 M oxalic acid.
The product treated at 0 ° C for 3 hours was subjected to molecular weight fractionation, and the molecular weight was 3
000 or more fractions were collected, and the adsorbed fraction was collected by anion exchange resin. This material was freeze-dried, acid-hydrolyzed with 4N hydrochloric acid, adjusted to pH 8, converted into PA, and analyzed for uronic acid by HPLC. The HPLC conditions were as follows.
【0119】装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:パルパックタイプN(4.6mm×250m
m)(宝酒造社製)
溶離液:200mM酢酸−トリエチルアミン緩衝液(p
H7.3):アセトニトリル=25:75
検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて
励起波長320nm、蛍光波長400nmで検出
流速:0.8ml/分
カラム温度:40℃Apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type N (4.6 mm × 250 m)
m) (Takara Shuzo) Eluent: 200 mM acetic acid-triethylamine buffer (p
H7.3): Acetonitrile = 25: 75 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) with excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm, detection flow rate: 0.8 ml / min Column temperature: 40 ° C.
【0120】なお、PA化ヘキスロン酸の標準物質はグ
ルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社
製、イズロン酸はシグマ社製の4−メチルウンベリフェ
リルα−L−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロ
ン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィ
カ(Acta Chemica Scandinavica)、第15巻、第139
7〜1398頁(1961)記載の方法に従い、和光純
薬社製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分
離したものをPA化することにより得た。The standard substance of PA hexuronic acid is glucuronic acid manufactured by Sigma, galacturonic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and iduronic acid hydrolyzed by 4-methylumbelliferyl α-L-iduronide manufactured by Sigma. And mannuronic acid and guluronic acid are Acta Chemica Scandinavica, Vol. 15, 139.
According to the method described on pages 7-1398 (1961), alginic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was hydrolyzed and then separated with an anion exchange resin to obtain PA, which was obtained.
【0121】この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合
物の糖鎖中に含まれるヘキスロン酸はグルクロン酸のみ
であることが判明した。As a result, it was revealed that the hexuronic acid contained in the sugar chain of the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was only glucuronic acid.
【0122】更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン
酸を陰イオン交換樹脂によりD−マンノースと分離し凍
結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグ
ルクロン酸はD−グルクロン酸であることが判明した。Further, glucuronic acid in the hydrolyzate of the above sugar chain was separated from D-mannose by an anion exchange resin, freeze-dried, and its specific optical rotation was measured to find that glucuronic acid was D-glucuronic acid. It turned out to be
【0123】また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有
多糖混合物をあらかじめ上記のエンド型フコイダン分解
酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で
酸加水分解したが、D−グルクロン酸とD−マンノース
が交互に結合したポリマーは検出されなかった。このこ
とから、上記のエンド型フコイダン分解酵素が脱離反応
により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造はD−
グルクロン酸とD−マンノースが交互に結合した構造を
持つことが判明した。Also, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from Gagome kelp which had been previously treated with the endo-fucoidan-degrading enzyme was acid-hydrolyzed with oxalic acid in the same manner as described above, but D-glucuronic acid and D-mannose were used. No polymer with alternating bonds was detected. From this, the skeletal structure of the sulfated-fucose-containing polysaccharide cleaved by the above-mentioned endo-fucoidan-degrading enzyme by the elimination reaction is D-
It was found to have a structure in which glucuronic acid and D-mannose were alternately bonded.
【0124】更に、D−グルクロン酸とD−マンノース
のそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック
配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマ
ーをNMR分析した。Further, in order to examine the binding positions of D-glucuronic acid and D-mannose and the anomeric configuration of the glycosidic bond, the polymer obtained by oxalic acid decomposition was analyzed by NMR.
【0125】ポリマーのNMRの測定結果を以下に示
す。但し、 1H−NMRでの化学シフト値はトリエチ
ルアミンのメチル基の化学シフト値を1.13ppm
に、13C−NMRではトリエチルアミンのメチル基の
化学シフト値を9.32ppmとして表した。The results of NMR measurement of the polymer are shown below. However, as for the chemical shift value in 1 H-NMR, the chemical shift value of the methyl group of triethylamine is 1.13 ppm.
In addition, in 13 C-NMR, the chemical shift value of the methyl group of triethylamine was expressed as 9.32 ppm.
【0126】1H−NMR(D2 O)
δ5.25(1H,br−s,1−H)、4.32(1
H,d,J=7.6Hz,1′−H)、4.00(1
H,br−s,2−H)、3.71(1H,m,5′−
H)、3.69(1H,m,5−CHのH)、3.68
(1H,m,3−H)、3.63(1H,m,5−CH
のH)、3.63(1H,m,4′−H)、3.57
(1H,m,4−H)、3.54(1H,m,3′−
H)、3.53(1H,m,5−H)、3.25(1
H,t,J=8.5Hz、2′−H)13C−NMR
(D2 O)
δ175.3(5′−COOHのC)、102.5
(1′−C)、99.6(1−C)、78.5(2−
C)、77.9(4′−C)、77.0(3′−C)、
76.7(5′−C)、73.9(5−C)、73.7
(2′−C)、70.6(3−C)、67.4(4−
C)、61.0(5−CH2 OHのC)
なお、ピークの帰属の番号は下記式(VII)の通りであ
る: 1 H-NMR (D 2 O) δ 5.25 (1 H, br-s, 1-H), 4.32 (1
H, d, J = 7.6 Hz, 1'-H), 4.00 (1
H, br-s, 2-H), 3.71 (1H, m, 5'-
H), 3.69 (1H, m, H of 5-CH), 3.68.
(1H, m, 3-H), 3.63 (1H, m, 5-CH
H), 3.63 (1H, m, 4'-H), 3.57
(1H, m, 4-H), 3.54 (1H, m, 3'-
H), 3.53 (1H, m, 5-H), 3.25 (1
H, t, J = 8.5 Hz, 2′-H) 13 C-NMR
(D 2 O) δ 175.3 (C in 5′-COOH), 102.5
(1'-C), 99.6 (1-C), 78.5 (2-
C), 77.9 (4'-C), 77.0 (3'-C),
76.7 (5'-C), 73.9 (5-C), 73.7
(2'-C), 70.6 (3-C), 67.4 (4-
C), 61.0 (C of 5-CH 2 OH) The peak attribution numbers are as shown in the following formula (VII):
【化16】 [Chemical 16]
【0127】D−グルクロン酸の1位の立体配置はその
ビシナル結合定数が7.6Hzであることからβ−D−
グルクロン酸であると決定した。The configuration at the 1-position of D-glucuronic acid is β-D- because the vicinal coupling constant is 7.6 Hz.
It was determined to be glucuronic acid.
【0128】また、マンノースの1位の立体配置はその
化学シフト値から5.25ppmであることからα−D
−マンノースであると決定した。Since the steric configuration at the 1-position of mannose is 5.25 ppm from its chemical shift value, α-D
-Determined to be mannose.
【0129】構成糖の結合様式は 1H検出異種核検出
法であるHMBC法を用いて行った。The binding mode of the constituent sugars was determined by the HMBC method, which is a 1 H-detecting heteronuclear detection method.
【0130】1H−NMRの帰属にはDQF−COSY
法及びHOHAHA法を、13C−NMRの帰属にはH
SQC法を用いた。DQF-COSY was assigned to 1 H-NMR.
Method and HOHAHA method, H for attribution of 13 C-NMR
The SQC method was used.
【0131】HMBCスペクトルにより1−Hと4′−
Cの間及び4′−Hと1−Cの間、1′−Hと2−Cの
間及び2−Hと1′−Cの間にそれぞれクロスピークが
認められた。このことからD−グルクロン酸はβ結合で
D−マンノースの2位に、D−マンノースはα結合でD
−グルクロン酸の4位にそれぞれ結合していることが明
らかとなった。From the HMBC spectrum, 1-H and 4'-
Cross peaks were observed between C and between 4'-H and 1-C, between 1'-H and 2-C and between 2-H and 1'-C. From this, D-glucuronic acid is in the 2-position of D-mannose by β bond, and D-mannose is in the D bond by α bond.
-It was revealed that they were respectively bound to the 4-position of glucuronic acid.
【0132】上記の結果を考え併せると、(a)は、還
元末端残基であるD−マンノースに不飽和D−グルクロ
ン酸と、硫酸基が結合したL−フコースが結合した構造
を持つこと、(b)は硫酸基が結合した還元末端残基で
あるD−マンノースに不飽和D−グルクロン酸と、2個
の硫酸基が結合したL−フコースが結合した構造を持つ
こと、(c)は還元末端残基であるD−マンノースにD
−グルクロン酸と、硫酸基が結合したL−フコースが結
合し、そのD−グルクロン酸にD−マンノースが結合
し、更にそのD−マンノースに不飽和D−グルクロン酸
と、硫酸基が結合したL−フコースが結合した構造を持
つことが判明した。Taking the above results into consideration, (a) has a structure in which unsaturated D-glucuronic acid and L-fucose having a sulfate group are bonded to the reducing terminal residue D-mannose, (B) has a structure in which unsaturated D-glucuronic acid, which is a reducing terminal residue having a sulfate group bonded thereto, and unsaturated D-glucuronic acid, and L-fucose having two sulfate groups bonded thereto, (c) D on the reducing terminal residue D-mannose
-Glucuronic acid and L-fucose bound to a sulfate group are bound, D-mannose is bound to the D-glucuronic acid, and unsaturated D-glucuronic acid and a sulfate group are bound to the D-mannose. -Fucose was found to have a bound structure.
【0133】以上、得られたフコース硫酸含有多糖−U
は、D−グルクロン酸とD−マンノースが交互に結合し
た構造を持ち、少なくとも1つ以上のD−マンノースに
L−フコースが結合している構造を有する。As described above, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U
Has a structure in which D-glucuronic acid and D-mannose are alternately bonded, and has a structure in which L-fucose is bonded to at least one or more D-mannose.
【0134】また、下記一般式(VIII)で表される部分
構造を有する(但し、式中の少なくとも1つのアルコー
ル性水酸基は硫酸エステル化しており、またnは1以上
の整数を表す)。Further, it has a partial structure represented by the following general formula (VIII) (provided that at least one alcoholic hydroxyl group in the formula is sulfated, and n represents an integer of 1 or more).
【化17】 [Chemical 17]
【0135】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Fと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Uが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−U
は構成糖としてウロン酸を含有し、フラボバクテリウム
sp. SA−0082(FERM BP−540
2)の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、
少なくとも上記式(I)、(II)、(III)で表される
化合物より選択される1種以上の化合物が生成する。そ
の分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸
含有多糖−Uをなんら限定するものではなく、任意の分
子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Uを調製す
ることができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコー
ス硫酸含有多糖を提供することができる。According to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is provided. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention
Contains uronic acid as a constituent sugar, and flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-540
2) The fucoidan-degrading enzyme produced by
At least one compound selected from the compounds represented by the above formulas (I), (II) and (III) is produced. The molecular weight, the molecular weight distribution, and the sugar composition do not limit the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention at all, and it is possible to prepare the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U having any molecular weight and molecular weight distribution. A sulfated-fucose-containing polysaccharide having clear physicochemical properties can be provided.
【0136】本発明のフコース硫酸含有多糖−Uはフコ
ース硫酸含有多糖−Fの有する強い抗凝血活性を有さ
ず、抗凝血活性を実質上示さないフコース硫酸含有多糖
が提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Uは純
化されたフコース硫酸含有多糖として制がん剤、抗転移
剤、発がん予防剤等に使用でき、また抗フコース硫酸含
有多糖抗体の抗原としても有用である。更にこのフコー
ス硫酸含有多糖−Uより、上記式(I)、(II)、(II
I)等の構造を有するオリゴ糖が製造でき、これらの新
規化合物の製造にも有用である。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention does not have the strong anticoagulant activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide substantially free of anticoagulant activity is provided. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention can be used as a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide as a carcinostatic agent, an anti-metastatic agent, a carcinogenic preventive agent, etc., and is also useful as an antigen for an anti-sulfate-fucose-containing polysaccharide antibody. Further, from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the above formulas (I), (II) and (II
Oligosaccharides having structures such as I) can be produced, and they are also useful for producing these novel compounds.
【0137】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−F及
びその製造方法について記載する。本発明の方法を用い
て本発明のフコース硫酸含有多糖−Fを製造する際には
フコース硫酸含有多糖−Uを分解する能力を有する分解
酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよ
く、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多
糖−Uを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素
はフコース硫酸含有多糖−Uを選択的に分解できる酵素
であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例え
ば、フラボバクテリウム(Flavobacterium)sp. S
A−0082株(FERM BP−5402)が生産す
る上記のエンド型フコイダン分解酵素が挙げられる。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the method for producing the same will be described. When the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is produced using the method of the present invention, a degrading enzyme having an ability to decompose the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U may be allowed to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After the reaction is completed, the low molecular weight sulfated-fucose-containing polysaccharide-U may be removed by ultrafiltration or the like. The above-mentioned degrading enzyme may be any enzyme as long as it is an enzyme capable of selectively degrading sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and specific examples thereof include Flavobacterium sp. S
The endo-type fucoidan degrading enzyme produced by the A-0082 strain (FERM BP-5402) can be mentioned.
【0138】本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利
に進むように基質濃度や温度、pH等を設定すればよい
が、基質濃度は通常0.1から10%程度、温度は20
から40℃付近、pHは6から9付近が望ましい。When the present enzyme is allowed to act, the substrate concentration, temperature, pH, etc. may be set so that the enzymatic reaction proceeds advantageously, but the substrate concentration is usually about 0.1 to 10%, and the temperature is 20%.
To about 40 ° C. and pH of about 6 to 9 are desirable.
【0139】また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地
に添加し、フコース硫酸含有多糖−Uを分解する能力を
有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養
し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物
はフコース硫酸含有多糖−Uを分解する能力を有する分
解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよ
いが、具体的には上記記載のフラボバクテリウム s
p. SA−0082株(FERM BP−5402)
又はフコイダノバクター マリナス(Fucoidanobacter
marinus) SI−0098株(FERM BP−540
3)が挙げられる。Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was added to the medium, and the microorganism capable of producing a degrading enzyme having the ability to decompose the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was cultured in the medium and purified from the medium after the culture. Good. The microorganism used may be any microorganism as long as it produces a degrading enzyme capable of decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and specifically, the above-mentioned Flavobacterium s.
p. SA-0082 strain (FERM BP-5402)
Or Fucoidanobacter marinas (Fucoidanobacter
marinus) SI-0098 strain (FERM BP-540
3) is mentioned.
【0140】培地に加える栄養源は使用する菌株が利用
し、該分解酵素を生産するものであればよく、炭素源と
しては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコ
ース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッ
カロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用
でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミ
ノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、
硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナト
リウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜
鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。The nutrient source added to the medium may be any that can be utilized by the strain to be used and produces the degrading enzyme. Examples of the carbon source include fucoidan, seaweed powder, alginic acid, fucose, glucose, mannitol, glycerol, saccharose, Maltose, lactose, starch, etc. can be used, and as nitrogen sources, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract, defatted soybean,
Ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.
【0141】また、培養条件は使用する菌株、培地組成
等に応じ、フコース硫酸含有多糖−Uの分解活性が最大
になるように設定するのはもちろんのことであるが、一
般に培養温度は15〜30℃、培地のpHは5〜9で、
5〜72時間の通気かくはん培養を行えばよい。培養終
了後、低分子化したフコース硫酸含有多糖−Uや培地中
のフコース硫酸含有多糖−F以外の成分は限外ろ過など
で除去すればよい。It is needless to say that the culture conditions are set so as to maximize the decomposition activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U depending on the strain used, the medium composition, etc. 30 ° C, pH of the medium is 5-9,
Aeration and stirring culture may be performed for 5 to 72 hours. After completion of the culture, components other than the low molecular weight sulfate-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F in the medium may be removed by ultrafiltration or the like.
【0142】なお、上記のフコイダノバクター マリナ
スSI−0098株は、青森県の海水中より本発明者ら
が新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通
りである。
1.フコイダノバクター マリナス SI−0098
a.形態的性質
(1)本菌は双球菌(短かん菌)である。
幅 0.5〜0.7μm
長さ 0.5〜0.7μm
(2)胞子の有無 なし
(3)グラム染色性 陰性
b.生理的性質
(1)生育の温度範囲
37℃で生育できる。好適な生育温度は15〜28℃である。
(2)酸素に対する態度 好気性
(3)カタラーゼ 陽性
(4)オキシダーゼ 陰性
(5)ウレアーゼ 陰性
(6)加水分解
デンプン 陽性
ゼラチン 陰性
カゼイン 陰性
エスクリン 陽性
(7)硝酸塩の還元 陰性
(8)インドールの生成 陰性
(9) 硫化水素の生成 陽性
(10) ミルクの凝固 陰性
(11)ナトリウムの要求性 陽性
(12)塩類要求性
0%食塩培地での生育 陰性
1%食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
(13)キノン系 メナキノン7
(14)菌体内DNAのGC含量 61%
(15)細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性
(16)グリコリル試験 陰性
(17)ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性
(18)OF−テスト O
(19)集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず
(20)運動性 あり
(21)滑走性 なし
(22)鞭毛 極単毛The above Fucoidanobacterium marinus SI-0098 strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. . 1. Fucoidanobactor Marinas SI-0098 a. Morphological properties (1) This bacterium is a diplococcus (short bacillus). Width 0.5 to 0.7 μm Length 0.5 to 0.7 μm (2) Presence or absence of spores (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) Temperature range of growth It can grow at 37 ° C. A suitable growth temperature is 15 to 28 ° C. (2) Attitude toward oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase negative (5) Urease negative (6) Hydrolysis starch positive Gelatin negative Casein negative Esculin positive (7) Nitrate reduction negative (8) Indole formation negative (9) Generation of hydrogen sulfide Positive (10) Milk coagulation negative (11) Sodium requirement positive (12) Salt requirement 0% growth in salt medium Negative 1% growth in salt medium Negative growth in seawater medium Positive (13) Quinone menaquinone 7 (14) GC content of intracellular DNA 61% (15) Diaminopimelic acid in cell wall negative (16) Glycolyl test negative (17) Presence of hydroxy fatty acid positive (18) OF-test O (19) ) Color of the colony No characteristic colony pigment is produced (20) Motility (21) No gliding (22) Flagella and very monochryte
【0143】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
ディターミネイティブ バクテリオロジー、第9巻
(1994)に記載の基本分類によればグループ4(グ
ラム陰性好気性かん菌及び球菌)に分類される。しかし
ながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン7を有し、G
C含量が61%の点でグループ4に属する菌と大いに異
なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノ
ンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。This strain is classified into Group 4 (Gram-negative aerobic bacillus and cocci) according to the basic classification described in Vergiz Manual of Determinative Bacteriology, Volume 9 (1994). However, this strain has menaquinone 7 in the electron transfer chain and
It is greatly different from the bacteria belonging to Group 4 in that the C content is 61%. Basically, Gram-negative bacteria have ubiquinone in the electron transfer chain, and Gram-positive bacteria have menaquinone.
【0144】グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム
属及びシトファーガ(Cytophaga)属は例外的に電子伝達
鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細
菌のGC含量は、土壌細菌であるシトファーガ アーベ
ンシコラ(Cytophaga arvensicola)が43〜46%、海
洋細菌であるシトファーガ ジフルエンス(Cytophaga
diffluens)、シトファーガ ファーメンタンス(Cytoph
aga fermentans) 、シトファーガ マリーナ(Cytophag
a marina) 、及びシトファーガ ウリギノーサ(Cytoph
ags uliginosa)が42%であり、本菌株の性質とは全く
異なる。更に、本菌株と既同定株の16SrDNA配列
の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株
ベルコミクロビウム スピノサム(Verrucomicrobium s
pinosum)においてもその相同性は、76.6%であっ
た。16SrDNA配列の相同性が90%以下の場合、
両細菌の属が異なることは一般に広く知られていること
から、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属
の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバク
ター マリナス SI−0098と命名した。Gram-negative bacteria such as Flavobacterium and Cytophaga have exceptionally a menaquinone in the electron transport chain, but the GC content of the bacteria belonging to these genera is 43-46% of Cytophaga arvensicola is a marine bacterium, Cytophaga difluence (Cytophaga arvensicola)
diffluens), Sitophaga fermentans (Cytoph
aga fermentans), Sitophaga marina (Cytophag
a marina) and Cytophaga uriginosa (Cytoph
ags uliginosa) is 42%, which is completely different from the properties of this strain. Furthermore, when the homology of the 16S rDNA sequence between this strain and the already-identified strain was compared, the already-identified strain Vercocomicrobium s
pinosum), the homology was 76.6%. When the homology of 16S rDNA sequence is 90% or less,
Since it is generally widely known that the genus of both bacteria is different, the present inventors concluded that this strain is a bacterium of a new genus that does not belong to the existing genus, and therefore the strain of Fucoidobacter It was named Marinas SI-0098.
【0145】なお上記菌株は Fucoidanobacter marinus
SI−0098と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目
1番3号(郵便番号305)]に平成7年3月29日よ
りFERM P−14873として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFERMB
P−5403(国際寄託への移管請求日: 平成8年2
月15日)として寄託されている。The above-mentioned strain is Fucoidanobacter marinus
SI-0098 is displayed, and the FERM P- has been displayed on March 29, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry [1-3, Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305)]. Deposited as 14873, FERMB in the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry
P-5403 (Date of request for transfer to international deposit: 1996-2)
(15th of a month).
【0146】本発明者らは前述のように0.6〜3Mの
1種類又は2種類以上の塩類の存在下で本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−Fとフコース硫酸含有多糖−Uが酸性
多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことも見出し
た。As described above, the present inventors have confirmed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention are aggregated with acidic polysaccharides in the presence of one or two or more salts of 0.6 to 3M. It was also found to behave quite differently for the agent.
【0147】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Fを分離することができる。For example, the method of the present invention can be used to separate the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention from an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture.
【0148】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に1種又は2種以上の塩類を添加しその総濃度を0.6
〜3Mとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こう
して塩濃度を調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸
性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、沈殿を集めると本発明のフコース硫酸含有多糖−F
が得られる。First, one or more salts are added to an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture to give a total concentration of 0.6.
~ 3M. Salts to be added are sodium chloride,
It is not particularly limited to calcium chloride and the like. After adjusting the salt concentration in this way, an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride is added until precipitation does not occur any more, and when the precipitate is collected, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is collected.
Is obtained.
【0149】しかし上記塩濃度を2M超にすると本発明
のフコース硫酸含有多糖−Fが塩化セチルピリジニウム
により沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発
明のフコース硫酸含有多糖−Fとフコース硫酸含有多糖
−Uを分離する目的では通常1.5M程度の塩濃度で目
的は達成できる(図1の説明参照)。However, if the salt concentration is more than 2 M, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is less likely to form a precipitate due to cetylpyridinium chloride, so caution is required. For the purpose of separating the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention, the purpose can be usually achieved with a salt concentration of about 1.5 M (see the explanation of FIG. 1).
【0150】次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿
中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗
い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Fを得る。
こうして得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Fか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。Next, if necessary, this precipitate is washed, and then cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with a salt-saturated alcohol to obtain the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention.
In order to remove the pigment from the thus-obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention, the precipitate may be dissolved and then subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting. In addition, a preservative and the like may be added during the process.
【0151】本発明者らは、前述の様にフコース硫酸含
有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に2価の陽イオ
ンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸
含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良
くなることも見出している。すなわち、本発明の方法を
用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Fを製造する際
には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に2価の陽イオ
ン源となる薬品を好ましくは1mM以上添加する。次
に、陰イオン交換樹脂を2価の陽イオンを好ましくは1
mM以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖
混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化し
た液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェン
トによりフコース硫酸含有多糖−Fを溶出させる。本方
法を用いる場合、添加する2価陽イオンの濃度は1mM
以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽イオン源
となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果
が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。As described above, the present inventors have found that the amount of sulfated-fucose-containing polysaccharide adsorbed per unit amount of resin increases when a divalent cation coexists when the sulfated-fucose-containing polysaccharide is purified by anion exchange resin. It has also been found that the separation of sulfated-fucose-containing polysaccharides is improved. That is, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is produced using the method of the present invention, first, a chemical that serves as a divalent cation source is added to the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, preferably at 1 mM or more. Next, an anion exchange resin is added to a divalent cation, preferably 1
Equilibrate with a solution containing at least mM to adsorb the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After sufficient washing with an equilibrated liquid of this anion exchange resin, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is eluted with a gradient of sodium chloride, for example. When using this method, the concentration of divalent cation added is 1 mM.
The above is all right. The divalent cation source chemicals used in this method are calcium salts and barium salts, which are particularly effective, but are not particularly limited, and magnesium sulfate, manganese chloride, etc. can also be used. .
【0152】本発明のフコース硫酸含有多糖−Fは例え
ば実施例8に記載のように得ることができる。以下、こ
のフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発
明のフコース硫酸含有多糖−Fはこの例に限定されるも
のでは無い。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention can be obtained, for example, as described in Example 8. The physicochemical properties of the sulfated-fucose-containing polysaccharide will be shown below, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is not limited to this example.
【0153】得られたフコース硫酸含有多糖−Fの分子
量をセファクリルS−500を用いたゲルろ過法により
求めたところ、約19万を中心とした分子量分布を示し
た(図17参照)。なお、図17において、縦軸はフェ
ノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を480
nmの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバーを
示す。When the molecular weight of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was determined by the gel filtration method using Sephacryl S-500, it showed a molecular weight distribution centered on about 190,000 (see FIG. 17). In addition, in FIG. 17, the vertical axis represents the sugar content in the sample measured by the phenol-sulfuric acid method.
The absorbance is shown in nm, and the horizontal axis shows the fraction number.
【0154】また、ゲルろ過の条件を下記に示す。
カラムサイズ: 3.08×162.5cm
溶媒:0.2Mの塩化ナトリウムと10%のエタノール
を含む10mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.
0)
流速:1.5ml/分
サンプル濃度:0.25%
サンプル液量:20ml
分子量標準物質:Shodex STANDARD P-82(昭和電工社
製)The conditions for gel filtration are shown below. Column size: 3.08 × 162.5 cm Solvent: 10 mM sodium phosphate buffer containing 0.2 M sodium chloride and 10% ethanol (pH 6.
0) Flow rate: 1.5 ml / min Sample concentration: 0.25% Sample liquid amount: 20 ml Molecular weight standard substance: Shodex STANDARD P-82 (manufactured by Showa Denko KK)
【0155】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Fの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biologica
l Chemistry)、第175巻、第595頁(1948)の
記載に従いフコース量を定量した。Next, the components of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention were analyzed. First of all, Journal of
Biological chemistry (Journal of Biologica
Chemistry), 175, 595 (1948).
【0156】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−F
の乾燥標品を1規定の塩酸に0.5%の濃度で溶解し、
110℃で2時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ及びグライコタッグ リージェント
キットを用いて加水分解して得られた単糖の還元性末
端をピリジル−(2)−アミノ化(PA化)し、HPL
Cにより構成糖の比率を調べた。なお、HPLCの条件
は下記によった。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
Dissolve the dried sample of 1 in 1N hydrochloric acid at a concentration of 0.5%,
It was treated at 110 ° C. for 2 hours and hydrolyzed into constituent monosaccharides. Next, the reducing end of the monosaccharide obtained by hydrolysis using Glycotag and Glycotag Regent Kit was pyridyl- (2) -aminated (PA-ized) to give HPL.
The ratio of constituent sugars was examined by C. The HPLC conditions were as follows.
【0157】装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:パルパックタイプA(4.6mm×150m
m)
溶離液:700mMホウ酸緩衝液(pH9.0):アセ
トニトリル=9:1
検出:蛍光検出器F−1150(日立製作所製)にて励
起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。
流速:0.3ml/分
カラム温度:65℃Apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm × 150 m)
m) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9.0): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) at excitation wavelength 310 nm and fluorescence wavelength 380 nm. Flow rate: 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C
【0158】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry)、第4巻、第330頁
(1962)の記載に従いウロン酸量を定量した。Next, the amount of uronic acid was quantified according to the description in Analytical Biochemistry, Volume 4, p. 330 (1962).
【0159】次に、バイオケミカル ジャーナル(Bioc
hemical Journal)、第84巻、第106頁(1962)
の記載に従い硫酸含量を定量した。Next, the Biochemical Journal (Bioc
hemical Journal), Vol. 84, p. 106 (1962).
The sulfuric acid content was quantified as described in.
【0160】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Fの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル
比は約10:1であった。ウロン酸及びその他の中性糖
は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫
酸基のモル比は約1:2であった。As a result of the above, the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F were fucose and galactose, and the molar ratio thereof was about 10: 1. Substantially free of uronic acid and other neutral sugars. Further, the molar ratio of fucose and sulfate group was about 1: 2.
【0161】1%のフコイダン−F溶液16mlと、5
0mMのリン酸緩衝液(pH8.0)12mlと4Mの
塩化ナトリウム4mlと32mU/mlの前出のフラボ
バクテリウムsp. SA−0082(FERM BP
−5402)由来のエンド型フコイダン分解酵素溶液8
mlを混合し、25℃で48時間反応させた。反応によ
る分解物の生成は認められず、その低分子化も認められ
なかった。16 ml of 1% fucoidan-F solution and 5
12 ml of 0 mM phosphate buffer (pH 8.0), 4 ml of 4 M sodium chloride, and 32 mU / ml of the above-mentioned Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP
-5402) -derived endo-fucoidan-degrading enzyme solution 8
ml was mixed and reacted at 25 ° C. for 48 hours. The formation of decomposition products by the reaction was not recognized, and the reduction of the molecular weight thereof was not recognized.
【0162】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−F
のカルシウム塩のIRスペクトルをフーリェ変換赤外分
光光度計 JIR−DIAMOND20(日本電子社
製)により測定したところ図18に示すスペクトルが得
られた。なお、図18において縦軸は透過率(%)、横
軸は波数(cm−1)を示す。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
The IR spectrum of the calcium salt was measured with a Fourier transform infrared spectrophotometer JIR-DIAMOND20 (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 18 was obtained. Note that in FIG. 18, the vertical axis represents the transmittance (%) and the horizontal axis represents the wave number (cm −1 ).
【0163】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−F
のナトリウム塩のNMRスペクトルを500MHzの核
磁気共鳴装置JNM−α500型核磁気共鳴装置(日本
電子社製)により測定したところ、図19に示すスペク
トルが得られた。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
The NMR spectrum of the sodium salt of 1. was measured by a 500 MHz nuclear magnetic resonance apparatus JNM-α500 type nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 19 was obtained.
【0164】図19中、縦軸はシグナルの強度、横軸は
化学シフト値(ppm)を示す。なお、 1H−NMR
での化学シフト値はHODの化学シフト値を4.65p
pmとして表した。1
H−NMR(D2 O)
5.30(フコースの1位のH)、1.19(フコース
の5位のCH3のH)In FIG. 19, the vertical axis represents signal intensity and the horizontal axis represents chemical shift value (ppm). In addition, 1 H-NMR
The chemical shift value at is the HOD chemical shift value of 4.65p.
Expressed as pm. 1 H-NMR (D 2 O) 5.30 (H at fucose 1-position H), 1.19 (fucose 5-position CH 3 H)
【0165】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−F
の凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計SEPA
−300(堀場製作所製)により測定したところ、−1
35度であった。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
High-speed and high-sensitivity polarimeter SEPA for the specific rotation of freeze-dried products
When measured by -300 (manufactured by HORIBA, Ltd.), -1
It was 35 degrees.
【0166】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Uと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Fが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−F
は構成糖としてウロン酸を実質的に含有せず、フラボバ
クテリウム sp. SA−0082(FERM BP
−5402)の生産するフコイダン分解酵素により低分
子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成は本発
明のフコース硫酸含有多糖−Fをなんら限定するもので
はなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有
多糖−Fを調製することができ、糖組成、還元末端等の
理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース
硫酸含有多糖−Fを提供することができる。The present invention provides a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F which is separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention and purified. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention
Contains substantially no uronic acid as a constituent sugar, and flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP
-5402) does not reduce the molecular weight of the fucoidan-degrading enzyme. The molecular weight, the molecular weight distribution and the sugar composition do not limit the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention at all, and it is possible to prepare the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having any molecular weight and molecular weight distribution. It is possible to provide a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having a clear physicochemical property such as a terminal and an extremely high degree of sulfation.
【0167】本発明のフコース硫酸含有多糖−Fは、実
質上抗凝血活性を有さないフコース硫酸含有多糖−Uと
分離しているため、強い抗凝血活性を有しており、該フ
コース硫酸含有多糖−F及び/又はその分解物は純化さ
れたフコース硫酸含有多糖として抗凝血剤に使用でき、
また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用で
ある。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention has a strong anticoagulant activity because it is separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U which has substantially no anticoagulant activity. The sulfate-containing polysaccharide-F and / or its degradation product can be used as a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide in an anticoagulant,
It is also useful as an antigen for anti-sulfur-fucose-containing polysaccharide antibodies.
【0168】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物をがん細胞の培養液に1μg/ml以上の濃度で添加
すれば、添加後1日から数日で癌細胞はアポトーシスを
起こす。すなわち、本発明のフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物は強いアポトーシス誘発作用を有する。なお、
これらの物質は正常細胞にはアポトーシスを誘発せず、
毒性も示さない。特に、食用褐藻植物、ナマコ由来のフ
コース硫酸含有多糖、その分解物は安全性が高い。When the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention or its degradation product is added to the culture medium of cancer cells at a concentration of 1 μg / ml or more, the cancer cells undergo apoptosis one to several days after the addition. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product have a strong apoptosis-inducing action. In addition,
These substances do not induce apoptosis in normal cells,
It also shows no toxicity. In particular, edible brown algae, sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from sea cucumber, and degradation products thereof are highly safe.
【0169】本発明のアポトーシス誘発剤を製剤化する
には、フコース硫酸含有多糖及び/又はその分解物を有
効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せればよ
い。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び/
又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の
担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化
剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤
等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤
等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とするこ
とができる。またこれを使用前に適当な担体を添加する
ことにより液状となし得る乾燥品とすることができる。To formulate the apoptosis-inducing agent of the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product may be used as an active ingredient, and this may be combined with a known pharmaceutical carrier. Generally, a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and / or
Alternatively, a decomposed product thereof is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant. By adding agents and the like, solid preparations such as tablets, granules, powders, powders and capsules, and liquid preparations such as normal solutions, suspensions and emulsions can be prepared. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid by adding an appropriate carrier before use.
【0170】本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤、
あるいは注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっ
ても投与することができる。The apoptosis inducer of the present invention is an oral agent,
Alternatively, it can be administered by any of parenteral agents such as injections and infusions.
【0171】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデン
プン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセル
ロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また
経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活
性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等
を配合することもできる。これらの具体例としては、以
下に示す物が挙げられる。
(結合剤)デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、
ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロ
キシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。
(崩壊剤)デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロー
ス、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。
(界面活性剤)ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチ
ン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート80。
(潤沢剤)タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン
酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレ
ングリコール。
(流動性促進剤)軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウ
ム。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above-mentioned administration form and dosage form. In the case of oral preparations, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts and the like are used. It Further, in the preparation of the oral preparation, a binder, a disintegrating agent, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a coloring agent, a fragrance and the like can be further added. Specific examples thereof include the followings. (Binder) Starch, dextrin, gum arabic powder,
Gelatin, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, crystalline cellulose, ethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol. (Disintegrant) Starch, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, carboxymethyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose. (Surfactant) sodium lauryl sulfate, soybean lecithin, sucrose fatty acid ester, polysorbate 80. (Lubricant) Talc, wax, hydrogenated vegetable oil, sucrose fatty acid ester, magnesium stearate, calcium stearate, aluminum stearate, polyethylene glycol. (Fluidity promoter) Light anhydrous silicic acid, dried aluminum hydroxide gel, synthetic aluminum silicate, magnesium silicate.
【0172】また、経口用の液剤としては、懸濁液、エ
マルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることが
でき、これらの各種剤型には矯味、矯臭剤、着色剤を配
合してもよい。Further, the liquid preparations for oral use may be suspensions, emulsions, syrups and elixirs, and these various dosage forms may be mixed with a flavoring agent, a flavoring agent and a coloring agent. .
【0173】一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発
明の有効成分であるフコース硫酸含有多糖及び/又はそ
の分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、
ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ
油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、
必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を
加えることにより調製される。On the other hand, in the case of parenteral preparations, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its decomposition product, which is the active ingredient of the present invention, is used as a diluent in distilled water for injection, physiological saline,
Glucose aqueous solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc. dissolved or suspended,
It is prepared by adding a bactericide, a stabilizer, a tonicity agent, a soothing agent, etc., if necessary.
【0174】本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態
に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に
限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。
注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与
し得、外用剤には座剤等も包含される。The apoptosis inducer of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited, and may be internal use, external use and injection.
The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, etc., and the external preparation also includes suppositories and the like.
【0175】本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、
その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用され
る患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定
ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が
成人1日当り1〜1000mg、好ましくは10〜20
0mgである。もちろん投与量は、種々の条件によって
変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合も
あるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。The dose of the apoptosis inducer of the present invention is
The formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight, and symptoms of the patient to which the formulation is applied are appropriately set, but the amount of the active ingredient contained in the formulation is not constant but is generally 1 to 1000 mg per adult per day. , Preferably 10-20
It is 0 mg. Of course, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases, or a dose exceeding the range may be necessary in some cases.
【0176】制がん作用を有する、本発明のフコース硫
酸含有多糖−U、フコース硫酸含有多糖−F及び/又は
その分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と
組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。
制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一
般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び/又はそ
の分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と
配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝
剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加え
て、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形
剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができ
る。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状
となし得る乾燥品とすることができる。If the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention having a carcinostatic action and / or a degradation product thereof is used as an active ingredient, it is formulated into a combination with a known pharmaceutical carrier. A carcinostatic agent can be manufactured.
The anticancer drug can be produced according to the above method. Generally, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and / or its decomposition product is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, Solid agents such as tablets, granules, powders, powders and capsules, and liquid agents such as normal liquids, suspensions and emulsions by adding agents, excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc. be able to. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.
【0177】制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点
滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することが
できる。The carcinostatic agent can be administered by any of oral agents and parenteral agents such as injections and infusions.
【0178】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above administration form and dosage form, and may be used in accordance with the above apoptosis inducer.
【0179】制がん剤としては、製剤形態に応じた適当
な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、
内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例
えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤
には座剤等も包含される。The carcinostatic agent is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited,
It can be for internal use, external use and injection. The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, etc., and the external preparation also includes suppositories and the like.
【0180】制がん剤としての投与量は、その製剤形
態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年
齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが
一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人1日当
り1〜1000mg、好ましくは10〜200mgであ
る。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するの
で、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あ
るいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤は
そのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日
常的に摂取させることもできる。The dose as a carcinostatic agent is appropriately set depending on the formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight, and symptom of the patient to whom it is applied, and it is not fixed but is generally contained in the formulation. The amount of the active ingredient used is 1 to 1000 mg, preferably 10 to 200 mg per day for an adult. Of course, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases, or a dose exceeding the range may be necessary in some cases. The drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
【0181】発がん抑制作用を有する、フコース硫酸含
有多糖及び/又はその分解物を有効成分とし、これを公
知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば発がん予防剤を製
造することができる。発がん予防剤の製造は上記方法に
準じ行うことができる。一般的には、フコース硫酸含有
多糖及び/又はその分解物を薬学的に許容できる液状又
は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散
剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊
剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、
カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液
剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体
の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができ
る。A carcinogenesis preventive agent can be produced by using a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof having an effect of suppressing carcinogenesis as an active ingredient, and formulating this in combination with a known pharmaceutical carrier. The carcinogenic agent can be produced according to the above method. Generally, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient. Tablets, granules, powders, powders, with the addition of excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.
It may be a solid preparation such as a capsule preparation, a normal liquid preparation, a suspension preparation, a liquid preparation such as an emulsion. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.
【0182】発がん予防剤としては、経口剤や、注射
剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与する
ことができる。As a carcinogenic agent, any of oral agents and parenteral agents such as injections and infusions can be administered.
【0183】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above administration form and dosage form, and may be used according to the above apoptosis inducer.
【0184】発がん予防剤としては、製剤形態に応じた
適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はな
く、内用、外用及び注射によることができる。注射剤
は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、
外用剤には座剤等も包含される。The carcinogenic agent is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited, and may be internal use, external use and injection. The injection may be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously,
The external preparation also includes suppositories and the like.
【0185】発がん予防剤としての投与量は、その製剤
形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の
年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではない
が一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人1日
当り1〜1000mg、好ましくは10〜200mgで
ある。もちろん投与量は、種々の条件によって変動する
ので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、
あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤
はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して
日常的に摂取させることもできる。The dose as a carcinogenic agent is appropriately set depending on the formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight and symptom of the patient to whom the agent is applied, and although it is not constant, it is generally contained in the formulation. The amount of the active ingredient is 1 to 1000 mg, preferably 10 to 200 mg per day for an adult. Of course, the dose varies depending on various conditions, so a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases,
Or it may be necessary beyond the range. The drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
【0186】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物は天然由来物質であり、マウスに経口投与を行っても
毒性は認められない。The sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product are naturally derived substances, and no toxicity is observed even when they are orally administered to mice.
【0187】本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又
は昂進あるいはがん疾患、ウイルス性疾患等の治療剤と
して用いることが期待される。発がん予防剤として健康
保持に使用することができる。また本発明のアポトーシ
ス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウ
イルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害
剤の開発等に有用である。特に、食用褐藻植物、食用ナ
マコから、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物
を調製すれば、これらは食品として長い歴史を有するも
のであり、これらから調製したフコース硫酸含有多糖、
その分解物は、経口投与の場合において、極めて安全性
の高いものである。The drug of the present invention is expected to be used as a therapeutic agent for infectious diseases, reduced or accelerated immune function, cancer diseases, viral diseases and the like. It can be used as a carcinogen to maintain health. Further, the apoptosis-inducing method of the present invention is useful for studying the biological defense mechanism, immune function or relationship with cancer, viral diseases, etc., development of apoptosis-inhibiting inhibitors and the like. In particular, from edible brown algae plants, edible sea cucumber, if the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product are prepared, these have a long history as foods, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide prepared from these,
The degradation product is extremely safe when orally administered.
【0188】次にフコース硫酸含有多糖は極めて分子量
が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用い
るより、抗原性、均一性、抗凝血活性などの改善のた
め、フコース硫酸含有多糖をある程度分解することが必
要とされているが、本発明により、フコース硫酸含有多
糖−Fのみを選択的に分解する酵素、該酵素を作用させ
て得られるフコース硫酸含有多糖−Fの低分子化物が提
供された。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide is a sulfated polysaccharide having an extremely large molecular weight, and decomposes the sulfated-fucose-containing polysaccharide to some extent in order to improve the antigenicity, homogeneity, anticoagulant activity, etc. rather than being used as a drug as it is. However, the present invention provides an enzyme that selectively decomposes only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, and a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained by the action of the enzyme. .
【0189】本発明に使用される菌株としては、アルテ
ロモナス(Alteromonas)属細菌に属し、本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株
であればいかなる菌株でもよい。また、該エンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株の具体例
としては、例えば、アルテロモナス sp. SN−1
009株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖に作用さ
せれば、本発明のフコース硫酸含有多糖−Fの低分子化
物を得ることができる。The strain used in the present invention may be any strain as long as it belongs to the bacterium of the genus Alteromonas and has the ability to produce the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention. Specific examples of the strain having the ability to produce the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme include, for example, Alteromonas sp. SN-1
009 strain. A low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention can be obtained by causing the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme derived from the strain to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0190】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。
a.形態的性質
(1)本菌はかん菌である。
幅 約1μm
長さ 約2μm
(2)胞子の有無 なし
(3)グラム染色性 陰性
b.生理的性質
(1)生育の温度範囲
好適な生育温度は15−30℃である。4℃あるいは4
0℃では生育できない。
(2)酸素に対する態度 好気性
(3)カタラーゼ 陽性
(4)オキシダーゼ 陽性
(5)リパーゼ 陽性
(6)資化性
グルコース 陽性
マンノース 陰性
スクロース 陽性
ラクトース 陰性
セロビオース 陽性
メリビオース 陰性
マンニトール 陽性
グリセリン 陽性
メタノール 陰性
DL−リンゴ酸 陰性
コハク酸 陰性
フマル酸 陰性
クエン酸 陰性
サリシン 陰性
(7)加水分解
デンプン 陰性
ゼラチン 陰性
(8)硝酸塩の還元 陰性
(9)脱窒反応 陰性
(10)アルギン酸の分解 陽性
(11)β−ヒドロキシ酪酸の利用 陰性
(12)ポリヒドロキシ酪酸の蓄積 陰性
(13)ナトリウムの要求性 陽性
(14)塩類要求性
0%食塩培地での生育 陰性
1%食塩培地での生育 陰性
海水培地での生育 陽性
(15)キノン系 ユビキノン8
(16)菌体内DNAのGC含量 36%
(17)OF−テスト O
(18)集落の色調 特徴的色素を生成せず
(19)発光性 陰性
(20)運動性 陽性
(21)鞭毛 極単毛The present strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. a. Morphological properties (1) This bacterium is a bacillus. Width about 1 μm Length about 2 μm (2) Presence or absence of spores None (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) Temperature range for growth The preferred growth temperature is 15-30 ° C. 4 ° C or 4
It cannot grow at 0 ° C. (2) Attitude to oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase positive (5) Lipase positive (6) Assimilating glucose positive mannose negative sucrose positive lactose negative cellobiose positive melibiose negative mannitol positive glycerin positive methanol negative DL-apple Acid negative Succinic acid Negative Fumaric acid Negative Citric acid Negative Salicin Negative (7) Hydrolyzed starch Negative gelatin Negative (8) Nitrate reduction Negative (9) Denitrification reaction Negative (10) Alginic acid decomposition Positive (11) β-Hydroxybutyric acid Negative (12) Accumulation of polyhydroxybutyrate Negative (13) Sodium requirement Positive (14) Salt requirement Growth in 0% saline medium Negative Growth in 1% saline medium Negative Growth in seawater medium Positive (15) ) Quinone ubiquinone 8 (16) GC of intracellular DNA The amount 36% (17) OF- test O (18) without generating a tone characteristic dye settlement (19) emitting negative (20) motility positive (21) flagella Gokutanke
【0191】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー、第1巻、第
343〜352頁(1984)、及びバージーズ マニ
ュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジ
ー、第9巻、第75頁、第132〜133頁(199
4)に記載されているアルテロモナス属細菌と同定し
た。しかしながら、本細菌の生理的性状は文献に記載さ
れているいずれの菌種とも一致せずGC含量も低い値で
あった。そこで、本菌株をアルテロモナス sp.SN
−1009と命名した。The strain of the present invention is known as Virgin's Manual of Cysticatic Bacteriology, Vol. 1, pp. 343-352 (1984), and Virgin's Manual of Derminative bacteriology, Vol. 9, pp. 75, 132-133. Page (199
It was identified as an Alteromonas bacterium described in 4). However, the physiological properties of this bacterium did not match any of the bacterial species described in the literature, and the GC content was low. Therefore, this strain was designated as Alteromonas sp. SN
It was named -1009.
【0192】なお上記菌株はAlteromonas sp. SN
−1009と表示され、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目1番3
号(郵便番号305)]に平成8年2月13日よりFE
RM P−15436として寄託され、前記通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−
5747(国際寄託への移管請求日: 平成8年11月
15日)として寄託されている。The above strain is Alteromonas sp. SN
-1009 is displayed and the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [1-3, Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan]
No. (Postal code 305)] from February 13, 1996
Deposited as RM P-15436, and FERM BP- at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
5747 (Date of request for transfer to international deposit: November 15, 1996).
【0193】本発明に使用する菌株の培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、本発明のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、
アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マ
ンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース
等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、
脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。そ
の他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシ
ウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよ
い。The nutrient source added to the culture medium of the strain used in the present invention may be any one that can be utilized by the strain used and produces the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention. Examples of the carbon source include fucose sulfate. Polysaccharide content, seaweed powder,
Alginic acid, fucose, galactose, glucose, mannitol, glycerol, saccharose, maltose and the like can be used, and as the nitrogen source, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract,
Defatted soybean, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.
【0194】また本菌株は上記栄養源を含んだ海水ある
いは人工海水中で非常に良く生育する。Further, this strain grows very well in seawater or artificial seawater containing the above nutrients.
【0195】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件に
より変動するが、一般に培養温度は、15℃〜30℃、
培地のpHは6〜9がよく、5〜72時間の通気かくは
ん培養で本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵
素の生産量は最高に達する。In culturing the bacterium producing the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, the production amount varies depending on the culturing conditions. Generally, the culturing temperature is 15 ° C to 30 ° C.
The pH of the medium is preferably 6 to 9, and the production amount of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention reaches the maximum after aeration and agitation culture for 5 to 72 hours.
【0196】培養条件は使用する菌株、培地組成等に応
じ、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の
生産量が最大になるように設定するのは当然のことであ
る。It is natural that the culture conditions are set so as to maximize the production of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention depending on the strain to be used, the composition of the medium and the like.
【0197】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。The endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is present both in the bacterial cells and in the culture supernatant.
【0198】上記のアルテロモナス sp. SN−1
009を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用
いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。The above-mentioned Alteromonas sp. SN-1
The cell-free extract is obtained by culturing 009 in an appropriate medium, collecting the cells, and disrupting the cells by a commonly used cell disruption means such as ultrasonication.
【0199】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を得ることができる。Next, a purified enzyme preparation can be obtained from this extract by a commonly used purification means. For example, purification can be performed by salting out, ion exchange column chromatography, hydrophobic binding column chromatography, gel filtration, etc. to obtain a purified endo-fucose-sulfate-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention containing no other fucoidan degrading enzyme. .
【0200】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵
素と同様の精製手段により精製することができる。[0200] Further, since a large amount of this enzyme is also present in the culture solution supernatant obtained by removing the cells from the above-mentioned culture solution, it can be purified by the same purification means as that for the intracellular enzyme.
【0201】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。
(i)作用:下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Fに作用し
て、該フコース硫酸含有多糖−Fを低分子化させる。
(a)構成糖:ウロン酸を実質的に含有しない。
(b)フラボバクテリウム(Flavobacterium) sp.
SA−0082(FERM BP−5402)の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すな
わちフコース硫酸含有多糖−Uに作用しない。
(c)構成糖:ウロン酸を含有する。
(d)フラボバクテリウム(Flavobacterium) sp.
SA−0082(FERM BP−5402)の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式(I)、(II)、(III)より選択される少なくと
も一種以上の化合物が生成する。The chemical and physicochemical properties of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention are as follows. (I) Action: It acts on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties, that is, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F to lower the molecular weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. (A) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (B) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.
It does not act on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties, that is, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. (C) Constituent sugar: Contains uronic acid. (D) Flavobacterium sp.
A fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) produces a low molecular weight compound, and at least one compound selected from at least the following formulas (I), (II) and (III) is produced.
【化18】 [Chemical 18]
【化19】 [Chemical 19]
【化20】
(ii)至適pH:本酵素の至適pHは7〜8付近である
(図20)。すなわち図20は本酵素のpHと相対活性
の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性(%)、横
軸はpHを示す。実線は、還元性末端をPA化したフコ
ース硫酸含有多糖−F(PA−FF)を基質に用いた曲
線であり、点線は下記(v)−(2)記載のフコース硫
酸含有多糖−Fを基質に用いた場合の曲線である。
(iii)至適温度:本酵素の至適温度は30〜35℃付
近である(図21)。すなわち図21は、本酵素の温度
と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
(%)、横軸は温度(℃)を示す。実線は、還元性末端
をPA化したフコース硫酸含有多糖−F(PA−FF)
を基質に用いた場合の曲線であり、点線は下記(v)−
(2)記載のフコース硫酸含有多糖−Fを基質に用いた
場合の曲線である。
(iv)分子量:本酵素の分子量を、セファクリル(Seph
acryl)S−200(ファルマシア社製)を用いたゲル
ろ過法により求めたところ、約10万であった。[Chemical 20] (Ii) Optimum pH: The optimum pH of this enzyme is around 7 to 8 (Fig. 20). That is, FIG. 20 is a graph showing the relationship between pH and relative activity of the present enzyme, where the vertical axis represents relative activity (%) and the horizontal axis represents pH. The solid line is a curve using sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (PA-FF) with PA at the reducing end as a substrate, and the dotted line is a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in (v)-(2) below as a substrate. It is a curve when used for. (Iii) Optimum temperature: The optimum temperature of this enzyme is around 30 to 35 ° C (Fig. 21). That is, FIG. 21 is a graph showing the relationship between the temperature and the relative activity of the present enzyme, wherein the vertical axis shows the relative activity (%) and the horizontal axis shows the temperature (° C.). The solid line is a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (PA-FF) with PA at the reducing end.
Is a curve when using as a substrate, and the dotted line is (v)-
It is a curve when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in (2) is used as a substrate. (Iv) Molecular weight: The molecular weight of the enzyme is
It was about 100,000 as determined by the gel filtration method using acryl) S-200 (manufactured by Pharmacia).
【0202】(v)酵素活性の測定方法:本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素活性の測定は次のよ
うにして行った。(V) Method of measuring enzyme activity: The activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured as follows.
【0203】まず、本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖−F、
及びPA−FFを下記(1)から(3)の工程により調
製した。First, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, which is a substrate of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention,
And PA-FF were prepared by the following steps (1) to (3).
【0204】(1)ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混
合物の調製
乾燥ガゴメ昆布2Kgを自由粉砕機M−2型(奈良機械
製作所製)により粉砕し、4.5倍量の80%エタノー
ル中で80℃、2時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記80%エタノール抽出、ろ過という工程をさらに3
回繰り返し、エタノール洗浄残渣1870gを得た。残
渣に36リットルの水を加え、100℃、2時間処理
し、ろ過により抽出液を得た。 抽出液の塩濃度を40
0mMの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、5%のセ
チルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくな
るまで添加し、遠心分離した。 その沈殿を、80%の
エタノールで繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロ
リドを完全に除去した後、3リットルの2M塩化ナトリ
ウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、2Mの塩化
ナトリウムで平衡化した100mlのDEAE−セルロ
ファインA−800を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂
を除いた。このろ液を、2Mの塩化ナトリウムで平衡化
した100mlのDEAE−セルロファインA−800
のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器(ろ過膜の排除
分子量10万)により脱塩及び低分子除去を行い、この
際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍
結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物
82.2gを得た。(1) Preparation of Gagome kelp fucose-sulfate-containing polysaccharide mixture 2 kg of dried gagome kelp was pulverized by a free pulverizer M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and 80 ° C in 4.5 times the amount of 80% ethanol. After treatment for 2 hours, it was filtered. For the residue,
The process of 80% ethanol extraction and filtration is further 3
Repeated times to obtain 1870 g of ethanol washing residue. 36 liters of water was added to the residue, treated at 100 ° C. for 2 hours and filtered to obtain an extract. The salt concentration of the extract is 40
After making the solution the same as 0 mM sodium chloride solution, 5% cetylpyridinium chloride was added until no more precipitation occurred, and the mixture was centrifuged. The precipitate was repeatedly washed with 80% ethanol to completely remove cetylpyridinium chloride, then dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, insoluble matter was removed by centrifugation, and equilibrated with 2M sodium chloride. 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 was suspended, stirred and filtered to remove the resin. The filtrate was 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M sodium chloride.
The column was subjected to desalting and removal of low-molecular weight components with an ultrafilter (excluding molecular weight of filtration membrane: 100,000), and the precipitate generated at this time was removed by centrifugation. The supernatant was freeze-dried to obtain 82.2 g of a purified mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides of Gagome kelp.
【0205】(2)フコース硫酸含有多糖−Fの調製
上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物6g
を600mlの0.2Mの塩化カルシウムを含む20m
Mの酢酸ナトリウム(pH6.0)に溶解後、あらかじ
め0.2Mの塩化カルシウムを含む20mMの酢酸ナト
リウム(pH6.0)で平衡化した3600mlのDE
AE−セファロースFFのカラムにかけ、0.2Mの塩
化カルシウムを含む20mMの酢酸ナトリウム(pH
6.0)で充分カラムを洗浄後、0〜2Mの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
0.75M以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
F画分を集め、排除分子量10万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Fの凍結乾燥標品を、3.3g得た。(2) Preparation of Sulfate-Fucose-Containing Polysaccharide-F 6 g of the above-mentioned polysaccharide mixture containing Sulfate-fucose-containing sulfate derived from Gagome kombu
20m containing 600ml of 0.2M calcium chloride
3600 ml of DE after dissolution in M sodium acetate (pH 6.0) and then equilibrated with 20 mM sodium acetate (pH 6.0) containing 0.2 M calcium chloride in advance.
Apply to AE-Sepharose FF column, 20 mM sodium acetate containing 0.2 M calcium chloride (pH
After thoroughly washing the column with 6.0), it was eluted with a gradient of 0 to 2 M sodium chloride. Sulfate-fucose-containing polysaccharide that elutes at a sodium chloride concentration of 0.75 M or more
The F fraction was collected, concentrated and desalted by an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then freeze-dried to obtain 3.3 g of a freeze-dried preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
【0206】(3)PA−FFの調製
上記のフコース硫酸含有多糖−Fの凍結乾燥標品12m
gを水480μlに溶解し、12μlずつ36本に分注
後、凍結乾燥しグライコタッグ及びグライコタッグ リ
ージェント キットを用いて還元性末端を、PA化し、
PA−FFを得た。 得られたPA−FFを、15ml
の10%のメタノールを含む10mMの酢酸アンモニウ
ム溶液に溶解し、セルロファインGCL−300のカラ
ム(40x900mm)によりゲルろ過し、高分子画分
を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ3500の
透析膜を用いて充分透析して脱塩し、次にエバポレータ
ーにより5mlに濃縮して本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖−F分解酵素の基質用PA−FFとした。ま
た、こうして得られたPA−FFを、市販のピリジル−
(2)−アミノ化フコース(宝酒造社製)の蛍光強度
(励起波長320nm、蛍光波長400nm)と比較す
ることにより定量したところ約40nmolであった。(3) Preparation of PA-FF 12 m of lyophilized preparation of the above-mentioned polysaccharide-F containing sulfated-fucose
g was dissolved in 480 μl of water, dispensed into 36 tubes of 12 μl each, lyophilized, and the reducing end was converted to PA using Glycotag and Glycotag Regent kit,
PA-FF was obtained. 15 ml of the obtained PA-FF
Was dissolved in a 10 mM ammonium acetate solution containing 10% of methanol and subjected to gel filtration through a Cellulofine GCL-300 column (40 × 900 mm) to collect a polymer fraction. The obtained polymer fraction was thoroughly dialyzed with a dialysis membrane having a pore size of 3500 to desalt, and then concentrated to 5 ml by an evaporator, and then PA for a substrate of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention. -FF. In addition, the PA-FF thus obtained was commercialized with pyridyl-
When quantified by comparison with the fluorescence intensity (excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm) of (2) -aminated fucose (Takara Shuzo), it was about 40 nmol.
【0207】上記(1)及び(2)の工程により得られ
たフコース硫酸含有多糖−Fを用いて本発明のエンド型
フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは
下記の要領で行った。When the activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured using the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in the above steps (1) and (2), the procedure was as follows. .
【0208】すなわち、2.5%のフコース硫酸含有多
糖−F溶液12μlと、6μlの1M塩化カルシウム溶
液と12μlの1M塩化ナトリウム溶液と、72μlの
50mMの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩
衝液(pH7.5)と、18μlの本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖−F分解酵素とを混合し、30℃、
3時間反応させた後、反応液を100℃、10分間処理
し、遠心分離後、100μlをHPLCにより分析し、
低分子化の程度を測定した。That is, 12 μl of a 2.5% polysaccharide solution of sulfated-fucose-F, 6 μl of 1M calcium chloride solution and 12 μl of 1M sodium chloride solution, and 72 μl of a buffer solution containing 50 mM acetic acid, imidazole and tris-hydrochloric acid. (PH 7.5) and 18 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention are mixed, and the mixture is heated at 30 ° C.
After reacting for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C. for 10 minutes, centrifuged, and 100 μl was analyzed by HPLC.
The degree of depolymerization was measured.
【0209】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有
多糖−F溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用
意し、それぞれ同様にHPLCにより分析した。As a control, the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was replaced by a buffer solution in which the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dissolved, and the reaction was conducted under the same conditions. Also, a solution obtained by performing a reaction using water instead of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solution was prepared, and analyzed by HPLC in the same manner.
【0210】1単位の酵素は、上記反応系において1分
間に1μmolのフコース硫酸含有多糖−Fのフコシル
結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合
の定量は下記式により求めた。
{(12 ×2.5)/(100 ×MF) }×{(MF/M)-1}×{0.12/
(180 ×0.01) }=U/ml
(12×2.5)/100:反応系中に添加したフコー
ス硫酸含有多糖−F(mg)
MF:基質フコース硫酸含有多糖−Fの平均分子量
M:反応生成物の平均分子量
(MF/M)−1:1分子のフコース硫酸含有多糖−F
が酵素により切断された数
180:反応時間(分)
0.01:酵素液量(ml)
0.12:反応液総量(ml)One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the fucosyl bond of 1 μmol of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F in 1 minute in the above reaction system. The amount of the cleaved fucosyl bond was determined by the following formula. {(12 x 2.5) / (100 x MF)} x {(MF / M) -1} x {0.12 /
(180 × 0.01)} = U / ml (12 × 2.5) / 100: sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (mg) MF added to the reaction system MF: average molecular weight of substrate-sulfated-fucose-containing polysaccharide-F M: reaction Product average molecular weight (MF / M) -1: 1 molecule of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
180: Reaction time (min) 0.01: Enzyme solution volume (ml) 0.12: Reaction solution total volume (ml)
【0211】なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:OHpak KB−804(8mm×300m
m)(昭和電工社製)
溶離液:5mMのアジ化ナトリウム、25mMの塩化カ
ルシウム、及び50mMの塩化ナトリウムを含む25m
Mのイミダゾール緩衝液(pH8)
検出:視差屈折率検出器(Shodex RI−71、
昭和電工社製)
流速:1ml/分
カラム温度:25℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak KB-804 (8 mm x 300 m
m) (manufactured by Showa Denko KK) Eluent: 25 m containing 5 mM sodium azide, 25 mM calcium chloride, and 50 mM sodium chloride
M imidazole buffer (pH 8) Detection: Parallax Refractive Index Detector (Shodex RI-71,
(Showa Denko) Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 25 ° C
【0212】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン(STANDARD P−
82、昭和電工社製)を上記のHPLC分析と同条件で
分析し、プルランの分子量とOHpak KB−804
の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物
の分子量測定のための標準曲線とした。For determination of the average molecular weight of the reaction product,
Commercially available pullulan with known molecular weight (STANDARD P-
82, Showa Denko KK) under the same conditions as the above-mentioned HPLC analysis, and the molecular weight of pullulan and OHpak KB-804 were analyzed.
The relationship with the retention time of was expressed as a curve, which was used as a standard curve for measuring the molecular weight of the enzyme reaction product.
【0213】上記(1)〜(3)の工程により得られた
PA−FFを用いて本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行っ
た。When the activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured using the PA-FF obtained by the steps (1) to (3), the procedure was as follows.
【0214】すなわち、8pmol/μlのPA−FF
溶液2μlと、5μlの1M塩化カルシウム溶液と10
μlの1M塩化ナトリウム溶液と、23μlの水と、5
0μlの50mMの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸
を含む緩衝液(pH8.2)と、10μlの本発明のエ
ンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素とを混合し、30
℃、3時間反応させた後、反応液を100℃、10分間
処理し、遠心分離後、80μlをHPLCにより分析
し、低分子化の程度を測定した。That is, 8 pmol / μl of PA-FF
2 μl of solution and 5 μl of 1M calcium chloride solution and 10
μl of 1M sodium chloride solution, 23 μl of water, 5
A buffer solution (pH 8.2) containing 0 μl of 50 mM acetic acid, imidazole and tris-hydrochloric acid was mixed with 10 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention,
After reacting at 3 ° C for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C for 10 minutes, centrifuged, and 80 µl was analyzed by HPLC to measure the degree of depolymerization.
【0215】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びPA−FF溶液の
代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ
同様にHPLCにより分析した。As a control, instead of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention, a buffer solution in which the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is dissolved is used and the reaction is conducted under the same conditions. And the PA-FF solution was used instead of the PA-FF solution to carry out the reaction, and each was similarly analyzed by HPLC.
【0216】1単位の酵素は、上記反応系において1分
間に1μmolのフコース硫酸含有多糖のフコシル結合
を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定
量は下記式により求めた。
16×10−6×{(MF/M)-1 }×{1/(180×0.01) }=U
/ml
16x10−6:反応系中に添加したPA−FF(μm
ol)
MF:基質PA−FFの平均分子量
M:反応生成物の平均分子量
(MF/M)−1:1分子のフコース硫酸含有多糖−F
が酵素により切断された数
180:反応時間(分)
0.01:酵素液量(ml)One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the fucosyl bond of 1 μmol of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the above reaction system per minute. The amount of the cleaved fucosyl bond was determined by the following formula. 16 x 10 -6 x {(MF / M) -1} x {1 / (180 x 0.01)} = U
/ Ml 16 × 10 −6 : PA-FF (μm added to the reaction system
ol) MF: average molecular weight of substrate PA-FF M: average molecular weight of reaction product (MF / M) -1: 1 molecule of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
180: Reaction time (min) 0.01: Enzyme solution volume (ml)
【0217】なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:OHpak SB−803(8 mm ×300 mm)
(昭和電工社製)
溶離液:5mMのアジ化ナトリウム及び10%のジメチ
ルスルホキシドを含む200mMの塩化ナトリウム溶液
検出:蛍光検出器 F-1150(日立製作所製)にて励起波
長320nm、蛍光波長400nmで検出。
流速:1ml/分
カラム温度:50℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak SB-803 (8 mm x 300 mm)
(Showa Denko KK) Eluent: 200 mM sodium chloride solution containing 5 mM sodium azide and 10% dimethylsulfoxide Detection: Fluorescence detector F-1150 (Hitachi) at excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm detection. Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 50 ° C
【0218】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン(STANDARD P−
82、昭和電工社製)をグライコタッグ及びグライコタ
ッグリージェント キットを用いて還元性末端を、PA
化し、様々な分子量のPA化プルランを得た。得られた
様々な分子量のPA化プルランを上記のHPLC分析と
同条件で分析し、プルランの分子量とOHpak SB
−803の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反
応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。For determination of the average molecular weight of the reaction product,
Commercially available pullulan with known molecular weight (STANDARD P-
82, manufactured by Showa Denko Co., Ltd.), and the reducing end was treated with Glycotag and Glycotag Regent Kit
To obtain PA-containing pullulan having various molecular weights. The obtained pullulanized PA having various molecular weights was analyzed under the same conditions as the above HPLC analysis, and the molecular weight of pullulan and OHpak SB were analyzed.
The relationship between the retention time of -803 and the retention time was represented by a curve, which was used as a standard curve for measuring the molecular weight of the enzyme reaction product.
【0219】タンパク質の定量は、酵素液の280nm
の吸光度を測定することにより行った。その際1mg/
mlのタンパク質溶液の吸光度を1.0として計算し
た。The protein was quantified by measuring the enzyme solution at 280 nm.
It was performed by measuring the absorbance of. At that time 1 mg /
The absorbance of the protein solution in ml was calculated as 1.0.
【0220】本発明者らは、以下に述べるように、本発
明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の作用機作
を決定した。The present inventors determined the mechanism of action of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, as described below.
【0221】(1)エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素によるフコース硫酸含有多糖−Fの分解及び分解物
の調製
精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Fに
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用
させ、分解物の調製を行った。(1) Decomposition of a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme and preparation of a decomposed product A degrading product was prepared by allowing a degrading enzyme to act.
【0222】まず、フコース硫酸含有多糖分解酵素の生
産を行った。すなわち、アルテロモナスsp. SN−
1009 (FERM BP−5747)を、グルコー
ス0.25%、ペプトン1.0%、酵母エキス0.05
%を含む人工海水(ジャマリンラボラトリー社製)pH
8.2からなる培地600mlを分注して殺菌した(1
20℃、20分)2リットルの三角フラスコに接種し、
25℃で26時間培養して種培養液とした。ペプトン
1.0%、酵母エキス0.02%、前記のガゴメ昆布由
来のフコース硫酸含有多糖0.2%、及び消泡剤(信越
化学工業社製KM70)0.01%を含む人工海水pH
8.0からなる培地20リットルを30リットル容のジ
ャーファーメンターに入れて120℃で20分殺菌し
た。冷却後、上記の種培養液600mlを接種し、24
℃で24時間、毎分10リットルの通気量と毎分250
回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた
培養上清を、分画分子量1万の限外ろ過器により濃縮後
85%飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集
め、10分の1濃度の人工海水を含む20mMのトリス
ー塩酸緩衝液(pH8.2)に対して充分透析し、60
0mlの粗酵素を得た。First, a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme was produced. That is, Alteromonas sp. SN-
1009 (FERM BP-5747), glucose 0.25%, peptone 1.0%, yeast extract 0.05
% Containing artificial seawater (made by Jamarin Laboratories) pH
Sterilized by dispensing 600 ml of a medium consisting of 8.2 (1
20 ° C, 20 minutes) Inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask,
It was cultured at 25 ° C. for 26 hours to obtain a seed culture solution. Artificial seawater pH containing 1.0% peptone, 0.02% yeast extract, 0.2% polysaccharide containing fucose sulfate derived from Gagome kelp, and 0.01% antifoaming agent (KM70 manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.)
20 liters of 8.0 medium was placed in a 30 liter jar fermenter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, inoculate 600 ml of the above seed culture,
Aeration rate of 10 liters per minute and 250 minutes per minute for 24 hours at ℃
The culture was carried out under the condition of agitating speed of rotation. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain cells and culture supernatant. The obtained culture supernatant was concentrated with an ultrafilter having a molecular weight cut-off of 10,000 and then salted out with 85% saturated ammonium sulfate, and the resulting precipitate was collected by centrifugation and collected with 20 mM of artificial seawater at a concentration of 1/10. Fully dialyzed against Tris-HCl buffer (pH 8.2), 60
0 ml of crude enzyme was obtained.
【0223】こうして得られた粗酵素のうち40ml
と、人工海水44mlと、前記のフコース硫酸含有多糖
−F510mgと水36mlを混合し、pHを8に調整
し、25℃で48時間反応後、セルロファインGCL−
300によりゲルろ過を行い、4画分に分け、分子量の
大きな方から順に、F−Fd−1(分子量25000
超)、F−Fd−2(分子量25000〜12000
超)、F−Fd−3(分子量12000〜6500
超)、及びF−Fd−4(分子量6500以下)とし
た。これらの4画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれ
ぞれ170mg、270mg、300mg、及び340
mg得た。40 ml of the crude enzyme thus obtained
Then, 44 ml of artificial seawater, 510 mg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and 36 ml of water were mixed, the pH was adjusted to 8, and after reacting at 25 ° C for 48 hours, Cellulofine GCL-
Gel filtration is performed with 300 to divide into 4 fractions, and F-Fd-1 (molecular weight 25000)
Super), F-Fd-2 (molecular weight 25,000 to 12,000)
Super), F-Fd-3 (molecular weight 12000 to 6500)
Super) and F-Fd-4 (molecular weight 6500 or less). These four fractions were desalted and lyophilized to give dried products of 170 mg, 270 mg, 300 mg, and 340, respectively.
mg was obtained.
【0224】フコース硫酸含有多糖−Fの酵素分解物、
すなわち低分子化物のセルロファインGCL−300に
よるゲルろ過の結果を図22に示す。図22において縦
軸は480nmの吸光度(フェノール硫酸法による発色
量)、横軸はフラクションナンバーを示し、1フラクシ
ョン10mlである。カラムボリュームは1075ml
であり、溶出液は10%のエタノールを含む0.2Mの
酢酸アンモニウム溶液である。Enzymatic degradation product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F,
That is, the result of gel filtration using Cellulofine GCL-300 having a low molecular weight is shown in FIG. In FIG. 22, the vertical axis represents the absorbance at 480 nm (coloring amount by the phenol-sulfuric acid method), the horizontal axis represents the fraction number, and one fraction is 10 ml. Column volume is 1075 ml
And the eluent is a 0.2 M ammonium acetate solution containing 10% ethanol.
【0225】図22中、白丸印はフコース硫酸含有多糖
−Fの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース
硫酸含有多糖−Fをそれぞれゲルろ過した結果を表す。In FIG. 22, white circles represent the results of gel filtration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F enzyme-decomposed products, and black triangles represent the results of gel-filtration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F before enzymatic degradation.
【0226】上記セルロファインGCL−300の結果
から、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の反応生
成物の分子量分布は約1000〜3万程度であることが
判明した。From the results of Cellulofine GCL-300, it was found that the reaction product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention has a molecular weight distribution of about 1,000 to 30,000.
【0227】(2)酵素反応生成物の還元末端糖及び中
性糖組成の分析
上記のF−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及
びF−Fd−4の一部をグライコタッグ及びグライコタ
ッグ リージェント キットを用いて還元性末端をPA
化し、得られた各PA化糖(PA−F−Fd−1)、
(PA−F−Fd−2)、(PA−F−Fd−3)、及
び(PA−F−Fd−4)を4規定の塩酸、100℃、
3時間処理により加水分解し、HPLCにより還元末端
糖を調べた。(2) Analysis of reducing terminal sugar and neutral sugar composition of enzymatic reaction product Part of the above-mentioned F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-4 To the reducing end using Glycotag and Glycotag Regent Kit.
Each of the obtained PA sugars (PA-F-Fd-1),
(PA-F-Fd-2), (PA-F-Fd-3), and (PA-F-Fd-4) are 4N hydrochloric acid, 100 ° C,
It was hydrolyzed by treatment for 3 hours, and the reducing terminal sugar was examined by HPLC.
【0228】なお、HPLCの条件は下記によった。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:パルパックタイプA(4.6 mm× 150 mm)(宝
酒造社製)
溶離液:700mMほう酸緩衝液(pH 9):アセト
ニトリル=9:1
検出:蛍光検出器 F−1150(日立製作所製)にて
励起波長310nm、蛍光波長380nmで検出。
流速:0.3ml/分
カラム温度:65℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm x 150 mm) (manufactured by Takara Shuzo) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detection Detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) detects at an excitation wavelength of 310 nm and a fluorescence wavelength of 380 nm. Flow rate: 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C
【0229】この結果、(PA−F−Fd−1)、(P
A−F−Fd−2)、(PA−F−Fd−3)、及び
(PA−F−Fd−4)の還元末端糖は総てフコースで
あった。As a result, (PA-F-Fd-1), (P
The reducing terminal sugars of AF-Fd-2), (PA-F-Fd-3), and (PA-F-Fd-4) were all fucose.
【0230】また、F−Fd−1、F−Fd−2、F−
Fd−3、及びF−Fd−4の中性糖組成を下記の方法
により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有
多糖−Fを硫酸加水分解後グライコタッグ及びグライコ
タッグ リージェント キットを用いて構成糖の還元性
末端をPA化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を
分析したときと同じHPLC条件で分析したところ、フ
コースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立
体配位はそれぞれL及びDであったので生成物に関して
もL−フコースとD−ガラクトースのみを測定した。In addition, F-Fd-1, F-Fd-2, F-
The neutral sugar composition of Fd-3 and F-Fd-4 was measured by the following method. After the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F used as the substrate was hydrolyzed with sulfuric acid, the reducing ends of the constituent sugars were converted to PA using Glycotag and Glycotag Regent kit, and the reducing ends of the above enzyme reaction products were analyzed. When analyzed under the same HPLC conditions as in the above, only fucose and galactose were detected, and their configurations were L and D, respectively. Therefore, for the product, only L-fucose and D-galactose were measured.
【0231】すなわち、構成糖の一つであるD−ガラク
トースの含量を調べるためにF−キット 乳糖/ガラク
トース(ベーリンガーマンハイムヤマノウチ社製)を用
い、説明書に従ってD−ガラクトースのみを測定できる
反応系を構築し、別に4規定の塩酸で100℃、2時間
加水分解したF−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−
3、及びF−Fd−4を中和後この反応系で測定した。That is, in order to examine the content of D-galactose which is one of the constituent sugars, a reaction system in which only D-galactose can be measured according to the instruction using F-kit lactose / galactose (manufactured by Boehringer Mannheim Yamanouchi) F-Fd-1, F-Fd-2 and F-Fd- were constructed and hydrolyzed separately with 4N hydrochloric acid at 100 ° C. for 2 hours.
3 and F-Fd-4 were neutralized and then measured in this reaction system.
【0232】更にもう一方の構成糖であるL−フコース
を定量するために、クリニカル ケミストリー(Clinic
al Chemistry)、第36巻、第474〜476頁(19
90)記載の方法に従って、別に4規定の塩酸で100
℃、2時間加水分解したF−Fd−1、F−Fd−2、
F−Fd−3、及びF−Fd−4を中和後この反応系で
測定した。[0232] In order to quantify L-fucose, which is the other constituent sugar, clinical chemistry (Clinic) was used.
al Chemistry), 36, 474-476 (19).
90) according to the method described above, 100 with 4N hydrochloric acid separately.
F-Fd-1, F-Fd-2 hydrolyzed for 2 hours at
After neutralizing F-Fd-3 and F-Fd-4, measurement was performed in this reaction system.
【0233】以上の結果L−フコースとD−ガラクトー
スの比率はF−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−
3、及びF−Fd−4それぞれおよそ100:44、1
00:27、100:5、及び100:1であった。As a result, the ratios of L-fucose and D-galactose were F-Fd-1, F-Fd-2 and F-Fd-.
3 and F-Fd-4 are approximately 100: 44, 1 respectively.
It was 00:27, 100: 5, and 100: 1.
【0234】以上の結果をまとめると、本発明のエンド
型フコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース硫酸含有
多糖−Fに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量
約1000〜3万程度の低分子化物を生成し、その低分
子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高いこ
とが判明した。なお、低分子化物の還元性末端はすべて
L−フコースであった。Summarizing the above results, the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention acts on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F to hydrolyze the fucosyl bond, and a low molecular weight compound having a molecular weight of about 1,000 to 30,000 is obtained. It was found that the higher the molecular weight of the low molecular weight compound, the higher the galactose content. The reducing ends of the low molecular weight compounds were all L-fucose.
【0235】次に、本酵素の基質特異性を調べるために
フコース硫酸含有多糖−Uに本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素を作用させた。Next, in order to examine the substrate specificity of this enzyme, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention was allowed to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
【0236】すなわち、2.5%のフコース硫酸含有多
糖−U溶液12μlと、6μlの1M塩化カルシウム溶
液と12μlの1M塩化ナトリウム溶液と、72μlの
50mMのイミダゾール緩衝液(pH7.5)と、18
μlの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
(1.6mU/ml)とを混合し、30℃、3時間反応
させた後、反応液を100℃、10分間処理し、遠心分
離後、100μlをHPLCにより分析し、低分子化の
程度を測定した。That is, 12 μl of a 2.5% polysaccharide-U solution containing sulfated-fucose, 6 μl of 1M calcium chloride solution and 12 μl of 1M sodium chloride solution, 72 μl of 50 mM imidazole buffer (pH 7.5), 18
After mixing with 1 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme (1.6 mU / ml) of the present invention and reacting at 30 ° C. for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C. for 10 minutes, and after centrifugation, 100 μl was analyzed by HPLC to measure the degree of depolymerization.
【0237】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代わりに、本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用い
て同様の条件により反応させたものを用意し、同様にH
PLCにより分析した。As a control, instead of the endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, a buffer solution in which the endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is dissolved and reacted under the same conditions And prepare H
Analyzed by PLC.
【0238】なお、HPLCの条件は次の通りである。
装置:L−6200型(日立製作所製)
カラム:OHpak KB−804(8 mm× 300 mm)
(昭和電工社製)
溶離液:5mMのアジ化ナトリウム、25mMの塩化カ
ルシウム、及び50mMの塩化ナトリウムを含む25m
Mのイミダゾール緩衝液(pH8)
検出:視差屈折率検出器(Shodex RI−71、
昭和電工社製)
流速:1ml/分
カラム温度:25℃The HPLC conditions are as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak KB-804 (8 mm x 300 mm)
(Showa Denko) Eluent: 25m containing 5mM sodium azide, 25mM calcium chloride, and 50mM sodium chloride
M imidazole buffer (pH 8) Detection: Parallax Refractive Index Detector (Shodex RI-71,
(Showa Denko) Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 25 ° C
【0239】その結果、本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Uを全く低分子化
しなかった。As a result, the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention did not lower the molecular weight of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U at all.
【0240】既述のように、本発明は、上記した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素と、カルシウム源とを
含有する酵素組成物に関する。As described above, the present invention relates to an enzyme composition containing the above-described sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention and a calcium source.
【0241】使用可能なカルシウム源としては、固形組
成物においては、例えば塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、酢酸カルシウムのようなカルシウム塩、酸化カルシ
ウム、水酸化カルシウム、あるいはそれらの水和物など
が挙げられる。他方、水、アルコール等の溶媒中に溶
解、懸濁、乳化させた液状組成物においては、カルシウ
ム源は、前記したような単体であっても、あるいは溶解
などによりイオン化した状態のものであってもよい。In the solid composition, examples of usable calcium sources include calcium salts such as calcium chloride, calcium carbonate, calcium acetate, calcium oxide, calcium hydroxide, and hydrates thereof. On the other hand, in the liquid composition dissolved, suspended, or emulsified in a solvent such as water or alcohol, the calcium source may be a simple substance as described above, or may be in an ionized state by dissolution or the like. Good.
【0242】これらカルシウム源は、当該酵素を賦活又
は安定化するので有効である。These calcium sources are effective because they activate or stabilize the enzyme.
【0243】したがって、上記酵素組成物は上記したカ
ルシウム源の作用効果を阻害しない範囲で、用途に応じ
て常用の添加剤を含有していてもよい。Therefore, the above-mentioned enzyme composition may contain a conventional additive depending on the application, as long as it does not impair the action and effect of the calcium source.
【0244】本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素を
フコース硫酸含有多糖−F含有物に作用させることによ
って、フコース硫酸含有多糖−Fの低分子化物を調製す
ることができる。フコース硫酸含有多糖−F含有物とし
ては、例えばフコース硫酸含有多糖−F精製品でもよ
く、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更
に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸
含有多糖−F含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、
溶解液中のフコース硫酸含有多糖濃度はその最高溶解濃
度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して
選定すればよい。By allowing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing product, a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F can be prepared. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing material may be, for example, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F purified product, the aforementioned mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, or an aqueous solvent extract of brown algae seaweed. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing material may be dissolved by an ordinary method,
The concentration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the solution may be its maximum concentration, but it is usually selected in consideration of its operability and enzyme titer.
【0245】フコース硫酸含有多糖−F溶解液としては
水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液
のpHは通常中性で、酵素反応は通常30℃付近で行
う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低
分子化物の分子量を調整することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solution may be selected from water, buffer solution and the like according to the purpose. The pH of the solution is usually neutral, and the enzyme reaction is usually performed at around 30 ° C. The molecular weight of the low molecular weight compound can be adjusted by adjusting the amount of enzyme, the reaction time, and the like.
【0246】次に低分子化物を分子量分画することによ
って、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖−
F低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩
処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本
発明の低分子化物の乾燥品を調製することもできる。Next, the low molecular weight product is subjected to molecular weight fractionation to give a more uniform molecular weight distribution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-
F low molecular weight compounds can be prepared. A commonly used method can be applied to the molecular weight fractionation, and for example, a gel filtration method or a molecular weight fractionation membrane may be used. The low molecular weight compound may be further subjected to purification operations such as ion exchange resin treatment and activated carbon treatment, if necessary, and desalting treatment, aseptic treatment, and freeze-drying to reduce the A dried product of the molecular compound can also be prepared.
【0247】[0247]
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定される
ものではない。なお、実施例における%は重量%を意味
する。The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these descriptions. In the examples,% means% by weight.
【0248】実施例1
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物2kgを自由粉砕機
(奈良機械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末
を9リットルの80%エタノールに懸濁し80℃、2時
間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この
残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3
回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を40
リットルの水に懸濁後、95℃、2時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖を含む抽出液36リットルを得た。得られた抽出
液1.8リットルを凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖
標品15.4gを得た。次に残りの抽出液に0.4Mと
なるように食塩を加え、更に5%の塩化セチルピリジニ
ウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離
により沈殿を集めた。この沈殿を3リットルの0.4M
食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を
3回繰り返した後沈殿に1リットルの4M食塩水を添加
し、よくかくはん後エタノールを80%となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を80%エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操
作を、上清中の260nmの吸光度が0になるまで繰り
返した。この沈殿を2Mの食塩水3リットルに溶解し、
不溶物を遠心分離により除去後、2Mの食塩水で平衡化
した100mlのDEAE−セルロファインA−800
(生化学工業社製)を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を2Mの食塩水で平衡化し
たDEAE−セルロファインA−800カラムにかけ、
非吸着分を排除分子量10万以下のホロファイバーを備
えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を
完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除
去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混
合物の重量は76gであった。Example 1 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg of the dried product was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol at 80 ° C. for 2 hours. Processed. It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. This residue was washed with ethanol and filtered as described in 3
Repeated times to obtain an ethanol washing residue. 40 of this residue
After being suspended in 1 liter of water, it was treated at 95 ° C. for 2 hours and filtered. The residue was washed with hot water to obtain 36 liters of the extract of Gagome kelp containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide. The obtained extract (1.8 liters) was freeze-dried to obtain 15.4 g of a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation. Next, sodium chloride was added to the remaining extract so that the concentration was 0.4 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur any more, and the precipitate was collected by centrifugation. 3 liters of this precipitate 0.4M
After suspension in saline, centrifugation and washing were performed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by centrifugation after stirring. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. Dissolve this precipitate in 3 liters of 2M saline solution,
After removing the insoluble matter by centrifugation, 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2 M saline was added.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2M saline,
The non-adsorbed component is ultrafiltered with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less to completely remove the coloring substance and salt, and then the insoluble substance is removed by centrifugation and filtration and freeze-dried. . The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 76 g.
【0249】実施例2
マ昆布を充分乾燥後、乾燥物2kgを自由粉砕機(奈良
機械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リ
ットルの80%エタノールに懸濁し、80℃、2時間処
理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残
渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回
繰り返し、エタノール洗浄残渣を得た。この残渣を40
リットルの水に懸濁後、95℃、2時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多
糖を含む抽出液36リットルを得た。得られた抽出液に
0.4Mとなるように食塩を加え、更に5%の塩化セチ
ルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を3リット
ルの0.3M食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。こ
の洗浄操作を3回繰り返した後沈殿に1リットルの4M
食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを80%と
なるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得
た。この沈殿を80%エタノール中に懸濁し、遠心分離
するという操作を、上清中の260nmの吸光度が0に
なるまで繰り返した。この沈殿を2Mの食塩水3リット
ルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、2Mの食
塩水で平衡化した100mlのDEAE−セルロファイ
ンA−800(生化学工業社製)を添加し、かくはん
後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を2Mの食
塩水で平衡化したDEAE−セルロファインA−800
カラムにかけ、非吸着分を排除分子量10万以下のホロ
ファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性
物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により
不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース
硫酸含有多糖混合物の重量は52gであった。Example 2 After thoroughly drying mackerel, 2 kg of the dried product was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and kept at 80 ° C. for 2 hours. Time processed. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. The above-mentioned ethanol washing and filtration operations were repeated 3 times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. 40 of this residue
After being suspended in 1 liter of water, it was treated at 95 ° C. for 2 hours and filtered. The residue was washed with hot water to obtain 36 liters of an extract of mackerel containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide. Sodium chloride was added to the obtained extract so that the concentration was 0.4 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur any more, and the precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was suspended in 3 liters of 0.3 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 L of 4M was added to the precipitate.
Saline was added, well stirred and then ethanol was added to 80%, and after stirring, a precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 2M saline was added, After stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was equilibrated with 2M saline solution DEAE-Cellulofine A-800.
After applying a column, the non-adsorbed component is subjected to ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight exclusion of 100,000 or less to completely remove the coloring substance and salt, and then the insoluble substance is removed by centrifugation and filtration. Lyophilized. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 52 g.
【0250】実施例3
マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出
マ昆布を充分乾燥後、2kgを自由粉砕機(奈良機械製
作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リットル
の80%エタノールに懸濁し80℃、2時間処理した。
処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して
上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返しエ
タノール洗浄残渣を得た。この残渣を36リットルの
0.2M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、95℃、2時間
処理し、ろ過した。残渣を4リットルの0.2M酢酸カ
ルシウム溶液で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖
混合物の抽出液36リットルを得た。Example 3 Extraction of Polysaccharide Mixture Containing Sulfuric Acid Fucose of Makonbu After thoroughly drying Makonbu, 2 kg was pulverized by a free pulverizer (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was 9 liters of 80% ethanol. And suspended at 80 ° C. for 2 hours.
It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of a 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of an extract of a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides of mackerel.
【0251】実施例4
マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の調製
実施例3で得られたろ液に、5%の塩化セチルピリジニ
ウムを、それ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分
離により沈殿を集めた。この沈殿を3リットルの0.3
M食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作
を3回繰り返した後沈殿に1リットルの4M食塩水を添
加しよくかくはん後エタノールを80%となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を80%エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作
を、上清中の260nmの吸光度が0になるまで繰り返
した。この沈殿を2Mの食塩水3リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、2Mの食塩水で平衡化し
た100mlのDEAE−セルロファインA−800
(生化学工業社製)を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を2Mの食塩水で平衡化し
たDEAE−セルロファインA−800カラムにかけ非
吸着分を排除分子量10万以下のホロファイバーを備え
た限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完
全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去
し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合
物の重量は52gであった。また、このフコース硫酸含
有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含
まなかった。Example 4 Preparation of Sulfate-fucose-containing Polysaccharide Mixture of Mackerel To the filtrate obtained in Example 3, 5% cetylpyridinium chloride was added until no further precipitation occurred, and the precipitate was collected by centrifugation. . Add 3 liters of this precipitate to 0.3
The cells were suspended in M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4 M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline solution, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M saline solution.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 52 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture did not contain a coloring substance that was adsorbed to the polysaccharide resin.
【0252】実施例5
実施例4記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を1gずつ4つ秤量し、それぞれ水、0.2Mの塩化
ナトリウム、0.2Mの塩化カルシウム、0.2Mの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、500mlのDEA
E−セファロースFFのカラムを4本用意し、内2本を
0.2Mの塩化ナトリウム、1本を0.2Mの塩化カル
シウム、1本を0.2Mの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。0.2Mの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの10倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したDEAE−セファロースFFの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分に
洗浄し、次に、0から4Mの塩化ナトリウムのグラジエ
ントで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化
マグネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫
酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食
塩で平衡化したカラムには0.4g相当のフコース硫酸
含有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムに
おいても、本発明のフコース硫酸含有多糖−Fとフコー
ス硫酸含有多糖−Uは実質的に分離された。Example 5 Four 1 g freeze-dried products of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 4 were weighed, and water, 0.2 M sodium chloride, 0.2 M calcium chloride and 0.2 M chloride were respectively weighed. Dissolved in magnesium. Next, 500 ml of DEA
Four E-Sepharose FF columns were prepared, and two of them were equilibrated with 0.2M sodium chloride, one with 0.2M calcium chloride, and one with 0.2M magnesium chloride. One of the columns equilibrated with 0.2 M sodium chloride was washed with 10 column volumes of water. Apply the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture dissolved in water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride to the DEAE-Sepharose FF column equilibrated with water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride, respectively, and use each for equilibration. The solution was washed thoroughly with the same solution and then eluted with a gradient of 0 to 4 M sodium chloride. As a result, the total amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture applied to the column only in the system using calcium chloride and magnesium chloride was adsorbed to the column. Only 0.4 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was adsorbed on the column equilibrated with water and sodium chloride. Further, in any of the columns, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention were substantially separated.
【0253】実施例6
ガゴメ昆布を充分乾燥後、2kgを自由粉砕機(奈良機
械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リッ
トルの80%エタノールに懸濁し80℃、2時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を36リットル
の0.2M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、95℃、2時
間処理し、ろ過した。残渣を4リットルの0.2M酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液36リットルを得た。このろ液を排
除分子量10万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器によ
り2リットルに濃縮し、次に、終濃度が1.5Mとなる
ように食塩を添加し5%の塩化セチルピリジニウムをこ
れ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を
遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過によ
り1リットルに濃縮し、4リットルのエタノールを添加
し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に1
00mlの4M食塩水を添加しよくかくはん後エタノー
ルを80%となるように添加し、かくはん後遠心分離に
より沈殿を得た。この沈殿を80%エタノール中に懸濁
し遠心分離するという操作を、上清中の260nmの吸
光度が0になるまで繰り返した。この沈殿を2Mの食塩
水2リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、2Mの食塩水で平衡化した50mlのDEAE−セ
ルロファインA−800(生化学工業社製)を添加し、
かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を
2Mの食塩水で平衡化したDEAE−セルロファインA
−800カラムにかけ非吸着分を排除分子量10万以下
のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、
着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過
により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥し
たフコース硫酸含有多糖−Uの重量は15gであった。
また、この本発明のフコース硫酸含有多糖−Uは多糖性
の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこの
フコース硫酸含有多糖−Uは、前記エンド型フコイダン
分解酵素を作用させると上記式(I)、(II)、及び
(III)で表されるオリゴ糖を生じた。Example 6 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and treated at 80 ° C. for 2 hours. . It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture extract of Gagome kelp. This filtrate was concentrated to 2 liters by an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then salt was added to a final concentration of 1.5M to obtain 5% cetylpyridinium chloride. Was added until no more precipitation occurred. The resulting precipitate was removed by centrifugation. The obtained supernatant was concentrated to 1 liter by ultrafiltration, 4 liter of ethanol was added, and the generated precipitate was collected by centrifugation. 1 for this precipitation
00 ml of 4M saline was added and well stirred, then ethanol was added to 80%, and after stirring, a precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 2 liters of 2M saline, insoluble matter was removed by centrifugation, and 50 ml of DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 2M saline was added,
After stirring, the added resin was removed by filtration. DEAE-Cellulofine A equilibrated with 2 M saline
-Extract the non-adsorbed portion by 800 column with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less,
After completely removing the coloring substance and salt, the insoluble substance was removed by centrifugation and filtration, and the mixture was freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-U weighed 15 g.
Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-U produced oligosaccharides represented by the above formulas (I), (II), and (III) when the endo-fucoidan-degrading enzyme was acted on.
【0254】実施例7
ガゴメ昆布を充分乾燥後、2kgを自由粉砕機(奈良機
械製作所製)により粉砕し、得られた乾燥粉末を9リッ
トルの80%エタノールに懸濁し80℃、2時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を36リットル
の0.2M酢酸カルシウム溶液に懸濁後、95℃、2時
間処理し、ろ過した。残渣を4リットルの0.2M酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液36リットルを得た。得られたろ液
に5%の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じ
なくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この
沈殿を3リットルの0.4M食塩水に懸濁後遠心分離
し、洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した後沈殿に
1リットルの4M食塩水を添加しよくかくはん後エタノ
ールを80%となるように添加し、かくはん後遠心分離
により沈澱を得た。この沈殿を80%エタノール中に懸
濁し遠心分離するという操作を、上清中の260nmの
吸光度を0になるまで繰り返した。この沈殿を2Mの食
塩水3リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、2Mの食塩水で平衡化した100mlのDEAE−
セルロファインA−800(生化学工業社製)を添加
し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ
液を2Mの食塩水で平衡化したDEAE−セルロファイ
ンA−800カラムにかけ非吸着分を排除分子量10万
以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過
し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及び
ろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾
燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は90gであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖混合物は多糖性の
樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。 このフコ
ース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を7g秤量し、
0.2Mの塩化カルシウムに溶解した。次に、4000
mlのDEAE−セファロースFFのカラムを0.2M
の塩化カルシウムで平衡化した。0.2Mの塩化カルシ
ウムに溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をDEAE
−セファロースFFのカラムにかけ、0.2Mの塩化カ
ルシウムで充分洗浄し、次に、0〜4Mの塩化ナトリウ
ムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内塩化ナト
リウム濃度が0.05〜0.8Mの画分を集め透析によ
り脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖−
Fと分離されたフコース硫酸含有多糖−Uを2.1g得
た。また、上記溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が0.
9〜1.5Mの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥
し、実質的にフコース硫酸含有多糖−Uと分離されたフ
コース硫酸含有多糖−Fを4.7g得た。Example 7 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and treated at 80 ° C. for 2 hours. . It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture extract of Gagome kelp. 5% of cetylpyridinium chloride was added to the obtained filtrate until precipitation no longer occurred, and the precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 3 liters of 0.4 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation 3 times, 1 liter of 4M saline was added to the precipitate, well stirred and ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline solution, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE- equilibrated with 2M saline solution.
Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 90 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture did not contain a coloring substance that was adsorbed to the polysaccharide resin. 7 g of the freeze-dried product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was weighed,
It was dissolved in 0.2 M calcium chloride. Then 4000
0.2 M column of DEAE-Sepharose FF.
Equilibrated with calcium chloride. DEAE of polysaccharide mixture containing sulfated fucose dissolved in 0.2M calcium chloride
-Applied to a column of Sepharose FF, washed extensively with 0.2 M calcium chloride, then eluted with a gradient of 0-4 M sodium chloride. Fractions having a sodium chloride concentration of 0.05 to 0.8 M in the eluted fraction were collected, desalted by dialysis, and lyophilized to give a substantial amount of sulfated-fucose-containing polysaccharide-
2.1 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U separated from F was obtained. In addition, the sodium chloride concentration in the eluted fraction was 0.
Fractions of 9 to 1.5 M were collected, desalted by dialysis, and then freeze-dried to obtain 4.7 g of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F substantially separated from sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
【0255】実施例8
フコース硫酸含有多糖−Fの製造
実施例7で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を1.
2g秤量し、1.5Mの塩化ナトリウム溶液に終濃度
0.2%となるように溶解し、1.25%の塩化セチル
ピリジニウムの1.5M塩化ナトリウム溶液をこれ以上
沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分
離により集め、この沈殿を500mlの1.5M食塩水
に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を3回繰
り返した後沈殿に1リットルの4M食塩水を添加しよく
かくはん後エタノールを80%となるように添加し、か
くはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を80%
エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清
中の260nmの吸光度が0になるまで繰り返した。こ
の沈殿を2Mの食塩水500mlに溶解し、不溶物を遠
心分離により除去後、2Mの食塩水で平衡化した1ml
のDEAE−セルロファインA−800(生化学工業社
製)を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除
去した。ろ液を2Mの食塩水で平衡化したDEAE−セ
ルロファインA−800カラムにかけ非吸着分を排除分
子量10万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠
心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Fの重量は710
mgであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Fは
多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。ま
たこのフコース硫酸含有多糖−Fはウロン酸を含まずフ
コースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含
有多糖−Fであった。Example 8 Production of Sulfuric Acid Fucose-Containing Polysaccharide-F The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was mixed with 1.
2 g was weighed and dissolved in a 1.5 M sodium chloride solution to a final concentration of 0.2%, and 1.25% cetylpyridinium chloride in a 1.5 M sodium chloride solution was added until no more precipitation occurred. . The generated precipitate was collected by centrifugation, suspended in 500 ml of 1.5 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4 M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. 80% of this precipitate
The operation of suspending in ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 500 ml of 2M saline, the insoluble matter was removed by centrifugation, and 1 ml equilibrated with 2M saline.
DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The weight of the freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was 710.
It was mg. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention containing no uronic acid and having fucose as a main component sugar.
【0256】実施例9
フコース硫酸含有多糖−Fの酵素的精製方法
実施例7で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を10
g秤量し、500mlの人工海水に溶解後、前記フラボ
バクテリウム sp. SA−0082(FERM B
P−5402)由来のエンド型フコイダン分解酵素を5
U添加し25℃、50時間反応させた。反応液を排除分
子量10万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離
及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍
結乾燥フコース硫酸含有多糖−Fの重量は6gであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖−Fは多糖性の樹
脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコ
ース硫酸含有多糖−Fはウロン酸を含まず、フコースを
構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−
Fであることが判明した。Example 9 Method for Enzymatic Purification of Sulfonose-Fucose-Containing Polysaccharide-F 10% of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was used.
After being weighed and dissolved in 500 ml of artificial seawater, the flavobacterium sp. SA-0082 (FERM B
P-5402) -derived endo-type fucoidan degrading enzyme
U was added and reacted at 25 ° C. for 50 hours. The reaction solution was subjected to ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less to completely remove low-molecular substances, and then insoluble substances were removed by centrifugation and filtration, followed by freeze-drying. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 6 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F does not contain uronic acid, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention containing fucose as a main component of the sugar-
It turned out to be F.
【0257】実施例10
フコース硫酸含有多糖−Fの培養的精製方法
実施例7で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を60
g秤量し、20リットルの人工海水に溶解後ペプトン2
00gと酵母エキス4gを加え、30リットルのジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、前記フラボバクテリウム
sp. SA−0082株(FERM BP−540
2)を植菌して25℃、24時間培養した。培養液を遠
心分離し菌体を除去後、排除分子量10万以下のホロフ
ァイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性
物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物
質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有
多糖−Fの重量は36gであった。また、このフコース
硫酸含有多糖−Fは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質
を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Fは
ウロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発
明のフコース硫酸含有多糖−Fであることが判明した。Example 10 Method for Culturally Purifying Sulfose-Fucose-Containing Polysaccharide-F 60% of the sulfate-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was used.
Weigh g and dissolve in 20 liters of artificial seawater, then peptone 2
00 g and yeast extract 4 g were added, and the mixture was placed in a 30 liter jar fermenter and sterilized, and then the flavobacterium sp. SA-0082 strain (FERM BP-540
2) was inoculated and cultured at 25 ° C. for 24 hours. After removing the bacterial cells by centrifuging the culture solution, ultrafiltration is performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less, and low molecular substances are completely removed, and then insoluble substances are obtained by centrifugation and filtration. Was removed and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 36 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, it was found that this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention containing no uronic acid and having fucose as the main component of the constituent sugars.
【0258】実施例11
実施例7記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を1gずつ4つ秤量し、それぞれ水、0.2Mの塩化
ナトリウム、0.2Mの塩化カルシウム、0.2Mの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、500mlのDEA
E−セファロースFFのカラムを4本用意し、内2本を
0.2Mの塩化ナトリウム、1本を0.2Mの塩化カル
シウム、1本を0.2Mの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。0.2Mの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの10倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したDEAE−セファロースFFの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分洗
浄し、次に、0から4Mの塩化ナトリウムのグラジェン
トで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化マ
グネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸
含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩
で平衡化したカラムには0.4g相当のフコース硫酸含
有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムにお
いても、フコース硫酸含有多糖−Fとフコース硫酸含有
多糖−Uは実質的に分離された。Example 11 Four 1 g freeze-dried products of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 7 were weighed, and water, 0.2 M sodium chloride, 0.2 M calcium chloride and 0.2 M chloride were respectively weighed. Dissolved in magnesium. Next, 500 ml of DEA
Four E-Sepharose FF columns were prepared, and two of them were equilibrated with 0.2M sodium chloride, one with 0.2M calcium chloride, and one with 0.2M magnesium chloride. One of the columns equilibrated with 0.2 M sodium chloride was washed with 10 column volumes of water. Apply the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture dissolved in water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride to the DEAE-Sepharose FF column equilibrated with water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride, respectively, and use each for equilibration. The solution was washed thoroughly with the same solution and then eluted with a 0-4 M sodium chloride gradient. As a result, the total amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture applied to the column only in the system using calcium chloride and magnesium chloride was adsorbed to the column. Only 0.4 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was adsorbed on the column equilibrated with water and sodium chloride. Further, in both columns, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U were substantially separated.
【0259】実施例12
実施例1記載のフコース硫酸含有多糖混合物を7g秤量
し、800mlの0.2Mの塩化カルシウムに溶解し
た。次に、4リットルのDEAE−セファロースFFの
カラムを0.2Mの塩化カルシウムで平衡化し、上記フ
コース硫酸含有多糖溶液を全量カラムにかけ、8リット
ルの0.2M塩化カルシウム溶液で洗浄後、0から4M
の塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。溶出画
分の内ウロン酸が検出される画分(塩化ナトリウム濃度
約0.9M以下:フコース硫酸含有多糖−U)、ウロン
酸が検出されない画分(塩化ナトリウム濃度約1.2M
付近:フコース硫酸含有多糖−F)のそれぞれを脱塩後
凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ1.4g及び4.8g得
た。Example 12 7 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 1 was weighed and dissolved in 800 ml of 0.2 M calcium chloride. Next, a 4-liter DEAE-Sepharose FF column was equilibrated with 0.2 M calcium chloride, the above-mentioned polysaccharide solution containing a sulfated-fucose solution was applied to the column, and after washing with 8 liters of 0.2 M calcium chloride solution, 0 to 4 M was added.
Was eluted with a gradient of sodium chloride. Fraction in which uronic acid is detected in the eluted fraction (sodium chloride concentration of about 0.9 M or less: sulfated-fucose-containing polysaccharide-U), fraction in which uronic acid is not detected (sodium chloride concentration of about 1.2 M)
Vicinity: Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F) was desalted and then freeze-dried to obtain 1.4 g and 4.8 g of dried products, respectively.
【0260】実施例13
実施例1で得られるフコース硫酸含有多糖混合物に、フ
ラボバクテリウム sp. SA−0082(FERM
BP−5402)の生産するエンド型フコイダン分解
酵素を作用させると下記の構造を有するオリゴ糖を生成
する。Example 13 The mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 1 was mixed with Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM
When an endo-fucoidan-degrading enzyme produced by BP-5402) is allowed to act, an oligosaccharide having the following structure is produced.
【化21】 [Chemical 21]
【化22】 [Chemical formula 22]
【化23】 [Chemical formula 23]
【0261】本発明者らは、下記の酵素反応を行い、上
記オリゴ糖を得た。The present inventors obtained the above oligosaccharide by carrying out the following enzyme reaction.
【0262】すなわち、2.5%の実施例1のフコース
硫酸含有多糖混合物溶液80mlと、50mMのリン酸
緩衝液(pH7.5)60mlと4Mの塩化ナトリウム
20mlと32mU/mlのエンド型フコイダン分解酵
素溶液40mlを混合し、25℃で48時間反応させ
た。That is, 80 ml of a 2.5% solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture solution of Example 1, 60 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 20 ml of 4 M sodium chloride and 32 mU / ml of endo-type fucoidan decomposition. 40 ml of the enzyme solution was mixed and reacted at 25 ° C for 48 hours.
【0263】反応液をセルロファインGCL−300
(生化学工業社製)のカラムにより分子量分画し、分子
量2000以下の画分を集めた。この画分をマイクロア
シライザーG3により脱塩後、DEAE−セファロース
FFにより3つの画分を分離し、再度脱塩後、凍結乾燥
した。こうして上記各式(I)、(II)、(III)のオ
リゴ糖をそれぞれ250mg、310mg、52mg得
た。The reaction solution was used as Cellulofine GCL-300.
Molecular weight fractionation was performed using a column (manufactured by Seikagaku Corporation), and fractions having a molecular weight of 2000 or less were collected. This fraction was desalted with Micro Acylyzer G3, then separated into 3 fractions with DEAE-Sepharose FF, desalted again, and lyophilized. Thus, 250 mg, 310 mg and 52 mg of oligosaccharides of the above formulas (I), (II) and (III) were obtained.
【0264】実施例14
実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物10g
を0.2Mのクエン酸500mlに溶解し、pHを2.
9に調整後、100℃で3時間処理した。この加水分解
物に1Mの酢酸カルシウム溶液を150ml添加し、生
じた沈殿を遠心分離により除去後セルロファインGCL
−25によるゲルろ過で分子量分画し(分子量5000
以上、5000〜3000超、3000〜2000超、
2000〜1000超、1000〜500超、500以
下)、分子量の大きい方から順に、GFd−Oli−
1、GFd−Oli−2、GFd−Oli−3、GFd
−Oli−4、GFd−Oli−5、及びGFd−Ol
i−6とした。これらの6画分を脱塩後凍結乾燥し、乾
燥品をそれぞれ2.3g、1.7g、0.88g、1.
8g、1.4g、及び0.72g得た。Example 14 10 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1
Was dissolved in 500 ml of 0.2 M citric acid and the pH was adjusted to 2.
After adjusting to 9, it was treated at 100 ° C. for 3 hours. To this hydrolyzate, 150 ml of 1M calcium acetate solution was added, and the resulting precipitate was removed by centrifugation and then Cellulofine GCL
The molecular weight was fractionated by gel filtration with -25 (molecular weight 5000
Above, over 5000-3000, over 3000-2000,
2,000 to more than 1000, more than 1000 to more than 500, and 500 or less), in descending order of molecular weight, GFd-Oli-
1, GFd-Oli-2, GFd-Oli-3, GFd
-Oli-4, GFd-Oli-5, and GFd-Ol
i-6. These 6 fractions were desalted and then lyophilized to obtain dried products of 2.3 g, 1.7 g, 0.88 g and 1.
8 g, 1.4 g, and 0.72 g were obtained.
【0265】実施例15
実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を60
g秤量し、20リットルの人工海水に溶解後ペプトン2
00gと酵母エキス4gを加え30リットル容のジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、フラボバクテリウム s
p. SA−0082(FERM BP−5402)を
植菌し25℃、24時間培養した。培養液を遠心分離
し、菌体を除去後、排除分子量10万以下のホロファイ
バーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質
を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を
除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖
−Fの重量は36gであった。Example 15 The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 was mixed with 60
Weigh g and dissolve in 20 liters of artificial seawater, then peptone 2
Add 00 g and 4 g of yeast extract, put in a 30 liter jar fermenter and sterilize, then flavobacterium s
p. SA-0082 (FERM BP-5402) was inoculated and cultured at 25 ° C. for 24 hours. After removing the bacterial cells by centrifuging the culture solution, ultrafiltration is performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less, and the low molecular weight substances are completely removed, and then insoluble by centrifugation and filtration. Material was removed and lyophilized. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 36 g.
【0266】実施例16
マナマコを5kg解体し、内臓を除去し、体壁を集め
た。体壁湿重量200g当り500mlのアセトンを加
え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着
色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を
吸引乾燥し140gの乾燥物を得た。この乾燥物に0.
4Mの食塩水2.8リットルを加え、100℃で1時間
処理後、ろ過し、残渣を0.4Mの食塩水で充分洗浄
し、抽出液3.7リットルを得た。この抽出液に5%の
セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなく
なるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈
殿を0.4Mの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られ
た沈殿に1リットルの4M食塩水を添加し、ホモジナイ
ザーで処理後、かくはんしながら4リットルのエタノー
ルを添加し、1時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。
この沈殿に対して、80%エタノールに懸濁後ろ過とい
う工程を上清の260nmの吸光度が0になるまで繰り
返した。得られた沈殿を2リットルの2M食塩水に懸濁
し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子
量3万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完
全に脱塩後、凍結乾燥し3.7gのフコース硫酸含有多
糖を得た。Example 16 5 kg of sea cucumber was disassembled, the internal organs were removed, and the body wall was collected. Acetone of 500 ml per 200 g of wet weight of the body wall was added, treated with a homogenizer and then filtered, and the residue was washed with acetone until there was no more colored substance. The residue was sucked and dried to obtain 140 g of a dried product. 0.
2.8 liters of 4M saline was added, and the mixture was treated at 100 ° C. for 1 hour and then filtered, and the residue was sufficiently washed with 0.4M saline to obtain 3.7 liters of extract. 5% of cetylpyridinium chloride was added to this extract until no more precipitate was formed, and the formed precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 0.4 M saline and then centrifuged again, and 1 liter of 4 M saline was added to the obtained precipitate. After treatment with a homogenizer, 4 liters of ethanol were added with stirring, and 1 After stirring for a while, the mixture was filtered to obtain a precipitate.
For this precipitation, the process of suspending in 80% ethanol and then filtering was repeated until the absorbance at 260 nm of the supernatant became zero. The obtained precipitate was suspended in 2 liters of 2M saline and the insoluble matter was removed by centrifugation. The supernatant was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration device equipped with a membrane having an exclusion molecular weight of 30,000, completely desalted, and then freeze-dried to obtain 3.7 g of a sulfated-fucose-containing polysaccharide.
【0267】実施例17
ヒバマタ(Fucus vesiculosus )を充分乾燥後、乾燥物
2kgを自由粉砕機(奈良機械製作所製)により粉砕
し、得られた乾燥粉末を9リットルの80%エタノール
に懸濁し、80℃、2時間処理した。処理後ろ紙により
ろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール
洗浄、ろ過という操作を3回繰り返しエタノール洗浄残
渣を得た。この残渣を40リットルの水に懸濁後、10
0℃、2時間処理し、ろ過した。ろ液に0.5Mとなる
ように塩化ナトリウムを加え、更に5%の塩化セチルピ
リジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、
遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を3リットルの
0.4M塩化ナトリウムに懸濁後遠心分離し、洗浄し
た。この洗浄操作を3回繰り返した後沈殿に250gの
塩化ナトリウムを加え、3リットルのエタノール中に懸
濁し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を80%エ
タノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清
中の260nmの吸光度が0になるまで繰り返した。こ
の沈殿を2Mの塩化ナトリウム3リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、2Mの食塩水で平衡化し
た100mlのDEAE−セルロファインA−800
(生化学工業社製)を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を2Mの塩化ナトリウムで
平衡化したDEAEーセルロファインA−800カラム
にかけ非吸着分を排除分子量10万以下のホロファイバ
ーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び
塩化ナトリウムを完全に除去後、遠心分離及びろ過によ
り不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコー
ス硫酸含有多糖の重量は92gであった。Example 17 Hibamata (Fucus vesiculosus) was thoroughly dried, and then 2 kg of the dried product was pulverized by a free pulverizer (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol to give 80 It was processed at 2 ° C. for 2 hours. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. After suspending the residue in 40 liters of water, 10
It was treated at 0 ° C. for 2 hours and filtered. Sodium chloride was added to the filtrate to 0.5 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur,
The precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 3 liters of 0.4 M sodium chloride and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 250 g of sodium chloride was added to the precipitate, the suspension was suspended in 3 liters of ethanol, and the precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, the insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M saline.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M sodium chloride, and non-adsorbed components were removed. Ultrafiltration was performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to remove coloring substances and sodium chloride. After complete removal, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide weighed 92 g.
【0268】実施例18
わかめ(Undaria pinnatifida)を充分乾燥後、2kgを
自由粉砕機(奈良機械製作所製)により粉砕し、得られ
た乾燥粉末を9リットルのエタノールに懸濁し、75
℃、1時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を
得た。この残渣に対して80%のエタノールを9リット
ル添加、かくはんし、80℃、1時間処理後、ろ紙によ
りろ過し、残渣を得た。この残渣に対して、上記80%
エタノール洗浄、ろ過という操作を3回繰り返し、エタ
ノール洗浄残渣1908gを得た。この残渣のうち68
4gを9リットルの0.2M酢酸カルシウムに懸濁後、
95℃、1時間処理し、24時間静置後その上清を得
た。上清を除去した沈殿に9リットルの0.2M酢酸カ
ルシウムを添加かくはんし、1時間静置後上清を得、上
記上清と合せた。こうして得られた上清をろ紙でろ過
後、排除分子量10,000のホロファイバーを備えた
限外ろ過装置により限外ろ過し、350mlに濃縮し
た。濃縮液を遠心分離し、沈殿を除去後、2mMの塩化
ナトリウムを添加しながら限外ろ過し、完全に酢酸カル
シウムを除去後、凍結乾燥し、凍結乾燥物3.2gを得
た。凍結乾燥物中のフコース硫酸含有多糖の重量は3.
1gであった。Example 18 Seaweed (Undaria pinnatifida) was thoroughly dried, and then 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of ethanol, and
It was treated at ℃ for 1 hour. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. To this residue, 9 liters of 80% ethanol was added, stirred, treated at 80 ° C. for 1 hour, and then filtered through filter paper to obtain a residue. 80% above for this residue
The operations of washing with ethanol and filtration were repeated three times to obtain 1908 g of an ethanol washing residue. 68 of this residue
After suspending 4 g in 9 L of 0.2 M calcium acetate,
The mixture was treated at 95 ° C for 1 hour and left standing for 24 hours to obtain the supernatant. 9 L of 0.2 M calcium acetate was added to the precipitate from which the supernatant had been removed, and the mixture was stirred and allowed to stand for 1 hour to obtain a supernatant, which was combined with the above supernatant. The supernatant thus obtained was filtered through a filter paper, then ultrafiltered by an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 10,000, and concentrated to 350 ml. The concentrated solution was centrifuged, the precipitate was removed, and ultrafiltration was performed while adding 2 mM sodium chloride to completely remove calcium acetate, followed by freeze-drying to obtain 3.2 g of a freeze-dried product. The weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the freeze-dried product was 3.
It was 1 g.
【0269】実施例19
(1)ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製
乾燥ガゴメ昆布2Kgを自由粉砕機M−2型(奈良機械
製作所製)により粉砕し、4.5倍量の80%エタノー
ル中で80℃、2時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記80%エタノール抽出、ろ過という工程を更に3回
繰り返し、エタノール洗浄残渣1870gを得た。残渣
に36リットルの水を加え、100℃、2時間処理し、
ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を400mM
の塩化ナトリウム溶液と同じにした後、5%のセチルピ
リジルクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離した。その沈殿を、80%のエタノールで
繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に
除去した後、3リットルの2M塩化ナトリウムに溶解
し、不溶物を遠心分離で除去し、2Mの塩化ナトリウム
で平衡化した100mlのDEAE−セルロファインA
−800を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。
このろ液を、2Mの塩化ナトリウムで平衡化した100
mlのDEAE−セルロファインA−800のカラムに
かけ、通過画分を限外ろ過器(ろ過膜の排除分子量10
万)により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈
殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して
精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物82.2g
を得た。Example 19 (1) Preparation of Gagome kelp fucose sulfate-containing polysaccharide mixture 2 Kg of dried Gagome kelp was pulverized with a free pulverizer M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and 4.5 times in 80% ethanol. After treatment at 80 ° C. for 2 hours, it was filtered. For the residue,
The above steps of 80% ethanol extraction and filtration were repeated three more times to obtain 1870 g of ethanol washing residue. To the residue was added 36 liters of water, treated at 100 ° C for 2 hours,
An extract was obtained by filtration. The salt concentration of the extract is 400 mM
After making it the same as the sodium chloride solution in Example 1, 5% cetylpyridyl chloride was added until no more precipitation occurred, and the mixture was centrifuged. The precipitate was repeatedly washed with 80% ethanol to completely remove cetylpyridinium chloride, then dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, insoluble matter was removed by centrifugation, and equilibrated with 2M sodium chloride. 100 ml DEAE-Cellulofine A
-800 was suspended, stirred and filtered to remove the resin.
The filtrate was equilibrated with 2M sodium chloride to 100.
It was applied to a column of ml DEAE-Cellulofine A-800, and the passed-through fraction was subjected to an ultrafiltration (excluded molecular weight of filtration membrane was
10,000) for desalting and removal of low-molecular weight compounds, and the precipitate generated at this time was removed by centrifugation. This supernatant was freeze-dried and then purified. Gagome kelp sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture 82.2 g
Got
【0270】(2)フコース硫酸含有多糖−Fの調製
上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物6g
を600mlの0.2Mの塩化カルシウムを含む20m
Mの酢酸ナトリウム(pH6.0)に溶解後、あらかじ
め0.2Mの塩化カルシウムを含む20mMの酢酸ナト
リウム(pH6.0)で平衡化した3600mlのDE
AE−セファロースFFのカラムにかけ、0.2Mの塩
化カルシウムを含む20mMの酢酸ナトリウム(pH
6.0)で充分カラムを洗浄後、0〜2Mの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
0.75M以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
F画分を集め、排除分子量10万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Fの凍結乾燥標品を3.3g得た。(2) Preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F 6 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture derived from Gagome kombu described above
20m containing 600ml of 0.2M calcium chloride
3600 ml of DE after dissolution in M sodium acetate (pH 6.0) and then equilibrated with 20 mM sodium acetate (pH 6.0) containing 0.2 M calcium chloride in advance.
Apply to AE-Sepharose FF column, 20 mM sodium acetate containing 0.2 M calcium chloride (pH
After thoroughly washing the column with 6.0), it was eluted with a gradient of 0 to 2 M sodium chloride. Sulfate-fucose-containing polysaccharide that elutes at a sodium chloride concentration of 0.75 M or more
The F fraction was collected, concentrated and desalted with an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then freeze-dried to obtain 3.3 g of a freeze-dried preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
【0271】(3)エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素の調製
アルテロモナス sp. SN−1009(FERM
BP−5747)を、グルコース0.25%、ペプトン
1.0%、酵母エキス0.05%を含む人工海水(ジャ
マリンラボラトリー社製)pH8.2からなる培地60
0mlを分注して殺菌した(120℃、20分)2リッ
トルの三角フラスコに接種し、25℃で25時間培養し
て種培養液とした。 ペプトン200g、酵母エキス4
g、及び消泡剤(信越化学工業社製KM70)4mlを
含む人工海水pH8.0からなる培地18リットルを3
0リットル容のジャーファーメンターに入れて120℃
で20分殺菌した。冷却後、別に120℃、15分殺菌
した2リットルの人工海水に溶解した20gの実施例8
の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸
含有多糖−F及び上記の種培養液600mlを接種し、
24℃で20時間、毎分10リットルの通気量と毎分2
50回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。培
養上清中の本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の活
性をフコース硫酸含有多糖−Fを基質に用いて測定した
ところ、5mU/ml・培養液であった。得られた培養
上清を、分画分子量1万の限外ろ過器により濃縮後、生
じた沈殿を遠心分離により除去し、85%飽和硫安塩析
し、生じた沈殿を遠心分離により集め、10分の1濃度
の人工海水(ジャマリンS)を含む20mMのトリス−
塩酸緩衝液(pH8.2)に対して充分透析し、400
mlの粗酵素を得た。(3) Preparation of endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme Alteromonas sp. SN-1009 (FERM
BP-5747), glucose 60% 0.25%, peptone 1.0%, yeast extract 0.05% artificial seawater (manufactured by Jamarin Laboratories) pH 8.2 medium 60
0 ml was dispensed and sterilized (120 ° C, 20 minutes) to inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask, and the mixture was cultured at 25 ° C for 25 hours to obtain a seed culture solution. 200g peptone, 4 yeast extract
g, and 4 ml of an antifoaming agent (KM70 manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 3 ml of 18 liters of a medium consisting of artificial seawater pH 8.0
Put in a 0 liter jar fermenter at 120 ° C
It was sterilized for 20 minutes. After cooling, 20 g of Example 8 separately dissolved in 2 liters of artificial seawater sterilized at 120 ° C. for 15 minutes
Inoculated with the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F derived from Gagome kelp prepared by the method of above and 600 ml of the above seed culture,
Aeration rate of 10 liters per minute and 2 per minute for 20 hours at 24 ° C
The culture was carried out under a stirring speed of 50 rpm. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain cells and culture supernatant. When the activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention in the culture supernatant was measured using the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F as a substrate, it was 5 mU / ml · culture liquid. The obtained culture supernatant was concentrated by an ultrafilter having a molecular weight cut-off of 10,000, and then the formed precipitate was removed by centrifugation, salted out with 85% saturated ammonium sulfate, and the formed precipitate was collected by centrifugation. 20 mM Tris containing artificial seawater (Jamarine S) at a concentration of 1 /
Thoroughly dialyzed against hydrochloric acid buffer (pH 8.2), 400
ml of crude enzyme was obtained.
【0272】得られた粗酵素液を、あらかじめ5mMの
アジ化ナトリウム及び10分の1濃度の人工海水(ジャ
マリンS)を含む20mMのトリスー塩酸緩衝液(pH
8.2)で平衡化したDEAE−セルロファインA−8
00(生化学工業社製)のカラムに吸着させ、吸着物を
同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に100mM、2
00mM、300mM、400mM、及び600mMの
塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集め
た。得られた部分精製酵素の活性はフコース硫酸含有多
糖−Fを基質に用いて測定したところ、10200mU
(10.2U)であった。なお、他のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の混入は認められなかった。得られた部分
精製酵素の一部をあらかじめ10分の1濃度の人工海水
(ジャマリンS)及び5mMのアジ化ナトリウムを含む
10mMのトリス−塩酸酸緩衝液(pH8.0)で平衡
化したセファクリル S−200でゲルろ過を行い、そ
の分子量を求めたところ約10万であった。The obtained crude enzyme solution was preliminarily treated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH: 5 mM sodium azide and artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10).
DEAE-Cellulofine A-8 equilibrated in 8.2)
00 column (manufactured by Seikagaku Corporation) was adsorbed, and the adsorbate was thoroughly washed with the same buffer solution.
Elution was performed with a solution containing 00 mM, 300 mM, 400 mM, and 600 mM sodium chloride, and active fractions were collected. The activity of the obtained partially purified enzyme was 10200 mU when measured using a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F as a substrate.
It was (10.2 U). No contamination with other sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzymes was observed. Sephacryl S obtained by previously equilibrating a part of the obtained partially purified enzyme with artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10 and 10 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 5 mM sodium azide. Gel filtration was performed at -200, and the molecular weight was determined to be about 100,000.
【0273】(4)上記実施例で得た部分精製酵素及び
PA−FFをそれぞれ酵素源及び基質として本酵素の活
性に及ぼすカルシウム濃度の検討を行った。酵素反応に
用いる緩衝液には50mMの酢酸、イミダゾール、及び
トリス−塩酸を含むpH7の緩衝液を用いた。また、反
応液には終濃度400mMの塩化ナトリウムを溶存させ
た。反応液中の塩化カルシウム濃度を0〜100mMま
で変化させ、酵素活性を測定したところ、図23に示す
ような結果が得られた。なお、図23において、縦軸は
相対活性(%)、横軸は反応液中カルシウム濃度(m
M) を示す。この結果、本酵素はカルシウム塩の存在下
著しく活性が高められることが判明した。(4) The partially purified enzyme and PA-FF obtained in the above Examples were used as the enzyme source and substrate, and the calcium concentration which affects the activity of this enzyme was examined. As the buffer solution used for the enzyme reaction, a buffer solution containing 50 mM acetic acid, imidazole, and tris-hydrochloric acid and having a pH of 7 was used. Further, sodium chloride having a final concentration of 400 mM was dissolved in the reaction solution. When the concentration of calcium chloride in the reaction solution was changed from 0 to 100 mM and the enzyme activity was measured, the results shown in FIG. 23 were obtained. In FIG. 23, the vertical axis represents relative activity (%), and the horizontal axis represents the concentration of calcium in the reaction solution (m
M) is shown. As a result, it was revealed that the activity of this enzyme was remarkably enhanced in the presence of calcium salt.
【0274】(5)本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素を下記6種類の緩衝液で透析しながら5℃
で20時間保持した後、残存活性を測定した。
1.20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)
2.5mMアジ化ナトリウムを含む20mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.2)
3.5mMアジ化ナトリウム及び50mM塩化ナトリウ
ムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)
4.5mMアジ化ナトリウム及び500mM塩化ナトリ
ウムを含む20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.2)
5.5mMアジ化ナトリウム、50mM塩化ナトリウ
ム、及び10mM塩化カルシウムを含む20mMトリス
−塩酸緩衝液(pH8.2)
6.5mMアジ化ナトリウム及び10分の1濃度の人工
海水(ジャマリンS)を含む20mMトリス−塩酸緩衝
液(pH8.2)
以上の結果、1、2、及び3の緩衝液で透析した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素は失活し、4、5、及
び6の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は活性が保持された。このことから本酵素は5
00mMの塩化ナトリウムの存在下あるいは10mMの
カルシウムイオンの存在下で安定化されることが判明し
た。(5) The endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dialyzed against the following 6 types of buffer solutions at 5 ° C.
After being kept at 20 ° C. for 20 hours, residual activity was measured. 1. 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) 20 mM Tris-HCl buffer containing 2.5 mM sodium azide (pH 8.2) 20 mM Tris-HCl buffer containing 3.5 mM sodium azide and 50 mM sodium chloride (PH 8.2) 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer containing 4.5 mM sodium azide and 500 mM sodium chloride (pH 8.2) 5.5 mM sodium azide, 50 mM sodium chloride, and 10 mM calcium chloride containing 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer Solution (pH 8.2) 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.2) containing 6.5 mM sodium azide and artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10 The above results 1, 2, and 3 buffers The sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention dialyzed with a liquid was inactivated, and the 4,5-, 6- and Fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dialyzed liquor activity was retained. Therefore, this enzyme is 5
It was found to be stabilized in the presence of 00 mM sodium chloride or in the presence of 10 mM calcium ions.
【0275】(6)上記実施例で調製したフコース硫酸
含有多糖−Fを5g秤量し、471mlの50mMイミ
ダゾール緩衝液(pH8)、12.5mlの4M塩化ナ
トリウム、6.25mlの4M塩化カルシウム、及び実
施例19−(3)で得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の部分精製品10ml(6mU相当)を混
合し、25℃で120時間反応させたところフコース硫
酸含有多糖−Fの低分子化物が得られた。得られた低分
子化物のIR及びNMRの分析結果はそれぞれ図25及
び図26に示すとおりであった。また、セルロファイン
GCL−300でゲルろ過したところ、図24に示す結
果が得られた。すなわち、本物質は分子量1000〜3
0000にわたって分布するものである。また、本物質
の硫酸含量はSO4(分子量96)として46%であ
り、中性糖組成はフコース:ガラクトース=100:4
であった。なお、図24〜図26における縦軸及び横軸
は、それぞれ図2〜図4と同義である。(6) 5 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F prepared in the above Example was weighed, and 471 ml of 50 mM imidazole buffer (pH 8), 12.5 ml of 4M sodium chloride, 6.25 ml of 4M calcium chloride, and When 10 ml (corresponding to 6 mU) of a partially purified product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention obtained in Example 19- (3) was mixed and reacted at 25 ° C for 120 hours, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F had a low content. A molecular product was obtained. The IR and NMR analysis results of the obtained low molecular weight compound were as shown in FIGS. 25 and 26, respectively. Further, when gel filtration was carried out using Cellulofine GCL-300, the results shown in FIG. 24 were obtained. That is, this substance has a molecular weight of 1000 to 3
It is distributed over 0000. The sulfuric acid content of this substance was 46% as SO 4 (molecular weight 96), and the neutral sugar composition was fucose: galactose = 100: 4.
Met. The vertical axis and the horizontal axis in FIGS. 24 to 26 have the same meanings as those in FIGS. 2 to 4, respectively.
【0276】実施例20
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60(ATCC CRL−1964)をASF1
04培地(味の素社製)にて5×105 個/9mlと
なるように懸濁した。この懸濁液9mlを4つ用意し、
それぞれの懸濁液に対し、実施例1、12、及び15で
得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液(5m
g/ml)のフィルター処理液〔ポアサイズ0.20μ
mのセルロースアセテート膜(コーニング社製)でろ過
したもの(以下フィルター処理はこの条件で行った)〕
を1ml添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で40
時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分
離した。得られた細胞を10mMのエチレンジアミンテ
トラアセテート及び0.5%のナトリウムラウロイルサ
ルコシネートを含む50mMのトリス塩酸緩衝液(pH
7.8)20μlにて懸濁し、10mg/mlのリボヌ
クレアーゼA(シグマ社製)を1μl添加して50℃、
30分間処理した後、10mg/mlのプロティネース
Kを1μl添加して50℃、1時間処理した。処理後の
細胞をサンプルとして、2%のアガロースゲルを用いて
100Vの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルを
エチジウムブロミド溶液に30分間浸した後、トランス
イルミネータを用いてゲル中のDNAの状態を確認した
ところ、アポトーシスに特有のDNAラダーが確認され
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンDの10μg/ml溶液
を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操
作したところ、培養20時間で、フコース硫酸含有多糖
の場合と同じDNAラダーが確認できた。この結果よ
り、HL−60細胞は実施例1、12、及び15で得ら
れたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発さ
れることが明らかとなった。HL−60(ATCC C
CL−240)を用い、実施例1、12、及び15で得
られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔5mg/mlとな
るように120mMの塩化ナトリウムを含む30mMの
ヘペス緩衝液(pH7.2)に溶解し、121℃、20
分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発
作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 20 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CRL-1964) to ASF1
The cells were suspended in 04 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) at 5 × 10 5 cells / 9 ml. Prepare four 9 ml of this suspension,
For each suspension, a physiological saline solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15 (5 m
g / ml) filter treatment solution [pore size 0.20μ
m filtered through a cellulose acetate membrane (manufactured by Corning Incorporated) (hereinafter, the filter treatment was performed under these conditions)]
1 ml was added, and 40 at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide.
Incubated for hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were treated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH: 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate).
7.8) Suspend in 20 μl, add 1 μl of 10 mg / ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) and
After treatment for 30 minutes, 1 μl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After immersing this gel in an ethidium bromide solution for 30 minutes and confirming the state of DNA in the gel using a transilluminator, a DNA ladder peculiar to apoptosis was confirmed. For confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in the same manner as the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide. The same DNA ladder as the case was confirmed. From these results, it was revealed that HL-60 cells were induced to undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15. HL-60 (ATCC C
CL-240), each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 12, and 15 was added to a 30 mM Hepes buffer solution (pH 7.2) containing 120 mM sodium chloride at 5 mg / ml. Melt, 121 ℃, 20
The thing which was autoclaved for 1 minute] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.
【0277】実施例21
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60(ATCC CCL−240)をASF10
4培地(味の素社製)にて5×105 個/9mlとな
るように懸濁した。この懸濁液9mlに対し、実施例1
5で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
(5mg/ml)のフィルター処理液を1ml添加し、
37℃、5%二酸化炭素存在下で20時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を「アポトーシス実験プロトコール」(秀潤社、田
沼靖一監修、第93〜95頁、1995年)に従ってギ
ムザ染色した。すなわち得られた細胞をカルノア固定液
(酢酸:メタノール=1:3)を用いてスライドグラス
上に固定し、ギムザ色素(メルク社製)を用いて染色
し、光学顕微鏡により観察したところアポトーシス特有
の核の断片化が観察された。この結果よりHL−60細
胞は実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖により
アポトーシスを起こすことが明らかとなった。実施例1
5で得られたフコース硫酸含有多糖溶液〔5mg/ml
となるように120mMの塩化ナトリウムを含む30m
Mのヘペス緩衝液(pH7.2)に溶解し、121℃、
20分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 21 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
The cells were suspended in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) at 5 × 10 5 cells / 9 ml. Example 9 was added to 9 ml of this suspension.
1 ml of a filtered solution of a physiological saline solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in 5 (5 mg / ml) was added,
The cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 20 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were stained with Giemsa according to the "apoptosis experiment protocol" (supervised by Shujunsha, Yasuichi Tanuma, pages 93 to 95, 1995). That is, the obtained cells were fixed on a slide glass using a Carnoy's fixative (acetic acid: methanol = 1: 3), stained with Giemsa dye (Merck), and observed by an optical microscope to show that they are peculiar to apoptosis. Nuclear fragmentation was observed. From these results, it was revealed that HL-60 cells undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15. Example 1
The sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in 5 [5 mg / ml
30m containing 120mM sodium chloride
Dissolve in M Hepes buffer (pH 7.2), 121 ℃,
After 20 minutes of autoclave treatment], the apoptosis-inducing action was measured according to the above, and similar results were obtained.
【0278】実施例22
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60(ATCC CCL−240)をASF10
4培地(味の素社製)にて5×105 コ/4.5ml
となるように懸濁した。この懸濁液4.5mlを4つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、実施例1、15、及び
18で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔10mg
/mlとなるように120mMの塩化ナトリウムを含む
30mMのヘペス緩衝液(pH7.2)に溶解し、12
1℃、20分間オートクレーブ処理したもの〕及び12
0mMの塩化ナトリウムを含む30mMのヘペス緩衝液
を0.5ml添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で
培養し、培養開始後24時間及び40時間後に細胞数を
トリパンブルー染色法で計測した。Example 22 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultivated at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 5 cells / 4.5 ml in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co.)
It was suspended so that 4.5 ml of this suspension was prepared, and for each suspension, the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in Examples 1, 15 and 18 [10 mg
Dissolve in 30 mM Hepes buffer (pH 7.2) containing 120 mM sodium chloride so that
Autoclaved at 1 ° C for 20 minutes] and 12
0.5 ml of 30 mM Hepes buffer containing 0 mM sodium chloride was added, the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide, and the number of cells was counted by the trypan blue staining method 24 hours and 40 hours after the start of the culture. .
【0279】この結果を図27に示す。図27はHL−
60細胞の培養液に実施例1、15、及び18で得られ
たフコース硫酸含有多糖を1mg/mlとなるように添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表
す図であり、横軸は培養時間(時間)、縦軸は培養液中
の生細胞数(×105 コ/5ml)を示す。図27
中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、□
印が無添加(対照)、+印が実施例1、・印が実施例1
5、×印が実施例18で得られたフコース硫酸含有多糖
であることを示す。The results are shown in FIG. FIG. 27 shows HL-
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 were added to the culture medium of 60 cells at 1 mg / ml. Yes, the horizontal axis shows the culture time (hours), and the vertical axis shows the number of viable cells in the culture solution (× 10 5 cells / 5 ml). FIG. 27
The type of sulfated-fucose-containing polysaccharide added to the medium is □
The mark indicates no addition (control), the + mark indicates Example 1, and the mark indicates Example 1
5, the mark x indicates that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 18 was used.
【0280】また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片
化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれ
らの結果から、HL−60細胞は実施例1、15、及び
18で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシ
スを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明し
た。実施例1、15、及び18で得られた各フコース硫
酸含有多糖溶液〔10mg/mlとなるように120m
Mの塩化ナトリウムを含む30mMのヘペス緩衝液(p
H7.2)に溶解し、フィルター処理したもの〕のアポ
トーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得
た。At this time, the dead cells showed morphology peculiar to apoptosis such as cell shrinkage and fragmentation. That is, from these results, it was revealed that HL-60 cells were induced to undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 and cell growth was significantly suppressed. Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 15 and 18 [120 m at 10 mg / ml]
30 mM Hepes buffer containing M sodium chloride (p
H7.2), which had been dissolved in H7.2) and subjected to a filter treatment], the apoptosis-inducing action was measured according to the above, and similar results were obtained.
【0281】実施例23
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)9mlにヒト急性リンパ芽球性白血病細胞MO
LT−3(ATCC CRL−1552)を5×105
個/9mlとなるように懸濁した。この懸濁液9ml
を5つ用意し、それぞれに実施例1、2、12、及び1
6で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
(5mg/ml)のフィルター処理液を1ml添加し、
37℃、5%二酸化炭素存在下で60時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を10mMのエチレンジアミンテトラアセテート及
び0.5%のナトリウムラウロイルサルコシネートを含
む50mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.8)20μl
にて懸濁し、10mg/mlのリボヌクレアーゼA(シ
グマ社製)を1μl添加して50℃、30分間処理した
後、10mg/mlのプロティネースKを1μl添加し
て50℃、1時間処理した。処理後の細胞をサンプルと
して、2%のアガロースゲルを用いて100Vの定電圧
の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミ
ド溶液に30分間浸した後、トランスイルミネータを用
いてゲル中のDNAの状態を確認したところ、アポトー
シスに特有のDNAラダーが確認された。更に確認のた
めアポトーシスを誘発する試薬として知られているアク
チノマイシンDの10μg/ml溶液を上記のフコース
硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培
養20時間で、フコース硫酸含有多糖の場合と同じDN
Aラダーが確認できた。この結果より実施例1、2、1
2、及び16で得られたフコース硫酸含有多糖はMOL
T−3細胞に対してアポトーシスを誘発することが判明
した。実施例1、2、12及び16で得られた各フコー
ス硫酸含有多糖溶液〔5mg/mlとなるようにPBS
(8gの塩化ナトリウム、0.2gの塩化カリウム、
2.9gのリン酸水素二ナトリム12水和物、及び0.
2gのリン酸二水素カリウムを1リットルの水に溶解し
たもの)に溶解し、121℃、20分間オートクレーブ
処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測
定し、同様の結果を得た。Example 23 Human acute lymphoblastic leukemia cell MO was added to 9 ml of RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes.
LT-3 (ATCC CRL-1552) 5 x 10 5
It was suspended so that the number of particles / 9 ml. 9 ml of this suspension
5 were prepared, and each of Examples 1, 2, 12 and 1 was prepared.
1 ml of a filtered solution of a physiological saline solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in 6 (5 mg / ml) was added,
The cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 60 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. 20 μl of the obtained cells containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate.
Then, 1 μl of 10 mg / ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) was added and treated at 50 ° C. for 30 minutes, and then 1 μl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After immersing this gel in an ethidium bromide solution for 30 minutes and confirming the state of DNA in the gel using a transilluminator, a DNA ladder peculiar to apoptosis was confirmed. For confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in the same manner as the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide. Same as the case
A ladder was confirmed. From these results, Examples 1, 2, 1
The sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in 2 and 16 are MOL
It was found to induce apoptosis in T-3 cells. Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 2, 12, and 16 [PBS at 5 mg / ml]
(8 g sodium chloride, 0.2 g potassium chloride,
2.9 g of di-natrihydrogen phosphate dodecahydrate, and 0.
2 g of potassium dihydrogen phosphate dissolved in 1 liter of water) and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.
【0282】実施例24
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト急性リンパ芽球性白
血病細胞MOLT−3(ATCC CRL−1552)
をRPMI1640培地にて5×103 コ/mlとな
るように懸濁し、FALCON社製24ウェルプレート
上の各ウェルに1.8mlずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、0.5mg/mlとなるようにPBSに溶
解後ろ過滅菌した実施例1で得られたフコース硫酸含有
多糖混合物、実施例12で得られたフコース硫酸含有多
糖−F、実施例15及び17で得られたフコース硫酸含
有多糖、及びデキストラン硫酸(分子量50万、和光純
薬社製)の溶液をそれぞれ0.2mlずつ添加し、37
℃、5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てPBSのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
2日、4日、6日、8日後の生細胞数をトリパンブルー
染色法により計測した。この結果を図28に示す。すな
わち図28はMOLT−3細胞の培養液に実施例1で得
られたフコース硫酸含有多糖、実施例12で得られたフ
コース硫酸含有多糖−F、実施例15及び17で得られ
たフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を0.
5mg/mlとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時
間(日)、縦軸は培養液中の生細胞数(×104 コ/
2ml)を示す。図28中、培地に添加した硫酸化多糖
の種類は、○印が無添加(対照)、●印が実施例12で
得られたフコース硫酸含有多糖−F、□印が実施例1で
得られたフコース硫酸含有多糖、△印が実施例17で得
られたフコース硫酸含有多糖、■印が実施例15で得ら
れたフコース硫酸含有多糖であることを示す。デキスト
ラン硫酸は実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖
の場合と実質的に同じ曲線を示した。また、この時死細
胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態
を示した。すなわちこれらの結果から、MOLT−3細
胞は実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例
12で得られたフコース硫酸含有多糖−F、実施例15
及び17で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキス
トラン硫酸によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著
しく抑制されることが判明した。実施例1で得られたフ
コース硫酸含有多糖、実施例12で得られたフコース硫
酸含有多糖−F、実施例15及び17で得られたフコー
ス硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸(分子量50
万、和光純薬社製)の各溶液(0.5mg/mlとなる
ようにPBSに溶解後、121℃、20分間オートクレ
ーブ処理したもの)のアポトーシス誘発作用を上記に準
じ測定し、同様の結果を得た。Example 24 Human acute lymphoblastic leukemia cell MOLT-cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes. 3 (ATCC CRL-1552)
Was suspended in RPMI1640 medium at 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12 were dissolved in PBS at a concentration of 0.5 mg / ml and sterilized by filtration. 0.2 ml each of the solutions of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 15 and 17 and dextran sulfate (molecular weight 500,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added, and 37
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. The number of living cells was counted 2 days, 4 days, 6 days, and 8 days after the start of culture by the trypan blue staining method. The result is shown in FIG. That is, FIG. 28 shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and the sulfated-fucose-containing sulfate obtained in Examples 15 and 17 were added to the culture medium of MOLT-3 cells. Polysaccharide and dextran sulfate were added to 0.
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added at 5 mg / ml, where the horizontal axis represents the culture time (days) and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 /
2 ml) is shown. In FIG. 28, the types of the sulfated polysaccharides added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and □ indicates Example 1. It shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharides, the symbol Δ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 17, and the symbol ■ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15. Dextran sulfate showed substantially the same curve as that of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15. At this time, the dead cells showed morphology peculiar to apoptosis such as cell shrinkage and fragmentation. That is, from these results, the MOLT-3 cells showed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and Example 15
It was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Nos. 17 and 17 and dextran sulfate induce apoptosis and remarkably suppress cell proliferation. The sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Examples 15 and 17, and dextran sulfate (molecular weight 50
According to the above results, the apoptosis-inducing effect of each solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (dissolved in PBS at 0.5 mg / ml and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes) was measured according to the above. Got
【0283】実施例25
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60(ATCC CCL−240)をASF10
4培地(味の素社製)にて5×104 個/900μl
となるように懸濁した。この懸濁液900μlを9つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、生理食塩水、及び実施
例1で得たフコース硫酸含有多糖標品、F−Fd−1〜
F−Fd−4、及び実施例13で得られた3種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液(10mg/m
l)フィルター処理液を100μl添加し、37℃、5
%二酸化炭素存在下で40時間培養した。培養した細胞
を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果、フコース硫酸含有多糖標品、F−Fd−
1〜F−Fd−4及び3種のフコース硫酸含有オリゴ糖
を添加したHL−60細胞はすべて細胞縮小及び細胞断
片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩
水を添加したHL−60細胞は細胞数が約4倍に増加し
たが、フコース硫酸含有多糖標品、F−Fd−1〜F−
Fd−4及び3種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加し
たHL−60細胞は細胞数が全く増加しないものから1
0分の1以下になるものまでが見られ、これらフコース
硫酸含有多糖標品、F−Fd−1〜F−Fd−4及び3
種のフコース硫酸含有オリゴ糖のアポトーシス誘発作用
によりHL−60細胞の増殖が抑えられることが判明し
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンDの10μg/ml溶液
を上記のフコース硫酸含有オリゴ糖の代りに用いて同様
に操作したところ、培養20時間で、フコース硫酸含有
オリゴ糖の場合と同じように、細胞の縮小及び細胞断片
化がみられた。この結果より、HL−60細胞は実施例
1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、F−Fd−1
〜F−Fd−及び実施例13で得られたフコース硫酸含
有オリゴ糖によりアポトーシスを誘発されることが明ら
かとなった。実施例1で得たフコース硫酸含有多糖標
品、F−Fd−1〜F−Fd−4及び実施例13で得ら
れた3種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各溶液〔10m
g/mlとなるように120mMの塩化ナトリウムを含
む30mMヘペス緩衝液(pH7)に溶解し、121
℃、20分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 25 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 4 cells / 900 μl in 4 medium (Ajinomoto Co.)
It was suspended so that Nine 900 μl of this suspension were prepared. For each suspension, physiological saline, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, F-Fd-1 to
Each physiological saline solution of F-Fd-4 and the three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 (10 mg / m 2
l) Add 100 μl of filter treatment solution,
Culture was performed for 40 hours in the presence of% carbon dioxide. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation, F-Fd-
HL-60 cells to which 1 to F-Fd-4 and three kinds of sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added all exhibited apoptotic characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of cells in the HL-60 cells to which physiological saline was added increased about 4-fold, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparations F-Fd-1 to F-
HL-60 cells to which Fd-4 and three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added showed no increase in cell number from 1 to 1.
It was observed that some of them were reduced to less than 1/0, and these sulfated-fucose-containing polysaccharide preparations, F-Fd-1 to F-Fd-4 and 3 were prepared.
It was revealed that the proliferation of HL-60 cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of the oligosaccharides containing sulfated fucose. Further, for confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in place of the above-mentioned sulfated-fucose-containing oligosaccharide, and the same procedure was performed. Similar to the case of sugar, cell shrinkage and cell fragmentation were observed. From this result, HL-60 cells were obtained from Example 1, F-Fd-1, a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation.
~ F-Fd- and the sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 were found to induce apoptosis. Each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, F-Fd-1 to F-Fd-4, and the three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 [10 m
It was dissolved in 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride so that the concentration of g / ml was 121.
The autoclave-treated product at 20 ° C. for 20 minutes] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.
【0284】実施例26
肺癌細胞A−549(ATCC CCL−185)、S
V40形質転換した肺細胞WI−38VA13(ATC
C CCL−75.1)、及び肝癌細胞HepG2(A
TCC HB−8065)をそれぞれ104 個/1.
8mlとなるよう、56℃、30分間処理した牛胎児血
清(JRHバイオサイエンス社)を10%含むRPMI
1640培地に懸濁した。この懸濁液を1.8mlずつ
分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食
塩水、及び実施例1及び15で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例14で得られた6種のフコース硫酸
含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液(1mg/ml)のフ
ィルター処理液を200μl添加し、37℃、5%二酸
化炭素存在下で6日間培養した。培養した細胞を顕微鏡
で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。この結
果実施例1及び15で得られたフコース硫酸含有多糖、
及び実施例14で得られた6種のフコース硫酸含有オリ
ゴ糖のうち分子量2000以上の3画分を添加した肺癌
細胞A−549、SV40形質転換した肺細胞WI−3
8VA13、及び肝癌細胞Hep G2はすべて細胞縮
小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。ま
た、生理食塩水を添加した各癌細胞は著しく細胞数が増
加したが、実施例1及び15で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例14で得られた6種のフコース硫酸
含有オリゴ糖のうち分子量2000以上の3画分を添加
した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫
酸含有多糖及びオリゴ糖のアポトーシス誘発作用により
各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明した。実施例
1及び15で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施
例14で得られた6種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各
PBS溶液(1mg/ml)の121℃、20分間オー
トクレーブ処理物のアポトーシス誘発作用を上記に準じ
測定し、同様の結果を得た。Example 26 Lung cancer cells A-549 (ATCC CCL-185), S
V40 transformed lung cells WI-38VA13 (ATC
C CCL-75.1), and liver cancer cell HepG2 (A
TCC HB-8065) 10 4 each / 1.
RPMI containing 10% fetal bovine serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes to make 8 ml.
Suspended in 1640 medium. This suspension was dispensed in 1.8 ml aliquots, and to each suspension, a physiological saline solution was prepared for each cancer cell, and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and Example 14. 200 μl of a filter-treated solution of each physiological saline solution (1 mg / ml) of the 6 types of oligosaccharides containing sulfated fucose thus obtained was added and cultured at 37 ° C. for 6 days in the presence of 5% carbon dioxide. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15,
And lung cancer cells A-549 and SV40-transformed lung cells WI-3 obtained by adding 3 fractions having a molecular weight of 2000 or more among the 6 types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14.
8VA13 and hepatoma cells Hep G2 all exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of each cancer cell to which physiological saline was added remarkably increased, the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and the 6 types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14 It was found that among the various cancer cells to which the three fractions having a molecular weight of 2000 or more were added, the number of cells decreased, and the proliferation of various cancer cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides. Apoptosis of autoclaved products of each PBS solution (1 mg / ml) of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and the 6 kinds of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14 at 121 ° C for 20 minutes. The induction effect was measured according to the above, and the same result was obtained.
【0285】実施例27
結腸癌細胞HCT 116(ATCC CCL−24
7)、及び胃癌細胞AGS(ATCC CRL−173
9)をそれぞれ104 個/1.8mlとなるよう、5
6℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサイ
エンス社)を10%含むMcCoy' s5a培地(ギブ
コ社製)、Ham' s F12培地(ギブコ社製)にそ
れぞれ懸濁した。この懸濁液を1.8mlずつ分注し、
それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及
び実施例1、12、及び15で得られたフコース硫酸含
有多糖及びF−Fd−1〜F−Fd−4の4種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液(10mg/m
l)のフィルター処理液を200μl添加し、37℃、
5%二酸化炭素存在下で48時間培養した。培養した細
胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果実施例1、12、及び15で得られたフコ
ース硫酸含有多糖及びF−Fd−1〜F−Fd−4の4
種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した結腸癌細胞H
CT 116及び胃癌細胞AGSはすべて細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生
理食塩水を添加した各種癌細胞は著しく細胞数が増加し
たが、実施例1、12、及び15で得られたフコース硫
酸含有多糖及びF−Fd−1〜F−Fd−4の4種のフ
コース硫酸含有オリゴ糖を添加した各種癌細胞は細胞数
が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖
のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑え
られることが判明した。実施例1、12、及び15で得
られたフコース硫酸含有多糖及びF−Fd−1〜F−F
d−4の4種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各PBS溶
液(10mg/ml)の121℃、20分間オートクレ
ーブ処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定
し、同様の結果を得た。Example 27 Colon Cancer Cells HCT 116 (ATCC CCL-24
7), and gastric cancer cell AGS (ATCC CRL-173)
5) so that each of 9) becomes 10 4 pieces / 1.8 ml.
The cells were suspended in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) and Ham's F12 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 6 ° C for 30 minutes. Dispense 1.8 ml each of this suspension,
For each suspension, physiological saline, and four types of sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12, and 15 were prepared for each cancer cell. Each physiological saline solution of oligosaccharides containing sulfated fucose (10 mg / m
200 μl of the filter treatment solution of 1) was added,
The cells were cultured in the presence of 5% carbon dioxide for 48 hours. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, 4 of the sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12 and 15 were obtained.
Colon cancer cells H to which seeded sulfated-fucose-containing oligosaccharides have been added
CT 116 and gastric cancer cells AGS all exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of various cancer cells to which physiological saline was added remarkably increased, the sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12, and 15 It was clarified that the number of various cancer cells to which the sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added decreased, and the proliferation of various cancer cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides. The sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15 and F-Fd-1 to FF.
Similar results were obtained by measuring the apoptosis-inducing action of each of the PBS solutions (10 mg / ml) of 4 types of d-4 sulfated-fucose-containing oligosaccharides at 121 ° C. for 20 minutes in the same manner as described above.
【0286】実施例28
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むMcCoy’s5a培地(ギ
ブコ社製)にて37℃で培養したヒト結腸癌細胞HCT
116をMcCoy’s5a培地にて5×103 コ
/mlとなるように懸濁し、FALCON社製24ウェ
ルプレート上の各ウェルに1.8mlずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、PBSに溶解させた10mg/
mlの実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、
フコース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得られたフ
コース硫酸含有多糖−F、フコース硫酸含有多糖−U、
F−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及びF−
Fd−4、実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖
の各溶液、及びPBSに溶解させた5mg/mlのヘパ
リン(和光純薬社製)及びデキストラン硫酸(分子量5
0万、和光純薬社製)を121℃、20分間オートクレ
ーブ処理したものを0.2ml添加し、37℃、5%二
酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてPBSの
みを同量添加し、同様に培養した。培養開始1日、2
日、3日、4日後の生細胞数を「組織培養の技術」(第
2版)(朝倉出版、日本組織培養学会編、1990
年))記載の方法(第26〜28頁)に従って計測し
た。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色によ
る方法で計測した。Example 28 Human colon cancer cells HCT cultured at 37 ° C. in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes
116 was suspended in McCoy's 5a medium at 5 × 10 3 co / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. 10 mg / PBS dissolved in each suspension
ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1,
Sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, sulfated-fucose-containing polysaccharide-U,
F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-
Fd-4, each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 5 mg / ml heparin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in PBS and dextran sulfate (molecular weight 5)
0.2 ml of what was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes was added to 0.2 million and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. Start of culture 1 day, 2
The number of viable cells after 3, 3 and 4 days was calculated as “Tissue culture technology” (2nd edition) (edited by Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990).
(Year)) and the method (pages 26 to 28) described. That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.
【0287】得られた結果を図29に示す。すなわち図
29はHCT 116細胞の培養液に実施例1で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品、実施例1で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−U及びフコース硫酸含有多糖−F、F
−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及びF−F
d−4、実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖を
1mg/ml、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を
0.5mg/mlとなるように添加したときの培養時間
と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培
養時間(日)、縦軸は培養液中の生細胞数(×104
コ/2ml)を示す。図29中、培地に添加したフコー
ス硫酸含有多糖あるいはオリゴ糖の種類は、○印が無添
加(対照)、●印が実施例1で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、■印が実施例1で得られたフコース硫酸含
有多糖混合物である。実施例12で得られたフコース硫
酸含有多糖−U及びフコース硫酸含有多糖−F、F−F
d−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及びF−Fd−
4、及び実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖は
実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物の場合
と実質的に同じ曲線を示した。またヘパリン及びデキス
トラン硫酸は実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の場合と実質的に同じ曲線を示した。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 29 shows that in the culture solution of HCT 116 cells, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 12- U and sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F
-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-F
d-4, 1 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 1 mg / ml of heparin and dextran sulfate were added to the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added to 0.5 mg / ml. It is a figure showing a relationship, a horizontal axis shows a culture time (day), and a vertical axis shows the number of viable cells in a culture solution (× 10 4).
(Co / 2 ml). In FIG. 29, types of the sulfated-fucose-containing polysaccharides or oligosaccharides added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, and ■ indicates an example. It is the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in 1. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and FF obtained in Example 12
d-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-
4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 showed substantially the same curve as that of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1. In addition, heparin and dextran sulfate showed substantially the same curves as in the case of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1.
【0288】この結果PBSを添加したHCT 116
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例1で得られた
フコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例12で得られたフコース硫酸含有多糖−F、
フコース硫酸含有多糖−U、F−Fd−1、F−Fd−
2、F−Fd−3、及びF−Fd−4、実施例15で得
られたフコース硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキスト
ラン硫酸を添加したHCT 116細胞は細胞数がほと
んど増加しないか、あるいは減少した。As a result, HCT 116 containing PBS was added.
Although the number of cells increased remarkably, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, the mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12,
Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-
2, F-Fd-3, and F-Fd-4, HCT 116 cells supplemented with the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin, and dextran sulfate had little or no increase in cell number. .
【0289】また、実施例1で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例12
で得られたフコース硫酸含有多糖−F、フコース硫酸含
有多糖−U、F−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−
3、及びF−Fd−4、実施例15で得られたフコース
硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸を添加
したHCT 116細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片
化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、これら
のフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖、ヘパリン、及び
デキストラン硫酸のアポトーシス誘発作用によりHCT
116細胞の増殖が抑制されることが判明した。PB
Sに溶解させた10mg/mlの実施例1で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例12で得られたフコース硫酸含有多糖−F、
フコース硫酸含有多糖−U、F−Fd−1、F−Fd−
2、F−Fd−3、及びF−Fd−4、実施例15で得
られたフコース硫酸含有多糖の各溶液のフィルター処理
液、及びPBSに溶解させた5mg/mlのヘパリン、
及びデキストラン硫酸の各フィルター処理液のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。The sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, Example 12
Sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-
3 and F-Fd-4, HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin, and dextran sulfate were added all exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, HCT is caused by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides, heparin, and dextran sulfate.
It was found that the proliferation of 116 cells was suppressed. PB
10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, dissolved in S.
Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-
2, F-Fd-3, and F-Fd-4, a filtered solution of each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 5 mg / ml heparin dissolved in PBS,
The apoptosis-inducing action of each filter treatment solution of dextran sulfate and dextran sulfate was measured according to the above, and similar results were obtained.
【0290】実施例29
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むMcCoy’s5a培地(ギ
ブコ社製)にて37℃で培養したヒト結腸癌細胞HCT
116をMcCoy’s5a培地にて5×103 コ
/mlとなるように懸濁し、FALCON社製24ウェ
ルプレート上の各ウェルに1.8mlずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、PBSに溶解させた20mg/
ml、30mg/ml、及び50mg/mlの実施例1
で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を121
℃、20分間オートクレーブ処理したものを0.2ml
添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で培養した。な
お、対照としてPBSのみを同量添加し、同様に培養し
た。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」
(第2版)(朝倉出版、日本組織培養学会編、1990
年)記載の方法(第26〜28頁)に従って計測した。
すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方
法で計測した。Example 29 Human colon cancer cell HCT cultured at 37 ° C. in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes
116 was suspended in McCoy's 5a medium at 5 × 10 3 co / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. 20 mg / PBS dissolved in each suspension
ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml of Example 1
The solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in
0.2 ml autoclaved at ℃ for 20 minutes
The mixture was added and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. "Tissue culture technology" to change the number of viable cells over time after the start of culture
(2nd edition) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990)
Year) Measured according to the method described (pages 26 to 28).
That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.
【0291】得られた結果を図30に示す。すなわち図
30はHCT 116細胞の培養液に実施例1で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したと
きの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であ
り、横軸は培養時間(時間)、縦軸は培養液中の生細胞
数(×104 コ/2ml)を示す。図30中、培地へ
のフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
(対照)、●印が2mg/ml、■印が3mg/ml、
黒三角印が5mg/mlである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 30 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of HCT 116 cells at various concentrations. The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 cells / 2 ml). In FIG. 30, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates 2 mg / ml, ■ indicates 3 mg / ml,
The black triangle mark is 5 mg / ml.
【0292】この結果PBSを添加したHCT 116
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例1で得られた
フコース硫酸含有多糖標品を添加したHCT 116細
胞は細胞数が減少した。また、実施例1で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を添加したHCT 116細胞は
すべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴
を呈した。すなわち、実施例1で得られたフコース硫酸
含有多糖標品は少なくとも2mg/mlの濃度でHCT
116細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細
胞の増殖を抑制できることが判明した。PBSに溶解さ
せた20mg/ml、30mg/ml、及び50mg/
mlの実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の
溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記
に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, HCT 116 containing PBS was added.
The number of cells increased remarkably, but the number of HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added decreased. In addition, all HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had HCT at a concentration of at least 2 mg / ml.
It was found that it has an apoptosis-inducing action on 116 cells and can suppress cell proliferation. 20 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filtered solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in Example 1 was measured according to the above, and the same result was obtained.
【0293】実施例30
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むHam’s F12培地(ギ
ブコ社製)にて37℃で培養したヒト胃癌細胞AGSを
Ham’s F12培地にて5×103 コ/mlとな
るように懸濁し、FALCON社製24ウェルプレート
上の各ウェルに1.8mlずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、PBSに溶解させた20mg/ml、30
mg/ml、及び50mg/mlの実施例1で得られた
フコース硫酸含有多糖標品の溶液を121℃、20分間
オートクレーブ処理したものを0.2ml添加し、37
℃、5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てPBSのみを同量添加し同様に培養した。培養開始後
経時的に生細胞数を「組織培養の技術」(第2版)(朝
倉出版、日本組織培養学会編、1990年)記載の方法
(第26〜28頁)に従って計測した。すなわち、血球
計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。Example 30 Human gastric cancer cell AGS cultured at 37 ° C. in Ham's F12 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes was Ham '. The cells were suspended in s F12 medium at 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 20 mg / ml, 30 dissolved in PBS
0.2 ml of a solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide standard solution obtained in Example 1 (mg / ml and 50 mg / ml) was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, and added to 37
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. After the start of culturing, the number of viable cells was counted over time according to the method (pages 26 to 28) described in "Technology of Tissue Culture" (Second Edition) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.
【0294】得られた結果を図31に示す。すなわち図
31はAGS細胞の培養液に実施例1で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養
時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸
は培養時間(時間)、縦軸は培養液中の生細胞数(×1
04 コ/2ml)を示す。図31中、培地へのフコー
ス硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加(対
照)、●印が2mg/ml、■印が3mg/ml、黒三
角印が5mg/mlである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 31 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of AGS cells at various concentrations. The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 1).
0 shows the 4 co / 2 ml). In FIG. 31, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is 0 for no addition (control), ● for 2 mg / ml, ■ for 3 mg / ml, and black triangle for 5 mg / ml. .
【0295】この結果PBSを添加したAGS細胞は著
しく細胞数が増加したが、実施例1で得られたフコース
硫酸含有多糖標品を終濃度で3mg/ml以上添加した
AGS細胞は細胞数が減少し、2mg/mlを添加した
ものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施例1
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したAGS
細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシス
の特徴を呈した。すなわち、実施例1で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品は少なくとも2mg/mlの濃度で
AGS細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞
の増殖を抑制できることが判明した。PBSに溶解させ
た20mg/ml、30mg/ml、及び50mg/m
lの実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶
液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に
準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of AGS cells to which PBS was added remarkably increased, but the number of AGS cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added at a final concentration of 3 mg / ml or more decreased. However, the cells to which 2 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. In addition, Example 1
AGS containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in
All cells exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had an apoptosis-inducing action on AGS cells at a concentration of at least 2 mg / ml and could suppress cell proliferation. 20 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / m dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filtered solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in Example 1 was measured according to the above, and similar results were obtained.
【0296】実施例31
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むL−15培地(ギブコ社製)
にて37℃で培養したヒト結腸癌細胞SW480(AT
CC CCL−228)をL−15培地にて5×10
3 コ/mlとなるように懸濁し、FALCON社製2
4ウェルプレート上の各ウェルに1.8mlずつ分注し
た。それぞれの懸濁液に対し、PBSに溶解させた10
mg/ml、30mg/ml、及び50mg/mlの実
施例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を1
21℃、20分間オートクレーブ処理したものを0.2
ml添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で培養し
た。なお、対照としてPBSのみを同量添加し、同様に
培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の
技術」(第2版)(朝倉出版、日本組織培養学会編、1
990年)記載の方法(第26〜28頁)に従って計測
した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色に
よる方法で計測した。Example 31 L-15 medium (manufactured by Gibco) containing 10% of fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes.
Human colon cancer cells SW480 (AT
CC CCL-228) in L-15 medium at 5 x 10
Suspend at 3 cells / ml, 2 from FALCON
1.8 ml was dispensed to each well on the 4-well plate. Each suspension was dissolved in PBS 10
1 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was prepared.
0.2 ° C after autoclaving at 21 ° C for 20 minutes
ml was added and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. "Technology of tissue culture" (2nd edition), the number of viable cells over time after the start of culture (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1
990) and the measurement (pages 26 to 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.
【0297】得られた結果を図32に示す。すなわち図
32はSW480細胞の培養液に実施例1で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの
培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、
横軸は培養時間(時間)、縦軸は培養液中の生細胞数
(×104 コ/2ml)を示す。図32中、培地への
フコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
(対照)、●印が1mg/ml、■印が3mg/ml、
黒三角印が5mg/mlである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 32 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of SW480 cells at various concentrations.
The horizontal axis represents the culture time (hour), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 cells / 2 ml). In FIG. 32, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates 1 mg / ml, ■ indicates 3 mg / ml,
The black triangle mark is 5 mg / ml.
【0298】この結果PBSを添加したSW480細胞
は著しく細胞数が増加したが、実施例1で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を終濃度で3mg/ml以上添加
したSW480細胞は細胞数が減少し、1mg/mlを
添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、
実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加し
たSW480細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等の
アポトーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例1で得
られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも1mg/
mlの濃度でSW480細胞に対してアポトーシス誘発
作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
PBSに溶解させた10mg/ml、30mg/ml、
及び50mg/mlの実施例1で得られたフコース硫酸
含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of cells of SW480 cells supplemented with PBS remarkably increased, but the number of cells of SW480 cells supplemented with the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 at a final concentration of 3 mg / ml or more decreased. However, the cells to which 1 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. Also,
All SW480 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added exhibited characteristics of apoptosis such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was at least 1 mg /
It was found that a concentration of ml has an action of inducing apoptosis on SW480 cells and can suppress cell growth.
10 mg / ml, 30 mg / ml dissolved in PBS,
And 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide standard solution obtained in Example 1 was used to measure the apoptosis-inducing action of the filter-treated solution according to the above, and similar results were obtained.
【0299】実施例32
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%及びNEAA(大日本製薬社製)
を1%含むDMEM培地(大日本製薬社製)にて37℃
で培養したヒト結腸癌細胞WiDr(ATCC CCL
−218)を上記培地にて5×103 コ/mlとなる
ように懸濁し、FALCON社製24ウェルプレート上
の各ウェルに1.8mlずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、PBSに溶解させた10mg/mlの実施例
1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例12
で得られたフコース硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及
びF−Fd−4、及び実施例15で得られたフコース硫
酸含有多糖の各溶液を121℃、20分間オートクレー
ブ処理したものを0.2ml添加し、37℃、5%二酸
化炭素存在下で培養した。なお、対照としてPBSのみ
を同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生
細胞数を「組織培養の技術」(第2版)(朝倉出版、日
本組織培養学会編、1990年)記載の方法(第26〜
28頁)に従って計測した。すなわち、血球計算板上の
トリパンブルー染色による方法で計測した。Example 32 10% of fetal bovine serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes and NEAA (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
In DMEM medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 1% of
Colon cancer cells WiDr (ATCC CCL
-218) was suspended in the above medium so as to be 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, dissolved in PBS, Example 12
Each of the solutions of the sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F-Fd-3 and F-Fd-4 obtained in 1. and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. .2 ml was added and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. The method described in "Technology of Tissue Culture" (second edition) (Asakura Publishing, edited by the Japan Tissue Culture Society, 1990), the number of viable cells over time after the start of culture (26th ~
It was measured according to page 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.
【0300】得られた結果を図33に示す。すなわち図
33はWiDr細胞の培養液に実施例1で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及びF−Fd−4及
び実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖を1mg
/mlとなるように添加したときの培養時間と培養液中
の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間(時
間)、縦軸は培養液中の生細胞数(×104 コ/2m
l)を示す。図33中、培地に添加したフコース硫酸含
有多糖の種類は、○印が無添加(対照)、■印が実施例
12で得られたフコース硫酸含有多糖−F、●印が実施
例15で得られたフコース硫酸含有多糖である。F−F
d−3及びF−Fd−4は実施例15で得られたフコー
ス硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 33 shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F-Fd-4 obtained in Example 1 was used in the culture medium of WiDr cells. 1 mg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added at a concentration of / ml, where the horizontal axis represents the culture time (hours) and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 pieces / 2m
1) is shown. In FIG. 33, types of the sulfated-fucose-containing polysaccharide added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ■ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and ● indicates the obtained in Example 15. It is a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained. FF
d-3 and F-Fd-4 showed substantially the same curves as in the case of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15.
【0301】この結果PBSを添加したWiDr細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例1で得られたフコー
ス硫酸含有多糖混合物、実施例12で得られたフコース
硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及びF−Fd−4、及
び実施例15で得られたフコース硫酸含有多糖を添加し
たWiDr細胞は細胞数が減少した。また、実施例1で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得
られたフコース硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及びF
−Fd−4、及び実施例15で得られたフコース硫酸含
有多糖を添加したWiDr細胞はすべて細胞縮小及び細
胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、
実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施
例12で得られたフコース硫酸含有多糖−F、F−Fd
−3及びF−Fd−4、及び実施例15で得られたフコ
ース硫酸含有多糖はWiDr細胞に対してアポトーシス
誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明し
た。PBSに溶解させた10mg/mlの実施例1で得
られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及びF−
Fd−4、及び実施例15で得られたフコース硫酸含有
多糖の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of WiDr cells to which PBS was added remarkably increased, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and F-Fd obtained in Example 12 were used. -3 and F-Fd-4, and the WiDr cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 was added had a decreased cell number. In addition, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F obtained in Example 12
All WiDr cells to which -Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 were added exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is,
The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharides-F and F-Fd obtained in Example 12
-3 and F-Fd-4, and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 were found to have an apoptosis-inducing action on WiDr cells and suppress cell proliferation. 10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, dissolved in PBS, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F-obtained in Example 12.
The apoptosis-inducing effect of the filter-treated solution of the solution of Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in Example 15 was measured according to the above, and similar results were obtained.
【0302】実施例33
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%及びNEAA(大日本製薬社製)
を1%含むDMEM培地(大日本製薬社製)にて37℃
で培養したヒト結腸癌細胞WiDr(ATCC CCL
−218)を上記培地にて5×103 コ/mlとなる
ように懸濁し、FALCON社製24ウェルプレート上
の各ウェルに1.8mlずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、PBSに溶解させた10mg/ml、30m
g/ml、及び50mg/mlの実施例1で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品の溶液を121℃、20分間オ
ートクレーブ処理したものを0.2ml添加し、37
℃、5%二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てPBSのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」(第2版)
(朝倉出版、日本組織培養学会編、1990年)記載の
方法(第26〜28頁)に従って計測した。すなわち、
血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測し
た。Example 33 10% of fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes and NEAA (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
In DMEM medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 1% of
Colon cancer cells WiDr (ATCC CCL
-218) was suspended in the above medium so as to be 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 10 mg / ml dissolved in PBS, 30 m
g / ml and 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, and 0.2 ml of the solution was added.
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. “Tissue culture technology” (2nd edition)
(Asakura Publishing, edited by the Japanese Society for Tissue Culture, 1990). That is,
It was measured by the method of trypan blue staining on a hemocytometer.
【0303】得られた結果を図34に示す。すなわち図
34はWiDr細胞の培養液に実施例1で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培
養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横
軸は培養時間(時間)、縦軸は培養液中の生細胞数(×
104 コ/2ml)を示す。図34中、培地へのフコ
ース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加(対
照)、●印が1mg/ml、■印が3mg/ml、黒三
角印が5mg/mlである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 34 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of WiDr cells at various concentrations, The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (×
10 4 co / 2 ml) is shown. In FIG. 34, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is 0 for no addition (control), ● for 1 mg / ml, ■ for 3 mg / ml, and black triangle for 5 mg / ml. .
【0304】この結果PBSを添加したWiDr細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例1で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を終濃度で3mg/ml以上添加し
たWiDr細胞は細胞数が減少し、1mg/mlを添加
したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施
例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したW
iDr細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポト
ーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例1で得られた
フコース硫酸含有多糖標品は少なくとも1mg/mlの
濃度でWiDr細胞に対してアポトーシス誘発作用を持
ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。PBSに
溶解させた10mg/ml、30mg/ml、及び50
mg/mlの実施例1で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of WiDr cells to which PBS was added was remarkably increased, but the number of WiDr cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added at a final concentration of 3 mg / ml or more was decreased. However, the cells to which 1 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. In addition, W to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added
All iDr cells exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had an apoptosis-inducing action on WiDr cells at a concentration of at least 1 mg / ml and could suppress cell proliferation. 10 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filter-treated solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in mg / ml was measured according to the above, and the same result was obtained.
【0305】実施例34
56℃、30分間処理した牛胎児血清(JRHバイオサ
イエンス社)を10%含むRPMI1640培地(ギブ
コ社製)にて37℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60(ATCC CCL−240)をASF10
4培地(味の素社製)にて5×104 コ/900μl
となるように懸濁し、FALCON社製6ウェルプレー
ト上の各ウェルに4.5mlずつ分注した。それぞれの
懸濁液に対し、実施例19−(6)記載のフコース硫酸
含有多糖−Fの低分子化物を凍結乾燥したものを10m
g/mlとなるように120mMの塩化ナトリウムを含
む30mMヘペス緩衝液(pH7)に溶解し、フィルタ
ーろ過処理したものを0.5ml添加し、37℃、5%
二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として上記緩
衝液のみを同量添加し、同様に培養した。培養開始22
時間後と46時間後の生細胞数を組織培養の技術(第2
版)(朝倉出版、日本組織培養学会編)記載の方法(第
26〜28頁)に従って計測した。すなわち、血球計算
板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。この
結果HL−60細胞は上記のフコース硫酸含有多糖−F
の低分子化物を凍結乾燥したものによりアポトーシスを
誘発され、細胞増殖速度が抑制されることが判明した。Example 34 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 4 cells / 900 μl in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co.)
The suspension was added to each well of the FALCON 6-well plate in an amount of 4.5 ml. 10 m of each suspension obtained by freeze-drying the low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 19- (6) was used.
It was dissolved in 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride so that the concentration would be g / ml, and 0.5 ml of the solution which had been subjected to filter filtration was added, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5%.
Cultured in the presence of carbon dioxide. As a control, the same amount of the above buffer solution was added and the cells were cultured in the same manner. Start culture 22
The number of viable cells after 2 hours and 46 hours was measured by the technique of tissue culture (second
Ed.) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society), method (pages 26 to 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer. As a result, the HL-60 cells showed the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
It was found that freeze-dried low molecular weight product of erythrocyte induced apoptosis and suppressed the cell growth rate.
【0306】実施例35
ヒト前骨髄性白血病細胞HL−60を、56℃、30分
間処理した牛胎児血清(JRHバイオサイエンス社製)
を10%含むRPMI1640培地(ギブコ社製)に5
×104 個/900μlとなるように懸濁した。この
懸濁液を6つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、120
mMの塩化ナトリウムを含む30mMのヘペス緩衝液
(pH7)及び同緩衝液に10mg/mlで溶解させた
実施例19−(2)記載のフコース硫酸含有多糖−F、
F−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及びF−
Fd−4のフィルター処理液をそれぞれ100μl添加
し、37℃、5%二酸化炭素存在下で46時間培養し
た。培養開始後22時間及び46時間に培養液中の生細
胞数を測定した。また、ヒト前骨髄性白血病細胞HL−
60を、ASF104培地(味の素社製)に5×104
個/900μlとなるように懸濁した。この懸濁液を
6つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、120mMの塩
化ナトリウムを含む30mMのヘペス緩衝液(pH7)
及び同緩衝液に10mg/mlで溶解させたフコース硫
酸含有多糖−F、F−Fd−1、F−Fd−2、F−F
d−3、及びF−Fd−4のフィルター処理液をそれぞ
れ100μl添加し、37℃、5%二酸化炭素存在下で
40時間培養した。培養開始後16時間及び40時間に
培養液中の生細胞数を測定した。また、上記2種類の培
養を行った細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞
の形態を調べた。この結果、ASF104培地で培養し
た細胞においては、フコース硫酸含有多糖−F、F−F
d−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及びF−Fd−
4を添加した細胞が総て細胞縮小及び細胞断片化等のア
ポトーシスの特徴を呈し、生細胞数はほとんど増加がみ
られなかったかあるいはほぼ完全に死滅していた。緩衝
液のみ添加した培地において細胞数は約3倍に増加して
いた。一方、RPMI1640培地で培養した細胞にお
いてはF−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及
びF−Fd−4を添加した細胞のみが総て細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈し、細胞はほと
んど死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細
胞数は約3倍に増加し、フコース硫酸含有多糖−Fを添
加した培地において細胞数は約2.5倍に増加してい
た。以上の結果から、フコース硫酸含有多糖−Fは無血
清培地で癌細胞に対して強いアポトーシス誘発作用を持
つが、F−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−3、及
びF−Fd−4は、無血清培地でも血清培地でも非常に
強いアポトーシス誘発作用を持つことが判明した。Example 35 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 were treated at 56 ° C. for 30 minutes with fetal bovine serum (JRH Bioscience).
5% in RPMI1640 medium containing 10% (manufactured by Gibco)
× was suspended in a 10 4/900 [mu] l. Prepare 6 of these suspensions, each for 120
30 mM Hepes buffer solution (pH 7) containing mM sodium chloride, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 19- (2) dissolved in the same buffer solution at 10 mg / ml.
F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-
100 μl of each Fd-4 filter solution was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 46 hours. The number of viable cells in the culture solution was measured 22 hours and 46 hours after the start of the culture. In addition, human promyelocytic leukemia cells HL-
5 was added to ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co.) at 5 × 10 4.
It was suspended so that the number of cells / 900 μl. Six suspensions were prepared, and 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride was prepared for each suspension.
And sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-1, F-Fd-2, FF dissolved in the same buffer at 10 mg / ml
100 μl of each of the filter treatment solutions of d-3 and F-Fd-4 was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 40 hours. The number of viable cells in the culture medium was measured 16 hours and 40 hours after the start of the culture. In addition, the cells subjected to the above-mentioned two types of culture were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and the cell morphology. As a result, in cells cultured in ASF104 medium, sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, FF
d-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-
All cells to which 4 was added exhibited apoptotic characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation, and the number of viable cells was hardly increased or almost completely died. The number of cells increased about 3-fold in the medium containing only the buffer solution. On the other hand, in the cells cultured in the RPMI1640 medium, only the cells to which F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-4 were added all showed cell shrinkage and cell fragmentation. It exhibited the characteristics of apoptosis and the cells were almost dead. The number of cells increased about 3-fold in the medium containing only the buffer solution, and the number of cells increased about 2.5-fold in the medium containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. From the above results, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F has a strong apoptosis-inducing action on cancer cells in a serum-free medium, but F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F- Fd-4 was found to have a very strong apoptosis-inducing action in both serum-free medium and serum medium.
【0307】更に確認のため、ヒト前骨髄性白血病細胞
HL−60を、56℃、30分間処理した牛胎児血清
(JRHバイオサイエンス社製)を10%含むRPMI
1640培地(ギブコ社製)に5×104 個/900
μlとなるように懸濁した。この懸濁液9mlを2本用
意し、それぞれに、120mMの塩化ナトリウムを含む
30mMのヘペス緩衝液(pH7)及び同緩衝液に10
mg/mlで溶解させたF−Fd−4のフィルター処理
液をそれぞれ1ml添加し、37℃、5%二酸化炭素存
在下で16時間培養した。 培養した細胞を遠心分離に
より上清と分離した。 得られた細胞を10mMのエチ
レンジアミンテトラアセテート及び0.5%のナトリウ
ムラウロイルサルコシネートを含む50mMのトリス塩
酸緩衝液(pH7.8)20μlにて懸濁し、10mg
/mlリボヌクレアーゼA(シグマ社製)を1μl添加
して50℃、30分間処理した後、10mg/mlのプ
ロテイネースKを1μl添加して50℃、30分間処理
した。 処理後の細胞をサンプルとして、2%のアガロ
ースゲルを用いて100Vの定電圧の下で電気泳動を行
った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に30分間浸
した後、トランスイルミネーターを用いてゲル中のDN
Aの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のDN
Aラダーが確認された。 さらに確認のためアポトーシ
スを誘発する試薬として知られているアクチノマイシン
Dを上記のF−Fd−4の代わりに用いて同様に操作し
たところ、F−Fd−4の場合と同じDNAラダーが確
認できた。すなわち、本発明のエンド型フコース硫酸含
有多糖−F分解酵素によりフコース硫酸含有多糖−Fを
分解するとがん細胞に対するアポトーシス誘発作用が強
くなることが判明した。For further confirmation, RPMI containing human promyelocytic leukemia cells HL-60 treated with 56% of fetal bovine serum (JRH Bioscience) at 30% for 30 minutes.
5 × 10 4 cells / 900 in 1640 medium (manufactured by Gibco)
The cells were suspended so that the volume became μl. Two 9 ml suspensions were prepared, each containing 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride and 10 ml of the same buffer.
1 ml each of F-Fd-4 filtered solution dissolved at mg / ml was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 16 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were suspended in 20 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate, and 10 mg
/ Ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) was added at 1 µl and treated at 50 ° C for 30 minutes, and then 1 µl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C for 30 minutes. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After soaking this gel in the ethidium bromide solution for 30 minutes, the DN in the gel was analyzed using a transilluminator.
When the condition of A was confirmed, DN unique to apoptosis was confirmed.
A ladder was confirmed. Furthermore, when actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in place of F-Fd-4 for confirmation, the same DNA ladder as in the case of F-Fd-4 was confirmed. It was That is, it was revealed that when the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention degrades the sulfate-fucose-containing polysaccharide-F, the apoptosis-inducing action on cancer cells becomes stronger.
【0308】実施例36
21才女性及び32才男性の健常人静脈血を採血し、1
リットル当りグルコースを100mg、CaCl2 ・
2H2 Oを0.74mg、MgCl2 を19.92m
g、KClを40.26mg、NaClを7371m
g、トリス−塩酸を1756.5mgを含む液で2倍希
釈後、リンパ球分離溶液(大日本製薬販売)をあらかじ
め希釈血液の2倍容量を入れた遠心分離管の中に静かに
重層し、18〜20℃、400gで30分間遠心分離し
た。遠心後、リンパ球分離溶液の上層のリンパ球画分を
集めた。こうして得られた健常リンパ球を1.9×10
5 個ずつ24ウェルのプレートに添加し、1.8ml
の10%牛胎児血清(56℃、30分処理後のもの)を
含むRPMI−1640培地に0.2mlの5mg/m
lの上記各実施例で得られたフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物を1種類ずつ加えた培地を加え37℃で培養し
た。コントロールとしてはフコース硫酸含有多糖溶液の
代りに生理食塩水を添加した。培養開始後、顕微鏡で各
ウェルの細胞の形態変化及び生細胞数を測定した。この
結果、各種フコース硫酸含有多糖、その分解物を加えた
ウェルもコントロールのウェルも細胞形態に差がなく、
また生細胞数の差もほとんど無く、13日目にはどちら
の細胞もほとんど死滅した。この結果より、フコース硫
酸含有多糖、その分解物は癌細胞に対して強くアポトー
シスを誘発させる濃度においても健常細胞に毒性を示さ
ないことが判明した。Example 36 Venous blood was collected from healthy humans of 21-year-old female and 32-year-old male, and 1
100 mg glucose per liter, CaCl 2 ·
0.74 mg of 2H 2 O and 19.92 m of MgCl 2
g, KCl 40.26mg, NaCl 7371m
g, tris-hydrochloric acid was diluted 2-fold with a solution containing 1756.5 mg, and then a lymphocyte separation solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was gently overlaid in a centrifuge tube containing twice the volume of diluted blood. It centrifuged at 18-20 degreeC and 400 g for 30 minutes. After centrifugation, the lymphocyte fraction in the upper layer of the lymphocyte separation solution was collected. The healthy lymphocytes thus obtained were 1.9 × 10
Add 5 each to a 24-well plate and add 1.8 ml
0.2 ml of 5 mg / m in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (after treatment at 56 ° C. for 30 minutes).
1 of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in each of the above-mentioned examples and degradation products thereof were added to each medium, and the mixture was cultured at 37 ° C. As a control, physiological saline was added instead of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution. After the start of the culture, the morphological changes of the cells in each well and the number of viable cells were measured with a microscope. As a result, there was no difference in the cell morphology between the wells containing various sulfated-fucose-containing polysaccharides and their degradation products and the control wells,
Also, there was almost no difference in the number of viable cells, and on day 13, both cells were almost dead. From this result, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide and its degradation product did not show toxicity to healthy cells even at a concentration that strongly induces apoptosis in cancer cells.
【0309】実施例37
フコース硫酸含有多糖−Uの固形がんに対する制がん作
用マウス固形がんMethA(4×106cells/
マウス)を8週齢の雌性BALB/cマウス(体重約2
0g)の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ
箇所に10日間実施例6記載のフコース硫酸含有多糖−
U(100mg/kg/day)を皮下注射した。一方
コントロール群には生理的食塩水を同様に皮下注射し
た。2週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出
して、その重量を測定した。結果を表2に示す。すなわ
ち、コントロール群では平均癌重量は1.25gであっ
たのに対し、フコース硫酸含有多糖−U投与群では0.
28gであり、有意(コントロール群に対しp<0.0
1)な制がん作用を示した。抑制率は77.6%であっ
た。Example 37 Carcinostatic effect of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U on solid cancer Mouse solid cancer MethA (4 × 10 6 cells /
Eight week old female BALB / c mice (body weight approximately 2
0 g) was subcutaneously injected into the abdomen. Then, subsequently, at the same location for 10 days, the sulfated-fucose-containing polysaccharide described in Example 6 was used.
U (100 mg / kg / day) was injected subcutaneously. On the other hand, the control group was similarly subcutaneously injected with physiological saline. Two weeks later, the cancer tissue formed in the abdomen of the mouse was excised and its weight was measured. The results are shown in Table 2. That is, the average cancer weight was 1.25 g in the control group, whereas the mean cancer weight was 0.1% in the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U administration group.
28 g, significant (p <0.0 vs control group)
1) It showed an anti-cancer effect. The inhibition rate was 77.6%.
【0310】[0310]
【表2】 [Table 2]
【0311】実施例38
フコース硫酸含有多糖の発がん予防作用
(1)6週令のSpragure−Dawleyラット
(雄)19匹に、7.4mg/kgのアゾキシメタン
(ナカライテスク社製)を背部皮下投与し、以降1週間
に1回、10週目まで背部皮下投与した。なお投与時
は、アゾキシメタンを0.9%の塩化ナトリウムを含む
pH6.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、毎回10
0μlとなるように溶液の濃度を調整した。上記19匹
中5匹に対しては最初のアゾキシメタン投与と同時に連
日、実施例1の記載に準じ調製した、ガゴメ昆布熱水抽
出液70mlを30週目まで飲料水として経口投与し
た。この熱水抽出液は2mg/mlのフコース硫酸含有
多糖混合物を含有し、140mg/kgのフコース硫酸
含有多糖混合物が連日経口投与された。なお上記19匹
中14匹に対してはフコース硫酸含有多糖は投与せず、
水道水を飲料水として与え、対照群とした。30週目ま
でに対照群の外耳巣がん発生が14匹中14匹見られた
のに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は5匹中
1匹であり、顕著な発がん抑制作用が認められた。なお
30週目までに対照群は3匹死亡したが、フコース硫酸
含有多糖混合物投与群は全匹生存した。また30週目の
対照群の平均体重が716gであるのに対し、フコース
硫酸含有多糖混合物投与群の平均体重は817gであっ
た。一方アゾキシメタン非投与のラット群(5匹)の平
均体重は788gであり、フコース硫酸含有多糖混合物
投与群の体重増加はアゾキシメタン非投与のラット群と
同等であった。次に、対照群の4匹を選抜し、30週目
より連日、上記ガゴメ昆布熱水抽出液40ml(フコー
ス硫酸含有多糖混合物80mg)を飲料水として経口投
与した。36週目において、4匹中2匹の外耳巣がんが
顕著に退縮し、フコース硫酸含有多糖の制がん作用が認
めらた。以上フコース硫酸含有多糖の経口投与により、
化学発がん剤による発がん予防作用、化学発がん剤によ
る体重増加抑制の防止作用、更にはがん組織の退縮が認
められた。Example 38 Carcinogenic Preventive Action of Polysaccharide Containing Sulfate Fucose (1) 19 mg of 6-week-old Sprague-Dawley rats (male) were subcutaneously administered with 7.4 mg / kg of azoxymethane (manufactured by Nacalai Tesque) on the back After that, subcutaneous administration was performed once a week until the 10th week on the back. At the time of administration, azoxymethane was dissolved in a 0.1 M phosphate buffer solution containing 0.9% sodium chloride and having a pH of 6.5, and 10 times each time.
The concentration of the solution was adjusted to be 0 μl. To 5 of the 19 animals, 70 ml of the hot water extract of Gagome kelp prepared according to the description of Example 1 was orally administered as drinking water until the 30th week on consecutive days simultaneously with the first administration of azoxymethane. This hot water extract contained 2 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, and 140 mg / kg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was orally administered every day. Incidentally, 14 of the 19 animals were not administered with the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
Tap water was given as drinking water to serve as a control group. By the 30th week, 14 out of 14 outbreaks of external ear tumors were observed in the control group, whereas 1 out of 5 animals in the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group had a remarkable carcinogenic inhibitory effect. . By the 30th week, 3 animals in the control group had died, while all animals in the group administered with the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture survived. Further, the average body weight of the control group at 30 weeks was 716 g, whereas the average body weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group was 817 g. On the other hand, the average body weight of the azoxymethane non-administered rat group (5 animals) was 788 g, and the weight gain of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group was similar to that of the azoxymethane non-administered rat group. Next, 4 animals in the control group were selected, and 40 days after the 30th week, 40 ml of the hot water extract of Gagome kelp (80 mg of a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides) was orally administered as drinking water. At 36 weeks, 2 out of 4 cancers of the external ear lobes significantly regressed, and the carcinostatic action of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was observed. By oral administration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
The carcinogenic preventive effect of the chemical carcinogen, the preventive effect of the weight increase suppression by the chemical carcinogen, and the regression of the cancer tissue were observed.
【0312】実施例39 注射剤
実施例1で製造したフコース硫酸含有多糖混合物を注射
用蒸留水に溶解し5%溶液とした。この溶液を凍結乾燥
用バイアル瓶1バイアル中に、フコース硫酸含有多糖と
して50mg充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液
として生理食塩水2mlを添加した。Example 39 Injectable Solution The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture prepared in Example 1 was dissolved in distilled water for injection to give a 5% solution. One vial for freeze-drying was filled with 50 mg of this solution as a sulfated-fucose-containing polysaccharide, and freeze-dried. Separately, 2 ml of physiological saline was added as a solution.
【0313】実施例40 注射剤
下記処方に従い注射剤を調製した。
フコース硫酸含有多糖−U[実施例12] 40mg
生理食塩水 適量
1アンプル当り 2ml
同様に実施例12記載のフコース硫酸含有多糖−Fを使
用し注射剤を調製した。Example 40 Injection Preparation An injection preparation was prepared according to the following formulation. Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U [Example 12] 40 mg Physiological saline 2 ml per ampoule Similarly, an injection was prepared using the sulfate-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 12.
【0314】実施例41 錠剤下記処方に従い錠剤を調
製した。
フコース硫酸含有多糖標品(実施例1) 10mg
コーンスターチ 65mg
カルボキシメチルセルロース 20mg
ポリビニルピロリドン 3mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
1錠当り 100mgExample 41 Tablet A tablet was prepared according to the following formulation. Sulfate-fucose-containing polysaccharide preparation (Example 1) 10 mg Corn starch 65 mg Carboxymethyl cellulose 20 mg Polyvinylpyrrolidone 3 mg Magnesium stearate 2 mg 100 mg per tablet
【0315】実施例42 注射剤
F−Fd−1を注射用蒸留水に溶解し5%溶液とした。
この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶1バイアル中に、フコ
ース硫酸含有多糖として50mg充てんし、凍結乾燥を
行った。別に溶解液として生理食塩水2mlを添加し
た。Example 42 Injection F-Fd-1 was dissolved in distilled water for injection to give a 5% solution.
One vial for freeze-drying was filled with 50 mg of this solution as a sulfated-fucose-containing polysaccharide, and freeze-dried. Separately, 2 ml of physiological saline was added as a solution.
【0316】実施例43 注射剤 下記処方に従い注射剤を調製した。 実施例19−(6)で得られたフコース硫酸含有多糖−F の低分子化物の凍結乾燥物 40mg 生理食塩水 適量 1アンプル当り 2mlExample 43 Injection Preparation An injection preparation was prepared according to the following formulation. Freeze-dried product of low molecular weight product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 19- (6) 40 mg physiological saline 2 mg per ampoule
【0317】実施例44 錠剤 下記処方に従い錠剤を調製した。 実施例19−(6)で得られたフコース硫酸含有多糖−F の低分子化物の凍結乾燥物 10mg コーンスターチ 65mg カルボキシメチルセルロース 20mg ポリビニルピロリドン 3mg ステアリン酸マグネシウム 2mg 1錠当り 100mgExample 44 Tablet A tablet was prepared according to the following formulation. Freeze-dried product of low molecular weight product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 19- (6) 10 mg Corn starch 65 mg Carboxymethyl cellulose 20 mg Polyvinylpyrrolidone 3 mg Magnesium stearate 2 mg 100 mg per tablet
【0318】[0318]
【発明の効果】本発明により不要若しくは病原細胞に対
してアポトーシス誘発作用を有し、がん等の異常増殖細
胞疾患や、ウイルス性疾患において、病変細胞にアポト
ーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な薬剤が
提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のが
んの場合、本発明の薬剤を経口投与することによりがん
細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、天
然食品由来のフコース硫酸含有多糖及び/又はその分解
物を有効成分とする本発明の薬剤は非常に消化器系がん
に適した制がん剤である。またその発がん予防効果によ
り、化学発がん剤等による発がんも予防できる。本発明
の薬剤は、食用の褐藻植物、食用のナマコ等、食用物質
を原料として安価に大量に供給可能であり、且つ安全性
が高い点においても優れている。また、フコース硫酸含
有多糖及び/又はその分解物を含有する食品又は飲料を
日常的に摂取することにより、健康を維持、増強するこ
とができる。また、本発明により簡便なアポトーシス誘
発方法が提供され、本発明の方法を使用することによ
り、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻
害剤の開発等を行うことができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, apoptosis is induced against unnecessary or pathogenic cells, and in abnormally proliferating cell diseases such as cancer and viral diseases, apoptosis is induced in diseased cells to prevent the disease, A therapeutically effective drug is provided. In particular, in the case of digestive system cancer such as colon cancer and gastric cancer, it is possible to cause cancer cells to undergo apoptosis by orally administering the agent of the present invention. The drug of the present invention containing the decomposed product as an active ingredient is a cancer drug extremely suitable for digestive system cancer. Further, due to its carcinogenic preventive effect, carcinogenic effects such as chemical carcinogens can be prevented. The agent of the present invention is excellent in that it can be inexpensively supplied in large quantities at a low cost using edible substances such as edible brown algae plants and edible sea cucumbers as raw materials, and is highly safe. Moreover, health can be maintained and enhanced by daily intake of foods or beverages containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product. Further, the present invention provides a simple method for inducing apoptosis, and by using the method of the present invention, research on elucidation of an apoptosis mechanism, development of an apoptosis induction inhibitor, etc. can be performed.
【0319】また本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Fを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な本発明のフコース
硫酸含有多糖−U及びその分解物が提供され、その効率
的な製造方法も提供された。Further, according to the present invention, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which is substantially free of sulfated-fucose-F and is useful in the fields of sugar chain engineering, medicine and the like, in which a highly reactive coloring substance is removed, U and its decomposition products were provided, and efficient production methods thereof were also provided.
【0320】更に本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Uを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な、本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−F及びその分解物が提供され、その効
率的な製造方法も提供された。Further, according to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which is substantially free of a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and is useful in the fields of sugar chain engineering, medicine, etc., in which a highly reactive coloring substance is removed. -F and its decomposition products were provided, and an efficient production method thereof was also provided.
【0321】本発明により、フコース硫酸含有多糖−F
の構造解析や分解、フコース硫酸含有多糖−Fの生物活
性の検索に有用なフコース硫酸含有多糖−Fの低分子化
物の製造に用いることができるエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素、その製造方法、及びがん細胞に対する
アポトーシス誘発作用が強いフコース硫酸含有多糖−F
の該酵素による低分子化物が提供された。According to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
Of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme, which can be used for the production of a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, which is useful for the structural analysis and decomposition of Sucrose-fucose-containing polysaccharide-F, and the biological activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. And a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F that strongly induces apoptosis in cancer cells
A low molecular weight product of the enzyme was provided.
【0322】また、本発明によりこれまで安定的に製造
されなかった本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−
F分解酵素を、カルシウムイオンの存在下極めて安定的
に製造することができるようになった。さらに、本発明
により、カルシウムイオンの存在下本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖分解酵素を極めて効率よく働かせる
ことが可能となった。In addition, the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which has not been produced stably according to the present invention,
It has become possible to produce F-degrading enzyme extremely stably in the presence of calcium ions. Furthermore, according to the present invention, it became possible to work the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention in the presence of calcium ions extremely efficiently.
【図1】図1はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示
したものである。FIG. 1 shows the precipitation rate of sulfated-fucose-containing polysaccharides.
【図2】図2はセファクリルS−500を用いたゲルろ
過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Uの分子量
分布を示したものである。FIG. 2 shows the molecular weight distribution of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U measured by a gel filtration method using Sephacryl S-500.
【図3】図3はフコース硫酸含有多糖−UのIRスペク
トルを示したものである。FIG. 3 shows an IR spectrum of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
【図4】図4はフコース硫酸含有多糖−Uの 1H−N
MRスペクトルを示したものである。FIG. 4 is 1 H—N of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
3 shows an MR spectrum.
【図5】図5は糖化合物(a)のピリジル−(2)−ア
ミノ化糖化合物(PA−a)をL−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。FIG. 5 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-a) of the sugar compound (a) was separated by an L-column.
【図6】図6は糖化合物(b)のピリジル−(2)−ア
ミノ化糖化合物(PA−b)をL−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。FIG. 6 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-b) of the sugar compound (b) was separated by an L-column.
【図7】図7は糖化合物(c)のピリジル−(2)−ア
ミノ化糖化合物(PA−c)をL−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものある。FIG. 7 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-c) of the sugar compound (c) was separated by an L-column.
【図8】図8は糖化合物(a)のマス分析(ネガティブ
測定)により得られた結果を示したものである。FIG. 8 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (a).
【図9】図9は糖化合物(b)のマス分析(ネガティブ
測定)により得られた結果を示したものである。FIG. 9 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (b).
【図10】図10は糖化合物(c)のマス分析(ネガテ
ィブ測定)により得られた結果を示したものである。FIG. 10 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of sugar compound (c).
【図11】図11は糖化合物(a)のマスマス分析(ネ
ガティブ測定)により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 11 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (a).
【図12】図12は糖化合物(b)のマスマス分析(ネ
ガティブ測定)により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 12 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (b).
【図13】図13は糖化合物(c)のマスマス分析(ネ
ガティブ測定)により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 13 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of sugar compound (c).
【図14】図14は糖化合物(a)の 1H−NMRス
ペクトルを示したものである。FIG. 14 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (a).
【図15】図15は糖化合物(b)の 1H−NMRス
ペクトルを示したものである。FIG. 15 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (b).
【図16】図16は糖化合物(c)の 1H−NMRス
ペクトルを示したものである。FIG. 16 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (c).
【図17】図17はセファクリルS−500を用いたゲ
ルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Fの分
子量分布を示したものである。FIG. 17 shows the molecular weight distribution of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F measured by the gel filtration method using Sephacryl S-500.
【図18】図18はフコース硫酸含有多糖−FのIRス
ペクトルを示したものである。FIG. 18 shows an IR spectrum of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
【図19】図19はフコース硫酸含有多糖−Fの 1H
−NMRスペクトルを示したものである。FIG. 19 shows 1 H of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
-Shows the NMR spectrum.
【図20】図20は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素のpHと相対活性の関係を示
すグラフである。FIG. 20 is a graph showing the relationship between pH and relative activity of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.
【図21】図21は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示
すグラフである。FIG. 21 is a graph showing the relationship between temperature and relative activity of endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzymes obtained by the present invention.
【図22】図22はセルロファインGCL−300を用
いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖
−Fを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示した
ものである。FIG. 22 shows the molecular weight distribution before and after the decomposition of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained by the present invention, which was measured by the gel filtration method using Cellulofine GCL-300. It is shown.
【図23】図23は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の反応液中のカルシウムイオ
ン濃度と相対活性の関係を示すグラフである。FIG. 23 is a graph showing the relationship between the calcium ion concentration and the relative activity in the reaction solution of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.
【図24】図24は実施例19−(6)においてセルロ
ファインGCL−300を用いたゲルろ過法により測定
した、フコース硫酸含有多糖−Fを本発明により得られ
るエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解し
たものの分子量分布を示したものである。FIG. 24 is an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained by the present invention, which is obtained by the method of Example 19- (6) using the gel filtration method using Cellulofine GCL-300. It shows the molecular weight distribution of what was decomposed by.
【図25】図25はフコース硫酸含有多糖−Fを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したもののIRスペクトルを示したものであ
る。FIG. 25 shows an IR spectrum of a product obtained by decomposing sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.
【図26】図26はフコース硫酸含有多糖−Fを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したものの1H−NMRスペクトルを示した
ものである。FIG. 26 is a 1 H-NMR spectrum of a product obtained by decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.
【図27】図27はHL−60細胞の培養液に実施例
1、15、及び18で得られたフコース硫酸含有多糖を
1mg/mlとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を示したものである。FIG. 27 shows the culture time and the culture time when the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 were added to the culture solution of HL-60 cells at a concentration of 1 mg / ml. It shows the relationship between the numbers of viable cells.
【図28】図28はMOLT−3細胞の培養液に実施例
1で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例12で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−F、実施例15及び17で
得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸
を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。FIG. 28 is a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, obtained in Examples 15 and 17 in a culture medium of MOLT-3 cells. FIG. 2 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in a culture solution when a sulfated-fucose-containing polysaccharide and dextran sulfate are added.
【図29】図29はHCT 116細胞の培養液に実施
例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例1で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得
られたフコース硫酸含有多糖−U及びフコース硫酸含有
多糖−F、F−Fd−1、F−Fd−2、F−Fd−
3、及びF−Fd−4、実施例15で得られたフコース
硫酸含有多糖、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。FIG. 29 is a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, and a fucose sulfate obtained in Example 12 in a culture solution of HCT 116 cells. Contained Polysaccharide-U and Sulfated Fucose-Containing Polysaccharide-F, F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-
Fig. 3 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture broth when F, Fd-4, F-Fd-4, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin and dextran sulfate were added.
【図30】図30はHCT 116細胞の培養液に実施
例1で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度
で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。FIG. 30 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of HCT 116 cells at various concentrations. It is a thing.
【図31】図31はAGS細胞の培養液に実施例1で得
られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加し
たときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示した
ものである。FIG. 31 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of AGS cells at various concentrations. It is a thing.
【図32】図32はSW480細胞の培養液に実施例1
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。FIG. 32 shows that the culture medium of SW480 cells was used in Example 1.
2 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in step 1 was added at various concentrations.
【図33】図33はWiDr細胞の培養液に実施例1で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例12で得
られたフコース硫酸含有多糖−F、F−Fd−3及びF
−Fd−4及び実施例15で得られたフコース硫酸含有
多糖を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の
関係を示したものである。FIG. 33 is a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 1, sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F-Fd-3 and F obtained in Example 1 in a culture medium of WiDr cells.
FIG. 16 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 were added.
【図34】図34はWiDr細胞の培養液に実施例1で
得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加
したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示し
たものである。FIG. 34 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of WiDr cells at various concentrations. It is a thing.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12P 19/04 C12P 19/04 Z 19/14 19/14 Z (C12N 9/26 C12N 9/26 C12R 1:20) C12R 1:20 (C12N 9/26 1:10 C12R 1:10) (31)優先権主張番号 特願平8−171658 (32)優先日 平成8年6月12日(1996.6.12) (33)優先権主張国 日本(JP) (31)優先権主張番号 特願平8−204187 (32)優先日 平成8年7月16日(1996.7.16) (33)優先権主張国 日本(JP) 微生物の受託番号 FERM P−15436 微生物の受託番号 FERM BP−5402 微生物の受託番号 FERM BP−5403 微生物の受託番号 FERM P−14872 微生物の受託番号 FERM P−14873 (72)発明者 北野 秀夫 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 于 福功 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中山 信司 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 児島 薫 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 木村 ひとみ 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中西 芳邦 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 片山 薫 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 冨永 隆生 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社 中央研究所内 (72)発明者 嶋中 一夫 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 猪飼 勝重 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地4 株式 会社糖鎖工学研究所内 (56)参考文献 特開 平7−215990(JP,A) 特表 平4−506089(JP,A) Takashi Nishino e t al.,Carbohydrate Research,1994年,255,213 −224 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C08B 1/00 - 37/18 CAPLUS(STN) MEDLINE(STN) BIOSIS(DIALOG)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C12P 19/04 C12P 19/04 Z 19/14 19/14 Z (C12N 9/26 C12N 9/26 C12R 1:20) C12R 1 : 20 (C12N 9/26 1:10 C12R 1:10) (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 8-171658 (32) Priority date June 12, 1996 (June 12, 1996) (33) Priority claiming country Japan (JP) (31) Priority claiming number Japanese Patent Application No. 8-204187 (32) Priority date July 16, 1996 (July 16, 1996) (33) Priority claiming country Japan (JP ) Accession number of microorganisms FERM P-15436 Accession number of microorganisms FERM BP-5402 Accession number of microorganisms FERM BP-5403 Accession number of microorganisms FERM P-14872 Accession number of microorganisms FERM P-14873 (72) Inventor Hideo No, 82, Fuyucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor in Fukuno, 82, Fufucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Invention Person Shinji Nakayama 82, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor Kaoru Kojima 82, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Research Institute (72) Invention Person Hitomi Kimura 82 Ginza-cho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor Yoshikuni Nakanishi 82 Ginzai-cho, Hirosaki, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute (72) Invention Person Kaoru Katayama 82-4, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture Glycoengineering Research Institute, Inc. (72) Inventor Takao Tominaga 3-4-1 Seta, Otsu, Shiga Prefecture, Central Research Laboratory, Taso Shuzo Co., Ltd. (72) Inventor Kazuo Shimanaka 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture, Takara Shuzo Co., Ltd., Central Research Laboratory (72) Inventor, Inoi Shige Prefecture Otsu, Shiga Prefecture 3-4-1 Seta, Central Research Laboratories, Inc. (72) Inventor Ikuno Kato 82, Fuyucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture Glycoengineering Research Institute (56) References Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-215990 (JP, A) Japanese Patent Publication No. 4-506089 (JP, A) Takashi Nishino et al. , Carbohydrate Research, 1994, 255, 213 -224 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C08B 1/00-37/18 CAPLUS (STN) MEDLINE (STN) BIOSIS (DIALOG)
Claims (4)
する、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖。 (1)構成糖:ウロン酸を含有する。 (2)フラボバクテリウム(Flavobacteri
um)sp. SA−0082(FERM BP−54
02)の生産するフコイダン分解酵素により低分子化
し、少なくとも下記式(I)、(II)、(III)で
表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成
する。 【化1】 【化2】 【化3】 1. A sulfated-fucose-containing polysaccharide derived from Gagome kombu, which has the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains uronic acid. (2) Flavobacterium
um) sp. SA-0082 (FERM BP-54
The fucoidan-degrading enzyme produced in 02) lowers the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III). [Chemical 1] [Chemical 2] [Chemical 3]
在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で処理し、沈殿物を除
去する工程を包含することを特徴とする請求項1記載の
フコース硫酸含有多糖の製造方法。2. The sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1, which comprises a step of treating the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture with a drug capable of aggregating acidic polysaccharides in the presence of salts to remove precipitates. Manufacturing method.
陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の
多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求項
1記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。3. The fucose according to claim 1, further comprising the step of treating the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation to collect the desired polysaccharide. A method for producing a sulfate-containing polysaccharide.
製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質ある
いは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程
を包含することを特徴とする請求項1記載のフコース硫
酸含有多糖の製造方法。4. The method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1, comprising a step of removing coexisting coloring substances using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group. The method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1.
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