JP3506672B2 - Sulfated-fucose-containing polysaccharide - Google Patents

Sulfated-fucose-containing polysaccharide

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JP3506672B2 JP2000400281A JP2000400281A JP3506672B2 JP 3506672 B2 JP3506672 B2 JP 3506672B2 JP 2000400281 A JP2000400281 A JP 2000400281A JP 2000400281 A JP2000400281 A JP 2000400281A JP 3506672 B2 JP3506672 B2 JP 3506672B2
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薫 片山
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Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品として利用
可能なアポトーシス誘発剤、制がん剤及び発がん予防剤
に関する。また、本発明はアポトーシス機構解明、アポ
トーシス誘発阻害剤スクリーニング等に有用なアポトー
シス誘発方法を提供する。更に本発明により純化された
フコース硫酸含有多糖及びその分解物が提供され、フコ
ース硫酸含有多糖分解物の製造や、構造究明に有用なフ
コース硫酸含有多糖分解酵素が提供される。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an apoptosis-inducing agent, a carcinostatic agent and a carcinogenic preventive agent, which can be used as pharmaceuticals. The present invention also provides a method for inducing apoptosis useful for elucidating the mechanism of apoptosis, screening for apoptosis induction inhibitors, and the like. Further, according to the present invention, a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide and a degradation product thereof are provided, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme useful for producing a degraded product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide and for investigating the structure is provided.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、細胞組織の死に関し、アポトーシ
ス（apoptosis 、アポプトーシスともいう；自爆死ある
いは細胞自滅）と言う様式が注目されている。2. Description of the Related Art In recent years, with respect to the death of cell tissues, a mode called apoptosis (also referred to as "apoptosis"; suicide bombing or cell suicide) has attracted attention.

【０００３】このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組込まれて
いる死であると考えられている。すなわち何らかの外部
的又は内部的要因が引き金となってアポトーシスをプロ
グラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元にプロ
グラム死遺伝子タンパク質が生合成され、生成したプロ
グラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至
ると考えられている。Unlike necrosis, which is a pathological cell death, this apoptosis is considered to be a death that is originally integrated in the gene of the cell itself. That is, some external or internal factor is triggered to activate a gene that programs apoptosis, and a programmed death gene protein is biosynthesized based on this gene, and the generated programmed death protein decomposes the cell itself to cause death. Is believed to reach.

【０００４】このようなアポトーシスを所望の組織、細
胞で発現せしめることができれば、不要若しくは病原細
胞を自然の形で生体から排除することが可能となり、極
めて意義深いものである。If such apoptosis can be expressed in a desired tissue or cell, unnecessary or pathogenic cells can be eliminated from the living body in a natural form, which is extremely significant.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アポ
トーシスを誘発する作用を有する安全性の高い化合物を
開発し、該化合物を含有するアポトーシス誘発剤、制が
ん剤、発がん予防剤、及び該化合物を有効成分として使
用するアポトーシス誘発方法を提供することにある。ま
た本発明の化合物の分解物の製造に有用な該化合物分解
酵素を提供することにある。The object of the present invention is to develop a highly safe compound having an action of inducing apoptosis, and to induce an apoptosis inducer, a carcinostatic agent, a carcinogenic preventive agent containing the compound, and An object of the present invention is to provide a method for inducing apoptosis using the compound as an active ingredient. Another object of the present invention is to provide a compound-degrading enzyme useful for producing a decomposed product of the compound of the present invention.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はアポトーシス誘発剤に関し、フコー
ス硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有することを
特徴とする。Means for Solving the Problems To outline the present invention, the first invention of the present invention relates to an apoptosis inducer, which is characterized by containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof.

【０００７】本発明の第２の発明はアポトーシス誘発方
法に関し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物
を有効成分として使用することを特徴とする。The second invention of the present invention relates to a method for inducing apoptosis, which is characterized by using a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product as an active ingredient.

【０００８】本発明の第３の発明は制がん剤に関し、本
発明の第５又は第６の発明のフコース硫酸含有多糖及び
／又はその分解物を含有することを特徴とする。A third invention of the present invention relates to a carcinostatic agent, which is characterized by containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the fifth or sixth invention of the present invention and / or its degradation product.

【０００９】本発明の第４の発明は発がん予防剤に関
し、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を含有
することを特徴とする。A fourth invention of the present invention relates to a carcinogen preventive agent, which is characterized by containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof.

【００１０】 本発明の第５の発明は下記理化学的性質
を有する、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖に関
する。 （１）構成糖：ウロン酸を含有する。 （２）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化
し、少なくとも下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で
表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成
する。A fifth invention of the present invention relates to a sulfated-fucose-containing polysaccharide derived from Gagome kombu having the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains uronic acid. (2) Flavobacterium
um) sp. SA-0082 (FERM BP-54
The fucoidan-degrading enzyme produced in 02) lowers the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III).

【化学式４】 [Chemical formula 4]

【化学式５】 [Chemical formula 5]

【化学式６】 [Chemical formula 6]

【００１１】本発明の第６の発明は下記理化学的性質を
有するフコース硫酸含有多糖に関する。 （１）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （２）フラボバクテリウム(Flavobacterium）ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコダイン分解酵素により実質上低分子化されない。The sixth invention of the present invention relates to a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (2) Flavobacterium sp.
The fucodine-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.

【００１２】本発明の第７の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を塩類の存在下、酸性多糖凝集能のあ
る薬剤で処理し、沈殿物を除去する工程を包含すること
を特徴とする。A seventh aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an agent capable of aggregating acidic polysaccharides in the presence of salts, It is characterized by including a step of removing a precipitate.

【００１３】本発明の第８の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース硫
酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イオ
ン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包含
することを特徴とする。An eighth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation. Then, the step of collecting the desired polysaccharide is included.

【００１４】本発明の第９の発明は本発明の第５の発明
のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の第
５の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共存
する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換基
を有する物質を用いて除去する工程を包含することを特
徴とする。A ninth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention, which is a coexisting coloring property when producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the fifth aspect of the present invention. The method is characterized by including the step of removing the substance using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group.

【００１５】本発明の第１０の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、ウロン酸を含むフコース硫酸含
有多糖を分解する能力を有する分解酵素、又は該分解酵
素をもつ微生物で処理して目的の多糖を採取する工程を
包含することを特徴とする。A tenth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, in which a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is decomposed to decompose a sulfated-fucose-containing polysaccharide containing uronic acid. The method is characterized by including a step of collecting the target polysaccharide by treating with an enzyme or a microorganism having the degrading enzyme.

【００１６】本発明の第１１の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、塩類の存在下、酸性多糖凝集能
のある薬剤で目的の多糖を沈殿させる工程を包含するこ
とを特徴とする。The eleventh aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is used as a drug having an ability to aggregate acidic polysaccharides in the presence of salts. It is characterized by including the step of precipitating a polysaccharide.

【００１７】本発明の第１２の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、フコース
硫酸含有多糖混合物を、２価の陽イオンの混在下に陰イ
オン交換樹脂で処理して目的の多糖を採取する工程を包
含することを特徴とする。A twelfth aspect of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to the sixth aspect of the present invention, wherein the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is treated with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation. Then, the step of collecting the desired polysaccharide is included.

【００１８】本発明の第１３の発明は本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖の製造方法に関し、本発明の
第６の発明のフコース硫酸含有多糖を製造する際に、共
存する着色性物質を多糖性の物質あるいは陰イオン交換
基を有する物質を用いて除去する工程を包含することを
特徴とする。The thirteenth invention of the present invention relates to a method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention, wherein the coexisting coloring property is present when the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention is produced. The method is characterized by including the step of removing the substance using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group.

【００１９】本発明の第１４の発明はフコース硫酸含有
多糖混合物の製造方法に関し、海藻から本発明の第７、
８、１０、１１又は１２の発明に使用するフコース硫酸
含有多糖混合物を抽出する際に、酢酸イオンとカルシウ
ムイオンを共存させることを特徴とする。A fourteenth invention of the present invention relates to a method for producing a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, which comprises the steps of:
When extracting the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture used in the invention of 8, 10, 11 or 12, acetate ion and calcium ion are made to coexist.

【００２０】本発明の第１５の発明は下記の理化学的性
質を有することを特徴とするエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素に関する。 （ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖に作用して、該フコース硫酸含有多糖を低分子化
させる。 （ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖に作用
しない。 （ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。 （ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される化合物より選
択される一種以上の化合物が生成する。The fifteenth invention of the present invention relates to an endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme having the following physicochemical properties. (I) Action: It acts on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties to lower the molecular weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. (A) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (B) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.
It does not act on sulfated-fucose-containing polysaccharides having the following physicochemical properties. (C) Constituent sugar: Contains uronic acid. (D) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) reduces the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III). .

【化７】 [Chemical 7]

【化８】 [Chemical 8]

【化９】 （ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近にあ
る。 （iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付
近である。[Chemical 9] (Ii) Optimum pH: The optimum pH of this enzyme is around 7-8. (Iii) Optimum temperature: The optimum temperature of this enzyme is around 30 to 35 ° C.

【００２１】本発明の第１６の発明はカルシウム源と本
発明の第１５の発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素を含有する酵素組成物に関する。The sixteenth invention of the present invention relates to an enzyme composition containing a calcium source and the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention.

【００２２】本発明の第１７の発明は本発明の第１５の
発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の製造方
法に関し、本発明の第１５の発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素生産能を有するアルテロモナス属細
菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特
徴とする。A seventeenth invention of the present invention relates to a method for producing an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention, which has an ability to produce an endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention. Is characterized by culturing a bacterium belonging to the genus Alteromonas and having the enzyme collected from the culture.

【００２３】本発明の第１８の発明はフコース硫酸含有
多糖の低分子化物に関し、本発明の第１５の発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を本発明の第６の発
明のフコース硫酸含有多糖に作用させて取得してなるも
のであることを特徴とする。The eighteenth invention of the present invention relates to a low molecular weight product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide, wherein the endo-fucose-sulfate-containing polysaccharide degrading enzyme of the fifteenth invention of the present invention is the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the sixth invention of the present invention. It is characterized by being obtained by acting on.

【００２４】本発明者らは様々な純化されたフコース硫
酸含有多糖やその分解物を得ることに成功し、次いでそ
れらの生物活性を検討し、それらの物質ががん細胞に対
してアポトーシスを誘発させること及び強い制がん作用
を示すことを見出した。またフコース硫酸含有多糖及び
／又はその分解物が強い発がん抑制作用を示すことを見
い出した。更に本発明の分解物の調製に有用なフコース
硫酸含有多糖分解酵素の単離に成功し、本発明を完成さ
せた。The present inventors succeeded in obtaining various purified sulfated-fucose-containing polysaccharides and degradation products thereof, and then examined their biological activities, and these substances induce apoptosis in cancer cells. It was found that the substance has a strong anticancer effect. It was also found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product has a strong carcinogenic inhibitory action. Furthermore, we succeeded in isolating a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme useful for the preparation of the degraded product of the present invention, and completed the present invention.

【００２５】[0025]

【発明の実施の形態】以下、本発明に関して具体的に説
明する。本発明に使用されるフコース硫酸含有多糖はガ
ゴメ昆布由来の物である。また本発明にはフコース硫酸
含有多糖の分解物も使用することができる。フコース硫
酸含有多糖の分解方法としては酸処理等の化学的に分解
する方法、超音波処理など物理的に分解する方法、ある
いは酵素的に分解する方法等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be specifically described below. The sulfated-fucose-containing polysaccharide used in the present invention is derived from Gagome kombu. Further, a decomposed product of a sulfated-fucose-containing polysaccharide can also be used in the present invention. Examples of the method for decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide include a chemical decomposition method such as acid treatment, a physical decomposition method such as ultrasonic treatment, and an enzymatic decomposition method.

【００２６】本発明者らは、上記のような様々なフコー
ス硫酸含有多糖及び／又はその分解物をがん細胞の培養
液に添加したところ添加後１日から数日で癌細胞がアポ
トーシスを起こすことを見出した。また、正常細胞に対
しては毒性を示さないことも確認した。The present inventors have added various sulfated-fucose-containing polysaccharides and / or their degradation products as described above to the culture medium of cancer cells, and the cancer cells undergo apoptosis 1 to several days after the addition. I found that. It was also confirmed that it did not show toxicity to normal cells.

【００２７】本発明において、フコース硫酸含有多糖と
は、分子中にフコース硫酸を含有する多糖であり、特に
限定はないが、例えば褐藻植物、ナマコ等に含有されて
いる〔左右田徳郎監修、江上不二夫編集、共立出版株式
会社、昭和３０年１２月１５日発刊、多糖類化学、第３
１９頁、第３２１頁〕。なお褐藻植物由来のフコース硫
酸含有多糖はフコイダン、フコイジン、フカンと通称さ
れ、いくつかの分子種があることが知られているがこれ
らは総称的にフコイダンと呼ばれることが多い。例え
ば、市販シグマ社製のフコイダンを１３種もの分子種に
分けたという報告があり〔カーボハイドレート リサー
チ（Carbohydrate Research)、第２５５巻、第２１３〜
２２４頁（１９９４）〕、その中にはフコースを主成分
とする一群と、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースや
マンノースを多く含む一群の分子種がある。その生物活
性についてはマクロファージ活性増強、癌転移抑制、抗
凝血等様々なものが報告されているが、フコース硫酸含
有多糖には分子種があるため活性の本体がどの分子種に
あるかを調べるためにはフコース硫酸含有多糖を分離精
製して調べる必要があった。フコース硫酸含有多糖に
は、ウロン酸を実質的に含まず構成糖の主成分がフコー
スのものと、ウロン酸を数％含み構成糖にフコースやマ
ンノースを含むもの等がある。以下、本明細書において
はウロン酸を実質的に含まない方をフコース硫酸含有多
糖−Ｆとし、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をフ
コース硫酸含有多糖−Ｕとし、両者の混合物をフコース
硫酸含有多糖混合物と記載する。In the present invention, the sulfated-fucose-containing polysaccharides are polysaccharides containing sulfated-fucose in the molecule and are not particularly limited, but are contained in, for example, brown algae plants, sea cucumbers and the like [supervised by Tokuro Shirota and Fujio Egami. Editorial, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., published December 15, 1955, Polysaccharide Chemistry, No. 3
19, p. 321]. Note that the sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from brown algae plants are commonly called fucoidan, fucoidin, and fucan, and it is known that there are several molecular species, but these are often generically called fucoidan. For example, there is a report that a commercially available Sigma fucoidan was divided into 13 kinds of molecular species [Carbohydrate Research, Vol. 255, No. 213-].
224 (1994)], and there are a group of molecular species containing fucose as a main component and a group of molecular species containing a few% of uronic acid and a large amount of fucose and mannose in the constituent sugars. Regarding its biological activity, various things such as enhancement of macrophage activity, suppression of cancer metastasis, anticoagulation, etc. have been reported. Since there are molecular species in sulfated-fucose-containing polysaccharides, it is investigated which molecular species is responsible for the activity. Therefore, it was necessary to separate and purify the sulfated-fucose-containing polysaccharide. The sulfated-fucose-containing polysaccharides include those in which uronic acid is not substantially contained and the main constituent sugar is fucose, and those in which uronic acid is contained in several percent and fucose and mannose are contained in the constituent sugars. Hereinafter, in the present specification, the one substantially free of uronic acid is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, the sulfated-fucose-containing polysaccharide containing uronic acid is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and a mixture of both is referred to as a sulfated-fucose-containing polysaccharide. Described as a mixture.

【００２８】これまでに知られているフコース硫酸含有
多糖−Ｆやフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する方法は
分子量分画や陰イオン交換樹脂による分離であり、その
分離は不充分なため薬品や機能性食品として大量調製が
困難なものであった。The known methods for separating the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are molecular weight fractionation and separation by an anion exchange resin. It was difficult to prepare a large amount of functional food.

【００２９】また、フコース硫酸含有多糖から着色性物
質を完全に除去することは困難なことが知られており、
市販のフコイダン等にも着色性物質が含まれている。通
常この着色性物質はポリフェノールが重合したものであ
り極めて反応性が強く様々な酵素反応を阻害したり細胞
の生育を阻害したり、また、例えば接した樹脂や樹脂性
の容器等に不可逆的に吸着することがある。そのためフ
コース硫酸含有多糖の生物活性を正確に調べるため、ま
た、容器や樹脂等の汚染を防ぐためにはフコース硫酸含
有多糖から反応性の強い着色性物質を除去する必要があ
った。Further, it is known that it is difficult to completely remove the coloring substance from the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
Commercially available fucoidan and the like also contain coloring substances. Usually, this coloring substance is a polymer of polyphenol and is extremely reactive and inhibits various enzyme reactions and cell growth, and it is irreversibly attached to, for example, a resin or a resin container in contact therewith. May be adsorbed. Therefore, in order to accurately investigate the biological activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide and to prevent the contamination of the container, the resin and the like, it was necessary to remove the highly reactive coloring substance from the sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【００３０】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖混合物を抽出する
際に可溶性の酢酸バリウムや塩化バリウムや塩化カルシ
ウムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができ
るため、後の精製が有利であることが知られているが、
可溶性のバリウム塩は廃液の処理などが容易ではなく、
また塩化カルシウムは海藻と混合するとｐＨが変動する
ため非分解性のフコース硫酸含有多糖を得るにはｐＨ調
整が必要である。このｐＨ調整の際に海藻粉末が粘性を
帯びて凝集することがあるため、その後の抽出効率が低
下したり固液分離とりわけろ過が困難となることがあ
る。When soluble barium acetate, barium chloride or calcium chloride is used to extract a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides from brown algae or alcoholic residues of brown algae, the mixture of alginic acid can be suppressed. Is known to be advantageous,
Soluble barium salt is not easy to treat waste liquid,
Further, when calcium chloride is mixed with seaweed, the pH changes, so that pH adjustment is necessary to obtain a non-degradable sulfated-fucose-containing polysaccharide. During this pH adjustment, the seaweed powder may be viscous and aggregate, which may reduce the subsequent extraction efficiency and make solid-liquid separation, especially filtration difficult.

【００３１】すなわち、現在フコース硫酸含有多糖の産
業上の有用性が期待されているにも関わらず、分子種的
に分別が充分なフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコース硫
酸含有多糖−Ｕの市販品もなく、またその効率的な製造
方法に関する報告もない。更には市販のフコース硫酸含
有多糖には上記のように反応性の強い着色性物質が含ま
れている。That is, although the fucose sulfate-containing polysaccharides are currently expected to be industrially useful, commercially available products of the fucose sulfate-containing polysaccharide-F and the fucose sulfate-containing polysaccharide-U which are sufficiently separated in terms of molecular species. There is also no report on its efficient production method. Furthermore, commercially available sulfated-fucose-containing polysaccharides contain a highly reactive coloring substance as described above.

【００３２】フコース硫酸含有多糖には様々な活性があ
るが、前述のごとくその分別調製が困難であるためいま
だに実質上純化されたフコース硫酸含有多糖−Ｆやフコ
ース硫酸含有多糖−Ｕは得られていなかった。Although the sulfated-fucose-containing polysaccharide has various activities, it is still difficult to fractionate and prepare it as described above, and thus the substantially purified fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide-F and fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide-U have been obtained. There wasn't.

【００３３】しかしながら本発明により、実質上純化さ
れたフコース硫酸含有多糖−Ｕ、その簡便な抽出方法及
びフコース硫酸含有多糖−Ｕの製造方法が提供された。
また本発明により、通常、フコース硫酸含有多糖から除
去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をもたらす反応性
の強い着色性物質を除去したフコース硫酸含有多糖−Ｕ
が提供された。However, the present invention provides a substantially purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, a simple extraction method thereof and a method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
In addition, according to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U obtained by removing a highly reactive coloring substance that is usually difficult to remove from a sulfated-fucose-containing polysaccharide and causes enzyme reaction inhibition, resin contamination, etc.
Was provided.

【００３４】更に本発明により、実質上純化されたフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ、その簡便な抽出方法及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆの製造方法が提供された。Furthermore, the present invention provides a substantially purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, a simple extraction method thereof and a method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.

【００３５】また本発明により、通常、フコース硫酸含
有多糖から除去困難で酵素反応阻害や樹脂の汚染等をも
たらす反応性の強い着色性物質を除去したフコース硫酸
含有多糖−Ｆが提供された。Further, the present invention provides a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F from which a highly reactive coloring substance which is usually difficult to remove from a sulfated-fucose-containing polysaccharide and which causes enzyme reaction inhibition and resin contamination is removed.

【００３６】本発明に使用するフコース硫酸含有多糖と
しては、褐藻植物、ナマコ等のフコース硫酸含有多糖含
有物を、例えばそのまま乾燥、粉砕して用いても良く、
またフコース硫酸含有多糖含有物よりのフコース硫酸含
有多糖抽出液、該抽出液よりの精製物を使用しても良
い。フコース硫酸含有多糖抽出液の調製方法、抽出液か
らの精製方法は公知の方法で行えばよく、特に限定はな
い。As the sulfated-fucose-containing polysaccharide used in the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing substance such as brown algae, sea cucumber and the like may be used, for example, by directly drying and crushing.
Further, a sulfated-fucose-containing polysaccharide extract from a sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing product, or a purified product from the extract may be used. A method for preparing the sulfated-fucose-containing polysaccharide extract and a method for purifying the extract from the extract may be known methods and are not particularly limited.

【００３７】また、本発明に使用する、フコース硫酸含
有多糖分解物とは、フコース硫酸含有多糖を酵素化学的
方法、化学的方法、物理学的方法で分解して得られるも
のであり、公知の酵素化学的方法、化学的方法、物理学
的方法を使用することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide degradation product used in the present invention is obtained by degrading a sulfated-fucose-containing polysaccharide by an enzymatic chemical method, a chemical method or a physical method. Enzymatic chemical methods, chemical methods, physical methods can be used.

【００３８】また、本発明に使用するフコース硫酸含有
多糖、フコース硫酸含有多糖分解物とはその薬学的に許
容される塩を包含する。Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and the sulfated-fucose-containing polysaccharide degradation product used in the present invention include pharmaceutically acceptable salts thereof.

【００３９】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植物
としては、例えば、山田幸雄序、瀬川宗吉著、保育社、
昭和５２年発刊の原色日本海藻図鑑、第２２〜５２頁に
記載の褐藻植物があり、例えば、ヒバマタ（Fucus evan
escens) 、ガゴメ昆布（Kjellmaniella crassifolia)、
マ昆布（Laminaria japonica) 、ワカメ（Undaria pinn
atifida)等を使用し、フコース硫酸含有多糖を調製する
ことができる。Examples of brown algae plants containing sulfated-fucose-containing polysaccharides include, for example, Yukio Yamada, Sokichi Segawa, nursery company,
There are brown algae plants described on pages 22 to 52 of the Primary Seaweed Illustrated Book published in 1977, and, for example, Hiba Mata (Fucus evan
escens), Gagome kelp (Kjellmaniella crassifolia),
Mackerel (Laminaria japonica), seaweed (Undaria pinn)
atifida) etc. can be used to prepare a sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【００４０】フコース硫酸含有多糖を含有するナマコと
しては、例えば、特開平４−９１０２７号公報記載のナ
マコがあり、例えばマナマコ（Stichopus japonicus)、
ニセクロナマコ（Holothuria leucospilota)等を使用す
ることができ、該公報記載の方法にて、フコース硫酸含
有多糖を調製することができる。Examples of sea cucumbers containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide include sea cucumbers described in Japanese Patent Laid-Open No. 4-91027, for example, sea cucumber (Stichopus japonicus),
Frozen sea cucumber (Holothuria leucospilota) and the like can be used, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide can be prepared by the method described in the publication.

【００４１】フコース硫酸含有多糖は硫酸基を分子中に
有しており、該基は種々の塩基と反応し塩を形成する。
これらのフコース硫酸含有多糖、それらの分解物は塩に
なった状態が安定であり、通常ナトリウム及び／又はカ
リウム等の塩の形態で単離される。これらの物質の塩は
ダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂で処理するこ
とによって遊離のフコース硫酸含有多糖、遊離のそれら
の分解物に導くことが可能である。また、これらは、更
に必要に応じ公知慣用の塩交換を行い、所望の種々の塩
に交換することができる。フコース硫酸含有多糖、それ
らの分解物の塩としては、薬学的に許容される塩が用い
られ、例えばカリウム、ナトリウム等のアルカリ金属
塩、カルシウム、マグネシウム、バリウム等のアルカリ
土類金属塩、ピリジニウム等の有機塩基との塩、及びア
ンモニウム塩等が挙げられる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide has a sulfate group in the molecule, and this group reacts with various bases to form a salt.
These sulfated-fucose-containing polysaccharides and their decomposition products are stable in a salt state, and are usually isolated in the form of salts such as sodium and / or potassium. Salts of these substances can be converted into free sulfated-fucose-containing polysaccharides and free degradation products thereof by treating with a cation exchange resin such as Dowex 50W. Further, these may be exchanged with various desired salts by performing publicly known and commonly used salt exchange, if necessary. As the sulfated-fucose-containing polysaccharides and salts of their decomposition products, pharmaceutically acceptable salts are used, for example, alkali metal salts such as potassium and sodium, alkaline earth metal salts such as calcium, magnesium and barium, pyridinium and the like. Examples thereof include salts with organic bases, ammonium salts, and the like.

【００４２】フコース硫酸含有多糖を含有する褐藻植
物、ナマコ等は乾燥後、粉砕処理を行うことにより、フ
コース硫酸含有多糖含有粉体を調製することができる。A brown algae plant, a sea cucumber, etc., containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide can be dried and then pulverized to prepare a powder containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【００４３】フコース硫酸含有多糖含有粉体から熱水抽
出、希酸抽出を行うことによってフコース硫酸含有多糖
抽出液を調製することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide extract can be prepared by performing hot water extraction and dilute acid extraction from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-containing powder.

【００４４】フコ−ス硫酸含有多糖含有物からの抽出温
度、時間としては０〜２００℃、１〜３６０分の範囲か
ら目的に応じ選択すれば良いが、通常１０〜１５０℃、
５〜２４０分、好適には５０〜１３０℃、１０〜１８０
分の範囲より選択して行うのが良い。The extraction temperature and time from the fucoose-sulfuric acid-containing polysaccharide-containing material may be selected according to the purpose from the range of 0 to 200 ° C. and 1 to 360 minutes, but usually 10 to 150 ° C.
5 to 240 minutes, preferably 50 to 130 ° C, 10 to 180
It is better to select from the range of minutes.

【００４５】フコース硫酸含有多糖含有率を高めるため
の抽出物精製手段としては、塩化カルシウム、酢酸バリ
ウム等を用いたフコース硫酸含有多糖の分画方法、塩化
セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を用いたフコー
ス硫酸含有多糖の分画方法、塩類の存在下で酸性多糖凝
集剤を用いるフコース硫酸含有多糖の分画方法、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー等があり、必要に応
じこれらを組合せて、精製を行うことができる。As the extract purification means for increasing the content of sulfated-fucose-containing polysaccharides, a method for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides using calcium chloride, barium acetate or the like, or an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride was used. There are methods for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides, methods for fractionating sulfated-fucose-containing polysaccharides using an acidic polysaccharide flocculant in the presence of salts, gel filtration, ion exchange chromatography, etc. It can be carried out.

【００４６】フコース硫酸含有多糖の分解方法として
は、フコース硫酸含有多糖分解酵素を使用する方法、酸
分解を行う方法、超音波処理を行う方法等フコース硫酸
含有多糖分解方法として公知の方法を使用することがで
き、分解物の精製は上記方法にて行えばよい。As a method for decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide, a method known as a method for decomposing a sulfated-fucose-containing polysaccharide, such as a method using a sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme, a method of decomposing an acid or a method of sonication is used. The degradation product can be purified by the above method.

【００４７】 通常、褐藻類には複数種のフコース硫酸
含有多糖が存在するが、本発明に使用される褐藻類の種
類はガゴメ昆布である。Normally, a plurality of types of sulfated-fucose-containing polysaccharides are present in brown algae, but the type of brown algae used in the present invention is gagome kelp.

【００４８】フコース硫酸含有多糖の製造にはまず、褐
藻類の水系溶媒による抽出液を得る。To produce the sulfated-fucose-containing polysaccharide, first, an extract of brown algae with an aqueous solvent is obtained.

【００４９】また、抽出に供する海藻は生海藻でも良い
が、抽出液を得る前に褐藻を乾燥したり、乾燥粉末にし
たり、６０〜１００％のアルコールやアセトン等で洗浄
したり、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アンモニア等を含む水溶液に浸しておけ
ばフコース硫酸含有多糖への着色性物質の混入が大幅に
減少するため有利である。The seaweed to be extracted may be raw seaweed, but before the extract is obtained, the brown algae is dried, made into a dry powder, washed with 60 to 100% alcohol, acetone or the like, formaldehyde or acetaldehyde. Soaking in an aqueous solution containing glutaraldehyde, ammonia, etc. is advantageous because it greatly reduces the mixing of coloring substances into the sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【００５０】また、褐藻類あるいは褐藻類のアルコール
洗浄残渣等からフコース硫酸含有多糖を抽出する際に可
溶性の酢酸バリウム、塩化バリウム、又は塩化カルシウ
ムを使用するとアルギン酸の混入を抑えることができる
ため後の精製が有利であるが上述した理由により抽出の
際には、１ｍＭ〜１Ｍ程度の酢酸カルシウム溶液で５０
〜１３０℃で抽出するのが好ましい。When soluble barium acetate, barium chloride, or calcium chloride is used for extracting the sulfated-fucose-containing polysaccharide from brown algae or alcohol washed residues of brown algae, the mixture of alginic acid can be suppressed. Purification is advantageous, but for the reason described above, 50 mM of calcium acetate solution of about 1 mM to 1 M is used for extraction.
Extraction at ~ 130 ° C is preferred.

【００５１】海藻が厚手で粉末（粒子）が大きい場合、
最初から０．２Ｍ以上の酢酸カルシウムを用いると抽出
効率が悪くなることがあるので、まず水で抽出したもの
に、酢酸カルシウムを加えて、生じるアルギン酸の沈殿
を除去すれば良い。When the seaweed is thick and the powder (particles) is large,
If 0.2M or more of calcium acetate is used from the beginning, the extraction efficiency may deteriorate. Therefore, calcium acetate may be added to the water-extracted product to remove the formed alginic acid precipitate.

【００５２】しかしながらフコース硫酸含有多糖をアル
ギン酸と同時に抽出したい場合や、抽出時ある程度分解
したものを得たい場合等では溶媒及び抽出条件は特に限
定されるものではなく、水あるいは、食塩、塩化マグネ
シウム等の様々な濃度の中性塩類水溶液、クエン酸、リ
ン酸、塩酸等様々な濃度の酸性水溶液、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等の様々な濃度のアルカリ性水溶液
が使用でき、緩衝剤や防腐剤を加えても良い。抽出液の
ｐＨや抽出温度、抽出時間なども特に限定されないが、
一般にフコース硫酸含有多糖は酸やアルカリに対して弱
いため、酸性溶液やアルカリ性溶液を使用する場合低分
子化が進行し易い。加熱温度、時間、ｐＨ等を調整する
ことにより、任意の分解物を調製することができ、例え
ばゲルろ過処理、分子量分画膜処理等により、分解物の
平均分子量、分子量分布等を調整することができる。However, the solvent and extraction conditions are not particularly limited in the case where it is desired to extract the sulfated-fucose-containing polysaccharide simultaneously with alginic acid, or to obtain a product which is decomposed to some extent at the time of extraction, and water, salt, magnesium chloride, etc. are not particularly limited. Various neutral salt aqueous solutions of various concentrations, acidic aqueous solutions of various concentrations such as citric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, alkaline aqueous solutions of various concentrations such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. can be used. You may add. The pH, extraction temperature, extraction time, etc. of the extract are not particularly limited,
In general, sulfated-fucose-containing polysaccharides are weak against acids and alkalis, so that when an acidic solution or an alkaline solution is used, lowering of the molecular weight tends to proceed. Arbitrary degradation products can be prepared by adjusting the heating temperature, time, pH, etc., for example, adjusting the average molecular weight, molecular weight distribution, etc. of the degradation products by gel filtration treatment, molecular weight fractionation membrane treatment, etc. You can

【００５３】すなわち本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子量及び糖組成は
フコース硫酸含有多糖の原料の収穫期、該原料の乾燥方
法、該原料の保存方法により異なり、またフコース硫酸
含有多糖の抽出時の加熱条件、ｐＨ条件等により異な
る。例えば酸によりフコース硫酸含有多糖は加水分解さ
れ、アルカリ条件下ではウロン酸のβ−脱離により、低
分子化が進行する。従って本明細書に記載したフコース
硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆの分子
量、分子量分布はその１例にすぎず、フコース硫酸含有
多糖の処理条件により、その分子量、分子量分布は容易
に変化させ得る。例えば、弱アルカリ性で１００℃、１
時間加熱し、脱塩に際し、ポアサイズ３００の分子ふる
い膜を使用すれば、分子量分布１０００から１万程度の
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
が調製でき、使用する条件によって任意の分子量、分子
量分布の本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆを調製できる。That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention-
The molecular weights and sugar compositions of U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F differ depending on the harvest time of the raw material of the sulfated-fucose-containing polysaccharide, the drying method of the raw material, the method of storing the raw material, and the heating conditions during the extraction of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. Depends on pH conditions and the like. For example, a sulfated-fucose-containing polysaccharide is hydrolyzed by an acid, and under alkaline conditions, β-elimination of uronic acid causes a reduction in molecular weight. Therefore, the molecular weight and molecular weight distribution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in the present specification are only one example, and the molecular weight and the molecular weight distribution can be easily changed depending on the treatment conditions of the sulfated-fucose-containing polysaccharide. Can be changed. For example, weakly alkaline at 100 ℃, 1
When a molecular sieve membrane having a pore size of 300 is used for desalting after heating for an hour, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having a molecular weight distribution of 1,000 to 10,000 are used.
According to the conditions used, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention having an arbitrary molecular weight and molecular weight distribution can be prepared.

【００５４】前記の褐藻類の抽出液からアルギン酸や中
性糖等を除くためには、例えば０．２〜０．６Ｍの濃度
の食塩などの塩類の存在下、これ以上沈殿が生じなくな
るまで塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を加
え、沈殿を集めれば良い。In order to remove alginic acid, neutral sugars and the like from the above-mentioned brown alga extract, for example, in the presence of salts such as sodium chloride at a concentration of 0.2 to 0.6 M, salification is continued until precipitation does not occur. The precipitate may be collected by adding an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium.

【００５５】必要に応じてこの沈殿を０．２〜０．６Ｍ
の濃度の食塩などの塩類溶液で洗浄後、沈殿中の塩化セ
チルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗い落とし、
フコース硫酸含有多糖混合物を得る。こうして得られた
フコース硫酸含有多糖混合物から色素を除くために、こ
の沈殿を溶解後陰イオン交換樹脂や多糖性の樹脂で処理
したり限外ろ過等を行ってもよい。また脱塩後凍結乾燥
すれば乾燥標品を得ることもできる。If necessary, this precipitate is added to 0.2 to 0.6M.
After washing with a salt solution such as sodium chloride at a concentration of, the cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with salt-saturated alcohol,
A sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is obtained. In order to remove the dye from the thus-obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, the precipitate may be dissolved and then treated with an anion exchange resin or a polysaccharide resin or subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting.

【００５６】本発明者らは０．６〜３Ｍの１種類又は２
種類以上の塩類の存在下で本発明のフコース硫酸含有多
糖−Ｆと本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性多糖
凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことを見出した。The present inventors used one type or two of 0.6 to 3M.
It was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention behaved completely differently with respect to the acidic polysaccharide flocculant in the presence of more than one salt.

【００５７】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｕを分離することができる。For example, the method of the present invention can be used to separate the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention from an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture.

【００５８】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６
〜２Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。First, one or more salts are added to an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture to give a total concentration of 0.6.
~ 2M. Salts to be added are sodium chloride,
It is not particularly limited to calcium chloride and the like.

【００５９】通常本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆと
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕを分離する場合１．
５Ｍ程度の塩濃度で目的は達成できる（後記する図１の
説明参照）。 例えば上記塩類の塩濃度を１．５Ｍに調
整した後塩化セチルピリジニウム等の酸性多糖凝集剤を
これ以上沈殿が生じなくなるまで添加するとフコース硫
酸含有多糖−Ｆが沈殿を形成するので、沈殿を除去する
と本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの溶液が得られ
る。必要に応じてこの溶液を濃縮後、４倍量のエタノー
ルなどで溶液中のフコース硫酸含有多糖−Ｕを沈殿さ
せ、沈殿中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコ
ールで洗い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
を得る。こうして得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。Usually, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention are separated: 1.
The purpose can be achieved with a salt concentration of about 5 M (see the description of FIG. 1 below). For example, when the salt concentration of the above-mentioned salts is adjusted to 1.5 M and then an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride is added until precipitation does not occur any more, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F forms a precipitate. A solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is obtained. If necessary, this solution is concentrated, and then the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U in the solution is precipitated with 4-fold amount of ethanol or the like, and cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with a salt-saturated alcohol to obtain the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention. -U
To get In order to remove the dye from the thus obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the precipitate may be dissolved and then subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting. In addition, a preservative and the like may be added during the process.

【００６０】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの
みを効率的に製造したい場合は、塩化セチルピリジニウ
ム等で凝集させる際に、０．２〜０．６Ｍの塩濃度では
なく、例えば２Ｍの塩濃度にすれば沈殿は本発明のフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆのみを含む。Next, when it is desired to efficiently produce only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention, when aggregating with cetylpyridinium chloride or the like, a salt concentration of, for example, 2M is used instead of a salt concentration of 0.2 to 0.6M. In terms of salt concentration, the precipitate contains only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention.

【００６１】本発明者らは、フコース硫酸含有多糖を陰
イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオンが共存す
ると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸含有多糖量
が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良くなること
も見出した。すなわち、本発明の方法を用いて本発明の
フコース硫酸含有多糖−Ｕを製造する際には、まずフコ
ース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオン源となる薬品
を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次に、陰イオン交換
樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１ｍＭ以上含む液で
平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖混合物を吸着させ
る。この陰イオン交換樹脂を平衡化した液で充分洗浄
後、例えば塩化ナトリウムのグラジエントによりフコー
ス硫酸含有多糖を溶出させる。本方法を用いる場合、添
加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ以上ならばよいが、
本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕをカラムに吸着させ
る目的の時は０．５Ｍ未満が望ましい。また本方法に用
いる２価の陽イオン源となる薬品はカルシウム塩やバリ
ウム塩が特にその効果が優れているが、特に限定される
ものではなく、硫酸マグネシウム、塩化マンガン等も使
用することができる。The present inventors have found that when a sulfated-fucose-containing polysaccharide is purified with an anion exchange resin, the coexistence of a divalent cation increases the amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide adsorbed per unit amount of resin, resulting in the addition of a sulfated-fucose-containing polysaccharide. It was also found that the separation of polysaccharides is improved. That is, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is produced by using the method of the present invention, first, a divalent cation source chemical, preferably 1 mM or more, is added to the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. Next, the anion exchange resin is equilibrated with a solution containing a divalent cation, preferably 1 mM or more, to adsorb the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After sufficient washing with an equilibrated liquid of this anion exchange resin, the sulfated-fucose-containing polysaccharide is eluted with a gradient of sodium chloride, for example. When this method is used, the concentration of the divalent cation added may be 1 mM or more,
For the purpose of adsorbing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention on a column, less than 0.5M is desirable. In addition, the chemicals used as the divalent cation source used in the present method are particularly excellent in their effects, but calcium salts and barium salts are not particularly limited, and magnesium sulfate, manganese chloride, etc. can also be used. .

【００６２】また、褐藻類から通常の方法でフコース硫
酸含有多糖混合物を製造すると上述のように反応性の強
い着色性物質が混入し、それらが接する樹脂や樹脂性容
器を汚染したり、酵素反応や細胞生育を阻害したりす
る。この着色性物質は多糖性の物質あるいは陰イオン交
換基を有する物質に結合あるいは吸着させれば容易に除
去できることを見出した。すなわち、フコース硫酸含有
多糖を含む溶液に例えば、セルロファイン、ＧＣＬ−２
０００（生化学工業社製）や、セファクリルＳ−５０
０、セファデッスクＧ−２００、セファロースＣＬ−２
Ｂ（共にファルマシア社製）等の多糖性の樹脂あるい
は、ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業
社製）、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦ、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックスＡ−５０、ＱＡＥ−セファデックスＡ−５
０、ＤＥＡＥ−セファセル（共にファルマシア社製）、
ＴＳＫ−ゲルＤＥＡＥ−トヨパール６５０、ＴＳＫ−ゲ
ルＤＥＡＥトヨパール５５０（トーソー社製）、アンバ
ーライト系の陰イオン交換樹脂（オルガノ社販売）キト
パール系の陰イオン交換樹脂（富士紡績社製）等の陰イ
オン交換基を有する物質を添加かくはん後除去したり、
あるいはこれらを充てんしたカラムにフコース硫酸含有
多糖を含む溶液を通過させればこの反応性の強い着色性
物質は容易に除去できる。但し、陰イオン交換樹脂の場
合フコース硫酸含有多糖も結合し得るので、着色性物質
を吸着させる時に塩濃度を２Ｍ程度にしておくことが好
ましい。In addition, when a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture is produced from brown algae by a usual method, a highly reactive coloring substance is mixed in as described above, which contaminates the resin or resin container with which they are in contact, or the enzymatic reaction. And inhibits cell growth. It has been found that this coloring substance can be easily removed by binding or adsorbing it to a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group. That is, for example, in a solution containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide, cellulofine, GCL-2
000 (manufactured by Seikagaku Corporation) and Sephacryl S-50
0, Sephadex G-200, Sepharose CL-2
Polysaccharide resins such as B (both manufactured by Pharmacia) or DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation), DEAE-Sepharose FF, DEAE-Sephadex A-50, QAE-Sephadex A-5.
0, DEAE-Sephacell (both made by Pharmacia),
Anions such as TSK-gel DEAE-Toyopearl 650, TSK-gel DEAE Toyopearl 550 (manufactured by Tosoh Corporation), amberlite-based anion exchange resin (sold by Organo), and chitopearl-based anion exchange resin (manufactured by Fuji Spinning Co., Ltd.) Addition of substances with exchange groups, removal after stirring,
Alternatively, if a solution containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide is passed through a column filled with these, this highly reactive coloring substance can be easily removed. However, in the case of an anion exchange resin, since a sulfated-fucose-containing polysaccharide can also be bound, it is preferable to keep the salt concentration at about 2M when adsorbing the coloring substance.

【００６３】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは例え
ば実施例６に記載のように調製することができる。以
下、このフコース硫酸含有多糖−Ｕの理化学的性質を示
すが、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはこの例に限
定されるものではない。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention can be prepared, for example, as described in Example 6. The physicochemical properties of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are shown below, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention is not limited to this example.

【００６４】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ、及び
実施例８で得た本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各
塩化ナトリウム濃度における、過剰量の塩化セチルピリ
ジニウム存在下における沈殿形成性を図１に示す。The sulfate-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention obtained in Example 8 at various sodium chloride concentrations were examined for their precipitation-forming properties in the presence of an excessive amount of cetylpyridinium chloride. Shown in 1.

【００６５】図１の縦軸は沈殿形成率（％）を示し、横
軸は塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。図中、実線及び
白丸は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの各塩化ナト
リウム濃度での沈殿形成率を示し、図中、点線及び白三
角は本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの各塩化ナトリ
ウム濃度（Ｍ）での沈殿形成率を示す。The vertical axis in FIG. 1 represents the precipitation formation rate (%), and the horizontal axis represents the sodium chloride concentration (M). In the figure, the solid line and the white circles show the precipitation formation rate of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention at each sodium chloride concentration, and the dotted line and the white triangles in the figure are the sodium chloride of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention. The precipitation formation rate at the concentration (M) is shown.

【００６６】沈殿形成率の測定は、溶液温度３７℃に
て、以下のように行った。本発明のフコース硫酸含有多
糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれ２％の
濃度で水及び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、これらを
様々な割合で混合することにより様々な濃度の塩化ナト
リウムに溶解したフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ溶液を各１２５μｌずつ調製した。
次に、塩化セチルピリジニウムを２．５％の濃度で水及
び４Ｍの塩化ナトリウムに溶解し、それらを混合するこ
とにより様々な濃度の塩化ナトリウムに溶解した１．２
５％の塩化セチルピリジニウム溶液を調製した。The precipitation formation rate was measured at a solution temperature of 37 ° C. as follows. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention were dissolved in water and 4M sodium chloride at a concentration of 2%, respectively, and these were mixed at various ratios to give various concentrations of sodium chloride. 125 μl each of the dissolved sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solutions were prepared.
Next, cetylpyridinium chloride was dissolved in water and 4M sodium chloride at a concentration of 2.5% and dissolved in various concentrations of sodium chloride by mixing them.
A 5% cetylpyridinium chloride solution was prepared.

【００６７】水に溶解している２％の本発明のフコース
硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．
２５％の塩化セチルピリジニウムで完全に沈殿させるに
は容量で３．２倍必要であった。そこで、各濃度の塩化
ナトリウムに溶解した２％のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
及びフコース硫酸含有多糖−Ｆの各１２５μｌに対して
各々の濃度の塩化ナトリウムに溶解した塩化セチルピリ
ジニウム溶液を４００μｌ添加後、充分かくはんし、３
０分放置後、遠心分離し上清中の糖含量をフェノール−
硫酸法〔アナリティカル ケミストリー（Analytical C
hemistry) 、第２８巻、第３５０頁（１９５６）〕によ
り測定し、各塩化ナトリウム濃度下での各フコース硫酸
含有多糖の沈殿形成率を算出した。2% of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention dissolved in water were 1.
3.2 times by volume was required for complete precipitation with 25% cetylpyridinium chloride. Therefore, 2% sulfated-fucose-containing polysaccharide-U dissolved in each concentration of sodium chloride
And to 125 μl of each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, 400 μl of a cetylpyridinium chloride solution dissolved in each concentration of sodium chloride was added, followed by thorough stirring.
After leaving it for 0 minutes, it was centrifuged to measure the sugar content in the supernatant with phenol-
Sulfuric acid method [Analytical C
hemistry), Vol. 28, p. 350 (1956)], and the precipitation formation rate of each sulfated-fucose-containing polysaccharide under each sodium chloride concentration was calculated.

【００６８】得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｕの分子量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過
法により求めたところ、約１９万を中心とした分子量分
布を示した（図２参照）。なお、図２において、縦軸は
フェノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４
８０ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバ
ーを示す。The obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention-
When the molecular weight of U was determined by a gel filtration method using Sephacryl S-500, a molecular weight distribution centered on about 190,000 was shown (see FIG. 2). In Fig. 2, the vertical axis represents the sugar content in the sample measured by the phenol-sulfuric acid method.
The absorbance is shown at 80 nm, and the horizontal axis shows the fraction number.

【００６９】なお、ゲルろ過の条件を下記に示す。 カラムサイズ：３．０８×１６２．５ｃｍ 溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノール
を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０） 流速：１．５ｍｌ／分 サンプル濃度：０．２５％ サンプル液量：２０ｍｌ 分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社
製）The conditions for gel filtration are shown below. Column size: 3.08 × 162.5 cm Solvent: 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.times.) Containing 0.2 M sodium chloride and 10% ethanol.
0) Flow rate: 1.5 ml / min Sample concentration: 0.25% Sample liquid amount: 20 ml Molecular weight standard substance: Shodex STANDARD P-82 (manufactured by Showa Denko KK)

【００７０】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｕの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の
記載に従いフコース量を定量した。Next, the components of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention were analyzed. First of all, Journal of
Biological chemistry (Journal of Biologica
Chemistry), 175, 595 (1948).

【００７１】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ
の乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、
１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ（GlycoTAG) 及びグライコタッグ
リージェント キット（GlycoTAG Reagent Kit) （共に
宝酒造社製）を用いて加水分解して得られた単糖の還元
性末端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、Ｈ
ＰＬＣにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの
条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ：宝酒造社製） 溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U
Dissolve the dried sample of 1 in 1N hydrochloric acid at a concentration of 0.5%,
It was treated at 110 ° C. for 2 hours and hydrolyzed into constituent monosaccharides. Next, GlycoTAG and GlycoTag
The reducing end of the monosaccharide obtained by hydrolysis using GlycoTAG Reagent Kit (both manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) is pyridyl- (2) -aminated (PA-modified) and H
The ratio of constituent sugars was examined by PLC. The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm x 150 m
m: Takara Shuzo Co., Ltd.) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9.0): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) Excitation wavelength 310 nm, Fluorescence wavelength 380 nm : 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C

【００７２】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。Next, the amount of uronic acid was quantified according to the description in Analytical Biochemistry, Volume 4, p. 330 (1962).

【００７３】次に、バイオケミカル ジャーナル（Bioc
hemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）
の記載に従い硫酸含量を定量した。Next, the Biochemical Journal (Bioc
hemical Journal), Vol. 84, p. 106 (1962).
The sulfuric acid content was quantified as described in.

【００７４】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｕの構成糖はフコース、マンノース、ガラクトー
ス、グルコース、ラムノース、キシロース、ウロン酸で
あった。その他の中性糖は実質的に含有されていなかっ
た。また、主要成分のフコース：マンノース：ガラクト
ース：ウロン酸：硫酸基はモル比で約１０：７：４：
５：２０であった。As a result, the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U were fucose, mannose, galactose, glucose, rhamnose, xylose and uronic acid. It was substantially free of other neutral sugars. In addition, the main component fucose: mannose: galactose: uronic acid: sulfate groups are in a molar ratio of about 10: 7: 4 :.
It was 5:20.

【００７５】次に、フコース硫酸含有多糖−Ｕのカルシ
ウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分光光度計
ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社製）により
測定したところ図３に示すスペクトルが得られた。な
お、図３において縦軸は透過率（％）、横軸は波数（ｃ
ｍ−１）を示す。Next, the IR spectrum of the calcium salt of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was measured with a Fourier transform infrared spectrophotometer JIR-DIAMOND20 (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 3 was obtained. In FIG. 3, the vertical axis represents the transmittance (%) and the horizontal axis represents the wave number (c
m- 1 ) is shown.

【００７６】次に、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
のカルシウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核
磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本
電子社製）により測定したところ図４に示すスペクトル
が得られた。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention
The NMR spectrum of the calcium salt was measured by a 500 MHz nuclear magnetic resonance apparatus JNM-α500 type nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 4 was obtained.

【００７７】図４中、縦軸はシグナルの強度、横軸は化
学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、 １Ｈ−ＮＭＲで
の化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐ
ｍとして表した。１ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．２７（マンノースの１位のＨ）、５．０７（フコ
ースの１位のＨ）、４．４９（フコースの３位のＨ）、
４．３７（グルクロン酸の１位のＨ）、４．０４（フコ
ースの４位のＨ）、３．８２（フコースの２位のＨ）、
３．５４（グルクロン酸の３位のＨ）、３．２８（グル
クロン酸の２位のＨ）、１．０９（フコースの５位のＣ
Ｈ３ のＨ）In FIG. 4, the vertical axis represents signal intensity and the horizontal axis represents chemical shift value (ppm). The chemical shift value in 1 H-NMR is 4.65 pp as the chemical shift value in HOD.
Expressed as m. 1 H-NMR (D 2 O) δ 5.27 (H at 1st position of mannose), 5.07 (H at 1st position of fucose), 4.49 (H at 3rd position of fucose),
4.37 (H at position 1 of glucuronic acid), 4.04 (H at position 4 of fucose), 3.82 (H at position 2 of fucose),
3.54 (H at the 3-position of glucuronic acid), 3.28 (H at the 2-position of glucuronic acid), 1.09 (C at the 5-position of fucose)
H of H 3 )

【００７８】この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの
凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ−
３００（堀場製作所製）により測定したところ、−５
３．６度であった。The specific optical rotation of the freeze-dried product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention was measured with a high-speed and high-sensitivity polarimeter SEPA-
-5 when measured by 300 (manufactured by Horiba Ltd.)
It was 3.6 degrees.

【００７９】本発明者らは、以下に述べるごとく得られ
た本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕの構造を決定し
た。The present inventors have determined the structure of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention obtained as described below.

【００８０】フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力
を有する分解酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｕの分
解及び分解物の精製 精製したフコース硫酸含有多糖−Ｕに下記のエンド型フ
コイダン分解酵素を作用させ分解物の精製を行った。Decomposition of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U by a degrading enzyme capable of degrading sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and purification of the decomposed product The purified endo-fucoidan-degrading enzyme described below is caused to act on the purified sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. The decomposition product was purified.

【００８１】すなわち、１％のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ溶液１６ｍｌと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１２ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ
／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵素溶液８ｍｌを混合
し、２５℃で４８時間反応させた。反応の進行と共に２
３０ｎｍの吸光度が増加することを確認し、本酵素によ
りフコース硫酸含有多糖−Ｕが分解されていることが判
明した。この反応液をマイクロアシライザーＧ３（旭化
成社製）により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦに
より３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に分離精製
した。That is, a polysaccharide containing 1% sulfuric acid fucose-
16 ml of U solution and 50 mM phosphate buffer (pH 8.
0) 12 ml and 4 M sodium chloride 4 ml and 32 mU
/ Ml of endo-fucoidan degrading enzyme solution (8 ml) was mixed and reacted at 25 ° C for 48 hours. 2 as the reaction progresses
It was confirmed that the absorbance at 30 nm increased, and it was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was decomposed by this enzyme. The reaction solution was desalted with Micro Acylyzer G3 (manufactured by Asahi Kasei Corp.), and then separated and purified into three fractions (a), (b), and (c) by DEAE-Sepharose FF.

【００８２】なお、上記のエンド型フコイダン分解酵素
は以下の方法により調製される。The above endo-type fucoidan degrading enzyme is prepared by the following method.

【００８３】該エンド型フコイダン分解酵素の生産に用
いる菌株としては、該エンド型フコイダン分解酵素生産
能を有する菌株であればいかなる菌株でもよいが、具体
例としては例えば、フラボバクテリウム（Flavobacteri
um）ｓｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２）が挙げられる。The strain used for the production of the endo-fucoidan-degrading enzyme may be any strain as long as it has the ability to produce the endo-fucoidan-degrading enzyme. Specific examples include, for example, Flavobacterium (Flavobacteri).
um) sp. SA-0082 strain (FERM BP-54
02).

【００８４】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。 １．フラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２株 ａ．形態的性質 （１）本菌は短かん菌である。 幅 ０．８〜１．０μｍ 長さ １．０〜１．２μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 ３７℃以下で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８
℃である。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）ウレアーゼ 弱陽性 （６）酸の生成 Ｄ−グルコース 陽性 ラクトース 陽性 マルトース 陽性 Ｄ−マンニトール 陽性 スクロース 陰性 トレハロース 陰性 （７）加水分解 デンプン 陰性 ゼラチン 陽性 カゼイン 陰性 エスクリン 陽性 （８）硝酸塩の還元 陰性 （９）インドールの生成 陰性 （１０）硫化水素の生成 陰性 （１１）ミルクの凝固 陰性 （１２）ナトリウムの要求性 陽性 （１３）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （１４）キノン系 メナキノン６ （１５）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ３２％ （１６）ＯＦ−テスト Ｏ （１７）集落の色調 黄色系 （１８）運動性 なし （１９）滑走性 なしThe present strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. 1. Flavobacterium sp. SA-0082 strain a. Morphological properties (1) This bacterium is a short bacterium. Width 0.8 to 1.0 μm Length 1.0 to 1.2 μm (2) Presence or absence of spores (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) It can grow in the temperature range of growth of 37 ° C or lower. Suitable growth temperature is 15-28
℃. (2) Attitude toward oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase positive (5) Urease Weak positive (6) Acid generation D-glucose positive lactose positive maltose positive D-mannitol positive sucrose negative trehalose negative (7) water Degraded starch Negative gelatin Positive casein Negative esculin Positive (8) Nitrate reduction Negative (9) Indole formation Negative (10) Hydrogen sulfide formation Negative (11) Milk coagulation Negative (12) Sodium requirement positive (13) Salts Requirement Growth in 0% saline medium Negative Growth in 1% saline medium Negative Growth in seawater medium Positive (14) Quinone menaquinone 6 (15) GC content of intracellular DNA 32% (16) OF-test O ( 17) Color of the village Yellowish (18) No mobility (19) No gliding

【００８５】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology) 、第１巻（１９８
４）、及びバージーズ マニュアル オブ ディターミ
ネイティブ バクテリオロジー (Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology)、第９巻（１９９４）に記
載のフラボバクテリウム アクアタイル（Flavobacteri
um aquatile)、及びフラボバクテリウム メニンゴセプ
チカム（Flavobacterium meningosepticum) の類縁細菌
と考えられるが、前者とはスクロースを資化して酸を形
成しない点、カゼインを分解できない点、エスクリンを
分解できる点、ゼラチンを液化できる点、ウレアーゼが
陽性である点が異なり、後者とはカゼインが分解できな
い点、３７℃での生育が遅い点が異なる。そこで本菌株
をフラボバクテリウムに属する細菌と同定し、フラボバ
クテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２と命名した。This strain is based on the Bergies Manual of Cysticatic Bacteriology (Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology), Volume 1 (198
4), and the Burgies Manual of Derminative Bacteriology (Bergey's Manual of D
eterminative Bacteriology), Volume 9 (1994).
um aquatile) and Flavobacterium meningosepticum (Flavobacterium meningosepticum), but the former does not assimilate sucrose to form an acid, cannot decompose casein, and can decompose esculin. The difference is that gelatin can be liquefied and urease is positive, and the latter is different in that casein cannot be decomposed and that it grows slowly at 37 ° C. Therefore, this strain was identified as a bacterium belonging to Flavobacterium and flavobacterium sp. It was named SA-0082.

【００８６】なお、上記菌株は Flavobacterium ｓｐ．
ＳＡ−００８２と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よ
りＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−５４０２（国際寄託への移管請求日： 平成８年２
月１５日）として寄託されている。The above strain was Flavobacterium sp.
SA-0082 is displayed, and it is displayed on the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [1-3-1-3 Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305)] from March 29, 1995. Deposited as 14872, FERMB in the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry
P-5402 (Request for transfer to international deposit: 1996 1996)
(15th of a month).

【００８７】本菌株の培地に加える栄養源は使用する菌
株が利用し、エンド型フコイダン分解酵素を生産するも
のであればよく、炭素源としては例えばフコイダン、海
藻粉末、アルギン酸、フコース、グルコース、マンニト
ール、グリセロール、サッカロース、マルトース、ラク
トース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母
エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が
適当である。その他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩
類を加えてもよい。The nutrient source added to the culture medium of this strain may be any one that can be utilized by the strain to be used and produces an endo-type fucoidan-degrading enzyme. Examples of the carbon source include fucoidan, seaweed powder, alginic acid, fucose, glucose and mannitol. , Glycerol, saccharose, maltose, lactose, starch and the like can be used, and as nitrogen sources, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract, defatted soybean, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.

【００８８】本エンド型フコイダン分解酵素の生産菌を
培養するに当り、生産量は培養条件により変動するが、
一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、培地のｐＨは５〜
９がよく、５〜７２時間の通気かくはん培養で本エンド
型フコイダン分解酵素の生産量は最高に達する。培養条
件は使用する菌株、培地組成等に応じ、本エンド型フコ
イダン分解酵素の生産量が最大になるように設定するの
は当然のことである。In culturing the bacterium producing the endo-type fucoidan-degrading enzyme, the production amount varies depending on the culture conditions.
Generally, the culture temperature is 15 ° C to 30 ° C, and the pH of the medium is 5 ° C.
9 is the best, and the production amount of the present endo-type fucoidan-degrading enzyme reaches the maximum after aeration and agitation culture for 5 to 72 hours. It is natural that the culture conditions are set so as to maximize the production of the endo-fucoidan-degrading enzyme according to the strain used, the composition of the medium, and the like.

【００８９】本エンド型フコイダン分解酵素は菌体中に
も培養物上清中にも存在する。The endo-type fucoidan-degrading enzyme is present in both bacterial cells and culture supernatant.

【００９０】上記のフラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ
−００８２株を適当な培地で培養し、その菌体を集め、
通常用いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理など
で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。The above-mentioned Flavobacterium sp. SA
-0082 strain is cultivated in an appropriate medium, the bacterial cells are collected,
A cell-free extract can be obtained by disrupting the cells by a commonly used cell disruption means such as ultrasonication.

【００９１】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本エンド型フコイダン
分解酵素を得ることができる。Then, a purified enzyme preparation can be obtained from this extract by a commonly used purification means. For example, purification can be performed by salting out, ion exchange column chromatography, hydrophobic binding column chromatography, gel filtration, etc. to obtain a purified endo-fucoidan degrading enzyme free of other fucoidan degrading enzymes.

【００９２】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素（菌体外酵素）が大量に存在する
ので、菌体内酵素と同様の精製手段により精製すること
ができる。Since the enzyme (extracellular enzyme) is present in a large amount in the supernatant of the culture solution obtained by removing the cells from the above-mentioned culture solution, it can be purified by the same purification means as the intracellular enzyme. it can.

【００９３】エンド型フコイダン分解酵素の精製例を示
す。An example of purification of endo-fucoidan degrading enzyme will be shown.

【００９４】フラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００
８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）をグルコース０．２
５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％を含む
人工海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５から
なる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２
０分）２リットルの三角フラスコに接種し、２４℃で２
４時間培養して種培養液とした。グルコース０．２５
％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５％、及び消
泡剤（信越化学工業製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工
海水（ジャマリンラボラトリー製）ｐＨ７．５からなる
培地２０リットルを３０リットル容のジャーファーメン
ターに入れ１２０℃で２０分殺菌した。冷却後、上記の
種培養液６００ｍｌを接種し、２４℃で２４時間、毎分
１０リットルの通気量と毎分１２５回転のかくはん速度
の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して
菌体を得た。Flavobacterium sp. SA-00
82 (FERM BP-5402) with glucose 0.2
600 ml of a medium consisting of artificial seawater (manufactured by Jamarin Laboratory) pH 7.5 containing 5%, peptone 1.0% and yeast extract 0.05% was dispensed and sterilized (120 ° C, 2
(0 min) Inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask and mix at 2
The cells were cultured for 4 hours to obtain a seed culture solution. Glucose 0.25
%, Peptone 1.0%, yeast extract 0.05%, and antifoaming agent (Shin-Etsu Chemical KM70) 0.01% artificial seawater (Jamarine Laboratory) pH 7.5 containing 20 liters of medium 30 It was put in a liter fermenter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, 600 ml of the above seed culture was inoculated and cultured at 24 ° C. for 24 hours under the conditions of an aeration rate of 10 liters per minute and a stirring speed of 125 rpm. After the completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain bacterial cells.

【００９５】この菌体を、２００ｍＭの食塩を含む２０
ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、超
音波破砕後、遠心分離して菌体抽出液を得た。この菌体
抽出液中の本エンド型フコイダン分解酵素の活性を測定
したところ、培地１ｍｌ中に５ｍＵの活性が検出され
た。The cells were treated with 20 mM sodium chloride.
The cells were suspended in mM acetic acid-phosphate buffer (pH 7.5), ultrasonically disrupted, and then centrifuged to obtain a cell extract. When the activity of the endo-type fucoidan degrading enzyme in this bacterial cell extract was measured, an activity of 5 mU was detected in 1 ml of the medium.

【００９６】本抽出液に、終濃度が９０％飽和となるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、かくはん溶解後遠心分離
し、沈殿を上記菌体抽出液と同じ緩衝液に懸濁して、５
０ｍＭの食塩を含む２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で充分透析した。透析により生じた沈殿を遠
心分離により除去後、あらかじめ５０ｍＭの食塩を含む
２０ｍＭの酢酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムに吸着させ、
吸着物を同緩衝液にて充分洗浄後、５０ｍＭから６００
ｍＭの食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を
集めた。次にこの活性画分に終濃度が４Ｍとなるように
食塩を加え、あらかじめ４Ｍの食塩を含む２０ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファ
ロースＣＬ−４Ｂのカラムに吸着させ、吸着物を同緩衝
液で充分洗浄後、４Ｍから１Ｍの食塩のグラジエントに
より溶出させ、活性画分を集めた。次にこの活性画分を
限外ろ過器で濃縮後、あらかじめ５０ｍＭ食塩を含む１
０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセファクリル Ｓ−３
００でゲルろ過を行い活性画分を集めた。この酵素の分
子量をセファクリル Ｓ−３００の保持時間から求めた
ところ約４６万であった。次にこの活性画分を２５０ｍ
Ｍの食塩を含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で透
析した。この酵素液を、あらかじめ２５０ｍＭの食塩を
含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したモ
ノ（Mono）Ｑ ＨＲ５／５のカラムに吸着させ、吸着物
を同緩衝液で充分洗浄後、２５０ｍＭから４５０ｍＭの
食塩のグラジエントにより溶出させ、活性画分を集め、
精製酵素を得た。以上の精製工程を表１に示す。Ammonium sulfate was added to this extract to a final concentration of 90% saturation, and the mixture was stirred and dissolved, followed by centrifugation, and the precipitate was suspended in the same buffer solution as the above-mentioned bacterial cell extract.
20 mM acetate-phosphate buffer containing 0 mM sodium chloride (p
It was dialyzed thoroughly with H7.5). After removing the precipitate generated by dialysis by centrifugation, the precipitate was adsorbed on a column of DEAE-Sepharose FF equilibrated with 20 mM acetic acid-phosphate buffer (pH 7.5) containing 50 mM sodium chloride in advance,
After thoroughly washing the adsorbate with the same buffer, from 50 mM to 600
The active fraction was collected by elution with a gradient of mM NaCl. Next, sodium chloride was added to this active fraction so that the final concentration was 4 M, and it was adsorbed on a phenyl sepharose CL-4B column equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 4 M sodium chloride in advance. The adsorbate was thoroughly washed with the same buffer and then eluted with a 4 M to 1 M sodium chloride gradient to collect active fractions. Next, this active fraction was concentrated with an ultrafilter and then pre-contained with 50 mM sodium chloride.
Sephacryl S-3 equilibrated with 0 mM phosphate buffer
Gel filtration was performed at 00 to collect active fractions. The molecular weight of this enzyme was about 460,000 when determined from the retention time of Sephacryl S-300. Next, this active fraction is 250 m
It was dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7) containing M sodium chloride. This enzyme solution was adsorbed to a column of Mono (Mono) Q HR5 / 5, which had been equilibrated with a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7) containing 250 mM sodium chloride in advance, and the adsorbed material was thoroughly washed with the same buffer solution and then 250 mM. To a 450 mM sodium chloride gradient to collect the active fractions,
A purified enzyme was obtained. Table 1 shows the above purification steps.

【００９７】[0097]

【表１】 [Table 1]

【００９８】本酵素の活性測定は下記の様に行う。The activity of this enzyme is measured as follows.

【００９９】２．５％のガゴメ昆布由来のフコイダン溶
液５０μｌと、１０μｌの本酵素と、６０μｌの６６７
ｍＭ塩化ナトリウムを含む８３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ
７．５を混合し、３７℃、３時間反応させた後、反応液
１０５μｌと水２ｍｌを混合かくはんし、その２３０ｎ
ｍにおける吸光度（ＡＴ）を測定する。対照として、本
酵素の代りに、本酵素を溶解している上記緩衝液のみを
用いて同様の条件により反応させたもの及びフコイダン
溶液の代りに水のみを用いて反応を行ったものを用意
し、それぞれ同様に吸光度を測定する（ＡＢ１及びＡＢ
２）。50 μl of a 2.5% fucoidan solution derived from Gagome kelp, 10 μl of the present enzyme, and 60 μl of 667
83 mM phosphate buffer pH containing mM sodium chloride
7.5 was mixed and reacted at 37 ° C. for 3 hours, then 105 μl of the reaction mixture and 2 ml of water were mixed and stirred, and
The absorbance (AT) at m is measured. As a control, instead of this enzyme, prepared was one that was reacted under the same conditions using only the above buffer solution in which this enzyme was dissolved, and one that was reacted using only water instead of the fucoidan solution. , And the absorbance is measured in the same manner (AB1 and AB
2).

【０１００】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのマンノースとウロン酸の間のグリコシ
ド結合を脱離的に切断する酵素量とする。切断された結
合の定量は、脱離反応の際に生じた不飽和ウロン酸のミ
リモル分子吸光係数を５．５として計算し行う。なお、
酵素の活性は下記式により求める。 （ＡＴ−ＡＢ１−ＡＢ２）×２．１０５×１２０／５．
５×１０５×０．０１×１８０＝Ｕ／ｍｌ ２．１０５：吸光度を測定するサンプルの液量（ｍｌ） １２０：酵素反応液の液量（μｌ） ５．５：不飽和ウロン酸の２３０ｎｍにおけるミリモル
分子吸光係数（／ｍＭ） １０５：希釈に用いる反応液の液量（μｌ） ０．０１：酵素液量（ｍｌ） １８０：反応時間（分）One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the glycosidic bond between 1 μmol of mannose and uronic acid in one minute in the above reaction system. The quantification of the cleaved bond is carried out by calculating the millimolar molecular extinction coefficient of unsaturated uronic acid produced during the elimination reaction as 5.5. In addition,
The enzyme activity is calculated by the following formula. (AT-AB1-AB2) x 2.105 x 120/5.
5 × 105 × 0.01 × 180 = U / ml 2.105: Volume of sample for measuring absorbance (ml) 120: Volume of enzyme reaction solution (μl) 5.5: Unsaturated uronic acid at 230 nm Millimolar extinction coefficient (/ mM) 105: volume of reaction solution used for dilution (μl) 0.01: volume of enzyme solution (ml) 180: reaction time (minutes)

【０１０１】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行う。その際１ｍｇ／ｍ
ｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算する。The protein was quantified by measuring the enzyme solution at 280 nm.
It is performed by measuring the absorbance. At that time 1 mg / m
The absorbance of 1 of the protein solution is calculated as 1.0.

【０１０２】なお基質のガゴメ昆布由来のフコイダンは
次の様に調製した。The fucoidan derived from the substrate Gagome kelp was prepared as follows.

【０１０３】乾燥ガゴメ昆布を自由粉砕機Ｍ−２型（奈
良機械製作所製）により粉砕し、１０倍量の８５％メタ
ノール中で７０℃、２時間処理後、ろ過し、残渣を１０
倍量のメタノール中で７０℃、２時間処理し、ろ過す
る。残渣に２０倍量の水を加え、１００℃、３時間処理
しろ過により抽出液を得る。抽出液の塩濃度を４００ｍ
Ｍの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、セチルピリジ
ニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離する。その沈殿を、エタノールで充分洗浄
し、セチルピリジニウムクロリドが完全に除去できた
ら、限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０万）（アミコ
ン社製）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じ
た沈殿を遠心分離により除去する。この上清を凍結乾燥
して精製ガゴメ昆布フコイダンを得る。The dried gagome kelp was crushed by a free crusher M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), treated with 10 times amount of 85% methanol at 70 ° C. for 2 hours, filtered, and the residue 10
It is treated at 70 ° C. for 2 hours in a double amount of methanol and filtered. 20 times amount of water is added to the residue, treated at 100 ° C. for 3 hours and filtered to obtain an extract. The salt concentration of the extract is 400m
After making the same as the M sodium chloride solution, cetylpyridinium chloride is added until no more precipitation occurs, and the mixture is centrifuged. The precipitate was thoroughly washed with ethanol, and when cetylpyridinium chloride could be completely removed, desalting and removal of low-molecular weight components were carried out using an ultrafilter (the molecular weight excluded from the filtration membrane was 100,000) (Amicon). The precipitate formed is removed by centrifugation. The supernatant is freeze-dried to obtain purified Gagome kelp fucoidan.

【０１０４】酵素反応生成物の構造解析 上記のエンド型フコイダン分解酵素は、フコース硫酸含
有多糖−Ｕ中に存在するＤ−マンノースとＤ−グルクロ
ン酸の間のα１→４結合を脱離的に分解する酵素であ
り、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用させると
下記式（Ｉ）、（II）、及び（III）の構造を有するオ
リゴ糖が生成した。Structural Analysis of Enzymatic Reaction Product The endo-fucoidan-degrading enzyme described above detachably decomposes the α1 → 4 bond between D-mannose and D-glucuronic acid present in the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. When the resulting sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is an enzyme, the oligosaccharides having the structures of the following formulas (I), (II) and (III) are produced.

【化１０】 [Chemical 10]

【化１１】 [Chemical 11]

【化１２】 [Chemical 12]

【０１０５】以下、詳細に説明する。The details will be described below.

【０１０６】上記のＤＥＡＥ−セファロースＦＦで分離
精製した３つの画分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）をそれ
ぞれ一部だけグライコタッグ及びグライコタッグ リー
ジェント キットを用いて還元性末端を、ピリジル−
（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、各ＰＡ化糖（ＰＡ−
ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）を得た。（ＰＡ
−ａ）、（ＰＡ−ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）をＨＰＬＣに
より分析した。[0106] A portion of each of the three fractions (a), (b), and (c) separated and purified by the DEAE-Sepharose FF described above was used in part by using Glycotag and Glycotag Regent kit to remove the reducing end from pyridyl. −
(2) -Amination (PA-ization), and each PA-modified sugar (PA-
a), (PA-b), and (PA-c) were obtained. (PA
-A), (PA-b), and (PA-c) were analyzed by HPLC.

【０１０７】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。The HPLC conditions were as follows.

【０１０８】（ア）分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ
分析 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＳＨＯＤＥＸ ＳＢ−８０３(４．６×２５０
ｍｍ)（昭和電工社製） 溶離液：０．２Ｍ塩化ナトリウム：ジメチルスルホキシ
ド＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：５０℃(A) HPLC using a molecular weight fractionation column
Analytical apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: SHODEX SB-803 (4.6 x 250)
mm) (manufactured by Showa Denko KK) Eluent: 0.2 M sodium chloride: dimethylsulfoxide = 9: 1 Detection: fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi Ltd.) excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm detection flow rate: 1 ml / Min Column temperature: 50 ℃

【０１０９】（イ）逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：Ｌ−カラム（４．６×２５０ｍｍ）〔（財）化
学薬品検査協会〕 溶離液：５０ｍＭ酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ５．
５） 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：４０℃(A) HPLC analyzer using reverse phase column: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: L-column (4.6 × 250 mm) [Chemicals Inspection Society of Japan] Eluent: 50 mM Acetic acid-triethylamine (pH 5.
5) Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) with excitation wavelength 320 nm and fluorescence wavelength 400 nm, detection flow rate: 1 ml / min Column temperature: 40 ° C.

【０１１０】図５、６、及び７には各々ピリジル−
（２）−アミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）、（ＰＡ−
ｂ）、及び（ＰＡ−ｃ）のＨＰＬＣの各溶出パターンを
示し、図において縦軸は相対蛍光強度、横軸は保持時間
（分）を示す。Pyridyl- is shown in FIGS. 5, 6 and 7, respectively.
(2) -aminated sugar compound (PA-a), (PA-
b) and (PA-c) HPLC elution patterns are shown, in which the vertical axis represents relative fluorescence intensity and the horizontal axis represents retention time (minutes).

【０１１１】下記に式（Ｉ）、式（II）、及び式（II
I）で表される化合物、すなわち（ａ）、（ｂ）、及び
（ｃ）の物性を示す。The formula (I), formula (II), and formula (II
The physical properties of the compound represented by I), that is, (a), (b), and (c) are shown.

【０１１２】図８に（ａ）の、図９に（ｂ）の、図１０
に（ｃ）のマスのスペクトルを示し、図１１に（ａ）
の、図１２に（ｂ）の、図１３に（ｃ）のマスマスのス
ペクトルを示し、各図において縦軸は相対強度（％）、
横軸はｍ／ｚ値を示す。FIG. 8A, FIG. 9B, FIG.
The spectrum of the mass of (c) is shown in FIG.
FIG. 12 (b) and FIG. 13 (c) show mass spectrums, where the vertical axis represents relative intensity (%),
The horizontal axis represents m / z value.

【０１１３】更に図１４は（ａ）の、図１５は（ｂ）
の、図１６は（ｃ）の １Ｈ−ＮＨＲスペクトルを示
し、各図において縦軸はシグナルの強度、横軸は化学シ
フト値（ｐｐｍ）を示す。Further, FIG. 14 shows (a) and FIG. 15 shows (b).
16 shows the 1 H-NHR spectrum of (c), and in each figure, the vertical axis shows the signal intensity and the horizontal axis shows the chemical shift value (ppm).

【０１１４】なお、 １Ｈ−ＮＨＲでの化学シフト値は
ＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐｐｍとして表した。The chemical shift value for 1 H-NHR was expressed by setting the chemical shift value of HOD to 4.65 ppm.

【０１１５】（ａ）の物性 分子量 ５６４ ＭＳ ｍ／ｚ ５６３〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１５７
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、
１７５〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕−、２２５
〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、２４３
〔Ｌ−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３１９〔不飽和Ｄ
−グルクロン酸とＤ−マンノースが結合したもの−Ｈ
２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルク
ロン酸−Ｈ ＋ 〕− 、４８３〔Ｍ−ＳＯ３ −
Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，４″−Ｈ）、
５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１−Ｈ）、５．
１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１′−Ｈ）、５．０
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１″−Ｈ）、４．４７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，３′−
Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１２
（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ
＝３．７，５．８Ｈｚ，３″−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４′−Ｈ）、３．８６（１Ｈ，
ｍ，３−Ｈ）、３．８３（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝４．０，
１０．４Ｈｚ，２′−Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，４−
Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．７０（２
Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．６５（１Ｈ，ｄ
−ｄ，Ｊ＝５．８，６．１Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０８
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
マンノース＝１：１：１（各１分子） 硫酸塩 １分子（Ｌ−フコースの３位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（IV）の通りである。Physical properties of (a) Molecular weight 564 MS m / z 563 [MH+]− MS / MS m / z 97 [HSOFour]−157
[Unsaturated D-glucuronic acid-HTwoOH+]−,
175 [unsaturated D-glucuronic acid-H+]−225
[L-fucose sulfate-HTwoOH+]−243
[L-fucose sulfate-H+]−319 [Unsaturated D
-Glucuronic acid bound to D-mannose-H
TwoOH+]−, 405 [M-unsaturated D-gluc
Lonic acid-H +]−, 483 [M-SOThree−
H+]− 1 H-NMR (DTwoO) δ 5.78 (1H, d, J = 3.7Hz, 4 ″ -H),
5.26 (1H, d, J = 1.2Hz, 1-H), 5.
12 (1H, d, J = 4.0Hz, 1'-H), 5.0
3 (1H, d, J = 6.1Hz, 1 "-H), 4.47
(1H, d-d, J = 3.4, 10.4Hz, 3'-
H), 4.21 (1H, br-s, 2-H), 4.12
(1H, m, 5'-H), 4.10 (1H, dd, J
= 3.7, 5.8 Hz, 3 ″ -H), 4.03 (1H,
d, J = 3.4 Hz, 4'-H), 3.86 (1H,
m, 3-H), 3.83 (1H, d-d, J = 4.0,
10.4Hz, 2'-H), 3.72 (1H, m, 4-
H), 3.72 (1H, m, 5-H), 3.70 (2
H, m, 5-CHTwoHTwo) 3.65 (1H, d
-D, J = 5.8, 6.1 Hz, 2 "-H), 1.08
(3H, d, J = 6.7Hz, 5'-CHThreeof
HThree) Sugar composition L-fucose: unsaturated D-glucuronic acid: D-
Mannose = 1: 1: 1 (1 molecule each) 1 molecule of sulfate (3rd position of L-fucose) In addition,1The number assigned to the peak in 1 H-NMR is as follows.
It is as shown in expression (IV).

【化１３】 [Chemical 13]

【０１１６】（ｂ）の物性 分子量 ７２４ ＭＳ ｍ／ｚ ７２３〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− 、３６１〔Ｍ
−２Ｈ＋ 〕２− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１７５
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕− 、２４３〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３２１〔Ｍ−ＳＯ３
−２Ｈ＋〕２−、４０５〔Ｍ−不飽和Ｄ−グルクロン酸
−２ＳＯ３−Ｈ＋ 〕− 、４１７（Ｍ−Ｌ−フコース
−２ＳＯ３ −Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，４″−Ｈ）、
５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１″−Ｈ）、
５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，′−Ｈ）、５．
２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．５
０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，４′−Ｈ）、４．３２
（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−Ｈ）、４．２７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．７，１０．４Ｈｚ，２′−
Ｈ）、４．２１（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，６．７Ｈ
ｚ，３″−Ｈ）、４．１８（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝１．
８，１１．０Ｈｚ，５−ＣＨのＨ）、４．１５（１Ｈ，
ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、４．１０（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝
５．８，１１．０Ｈｚ、５−ＣＨのＨ）、３．９９（１
Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．１，１０．４Ｈｚ，３′−Ｈ）、
３．９０（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，
３−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）３．５４（１
Ｈ，ｂｒ−ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．１１
（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
マンノース＝１：１：１（各１分子） 硫酸塩 ３分子（Ｌ−フコースの２位と４位及びＤ−マ
ンノースの６位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（Ｖ）の通りである。Physical properties of (b) Molecular weight 724 MS m / z 723 [MH + ] - , 361 [M
-2H +] 2- MS / MS m / z 97 [HSO 4] -, 175
[Unsaturated D-glucuronic acid-H + ] - , 243 [L
- fucose -H +] -, 321 [M-SO 3
-2H +] 2-, 405 [M- unsaturated D- glucuronic acid -2SO 3 -H +] -, 417 (M-L- fucose -2SO 3 -H +] - 1 H-NMR (D 2 O) δ5.66 (1H, d, J = 3.4Hz, 4 ″ -H),
5.27 (1H, d, J = 7.3 Hz, 1 ″ -H),
5.22 (1H, d, J = 1.8Hz, '-H), 5.
21 (1H, d, J = 3.7Hz, 1'-H), 4.5
0 (1H, d, J = 3.1Hz, 4'-H), 4.32
(1H, q, J = 6.7Hz, 5'-H), 4.27
(1H, d-d, J = 3.7, 10.4Hz, 2'-
H), 4.21 (1H, dd, J = 3.4, 6.7H)
z, 3 "-H), 4.18 (1H, d-d, J = 1.
8,11.0 Hz, 5-CH H), 4.15 (1H,
br-s, 2-H), 4.10 (1H, dd, J =
5.8, 11.0 Hz, 5-CH H), 3.99 (1
H, dd, J = 3.1, 10.4 Hz, 3'-H),
3.90 (1H, m, 5-H), 3.82 (1H, m,
3-H), 3.82 (1H, m, 4-H) 3.54 (1
H, br-t, J = 7.3 Hz, 2 ″ -H), 1.11.
(3H, d, J = 6.7Hz , H 3 of the 5'-CH 3) Sugar composition L- fucose: unsaturated D- glucuronic acid: D-
Mannose = 1: 1: 1 (1 molecule each) Sulfate 3 molecules (2nd and 4th positions of L-fucose and 6th position of D-mannose) In addition, the number of peak assignment in 1 H-NMR is represented by the following formula ( V).

【化１４】 [Chemical 14]

【０１１７】（ｃ）の物性 分子量 １１２８ ＭＳ ｍ／ｚ １１２７〔Ｍ−Ｈ＋ 〕− ＭＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ９７〔ＨＳＯ４ 〕− 、１７５
〔不飽和Ｄ−グルクロン酸−Ｈ＋ 〕− 、２２５〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− 、２４３〔Ｌ
−フコース硫酸−Ｈ＋ 〕− 、３７１〔Ｍ−不飽和Ｄ
−グルクロン酸−Ｌ−フコース−ＳＯ３ −２Ｈ＋ 〕
２−、４０５〔硫酸化Ｌ−フコースとＤ−マンノースが
結合したもの−Ｈ＋ 〕− 、７２１〔Ｍ−Ｄ−マンノ
ース−Ｌ−フコース−ＳＯ３ −Ｈ２ Ｏ−Ｈ＋ 〕− １ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，（４）″−
Ｈ）、５．３４（１Ｈ，ｓ，（１）−Ｈ）、５．１６
（１Ｈ，ｓ，１−Ｈ）、５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．
０Ｈｚ，（１）′−Ｈ）、５．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．４Ｈｚ，（１）″−Ｈ）、４．５０（１Ｈ，ｄ−
ｄ，Ｊ＝３．４，１０．７Ｈｚ，３′−Ｈ）、４．４７
（１Ｈ，ｄ−ｄ，Ｊ＝３．４，１０．４Ｈｚ，（３）′
−Ｈ）、４．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１″−
Ｈ）、４．３３（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，（２）−Ｈ）、４．
１４（１Ｈ，ｍ，２−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，
（３）″−Ｈ）、４．１２（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ）、
４．１２（１Ｈ，ｍ，（５）′−Ｈ）、４．０４（１
Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、４．０３（１Ｈ，ｍ，（４）′−
Ｈ），３．８５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈ）、３．８５（１
Ｈ，ｍ，（２）′−Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，３−
Ｈ）、３．８２（１Ｈ，ｍ，（３）−Ｈ）、３．７３
（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，５−
Ｈ）、３．７３（１Ｈ，ｍ，（４）−Ｈ）、３．７０
（２Ｈ，ｍ，５−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．７０（２
Ｈ，ｍ，（５）−ＣＨ２ のＨ２ ）、３．６７（１
Ｈ，ｍ，５″−Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，４″−
Ｈ）、３．６２（１Ｈ，ｍ，（２）″−Ｈ）、３．６２
（１Ｈ，ｍ，（５）−Ｈ）、３．５１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
８．９Ｈｚ，３″−Ｈ）、３．２８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝
７．９Ｈｚ，２″−Ｈ）、１．０９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝
６．７Ｈｚ，（５）′−ＣＨ３ のＨ３ ）、１．０７
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，５′−ＣＨ３ の
Ｈ３ ） 糖組成 Ｌ−フコース：不飽和Ｄ−グルクロン酸：Ｄ−
グルクロン酸：Ｄ−マンノース＝２：１：１：２（Ｌ−
フコースとＤ−マンノース各２分子と不飽和Ｄ−グルク
ロン酸とＤ−グルクロン酸各１分子） 硫酸塩 ２分子（各Ｌ−フコースの３位） なお、 １Ｈ−ＮＭＲにおけるピークの帰属の番号は下
記式（VI）の通りである。Physical properties of (c) molecular weight 1128 MS m / z 1127 [MH + ] - MS / MS m / z 97 [HSO 4 ] - , 175
[Unsaturated D-glucuronic acid-H + ] - , 225 [L
- fucose -H 2 O-H +] -, 243 [L
-Fucose sulfuric acid-H + ] - , 371 [M-unsaturated D
- glucuronic acid -L- fucose -SO 3 -2H +]
2, 405 [-H + that sulfated L- fucose and D- mannose bound] -, 721 [M-D- mannose -L--fucose -SO 3 -H 2 O-H +] - 1 H- NMR (D 2 O) δ 5.69 (1H, d, J = 3.7Hz, (4) ″-
H), 5.34 (1H, s, (1) -H), 5.16.
(1H, s, 1-H), 5.10 (1H, d, J = 4.
0 Hz, (1) '-H), 5.50 (1H, d, J =
3.7 Hz, 1'-H), 4.93 (1H, d, J =
6.4 Hz, (1) "-H), 4.50 (1H, d-
d, J = 3.4, 10.7 Hz, 3'-H), 4.47
(1H, dd, J = 3.4, 10.4Hz, (3) '
-H), 4.39 (1H, d, J = 7.9Hz, 1 "-
H), 4.33 (1H, br-s, (2) -H), 4.
14 (1H, m, 2-H), 4.12 (1H, m,
(3) ″-H), 4.12 (1H, m, 5′-H),
4.12 (1H, m, (5) '-H), 4.04 (1
H, m, 4'-H), 4.03 (1H, m, (4) '-
H), 3.85 (1H, m, 2'-H), 3.85 (1
H, m, (2) '-H), 3.82 (1H, m, 3-
H), 3.82 (1H, m, (3) -H), 3.73.
(1H, m, 4-H) 3.73 (1H, m, 5-
H), 3.73 (1H, m, (4) -H), 3.70.
(2H, m, of 5-CH 2 H 2), 3.70 (2
H, m, (5) H 2 in -CH 2), 3.67 (1
H, m, 5 "-H), 3.62 (1H, m, 4"-
H), 3.62 (1H, m, (2) ″-H), 3.62
(1H, m, (5) -H), 3.51 (1H, t, J =
8.9 Hz, 3 ″ -H), 3.28 (1H, t, J =
7.9 Hz, 2 ″ -H), 1.09 (3H, d, J =
6.7Hz, (5) '- CH 3 of H 3), 1.07
(1H, d, J = 6.7Hz , H 3 of the 5'-CH 3) Sugar composition L- fucose: unsaturated D- glucuronic acid: D-
Glucuronic acid: D-mannose = 2: 1: 1: 2 (L-
Fucose and D-mannose (2 molecules each), unsaturated D-glucuronic acid and D-glucuronic acid (1 molecule each), sulfate 2 molecules (3rd position of each L-fucose), and the number of the peak assignment in 1 H-NMR is It is as in the following formula (VI).

【化１５】 [Chemical 15]

【０１１８】得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕに上記
エンド型フコイダン分解酵素を作用させると反応の進行
と共に脱離反応が起こって２３０ｎｍの吸光度が増加す
るが、脱離反応の生成物となる不飽和ヘキスロン酸基が
主要反応生成物のすべてにあることから得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕの分子内にヘキスロン酸とマンノー
スが交互に結合した糖鎖の存在が示唆された。得られた
フコース硫酸含有多糖−Ｕの構成糖の多くはフコースで
あるためフコース硫酸含有多糖−Ｕは一般の多糖より酸
に分解され易い。一方、ヘキスロン酸やマンノースの結
合は比較的酸に強いことが知られている。本発明者らは
ガゴメ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の分子内に存
在するヘキスロン酸とマンノースが交互に結合している
糖鎖中のヘキスロン酸の種類を明らかにするためにカー
ボハイドレート リサーチ、第１２５巻、第２８３〜２
９０頁（１９８４）の方法を参考にして、まずフコース
硫酸含有多糖混合物を０．３Ｍのシュウ酸に溶解し１０
０℃、３時間処理したものを分子量分画し、分子量が３
０００以上の画分を集め、更に陰イオン交換樹脂により
吸着分を集めた。この物質を凍結乾燥後４Ｎの塩酸で酸
加水分解し、ｐＨ８に調整後、ＰＡ化し、ＨＰＬＣによ
りウロン酸の分析を行った。なおＨＰＬＣの条件は下記
によった。When the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is allowed to act on the endo-fucoidan-degrading enzyme, the elimination reaction occurs with the progress of the reaction and the absorbance at 230 nm increases, but a product of the elimination reaction is obtained. The presence of a sugar chain in which hexuronic acid and mannose were alternately bound in the molecule of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U obtained from the fact that saturated hexuronic acid groups were present in all the main reaction products was suggested. Since many of the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U are fucose, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U is more easily decomposed into an acid than general polysaccharides. On the other hand, it is known that the bond between hexuronic acid and mannose is relatively strong against acid. In order to clarify the kind of hexuronic acid in a sugar chain in which hexuronic acid and mannose present in the molecule of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture of Gagome kelp are alternately bound, the present inventors have studied Carbohydrate Research, Volume 125, No. 283-2
Referring to the method on page 90 (1984), first, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was dissolved in 0.3 M oxalic acid.
The product treated at 0 ° C for 3 hours was subjected to molecular weight fractionation, and the molecular weight was 3
000 or more fractions were collected, and the adsorbed fraction was collected by anion exchange resin. This material was freeze-dried, acid-hydrolyzed with 4N hydrochloric acid, adjusted to pH 8, converted into PA, and analyzed for uronic acid by HPLC. The HPLC conditions were as follows.

【０１１９】装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＮ（４．６ｍｍ×２５０ｍ
ｍ）（宝酒造社製） 溶離液：２００ｍＭ酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）：アセトニトリル＝２５：７５ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出 流速：０．８ｍｌ／分 カラム温度：４０℃Apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type N (4.6 mm × 250 m)
m) (Takara Shuzo) Eluent: 200 mM acetic acid-triethylamine buffer (p
H7.3): Acetonitrile = 25: 75 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) with excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm, detection flow rate: 0.8 ml / min Column temperature: 40 ° C.

【０１２０】なお、ＰＡ化ヘキスロン酸の標準物質はグ
ルクロン酸はシグマ社製、ガラクツロン酸は和光純薬社
製、イズロン酸はシグマ社製の４−メチルウンベリフェ
リルα−Ｌ−イズロニドを加水分解したもの、マンヌロ
ン酸及びグルロン酸はアクタ・ケミカ・スカンヂナヴィ
カ（Acta Chemica Scandinavica)、第１５巻、第１３９
７〜１３９８頁（１９６１）記載の方法に従い、和光純
薬社製のアルギン酸を加水分解後陰イオン交換樹脂で分
離したものをＰＡ化することにより得た。The standard substance of PA hexuronic acid is glucuronic acid manufactured by Sigma, galacturonic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, and iduronic acid hydrolyzed by 4-methylumbelliferyl α-L-iduronide manufactured by Sigma. And mannuronic acid and guluronic acid are Acta Chemica Scandinavica, Vol. 15, 139.
According to the method described on pages 7-1398 (1961), alginic acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was hydrolyzed and then separated with an anion exchange resin to obtain PA, which was obtained.

【０１２１】この結果、上記フコース硫酸含有多糖混合
物の糖鎖中に含まれるヘキスロン酸はグルクロン酸のみ
であることが判明した。As a result, it was revealed that the hexuronic acid contained in the sugar chain of the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was only glucuronic acid.

【０１２２】更に上記糖鎖の加水分解物中のグルクロン
酸を陰イオン交換樹脂によりＤ−マンノースと分離し凍
結乾燥後その比旋光度を測定したところ右旋性でありグ
ルクロン酸はＤ−グルクロン酸であることが判明した。Further, glucuronic acid in the hydrolyzate of the above sugar chain was separated from D-mannose by an anion exchange resin, freeze-dried, and its specific optical rotation was measured to find that glucuronic acid was D-glucuronic acid. It turned out to be

【０１２３】また、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有
多糖混合物をあらかじめ上記のエンド型フコイダン分解
酵素で処理したものについても上記と同様にシュウ酸で
酸加水分解したが、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース
が交互に結合したポリマーは検出されなかった。このこ
とから、上記のエンド型フコイダン分解酵素が脱離反応
により切断するフコース硫酸含有多糖の骨格構造はＤ−
グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合した構造を
持つことが判明した。Also, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from Gagome kelp which had been previously treated with the endo-fucoidan-degrading enzyme was acid-hydrolyzed with oxalic acid in the same manner as described above, but D-glucuronic acid and D-mannose were used. No polymer with alternating bonds was detected. From this, the skeletal structure of the sulfated-fucose-containing polysaccharide cleaved by the above-mentioned endo-fucoidan-degrading enzyme by the elimination reaction is D-
It was found to have a structure in which glucuronic acid and D-mannose were alternately bonded.

【０１２４】更に、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノース
のそれぞれの結合位置とグリコシド結合のアノメリック
配置を調べるため、シュウ酸分解により得られたポリマ
ーをＮＭＲ分析した。Further, in order to examine the binding positions of D-glucuronic acid and D-mannose and the anomeric configuration of the glycosidic bond, the polymer obtained by oxalic acid decomposition was analyzed by NMR.

【０１２５】ポリマーのＮＭＲの測定結果を以下に示
す。但し、 １Ｈ−ＮＭＲでの化学シフト値はトリエチ
ルアミンのメチル基の化学シフト値を１．１３ｐｐｍ
に、１３Ｃ−ＮＭＲではトリエチルアミンのメチル基の
化学シフト値を９．３２ｐｐｍとして表した。The results of NMR measurement of the polymer are shown below. However, as for the chemical shift value in 1 H-NMR, the chemical shift value of the methyl group of triethylamine is 1.13 ppm.
In addition, in 13 C-NMR, the chemical shift value of the methyl group of triethylamine was expressed as 9.32 ppm.

【０１２６】１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） δ５．２５（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，１−Ｈ）、４．３２（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１′−Ｈ）、４．００（１
Ｈ，ｂｒ−ｓ，２−Ｈ）、３．７１（１Ｈ，ｍ，５′−
Ｈ）、３．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨのＨ）、３．６８
（１Ｈ，ｍ，３−Ｈ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ
のＨ）、３．６３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ）、３．５７
（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、３．５４（１Ｈ，ｍ，３′−
Ｈ）、３．５３（１Ｈ，ｍ，５−Ｈ）、３．２５（１
Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、２′−Ｈ）１３Ｃ−ＮＭＲ
（Ｄ２ Ｏ） δ１７５．３（５′−ＣＯＯＨのＣ）、１０２．５
（１′−Ｃ）、９９．６（１−Ｃ）、７８．５（２−
Ｃ）、７７．９（４′−Ｃ）、７７．０（３′−Ｃ）、
７６．７（５′−Ｃ）、７３．９（５−Ｃ）、７３．７
（２′−Ｃ）、７０．６（３−Ｃ）、６７．４（４−
Ｃ）、６１．０（５−ＣＨ２ ＯＨのＣ） なお、ピークの帰属の番号は下記式（VII）の通りであ
る： 1 H-NMR (D 2 O) δ 5.25 (1 H, br-s, 1-H), 4.32 (1
H, d, J = 7.6 Hz, 1'-H), 4.00 (1
H, br-s, 2-H), 3.71 (1H, m, 5'-
H), 3.69 (1H, m, H of 5-CH), 3.68.
(1H, m, 3-H), 3.63 (1H, m, 5-CH
H), 3.63 (1H, m, 4'-H), 3.57
(1H, m, 4-H), 3.54 (1H, m, 3'-
H), 3.53 (1H, m, 5-H), 3.25 (1
H, t, J = 8.5 Hz, 2′-H) 13 C-NMR
(D 2 O) δ 175.3 (C in 5′-COOH), 102.5
(1'-C), 99.6 (1-C), 78.5 (2-
C), 77.9 (4'-C), 77.0 (3'-C),
76.7 (5'-C), 73.9 (5-C), 73.7
(2'-C), 70.6 (3-C), 67.4 (4-
C), 61.0 (C of 5-CH 2 OH) The peak attribution numbers are as shown in the following formula (VII):

【化１６】 [Chemical 16]

【０１２７】Ｄ−グルクロン酸の１位の立体配置はその
ビシナル結合定数が７．６Ｈｚであることからβ−Ｄ−
グルクロン酸であると決定した。The configuration at the 1-position of D-glucuronic acid is β-D- because the vicinal coupling constant is 7.6 Hz.
It was determined to be glucuronic acid.

【０１２８】また、マンノースの１位の立体配置はその
化学シフト値から５．２５ｐｐｍであることからα−Ｄ
−マンノースであると決定した。Since the steric configuration at the 1-position of mannose is 5.25 ppm from its chemical shift value, α-D
-Determined to be mannose.

【０１２９】構成糖の結合様式は １Ｈ検出異種核検出
法であるＨＭＢＣ法を用いて行った。The binding mode of the constituent sugars was determined by the HMBC method, which is a 1 H-detecting heteronuclear detection method.

【０１３０】１Ｈ−ＮＭＲの帰属にはＤＱＦ−ＣＯＳＹ
法及びＨＯＨＡＨＡ法を、１３Ｃ−ＮＭＲの帰属にはＨ
ＳＱＣ法を用いた。DQF-COSY was assigned to 1 H-NMR.
Method and HOHAHA method, H for attribution of 13 C-NMR
The SQC method was used.

【０１３１】ＨＭＢＣスペクトルにより１−Ｈと４′−
Ｃの間及び４′−Ｈと１−Ｃの間、１′−Ｈと２−Ｃの
間及び２−Ｈと１′−Ｃの間にそれぞれクロスピークが
認められた。このことからＤ−グルクロン酸はβ結合で
Ｄ−マンノースの２位に、Ｄ−マンノースはα結合でＤ
−グルクロン酸の４位にそれぞれ結合していることが明
らかとなった。From the HMBC spectrum, 1-H and 4'-
Cross peaks were observed between C and between 4'-H and 1-C, between 1'-H and 2-C and between 2-H and 1'-C. From this, D-glucuronic acid is in the 2-position of D-mannose by β bond, and D-mannose is in the D bond by α bond.
-It was revealed that they were respectively bound to the 4-position of glucuronic acid.

【０１３２】上記の結果を考え併せると、（ａ）は、還
元末端残基であるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロ
ン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造
を持つこと、（ｂ）は硫酸基が結合した還元末端残基で
あるＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸と、２個
の硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持つ
こと、（ｃ）は還元末端残基であるＤ−マンノースにＤ
−グルクロン酸と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結
合し、そのＤ−グルクロン酸にＤ−マンノースが結合
し、更にそのＤ−マンノースに不飽和Ｄ−グルクロン酸
と、硫酸基が結合したＬ−フコースが結合した構造を持
つことが判明した。Taking the above results into consideration, (a) has a structure in which unsaturated D-glucuronic acid and L-fucose having a sulfate group are bonded to the reducing terminal residue D-mannose, (B) has a structure in which unsaturated D-glucuronic acid, which is a reducing terminal residue having a sulfate group bonded thereto, and unsaturated D-glucuronic acid, and L-fucose having two sulfate groups bonded thereto, (c) D on the reducing terminal residue D-mannose
-Glucuronic acid and L-fucose bound to a sulfate group are bound, D-mannose is bound to the D-glucuronic acid, and unsaturated D-glucuronic acid and a sulfate group are bound to the D-mannose. -Fucose was found to have a bound structure.

【０１３３】以上、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ
は、Ｄ−グルクロン酸とＤ−マンノースが交互に結合し
た構造を持ち、少なくとも１つ以上のＤ−マンノースに
Ｌ−フコースが結合している構造を有する。As described above, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-U
Has a structure in which D-glucuronic acid and D-mannose are alternately bonded, and has a structure in which L-fucose is bonded to at least one or more D-mannose.

【０１３４】また、下記一般式（VIII）で表される部分
構造を有する（但し、式中の少なくとも１つのアルコー
ル性水酸基は硫酸エステル化しており、またｎは１以上
の整数を表す）。Further, it has a partial structure represented by the following general formula (VIII) (provided that at least one alcoholic hydroxyl group in the formula is sulfated, and n represents an integer of 1 or more).

【化１７】 [Chemical 17]

【０１３５】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｆと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Ｕが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕ
は構成糖としてウロン酸を含有し、フラボバクテリウム
ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化し、
少なくとも上記式（Ｉ）、（II）、（III）で表される
化合物より選択される１種以上の化合物が生成する。そ
の分子量、分子量分布、糖組成は本発明のフコース硫酸
含有多糖−Ｕをなんら限定するものではなく、任意の分
子量、分子量分布のフコース硫酸含有多糖−Ｕを調製す
ることができ、糖組成等の理化学的性質が明確なフコー
ス硫酸含有多糖を提供することができる。According to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is provided. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention
Contains uronic acid as a constituent sugar, and flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP-540
2) The fucoidan-degrading enzyme produced by
At least one compound selected from the compounds represented by the above formulas (I), (II) and (III) is produced. The molecular weight, the molecular weight distribution, and the sugar composition do not limit the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention at all, and it is possible to prepare the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U having any molecular weight and molecular weight distribution. A sulfated-fucose-containing polysaccharide having clear physicochemical properties can be provided.

【０１３６】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕはフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆの有する強い抗凝血活性を有さ
ず、抗凝血活性を実質上示さないフコース硫酸含有多糖
が提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは純
化されたフコース硫酸含有多糖として制がん剤、抗転移
剤、発がん予防剤等に使用でき、また抗フコース硫酸含
有多糖抗体の抗原としても有用である。更にこのフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕより、上記式（Ｉ）、（II）、（II
I）等の構造を有するオリゴ糖が製造でき、これらの新
規化合物の製造にも有用である。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention does not have the strong anticoagulant activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide substantially free of anticoagulant activity is provided. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention can be used as a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide as a carcinostatic agent, an anti-metastatic agent, a carcinogenic preventive agent, etc., and is also useful as an antigen for an anti-sulfate-fucose-containing polysaccharide antibody. Further, from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the above formulas (I), (II) and (II
Oligosaccharides having structures such as I) can be produced, and they are also useful for producing these novel compounds.

【０１３７】次に本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ及
びその製造方法について記載する。本発明の方法を用い
て本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際には
フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分解
酵素をフコース硫酸含有多糖混合物に作用させればよ
く、酵素反応が終了後低分子化したフコース硫酸含有多
糖−Ｕを限外ろ過などで除去すればよい。上記分解酵素
はフコース硫酸含有多糖−Ｕを選択的に分解できる酵素
であればいかなる酵素でもよいが、具体例としては例え
ば、フラボバクテリウム（Flavobacterium）ｓｐ． Ｓ
Ａ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）が生産す
る上記のエンド型フコイダン分解酵素が挙げられる。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention and the method for producing the same will be described. When the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is produced using the method of the present invention, a degrading enzyme having an ability to decompose the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U may be allowed to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After the reaction is completed, the low molecular weight sulfated-fucose-containing polysaccharide-U may be removed by ultrafiltration or the like. The above-mentioned degrading enzyme may be any enzyme as long as it is an enzyme capable of selectively degrading sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and specific examples thereof include Flavobacterium sp. S
The endo-type fucoidan degrading enzyme produced by the A-0082 strain (FERM BP-5402) can be mentioned.

【０１３８】本酵素を作用させる場合は酵素反応が有利
に進むように基質濃度や温度、ｐＨ等を設定すればよい
が、基質濃度は通常０．１から１０％程度、温度は２０
から４０℃付近、ｐＨは６から９付近が望ましい。When the present enzyme is allowed to act, the substrate concentration, temperature, pH, etc. may be set so that the enzymatic reaction proceeds advantageously, but the substrate concentration is usually about 0.1 to 10%, and the temperature is 20%.
To about 40 ° C. and pH of about 6 to 9 are desirable.

【０１３９】また、フコース硫酸含有多糖混合物を培地
に添加し、フコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を
有する分解酵素生産能を有する微生物をその培地で培養
し、培養後の培地から精製してもよい。使用する微生物
はフコース硫酸含有多糖−Ｕを分解する能力を有する分
解酵素を生産する微生物であればいかなる微生物でもよ
いが、具体的には上記記載のフラボバクテリウム ｓ
ｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）
又はフコイダノバクター マリナス（Fucoidanobacter
marinus) ＳＩ−００９８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
３）が挙げられる。Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was added to the medium, and the microorganism capable of producing a degrading enzyme having the ability to decompose the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U was cultured in the medium and purified from the medium after the culture. Good. The microorganism used may be any microorganism as long as it produces a degrading enzyme capable of decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, and specifically, the above-mentioned Flavobacterium s.
p. SA-0082 strain (FERM BP-5402)
Or Fucoidanobacter marinas (Fucoidanobacter
marinus) SI-0098 strain (FERM BP-540
3) is mentioned.

【０１４０】培地に加える栄養源は使用する菌株が利用
し、該分解酵素を生産するものであればよく、炭素源と
しては例えばフコイダン、海藻粉末、アルギン酸、フコ
ース、グルコース、マンニトール、グリセロール、サッ
カロース、マルトース、ラクトース、デンプン等が利用
でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミ
ノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、
硫安、塩化アンモニウム等が適当である。その他にナト
リウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜
鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよい。The nutrient source added to the medium may be any that can be utilized by the strain to be used and produces the degrading enzyme. Examples of the carbon source include fucoidan, seaweed powder, alginic acid, fucose, glucose, mannitol, glycerol, saccharose, Maltose, lactose, starch, etc. can be used, and as nitrogen sources, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract, defatted soybean,
Ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.

【０１４１】また、培養条件は使用する菌株、培地組成
等に応じ、フコース硫酸含有多糖−Ｕの分解活性が最大
になるように設定するのはもちろんのことであるが、一
般に培養温度は１５〜３０℃、培地のｐＨは５〜９で、
５〜７２時間の通気かくはん培養を行えばよい。培養終
了後、低分子化したフコース硫酸含有多糖−Ｕや培地中
のフコース硫酸含有多糖−Ｆ以外の成分は限外ろ過など
で除去すればよい。It is needless to say that the culture conditions are set so as to maximize the decomposition activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U depending on the strain used, the medium composition, etc. 30 ° C, pH of the medium is 5-9,
Aeration and stirring culture may be performed for 5 to 72 hours. After completion of the culture, components other than the low molecular weight sulfate-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F in the medium may be removed by ultrafiltration or the like.

【０１４２】なお、上記のフコイダノバクター マリナ
スＳＩ−００９８株は、青森県の海水中より本発明者ら
が新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通
りである。 １．フコイダノバクター マリナス ＳＩ−００９８ ａ．形態的性質 （１）本菌は双球菌（短かん菌）である。 幅 ０．５〜０．７μｍ 長さ ０．５〜０．７μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 ３７℃で生育できる。好適な生育温度は１５〜２８℃である。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陰性 （５）ウレアーゼ 陰性 （６）加水分解 デンプン 陽性 ゼラチン 陰性 カゼイン 陰性 エスクリン 陽性 （７）硝酸塩の還元 陰性 （８）インドールの生成 陰性 （９) 硫化水素の生成 陽性 （10) ミルクの凝固 陰性 （11）ナトリウムの要求性 陽性 （12）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （13）キノン系 メナキノン７ （14）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ６１％ （15）細胞壁のジアミノピメリン酸 陰性 （16）グリコリル試験 陰性 （17）ヒドロキシ脂肪酸の存在 陽性 （18）ＯＦ−テスト Ｏ （19）集落の色調 特徴的な集落色素を生成せず （20）運動性 あり （21）滑走性 なし （22）鞭毛 極単毛The above Fucoidanobacterium marinus SI-0098 strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. . 1. Fucoidanobactor Marinas SI-0098 a. Morphological properties (1) This bacterium is a diplococcus (short bacillus). Width 0.5 to 0.7 μm Length 0.5 to 0.7 μm (2) Presence or absence of spores (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) Temperature range of growth It can grow at 37 ° C. A suitable growth temperature is 15 to 28 ° C. (2) Attitude toward oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase negative (5) Urease negative (6) Hydrolysis starch positive Gelatin negative Casein negative Esculin positive (7) Nitrate reduction negative (8) Indole formation negative (9) Generation of hydrogen sulfide Positive (10) Milk coagulation negative (11) Sodium requirement positive (12) Salt requirement 0% growth in salt medium Negative 1% growth in salt medium Negative growth in seawater medium Positive (13) Quinone menaquinone 7 (14) GC content of intracellular DNA 61% (15) Diaminopimelic acid in cell wall negative (16) Glycolyl test negative (17) Presence of hydroxy fatty acid positive (18) OF-test O (19) ) Color of the colony No characteristic colony pigment is produced (20) Motility (21) No gliding (22) Flagella and very monochryte

【０１４３】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
ディターミネイティブ バクテリオロジー、第９巻
（１９９４）に記載の基本分類によればグループ４（グ
ラム陰性好気性かん菌及び球菌）に分類される。しかし
ながら本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン７を有し、Ｇ
Ｃ含量が６１％の点でグループ４に属する菌と大いに異
なる。基本的にグラム陰性細菌は電子伝達鎖にユビキノ
ンを有し、グラム陽性細菌はメナキノンを有している。This strain is classified into Group 4 (Gram-negative aerobic bacillus and cocci) according to the basic classification described in Vergiz Manual of Determinative Bacteriology, Volume 9 (1994). However, this strain has menaquinone 7 in the electron transfer chain and
It is greatly different from the bacteria belonging to Group 4 in that the C content is 61%. Basically, Gram-negative bacteria have ubiquinone in the electron transfer chain, and Gram-positive bacteria have menaquinone.

【０１４４】グラム陰性細菌であるフラボバクテリウム
属及びシトファーガ（Cytophaga)属は例外的に電子伝達
鎖にメナキノンを有しているが、これらの属に属する細
菌のＧＣ含量は、土壌細菌であるシトファーガ アーベ
ンシコラ（Cytophaga arvensicola)が４３〜４６％、海
洋細菌であるシトファーガ ジフルエンス（Cytophaga
diffluens)、シトファーガ ファーメンタンス（Cytoph
aga fermentans) 、シトファーガ マリーナ（Cytophag
a marina) 、及びシトファーガ ウリギノーサ（Cytoph
ags uliginosa)が４２％であり、本菌株の性質とは全く
異なる。更に、本菌株と既同定株の１６ＳｒＤＮＡ配列
の相同性を比較したところ、最も相同性の高い既同定株
ベルコミクロビウム スピノサム（Verrucomicrobium s
pinosum)においてもその相同性は、７６．６％であっ
た。１６ＳｒＤＮＡ配列の相同性が９０％以下の場合、
両細菌の属が異なることは一般に広く知られていること
から、本発明者らは、本菌株は既存の属に属さない新属
の細菌であると断定し、よって本菌株をフコイダノバク
ター マリナス ＳＩ−００９８と命名した。Gram-negative bacteria such as Flavobacterium and Cytophaga have exceptionally a menaquinone in the electron transport chain, but the GC content of the bacteria belonging to these genera is 43-46% of Cytophaga arvensicola is a marine bacterium, Cytophaga difluence (Cytophaga arvensicola)
diffluens), Sitophaga fermentans (Cytoph
aga fermentans), Sitophaga marina (Cytophag
a marina) and Cytophaga uriginosa (Cytoph
ags uliginosa) is 42%, which is completely different from the properties of this strain. Furthermore, when the homology of the 16S rDNA sequence between this strain and the already-identified strain was compared, the already-identified strain Vercocomicrobium s
pinosum), the homology was 76.6%. When the homology of 16S rDNA sequence is 90% or less,
Since it is generally widely known that the genus of both bacteria is different, the present inventors concluded that this strain is a bacterium of a new genus that does not belong to the existing genus, and therefore the strain of Fucoidobacter It was named Marinas SI-0098.

【０１４５】なお上記菌株は Fucoidanobacter marinus
ＳＩ−００９８と表示され、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号３０５）］に平成７年３月２９日よ
りＦＥＲＭ Ｐ−１４８７３として寄託され、前記通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢ
Ｐ−５４０３（国際寄託への移管請求日： 平成８年２
月１５日）として寄託されている。The above-mentioned strain is Fucoidanobacter marinus
SI-0098 is displayed, and the FERM P- has been displayed on March 29, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry [1-3, Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code 305)]. Deposited as 14873, FERMB in the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry
P-5403 (Date of request for transfer to international deposit: 1996-2)
(15th of a month).

【０１４６】本発明者らは前述のように０．６〜３Ｍの
１種類又は２種類以上の塩類の存在下で本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖−Ｕが酸性
多糖凝集剤に対して全く異なる挙動を示すことも見出し
た。As described above, the present inventors have confirmed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention are aggregated with acidic polysaccharides in the presence of one or two or more salts of 0.6 to 3M. It was also found to behave quite differently for the agent.

【０１４７】例えば本発明の方法を用いて、フコース硫
酸含有多糖混合物の水溶液から本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｆを分離することができる。For example, the method of the present invention can be used to separate the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention from an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture.

【０１４８】まずフコース硫酸含有多糖混合物の水溶液
に１種又は２種以上の塩類を添加しその総濃度を０．６
〜３Ｍとする。添加する塩類は例えば塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等で特に限定されるものではない。こう
して塩濃度を調整した後塩化セチルピリジニウム等の酸
性多糖凝集剤をこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、沈殿を集めると本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が得られる。First, one or more salts are added to an aqueous solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture to give a total concentration of 0.6.
~ 3M. Salts to be added are sodium chloride,
It is not particularly limited to calcium chloride and the like. After adjusting the salt concentration in this way, an acidic polysaccharide flocculant such as cetylpyridinium chloride is added until precipitation does not occur any more, and when the precipitate is collected, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is collected.
Is obtained.

【０１４９】しかし上記塩濃度を２Ｍ超にすると本発明
のフコース硫酸含有多糖−Ｆが塩化セチルピリジニウム
により沈殿を形成しにくくなるので注意を要する。本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有多糖
−Ｕを分離する目的では通常１．５Ｍ程度の塩濃度で目
的は達成できる（図１の説明参照）。However, if the salt concentration is more than 2 M, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is less likely to form a precipitate due to cetylpyridinium chloride, so caution is required. For the purpose of separating the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention, the purpose can be usually achieved with a salt concentration of about 1.5 M (see the explanation of FIG. 1).

【０１５０】次に必要に応じてこの沈殿を洗浄後、沈殿
中の塩化セチルピリジニウムを食塩飽和アルコールで洗
い落とし、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを得る。
こうして得られた本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆか
ら色素を除くために、この沈殿を溶解後限外ろ過等を行
っても良い。また脱塩後凍結乾燥すれば乾燥標品を得る
こともできる。また、工程中防腐剤などを添加してもよ
い。Next, if necessary, this precipitate is washed, and then cetylpyridinium chloride in the precipitate is washed off with a salt-saturated alcohol to obtain the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention.
In order to remove the pigment from the thus-obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention, the precipitate may be dissolved and then subjected to ultrafiltration or the like. Also, a desiccated product can be obtained by lyophilization after desalting. In addition, a preservative and the like may be added during the process.

【０１５１】本発明者らは、前述の様にフコース硫酸含
有多糖を陰イオン交換樹脂で精製する際に２価の陽イオ
ンが共存すると単位樹脂量当りに吸着するフコース硫酸
含有多糖量が増加し、フコース硫酸含有多糖の分離が良
くなることも見出している。すなわち、本発明の方法を
用いて本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆを製造する際
には、まずフコース硫酸含有多糖混合物に２価の陽イオ
ン源となる薬品を好ましくは１ｍＭ以上添加する。次
に、陰イオン交換樹脂を２価の陽イオンを好ましくは１
ｍＭ以上含む液で平衡化し、上記フコース硫酸含有多糖
混合物を吸着させる。この陰イオン交換樹脂を平衡化し
た液で充分洗浄後、例えば塩化ナトリウムのグラジェン
トによりフコース硫酸含有多糖−Ｆを溶出させる。本方
法を用いる場合、添加する２価陽イオンの濃度は１ｍＭ
以上ならばよい。また本方法に用いる二価の陽イオン源
となる薬品はカルシウム塩やバリウム塩が特にその効果
が優れているが、特に限定されるものではなく、硫酸マ
グネシウム、塩化マンガン等も使用することができる。As described above, the present inventors have found that the amount of sulfated-fucose-containing polysaccharide adsorbed per unit amount of resin increases when a divalent cation coexists when the sulfated-fucose-containing polysaccharide is purified by anion exchange resin. It has also been found that the separation of sulfated-fucose-containing polysaccharides is improved. That is, when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is produced using the method of the present invention, first, a chemical that serves as a divalent cation source is added to the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, preferably at 1 mM or more. Next, an anion exchange resin is added to a divalent cation, preferably 1
Equilibrate with a solution containing at least mM to adsorb the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture. After sufficient washing with an equilibrated liquid of this anion exchange resin, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is eluted with a gradient of sodium chloride, for example. When using this method, the concentration of divalent cation added is 1 mM.
The above is all right. The divalent cation source chemicals used in this method are calcium salts and barium salts, which are particularly effective, but are not particularly limited, and magnesium sulfate, manganese chloride, etc. can also be used. .

【０１５２】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは例え
ば実施例８に記載のように得ることができる。以下、こ
のフコース硫酸含有多糖の理化学的性質を示すが、本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆはこの例に限定されるも
のでは無い。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention can be obtained, for example, as described in Example 8. The physicochemical properties of the sulfated-fucose-containing polysaccharide will be shown below, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention is not limited to this example.

【０１５３】得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆの分子
量をセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ過法により
求めたところ、約１９万を中心とした分子量分布を示し
た（図１７参照）。なお、図１７において、縦軸はフェ
ノール−硫酸法により測定した試料中の糖含量を４８０
ｎｍの吸光度で示し、横軸はフラクション ナンバーを
示す。When the molecular weight of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was determined by the gel filtration method using Sephacryl S-500, it showed a molecular weight distribution centered on about 190,000 (see FIG. 17). In addition, in FIG. 17, the vertical axis represents the sugar content in the sample measured by the phenol-sulfuric acid method.
The absorbance is shown in nm, and the horizontal axis shows the fraction number.

【０１５４】また、ゲルろ過の条件を下記に示す。 カラムサイズ： ３．０８×１６２．５ｃｍ 溶媒：０．２Ｍの塩化ナトリウムと１０％のエタノール
を含む１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０） 流速：１．５ｍｌ／分 サンプル濃度：０．２５％ サンプル液量：２０ｍｌ 分子量標準物質：Shodex STANDARD P-82（昭和電工社
製）The conditions for gel filtration are shown below. Column size: 3.08 × 162.5 cm Solvent: 10 mM sodium phosphate buffer containing 0.2 M sodium chloride and 10% ethanol (pH 6.
0) Flow rate: 1.5 ml / min Sample concentration: 0.25% Sample liquid amount: 20 ml Molecular weight standard substance: Shodex STANDARD P-82 (manufactured by Showa Denko KK)

【０１５５】次に、得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｆの成分を分析した。まず、ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry)、第１７５巻、第５９５頁（１９４８）の
記載に従いフコース量を定量した。Next, the components of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention were analyzed. First of all, Journal of
Biological chemistry (Journal of Biologica
Chemistry), 175, 595 (1948).

【０１５６】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の乾燥標品を１規定の塩酸に０．５％の濃度で溶解し、
１１０℃で２時間処理し、構成単糖に加水分解した。次
に、グライコタッグ及びグライコタッグ リージェント
キットを用いて加水分解して得られた単糖の還元性末
端をピリジル−（２）−アミノ化（ＰＡ化）し、ＨＰＬ
Ｃにより構成糖の比率を調べた。なお、ＨＰＬＣの条件
は下記によった。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
Dissolve the dried sample of 1 in 1N hydrochloric acid at a concentration of 0.5%,
It was treated at 110 ° C. for 2 hours and hydrolyzed into constituent monosaccharides. Next, the reducing end of the monosaccharide obtained by hydrolysis using Glycotag and Glycotag Regent Kit was pyridyl- (2) -aminated (PA-ized) to give HPL.
The ratio of constituent sugars was examined by C. The HPLC conditions were as follows.

【０１５７】装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ） 溶離液：７００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）：アセ
トニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて励
起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃Apparatus: L-6200 type (manufactured by Hitachi Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm × 150 m)
m) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9.0): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) at excitation wavelength 310 nm and fluorescence wavelength 380 nm. Flow rate: 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C

【０１５８】次に、アナリティカル バイオケミストリ
ー（Analytical Biochemistry)、第４巻、第３３０頁
（１９６２）の記載に従いウロン酸量を定量した。Next, the amount of uronic acid was quantified according to the description in Analytical Biochemistry, Volume 4, p. 330 (1962).

【０１５９】次に、バイオケミカル ジャーナル（Bioc
hemical Journal)、第８４巻、第１０６頁（１９６２）
の記載に従い硫酸含量を定量した。Next, the Biochemical Journal (Bioc
hemical Journal), Vol. 84, p. 106 (1962).
The sulfuric acid content was quantified as described in.

【０１６０】以上の結果、得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｆの構成糖はフコース、ガラクトースで、そのモル
比は約１０：１であった。ウロン酸及びその他の中性糖
は実質的に含有されていなかった。また、フコースと硫
酸基のモル比は約１：２であった。As a result of the above, the constituent sugars of the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F were fucose and galactose, and the molar ratio thereof was about 10: 1. Substantially free of uronic acid and other neutral sugars. Further, the molar ratio of fucose and sulfate group was about 1: 2.

【０１６１】１％のフコイダン−Ｆ溶液１６ｍｌと、５
０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２ｍｌと４Ｍの
塩化ナトリウム４ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌの前出のフラボ
バクテリウムｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素溶液８
ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させた。反応によ
る分解物の生成は認められず、その低分子化も認められ
なかった。16 ml of 1% fucoidan-F solution and 5
12 ml of 0 mM phosphate buffer (pH 8.0), 4 ml of 4 M sodium chloride, and 32 mU / ml of the above-mentioned Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP
-5402) -derived endo-fucoidan-degrading enzyme solution 8
ml was mixed and reacted at 25 ° C. for 48 hours. The formation of decomposition products by the reaction was not recognized, and the reduction of the molecular weight thereof was not recognized.

【０１６２】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
のカルシウム塩のＩＲスペクトルをフーリェ変換赤外分
光光度計 ＪＩＲ−ＤＩＡＭＯＮＤ２０（日本電子社
製）により測定したところ図１８に示すスペクトルが得
られた。なお、図１８において縦軸は透過率（％）、横
軸は波数（ｃｍ−１）を示す。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
The IR spectrum of the calcium salt was measured with a Fourier transform infrared spectrophotometer JIR-DIAMOND20 (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 18 was obtained. Note that in FIG. 18, the vertical axis represents the transmittance (%) and the horizontal axis represents the wave number (cm −1 ).

【０１６３】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
のナトリウム塩のＮＭＲスペクトルを５００ＭＨｚの核
磁気共鳴装置ＪＮＭ−α５００型核磁気共鳴装置（日本
電子社製）により測定したところ、図１９に示すスペク
トルが得られた。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
The NMR spectrum of the sodium salt of 1. was measured by a 500 MHz nuclear magnetic resonance apparatus JNM-α500 type nuclear magnetic resonance apparatus (manufactured by JEOL Ltd.), and the spectrum shown in FIG. 19 was obtained.

【０１６４】図１９中、縦軸はシグナルの強度、横軸は
化学シフト値（ｐｐｍ）を示す。なお、 １Ｈ−ＮＭＲ
での化学シフト値はＨＯＤの化学シフト値を４．６５ｐ
ｐｍとして表した。１ Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２ Ｏ） ５．３０（フコースの１位のＨ）、１．１９（フコース
の５位のＣＨ３のＨ）In FIG. 19, the vertical axis represents signal intensity and the horizontal axis represents chemical shift value (ppm). In addition, 1 H-NMR
The chemical shift value at is the HOD chemical shift value of 4.65p.
Expressed as pm. 1 H-NMR (D 2 O) 5.30 (H at fucose 1-position H), 1.19 (fucose 5-position CH 3 H)

【０１６５】次に、得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の凍結乾燥物の比旋光度を高速・高感度旋光計ＳＥＰＡ
−３００（堀場製作所製）により測定したところ、−１
３５度であった。Next, the obtained sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was obtained.
High-speed and high-sensitivity polarimeter SEPA for the specific rotation of freeze-dried products
When measured by -300 (manufactured by HORIBA, Ltd.), -1
It was 35 degrees.

【０１６６】本発明により、本発明のフコース硫酸含有
多糖−Ｕと分離され、純化されたフコース硫酸含有多糖
−Ｆが提供される。本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
は構成糖としてウロン酸を実質的に含有せず、フラボバ
クテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５４０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分
子化されない。その分子量、分子量分布、糖組成は本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆをなんら限定するもので
はなく、任意の分子量、分子量分布のフコース硫酸含有
多糖−Ｆを調製することができ、糖組成、還元末端等の
理化学的性質が明確で、硫酸化度が極めて高いフコース
硫酸含有多糖−Ｆを提供することができる。The present invention provides a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F which is separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention and purified. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention
Contains substantially no uronic acid as a constituent sugar, and flavobacterium sp. SA-0082 (FERM BP
-5402) does not reduce the molecular weight of the fucoidan-degrading enzyme. The molecular weight, the molecular weight distribution and the sugar composition do not limit the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention at all, and it is possible to prepare the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having any molecular weight and molecular weight distribution. It is possible to provide a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F having a clear physicochemical property such as a terminal and an extremely high degree of sulfation.

【０１６７】本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆは、実
質上抗凝血活性を有さないフコース硫酸含有多糖−Ｕと
分離しているため、強い抗凝血活性を有しており、該フ
コース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又はその分解物は純化さ
れたフコース硫酸含有多糖として抗凝血剤に使用でき、
また抗フコース硫酸含有多糖抗体の抗原としても有用で
ある。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention has a strong anticoagulant activity because it is separated from the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U which has substantially no anticoagulant activity. The sulfate-containing polysaccharide-F and / or its degradation product can be used as a purified sulfated-fucose-containing polysaccharide in an anticoagulant,
It is also useful as an antigen for anti-sulfur-fucose-containing polysaccharide antibodies.

【０１６８】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物をがん細胞の培養液に１μｇ／ｍｌ以上の濃度で添加
すれば、添加後１日から数日で癌細胞はアポトーシスを
起こす。すなわち、本発明のフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物は強いアポトーシス誘発作用を有する。なお、
これらの物質は正常細胞にはアポトーシスを誘発せず、
毒性も示さない。特に、食用褐藻植物、ナマコ由来のフ
コース硫酸含有多糖、その分解物は安全性が高い。When the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention or its degradation product is added to the culture medium of cancer cells at a concentration of 1 μg / ml or more, the cancer cells undergo apoptosis one to several days after the addition. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product have a strong apoptosis-inducing action. In addition,
These substances do not induce apoptosis in normal cells,
It also shows no toxicity. In particular, edible brown algae, sulfated-fucose-containing polysaccharides derived from sea cucumber, and degradation products thereof are highly safe.

【０１６９】本発明のアポトーシス誘発剤を製剤化する
には、フコース硫酸含有多糖及び／又はその分解物を有
効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せればよ
い。一般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／
又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の
担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化
剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤
等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤
等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とするこ
とができる。またこれを使用前に適当な担体を添加する
ことにより液状となし得る乾燥品とすることができる。To formulate the apoptosis-inducing agent of the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product may be used as an active ingredient, and this may be combined with a known pharmaceutical carrier. Generally, a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and / or
Alternatively, a decomposed product thereof is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant. By adding agents and the like, solid preparations such as tablets, granules, powders, powders and capsules, and liquid preparations such as normal solutions, suspensions and emulsions can be prepared. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid by adding an appropriate carrier before use.

【０１７０】本発明のアポトーシス誘発剤は、経口剤、
あるいは注射剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっ
ても投与することができる。The apoptosis inducer of the present invention is an oral agent,
Alternatively, it can be administered by any of parenteral agents such as injections and infusions.

【０１７１】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデン
プン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセル
ロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また
経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活
性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等
を配合することもできる。これらの具体例としては、以
下に示す物が挙げられる。 （結合剤）デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、
ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロ
キシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセル
ロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール。 （崩壊剤）デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロー
ス、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。 （界面活性剤）ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチ
ン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０。 （潤沢剤）タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン
酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレ
ングリコール。 （流動性促進剤）軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウ
ム。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above-mentioned administration form and dosage form. In the case of oral preparations, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts and the like are used. It Further, in the preparation of the oral preparation, a binder, a disintegrating agent, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a coloring agent, a fragrance and the like can be further added. Specific examples thereof include the followings. (Binder) Starch, dextrin, gum arabic powder,
Gelatin, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, crystalline cellulose, ethyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, macrogol. (Disintegrant) Starch, hydroxypropyl starch, sodium carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, carboxymethyl cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose. (Surfactant) sodium lauryl sulfate, soybean lecithin, sucrose fatty acid ester, polysorbate 80. (Lubricant) Talc, wax, hydrogenated vegetable oil, sucrose fatty acid ester, magnesium stearate, calcium stearate, aluminum stearate, polyethylene glycol. (Fluidity promoter) Light anhydrous silicic acid, dried aluminum hydroxide gel, synthetic aluminum silicate, magnesium silicate.

【０１７２】また、経口用の液剤としては、懸濁液、エ
マルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤とすることが
でき、これらの各種剤型には矯味、矯臭剤、着色剤を配
合してもよい。Further, the liquid preparations for oral use may be suspensions, emulsions, syrups and elixirs, and these various dosage forms may be mixed with a flavoring agent, a flavoring agent and a coloring agent. .

【０１７３】一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発
明の有効成分であるフコース硫酸含有多糖及び／又はそ
の分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、
ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ
油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、
必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を
加えることにより調製される。On the other hand, in the case of parenteral preparations, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its decomposition product, which is the active ingredient of the present invention, is used as a diluent in distilled water for injection, physiological saline,
Glucose aqueous solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc. dissolved or suspended,
It is prepared by adding a bactericide, a stabilizer, a tonicity agent, a soothing agent, etc., if necessary.

【０１７４】本発明のアポトーシス誘発剤は、製剤形態
に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に
限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。
注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与
し得、外用剤には座剤等も包含される。The apoptosis inducer of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited, and may be internal use, external use and injection.
The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, etc., and the external preparation also includes suppositories and the like.

【０１７５】本発明のアポトーシス誘発剤の投与量は、
その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用され
る患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定
ではないが一般には製剤中に含有される有効成分の量が
成人１日当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２０
０ｍｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって
変動するので、上記投与量より少ない量で充分な場合も
あるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。The dose of the apoptosis inducer of the present invention is
The formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight, and symptoms of the patient to which the formulation is applied are appropriately set, but the amount of the active ingredient contained in the formulation is not constant but is generally 1 to 1000 mg per adult per day. , Preferably 10-20
It is 0 mg. Of course, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases, or a dose exceeding the range may be necessary in some cases.

【０１７６】制がん作用を有する、本発明のフコース硫
酸含有多糖−Ｕ、フコース硫酸含有多糖−Ｆ及び／又は
その分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と
組合せ製剤化すれば制がん剤を製造することができる。
制がん剤の製造は上記方法に準じ行うことができる。一
般的には、本発明のフコース硫酸含有多糖及び／又はそ
の分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と
配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝
剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加え
て、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形
剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができ
る。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状
となし得る乾燥品とすることができる。If the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention having a carcinostatic action and / or a degradation product thereof is used as an active ingredient, it is formulated into a combination with a known pharmaceutical carrier. A carcinostatic agent can be manufactured.
The anticancer drug can be produced according to the above method. Generally, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and / or its decomposition product is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, Solid agents such as tablets, granules, powders, powders and capsules, and liquid agents such as normal liquids, suspensions and emulsions by adding agents, excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc. be able to. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.

【０１７７】制がん剤としては、経口剤や、注射剤、点
滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与することが
できる。The carcinostatic agent can be administered by any of oral agents and parenteral agents such as injections and infusions.

【０１７８】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above administration form and dosage form, and may be used in accordance with the above apoptosis inducer.

【０１７９】制がん剤としては、製剤形態に応じた適当
な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、
内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例
えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤
には座剤等も包含される。The carcinostatic agent is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited,
It can be for internal use, external use and injection. The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, etc., and the external preparation also includes suppositories and the like.

【０１８０】制がん剤としての投与量は、その製剤形
態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年
齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが
一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日当
り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇであ
る。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するの
で、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、あ
るいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤は
そのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日
常的に摂取させることもできる。The dose as a carcinostatic agent is appropriately set depending on the formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight, and symptom of the patient to whom it is applied, and it is not fixed but is generally contained in the formulation. The amount of the active ingredient used is 1 to 1000 mg, preferably 10 to 200 mg per day for an adult. Of course, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases, or a dose exceeding the range may be necessary in some cases. The drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.

【０１８１】発がん抑制作用を有する、フコース硫酸含
有多糖及び／又はその分解物を有効成分とし、これを公
知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば発がん予防剤を製
造することができる。発がん予防剤の製造は上記方法に
準じ行うことができる。一般的には、フコース硫酸含有
多糖及び／又はその分解物を薬学的に許容できる液状又
は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散
剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊
剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、
カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液
剤とすることができる。またこれを使用前に適当な担体
の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができ
る。A carcinogenesis preventive agent can be produced by using a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a degradation product thereof having an effect of suppressing carcinogenesis as an active ingredient, and formulating this in combination with a known pharmaceutical carrier. The carcinogenic agent can be produced according to the above method. Generally, the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and if necessary, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient. Tablets, granules, powders, powders, with the addition of excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.
It may be a solid preparation such as a capsule preparation, a normal liquid preparation, a suspension preparation, a liquid preparation such as an emulsion. Further, it can be made into a dried product which can be made into a liquid form by adding an appropriate carrier before use.

【０１８２】発がん予防剤としては、経口剤や、注射
剤、点滴用剤等の非経口剤のいずれによっても投与する
ことができる。As a carcinogenic agent, any of oral agents and parenteral agents such as injections and infusions can be administered.

【０１８３】医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応
じて選択することができ、上記アポトーシス誘発剤に準
じ使用すれば良い。The pharmaceutical carrier can be selected according to the above administration form and dosage form, and may be used according to the above apoptosis inducer.

【０１８４】発がん予防剤としては、製剤形態に応じた
適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はな
く、内用、外用及び注射によることができる。注射剤
は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、
外用剤には座剤等も包含される。The carcinogenic agent is administered by an appropriate administration route depending on the dosage form. The administration method is not particularly limited, and may be internal use, external use and injection. The injection may be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously,
The external preparation also includes suppositories and the like.

【０１８５】発がん予防剤としての投与量は、その製剤
形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の
年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではない
が一般には製剤中に含有される有効成分の量が成人１日
当り１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜２００ｍｇで
ある。もちろん投与量は、種々の条件によって変動する
ので、上記投与量より少ない量で充分な場合もあるし、
あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤
はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して
日常的に摂取させることもできる。The dose as a carcinogenic agent is appropriately set depending on the formulation form, administration method, purpose of use and age, body weight and symptom of the patient to whom the agent is applied, and although it is not constant, it is generally contained in the formulation. The amount of the active ingredient is 1 to 1000 mg, preferably 10 to 200 mg per day for an adult. Of course, the dose varies depending on various conditions, so a dose smaller than the above dose may be sufficient in some cases,
Or it may be necessary beyond the range. The drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.

【０１８６】本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解
物は天然由来物質であり、マウスに経口投与を行っても
毒性は認められない。The sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product are naturally derived substances, and no toxicity is observed even when they are orally administered to mice.

【０１８７】本発明の薬剤は感染症、免疫機能の低下又
は昂進あるいはがん疾患、ウイルス性疾患等の治療剤と
して用いることが期待される。発がん予防剤として健康
保持に使用することができる。また本発明のアポトーシ
ス誘発方法は生体防御機構、免疫機能あるいはがん、ウ
イルス性疾患等との関係の研究、アポトーシス誘発阻害
剤の開発等に有用である。特に、食用褐藻植物、食用ナ
マコから、本発明のフコース硫酸含有多糖、その分解物
を調製すれば、これらは食品として長い歴史を有するも
のであり、これらから調製したフコース硫酸含有多糖、
その分解物は、経口投与の場合において、極めて安全性
の高いものである。The drug of the present invention is expected to be used as a therapeutic agent for infectious diseases, reduced or accelerated immune function, cancer diseases, viral diseases and the like. It can be used as a carcinogen to maintain health. Further, the apoptosis-inducing method of the present invention is useful for studying the biological defense mechanism, immune function or relationship with cancer, viral diseases, etc., development of apoptosis-inhibiting inhibitors and the like. In particular, from edible brown algae plants, edible sea cucumber, if the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention and its degradation product are prepared, these have a long history as foods, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide prepared from these,
The degradation product is extremely safe when orally administered.

【０１８８】次にフコース硫酸含有多糖は極めて分子量
が大きな硫酸化多糖であり、そのまま医薬品として用い
るより、抗原性、均一性、抗凝血活性などの改善のた
め、フコース硫酸含有多糖をある程度分解することが必
要とされているが、本発明により、フコース硫酸含有多
糖−Ｆのみを選択的に分解する酵素、該酵素を作用させ
て得られるフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物が提
供された。Next, the sulfated-fucose-containing polysaccharide is a sulfated polysaccharide having an extremely large molecular weight, and decomposes the sulfated-fucose-containing polysaccharide to some extent in order to improve the antigenicity, homogeneity, anticoagulant activity, etc. rather than being used as a drug as it is. However, the present invention provides an enzyme that selectively decomposes only the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, and a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained by the action of the enzyme. .

【０１８９】本発明に使用される菌株としては、アルテ
ロモナス（Alteromonas）属細菌に属し、本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株
であればいかなる菌株でもよい。また、該エンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素生産能を有する菌株の具体例
としては、例えば、アルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１
００９株が挙げられる。該菌株由来のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素をフコース硫酸含有多糖に作用さ
せれば、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化
物を得ることができる。The strain used in the present invention may be any strain as long as it belongs to the bacterium of the genus Alteromonas and has the ability to produce the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention. Specific examples of the strain having the ability to produce the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme include, for example, Alteromonas sp. SN-1
009 strain. A low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention can be obtained by causing the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme derived from the strain to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【０１９０】本菌株は青森県の海水中より本発明者らが
新たに検索して得た菌株で、その菌学的性質は次の通り
である。 ａ．形態的性質 （１）本菌はかん菌である。 幅 約１μｍ 長さ 約２μｍ （２）胞子の有無 なし （３）グラム染色性 陰性 ｂ．生理的性質 （１）生育の温度範囲 好適な生育温度は１５−３０℃である。４℃あるいは４
０℃では生育できない。 （２）酸素に対する態度 好気性 （３）カタラーゼ 陽性 （４）オキシダーゼ 陽性 （５）リパーゼ 陽性 （６）資化性 グルコース 陽性 マンノース 陰性 スクロース 陽性 ラクトース 陰性 セロビオース 陽性 メリビオース 陰性 マンニトール 陽性 グリセリン 陽性 メタノール 陰性 ＤＬ−リンゴ酸 陰性 コハク酸 陰性 フマル酸 陰性 クエン酸 陰性 サリシン 陰性 （７）加水分解 デンプン 陰性 ゼラチン 陰性 （８）硝酸塩の還元 陰性 （９）脱窒反応 陰性 （１０）アルギン酸の分解 陽性 （１１）β−ヒドロキシ酪酸の利用 陰性 （１２）ポリヒドロキシ酪酸の蓄積 陰性 （１３）ナトリウムの要求性 陽性 （１４）塩類要求性 ０％食塩培地での生育 陰性 １％食塩培地での生育 陰性 海水培地での生育 陽性 （１５）キノン系 ユビキノン８ （１６）菌体内ＤＮＡのＧＣ含量 ３６％ （１７）ＯＦ−テスト Ｏ （１８）集落の色調 特徴的色素を生成せず （１９）発光性 陰性 （２０）運動性 陽性 （２１）鞭毛 極単毛The present strain is a strain newly obtained by the present inventors from seawater in Aomori prefecture, and its mycological properties are as follows. a. Morphological properties (1) This bacterium is a bacillus. Width about 1 μm Length about 2 μm (2) Presence or absence of spores None (3) Gram stainability Negative b. Physiological properties (1) Temperature range for growth The preferred growth temperature is 15-30 ° C. 4 ° C or 4
It cannot grow at 0 ° C. (2) Attitude to oxygen Aerobic (3) Catalase positive (4) Oxidase positive (5) Lipase positive (6) Assimilating glucose positive mannose negative sucrose positive lactose negative cellobiose positive melibiose negative mannitol positive glycerin positive methanol negative DL-apple Acid negative Succinic acid Negative Fumaric acid Negative Citric acid Negative Salicin Negative (7) Hydrolyzed starch Negative gelatin Negative (8) Nitrate reduction Negative (9) Denitrification reaction Negative (10) Alginic acid decomposition Positive (11) β-Hydroxybutyric acid Negative (12) Accumulation of polyhydroxybutyrate Negative (13) Sodium requirement Positive (14) Salt requirement Growth in 0% saline medium Negative Growth in 1% saline medium Negative Growth in seawater medium Positive (15) ) Quinone ubiquinone 8 (16) GC of intracellular DNA The amount 36% (17) OF- test O (18) without generating a tone characteristic dye settlement (19) emitting negative (20) motility positive (21) flagella Gokutanke

【０１９１】本菌株は、バージーズ マニュアル オブ
システィマティック バクテリオロジー、第１巻、第
３４３〜３５２頁（１９８４）、及びバージーズ マニ
ュアル オブ ディターミネイティブ バクテリオロジ
ー、第９巻、第７５頁、第１３２〜１３３頁（１９９
４）に記載されているアルテロモナス属細菌と同定し
た。しかしながら、本細菌の生理的性状は文献に記載さ
れているいずれの菌種とも一致せずＧＣ含量も低い値で
あった。そこで、本菌株をアルテロモナス ｓｐ．ＳＮ
−１００９と命名した。The strain of the present invention is known as Virgin's Manual of Cysticatic Bacteriology, Vol. 1, pp. 343-352 (1984), and Virgin's Manual of Derminative bacteriology, Vol. 9, pp. 75, 132-133. Page (199
It was identified as an Alteromonas bacterium described in 4). However, the physiological properties of this bacterium did not match any of the bacterial species described in the literature, and the GC content was low. Therefore, this strain was designated as Alteromonas sp. SN
It was named -1009.

【０１９２】なお上記菌株はAlteromonas ｓｐ． ＳＮ
−１００９と表示され、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所［日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号（郵便番号３０５）］に平成８年２月１３日よりＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５４３６として寄託され、前記通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
５７４７（国際寄託への移管請求日： 平成８年１１月
１５日）として寄託されている。The above strain is Alteromonas sp. SN
-1009 is displayed and the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry [1-3, Higashi 1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan]
No. (Postal code 305)] from February 13, 1996
Deposited as RM P-15436, and FERM BP- at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
5747 (Date of request for transfer to international deposit: November 15, 1996).

【０１９３】本発明に使用する菌株の培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、本発明のエンド型フコース
硫酸含有多糖分解酵素を生産するものであればよく、炭
素源としては例えばフコース硫酸含有多糖、海藻粉末、
アルギン酸、フコース、ガラクトース、グルコース、マ
ンニトール、グリセロール、サッカロース、マルトース
等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプト
ン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、
脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウム等が適当である。そ
の他にナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、マグネシ
ウム塩、亜鉛塩等の無機質、及び金属塩類を加えてもよ
い。The nutrient source added to the culture medium of the strain used in the present invention may be any one that can be utilized by the strain used and produces the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention. Examples of the carbon source include fucose sulfate. Polysaccharide content, seaweed powder,
Alginic acid, fucose, galactose, glucose, mannitol, glycerol, saccharose, maltose and the like can be used, and as the nitrogen source, yeast extract, peptone, casamino acid, corn steep liquor, meat extract,
Defatted soybean, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like are suitable. In addition, inorganic substances such as sodium salt, phosphate salt, potassium salt, magnesium salt and zinc salt, and metal salts may be added.

【０１９４】また本菌株は上記栄養源を含んだ海水ある
いは人工海水中で非常に良く生育する。Further, this strain grows very well in seawater or artificial seawater containing the above nutrients.

【０１９５】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の生産菌を培養するに当り、生産量は培養条件に
より変動するが、一般に培養温度は、１５℃〜３０℃、
培地のｐＨは６〜９がよく、５〜７２時間の通気かくは
ん培養で本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵
素の生産量は最高に達する。In culturing the bacterium producing the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, the production amount varies depending on the culturing conditions. Generally, the culturing temperature is 15 ° C to 30 ° C.
The pH of the medium is preferably 6 to 9, and the production amount of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention reaches the maximum after aeration and agitation culture for 5 to 72 hours.

【０１９６】培養条件は使用する菌株、培地組成等に応
じ、本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の
生産量が最大になるように設定するのは当然のことであ
る。It is natural that the culture conditions are set so as to maximize the production of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention depending on the strain to be used, the composition of the medium and the like.

【０１９７】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素は菌体中にも培養物上清中にも存在する。The endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is present both in the bacterial cells and in the culture supernatant.

【０１９８】上記のアルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１
００９を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常用
いられる細胞破壊手段、例えば、超音波処理などで菌体
を破砕すると無細胞抽出液が得られる。The above-mentioned Alteromonas sp. SN-1
The cell-free extract is obtained by culturing 009 in an appropriate medium, collecting the cells, and disrupting the cells by a commonly used cell disruption means such as ultrasonication.

【０１９９】次いで、この抽出液から通常用いられる精
製手段により精製酵素標品を得ることができる。例え
ば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水結合カラム
クロマト、ゲルろ過等により精製を行い、他のフコイダ
ン分解酵素を含まない純化された本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を得ることができる。Next, a purified enzyme preparation can be obtained from this extract by a commonly used purification means. For example, purification can be performed by salting out, ion exchange column chromatography, hydrophobic binding column chromatography, gel filtration, etc. to obtain a purified endo-fucose-sulfate-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention containing no other fucoidan degrading enzyme. .

【０２００】また、上述の培養液から菌体を除去した培
養液上清中にも本酵素が大量に存在するので、菌体内酵
素と同様の精製手段により精製することができる。[0200] Further, since a large amount of this enzyme is also present in the culture solution supernatant obtained by removing the cells from the above-mentioned culture solution, it can be purified by the same purification means as that for the intracellular enzyme.

【０２０１】本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分
解酵素の化学的及び理化学的性質は次の通りである。 （ｉ）作用：下記理化学的性質を有するフコース硫酸含
有多糖、すなわちフコース硫酸含有多糖−Ｆに作用し
て、該フコース硫酸含有多糖−Ｆを低分子化させる。 （ａ）構成糖：ウロン酸を実質的に含有しない。 （ｂ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により実質上低分子化されない。
下記理化学的性質を有するフコース硫酸含有多糖、すな
わちフコース硫酸含有多糖−Ｕに作用しない。 （ｃ）構成糖：ウロン酸を含有する。 （ｄ）フラボバクテリウム(Flavobacterium) ｓｐ．
ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）の生産す
るフコイダン分解酵素により低分子化し、少なくとも下
記式（Ｉ）、（II）、（III）より選択される少なくと
も一種以上の化合物が生成する。The chemical and physicochemical properties of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention are as follows. (I) Action: It acts on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties, that is, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F to lower the molecular weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. (A) Constituent sugar: Contains substantially no uronic acid. (B) Flavobacterium sp.
The fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) does not substantially lower the molecular weight.
It does not act on a sulfated-fucose-containing polysaccharide having the following physicochemical properties, that is, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U. (C) Constituent sugar: Contains uronic acid. (D) Flavobacterium sp.
A fucoidan-degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) produces a low molecular weight compound, and at least one compound selected from at least the following formulas (I), (II) and (III) is produced.

【化１８】 [Chemical 18]

【化１９】 [Chemical 19]

【化２０】 （ii）至適ｐＨ：本酵素の至適ｐＨは７〜８付近である
（図２０）。すなわち図２０は本酵素のｐＨと相対活性
の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性（％）、横
軸はｐＨを示す。実線は、還元性末端をＰＡ化したフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）を基質に用いた曲
線であり、点線は下記（ｖ）−（２）記載のフコース硫
酸含有多糖−Ｆを基質に用いた場合の曲線である。 （iii）至適温度：本酵素の至適温度は３０〜３５℃付
近である（図２１）。すなわち図２１は、本酵素の温度
と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性
（％）、横軸は温度（℃）を示す。実線は、還元性末端
をＰＡ化したフコース硫酸含有多糖−Ｆ（ＰＡ−ＦＦ）
を基質に用いた場合の曲線であり、点線は下記（ｖ）−
（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いた
場合の曲線である。 （iv）分子量：本酵素の分子量を、セファクリル（Seph
acryl）Ｓ−２００（ファルマシア社製）を用いたゲル
ろ過法により求めたところ、約１０万であった。[Chemical 20] (Ii) Optimum pH: The optimum pH of this enzyme is around 7 to 8 (Fig. 20). That is, FIG. 20 is a graph showing the relationship between pH and relative activity of the present enzyme, where the vertical axis represents relative activity (%) and the horizontal axis represents pH. The solid line is a curve using sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (PA-FF) with PA at the reducing end as a substrate, and the dotted line is a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in (v)-(2) below as a substrate. It is a curve when used for. (Iii) Optimum temperature: The optimum temperature of this enzyme is around 30 to 35 ° C (Fig. 21). That is, FIG. 21 is a graph showing the relationship between the temperature and the relative activity of the present enzyme, wherein the vertical axis shows the relative activity (%) and the horizontal axis shows the temperature (° C.). The solid line is a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (PA-FF) with PA at the reducing end.
Is a curve when using as a substrate, and the dotted line is (v)-
It is a curve when the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in (2) is used as a substrate. (Iv) Molecular weight: The molecular weight of the enzyme is
It was about 100,000 as determined by the gel filtration method using acryl) S-200 (manufactured by Pharmacia).

【０２０２】（ｖ）酵素活性の測定方法：本発明のエン
ド型フコース硫酸含有多糖分解酵素活性の測定は次のよ
うにして行った。(V) Method of measuring enzyme activity: The activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured as follows.

【０２０３】まず、本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の基質となるフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
及びＰＡ−ＦＦを下記（１）から（３）の工程により調
製した。First, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, which is a substrate of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention,
And PA-FF were prepared by the following steps (1) to (3).

【０２０４】（１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混
合物の調製 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械
製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノー
ル中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程をさらに３
回繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残
渣に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理
し、ろ過により抽出液を得た。 抽出液の塩濃度を４０
０ｍＭの塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセ
チルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくな
るまで添加し、遠心分離した。 その沈殿を、８０％の
エタノールで繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロ
リドを完全に除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリ
ウムに溶解し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化
ナトリウムで平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロ
ファインＡ−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂
を除いた。このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化
した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
のカラムにかけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除
分子量１０万）により脱塩及び低分子除去を行い、この
際生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清を凍
結乾燥して精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物
８２．２ｇを得た。(1) Preparation of Gagome kelp fucose-sulfate-containing polysaccharide mixture 2 kg of dried gagome kelp was pulverized by a free pulverizer M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and 80 ° C in 4.5 times the amount of 80% ethanol. After treatment for 2 hours, it was filtered. For the residue,
The process of 80% ethanol extraction and filtration is further 3
Repeated times to obtain 1870 g of ethanol washing residue. 36 liters of water was added to the residue, treated at 100 ° C. for 2 hours and filtered to obtain an extract. The salt concentration of the extract is 40
After making the solution the same as 0 mM sodium chloride solution, 5% cetylpyridinium chloride was added until no more precipitation occurred, and the mixture was centrifuged. The precipitate was repeatedly washed with 80% ethanol to completely remove cetylpyridinium chloride, then dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, insoluble matter was removed by centrifugation, and equilibrated with 2M sodium chloride. 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 was suspended, stirred and filtered to remove the resin. The filtrate was 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M sodium chloride.
The column was subjected to desalting and removal of low-molecular weight components with an ultrafilter (excluding molecular weight of filtration membrane: 100,000), and the precipitate generated at this time was removed by centrifugation. The supernatant was freeze-dried to obtain 82.2 g of a purified mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides of Gagome kelp.

【０２０５】（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製 上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇ
を６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじ
め０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩
化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を、３．３ｇ得た。(2) Preparation of Sulfate-Fucose-Containing Polysaccharide-F 6 g of the above-mentioned polysaccharide mixture containing Sulfate-fucose-containing sulfate derived from Gagome kombu
20m containing 600ml of 0.2M calcium chloride
3600 ml of DE after dissolution in M sodium acetate (pH 6.0) and then equilibrated with 20 mM sodium acetate (pH 6.0) containing 0.2 M calcium chloride in advance.
Apply to AE-Sepharose FF column, 20 mM sodium acetate containing 0.2 M calcium chloride (pH
After thoroughly washing the column with 6.0), it was eluted with a gradient of 0 to 2 M sodium chloride. Sulfate-fucose-containing polysaccharide that elutes at a sodium chloride concentration of 0.75 M or more
The F fraction was collected, concentrated and desalted by an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then freeze-dried to obtain 3.3 g of a freeze-dried preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.

【０２０６】（３）ＰＡ−ＦＦの調製 上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆの凍結乾燥標品１２ｍ
ｇを水４８０μｌに溶解し、１２μｌずつ３６本に分注
後、凍結乾燥しグライコタッグ及びグライコタッグ リ
ージェント キットを用いて還元性末端を、ＰＡ化し、
ＰＡ−ＦＦを得た。 得られたＰＡ−ＦＦを、１５ｍｌ
の１０％のメタノールを含む１０ｍＭの酢酸アンモニウ
ム溶液に溶解し、セルロファインＧＣＬ−３００のカラ
ム（４０ｘ９００ｍｍ）によりゲルろ過し、高分子画分
を集めた。得られた高分子画分をポアサイズ３５００の
透析膜を用いて充分透析して脱塩し、次にエバポレータ
ーにより５ｍｌに濃縮して本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖−Ｆ分解酵素の基質用ＰＡ−ＦＦとした。ま
た、こうして得られたＰＡ−ＦＦを、市販のピリジル−
（２）−アミノ化フコース（宝酒造社製）の蛍光強度
（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）と比較す
ることにより定量したところ約４０ｎｍｏｌであった。(3) Preparation of PA-FF 12 m of lyophilized preparation of the above-mentioned polysaccharide-F containing sulfated-fucose
g was dissolved in 480 μl of water, dispensed into 36 tubes of 12 μl each, lyophilized, and the reducing end was converted to PA using Glycotag and Glycotag Regent kit,
PA-FF was obtained. 15 ml of the obtained PA-FF
Was dissolved in a 10 mM ammonium acetate solution containing 10% of methanol and subjected to gel filtration through a Cellulofine GCL-300 column (40 × 900 mm) to collect a polymer fraction. The obtained polymer fraction was thoroughly dialyzed with a dialysis membrane having a pore size of 3500 to desalt, and then concentrated to 5 ml by an evaporator, and then PA for a substrate of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention. -FF. In addition, the PA-FF thus obtained was commercialized with pyridyl-
When quantified by comparison with the fluorescence intensity (excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm) of (2) -aminated fucose (Takara Shuzo), it was about 40 nmol.

【０２０７】上記（１）及び（２）の工程により得られ
たフコース硫酸含有多糖−Ｆを用いて本発明のエンド型
フコース硫酸含有多糖分解酵素の活性を測定するときは
下記の要領で行った。When the activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured using the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in the above steps (1) and (2), the procedure was as follows. .

【０２０８】すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多
糖−Ｆ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶
液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの
５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸を含む緩
衝液（ｐＨ７．５）と、１８μｌの本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖−Ｆ分解酵素とを混合し、３０℃、
３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間処理
し、遠心分離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、
低分子化の程度を測定した。That is, 12 μl of a 2.5% polysaccharide solution of sulfated-fucose-F, 6 μl of 1M calcium chloride solution and 12 μl of 1M sodium chloride solution, and 72 μl of a buffer solution containing 50 mM acetic acid, imidazole and tris-hydrochloric acid. (PH 7.5) and 18 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention are mixed, and the mixture is heated at 30 ° C.
After reacting for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C. for 10 minutes, centrifuged, and 100 μl was analyzed by HPLC.
The degree of depolymerization was measured.

【０２０９】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びフコース硫酸含有
多糖−Ｆ溶液の代りに水を用いて反応を行ったものを用
意し、それぞれ同様にＨＰＬＣにより分析した。As a control, the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was replaced by a buffer solution in which the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dissolved, and the reaction was conducted under the same conditions. Also, a solution obtained by performing a reaction using water instead of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solution was prepared, and analyzed by HPLC in the same manner.

【０２１０】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖−Ｆのフコシル
結合を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合
の定量は下記式により求めた。 ｛（12 ×2.5)/(100 ×MF) ｝×｛(MF/M)-1｝×｛0.12/
(180 ×0.01) ｝＝U/ml （１２×２．５）／１００：反応系中に添加したフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ（ｍｇ） ＭＦ：基質フコース硫酸含有多糖−Ｆの平均分子量 Ｍ：反応生成物の平均分子量 （ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が酵素により切断された数 １８０：反応時間（分） ０．０１：酵素液量（ｍｌ） ０．１２：反応液総量（ｍｌ）One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the fucosyl bond of 1 μmol of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F in 1 minute in the above reaction system. The amount of the cleaved fucosyl bond was determined by the following formula. {(12 x 2.5) / (100 x MF)} x {(MF / M) -1} x {0.12 /
(180 × 0.01)} = U / ml (12 × 2.5) / 100: sulfated-fucose-containing polysaccharide-F (mg) MF added to the reaction system MF: average molecular weight of substrate-sulfated-fucose-containing polysaccharide-F M: reaction Product average molecular weight (MF / M) -1: 1 molecule of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
180: Reaction time (min) 0.01: Enzyme solution volume (ml) 0.12: Reaction solution total volume (ml)

【０２１１】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４（８ｍｍ×３００ｍ
ｍ）（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カ
ルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８） 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak KB-804 (8 mm x 300 m
m) (manufactured by Showa Denko KK) Eluent: 25 m containing 5 mM sodium azide, 25 mM calcium chloride, and 50 mM sodium chloride
M imidazole buffer (pH 8) Detection: Parallax Refractive Index Detector (Shodex RI-71,
(Showa Denko) Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 25 ° C

【０２１２】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）を上記のＨＰＬＣ分析と同条件で
分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４
の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反応生成物
の分子量測定のための標準曲線とした。For determination of the average molecular weight of the reaction product,
Commercially available pullulan with known molecular weight (STANDARD P-
82, Showa Denko KK) under the same conditions as the above-mentioned HPLC analysis, and the molecular weight of pullulan and OHpak KB-804 were analyzed.
The relationship with the retention time of was expressed as a curve, which was used as a standard curve for measuring the molecular weight of the enzyme reaction product.

【０２１３】上記（１）〜（３）の工程により得られた
ＰＡ−ＦＦを用いて本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素の活性を測定するときは下記の要領で行っ
た。When the activity of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was measured using the PA-FF obtained by the steps (1) to (3), the procedure was as follows.

【０２１４】すなわち、８ｐｍｏｌ／μｌのＰＡ−ＦＦ
溶液２μｌと、５μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶液と１０
μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、２３μｌの水と、５
０μｌの５０ｍＭの酢酸とイミダゾールとトリス−塩酸
を含む緩衝液（ｐＨ８．２）と、１０μｌの本発明のエ
ンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素とを混合し、３０
℃、３時間反応させた後、反応液を１００℃、１０分間
処理し、遠心分離後、８０μｌをＨＰＬＣにより分析
し、低分子化の程度を測定した。That is, 8 pmol / μl of PA-FF
2 μl of solution and 5 μl of 1M calcium chloride solution and 10
μl of 1M sodium chloride solution, 23 μl of water, 5
A buffer solution (pH 8.2) containing 0 μl of 50 mM acetic acid, imidazole and tris-hydrochloric acid was mixed with 10 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention,
After reacting at 3 ° C for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C for 10 minutes, centrifuged, and 80 µl was analyzed by HPLC to measure the degree of depolymerization.

【０２１５】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代りに、本発明のエンド型フコー
ス硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用いて
同様の条件により反応させたもの及びＰＡ−ＦＦ溶液の
代りに水を用いて反応を行ったものを用意し、それぞれ
同様にＨＰＬＣにより分析した。As a control, instead of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention, a buffer solution in which the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is dissolved is used and the reaction is conducted under the same conditions. And the PA-FF solution was used instead of the PA-FF solution to carry out the reaction, and each was similarly analyzed by HPLC.

【０２１６】１単位の酵素は、上記反応系において１分
間に１μｍｏｌのフコース硫酸含有多糖のフコシル結合
を切断する酵素量とする。切断されたフコシル結合の定
量は下記式により求めた。 16×10−６×｛（MF/M)-1 ｝×｛1/(180×0.01) ｝＝Ｕ
／ml １６ｘ１０−６：反応系中に添加したＰＡ−ＦＦ（μｍ
ｏｌ） ＭＦ：基質ＰＡ−ＦＦの平均分子量 Ｍ：反応生成物の平均分子量 （ＭＦ／Ｍ）−１：１分子のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
が酵素により切断された数 １８０：反応時間（分） ０．０１：酵素液量（ｍｌ）One unit of enzyme is the amount of enzyme that cleaves the fucosyl bond of 1 μmol of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the above reaction system per minute. The amount of the cleaved fucosyl bond was determined by the following formula. 16 x 10 -6 x {(MF / M) -1} x {1 / (180 x 0.01)} = U
/ Ml 16 × 10 −6 : PA-FF (μm added to the reaction system
ol) MF: average molecular weight of substrate PA-FF M: average molecular weight of reaction product (MF / M) -1: 1 molecule of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
180: Reaction time (min) 0.01: Enzyme solution volume (ml)

【０２１７】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０３（8 mm ×300 mm）
（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム及び１０％のジメチ
ルスルホキシドを含む２００ｍＭの塩化ナトリウム溶液 検出：蛍光検出器 F-1150（日立製作所製）にて励起波
長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍで検出。 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：５０℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak SB-803 (8 mm x 300 mm)
(Showa Denko KK) Eluent: 200 mM sodium chloride solution containing 5 mM sodium azide and 10% dimethylsulfoxide Detection: Fluorescence detector F-1150 (Hitachi) at excitation wavelength 320 nm, fluorescence wavelength 400 nm detection. Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 50 ° C

【０２１８】反応生成物の平均分子量の測定のために、
市販の分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−
８２、昭和電工社製）をグライコタッグ及びグライコタ
ッグリージェント キットを用いて還元性末端を、ＰＡ
化し、様々な分子量のＰＡ化プルランを得た。得られた
様々な分子量のＰＡ化プルランを上記のＨＰＬＣ分析と
同条件で分析し、プルランの分子量とＯＨｐａｋ ＳＢ
−８０３の保持時間との関係を曲線に表し、上記酵素反
応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。For determination of the average molecular weight of the reaction product,
Commercially available pullulan with known molecular weight (STANDARD P-
82, manufactured by Showa Denko Co., Ltd.), and the reducing end was treated with Glycotag and Glycotag Regent Kit
To obtain PA-containing pullulan having various molecular weights. The obtained pullulanized PA having various molecular weights was analyzed under the same conditions as the above HPLC analysis, and the molecular weight of pullulan and OHpak SB were analyzed.
The relationship between the retention time of -803 and the retention time was represented by a curve, which was used as a standard curve for measuring the molecular weight of the enzyme reaction product.

【０２１９】タンパク質の定量は、酵素液の２８０ｎｍ
の吸光度を測定することにより行った。その際１ｍｇ／
ｍｌのタンパク質溶液の吸光度を１．０として計算し
た。The protein was quantified by measuring the enzyme solution at 280 nm.
It was performed by measuring the absorbance of. At that time 1 mg /
The absorbance of the protein solution in ml was calculated as 1.0.

【０２２０】本発明者らは、以下に述べるように、本発
明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素の作用機作
を決定した。The present inventors determined the mechanism of action of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, as described below.

【０２２１】（１）エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素によるフコース硫酸含有多糖−Ｆの分解及び分解物
の調製 精製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖−Ｆに
本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素を作用
させ、分解物の調製を行った。(1) Decomposition of a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme and preparation of a decomposed product A degrading product was prepared by allowing a degrading enzyme to act.

【０２２２】まず、フコース硫酸含有多糖分解酵素の生
産を行った。すなわち、アルテロモナスｓｐ． ＳＮ−
１００９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を、グルコー
ス０．２５％、ペプトン１．０％、酵母エキス０．０５
％を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ
８．２からなる培地６００ｍｌを分注して殺菌した（１
２０℃、２０分）２リットルの三角フラスコに接種し、
２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン
１．０％、酵母エキス０．０２％、前記のガゴメ昆布由
来のフコース硫酸含有多糖０．２％、及び消泡剤（信越
化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を含む人工海水ｐＨ
８．０からなる培地２０リットルを３０リットル容のジ
ャーファーメンターに入れて１２０℃で２０分殺菌し
た。冷却後、上記の種培養液６００ｍｌを接種し、２４
℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０
回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培
養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた
培養上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後
８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集
め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭのトリス
ー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、６０
０ｍｌの粗酵素を得た。First, a sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme was produced. That is, Alteromonas sp. SN-
1009 (FERM BP-5747), glucose 0.25%, peptone 1.0%, yeast extract 0.05
% Containing artificial seawater (made by Jamarin Laboratories) pH
Sterilized by dispensing 600 ml of a medium consisting of 8.2 (1
20 ° C, 20 minutes) Inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask,
It was cultured at 25 ° C. for 26 hours to obtain a seed culture solution. Artificial seawater pH containing 1.0% peptone, 0.02% yeast extract, 0.2% polysaccharide containing fucose sulfate derived from Gagome kelp, and 0.01% antifoaming agent (KM70 manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.)
20 liters of 8.0 medium was placed in a 30 liter jar fermenter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, inoculate 600 ml of the above seed culture,
Aeration rate of 10 liters per minute and 250 minutes per minute for 24 hours at ℃
The culture was carried out under the condition of agitating speed of rotation. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain cells and culture supernatant. The obtained culture supernatant was concentrated with an ultrafilter having a molecular weight cut-off of 10,000 and then salted out with 85% saturated ammonium sulfate, and the resulting precipitate was collected by centrifugation and collected with 20 mM of artificial seawater at a concentration of 1/10. Fully dialyzed against Tris-HCl buffer (pH 8.2), 60
0 ml of crude enzyme was obtained.

【０２２３】こうして得られた粗酵素のうち４０ｍｌ
と、人工海水４４ｍｌと、前記のフコース硫酸含有多糖
−Ｆ５１０ｍｇと水３６ｍｌを混合し、ｐＨを８に調整
し、２５℃で４８時間反応後、セルロファインＧＣＬ−
３００によりゲルろ過を行い、４画分に分け、分子量の
大きな方から順に、Ｆ−Ｆｄ−１（分子量２５０００
超）、Ｆ−Ｆｄ−２（分子量２５０００〜１２０００
超）、Ｆ−Ｆｄ−３（分子量１２０００〜６５００
超）、及びＦ−Ｆｄ−４（分子量６５００以下）とし
た。これらの４画分を脱塩後凍結乾燥し、乾燥品をそれ
ぞれ１７０ｍｇ、２７０ｍｇ、３００ｍｇ、及び３４０
ｍｇ得た。40 ml of the crude enzyme thus obtained
Then, 44 ml of artificial seawater, 510 mg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and 36 ml of water were mixed, the pH was adjusted to 8, and after reacting at 25 ° C for 48 hours, Cellulofine GCL-
Gel filtration is performed with 300 to divide into 4 fractions, and F-Fd-1 (molecular weight 25000)
Super), F-Fd-2 (molecular weight 25,000 to 12,000)
Super), F-Fd-3 (molecular weight 12000 to 6500)
Super) and F-Fd-4 (molecular weight 6500 or less). These four fractions were desalted and lyophilized to give dried products of 170 mg, 270 mg, 300 mg, and 340, respectively.
mg was obtained.

【０２２４】フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素分解物、
すなわち低分子化物のセルロファインＧＣＬ−３００に
よるゲルろ過の結果を図２２に示す。図２２において縦
軸は４８０ｎｍの吸光度（フェノール硫酸法による発色
量）、横軸はフラクションナンバーを示し、１フラクシ
ョン１０ｍｌである。カラムボリュームは１０７５ｍｌ
であり、溶出液は１０％のエタノールを含む０．２Ｍの
酢酸アンモニウム溶液である。Enzymatic degradation product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F,
That is, the result of gel filtration using Cellulofine GCL-300 having a low molecular weight is shown in FIG. In FIG. 22, the vertical axis represents the absorbance at 480 nm (coloring amount by the phenol-sulfuric acid method), the horizontal axis represents the fraction number, and one fraction is 10 ml. Column volume is 1075 ml
And the eluent is a 0.2 M ammonium acetate solution containing 10% ethanol.

【０２２５】図２２中、白丸印はフコース硫酸含有多糖
−Ｆの酵素分解物を、黒三角印は酵素分解前のフコース
硫酸含有多糖−Ｆをそれぞれゲルろ過した結果を表す。In FIG. 22, white circles represent the results of gel filtration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F enzyme-decomposed products, and black triangles represent the results of gel-filtration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F before enzymatic degradation.

【０２２６】上記セルロファインＧＣＬ−３００の結果
から、本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の反応生
成物の分子量分布は約１０００〜３万程度であることが
判明した。From the results of Cellulofine GCL-300, it was found that the reaction product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention has a molecular weight distribution of about 1,000 to 30,000.

【０２２７】（２）酵素反応生成物の還元末端糖及び中
性糖組成の分析 上記のＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４の一部をグライコタッグ及びグライコタ
ッグ リージェント キットを用いて還元性末端をＰＡ
化し、得られた各ＰＡ化糖（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、
（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及
び（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）を４規定の塩酸、１００℃、
３時間処理により加水分解し、ＨＰＬＣにより還元末端
糖を調べた。(2) Analysis of reducing terminal sugar and neutral sugar composition of enzymatic reaction product Part of the above-mentioned F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-4 To the reducing end using Glycotag and Glycotag Regent Kit.
Each of the obtained PA sugars (PA-F-Fd-1),
(PA-F-Fd-2), (PA-F-Fd-3), and (PA-F-Fd-4) are 4N hydrochloric acid, 100 ° C,
It was hydrolyzed by treatment for 3 hours, and the reducing terminal sugar was examined by HPLC.

【０２２８】なお、ＨＰＬＣの条件は下記によった。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：パルパックタイプＡ（4.6 mm× 150 mm）（宝
酒造社製） 溶離液：７００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ ９）：アセト
ニトリル＝９：１ 検出：蛍光検出器 Ｆ−１１５０（日立製作所製）にて
励起波長３１０ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍで検出。 流速：０．３ｍｌ／分 カラム温度：６５℃The HPLC conditions were as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: Palpack type A (4.6 mm x 150 mm) (manufactured by Takara Shuzo) Eluent: 700 mM borate buffer (pH 9): Acetonitrile = 9: 1 Detection: Fluorescence detection Detector F-1150 (manufactured by Hitachi, Ltd.) detects at an excitation wavelength of 310 nm and a fluorescence wavelength of 380 nm. Flow rate: 0.3 ml / min Column temperature: 65 ° C

【０２２９】この結果、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−１）、（Ｐ
Ａ−Ｆ−Ｆｄ−２）、（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−３）、及び
（ＰＡ−Ｆ−Ｆｄ−４）の還元末端糖は総てフコースで
あった。As a result, (PA-F-Fd-1), (P
The reducing terminal sugars of AF-Fd-2), (PA-F-Fd-3), and (PA-F-Fd-4) were all fucose.

【０２３０】また、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−
Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４の中性糖組成を下記の方法
により測定した。なお、基質に用いたフコース硫酸含有
多糖−Ｆを硫酸加水分解後グライコタッグ及びグライコ
タッグ リージェント キットを用いて構成糖の還元性
末端をＰＡ化し、上記の酵素反応生成物の還元性末端を
分析したときと同じＨＰＬＣ条件で分析したところ、フ
コースとガラクトースのみしか検出されず、それらの立
体配位はそれぞれＬ及びＤであったので生成物に関して
もＬ−フコースとＤ−ガラクトースのみを測定した。In addition, F-Fd-1, F-Fd-2, F-
The neutral sugar composition of Fd-3 and F-Fd-4 was measured by the following method. After the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F used as the substrate was hydrolyzed with sulfuric acid, the reducing ends of the constituent sugars were converted to PA using Glycotag and Glycotag Regent kit, and the reducing ends of the above enzyme reaction products were analyzed. When analyzed under the same HPLC conditions as in the above, only fucose and galactose were detected, and their configurations were L and D, respectively. Therefore, for the product, only L-fucose and D-galactose were measured.

【０２３１】すなわち、構成糖の一つであるＤ−ガラク
トースの含量を調べるためにＦ−キット 乳糖／ガラク
トース（ベーリンガーマンハイムヤマノウチ社製）を用
い、説明書に従ってＤ−ガラクトースのみを測定できる
反応系を構築し、別に４規定の塩酸で１００℃、２時間
加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で測定した。That is, in order to examine the content of D-galactose which is one of the constituent sugars, a reaction system in which only D-galactose can be measured according to the instruction using F-kit lactose / galactose (manufactured by Boehringer Mannheim Yamanouchi) F-Fd-1, F-Fd-2 and F-Fd- were constructed and hydrolyzed separately with 4N hydrochloric acid at 100 ° C. for 2 hours.
3 and F-Fd-4 were neutralized and then measured in this reaction system.

【０２３２】更にもう一方の構成糖であるＬ−フコース
を定量するために、クリニカル ケミストリー（Clinic
al Chemistry)、第３６巻、第４７４〜４７６頁（１９
９０）記載の方法に従って、別に４規定の塩酸で１００
℃、２時間加水分解したＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、
Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４を中和後この反応系で
測定した。[0232] In order to quantify L-fucose, which is the other constituent sugar, clinical chemistry (Clinic) was used.
al Chemistry), 36, 474-476 (19).
90) according to the method described above, 100 with 4N hydrochloric acid separately.
F-Fd-1, F-Fd-2 hydrolyzed for 2 hours at
After neutralizing F-Fd-3 and F-Fd-4, measurement was performed in this reaction system.

【０２３３】以上の結果Ｌ−フコースとＤ−ガラクトー
スの比率はＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４それぞれおよそ１００：４４、１
００：２７、１００：５、及び１００：１であった。As a result, the ratios of L-fucose and D-galactose were F-Fd-1, F-Fd-2 and F-Fd-.
3 and F-Fd-4 are approximately 100: 44, 1 respectively.
It was 00:27, 100: 5, and 100: 1.

【０２３４】以上の結果をまとめると、本発明のエンド
型フコース硫酸含有多糖分解酵素は、フコース硫酸含有
多糖−Ｆに作用してフコシル結合を加水分解し、分子量
約１０００〜３万程度の低分子化物を生成し、その低分
子化物は分子量が大きいほどガラクトース含量が高いこ
とが判明した。なお、低分子化物の還元性末端はすべて
Ｌ−フコースであった。Summarizing the above results, the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention acts on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F to hydrolyze the fucosyl bond, and a low molecular weight compound having a molecular weight of about 1,000 to 30,000 is obtained. It was found that the higher the molecular weight of the low molecular weight compound, the higher the galactose content. The reducing ends of the low molecular weight compounds were all L-fucose.

【０２３５】次に、本酵素の基質特異性を調べるために
フコース硫酸含有多糖−Ｕに本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素を作用させた。Next, in order to examine the substrate specificity of this enzyme, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention was allowed to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.

【０２３６】すなわち、２．５％のフコース硫酸含有多
糖−Ｕ溶液１２μｌと、６μｌの１Ｍ塩化カルシウム溶
液と１２μｌの１Ｍ塩化ナトリウム溶液と、７２μｌの
５０ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．５）と、１８
μｌの本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
（１．６ｍＵ／ｍｌ）とを混合し、３０℃、３時間反応
させた後、反応液を１００℃、１０分間処理し、遠心分
離後、１００μｌをＨＰＬＣにより分析し、低分子化の
程度を測定した。That is, 12 μl of a 2.5% polysaccharide-U solution containing sulfated-fucose, 6 μl of 1M calcium chloride solution and 12 μl of 1M sodium chloride solution, 72 μl of 50 mM imidazole buffer (pH 7.5), 18
After mixing with 1 μl of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme (1.6 mU / ml) of the present invention and reacting at 30 ° C. for 3 hours, the reaction solution was treated at 100 ° C. for 10 minutes, and after centrifugation, 100 μl was analyzed by HPLC to measure the degree of depolymerization.

【０２３７】対照として、本発明のエンド型フコース硫
酸含有多糖分解酵素の代わりに、本発明のエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素を溶解している緩衝液を用い
て同様の条件により反応させたものを用意し、同様にＨ
ＰＬＣにより分析した。As a control, instead of the endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention, a buffer solution in which the endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention is dissolved and reacted under the same conditions And prepare H
Analyzed by PLC.

【０２３８】なお、ＨＰＬＣの条件は次の通りである。 装置：Ｌ−６２００型（日立製作所製） カラム：ＯＨｐａｋ ＫＢ−８０４（8 mm× 300 mm）
（昭和電工社製） 溶離液：５ｍＭのアジ化ナトリウム、２５ｍＭの塩化カ
ルシウム、及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２５ｍ
Ｍのイミダゾール緩衝液（ｐＨ８） 検出：視差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１、
昭和電工社製） 流速：１ｍｌ／分 カラム温度：２５℃The HPLC conditions are as follows. Device: L-6200 type (manufactured by Hitachi, Ltd.) Column: OHpak KB-804 (8 mm x 300 mm)
(Showa Denko) Eluent: 25m containing 5mM sodium azide, 25mM calcium chloride, and 50mM sodium chloride
M imidazole buffer (pH 8) Detection: Parallax Refractive Index Detector (Shodex RI-71,
(Showa Denko) Flow rate: 1 ml / min Column temperature: 25 ° C

【０２３９】その結果、本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は、フコース硫酸含有多糖−Ｕを全く低分子化
しなかった。As a result, the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention did not lower the molecular weight of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U at all.

【０２４０】既述のように、本発明は、上記した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素と、カルシウム源とを
含有する酵素組成物に関する。As described above, the present invention relates to an enzyme composition containing the above-described sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention and a calcium source.

【０２４１】使用可能なカルシウム源としては、固形組
成物においては、例えば塩化カルシウム、炭酸カルシウ
ム、酢酸カルシウムのようなカルシウム塩、酸化カルシ
ウム、水酸化カルシウム、あるいはそれらの水和物など
が挙げられる。他方、水、アルコール等の溶媒中に溶
解、懸濁、乳化させた液状組成物においては、カルシウ
ム源は、前記したような単体であっても、あるいは溶解
などによりイオン化した状態のものであってもよい。In the solid composition, examples of usable calcium sources include calcium salts such as calcium chloride, calcium carbonate, calcium acetate, calcium oxide, calcium hydroxide, and hydrates thereof. On the other hand, in the liquid composition dissolved, suspended, or emulsified in a solvent such as water or alcohol, the calcium source may be a simple substance as described above, or may be in an ionized state by dissolution or the like. Good.

【０２４２】これらカルシウム源は、当該酵素を賦活又
は安定化するので有効である。These calcium sources are effective because they activate or stabilize the enzyme.

【０２４３】したがって、上記酵素組成物は上記したカ
ルシウム源の作用効果を阻害しない範囲で、用途に応じ
て常用の添加剤を含有していてもよい。Therefore, the above-mentioned enzyme composition may contain a conventional additive depending on the application, as long as it does not impair the action and effect of the calcium source.

【０２４４】本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素を
フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物に作用させることによ
って、フコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化物を調製す
ることができる。フコース硫酸含有多糖−Ｆ含有物とし
ては、例えばフコース硫酸含有多糖−Ｆ精製品でもよ
く、また前述フコース硫酸含有多糖混合物でもよく、更
に褐藻類海藻の水性溶媒抽出物でもよい。フコース硫酸
含有多糖−Ｆ含有物の溶解は通常の方法で行えばよく、
溶解液中のフコース硫酸含有多糖濃度はその最高溶解濃
度でもよいが、通常はその操作性、酵素力価を考慮して
選定すればよい。By allowing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention to act on the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing product, a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F can be prepared. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing material may be, for example, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F purified product, the aforementioned mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, or an aqueous solvent extract of brown algae seaweed. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F-containing material may be dissolved by an ordinary method,
The concentration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the solution may be its maximum concentration, but it is usually selected in consideration of its operability and enzyme titer.

【０２４５】フコース硫酸含有多糖−Ｆ溶解液としては
水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液
のｐＨは通常中性で、酵素反応は通常３０℃付近で行
う。酵素量、反応時間などを調整することによって、低
分子化物の分子量を調整することができる。The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F solution may be selected from water, buffer solution and the like according to the purpose. The pH of the solution is usually neutral, and the enzyme reaction is usually performed at around 30 ° C. The molecular weight of the low molecular weight compound can be adjusted by adjusting the amount of enzyme, the reaction time, and the like.

【０２４６】次に低分子化物を分子量分画することによ
って、更に均一な分子量分布のフコース硫酸含有多糖−
Ｆ低分子化物を調製することができる。分子量分画は通
常よく使用されている方法を適用することができ、例え
ばゲルろ過法や分子量分画膜を使用すればよい。低分子
化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭
処理などの精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩
処理、無菌処理を行い、凍結乾燥することによって、本
発明の低分子化物の乾燥品を調製することもできる。Next, the low molecular weight product is subjected to molecular weight fractionation to give a more uniform molecular weight distribution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-
F low molecular weight compounds can be prepared. A commonly used method can be applied to the molecular weight fractionation, and for example, a gel filtration method or a molecular weight fractionation membrane may be used. The low molecular weight compound may be further subjected to purification operations such as ion exchange resin treatment and activated carbon treatment, if necessary, and desalting treatment, aseptic treatment, and freeze-drying to reduce the A dried product of the molecular compound can also be prepared.

【０２４７】[0247]

【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定される
ものではない。なお、実施例における％は重量％を意味
する。The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these descriptions. In the examples,% means% by weight.

【０２４８】実施例１ ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機
（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末
を９リットルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時
間処理した。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この
残渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３
回繰り返しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０
リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出
液１．８リットルを凍結乾燥し、フコース硫酸含有多糖
標品１５．４ｇを得た。次に残りの抽出液に０．４Ｍと
なるように食塩を加え、更に５％の塩化セチルピリジニ
ウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分離
により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．４Ｍ
食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を
３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加
し、よくかくはん後エタノールを８０％となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離するという操
作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り
返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、
不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化
した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、
非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備
えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を
完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除
去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混
合物の重量は７６ｇであった。Example 1 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg of the dried product was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol at 80 ° C. for 2 hours. Processed. It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. This residue was washed with ethanol and filtered as described in 3
Repeated times to obtain an ethanol washing residue. 40 of this residue
After being suspended in 1 liter of water, it was treated at 95 ° C. for 2 hours and filtered. The residue was washed with hot water to obtain 36 liters of the extract of Gagome kelp containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide. The obtained extract (1.8 liters) was freeze-dried to obtain 15.4 g of a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation. Next, sodium chloride was added to the remaining extract so that the concentration was 0.4 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur any more, and the precipitate was collected by centrifugation. 3 liters of this precipitate 0.4M
After suspension in saline, centrifugation and washing were performed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by centrifugation after stirring. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. Dissolve this precipitate in 3 liters of 2M saline solution,
After removing the insoluble matter by centrifugation, 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2 M saline was added.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2M saline,
The non-adsorbed component is ultrafiltered with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less to completely remove the coloring substance and salt, and then the insoluble substance is removed by centrifugation and filtration and freeze-dried. . The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 76 g.

【０２４９】実施例２ マ昆布を充分乾燥後、乾燥物２ｋｇを自由粉砕機（奈良
機械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リ
ットルの８０％エタノールに懸濁し、８０℃、２時間処
理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を得た。この残
渣に対して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回
繰り返し、エタノール洗浄残渣を得た。この残渣を４０
リットルの水に懸濁後、９５℃、２時間処理し、ろ過し
た。残渣を熱水で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多
糖を含む抽出液３６リットルを得た。得られた抽出液に
０．４Ｍとなるように食塩を加え、更に５％の塩化セチ
ルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リット
ルの０．３Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。こ
の洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ
食塩水を添加し、よくかくはん後エタノールを８０％と
なるように添加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得
た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁し、遠心分離
するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０に
なるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リット
ルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食
塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、かくはん
後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食
塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
カラムにかけ、非吸着分を排除分子量１０万以下のホロ
ファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性
物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過により
不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース
硫酸含有多糖混合物の重量は５２ｇであった。Example 2 After thoroughly drying mackerel, 2 kg of the dried product was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and kept at 80 ° C. for 2 hours. Time processed. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. The above-mentioned ethanol washing and filtration operations were repeated 3 times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. 40 of this residue
After being suspended in 1 liter of water, it was treated at 95 ° C. for 2 hours and filtered. The residue was washed with hot water to obtain 36 liters of an extract of mackerel containing a sulfated-fucose-containing polysaccharide. Sodium chloride was added to the obtained extract so that the concentration was 0.4 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur any more, and the precipitate was collected by centrifugation. The precipitate was suspended in 3 liters of 0.3 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 L of 4M was added to the precipitate.
Saline was added, well stirred and then ethanol was added to 80%, and after stirring, a precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 2M saline was added, After stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was equilibrated with 2M saline solution DEAE-Cellulofine A-800.
After applying a column, the non-adsorbed component is subjected to ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight exclusion of 100,000 or less to completely remove the coloring substance and salt, and then the insoluble substance is removed by centrifugation and filtration. Lyophilized. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 52 g.

【０２５０】実施例３ マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の抽出 マ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製
作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リットル
の８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理した。
処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対して
上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエ
タノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットルの
０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時間
処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸カ
ルシウム溶液で洗浄し、マ昆布のフコース硫酸含有多糖
混合物の抽出液３６リットルを得た。Example 3 Extraction of Polysaccharide Mixture Containing Sulfuric Acid Fucose of Makonbu After thoroughly drying Makonbu, 2 kg was pulverized by a free pulverizer (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was 9 liters of 80% ethanol. And suspended at 80 ° C. for 2 hours.
It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of a 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of an extract of a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides of mackerel.

【０２５１】実施例４ マ昆布のフコース硫酸含有多糖混合物の調製 実施例３で得られたろ液に、５％の塩化セチルピリジニ
ウムを、それ以上沈殿が生じなくなるまで添加し遠心分
離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの０．３
Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作
を３回繰り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添
加しよくかくはん後エタノールを８０％となるように添
加し、かくはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿
を８０％エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作
を、上清中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返
した。この沈殿を２Ｍの食塩水３リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化し
た１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ非
吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバーを備え
た限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完
全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を除去
し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖混合
物の重量は５２ｇであった。また、このフコース硫酸含
有多糖混合物は多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含
まなかった。Example 4 Preparation of Sulfate-fucose-containing Polysaccharide Mixture of Mackerel To the filtrate obtained in Example 3, 5% cetylpyridinium chloride was added until no further precipitation occurred, and the precipitate was collected by centrifugation. . Add 3 liters of this precipitate to 0.3
The cells were suspended in M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4 M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline solution, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M saline solution.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 52 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture did not contain a coloring substance that was adsorbed to the polysaccharide resin.

【０２５２】実施例５ 実施例４記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化
ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を
０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カル
シウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分に
洗浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジエ
ントで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化
マグネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫
酸含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食
塩で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸
含有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムに
おいても、本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｆとフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕは実質的に分離された。Example 5 Four 1 g freeze-dried products of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 4 were weighed, and water, 0.2 M sodium chloride, 0.2 M calcium chloride and 0.2 M chloride were respectively weighed. Dissolved in magnesium. Next, 500 ml of DEA
Four E-Sepharose FF columns were prepared, and two of them were equilibrated with 0.2M sodium chloride, one with 0.2M calcium chloride, and one with 0.2M magnesium chloride. One of the columns equilibrated with 0.2 M sodium chloride was washed with 10 column volumes of water. Apply the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture dissolved in water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride to the DEAE-Sepharose FF column equilibrated with water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride, respectively, and use each for equilibration. The solution was washed thoroughly with the same solution and then eluted with a gradient of 0 to 4 M sodium chloride. As a result, the total amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture applied to the column only in the system using calcium chloride and magnesium chloride was adsorbed to the column. Only 0.4 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was adsorbed on the column equilibrated with water and sodium chloride. Further, in any of the columns, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention were substantially separated.

【０２５３】実施例６ ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機
械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リッ
トルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットル
の０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時
間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。このろ液を排
除分子量１０万の限外ろ過膜を装着した限外ろ過器によ
り２リットルに濃縮し、次に、終濃度が１．５Ｍとなる
ように食塩を添加し５％の塩化セチルピリジニウムをこ
れ以上沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を
遠心分離により除去した。得られた上清を限外ろ過によ
り１リットルに濃縮し、４リットルのエタノールを添加
し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿に１
００ｍｌの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノー
ルを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離に
より沈殿を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸濁
し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの吸
光度が０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食塩
水２リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、２Ｍの食塩水で平衡化した５０ｍｌのＤＥＡＥ−セ
ルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加し、
かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ液を
２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万以下
のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、
着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及びろ過
により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥し
たフコース硫酸含有多糖−Ｕの重量は１５ｇであった。
また、この本発明のフコース硫酸含有多糖−Ｕは多糖性
の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこの
フコース硫酸含有多糖−Ｕは、前記エンド型フコイダン
分解酵素を作用させると上記式（Ｉ）、（II）、及び
（III）で表されるオリゴ糖を生じた。Example 6 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and treated at 80 ° C. for 2 hours. . It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture extract of Gagome kelp. This filtrate was concentrated to 2 liters by an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then salt was added to a final concentration of 1.5M to obtain 5% cetylpyridinium chloride. Was added until no more precipitation occurred. The resulting precipitate was removed by centrifugation. The obtained supernatant was concentrated to 1 liter by ultrafiltration, 4 liter of ethanol was added, and the generated precipitate was collected by centrifugation. 1 for this precipitation
00 ml of 4M saline was added and well stirred, then ethanol was added to 80%, and after stirring, a precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 2 liters of 2M saline, insoluble matter was removed by centrifugation, and 50 ml of DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 2M saline was added,
After stirring, the added resin was removed by filtration. DEAE-Cellulofine A equilibrated with 2 M saline
-Extract the non-adsorbed portion by 800 column with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less,
After completely removing the coloring substance and salt, the insoluble substance was removed by centrifugation and filtration, and the mixture was freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-U weighed 15 g.
Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U of the present invention did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-U produced oligosaccharides represented by the above formulas (I), (II), and (III) when the endo-fucoidan-degrading enzyme was acted on.

【０２５４】実施例７ ガゴメ昆布を充分乾燥後、２ｋｇを自由粉砕機（奈良機
械製作所製）により粉砕し、得られた乾燥粉末を９リッ
トルの８０％エタノールに懸濁し８０℃、２時間処理し
た。処理後ろ紙によりろ過し残渣を得た。この残渣に対
して上記エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返
しエタノール洗浄残渣を得た。この残渣を３６リットル
の０．２Ｍ酢酸カルシウム溶液に懸濁後、９５℃、２時
間処理し、ろ過した。残渣を４リットルの０．２Ｍ酢酸
カルシウム溶液で洗浄し、ガゴメ昆布のフコース硫酸含
有多糖混合物抽出液３６リットルを得た。得られたろ液
に５％の塩化セチルピリジニウムをそれ以上沈殿が生じ
なくなるまで添加し遠心分離により沈殿を集めた。この
沈殿を３リットルの０．４Ｍ食塩水に懸濁後遠心分離
し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に
１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよくかくはん後エタノ
ールを８０％となるように添加し、かくはん後遠心分離
により沈澱を得た。この沈殿を８０％エタノール中に懸
濁し遠心分離するという操作を、上清中の２６０ｎｍの
吸光度を０になるまで繰り返した。この沈殿を２Ｍの食
塩水３リットルに溶解し、不溶物を遠心分離により除去
後、２Ｍの食塩水で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−
セルロファインＡ−８００（生化学工業社製）を添加
し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除去した。ろ
液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファイ
ンＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分子量１０万
以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過
し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠心分離及び
ろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾
燥フコース硫酸含有多糖混合物の重量は９０ｇであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖混合物は多糖性の
樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。 このフコ
ース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥物を７ｇ秤量し、
０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解した。次に、４０００
ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦのカラムを０．２Ｍ
の塩化カルシウムで平衡化した。０．２Ｍの塩化カルシ
ウムに溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をＤＥＡＥ
−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩化カ
ルシウムで充分洗浄し、次に、０〜４Ｍの塩化ナトリウ
ムのグラジエントで溶出させた。溶出画分の内塩化ナト
リウム濃度が０．０５〜０．８Ｍの画分を集め透析によ
り脱塩後凍結乾燥し、実質的にフコース硫酸含有多糖−
Ｆと分離されたフコース硫酸含有多糖−Ｕを２．１ｇ得
た。また、上記溶出画分の内塩化ナトリウム濃度が０．
９〜１．５Ｍの画分を集め透析により脱塩後凍結乾燥
し、実質的にフコース硫酸含有多糖−Ｕと分離されたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆを４．７ｇ得た。Example 7 After thoroughly drying gagome kelp, 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol and treated at 80 ° C. for 2 hours. . It was filtered through a paper after the treatment to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. The residue was suspended in 36 liters of 0.2 M calcium acetate solution, treated at 95 ° C. for 2 hours, and filtered. The residue was washed with 4 liters of 0.2 M calcium acetate solution to obtain 36 liters of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture extract of Gagome kelp. 5% of cetylpyridinium chloride was added to the obtained filtrate until precipitation no longer occurred, and the precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 3 liters of 0.4 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation 3 times, 1 liter of 4M saline was added to the precipitate, well stirred and ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M saline solution, insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE- equilibrated with 2M saline solution.
Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture weighed 90 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture did not contain a coloring substance that was adsorbed to the polysaccharide resin. 7 g of the freeze-dried product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was weighed,
It was dissolved in 0.2 M calcium chloride. Then 4000
0.2 M column of DEAE-Sepharose FF.
Equilibrated with calcium chloride. DEAE of polysaccharide mixture containing sulfated fucose dissolved in 0.2M calcium chloride
-Applied to a column of Sepharose FF, washed extensively with 0.2 M calcium chloride, then eluted with a gradient of 0-4 M sodium chloride. Fractions having a sodium chloride concentration of 0.05 to 0.8 M in the eluted fraction were collected, desalted by dialysis, and lyophilized to give a substantial amount of sulfated-fucose-containing polysaccharide-
2.1 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U separated from F was obtained. In addition, the sodium chloride concentration in the eluted fraction was 0.
Fractions of 9 to 1.5 M were collected, desalted by dialysis, and then freeze-dried to obtain 4.7 g of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F substantially separated from sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.

【０２５５】実施例８ フコース硫酸含有多糖−Ｆの製造 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１．
２ｇ秤量し、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液に終濃度
０．２％となるように溶解し、１．２５％の塩化セチル
ピリジニウムの１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液をこれ以上
沈殿が生じなくなるまで添加した。生じた沈殿を遠心分
離により集め、この沈殿を５００ｍｌの１．５Ｍ食塩水
に懸濁後遠心分離し、洗浄した。この洗浄操作を３回繰
り返した後沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加しよく
かくはん後エタノールを８０％となるように添加し、か
くはん後遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％
エタノール中に懸濁し遠心分離するという操作を、上清
中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。こ
の沈殿を２Ｍの食塩水５００ｍｌに溶解し、不溶物を遠
心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化した１ｍｌ
のＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００（生化学工業社
製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂をろ過により除
去した。ろ液を２Ｍの食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロファインＡ−８００カラムにかけ非吸着分を排除分
子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、着色性物質及び食塩を完全に除去後、遠
心分離及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は７１０
ｍｇであった。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは
多糖性の樹脂に吸着する着色性物質を含まなかった。ま
たこのフコース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まずフ
コースを構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含
有多糖−Ｆであった。Example 8 Production of Sulfuric Acid Fucose-Containing Polysaccharide-F The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was mixed with 1.
2 g was weighed and dissolved in a 1.5 M sodium chloride solution to a final concentration of 0.2%, and 1.25% cetylpyridinium chloride in a 1.5 M sodium chloride solution was added until no more precipitation occurred. . The generated precipitate was collected by centrifugation, suspended in 500 ml of 1.5 M saline and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 1 liter of 4 M saline was added to the precipitate, well stirred and then ethanol was added to 80%, and the precipitate was obtained by stirring and centrifugation. 80% of this precipitate
The operation of suspending in ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 500 ml of 2M saline, the insoluble matter was removed by centrifugation, and 1 ml equilibrated with 2M saline.
DEAE-Cellulofine A-800 (manufactured by Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M saline, and non-adsorbed components were removed by ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to give a coloring substance and salt. Was completely removed, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The weight of the freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was 710.
It was mg. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-F was the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention containing no uronic acid and having fucose as a main component sugar.

【０２５６】実施例９ フコース硫酸含有多糖−Ｆの酵素的精製方法 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を１０
ｇ秤量し、５００ｍｌの人工海水に溶解後、前記フラボ
バクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４０２）由来のエンド型フコイダン分解酵素を５
Ｕ添加し２５℃、５０時間反応させた。反応液を排除分
子量１０万以下のホロファイバーを備えた限外ろ過装置
で限外ろ過し、低分子性物質を完全に除去後、遠心分離
及びろ過により不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍
結乾燥フコース硫酸含有多糖−Ｆの重量は６ｇであっ
た。また、このフコース硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹
脂に吸着する着色性物質を含まなかった。またこのフコ
ース硫酸含有多糖−Ｆはウロン酸を含まず、フコースを
構成糖の主成分とする本発明のフコース硫酸含有多糖−
Ｆであることが判明した。Example 9 Method for Enzymatic Purification of Sulfonose-Fucose-Containing Polysaccharide-F 10% of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was used.
After being weighed and dissolved in 500 ml of artificial seawater, the flavobacterium sp. SA-0082 (FERM B
P-5402) -derived endo-type fucoidan degrading enzyme
U was added and reacted at 25 ° C. for 50 hours. The reaction solution was subjected to ultrafiltration with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less to completely remove low-molecular substances, and then insoluble substances were removed by centrifugation and filtration, followed by freeze-drying. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 6 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F does not contain uronic acid, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention containing fucose as a main component of the sugar-
It turned out to be F.

【０２５７】実施例１０ フコース硫酸含有多糖−Ｆの培養的精製方法 実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０
ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２
００ｇと酵母エキス４ｇを加え、３０リットルのジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、前記フラボバクテリウム
ｓｐ． ＳＡ−００８２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０
２）を植菌して２５℃、２４時間培養した。培養液を遠
心分離し菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロフ
ァイバーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性
物質を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物
質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有
多糖−Ｆの重量は３６ｇであった。また、このフコース
硫酸含有多糖−Ｆは多糖性の樹脂に吸着する着色性物質
を含まなかった。またこのフコース硫酸含有多糖−Ｆは
ウロン酸を含まずフコースを構成糖の主成分とする本発
明のフコース硫酸含有多糖−Ｆであることが判明した。Example 10 Method for Culturally Purifying Sulfose-Fucose-Containing Polysaccharide-F 60% of the sulfate-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 7 was used.
Weigh g and dissolve in 20 liters of artificial seawater, then peptone 2
00 g and yeast extract 4 g were added, and the mixture was placed in a 30 liter jar fermenter and sterilized, and then the flavobacterium sp. SA-0082 strain (FERM BP-540
2) was inoculated and cultured at 25 ° C. for 24 hours. After removing the bacterial cells by centrifuging the culture solution, ultrafiltration is performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less, and low molecular substances are completely removed, and then insoluble substances are obtained by centrifugation and filtration. Was removed and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 36 g. In addition, this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F did not contain a coloring substance that was adsorbed on the polysaccharide resin. Further, it was found that this sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F of the present invention containing no uronic acid and having fucose as the main component of the constituent sugars.

【０２５８】実施例１１ 実施例７記載のフコース硫酸含有多糖混合物の凍結乾燥
物を１ｇずつ４つ秤量し、それぞれ水、０．２Ｍの塩化
ナトリウム、０．２Ｍの塩化カルシウム、０．２Ｍの塩
化マグネシウムに溶解した。次に、５００ｍｌのＤＥＡ
Ｅ−セファロースＦＦのカラムを４本用意し、内２本を
０．２Ｍの塩化ナトリウム、１本を０．２Ｍの塩化カル
シウム、１本を０．２Ｍの塩化マグネシウムでそれぞれ
平衡化した。０．２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化したカ
ラムの一方をカラムの１０倍量の水で洗浄した。水、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムにそ
れぞれ溶解したフコース硫酸含有多糖混合物をそれぞれ
水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ムでそれぞれ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムにかけ、それぞれを平衡化に用いた溶液で充分洗
浄し、次に、０から４Ｍの塩化ナトリウムのグラジェン
トで溶出させた。この結果、塩化カルシウム及び塩化マ
グネシウムを用いた系のみカラムにかけたフコース硫酸
含有多糖混合物の総量がカラムに吸着した。水及び食塩
で平衡化したカラムには０．４ｇ相当のフコース硫酸含
有多糖しか吸着しなかった。また、いずれのカラムにお
いても、フコース硫酸含有多糖−Ｆとフコース硫酸含有
多糖−Ｕは実質的に分離された。Example 11 Four 1 g freeze-dried products of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 7 were weighed, and water, 0.2 M sodium chloride, 0.2 M calcium chloride and 0.2 M chloride were respectively weighed. Dissolved in magnesium. Next, 500 ml of DEA
Four E-Sepharose FF columns were prepared, and two of them were equilibrated with 0.2M sodium chloride, one with 0.2M calcium chloride, and one with 0.2M magnesium chloride. One of the columns equilibrated with 0.2 M sodium chloride was washed with 10 column volumes of water. Apply the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture dissolved in water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride to the DEAE-Sepharose FF column equilibrated with water, sodium chloride, calcium chloride, and magnesium chloride, respectively, and use each for equilibration. The solution was washed thoroughly with the same solution and then eluted with a 0-4 M sodium chloride gradient. As a result, the total amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture applied to the column only in the system using calcium chloride and magnesium chloride was adsorbed to the column. Only 0.4 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was adsorbed on the column equilibrated with water and sodium chloride. Further, in both columns, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U were substantially separated.

【０２５９】実施例１２ 実施例１記載のフコース硫酸含有多糖混合物を７ｇ秤量
し、８００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムに溶解し
た。次に、４リットルのＤＥＡＥ−セファロースＦＦの
カラムを０．２Ｍの塩化カルシウムで平衡化し、上記フ
コース硫酸含有多糖溶液を全量カラムにかけ、８リット
ルの０．２Ｍ塩化カルシウム溶液で洗浄後、０から４Ｍ
の塩化ナトリウムのグラジエントで溶出させた。溶出画
分の内ウロン酸が検出される画分（塩化ナトリウム濃度
約０．９Ｍ以下：フコース硫酸含有多糖−Ｕ）、ウロン
酸が検出されない画分（塩化ナトリウム濃度約１．２Ｍ
付近：フコース硫酸含有多糖−Ｆ）のそれぞれを脱塩後
凍結乾燥し、乾燥品をそれぞれ１．４ｇ及び４．８ｇ得
た。Example 12 7 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture described in Example 1 was weighed and dissolved in 800 ml of 0.2 M calcium chloride. Next, a 4-liter DEAE-Sepharose FF column was equilibrated with 0.2 M calcium chloride, the above-mentioned polysaccharide solution containing a sulfated-fucose solution was applied to the column, and after washing with 8 liters of 0.2 M calcium chloride solution, 0 to 4 M was added.
Was eluted with a gradient of sodium chloride. Fraction in which uronic acid is detected in the eluted fraction (sodium chloride concentration of about 0.9 M or less: sulfated-fucose-containing polysaccharide-U), fraction in which uronic acid is not detected (sodium chloride concentration of about 1.2 M)
Vicinity: Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F) was desalted and then freeze-dried to obtain 1.4 g and 4.8 g of dried products, respectively.

【０２６０】実施例１３ 実施例１で得られるフコース硫酸含有多糖混合物に、フ
ラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４０２）の生産するエンド型フコイダン分解
酵素を作用させると下記の構造を有するオリゴ糖を生成
する。Example 13 The mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 1 was mixed with Flavobacterium sp. SA-0082 (FERM
When an endo-fucoidan-degrading enzyme produced by BP-5402) is allowed to act, an oligosaccharide having the following structure is produced.

【化２１】 [Chemical 21]

【化２２】 [Chemical formula 22]

【化２３】 [Chemical formula 23]

【０２６１】本発明者らは、下記の酵素反応を行い、上
記オリゴ糖を得た。The present inventors obtained the above oligosaccharide by carrying out the following enzyme reaction.

【０２６２】すなわち、２．５％の実施例１のフコース
硫酸含有多糖混合物溶液８０ｍｌと、５０ｍＭのリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）６０ｍｌと４Ｍの塩化ナトリウム
２０ｍｌと３２ｍＵ／ｍｌのエンド型フコイダン分解酵
素溶液４０ｍｌを混合し、２５℃で４８時間反応させ
た。That is, 80 ml of a 2.5% solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture solution of Example 1, 60 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 20 ml of 4 M sodium chloride and 32 mU / ml of endo-type fucoidan decomposition. 40 ml of the enzyme solution was mixed and reacted at 25 ° C for 48 hours.

【０２６３】反応液をセルロファインＧＣＬ−３００
（生化学工業社製）のカラムにより分子量分画し、分子
量２０００以下の画分を集めた。この画分をマイクロア
シライザーＧ３により脱塩後、ＤＥＡＥ−セファロース
ＦＦにより３つの画分を分離し、再度脱塩後、凍結乾燥
した。こうして上記各式（Ｉ）、（II）、（III）のオ
リゴ糖をそれぞれ２５０ｍｇ、３１０ｍｇ、５２ｍｇ得
た。The reaction solution was used as Cellulofine GCL-300.
Molecular weight fractionation was performed using a column (manufactured by Seikagaku Corporation), and fractions having a molecular weight of 2000 or less were collected. This fraction was desalted with Micro Acylyzer G3, then separated into 3 fractions with DEAE-Sepharose FF, desalted again, and lyophilized. Thus, 250 mg, 310 mg and 52 mg of oligosaccharides of the above formulas (I), (II) and (III) were obtained.

【０２６４】実施例１４ 実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物１０ｇ
を０．２Ｍのクエン酸５００ｍｌに溶解し、ｐＨを２．
９に調整後、１００℃で３時間処理した。この加水分解
物に１Ｍの酢酸カルシウム溶液を１５０ｍｌ添加し、生
じた沈殿を遠心分離により除去後セルロファインＧＣＬ
−２５によるゲルろ過で分子量分画し（分子量５０００
以上、５０００〜３０００超、３０００〜２０００超、
２０００〜１０００超、１０００〜５００超、５００以
下）、分子量の大きい方から順に、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−
１、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−２、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−３、ＧＦｄ
−Ｏｌｉ−４、ＧＦｄ−Ｏｌｉ−５、及びＧＦｄ−Ｏｌ
ｉ−６とした。これらの６画分を脱塩後凍結乾燥し、乾
燥品をそれぞれ２．３ｇ、１．７ｇ、０．８８ｇ、１．
８ｇ、１．４ｇ、及び０．７２ｇ得た。Example 14 10 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1
Was dissolved in 500 ml of 0.2 M citric acid and the pH was adjusted to 2.
After adjusting to 9, it was treated at 100 ° C. for 3 hours. To this hydrolyzate, 150 ml of 1M calcium acetate solution was added, and the resulting precipitate was removed by centrifugation and then Cellulofine GCL
The molecular weight was fractionated by gel filtration with -25 (molecular weight 5000
Above, over 5000-3000, over 3000-2000,
2,000 to more than 1000, more than 1000 to more than 500, and 500 or less), in descending order of molecular weight, GFd-Oli-
1, GFd-Oli-2, GFd-Oli-3, GFd
-Oli-4, GFd-Oli-5, and GFd-Ol
i-6. These 6 fractions were desalted and then lyophilized to obtain dried products of 2.3 g, 1.7 g, 0.88 g and 1.
8 g, 1.4 g, and 0.72 g were obtained.

【０２６５】実施例１５ 実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物を６０
ｇ秤量し、２０リットルの人工海水に溶解後ペプトン２
００ｇと酵母エキス４ｇを加え３０リットル容のジャー
ファーメンターに入れ滅菌後、フラボバクテリウム ｓ
ｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を
植菌し２５℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離
し、菌体を除去後、排除分子量１０万以下のホロファイ
バーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、低分子性物質
を完全に除去後、遠心分離及びろ過により不溶性物質を
除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコース硫酸含有多糖
−Ｆの重量は３６ｇであった。Example 15 The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 was mixed with 60
Weigh g and dissolve in 20 liters of artificial seawater, then peptone 2
Add 00 g and 4 g of yeast extract, put in a 30 liter jar fermenter and sterilize, then flavobacterium s
p. SA-0082 (FERM BP-5402) was inoculated and cultured at 25 ° C. for 24 hours. After removing the bacterial cells by centrifuging the culture solution, ultrafiltration is performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 100,000 or less, and the low molecular weight substances are completely removed, and then insoluble by centrifugation and filtration. Material was removed and lyophilized. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide-F weighed 36 g.

【０２６６】実施例１６ マナマコを５ｋｇ解体し、内臓を除去し、体壁を集め
た。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍｌのアセトンを加
え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着
色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を
吸引乾燥し１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．
４Ｍの食塩水２．８リットルを加え、１００℃で１時間
処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍの食塩水で充分洗浄
し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％の
セチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなく
なるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈
殿を０．４Ｍの食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られ
た沈殿に１リットルの４Ｍ食塩水を添加し、ホモジナイ
ザーで処理後、かくはんしながら４リットルのエタノー
ルを添加し、１時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。
この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過とい
う工程を上清の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り
返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ食塩水に懸濁
し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子
量３万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完
全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのフコース硫酸含有多
糖を得た。Example 16 5 kg of sea cucumber was disassembled, the internal organs were removed, and the body wall was collected. Acetone of 500 ml per 200 g of wet weight of the body wall was added, treated with a homogenizer and then filtered, and the residue was washed with acetone until there was no more colored substance. The residue was sucked and dried to obtain 140 g of a dried product. 0.
2.8 liters of 4M saline was added, and the mixture was treated at 100 ° C. for 1 hour and then filtered, and the residue was sufficiently washed with 0.4M saline to obtain 3.7 liters of extract. 5% of cetylpyridinium chloride was added to this extract until no more precipitate was formed, and the formed precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 0.4 M saline and then centrifuged again, and 1 liter of 4 M saline was added to the obtained precipitate. After treatment with a homogenizer, 4 liters of ethanol were added with stirring, and 1 After stirring for a while, the mixture was filtered to obtain a precipitate.
For this precipitation, the process of suspending in 80% ethanol and then filtering was repeated until the absorbance at 260 nm of the supernatant became zero. The obtained precipitate was suspended in 2 liters of 2M saline and the insoluble matter was removed by centrifugation. The supernatant was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration device equipped with a membrane having an exclusion molecular weight of 30,000, completely desalted, and then freeze-dried to obtain 3.7 g of a sulfated-fucose-containing polysaccharide.

【０２６７】実施例１７ ヒバマタ（Fucus vesiculosus ）を充分乾燥後、乾燥物
２ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕
し、得られた乾燥粉末を９リットルの８０％エタノール
に懸濁し、８０℃、２時間処理した。処理後ろ紙により
ろ過し、残渣を得た。この残渣に対して上記エタノール
洗浄、ろ過という操作を３回繰り返しエタノール洗浄残
渣を得た。この残渣を４０リットルの水に懸濁後、１０
０℃、２時間処理し、ろ過した。ろ液に０．５Ｍとなる
ように塩化ナトリウムを加え、更に５％の塩化セチルピ
リジニウムをそれ以上沈殿が生じなくなるまで添加し、
遠心分離により沈殿を集めた。この沈殿を３リットルの
０．４Ｍ塩化ナトリウムに懸濁後遠心分離し、洗浄し
た。この洗浄操作を３回繰り返した後沈殿に２５０ｇの
塩化ナトリウムを加え、３リットルのエタノール中に懸
濁し、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を８０％エ
タノール中に懸濁し、遠心分離するという操作を、上清
中の２６０ｎｍの吸光度が０になるまで繰り返した。こ
の沈殿を２Ｍの塩化ナトリウム３リットルに溶解し、不
溶物を遠心分離により除去後、２Ｍの食塩水で平衡化し
た１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００
（生化学工業社製）を添加し、かくはん後、加えた樹脂
をろ過により除去した。ろ液を２Ｍの塩化ナトリウムで
平衡化したＤＥＡＥーセルロファインＡ−８００カラム
にかけ非吸着分を排除分子量１０万以下のホロファイバ
ーを備えた限外ろ過装置で限外ろ過し、着色性物質及び
塩化ナトリウムを完全に除去後、遠心分離及びろ過によ
り不溶性物質を除去し、凍結乾燥した。凍結乾燥フコー
ス硫酸含有多糖の重量は９２ｇであった。Example 17 Hibamata (Fucus vesiculosus) was thoroughly dried, and then 2 kg of the dried product was pulverized by a free pulverizer (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of 80% ethanol to give 80 It was processed at 2 ° C. for 2 hours. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. The above-mentioned operation of washing with ethanol and filtration was repeated three times on this residue to obtain an ethanol-washed residue. After suspending the residue in 40 liters of water, 10
It was treated at 0 ° C. for 2 hours and filtered. Sodium chloride was added to the filtrate to 0.5 M, and 5% cetylpyridinium chloride was further added until precipitation did not occur,
The precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 3 liters of 0.4 M sodium chloride and then centrifuged and washed. After repeating this washing operation three times, 250 g of sodium chloride was added to the precipitate, the suspension was suspended in 3 liters of ethanol, and the precipitate was obtained by centrifugation. The operation of suspending this precipitate in 80% ethanol and centrifuging was repeated until the absorbance at 260 nm in the supernatant became zero. This precipitate was dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, the insoluble matter was removed by centrifugation, and 100 ml of DEAE-Cellulofine A-800 equilibrated with 2M saline.
(Seikagaku Corporation) was added, and after stirring, the added resin was removed by filtration. The filtrate was applied to a DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 2 M sodium chloride, and non-adsorbed components were removed. Ultrafiltration was performed with an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having a molecular weight of 100,000 or less to remove coloring substances and sodium chloride. After complete removal, insoluble material was removed by centrifugation and filtration, and freeze-dried. The freeze-dried sulfated-fucose-containing polysaccharide weighed 92 g.

【０２６８】実施例１８ わかめ（Undaria pinnatifida)を充分乾燥後、２ｋｇを
自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕し、得られ
た乾燥粉末を９リットルのエタノールに懸濁し、７５
℃、１時間処理した。処理後ろ紙によりろ過し、残渣を
得た。この残渣に対して８０％のエタノールを９リット
ル添加、かくはんし、８０℃、１時間処理後、ろ紙によ
りろ過し、残渣を得た。この残渣に対して、上記８０％
エタノール洗浄、ろ過という操作を３回繰り返し、エタ
ノール洗浄残渣１９０８ｇを得た。この残渣のうち６８
４ｇを９リットルの０．２Ｍ酢酸カルシウムに懸濁後、
９５℃、１時間処理し、２４時間静置後その上清を得
た。上清を除去した沈殿に９リットルの０．２Ｍ酢酸カ
ルシウムを添加かくはんし、１時間静置後上清を得、上
記上清と合せた。こうして得られた上清をろ紙でろ過
後、排除分子量１０，０００のホロファイバーを備えた
限外ろ過装置により限外ろ過し、３５０ｍｌに濃縮し
た。濃縮液を遠心分離し、沈殿を除去後、２ｍＭの塩化
ナトリウムを添加しながら限外ろ過し、完全に酢酸カル
シウムを除去後、凍結乾燥し、凍結乾燥物３．２ｇを得
た。凍結乾燥物中のフコース硫酸含有多糖の重量は３．
１ｇであった。Example 18 Seaweed (Undaria pinnatifida) was thoroughly dried, and then 2 kg was crushed by a free crusher (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and the obtained dry powder was suspended in 9 liters of ethanol, and
It was treated at ℃ for 1 hour. After treatment, the solution was filtered through paper to obtain a residue. To this residue, 9 liters of 80% ethanol was added, stirred, treated at 80 ° C. for 1 hour, and then filtered through filter paper to obtain a residue. 80% above for this residue
The operations of washing with ethanol and filtration were repeated three times to obtain 1908 g of an ethanol washing residue. 68 of this residue
After suspending 4 g in 9 L of 0.2 M calcium acetate,
The mixture was treated at 95 ° C for 1 hour and left standing for 24 hours to obtain the supernatant. 9 L of 0.2 M calcium acetate was added to the precipitate from which the supernatant had been removed, and the mixture was stirred and allowed to stand for 1 hour to obtain a supernatant, which was combined with the above supernatant. The supernatant thus obtained was filtered through a filter paper, then ultrafiltered by an ultrafiltration device equipped with a hollow fiber having an exclusion molecular weight of 10,000, and concentrated to 350 ml. The concentrated solution was centrifuged, the precipitate was removed, and ultrafiltration was performed while adding 2 mM sodium chloride to completely remove calcium acetate, followed by freeze-drying to obtain 3.2 g of a freeze-dried product. The weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide in the freeze-dried product was 3.
It was 1 g.

【０２６９】実施例１９ （１）ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物の調製 乾燥ガゴメ昆布２Ｋｇを自由粉砕機Ｍ−２型（奈良機械
製作所製）により粉砕し、４．５倍量の８０％エタノー
ル中で８０℃、２時間処理後、ろ過した。残渣に対し、
上記８０％エタノール抽出、ろ過という工程を更に３回
繰り返し、エタノール洗浄残渣１８７０ｇを得た。残渣
に３６リットルの水を加え、１００℃、２時間処理し、
ろ過により抽出液を得た。抽出液の塩濃度を４００ｍＭ
の塩化ナトリウム溶液と同じにした後、５％のセチルピ
リジルクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで添加
し、遠心分離した。その沈殿を、８０％のエタノールで
繰り返し洗浄し、セチルピリジニウムクロリドを完全に
除去した後、３リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解
し、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍの塩化ナトリウム
で平衡化した１００ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ
−８００を懸濁し、かくはん後ろ過し、樹脂を除いた。
このろ液を、２Ｍの塩化ナトリウムで平衡化した１００
ｍｌのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００のカラムに
かけ、通過画分を限外ろ過器（ろ過膜の排除分子量１０
万）により脱塩及び低分子除去を行い、この際生じた沈
殿を遠心分離により除去した。この上清を凍結乾燥して
精製ガゴメ昆布フコース硫酸含有多糖混合物８２．２ｇ
を得た。Example 19 (1) Preparation of Gagome kelp fucose sulfate-containing polysaccharide mixture 2 Kg of dried Gagome kelp was pulverized with a free pulverizer M-2 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.), and 4.5 times in 80% ethanol. After treatment at 80 ° C. for 2 hours, it was filtered. For the residue,
The above steps of 80% ethanol extraction and filtration were repeated three more times to obtain 1870 g of ethanol washing residue. To the residue was added 36 liters of water, treated at 100 ° C for 2 hours,
An extract was obtained by filtration. The salt concentration of the extract is 400 mM
After making it the same as the sodium chloride solution in Example 1, 5% cetylpyridyl chloride was added until no more precipitation occurred, and the mixture was centrifuged. The precipitate was repeatedly washed with 80% ethanol to completely remove cetylpyridinium chloride, then dissolved in 3 liters of 2M sodium chloride, insoluble matter was removed by centrifugation, and equilibrated with 2M sodium chloride. 100 ml DEAE-Cellulofine A
-800 was suspended, stirred and filtered to remove the resin.
The filtrate was equilibrated with 2M sodium chloride to 100.
It was applied to a column of ml DEAE-Cellulofine A-800, and the passed-through fraction was subjected to an ultrafiltration (excluded molecular weight of filtration membrane was
10,000) for desalting and removal of low-molecular weight compounds, and the precipitate generated at this time was removed by centrifugation. This supernatant was freeze-dried and then purified. Gagome kelp sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture 82.2 g
Got

【０２７０】（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製 上記のガゴメ昆布由来フコース硫酸含有多糖混合物６ｇ
を６００ｍｌの０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍ
Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解後、あらかじ
め０．２Ｍの塩化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．０）で平衡化した３６００ｍｌのＤＥ
ＡＥ−セファロースＦＦのカラムにかけ、０．２Ｍの塩
化カルシウムを含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ
６．０）で充分カラムを洗浄後、０〜２Ｍの塩化ナトリ
ウムのグラジエントで溶出した。塩化ナトリウム濃度が
０．７５Ｍ以上で溶出してくるフコース硫酸含有多糖−
Ｆ画分を集め、排除分子量１０万の限外ろ過膜を装着し
た限外ろ過器で濃縮脱塩後凍結乾燥し、フコース硫酸含
有多糖−Ｆの凍結乾燥標品を３．３ｇ得た。(2) Preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F 6 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture derived from Gagome kombu described above
20m containing 600ml of 0.2M calcium chloride
3600 ml of DE after dissolution in M sodium acetate (pH 6.0) and then equilibrated with 20 mM sodium acetate (pH 6.0) containing 0.2 M calcium chloride in advance.
Apply to AE-Sepharose FF column, 20 mM sodium acetate containing 0.2 M calcium chloride (pH
After thoroughly washing the column with 6.0), it was eluted with a gradient of 0 to 2 M sodium chloride. Sulfate-fucose-containing polysaccharide that elutes at a sodium chloride concentration of 0.75 M or more
The F fraction was collected, concentrated and desalted with an ultrafilter equipped with an ultrafiltration membrane having an exclusion molecular weight of 100,000, and then freeze-dried to obtain 3.3 g of a freeze-dried preparation of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.

【０２７１】（３）エンド型フコース硫酸含有多糖分解
酵素の調製 アルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５７４７）を、グルコース０．２５％、ペプトン
１．０％、酵母エキス０．０５％を含む人工海水（ジャ
マリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６０
０ｍｌを分注して殺菌した（１２０℃、２０分）２リッ
トルの三角フラスコに接種し、２５℃で２５時間培養し
て種培養液とした。 ペプトン２００ｇ、酵母エキス４
ｇ、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）４ｍｌを
含む人工海水ｐＨ８．０からなる培地１８リットルを３
０リットル容のジャーファーメンターに入れて１２０℃
で２０分殺菌した。冷却後、別に１２０℃、１５分殺菌
した２リットルの人工海水に溶解した２０ｇの実施例８
の方法を用いて調製したガゴメ昆布由来のフコース硫酸
含有多糖−Ｆ及び上記の種培養液６００ｍｌを接種し、
２４℃で２０時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２
５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。培
養上清中の本発明のフコース硫酸含有多糖分解酵素の活
性をフコース硫酸含有多糖−Ｆを基質に用いて測定した
ところ、５ｍＵ／ｍｌ・培養液であった。得られた培養
上清を、分画分子量１万の限外ろ過器により濃縮後、生
じた沈殿を遠心分離により除去し、８５％飽和硫安塩析
し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度
の人工海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、４００
ｍｌの粗酵素を得た。(3) Preparation of endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme Alteromonas sp. SN-1009 (FERM
BP-5747), glucose 60% 0.25%, peptone 1.0%, yeast extract 0.05% artificial seawater (manufactured by Jamarin Laboratories) pH 8.2 medium 60
0 ml was dispensed and sterilized (120 ° C, 20 minutes) to inoculate a 2 liter Erlenmeyer flask, and the mixture was cultured at 25 ° C for 25 hours to obtain a seed culture solution. 200g peptone, 4 yeast extract
g, and 4 ml of an antifoaming agent (KM70 manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 3 ml of 18 liters of a medium consisting of artificial seawater pH 8.0
Put in a 0 liter jar fermenter at 120 ° C
It was sterilized for 20 minutes. After cooling, 20 g of Example 8 separately dissolved in 2 liters of artificial seawater sterilized at 120 ° C. for 15 minutes
Inoculated with the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F derived from Gagome kelp prepared by the method of above and 600 ml of the above seed culture,
Aeration rate of 10 liters per minute and 2 per minute for 20 hours at 24 ° C
The culture was carried out under a stirring speed of 50 rpm. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain cells and culture supernatant. When the activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention in the culture supernatant was measured using the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F as a substrate, it was 5 mU / ml · culture liquid. The obtained culture supernatant was concentrated by an ultrafilter having a molecular weight cut-off of 10,000, and then the formed precipitate was removed by centrifugation, salted out with 85% saturated ammonium sulfate, and the formed precipitate was collected by centrifugation. 20 mM Tris containing artificial seawater (Jamarine S) at a concentration of 1 /
Thoroughly dialyzed against hydrochloric acid buffer (pH 8.2), 400
ml of crude enzyme was obtained.

【０２７２】得られた粗酵素液を、あらかじめ５ｍＭの
アジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工海水（ジャ
マリンＳ）を含む２０ｍＭのトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ
８．２）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８
００（生化学工業社製）のカラムに吸着させ、吸着物を
同緩衝液にて充分洗浄後、同緩衝液中に１００ｍＭ、２
００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、及び６００ｍＭの
塩化ナトリウムを含む溶液で溶出し、活性画分を集め
た。得られた部分精製酵素の活性はフコース硫酸含有多
糖−Ｆを基質に用いて測定したところ、１０２００ｍＵ
（１０．２Ｕ）であった。なお、他のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の混入は認められなかった。得られた部分
精製酵素の一部をあらかじめ１０分の１濃度の人工海水
（ジャマリンＳ）及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む
１０ｍＭのトリス−塩酸酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したセファクリル Ｓ−２００でゲルろ過を行い、そ
の分子量を求めたところ約１０万であった。The obtained crude enzyme solution was preliminarily treated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH: 5 mM sodium azide and artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10).
DEAE-Cellulofine A-8 equilibrated in 8.2)
00 column (manufactured by Seikagaku Corporation) was adsorbed, and the adsorbate was thoroughly washed with the same buffer solution.
Elution was performed with a solution containing 00 mM, 300 mM, 400 mM, and 600 mM sodium chloride, and active fractions were collected. The activity of the obtained partially purified enzyme was 10200 mU when measured using a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F as a substrate.
It was (10.2 U). No contamination with other sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzymes was observed. Sephacryl S obtained by previously equilibrating a part of the obtained partially purified enzyme with artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10 and 10 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 8.0) containing 5 mM sodium azide. Gel filtration was performed at -200, and the molecular weight was determined to be about 100,000.

【０２７３】（４）上記実施例で得た部分精製酵素及び
ＰＡ−ＦＦをそれぞれ酵素源及び基質として本酵素の活
性に及ぼすカルシウム濃度の検討を行った。酵素反応に
用いる緩衝液には５０ｍＭの酢酸、イミダゾール、及び
トリス−塩酸を含むｐＨ７の緩衝液を用いた。また、反
応液には終濃度４００ｍＭの塩化ナトリウムを溶存させ
た。反応液中の塩化カルシウム濃度を０〜１００ｍＭま
で変化させ、酵素活性を測定したところ、図２３に示す
ような結果が得られた。なお、図２３において、縦軸は
相対活性（％）、横軸は反応液中カルシウム濃度（ｍ
Ｍ) を示す。この結果、本酵素はカルシウム塩の存在下
著しく活性が高められることが判明した。(4) The partially purified enzyme and PA-FF obtained in the above Examples were used as the enzyme source and substrate, and the calcium concentration which affects the activity of this enzyme was examined. As the buffer solution used for the enzyme reaction, a buffer solution containing 50 mM acetic acid, imidazole, and tris-hydrochloric acid and having a pH of 7 was used. Further, sodium chloride having a final concentration of 400 mM was dissolved in the reaction solution. When the concentration of calcium chloride in the reaction solution was changed from 0 to 100 mM and the enzyme activity was measured, the results shown in FIG. 23 were obtained. In FIG. 23, the vertical axis represents relative activity (%), and the horizontal axis represents the concentration of calcium in the reaction solution (m
M) is shown. As a result, it was revealed that the activity of this enzyme was remarkably enhanced in the presence of calcium salt.

【０２７４】（５）本発明のエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素を下記６種類の緩衝液で透析しながら５℃
で２０時間保持した後、残存活性を測定した。 １．２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ２．５ｍＭアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．２） ３．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ４．５ｍＭアジ化ナトリウム及び５００ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ５．５ｍＭアジ化ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、及び１０ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２） ６．５ｍＭアジ化ナトリウム及び１０分の１濃度の人工
海水（ジャマリンＳ）を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．２） 以上の結果、１、２、及び３の緩衝液で透析した本発明
のフコース硫酸含有多糖分解酵素は失活し、４、５、及
び６の緩衝液で透析した本発明のフコース硫酸含有多糖
分解酵素は活性が保持された。このことから本酵素は５
００ｍＭの塩化ナトリウムの存在下あるいは１０ｍＭの
カルシウムイオンの存在下で安定化されることが判明し
た。(5) The endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dialyzed against the following 6 types of buffer solutions at 5 ° C.
After being kept at 20 ° C. for 20 hours, residual activity was measured. 1. 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) 20 mM Tris-HCl buffer containing 2.5 mM sodium azide (pH 8.2) 20 mM Tris-HCl buffer containing 3.5 mM sodium azide and 50 mM sodium chloride (PH 8.2) 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer containing 4.5 mM sodium azide and 500 mM sodium chloride (pH 8.2) 5.5 mM sodium azide, 50 mM sodium chloride, and 10 mM calcium chloride containing 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer Solution (pH 8.2) 20 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 8.2) containing 6.5 mM sodium azide and artificial seawater (Jamarin S) at a concentration of 1/10 The above results 1, 2, and 3 buffers The sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention dialyzed with a liquid was inactivated, and the 4,5-, 6- and Fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention was dialyzed liquor activity was retained. Therefore, this enzyme is 5
It was found to be stabilized in the presence of 00 mM sodium chloride or in the presence of 10 mM calcium ions.

【０２７５】（６）上記実施例で調製したフコース硫酸
含有多糖−Ｆを５ｇ秤量し、４７１ｍｌの５０ｍＭイミ
ダゾール緩衝液（ｐＨ８）、１２．５ｍｌの４Ｍ塩化ナ
トリウム、６．２５ｍｌの４Ｍ塩化カルシウム、及び実
施例１９−（３）で得られた本発明のフコース硫酸含有
多糖分解酵素の部分精製品１０ｍｌ（６ｍＵ相当）を混
合し、２５℃で１２０時間反応させたところフコース硫
酸含有多糖−Ｆの低分子化物が得られた。得られた低分
子化物のＩＲ及びＮＭＲの分析結果はそれぞれ図２５及
び図２６に示すとおりであった。また、セルロファイン
ＧＣＬ−３００でゲルろ過したところ、図２４に示す結
果が得られた。すなわち、本物質は分子量１０００〜３
００００にわたって分布するものである。また、本物質
の硫酸含量はＳＯ４（分子量９６）として４６％であ
り、中性糖組成はフコース：ガラクトース＝１００：４
であった。なお、図２４〜図２６における縦軸及び横軸
は、それぞれ図２〜図４と同義である。(6) 5 g of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F prepared in the above Example was weighed, and 471 ml of 50 mM imidazole buffer (pH 8), 12.5 ml of 4M sodium chloride, 6.25 ml of 4M calcium chloride, and When 10 ml (corresponding to 6 mU) of a partially purified product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme of the present invention obtained in Example 19- (3) was mixed and reacted at 25 ° C for 120 hours, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F had a low content. A molecular product was obtained. The IR and NMR analysis results of the obtained low molecular weight compound were as shown in FIGS. 25 and 26, respectively. Further, when gel filtration was carried out using Cellulofine GCL-300, the results shown in FIG. 24 were obtained. That is, this substance has a molecular weight of 1000 to 3
It is distributed over 0000. The sulfuric acid content of this substance was 46% as SO 4 (molecular weight 96), and the neutral sugar composition was fucose: galactose = 100: 4.
Met. The vertical axis and the horizontal axis in FIGS. 24 to 26 have the same meanings as those in FIGS. 2 to 4, respectively.

【０２７６】実施例２０ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６４）をＡＳＦ１
０４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌと
なるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを４つ用意し、
それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１２、及び１５で
得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液（５ｍ
ｇ／ｍｌ）のフィルター処理液〔ポアサイズ０．２０μ
ｍのセルロースアセテート膜（コーニング社製）でろ過
したもの（以下フィルター処理はこの条件で行った）〕
を１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４０
時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分
離した。得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテ
トラアセテート及び０．５％のナトリウムラウロイルサ
ルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌ
クレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加して５０℃、
３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネース
Ｋを１μｌ添加して５０℃、１時間処理した。処理後の
細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて
１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルを
エチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランス
イルミネータを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認した
ところ、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認され
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液
を上記のフコース硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操
作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有多糖
の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。この結果よ
り、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１２、及び１５で得ら
れたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシスを誘発さ
れることが明らかとなった。ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ−２４０）を用い、実施例１、１２、及び１５で得
られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとな
るように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭの
ヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、２０
分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス誘発
作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 20 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CRL-1964) to ASF1
The cells were suspended in 04 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) at 5 × 10 5 cells / 9 ml. Prepare four 9 ml of this suspension,
For each suspension, a physiological saline solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15 (5 m
g / ml) filter treatment solution [pore size 0.20μ
m filtered through a cellulose acetate membrane (manufactured by Corning Incorporated) (hereinafter, the filter treatment was performed under these conditions)]
1 ml was added, and 40 at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide.
Incubated for hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were treated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH: 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate).
7.8) Suspend in 20 μl, add 1 μl of 10 mg / ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) and
After treatment for 30 minutes, 1 μl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After immersing this gel in an ethidium bromide solution for 30 minutes and confirming the state of DNA in the gel using a transilluminator, a DNA ladder peculiar to apoptosis was confirmed. For confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in the same manner as the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide. The same DNA ladder as the case was confirmed. From these results, it was revealed that HL-60 cells were induced to undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15. HL-60 (ATCC C
CL-240), each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 12, and 15 was added to a 30 mM Hepes buffer solution (pH 7.2) containing 120 mM sodium chloride at 5 mg / ml. Melt, 121 ℃, 20
The thing which was autoclaved for 1 minute] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.

【０２７７】実施例２１ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０５ 個／９ｍｌとな
るように懸濁した。この懸濁液９ｍｌに対し、実施例１
５で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で２０時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を「アポトーシス実験プロトコール」（秀潤社、田
沼靖一監修、第９３〜９５頁、１９９５年）に従ってギ
ムザ染色した。すなわち得られた細胞をカルノア固定液
（酢酸：メタノール＝１：３）を用いてスライドグラス
上に固定し、ギムザ色素（メルク社製）を用いて染色
し、光学顕微鏡により観察したところアポトーシス特有
の核の断片化が観察された。この結果よりＨＬ−６０細
胞は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖により
アポトーシスを起こすことが明らかとなった。実施例１
５で得られたフコース硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌ
となるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍ
Ｍのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２１℃、
２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 21 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
The cells were suspended in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) at 5 × 10 5 cells / 9 ml. Example 9 was added to 9 ml of this suspension.
1 ml of a filtered solution of a physiological saline solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in 5 (5 mg / ml) was added,
The cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 20 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were stained with Giemsa according to the "apoptosis experiment protocol" (supervised by Shujunsha, Yasuichi Tanuma, pages 93 to 95, 1995). That is, the obtained cells were fixed on a slide glass using a Carnoy's fixative (acetic acid: methanol = 1: 3), stained with Giemsa dye (Merck), and observed by an optical microscope to show that they are peculiar to apoptosis. Nuclear fragmentation was observed. From these results, it was revealed that HL-60 cells undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15. Example 1
The sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in 5 [5 mg / ml
30m containing 120mM sodium chloride
Dissolve in M Hepes buffer (pH 7.2), 121 ℃,
After 20 minutes of autoclave treatment], the apoptosis-inducing action was measured according to the above, and similar results were obtained.

【０２７８】実施例２２ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０５ コ／４．５ｍｌ
となるように懸濁した。この懸濁液４．５ｍｌを４つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、実施例１、１５、及び
１８で得られた各フコース硫酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ
／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１２
１℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕及び１２
０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液
を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
培養し、培養開始後２４時間及び４０時間後に細胞数を
トリパンブルー染色法で計測した。Example 22 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultivated at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 5 cells / 4.5 ml in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co.)
It was suspended so that 4.5 ml of this suspension was prepared, and for each suspension, the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in Examples 1, 15 and 18 [10 mg
Dissolve in 30 mM Hepes buffer (pH 7.2) containing 120 mM sodium chloride so that
Autoclaved at 1 ° C for 20 minutes] and 12
0.5 ml of 30 mM Hepes buffer containing 0 mM sodium chloride was added, the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide, and the number of cells was counted by the trypan blue staining method 24 hours and 40 hours after the start of the culture. .

【０２７９】この結果を図２７に示す。図２７はＨＬ−
６０細胞の培養液に実施例１、１５、及び１８で得られ
たフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ／ｍｌとなるように添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表
す図であり、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中
の生細胞数（×１０５ コ／５ｍｌ）を示す。図２７
中、培地に添加したフコース硫酸含有多糖の種類は、□
印が無添加（対照）、＋印が実施例１、・印が実施例１
５、×印が実施例１８で得られたフコース硫酸含有多糖
であることを示す。The results are shown in FIG. FIG. 27 shows HL-
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 were added to the culture medium of 60 cells at 1 mg / ml. Yes, the horizontal axis shows the culture time (hours), and the vertical axis shows the number of viable cells in the culture solution (× 10 5 cells / 5 ml). FIG. 27
The type of sulfated-fucose-containing polysaccharide added to the medium is □
The mark indicates no addition (control), the + mark indicates Example 1, and the mark indicates Example 1
5, the mark x indicates that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 18 was used.

【０２８０】また、この時死細胞は細胞の縮小及び断片
化等アポトーシスに特有の形態を示した。すなわちこれ
らの結果から、ＨＬ−６０細胞は実施例１、１５、及び
１８で得られたフコース硫酸含有多糖によりアポトーシ
スを誘発され細胞増殖を著しく抑制されることが判明し
た。実施例１、１５、及び１８で得られた各フコース硫
酸含有多糖溶液〔１０ｍｇ／ｍｌとなるように１２０ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）に溶解し、フィルター処理したもの〕のアポ
トーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得
た。At this time, the dead cells showed morphology peculiar to apoptosis such as cell shrinkage and fragmentation. That is, from these results, it was revealed that HL-60 cells were induced to undergo apoptosis by the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 and cell growth was significantly suppressed. Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 15 and 18 [120 m at 10 mg / ml]
30 mM Hepes buffer containing M sodium chloride (p
H7.2), which had been dissolved in H7.2) and subjected to a filter treatment], the apoptosis-inducing action was measured according to the above, and similar results were obtained.

【０２８１】実施例２３ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）９ｍｌにヒト急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＯ
ＬＴ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５２）を５×１０５
個／９ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌ
を５つ用意し、それぞれに実施例１、２、１２、及び１
６で得られたフコース硫酸含有多糖の生理食塩水溶液
（５ｍｇ／ｍｌ）のフィルター処理液を１ｍｌ添加し、
３７℃、５％二酸化炭素存在下で６０時間培養した。培
養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた
細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及
び０．５％のナトリウムラウロイルサルコシネートを含
む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌ
にて懸濁し、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（シ
グマ社製）を１μｌ添加して５０℃、３０分間処理した
後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネースＫを１μｌ添加し
て５０℃、１時間処理した。処理後の細胞をサンプルと
して、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧
の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミ
ド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネータを用
いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、アポトー
シスに特有のＤＮＡラダーが確認された。更に確認のた
めアポトーシスを誘発する試薬として知られているアク
チノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記のフコース
硫酸含有多糖の代りに用いて同様に操作したところ、培
養２０時間で、フコース硫酸含有多糖の場合と同じＤＮ
Ａラダーが確認できた。この結果より実施例１、２、１
２、及び１６で得られたフコース硫酸含有多糖はＭＯＬ
Ｔ−３細胞に対してアポトーシスを誘発することが判明
した。実施例１、２、１２及び１６で得られた各フコー
ス硫酸含有多糖溶液〔５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ
（８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、
２．９ｇのリン酸水素二ナトリム１２水和物、及び０．
２ｇのリン酸二水素カリウムを１リットルの水に溶解し
たもの）に溶解し、１２１℃、２０分間オートクレーブ
処理したもの〕のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測
定し、同様の結果を得た。Example 23 Human acute lymphoblastic leukemia cell MO was added to 9 ml of RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes.
LT-3 (ATCC CRL-1552) 5 x 10 5
It was suspended so that the number of particles / 9 ml. 9 ml of this suspension
5 were prepared, and each of Examples 1, 2, 12 and 1 was prepared.
1 ml of a filtered solution of a physiological saline solution of a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in 6 (5 mg / ml) was added,
The cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 60 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. 20 μl of the obtained cells containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate.
Then, 1 μl of 10 mg / ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) was added and treated at 50 ° C. for 30 minutes, and then 1 μl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After immersing this gel in an ethidium bromide solution for 30 minutes and confirming the state of DNA in the gel using a transilluminator, a DNA ladder peculiar to apoptosis was confirmed. For confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in the same manner as the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide. Same as the case
A ladder was confirmed. From these results, Examples 1, 2, 1
The sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in 2 and 16 are MOL
It was found to induce apoptosis in T-3 cells. Each of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solutions obtained in Examples 1, 2, 12, and 16 [PBS at 5 mg / ml]
(8 g sodium chloride, 0.2 g potassium chloride,
2.9 g of di-natrihydrogen phosphate dodecahydrate, and 0.
2 g of potassium dihydrogen phosphate dissolved in 1 liter of water) and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.

【０２８２】実施例２４ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト急性リンパ芽球性白
血病細胞ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５２）
をＲＰＭＩ１６４０培地にて５×１０３ コ／ｍｌとな
るように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート
上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶
解後ろ過滅菌した実施例１で得られたフコース硫酸含有
多糖混合物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多
糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコース硫酸含
有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０万、和光純
薬社製）の溶液をそれぞれ０．２ｍｌずつ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
２日、４日、６日、８日後の生細胞数をトリパンブルー
染色法により計測した。この結果を図２８に示す。すな
わち図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られ
たフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸を０．
５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時
間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４ コ／
２ｍｌ）を示す。図２８中、培地に添加した硫酸化多糖
の種類は、○印が無添加（対照）、●印が実施例１２で
得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、□印が実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖、△印が実施例１７で得
られたフコース硫酸含有多糖、■印が実施例１５で得ら
れたフコース硫酸含有多糖であることを示す。デキスト
ラン硫酸は実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖
の場合と実質的に同じ曲線を示した。また、この時死細
胞は細胞の縮小及び断片化等アポトーシスに特有の形態
を示した。すなわちこれらの結果から、ＭＯＬＴ−３細
胞は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例
１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５
及び１７で得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキス
トラン硫酸によりアポトーシスを誘発され細胞増殖を著
しく抑制されることが判明した。実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖、実施例１２で得られたフコース硫
酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で得られたフコー
ス硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸（分子量５０
万、和光純薬社製）の各溶液（０．５ｍｇ／ｍｌとなる
ようにＰＢＳに溶解後、１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理したもの）のアポトーシス誘発作用を上記に準
じ測定し、同様の結果を得た。Example 24 Human acute lymphoblastic leukemia cell MOLT-cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes. 3 (ATCC CRL-1552)
Was suspended in RPMI1640 medium at 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12 were dissolved in PBS at a concentration of 0.5 mg / ml and sterilized by filtration. 0.2 ml each of the solutions of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 15 and 17 and dextran sulfate (molecular weight 500,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added, and 37
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. The number of living cells was counted 2 days, 4 days, 6 days, and 8 days after the start of culture by the trypan blue staining method. The result is shown in FIG. That is, FIG. 28 shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and the sulfated-fucose-containing sulfate obtained in Examples 15 and 17 were added to the culture medium of MOLT-3 cells. Polysaccharide and dextran sulfate were added to 0.
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added at 5 mg / ml, where the horizontal axis represents the culture time (days) and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 /
2 ml) is shown. In FIG. 28, the types of the sulfated polysaccharides added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and □ indicates Example 1. It shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharides, the symbol Δ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 17, and the symbol ■ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15. Dextran sulfate showed substantially the same curve as that of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15. At this time, the dead cells showed morphology peculiar to apoptosis such as cell shrinkage and fragmentation. That is, from these results, the MOLT-3 cells showed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and Example 15
It was found that the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Nos. 17 and 17 and dextran sulfate induce apoptosis and remarkably suppress cell proliferation. The sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Examples 15 and 17, and dextran sulfate (molecular weight 50
According to the above results, the apoptosis-inducing effect of each solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (dissolved in PBS at 0.5 mg / ml and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes) was measured according to the above. Got

【０２８３】実施例２５ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０４ 個／９００μｌ
となるように懸濁した。この懸濁液９００μｌを９つ用
意し、それぞれの懸濁液に対し、生理食塩水、及び実施
例１で得たフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜
Ｆ−Ｆｄ−４、及び実施例１３で得られた３種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）フィルター処理液を１００μｌ添加し、３７℃、５
％二酸化炭素存在下で４０時間培養した。培養した細胞
を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−
１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖
を添加したＨＬ−６０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断
片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生理食塩
水を添加したＨＬ−６０細胞は細胞数が約４倍に増加し
たが、フコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−
Ｆｄ−４及び３種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加し
たＨＬ−６０細胞は細胞数が全く増加しないものから１
０分の１以下になるものまでが見られ、これらフコース
硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び３
種のフコース硫酸含有オリゴ糖のアポトーシス誘発作用
によりＨＬ−６０細胞の増殖が抑えられることが判明し
た。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として
知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液
を上記のフコース硫酸含有オリゴ糖の代りに用いて同様
に操作したところ、培養２０時間で、フコース硫酸含有
オリゴ糖の場合と同じように、細胞の縮小及び細胞断片
化がみられた。この結果より、ＨＬ−６０細胞は実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、Ｆ−Ｆｄ−１
〜Ｆ−Ｆｄ−及び実施例１３で得られたフコース硫酸含
有オリゴ糖によりアポトーシスを誘発されることが明ら
かとなった。実施例１で得たフコース硫酸含有多糖標
品、Ｆ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４及び実施例１３で得ら
れた３種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各溶液〔１０ｍ
ｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、１２１
℃、２０分間オートクレーブ処理したもの〕のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。Example 25 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 4 cells / 900 μl in 4 medium (Ajinomoto Co.)
It was suspended so that Nine 900 μl of this suspension were prepared. For each suspension, physiological saline, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, F-Fd-1 to
Each physiological saline solution of F-Fd-4 and the three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 (10 mg / m 2
l) Add 100 μl of filter treatment solution,
Culture was performed for 40 hours in the presence of% carbon dioxide. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation, F-Fd-
HL-60 cells to which 1 to F-Fd-4 and three kinds of sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added all exhibited apoptotic characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of cells in the HL-60 cells to which physiological saline was added increased about 4-fold, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparations F-Fd-1 to F-
HL-60 cells to which Fd-4 and three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added showed no increase in cell number from 1 to 1.
It was observed that some of them were reduced to less than 1/0, and these sulfated-fucose-containing polysaccharide preparations, F-Fd-1 to F-Fd-4 and 3 were prepared.
It was revealed that the proliferation of HL-60 cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of the oligosaccharides containing sulfated fucose. Further, for confirmation, a 10 μg / ml solution of actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in place of the above-mentioned sulfated-fucose-containing oligosaccharide, and the same procedure was performed. Similar to the case of sugar, cell shrinkage and cell fragmentation were observed. From this result, HL-60 cells were obtained from Example 1, F-Fd-1, a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation.
~ F-Fd- and the sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 were found to induce apoptosis. Each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, F-Fd-1 to F-Fd-4, and the three types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 13 [10 m
It was dissolved in 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride so that the concentration of g / ml was 121.
The autoclave-treated product at 20 ° C. for 20 minutes] was used to measure the apoptosis-inducing effect according to the above, and similar results were obtained.

【０２８４】実施例２６ 肺癌細胞Ａ−５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、Ｓ
Ｖ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ−７５．１）、及び肝癌細胞ＨｅｐＧ２（Ａ
ＴＣＣ ＨＢ−８０６５）をそれぞれ１０４ 個／１．
８ｍｌとなるよう、５６℃、３０分間処理した牛胎児血
清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ
１６４０培地に懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ
分注し、それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食
塩水、及び実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸
含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）のフ
ィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、５％二酸
化炭素存在下で６日間培養した。培養した細胞を顕微鏡
で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べた。この結
果実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、
及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリ
ゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加した肺癌
細胞Ａ−５４９、ＳＶ４０形質転換した肺細胞ＷＩ−３
８ＶＡ１３、及び肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２はすべて細胞縮
小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。ま
た、生理食塩水を添加した各癌細胞は著しく細胞数が増
加したが、実施例１及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖、及び実施例１４で得られた６種のフコース硫酸
含有オリゴ糖のうち分子量２０００以上の３画分を添加
した各種癌細胞は細胞数が減少し、これらのフコース硫
酸含有多糖及びオリゴ糖のアポトーシス誘発作用により
各種癌細胞の増殖が抑えられることが判明した。実施例
１及び１５で得られたフコース硫酸含有多糖、及び実施
例１４で得られた６種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各
ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オー
トクレーブ処理物のアポトーシス誘発作用を上記に準じ
測定し、同様の結果を得た。Example 26 Lung cancer cells A-549 (ATCC CCL-185), S
V40 transformed lung cells WI-38VA13 (ATC
C CCL-75.1), and liver cancer cell HepG2 (A
TCC HB-8065) 10 4 each / 1.
RPMI containing 10% fetal bovine serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes to make 8 ml.
Suspended in 1640 medium. This suspension was dispensed in 1.8 ml aliquots, and to each suspension, a physiological saline solution was prepared for each cancer cell, and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and Example 14. 200 μl of a filter-treated solution of each physiological saline solution (1 mg / ml) of the 6 types of oligosaccharides containing sulfated fucose thus obtained was added and cultured at 37 ° C. for 6 days in the presence of 5% carbon dioxide. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15,
And lung cancer cells A-549 and SV40-transformed lung cells WI-3 obtained by adding 3 fractions having a molecular weight of 2000 or more among the 6 types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14.
8VA13 and hepatoma cells Hep G2 all exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of each cancer cell to which physiological saline was added remarkably increased, the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and the 6 types of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14 It was found that among the various cancer cells to which the three fractions having a molecular weight of 2000 or more were added, the number of cells decreased, and the proliferation of various cancer cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides. Apoptosis of autoclaved products of each PBS solution (1 mg / ml) of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1 and 15 and the 6 kinds of sulfated-fucose-containing oligosaccharides obtained in Example 14 at 121 ° C for 20 minutes. The induction effect was measured according to the above, and the same result was obtained.

【０２８５】実施例２７ 結腸癌細胞ＨＣＴ １１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４
７）、及び胃癌細胞ＡＧＳ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３
９）をそれぞれ１０４ 個／１．８ｍｌとなるよう、５
６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイ
エンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ' ｓ５ａ培地（ギブ
コ社製）、Ｈａｍ' ｓ Ｆ１２培地（ギブコ社製）にそ
れぞれ懸濁した。この懸濁液を１．８ｍｌずつ分注し、
それぞれの懸濁液に対し、各癌細胞毎に生理食塩水、及
び実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫酸含
有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフコー
ス硫酸含有オリゴ糖の各生理食塩水溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）のフィルター処理液を２００μｌ添加し、３７℃、
５％二酸化炭素存在下で４８時間培養した。培養した細
胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞の形態を調べ
た。この結果実施例１、１２、及び１５で得られたフコ
ース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４
種のフコース硫酸含有オリゴ糖を添加した結腸癌細胞Ｈ
ＣＴ １１６及び胃癌細胞ＡＧＳはすべて細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。また、生
理食塩水を添加した各種癌細胞は著しく細胞数が増加し
たが、実施例１、１２、及び１５で得られたフコース硫
酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆｄ−４の４種のフ
コース硫酸含有オリゴ糖を添加した各種癌細胞は細胞数
が減少し、これらのフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖
のアポトーシス誘発作用により各種癌細胞の増殖が抑え
られることが判明した。実施例１、１２、及び１５で得
られたフコース硫酸含有多糖及びＦ−Ｆｄ−１〜Ｆ−Ｆ
ｄ−４の４種のフコース硫酸含有オリゴ糖の各ＰＢＳ溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）の１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理液のアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定
し、同様の結果を得た。Example 27 Colon Cancer Cells HCT 116 (ATCC CCL-24
7), and gastric cancer cell AGS (ATCC CRL-173)
5) so that each of 9) becomes 10 4 pieces / 1.8 ml.
The cells were suspended in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) and Ham's F12 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 6 ° C for 30 minutes. Dispense 1.8 ml each of this suspension,
For each suspension, physiological saline, and four types of sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12, and 15 were prepared for each cancer cell. Each physiological saline solution of oligosaccharides containing sulfated fucose (10 mg / m
200 μl of the filter treatment solution of 1) was added,
The cells were cultured in the presence of 5% carbon dioxide for 48 hours. The cultured cells were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and cell morphology. As a result, 4 of the sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12 and 15 were obtained.
Colon cancer cells H to which seeded sulfated-fucose-containing oligosaccharides have been added
CT 116 and gastric cancer cells AGS all exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. In addition, although the number of various cancer cells to which physiological saline was added remarkably increased, the sulfated-fucose-containing polysaccharides and F-Fd-1 to F-Fd-4 obtained in Examples 1, 12, and 15 It was clarified that the number of various cancer cells to which the sulfated-fucose-containing oligosaccharides were added decreased, and the proliferation of various cancer cells was suppressed by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides. The sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 12, and 15 and F-Fd-1 to FF.
Similar results were obtained by measuring the apoptosis-inducing action of each of the PBS solutions (10 mg / ml) of 4 types of d-4 sulfated-fucose-containing oligosaccharides at 121 ° C. for 20 minutes in the same manner as described above.

【０２８６】実施例２８ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ
１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３ コ
／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェ
ルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／
ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、
フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフ
コース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕ、
Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−
Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖
の各溶液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパ
リン（和光純薬社製）及びデキストラン硫酸（分子量５
０万、和光純薬社製）を１２１℃、２０分間オートクレ
ーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二
酸化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳの
みを同量添加し、同様に培養した。培養開始１日、２
日、３日、４日後の生細胞数を「組織培養の技術」（第
２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０
年））記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測し
た。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色によ
る方法で計測した。Example 28 Human colon cancer cells HCT cultured at 37 ° C. in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes
116 was suspended in McCoy's 5a medium at 5 × 10 3 co / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. 10 mg / PBS dissolved in each suspension
ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1,
Sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, sulfated-fucose-containing polysaccharide-U,
F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-
Fd-4, each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 5 mg / ml heparin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in PBS and dextran sulfate (molecular weight 5)
0.2 ml of what was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes was added to 0.2 million and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. Start of culture 1 day, 2
The number of viable cells after 3, 3 and 4 days was calculated as “Tissue culture technology” (2nd edition) (edited by Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990).
(Year)) and the method (pages 26 to 28) described. That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.

【０２８７】得られた結果を図２９に示す。すなわち図
２９はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施例１で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ
−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆ
ｄ−４、実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を
１ｍｇ／ｍｌ、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を
０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間
と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培
養時間（日）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４
コ／２ｍｌ）を示す。図２９中、培地に添加したフコー
ス硫酸含有多糖あるいはオリゴ糖の種類は、○印が無添
加（対照）、●印が実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、■印が実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖混合物である。実施例１２で得られたフコース硫
酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆ
ｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−
４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖は
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物の場合
と実質的に同じ曲線を示した。またヘパリン及びデキス
トラン硫酸は実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の場合と実質的に同じ曲線を示した。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 29 shows that in the culture solution of HCT 116 cells, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 12- U and sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F
-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-F
d-4, 1 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 1 mg / ml of heparin and dextran sulfate were added to the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added to 0.5 mg / ml. It is a figure showing a relationship, a horizontal axis shows a culture time (day), and a vertical axis shows the number of viable cells in a culture solution (× 10 4).
(Co / 2 ml). In FIG. 29, types of the sulfated-fucose-containing polysaccharides or oligosaccharides added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, and ■ indicates an example. It is the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in 1. The sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and FF obtained in Example 12
d-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-
4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 showed substantially the same curve as that of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1. In addition, heparin and dextran sulfate showed substantially the same curves as in the case of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1.

【０２８８】この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ １１６
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−
２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得
られたフコース硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキスト
ラン硫酸を添加したＨＣＴ １１６細胞は細胞数がほと
んど増加しないか、あるいは減少した。As a result, HCT 116 containing PBS was added.
Although the number of cells increased remarkably, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, the mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12,
Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-
2, F-Fd-3, and F-Fd-4, HCT 116 cells supplemented with the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin, and dextran sulfate had little or no increase in cell number. .

【０２８９】また、実施例１で得られたフコース硫酸含
有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２
で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含
有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース
硫酸含有多糖、ヘパリン、及びデキストラン硫酸を添加
したＨＣＴ １１６細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片
化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、これら
のフコース硫酸含有多糖及びオリゴ糖、ヘパリン、及び
デキストラン硫酸のアポトーシス誘発作用によりＨＣＴ
１１６細胞の増殖が抑制されることが判明した。ＰＢ
Ｓに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品、フコース硫酸含有多糖混合
物、実施例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
フコース硫酸含有多糖−Ｕ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−
２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得
られたフコース硫酸含有多糖の各溶液のフィルター処理
液、及びＰＢＳに溶解させた５ｍｇ／ｍｌのヘパリン、
及びデキストラン硫酸の各フィルター処理液のアポトー
シス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。The sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, Example 12
Sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, sulfated-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-
3 and F-Fd-4, HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin, and dextran sulfate were added all exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, HCT is caused by the apoptosis-inducing action of these sulfated-fucose-containing polysaccharides and oligosaccharides, heparin, and dextran sulfate.
It was found that the proliferation of 116 cells was suppressed. PB
10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides, and a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, dissolved in S.
Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U, F-Fd-1, F-Fd-
2, F-Fd-3, and F-Fd-4, a filtered solution of each solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, and 5 mg / ml heparin dissolved in PBS,
The apoptosis-inducing action of each filter treatment solution of dextran sulfate and dextran sulfate was measured according to the above, and similar results were obtained.

【０２９０】実施例２９ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＨＣＴ
１１６をＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地にて５×１０３ コ
／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェ
ルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。そ
れぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／
ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１
℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ
添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。な
お、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養し
た。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」
（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０
年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。
すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色による方
法で計測した。Example 29 Human colon cancer cell HCT cultured at 37 ° C. in McCoy's 5a medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes
116 was suspended in McCoy's 5a medium at 5 × 10 3 co / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. 20 mg / PBS dissolved in each suspension
ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml of Example 1
The solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in
0.2 ml autoclaved at ℃ for 20 minutes
The mixture was added and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. "Tissue culture technology" to change the number of viable cells over time after the start of culture
(2nd edition) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990)
Year) Measured according to the method described (pages 26 to 28).
That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.

【０２９１】得られた結果を図３０に示す。すなわち図
３０はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施例１で得られ
たフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したと
きの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であ
り、横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞
数（×１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３０中、培地へ
のフコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
（対照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、
黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 30 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of HCT 116 cells at various concentrations. The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 cells / 2 ml). In FIG. 30, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates 2 mg / ml, ■ indicates 3 mg / ml,
The black triangle mark is 5 mg / ml.

【０２９２】この結果ＰＢＳを添加したＨＣＴ １１６
細胞は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ １１６細
胞は細胞数が減少した。また、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を添加したＨＣＴ １１６細胞は
すべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシスの特徴
を呈した。すなわち、実施例１で得られたフコース硫酸
含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度でＨＣＴ
１１６細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細
胞の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに溶解さ
せた２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／
ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の
溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記
に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, HCT 116 containing PBS was added.
The number of cells increased remarkably, but the number of HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added decreased. In addition, all HCT 116 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had HCT at a concentration of at least 2 mg / ml.
It was found that it has an apoptosis-inducing action on 116 cells and can suppress cell proliferation. 20 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filtered solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in Example 1 was measured according to the above, and the same result was obtained.

【０２９３】実施例３０ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地（ギ
ブコ社製）にて３７℃で培養したヒト胃癌細胞ＡＧＳを
Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地にて５×１０３ コ／ｍｌとな
るように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート
上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸
濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた２０ｍｇ／ｍｌ、３０
ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間
オートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し同様に培養した。培養開始後
経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝
倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法
（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球
計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。Example 30 Human gastric cancer cell AGS cultured at 37 ° C. in Ham's F12 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes was Ham '. The cells were suspended in s F12 medium at 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 20 mg / ml, 30 dissolved in PBS
0.2 ml of a solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide standard solution obtained in Example 1 (mg / ml and 50 mg / ml) was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, and added to 37
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. After the start of culturing, the number of viable cells was counted over time according to the method (pages 26 to 28) described in "Technology of Tissue Culture" (Second Edition) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1990). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.

【０２９４】得られた結果を図３１に示す。すなわち図
３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培養
時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横軸
は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１
０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３１中、培地へのフコー
ス硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対
照）、●印が２ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三
角印が５ｍｇ／ｍｌである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 31 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of AGS cells at various concentrations. The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 1).
0 shows the 4 co / 2 ml). In FIG. 31, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is 0 for no addition (control), ● for 2 mg / ml, ■ for 3 mg / ml, and black triangle for 5 mg / ml. .

【０２９５】この結果ＰＢＳを添加したＡＧＳ細胞は著
しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコース
硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加した
ＡＧＳ細胞は細胞数が減少し、２ｍｇ／ｍｌを添加した
ものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＡＧＳ
細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポトーシス
の特徴を呈した。すなわち、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品は少なくとも２ｍｇ／ｍｌの濃度で
ＡＧＳ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持ち、細胞
の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに溶解させ
た２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍ
ｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶
液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用を上記に
準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of AGS cells to which PBS was added remarkably increased, but the number of AGS cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added at a final concentration of 3 mg / ml or more decreased. However, the cells to which 2 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. In addition, Example 1
AGS containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in
All cells exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had an apoptosis-inducing action on AGS cells at a concentration of at least 2 mg / ml and could suppress cell proliferation. 20 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / m dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filtered solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in Example 1 was measured according to the above, and similar results were obtained.

【０２９６】実施例３１ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＬ−１５培地（ギブコ社製）
にて３７℃で培養したヒト結腸癌細胞ＳＷ４８０（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−２２８）をＬ−１５培地にて５×１０
３ コ／ｍｌとなるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２
４ウェルプレート上の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注し
た。それぞれの懸濁液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０
ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実
施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品の溶液を１
２１℃、２０分間オートクレーブ処理したものを０．２
ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し
た。なお、対照としてＰＢＳのみを同量添加し、同様に
培養した。培養開始後経時的に生細胞数を「組織培養の
技術」（第２版）（朝倉出版、日本組織培養学会編、１
９９０年）記載の方法（第２６〜２８頁）に従って計測
した。すなわち、血球計算板上のトリパンブルー染色に
よる方法で計測した。Example 31 L-15 medium (manufactured by Gibco) containing 10% of fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes.
Human colon cancer cells SW480 (AT
CC CCL-228) in L-15 medium at 5 x 10
Suspend at 3 cells / ml, 2 from FALCON
1.8 ml was dispensed to each well on the 4-well plate. Each suspension was dissolved in PBS 10
1 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was prepared.
0.2 ° C after autoclaving at 21 ° C for 20 minutes
ml was added and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. "Technology of tissue culture" (2nd edition), the number of viable cells over time after the start of culture (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society, 1
990) and the measurement (pages 26 to 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.

【０２９７】得られた結果を図３２に示す。すなわち図
３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの
培養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、
横軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数
（×１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３２中、培地への
フコース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加
（対照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、
黒三角印が５ｍｇ／ｍｌである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 32 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of SW480 cells at various concentrations.
The horizontal axis represents the culture time (hour), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 cells / 2 ml). In FIG. 32, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is as follows: ○ indicates no addition (control), ● indicates 1 mg / ml, ■ indicates 3 mg / ml,
The black triangle mark is 5 mg / ml.

【０２９８】この結果ＰＢＳを添加したＳＷ４８０細胞
は著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加
したＳＷ４８０細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを
添加したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加し
たＳＷ４８０細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等の
アポトーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／
ｍｌの濃度でＳＷ４８０細胞に対してアポトーシス誘発
作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。
ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、
及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸
含有多糖標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス
誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of cells of SW480 cells supplemented with PBS remarkably increased, but the number of cells of SW480 cells supplemented with the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 at a final concentration of 3 mg / ml or more decreased. However, the cells to which 1 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. Also,
All SW480 cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added exhibited characteristics of apoptosis such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was at least 1 mg /
It was found that a concentration of ml has an action of inducing apoptosis on SW480 cells and can suppress cell growth.
10 mg / ml, 30 mg / ml dissolved in PBS,
And 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide standard solution obtained in Example 1 was used to measure the apoptosis-inducing action of the filter-treated solution according to the above, and similar results were obtained.

【０２９９】実施例３２ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）
を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃
で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−２１８）を上記培地にて５×１０３ コ／ｍｌとなる
ように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上
の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２
で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及
びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫
酸含有多糖の各溶液を１２１℃、２０分間オートクレー
ブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸
化炭素存在下で培養した。なお、対照としてＰＢＳのみ
を同量添加し、同様に培養した。培養開始後経時的に生
細胞数を「組織培養の技術」（第２版）（朝倉出版、日
本組織培養学会編、１９９０年）記載の方法（第２６〜
２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算板上の
トリパンブルー染色による方法で計測した。Example 32 10% of fetal bovine serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes and NEAA (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
In DMEM medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 1% of
Colon cancer cells WiDr (ATCC CCL
-218) was suspended in the above medium so as to be 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, dissolved in PBS, Example 12
Each of the solutions of the sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F-Fd-3 and F-Fd-4 obtained in 1. and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. .2 ml was added and the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. The method described in "Technology of Tissue Culture" (second edition) (Asakura Publishing, edited by the Japan Tissue Culture Society, 1990), the number of viable cells over time after the start of culture (26th ~
It was measured according to page 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer.

【０３００】得られた結果を図３３に示す。すなわち図
３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４及
び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を１ｍｇ
／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培養液中
の生細胞数の関係を表す図であり、横軸は培養時間（時
間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×１０４ コ／２ｍ
ｌ）を示す。図３３中、培地に添加したフコース硫酸含
有多糖の種類は、○印が無添加（対照）、■印が実施例
１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、●印が実施
例１５で得られたフコース硫酸含有多糖である。Ｆ−Ｆ
ｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４は実施例１５で得られたフコー
ス硫酸含有多糖の場合と実質的に同じ曲線を示した。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 33 shows that the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F-Fd-4 obtained in Example 1 was used in the culture medium of WiDr cells. 1 mg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15
FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when added at a concentration of / ml, where the horizontal axis represents the culture time (hours) and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (× 10 4 pieces / 2m
1) is shown. In FIG. 33, types of the sulfated-fucose-containing polysaccharide added to the medium are as follows: ○ indicates no addition (control), ■ indicates the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, and ● indicates the obtained in Example 15. It is a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained. FF
d-3 and F-Fd-4 showed substantially the same curves as in the case of the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15.

【０３０１】この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得られたフコース
硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−Ｆｄ−４、及
び実施例１５で得られたフコース硫酸含有多糖を添加し
たＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少した。また、実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ
−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含
有多糖を添加したＷｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細
胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈した。すなわち、
実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施
例１２で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ
−３及びＦ−Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコ
ース硫酸含有多糖はＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス
誘発作用を持ち、細胞の増殖を抑制できることが判明し
た。ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ−
Ｆｄ−４、及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有
多糖の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of WiDr cells to which PBS was added remarkably increased, but the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F and F-Fd obtained in Example 12 were used. -3 and F-Fd-4, and the WiDr cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 was added had a decreased cell number. In addition, the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F obtained in Example 12
All WiDr cells to which -Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 were added exhibited apoptosis characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is,
The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, the sulfated-fucose-containing polysaccharides-F and F-Fd obtained in Example 12
-3 and F-Fd-4, and the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 15 were found to have an apoptosis-inducing action on WiDr cells and suppress cell proliferation. 10 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, dissolved in PBS, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-3 and F-obtained in Example 12.
The apoptosis-inducing effect of the filter-treated solution of the solution of Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution obtained in Example 15 was measured according to the above, and similar results were obtained.

【０３０２】実施例３３ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％及びＮＥＡＡ（大日本製薬社製）
を１％含むＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）にて３７℃
で培養したヒト結腸癌細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−２１８）を上記培地にて５×１０３ コ／ｍｌとなる
ように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製２４ウェルプレート上
の各ウェルに１．８ｍｌずつ分注した。それぞれの懸濁
液に対し、ＰＢＳに溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍ
ｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフ
コース硫酸含有多糖標品の溶液を１２１℃、２０分間オ
ートクレーブ処理したものを０．２ｍｌ添加し、３７
℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照とし
てＰＢＳのみを同量添加し、同様に培養した。培養開始
後経時的に生細胞数を「組織培養の技術」（第２版）
（朝倉出版、日本組織培養学会編、１９９０年）記載の
方法（第２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、
血球計算板上のトリパンブルー染色による方法で計測し
た。Example 33 10% of fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes and NEAA (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)
In DMEM medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 1% of
Colon cancer cells WiDr (ATCC CCL
-218) was suspended in the above medium so as to be 5 × 10 3 cells / ml, and 1.8 ml was dispensed to each well on a 24-well plate manufactured by FALCON. For each suspension, 10 mg / ml dissolved in PBS, 30 m
g / ml and 50 mg / ml of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes, and 0.2 ml of the solution was added.
Culturing was carried out at 5 ° C in the presence of 5% carbon dioxide. As a control, the same amount of PBS alone was added and the cells were similarly cultured. “Tissue culture technology” (2nd edition)
(Asakura Publishing, edited by the Japanese Society for Tissue Culture, 1990). That is,
It was measured by the method of trypan blue staining on a hemocytometer.

【０３０３】得られた結果を図３４に示す。すなわち図
３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で得られたフコ
ース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加したときの培
養時間と培養液中の生細胞数の関係を表す図であり、横
軸は培養時間（時間）、縦軸は培養液中の生細胞数（×
１０４ コ／２ｍｌ）を示す。図３４中、培地へのフコ
ース硫酸含有多糖標品の添加量は、○印が無添加（対
照）、●印が１ｍｇ／ｍｌ、■印が３ｍｇ／ｍｌ、黒三
角印が５ｍｇ／ｍｌである。The obtained results are shown in FIG. That is, FIG. 34 is a diagram showing the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture solution of WiDr cells at various concentrations, The horizontal axis represents the culture time (hours), and the vertical axis represents the number of viable cells in the culture solution (×
10 4 co / 2 ml) is shown. In FIG. 34, the addition amount of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation to the medium is 0 for no addition (control), ● for 1 mg / ml, ■ for 3 mg / ml, and black triangle for 5 mg / ml. .

【０３０４】この結果ＰＢＳを添加したＷｉＤｒ細胞は
著しく細胞数が増加したが、実施例１で得られたフコー
ス硫酸含有多糖標品を終濃度で３ｍｇ／ｍｌ以上添加し
たＷｉＤｒ細胞は細胞数が減少し、１ｍｇ／ｍｌを添加
したものも著しく細胞の増殖が抑制された。また、実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を添加したＷ
ｉＤｒ細胞はすべて細胞縮小及び細胞断片化等のアポト
ーシスの特徴を呈した。すなわち、実施例１で得られた
フコース硫酸含有多糖標品は少なくとも１ｍｇ／ｍｌの
濃度でＷｉＤｒ細胞に対してアポトーシス誘発作用を持
ち、細胞の増殖を抑制できることが判明した。ＰＢＳに
溶解させた１０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、及び５０
ｍｇ／ｍｌの実施例１で得られたフコース硫酸含有多糖
標品の溶液のフィルター処理液のアポトーシス誘発作用
を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。As a result, the number of WiDr cells to which PBS was added was remarkably increased, but the number of WiDr cells to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added at a final concentration of 3 mg / ml or more was decreased. However, the cells to which 1 mg / ml was added remarkably suppressed cell growth. In addition, W to which the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added
All iDr cells exhibited apoptotic features such as cell shrinkage and cell fragmentation. That is, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 had an apoptosis-inducing action on WiDr cells at a concentration of at least 1 mg / ml and could suppress cell proliferation. 10 mg / ml, 30 mg / ml, and 50 dissolved in PBS
The apoptosis-inducing action of the filter-treated solution of the solution of the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 in mg / ml was measured according to the above, and the same result was obtained.

【０３０５】実施例３４ ５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサ
イエンス社）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブ
コ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）をＡＳＦ１０
４培地（味の素社製）にて５×１０４ コ／９００μｌ
となるように懸濁し、ＦＡＬＣＯＮ社製６ウェルプレー
ト上の各ウェルに４．５ｍｌずつ分注した。それぞれの
懸濁液に対し、実施例１９−（６）記載のフコース硫酸
含有多糖−Ｆの低分子化物を凍結乾燥したものを１０ｍ
ｇ／ｍｌとなるように１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含
む３０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、フィルタ
ーろ過処理したものを０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％
二酸化炭素存在下で培養した。なお、対照として上記緩
衝液のみを同量添加し、同様に培養した。培養開始２２
時間後と４６時間後の生細胞数を組織培養の技術（第２
版）（朝倉出版、日本組織培養学会編）記載の方法（第
２６〜２８頁）に従って計測した。すなわち、血球計算
板上のトリパンブルー染色による方法で計測した。この
結果ＨＬ−６０細胞は上記のフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の低分子化物を凍結乾燥したものによりアポトーシスを
誘発され、細胞増殖速度が抑制されることが判明した。Example 34 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 (cultured at 37 ° C. in RPMI1640 medium (manufactured by Gibco) containing 10% fetal calf serum (JRH Bioscience) treated at 56 ° C. for 30 minutes ( ATCC CCL-240) to ASF10
5 × 10 4 cells / 900 μl in 4 medium (manufactured by Ajinomoto Co.)
The suspension was added to each well of the FALCON 6-well plate in an amount of 4.5 ml. 10 m of each suspension obtained by freeze-drying the low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 19- (6) was used.
It was dissolved in 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride so that the concentration would be g / ml, and 0.5 ml of the solution which had been subjected to filter filtration was added, and the mixture was incubated at 37 ° C., 5%.
Cultured in the presence of carbon dioxide. As a control, the same amount of the above buffer solution was added and the cells were cultured in the same manner. Start culture 22
The number of viable cells after 2 hours and 46 hours was measured by the technique of tissue culture (second
Ed.) (Asakura Publishing, Japan Tissue Culture Society), method (pages 26 to 28). That is, the measurement was carried out by a method based on trypan blue staining on a hemocytometer. As a result, the HL-60 cells showed the above-mentioned sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
It was found that freeze-dried low molecular weight product of erythrocyte induced apoptosis and suppressed the cell growth rate.

【０３０６】実施例３５ ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０を、５６℃、３０分
間処理した牛胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社製）
を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に５
×１０４ 個／９００μｌとなるように懸濁した。この
懸濁液を６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０
ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液
（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた
実施例１９−（２）記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆ、
Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−
Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞれ１００μｌ添加
し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４６時間培養し
た。培養開始後２２時間及び４６時間に培養液中の生細
胞数を測定した。また、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−
６０を、ＡＳＦ１０４培地（味の素社製）に５×１０４
個／９００μｌとなるように懸濁した。この懸濁液を
６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、１２０ｍＭの塩
化ナトリウムを含む３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）
及び同緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解させたフコース硫
酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆ
ｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理液をそれぞ
れ１００μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で
４０時間培養した。培養開始後１６時間及び４０時間に
培養液中の生細胞数を測定した。また、上記２種類の培
養を行った細胞を顕微鏡で観察し、増殖の程度及び細胞
の形態を調べた。この結果、ＡＳＦ１０４培地で培養し
た細胞においては、フコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆ
ｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及びＦ−Ｆｄ−
４を添加した細胞が総て細胞縮小及び細胞断片化等のア
ポトーシスの特徴を呈し、生細胞数はほとんど増加がみ
られなかったかあるいはほぼ完全に死滅していた。緩衝
液のみ添加した培地において細胞数は約３倍に増加して
いた。一方、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した細胞にお
いてはＦ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４を添加した細胞のみが総て細胞縮小及び
細胞断片化等のアポトーシスの特徴を呈し、細胞はほと
んど死滅していた。緩衝液のみ添加した培地において細
胞数は約３倍に増加し、フコース硫酸含有多糖−Ｆを添
加した培地において細胞数は約２．５倍に増加してい
た。以上の結果から、フコース硫酸含有多糖−Ｆは無血
清培地で癌細胞に対して強いアポトーシス誘発作用を持
つが、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−３、及
びＦ−Ｆｄ−４は、無血清培地でも血清培地でも非常に
強いアポトーシス誘発作用を持つことが判明した。Example 35 Human promyelocytic leukemia cells HL-60 were treated at 56 ° C. for 30 minutes with fetal bovine serum (JRH Bioscience).
5% in RPMI1640 medium containing 10% (manufactured by Gibco)
× was suspended in a 10 4/900 [mu] l. Prepare 6 of these suspensions, each for 120
30 mM Hepes buffer solution (pH 7) containing mM sodium chloride, and the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 19- (2) dissolved in the same buffer solution at 10 mg / ml.
F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-
100 μl of each Fd-4 filter solution was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 46 hours. The number of viable cells in the culture solution was measured 22 hours and 46 hours after the start of the culture. In addition, human promyelocytic leukemia cells HL-
5 was added to ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co.) at 5 × 10 4.
It was suspended so that the number of cells / 900 μl. Six suspensions were prepared, and 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride was prepared for each suspension.
And sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, F-Fd-1, F-Fd-2, FF dissolved in the same buffer at 10 mg / ml
100 μl of each of the filter treatment solutions of d-3 and F-Fd-4 was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 40 hours. The number of viable cells in the culture medium was measured 16 hours and 40 hours after the start of the culture. In addition, the cells subjected to the above-mentioned two types of culture were observed under a microscope to examine the degree of proliferation and the cell morphology. As a result, in cells cultured in ASF104 medium, sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, FF
d-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-
All cells to which 4 was added exhibited apoptotic characteristics such as cell shrinkage and cell fragmentation, and the number of viable cells was hardly increased or almost completely died. The number of cells increased about 3-fold in the medium containing only the buffer solution. On the other hand, in the cells cultured in the RPMI1640 medium, only the cells to which F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F-Fd-4 were added all showed cell shrinkage and cell fragmentation. It exhibited the characteristics of apoptosis and the cells were almost dead. The number of cells increased about 3-fold in the medium containing only the buffer solution, and the number of cells increased about 2.5-fold in the medium containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. From the above results, the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F has a strong apoptosis-inducing action on cancer cells in a serum-free medium, but F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-3, and F- Fd-4 was found to have a very strong apoptosis-inducing action in both serum-free medium and serum medium.

【０３０７】更に確認のため、ヒト前骨髄性白血病細胞
ＨＬ−６０を、５６℃、３０分間処理した牛胎児血清
（ＪＲＨバイオサイエンス社製）を１０％含むＲＰＭＩ
１６４０培地（ギブコ社製）に５×１０４ 個／９００
μｌとなるように懸濁した。この懸濁液９ｍｌを２本用
意し、それぞれに、１２０ｍＭの塩化ナトリウムを含む
３０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７）及び同緩衝液に１０
ｍｇ／ｍｌで溶解させたＦ−Ｆｄ−４のフィルター処理
液をそれぞれ１ｍｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存
在下で１６時間培養した。 培養した細胞を遠心分離に
より上清と分離した。 得られた細胞を１０ｍＭのエチ
レンジアミンテトラアセテート及び０．５％のナトリウ
ムラウロイルサルコシネートを含む５０ｍＭのトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌにて懸濁し、１０ｍｇ
／ｍｌリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を１μｌ添加
して５０℃、３０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプ
ロテイネースＫを１μｌ添加して５０℃、３０分間処理
した。 処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロ
ースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行
った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸
した後、トランスイルミネーターを用いてゲル中のＤＮ
Ａの状態を確認したところ、アポトーシスに特有のＤＮ
Ａラダーが確認された。 さらに確認のためアポトーシ
スを誘発する試薬として知られているアクチノマイシン
Ｄを上記のＦ−Ｆｄ−４の代わりに用いて同様に操作し
たところ、Ｆ−Ｆｄ−４の場合と同じＤＮＡラダーが確
認できた。すなわち、本発明のエンド型フコース硫酸含
有多糖−Ｆ分解酵素によりフコース硫酸含有多糖−Ｆを
分解するとがん細胞に対するアポトーシス誘発作用が強
くなることが判明した。For further confirmation, RPMI containing human promyelocytic leukemia cells HL-60 treated with 56% of fetal bovine serum (JRH Bioscience) at 30% for 30 minutes.
5 × 10 4 cells / 900 in 1640 medium (manufactured by Gibco)
The cells were suspended so that the volume became μl. Two 9 ml suspensions were prepared, each containing 30 mM Hepes buffer (pH 7) containing 120 mM sodium chloride and 10 ml of the same buffer.
1 ml each of F-Fd-4 filtered solution dissolved at mg / ml was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 16 hours. The cultured cells were separated from the supernatant by centrifugation. The obtained cells were suspended in 20 μl of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.8) containing 10 mM ethylenediamine tetraacetate and 0.5% sodium lauroyl sarcosinate, and 10 mg
/ Ml ribonuclease A (manufactured by Sigma) was added at 1 µl and treated at 50 ° C for 30 minutes, and then 1 µl of 10 mg / ml proteinase K was added and treated at 50 ° C for 30 minutes. Using the treated cells as a sample, electrophoresis was performed using a 2% agarose gel under a constant voltage of 100V. After soaking this gel in the ethidium bromide solution for 30 minutes, the DN in the gel was analyzed using a transilluminator.
When the condition of A was confirmed, DN unique to apoptosis was confirmed.
A ladder was confirmed. Furthermore, when actinomycin D, which is known as a reagent for inducing apoptosis, was used in place of F-Fd-4 for confirmation, the same DNA ladder as in the case of F-Fd-4 was confirmed. It was That is, it was revealed that when the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide-F degrading enzyme of the present invention degrades the sulfate-fucose-containing polysaccharide-F, the apoptosis-inducing action on cancer cells becomes stronger.

【０３０８】実施例３６ ２１才女性及び３２才男性の健常人静脈血を採血し、１
リットル当りグルコースを１００ｍｇ、ＣａＣｌ２ ・
２Ｈ２ Ｏを０．７４ｍｇ、ＭｇＣｌ２ を１９．９２ｍ
ｇ、ＫＣｌを４０．２６ｍｇ、ＮａＣｌを７３７１ｍ
ｇ、トリス−塩酸を１７５６．５ｍｇを含む液で２倍希
釈後、リンパ球分離溶液（大日本製薬販売）をあらかじ
め希釈血液の２倍容量を入れた遠心分離管の中に静かに
重層し、１８〜２０℃、４００ｇで３０分間遠心分離し
た。遠心後、リンパ球分離溶液の上層のリンパ球画分を
集めた。こうして得られた健常リンパ球を１．９×１０
５ 個ずつ２４ウェルのプレートに添加し、１．８ｍｌ
の１０％牛胎児血清（５６℃、３０分処理後のもの）を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地に０．２ｍｌの５ｍｇ／ｍ
ｌの上記各実施例で得られたフコース硫酸含有多糖、そ
の分解物を１種類ずつ加えた培地を加え３７℃で培養し
た。コントロールとしてはフコース硫酸含有多糖溶液の
代りに生理食塩水を添加した。培養開始後、顕微鏡で各
ウェルの細胞の形態変化及び生細胞数を測定した。この
結果、各種フコース硫酸含有多糖、その分解物を加えた
ウェルもコントロールのウェルも細胞形態に差がなく、
また生細胞数の差もほとんど無く、１３日目にはどちら
の細胞もほとんど死滅した。この結果より、フコース硫
酸含有多糖、その分解物は癌細胞に対して強くアポトー
シスを誘発させる濃度においても健常細胞に毒性を示さ
ないことが判明した。Example 36 Venous blood was collected from healthy humans of 21-year-old female and 32-year-old male, and 1
100 mg glucose per liter, CaCl 2 ·
0.74 mg of 2H 2 O and 19.92 m of MgCl 2
g, KCl 40.26mg, NaCl 7371m
g, tris-hydrochloric acid was diluted 2-fold with a solution containing 1756.5 mg, and then a lymphocyte separation solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was gently overlaid in a centrifuge tube containing twice the volume of diluted blood. It centrifuged at 18-20 degreeC and 400 g for 30 minutes. After centrifugation, the lymphocyte fraction in the upper layer of the lymphocyte separation solution was collected. The healthy lymphocytes thus obtained were 1.9 × 10
Add 5 each to a 24-well plate and add 1.8 ml
0.2 ml of 5 mg / m in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (after treatment at 56 ° C. for 30 minutes).
1 of the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in each of the above-mentioned examples and degradation products thereof were added to each medium, and the mixture was cultured at 37 ° C. As a control, physiological saline was added instead of the sulfated-fucose-containing polysaccharide solution. After the start of the culture, the morphological changes of the cells in each well and the number of viable cells were measured with a microscope. As a result, there was no difference in the cell morphology between the wells containing various sulfated-fucose-containing polysaccharides and their degradation products and the control wells,
Also, there was almost no difference in the number of viable cells, and on day 13, both cells were almost dead. From this result, it was revealed that the sulfated-fucose-containing polysaccharide and its degradation product did not show toxicity to healthy cells even at a concentration that strongly induces apoptosis in cancer cells.

【０３０９】実施例３７ フコース硫酸含有多糖−Ｕの固形がんに対する制がん作
用マウス固形がんＭｅｔｈＡ（４×１０６ｃｅｌｌｓ／
マウス）を８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重約２
０ｇ）の腹部に皮下注射した。その後、引き続いて同じ
箇所に１０日間実施例６記載のフコース硫酸含有多糖−
Ｕ（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を皮下注射した。一方
コントロール群には生理的食塩水を同様に皮下注射し
た。２週間後にマウス腹部に形成されたがん組織を摘出
して、その重量を測定した。結果を表２に示す。すなわ
ち、コントロール群では平均癌重量は１．２５ｇであっ
たのに対し、フコース硫酸含有多糖−Ｕ投与群では０．
２８ｇであり、有意（コントロール群に対しｐ＜０．０
１）な制がん作用を示した。抑制率は７７．６％であっ
た。Example 37 Carcinostatic effect of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U on solid cancer Mouse solid cancer MethA (4 × 10 6 cells /
Eight week old female BALB / c mice (body weight approximately 2
0 g) was subcutaneously injected into the abdomen. Then, subsequently, at the same location for 10 days, the sulfated-fucose-containing polysaccharide described in Example 6 was used.
U (100 mg / kg / day) was injected subcutaneously. On the other hand, the control group was similarly subcutaneously injected with physiological saline. Two weeks later, the cancer tissue formed in the abdomen of the mouse was excised and its weight was measured. The results are shown in Table 2. That is, the average cancer weight was 1.25 g in the control group, whereas the mean cancer weight was 0.1% in the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U administration group.
28 g, significant (p <0.0 vs control group)
1) It showed an anti-cancer effect. The inhibition rate was 77.6%.

【０３１０】[0310]

【表２】 [Table 2]

【０３１１】実施例３８ フコース硫酸含有多糖の発がん予防作用 （１）６週令のＳｐｒａｇｕｒｅ−Ｄａｗｌｅｙラット
（雄）１９匹に、７．４ｍｇ／ｋｇのアゾキシメタン
（ナカライテスク社製）を背部皮下投与し、以降１週間
に１回、１０週目まで背部皮下投与した。なお投与時
は、アゾキシメタンを０．９％の塩化ナトリウムを含む
ｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、毎回１０
０μｌとなるように溶液の濃度を調整した。上記１９匹
中５匹に対しては最初のアゾキシメタン投与と同時に連
日、実施例１の記載に準じ調製した、ガゴメ昆布熱水抽
出液７０ｍｌを３０週目まで飲料水として経口投与し
た。この熱水抽出液は２ｍｇ／ｍｌのフコース硫酸含有
多糖混合物を含有し、１４０ｍｇ／ｋｇのフコース硫酸
含有多糖混合物が連日経口投与された。なお上記１９匹
中１４匹に対してはフコース硫酸含有多糖は投与せず、
水道水を飲料水として与え、対照群とした。３０週目ま
でに対照群の外耳巣がん発生が１４匹中１４匹見られた
のに対し、フコース硫酸含有多糖混合物投与群は５匹中
１匹であり、顕著な発がん抑制作用が認められた。なお
３０週目までに対照群は３匹死亡したが、フコース硫酸
含有多糖混合物投与群は全匹生存した。また３０週目の
対照群の平均体重が７１６ｇであるのに対し、フコース
硫酸含有多糖混合物投与群の平均体重は８１７ｇであっ
た。一方アゾキシメタン非投与のラット群（５匹）の平
均体重は７８８ｇであり、フコース硫酸含有多糖混合物
投与群の体重増加はアゾキシメタン非投与のラット群と
同等であった。次に、対照群の４匹を選抜し、３０週目
より連日、上記ガゴメ昆布熱水抽出液４０ｍｌ（フコー
ス硫酸含有多糖混合物８０ｍｇ）を飲料水として経口投
与した。３６週目において、４匹中２匹の外耳巣がんが
顕著に退縮し、フコース硫酸含有多糖の制がん作用が認
めらた。以上フコース硫酸含有多糖の経口投与により、
化学発がん剤による発がん予防作用、化学発がん剤によ
る体重増加抑制の防止作用、更にはがん組織の退縮が認
められた。Example 38 Carcinogenic Preventive Action of Polysaccharide Containing Sulfate Fucose (1) 19 mg of 6-week-old Sprague-Dawley rats (male) were subcutaneously administered with 7.4 mg / kg of azoxymethane (manufactured by Nacalai Tesque) on the back After that, subcutaneous administration was performed once a week until the 10th week on the back. At the time of administration, azoxymethane was dissolved in a 0.1 M phosphate buffer solution containing 0.9% sodium chloride and having a pH of 6.5, and 10 times each time.
The concentration of the solution was adjusted to be 0 μl. To 5 of the 19 animals, 70 ml of the hot water extract of Gagome kelp prepared according to the description of Example 1 was orally administered as drinking water until the 30th week on consecutive days simultaneously with the first administration of azoxymethane. This hot water extract contained 2 mg / ml of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture, and 140 mg / kg of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture was orally administered every day. Incidentally, 14 of the 19 animals were not administered with the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
Tap water was given as drinking water to serve as a control group. By the 30th week, 14 out of 14 outbreaks of external ear tumors were observed in the control group, whereas 1 out of 5 animals in the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group had a remarkable carcinogenic inhibitory effect. . By the 30th week, 3 animals in the control group had died, while all animals in the group administered with the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture survived. Further, the average body weight of the control group at 30 weeks was 716 g, whereas the average body weight of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group was 817 g. On the other hand, the average body weight of the azoxymethane non-administered rat group (5 animals) was 788 g, and the weight gain of the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture administration group was similar to that of the azoxymethane non-administered rat group. Next, 4 animals in the control group were selected, and 40 days after the 30th week, 40 ml of the hot water extract of Gagome kelp (80 mg of a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides) was orally administered as drinking water. At 36 weeks, 2 out of 4 cancers of the external ear lobes significantly regressed, and the carcinostatic action of the sulfated-fucose-containing polysaccharide was observed. By oral administration of the sulfated-fucose-containing polysaccharide,
The carcinogenic preventive effect of the chemical carcinogen, the preventive effect of the weight increase suppression by the chemical carcinogen, and the regression of the cancer tissue were observed.

【０３１２】実施例３９ 注射剤 実施例１で製造したフコース硫酸含有多糖混合物を注射
用蒸留水に溶解し５％溶液とした。この溶液を凍結乾燥
用バイアル瓶１バイアル中に、フコース硫酸含有多糖と
して５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を行った。別に溶解液
として生理食塩水２ｍｌを添加した。Example 39 Injectable Solution The sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture prepared in Example 1 was dissolved in distilled water for injection to give a 5% solution. One vial for freeze-drying was filled with 50 mg of this solution as a sulfated-fucose-containing polysaccharide, and freeze-dried. Separately, 2 ml of physiological saline was added as a solution.

【０３１３】実施例４０ 注射剤 下記処方に従い注射剤を調製した。 フコース硫酸含有多糖−Ｕ［実施例１２］ ４０ｍｇ 生理食塩水 適量 １アンプル当り ２ｍｌ 同様に実施例１２記載のフコース硫酸含有多糖−Ｆを使
用し注射剤を調製した。Example 40 Injection Preparation An injection preparation was prepared according to the following formulation. Sulfate-fucose-containing polysaccharide-U [Example 12] 40 mg Physiological saline 2 ml per ampoule Similarly, an injection was prepared using the sulfate-fucose-containing polysaccharide-F described in Example 12.

【０３１４】実施例４１ 錠剤下記処方に従い錠剤を調
製した。 フコース硫酸含有多糖標品（実施例１） １０ｍｇ コーンスターチ ６５ｍｇ カルボキシメチルセルロース ２０ｍｇ ポリビニルピロリドン ３ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ １錠当り １００ｍｇExample 41 Tablet A tablet was prepared according to the following formulation. Sulfate-fucose-containing polysaccharide preparation (Example 1) 10 mg Corn starch 65 mg Carboxymethyl cellulose 20 mg Polyvinylpyrrolidone 3 mg Magnesium stearate 2 mg 100 mg per tablet

【０３１５】実施例４２ 注射剤 Ｆ−Ｆｄ−１を注射用蒸留水に溶解し５％溶液とした。
この溶液を凍結乾燥用バイアル瓶１バイアル中に、フコ
ース硫酸含有多糖として５０ｍｇ充てんし、凍結乾燥を
行った。別に溶解液として生理食塩水２ｍｌを添加し
た。Example 42 Injection F-Fd-1 was dissolved in distilled water for injection to give a 5% solution.
One vial for freeze-drying was filled with 50 mg of this solution as a sulfated-fucose-containing polysaccharide, and freeze-dried. Separately, 2 ml of physiological saline was added as a solution.

【０３１６】実施例４３ 注射剤 下記処方に従い注射剤を調製した。 実施例１９−（６）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ の低分子化物の凍結乾燥物 ４０ｍｇ 生理食塩水 適量 １アンプル当り ２ｍｌExample 43 Injection Preparation An injection preparation was prepared according to the following formulation. Freeze-dried product of low molecular weight product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 19- (6) 40 mg physiological saline 2 mg per ampoule

【０３１７】実施例４４ 錠剤 下記処方に従い錠剤を調製した。 実施例１９−（６）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ の低分子化物の凍結乾燥物 １０ｍｇ コーンスターチ ６５ｍｇ カルボキシメチルセルロース ２０ｍｇ ポリビニルピロリドン ３ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ １錠当り １００ｍｇExample 44 Tablet A tablet was prepared according to the following formulation. Freeze-dried product of low molecular weight product of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 19- (6) 10 mg Corn starch 65 mg Carboxymethyl cellulose 20 mg Polyvinylpyrrolidone 3 mg Magnesium stearate 2 mg 100 mg per tablet

【０３１８】[0318]

【発明の効果】本発明により不要若しくは病原細胞に対
してアポトーシス誘発作用を有し、がん等の異常増殖細
胞疾患や、ウイルス性疾患において、病変細胞にアポト
ーシスを誘発させ、該疾患の予防、治療に有効な薬剤が
提供される。とりわけ大腸がん、胃がん等消化器系のが
んの場合、本発明の薬剤を経口投与することによりがん
細胞にアポトーシスを起こさせることができるため、天
然食品由来のフコース硫酸含有多糖及び／又はその分解
物を有効成分とする本発明の薬剤は非常に消化器系がん
に適した制がん剤である。またその発がん予防効果によ
り、化学発がん剤等による発がんも予防できる。本発明
の薬剤は、食用の褐藻植物、食用のナマコ等、食用物質
を原料として安価に大量に供給可能であり、且つ安全性
が高い点においても優れている。また、フコース硫酸含
有多糖及び／又はその分解物を含有する食品又は飲料を
日常的に摂取することにより、健康を維持、増強するこ
とができる。また、本発明により簡便なアポトーシス誘
発方法が提供され、本発明の方法を使用することによ
り、アポトーシス機構解明の研究、アポトーシス誘発阻
害剤の開発等を行うことができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, apoptosis is induced against unnecessary or pathogenic cells, and in abnormally proliferating cell diseases such as cancer and viral diseases, apoptosis is induced in diseased cells to prevent the disease, A therapeutically effective drug is provided. In particular, in the case of digestive system cancer such as colon cancer and gastric cancer, it is possible to cause cancer cells to undergo apoptosis by orally administering the agent of the present invention. The drug of the present invention containing the decomposed product as an active ingredient is a cancer drug extremely suitable for digestive system cancer. Further, due to its carcinogenic preventive effect, carcinogenic effects such as chemical carcinogens can be prevented. The agent of the present invention is excellent in that it can be inexpensively supplied in large quantities at a low cost using edible substances such as edible brown algae plants and edible sea cucumbers as raw materials, and is highly safe. Moreover, health can be maintained and enhanced by daily intake of foods or beverages containing the sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or its degradation product. Further, the present invention provides a simple method for inducing apoptosis, and by using the method of the present invention, research on elucidation of an apoptosis mechanism, development of an apoptosis induction inhibitor, etc. can be performed.

【０３１９】また本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Ｆを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な本発明のフコース
硫酸含有多糖−Ｕ及びその分解物が提供され、その効率
的な製造方法も提供された。Further, according to the present invention, the sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which is substantially free of sulfated-fucose-F and is useful in the fields of sugar chain engineering, medicine and the like, in which a highly reactive coloring substance is removed, U and its decomposition products were provided, and efficient production methods thereof were also provided.

【０３２０】更に本発明により、フコース硫酸含有多糖
−Ｕを実質的に含まず、反応性の強い着色性物質を除去
した糖鎖工学、医学等の分野で有用な、本発明のフコー
ス硫酸含有多糖−Ｆ及びその分解物が提供され、その効
率的な製造方法も提供された。Further, according to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which is substantially free of a sulfated-fucose-containing polysaccharide-U and is useful in the fields of sugar chain engineering, medicine, etc., in which a highly reactive coloring substance is removed. -F and its decomposition products were provided, and an efficient production method thereof was also provided.

【０３２１】本発明により、フコース硫酸含有多糖−Ｆ
の構造解析や分解、フコース硫酸含有多糖−Ｆの生物活
性の検索に有用なフコース硫酸含有多糖−Ｆの低分子化
物の製造に用いることができるエンド型フコース硫酸含
有多糖分解酵素、その製造方法、及びがん細胞に対する
アポトーシス誘発作用が強いフコース硫酸含有多糖−Ｆ
の該酵素による低分子化物が提供された。According to the present invention, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F
Of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme, which can be used for the production of a low molecular weight product of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F, which is useful for the structural analysis and decomposition of Sucrose-fucose-containing polysaccharide-F, and the biological activity of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F. And a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F that strongly induces apoptosis in cancer cells
A low molecular weight product of the enzyme was provided.

【０３２２】また、本発明によりこれまで安定的に製造
されなかった本発明のエンド型フコース硫酸含有多糖−
Ｆ分解酵素を、カルシウムイオンの存在下極めて安定的
に製造することができるようになった。さらに、本発明
により、カルシウムイオンの存在下本発明のエンド型フ
コース硫酸含有多糖分解酵素を極めて効率よく働かせる
ことが可能となった。In addition, the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide of the present invention, which has not been produced stably according to the present invention,
It has become possible to produce F-degrading enzyme extremely stably in the presence of calcium ions. Furthermore, according to the present invention, it became possible to work the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide-degrading enzyme of the present invention in the presence of calcium ions extremely efficiently.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】図１はフコース硫酸含有多糖の沈殿形成率を示
したものである。FIG. 1 shows the precipitation rate of sulfated-fucose-containing polysaccharides.

【図２】図２はセファクリルＳ−５００を用いたゲルろ
過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｕの分子量
分布を示したものである。FIG. 2 shows the molecular weight distribution of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U measured by a gel filtration method using Sephacryl S-500.

【図３】図３はフコース硫酸含有多糖−ＵのＩＲスペク
トルを示したものである。FIG. 3 shows an IR spectrum of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.

【図４】図４はフコース硫酸含有多糖−Ｕの １Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示したものである。FIG. 4 is 1 H—N of sulfated-fucose-containing polysaccharide-U.
3 shows an MR spectrum.

【図５】図５は糖化合物（ａ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ａ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。FIG. 5 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-a) of the sugar compound (a) was separated by an L-column.

【図６】図６は糖化合物（ｂ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ｂ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものである。FIG. 6 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-b) of the sugar compound (b) was separated by an L-column.

【図７】図７は糖化合物（ｃ）のピリジル−（２）−ア
ミノ化糖化合物（ＰＡ−ｃ）をＬ−カラムにより分離し
たときの溶出パターンを示したものある。FIG. 7 shows an elution pattern when a pyridyl- (2) -aminated sugar compound (PA-c) of the sugar compound (c) was separated by an L-column.

【図８】図８は糖化合物（ａ）のマス分析（ネガティブ
測定）により得られた結果を示したものである。FIG. 8 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (a).

【図９】図９は糖化合物（ｂ）のマス分析（ネガティブ
測定）により得られた結果を示したものである。FIG. 9 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (b).

【図１０】図１０は糖化合物（ｃ）のマス分析（ネガテ
ィブ測定）により得られた結果を示したものである。FIG. 10 shows the results obtained by mass analysis (negative measurement) of sugar compound (c).

【図１１】図１１は糖化合物（ａ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 11 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (a).

【図１２】図１２は糖化合物（ｂ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 12 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of the sugar compound (b).

【図１３】図１３は糖化合物（ｃ）のマスマス分析（ネ
ガティブ測定）により得られた結果を示したものであ
る。FIG. 13 shows the results obtained by mass-mass analysis (negative measurement) of sugar compound (c).

【図１４】図１４は糖化合物（ａ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。FIG. 14 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (a).

【図１５】図１５は糖化合物（ｂ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。FIG. 15 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (b).

【図１６】図１６は糖化合物（ｃ）の １Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示したものである。FIG. 16 shows 1 H-NMR spectrum of sugar compound (c).

【図１７】図１７はセファクリルＳ−５００を用いたゲ
ルろ過法により測定したフコース硫酸含有多糖−Ｆの分
子量分布を示したものである。FIG. 17 shows the molecular weight distribution of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F measured by the gel filtration method using Sephacryl S-500.

【図１８】図１８はフコース硫酸含有多糖−ＦのＩＲス
ペクトルを示したものである。FIG. 18 shows an IR spectrum of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.

【図１９】図１９はフコース硫酸含有多糖−Ｆの １Ｈ
−ＮＭＲスペクトルを示したものである。FIG. 19 shows 1 H of sulfated-fucose-containing polysaccharide-F.
-Shows the NMR spectrum.

【図２０】図２０は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素のｐＨと相対活性の関係を示
すグラフである。FIG. 20 is a graph showing the relationship between pH and relative activity of the endo-sulfate-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.

【図２１】図２１は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の温度と相対活性の関係を示
すグラフである。FIG. 21 is a graph showing the relationship between temperature and relative activity of endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzymes obtained by the present invention.

【図２２】図２２はセルロファインＧＣＬ−３００を用
いたゲルろ過法により測定した、フコース硫酸含有多糖
−Ｆを本発明により得られるエンド型フコース硫酸含有
多糖分解酵素により分解する前後の分子量分布を示した
ものである。FIG. 22 shows the molecular weight distribution before and after the decomposition of the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained by the present invention, which was measured by the gel filtration method using Cellulofine GCL-300. It is shown.

【図２３】図２３は本発明により得られるエンド型フコ
ース硫酸含有多糖分解酵素の反応液中のカルシウムイオ
ン濃度と相対活性の関係を示すグラフである。FIG. 23 is a graph showing the relationship between the calcium ion concentration and the relative activity in the reaction solution of the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.

【図２４】図２４は実施例１９−（６）においてセルロ
ファインＧＣＬ−３００を用いたゲルろ過法により測定
した、フコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明により得られ
るエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素により分解し
たものの分子量分布を示したものである。FIG. 24 is an endo-type sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained by the present invention, which is obtained by the method of Example 19- (6) using the gel filtration method using Cellulofine GCL-300. It shows the molecular weight distribution of what was decomposed by.

【図２５】図２５はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したもののＩＲスペクトルを示したものであ
る。FIG. 25 shows an IR spectrum of a product obtained by decomposing sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.

【図２６】図２６はフコース硫酸含有多糖−Ｆを本発明
により得られるエンド型フコース硫酸含有多糖分解酵素
により分解したものの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示した
ものである。FIG. 26 is a 1 H-NMR spectrum of a product obtained by decomposing the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F by the endo-sulfated-fucose-containing polysaccharide degrading enzyme obtained according to the present invention.

【図２７】図２７はＨＬ−６０細胞の培養液に実施例
１、１５、及び１８で得られたフコース硫酸含有多糖を
１ｍｇ／ｍｌとなるように添加したときの培養時間と培
養液中の生細胞数の関係を示したものである。FIG. 27 shows the culture time and the culture time when the sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Examples 1, 15 and 18 were added to the culture solution of HL-60 cells at a concentration of 1 mg / ml. It shows the relationship between the numbers of viable cells.

【図２８】図２８はＭＯＬＴ−３細胞の培養液に実施例
１で得られたフコース硫酸含有多糖、実施例１２で得ら
れたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、実施例１５及び１７で
得られたフコース硫酸含有多糖、及びデキストラン硫酸
を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。FIG. 28 is a sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 1, a sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained in Example 12, obtained in Examples 15 and 17 in a culture medium of MOLT-3 cells. FIG. 2 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in a culture solution when a sulfated-fucose-containing polysaccharide and dextran sulfate are added.

【図２９】図２９はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品、実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ及びフコース硫酸含有
多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−１、Ｆ−Ｆｄ−２、Ｆ−Ｆｄ−
３、及びＦ−Ｆｄ−４、実施例１５で得られたフコース
硫酸含有多糖、及びヘパリン及びデキストラン硫酸を添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。FIG. 29 is a sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1, a fucose-sulfuric acid-containing polysaccharide mixture obtained in Example 1, and a fucose sulfate obtained in Example 12 in a culture solution of HCT 116 cells. Contained Polysaccharide-U and Sulfated Fucose-Containing Polysaccharide-F, F-Fd-1, F-Fd-2, F-Fd-
Fig. 3 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture broth when F, Fd-4, F-Fd-4, the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15, heparin and dextran sulfate were added.

【図３０】図３０はＨＣＴ １１６細胞の培養液に実施
例１で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度
で添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係
を示したものである。FIG. 30 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of HCT 116 cells at various concentrations. It is a thing.

【図３１】図３１はＡＧＳ細胞の培養液に実施例１で得
られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加し
たときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示した
ものである。FIG. 31 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of AGS cells at various concentrations. It is a thing.

【図３２】図３２はＳＷ４８０細胞の培養液に実施例１
で得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添
加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示
したものである。FIG. 32 shows that the culture medium of SW480 cells was used in Example 1.
2 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in step 1 was added at various concentrations.

【図３３】図３３はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖混合物、実施例１２で得
られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、Ｆ−Ｆｄ−３及びＦ
−Ｆｄ−４及び実施例１５で得られたフコース硫酸含有
多糖を添加したときの培養時間と培養液中の生細胞数の
関係を示したものである。FIG. 33 is a mixture of sulfated-fucose-containing polysaccharides obtained in Example 1, sulfated-fucose-containing polysaccharides-F, F-Fd-3 and F obtained in Example 1 in a culture medium of WiDr cells.
FIG. 16 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture solution when Fd-4 and the sulfated-fucose-containing polysaccharide obtained in Example 15 were added.

【図３４】図３４はＷｉＤｒ細胞の培養液に実施例１で
得られたフコース硫酸含有多糖標品を様々な濃度で添加
したときの培養時間と培養液中の生細胞数の関係を示し
たものである。FIG. 34 shows the relationship between the culture time and the number of viable cells in the culture medium when the sulfated-fucose-containing polysaccharide preparation obtained in Example 1 was added to the culture medium of WiDr cells at various concentrations. It is a thing.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｚ 19/14 19/14 Ｚ (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:20） Ｃ１２Ｒ 1:20 (Ｃ１２Ｎ 9/26 1:10 Ｃ１２Ｒ 1:10） (31)優先権主張番号 特願平8−171658 (32)優先日 平成８年６月12日(1996．6．12) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願平8−204187 (32)優先日 平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５４３６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４８７３ (72)発明者 北野 秀夫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 于 福功 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中山 信司 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 児島 薫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 木村 ひとみ 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 中西 芳邦 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 片山 薫 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (72)発明者 冨永 隆生 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社 中央研究所内 (72)発明者 嶋中 一夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 猪飼 勝重 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 青森県弘前市大字在府町82番地４ 株式 会社糖鎖工学研究所内 (56)参考文献 特開 平７−215990（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−506089（ＪＰ，Ａ) Ｔａｋａｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅ ｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，1994年，255，213 −224 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08B 1/00 - 37/18 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C12P 19/04 C12P 19/04 Z 19/14 19/14 Z (C12N 9/26 C12N 9/26 C12R 1:20) C12R 1 : 20 (C12N 9/26 1:10 C12R 1:10) (31) Priority claim number Japanese Patent Application No. 8-171658 (32) Priority date June 12, 1996 (June 12, 1996) (33) Priority claiming country Japan (JP) (31) Priority claiming number Japanese Patent Application No. 8-204187 (32) Priority date July 16, 1996 (July 16, 1996) (33) Priority claiming country Japan (JP ) Accession number of microorganisms FERM P-15436 Accession number of microorganisms FERM BP-5402 Accession number of microorganisms FERM BP-5403 Accession number of microorganisms FERM P-14872 Accession number of microorganisms FERM P-14873 (72) Inventor Hideo No, 82, Fuyucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor in Fukuno, 82, Fufucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Invention Person Shinji Nakayama 82, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor Kaoru Kojima 82, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Research Institute (72) Invention Person Hitomi Kimura 82 Ginza-cho, Hirosaki City, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute, Inc. (72) Inventor Yoshikuni Nakanishi 82 Ginzai-cho, Hirosaki, Aomori Prefecture 4 Glycoengineering Institute (72) Invention Person Kaoru Katayama 82-4, Fufu-cho, Hirosaki-shi, Aomori Prefecture Glycoengineering Research Institute, Inc. (72) Inventor Takao Tominaga 3-4-1 Seta, Otsu, Shiga Prefecture, Central Research Laboratory, Taso Shuzo Co., Ltd. (72) Inventor Kazuo Shimanaka 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture, Takara Shuzo Co., Ltd., Central Research Laboratory (72) Inventor, Inoi Shige Prefecture Otsu, Shiga Prefecture 3-4-1 Seta, Central Research Laboratories, Inc. (72) Inventor Ikuno Kato 82, Fuyucho, Hirosaki City, Aomori Prefecture Glycoengineering Research Institute (56) References Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-215990 (JP, A) Japanese Patent Publication No. 4-506089 (JP, A) Takashi Nishino et al. , Carbohydrate Research, 1994, 255, 213 -224 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C08B 1/00-37/18 CAPLUS (STN) MEDLINE (STN) BIOSIS (DIALOG)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記理化学的性質を有することを特徴と
する、ガゴメ昆布由来のフコース硫酸含有多糖。 （１）構成糖：ウロン酸を含有する。 （２）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
０２）の生産するフコイダン分解酵素により低分子化
し、少なくとも下記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）で
表される化合物より選択される一種以上の化合物が生成
する。 【化１】 【化２】 【化３】 1. A sulfated-fucose-containing polysaccharide derived from Gagome kombu, which has the following physicochemical properties. (1) Constituent sugar: Contains uronic acid. (2) Flavobacterium
um) sp. SA-0082 (FERM BP-54
The fucoidan-degrading enzyme produced in 02) lowers the molecular weight to produce at least one compound selected from the compounds represented by the following formulas (I), (II) and (III). [Chemical 1] [Chemical 2] [Chemical 3] 【請求項２】 フコース硫酸含有多糖混合物を塩類の存
在下、酸性多糖凝集能のある薬剤で処理し、沈殿物を除
去する工程を包含することを特徴とする請求項１記載の
フコース硫酸含有多糖の製造方法。2. The sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1, which comprises a step of treating the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture with a drug capable of aggregating acidic polysaccharides in the presence of salts to remove precipitates. Manufacturing method. 【請求項３】 フコース硫酸含有多糖混合物を、２価の
陽イオンの混在下に陰イオン交換樹脂で処理して目的の
多糖を採取する工程を包含することを特徴とする請求項
１記載のフコース硫酸含有多糖の製造方法。3. The fucose according to claim 1, further comprising the step of treating the sulfated-fucose-containing polysaccharide mixture with an anion exchange resin in the presence of a divalent cation to collect the desired polysaccharide. A method for producing a sulfate-containing polysaccharide. 【請求項４】 請求項１記載のフコース硫酸含有多糖を
製造する際に、共存する着色性物質を多糖性の物質ある
いは陰イオン交換基を有する物質を用いて除去する工程
を包含することを特徴とする請求項１記載のフコース硫
酸含有多糖の製造方法。4. The method for producing the sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1, comprising a step of removing coexisting coloring substances using a polysaccharide substance or a substance having an anion exchange group. The method for producing a sulfated-fucose-containing polysaccharide according to claim 1.
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