JP3499263B2 - Detection and nucleotide sequence of Klebsiella spp. - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌の１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ遺伝子に由来する塩基配列及びその利用に関する。
更に詳細には、本発明に係る塩基配列は、１８塩基から
なる核酸断片であって、分子交雑により大腸菌群、特に
クレブシエラ属菌と特異的に結合するため、この細菌を
検出することができるものである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to 16S rR of Escherichia coli.
The present invention relates to a nucleotide sequence derived from the NA gene and its use.
More specifically, the base sequence according to the present invention is a nucleic acid fragment consisting of 18 bases, which specifically binds to coliform bacteria, particularly Klebsiella spp. Is.

【０００２】したがって本発明は、食品その他の検体か
らクレブシエラ属菌を検出するのに利用することができ
るほか、細菌の同定等、食品、医療その他バイオテクノ
ロジーの技術分野で重用されるものである。Therefore, the present invention can be used for detecting Klebsiella sp. From foods and other specimens, and is also used in the technical fields of food, medical and other biotechnology, such as identification of bacteria.

【０００３】[0003]

【従来の技術】従来、食品その他の検体中における大腸
菌群、特にクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅ
ｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニ
エ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）等
のクレブシエラ属細菌の検出は、次のようにして行って
いるが、その菌種同定には数日〜１週間もの長い期間を
要する。2. Description of the Related Art Conventionally, coliforms in foods and other samples, especially Klebsiella oxytoca.
detection of Klebsiella pneumoniae bacteria such as Lla oxytoca) and Klebsiella pneumoniae is performed as follows, but identification of the bacterial species requires a long period of several days to one week.

【０００４】先ず、食品等検体中の大腸菌群の検査は、
ＢＧＬＢ発酵管培地による推定試験を経てＥＭＢ培地に
よる確定試験、そしてＬＢ培地での乳糖分解、ガス発生
試験後グラム染色での確認（グラム陰性短桿菌）によ
り、大腸菌群であることが判明する。ここでの試験に約
２日間を要する。First, the inspection of coliforms in food samples is as follows:
It is found to be a coliform group by a confirmation test using an EMB medium through a putative test using a BGLB fermentation tube medium, and a lactose decomposition in the LB medium, and confirmation by Gram staining after a gas generation test (Gram-negative short bacilli). The test here takes about 2 days.

【０００５】次に、ＩＭＶＩＣ鑑定で菌種の同定に移
る。Ｉｎｄｏｌｅ，ＭＲ，ＶＰ，Ｃｉｔｒａｔｅなどの
各反応試験で大腸菌群の分類を行う。この期間約２日な
いし３日間を要する。そのため、菌種同定に要する期間
は１週間弱となる。Next, the identification of the bacterial species will proceed to the IMVIC evaluation. The coliforms are classified by each reaction test such as Indole, MR, VP and Citrate. This period takes about 2 to 3 days. Therefore, the period required for bacterial species identification is less than one week.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】上記のように従来の方
法では菌種を検出するために少なくとも数日を要する。
本発明は、この作業日数を大幅に短縮することを目的と
する。As described above, in the conventional method, it takes at least several days to detect the bacterial species.
The present invention aims to significantly reduce the number of working days.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に鋭意研究した結果、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子
において広く腸内細菌に保存されている領域（ｖａｒｉ
ａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）からプライマーを合成するの
に成功し、そしてこれを用いてＰＣＲ法によって１６Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、次いでＤＮＡの塩基配列を
決定するのに成功し、そして遂に、これらの配列よりプ
ローブとなり得る領域を選択し、１８塩基からなるオリ
ゴヌクレオチドプローブを新たに合成するのに成功し、
本発明の完成に至ったものである。図１に１６Ｓ ｒＲ
ＮＡの２次構造を示す。[Means for Solving the Problems] As a result of extensive studies aimed at achieving the above-mentioned object, a region (vari) widely conserved in enterobacteria in the 16S rRNA gene of Escherichia coli
successfully synthesized a primer from a double region and used it for 16S by PCR.
Succeeded in amplifying the rRNA gene and then in determining the base sequence of DNA, and finally selecting a region that could be a probe from these sequences, and succeeded in newly synthesizing an oligonucleotide probe consisting of 18 bases. ,
The present invention has been completed. 16S rR in Figure 1
The secondary structure of NA is shown.

【０００８】更に、これらの新規合成プローブは、１８
塩基の核酸断片であって分子交雑によってクレブシエラ
属菌種に特異的に結合するという特性を有しているの
で、この特性を利用することにより、例えばリバースド
ットブロットハイブリダイゼーションその他既知の方法
によって、これらの菌種の検出、同定が正確且つ迅速に
実施できることも研究の結果確認された。Furthermore, these newly synthesized probes are
Since it is a nucleic acid fragment of a base and has a property of specifically binding to Klebsiella spp. By molecular hybridization, by utilizing this property, for example, by reverse dot blot hybridization or other known methods, It was also confirmed as a result of the study that the detection and identification of the bacterial species of A. can be performed accurately and rapidly.

【０００９】以下、本発明を実施例にしたがって具体的
に説明する。The present invention will be described in detail below with reference to examples.

【００１０】（Ａ）菌ＤＮＡの調製 以下に示す試薬を用いて１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を調製
する。(A) Preparation of bacterial DNA 16S rRNA gene is prepared using the reagents shown below.

【００１１】１．培地Ｂａｃｔｏ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉ
ｃ Ｍｅｄｉｕｍ３ 細菌培地用寒天末 ２．１０×ＰＣＲバッファー 反応時の濃度 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０) １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ２５ｍＭ ＫＣｌ ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０ ３．ＰＣＲプライマー Ｆ ５’−ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ−
３’ Ｒ ５’−ＴＡＣＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＴＡＣ−
３’ （１０μＭに調整） ４．２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（但しｄＮＴＰは１．５ｍ
Ｍ） ５．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ ６．ＲＮａｓｅＡ（１０μｇ／ｍｌ）1. Medium Bacto Antibioti
c Medium 3 Agar powder for bacterial medium 2.10 × concentration during PCR buffer reaction 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 1.5 mM MgCl ₂ 25 mM KCl 0.05% Tween-20 3. PCR primer F 5'-CCTACGGGAGGCAGCAGT-
3'R 5'-TACCGCATTTCACCGCTAC-
3 '(adjusted to 10 μM) 4.2.5 mM dNTP (however, dNTP is 1.5 m
M) 5. Fluorescein-11-dUTP 6. RNaseA (10 μg / ml)

【００１２】その調製方法は、次のとおりである。The preparation method is as follows.

【００１３】１；終夜平面培地で培養した菌を滅菌した
楊子を用いて２００μｌの滅菌水に懸濁し、１００℃で
５分間煮沸する。 ２；煮沸したサンプルを１４０００ｒｐｍで５分間遠心
し、ＤＮＡを上清中に集め、この上清をＰＣＲに用い
る。ＰＣＲは次のようにして行う（図２）。 ３；反応系 煮沸したＤＮＡ ３８μｌ １０×ＰＣＲバッファー ５μｌ プライマー ２μｌ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｘ ３μｌ ＲＮａｓｅＡ １μｌ ＶＥＮＴ（Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） １μｌ 計５０μｌを良く混ぜてＰＣＲ法により増幅する。 ４；ＰＣＲ法のプログラムは、以下に示す通り。 ９４℃ ２分 ４８℃ ２分 ７２℃ ２分
を１回 ９４℃ ３０秒 ４８℃ ３０秒 ７２℃ ２分
を２９回 ７２℃ ２分 を１回 ５；増幅したＤＮＡを確認するために、１．５％アガロ
ースゲルを用いて電気泳動しＥｔＢｒ溶液染色し確認す
る。 ６；ＰＣＲ反応液を５０μｌの滅菌蒸留水に溶かし、全
量の１００μｌをハイブリダイゼーションに用いる。 ７；上記したように増幅したＰＣＲサンプルはミニゲル
で確認後、４％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分
離精製し、切り出したゲルを透析チューブにいれ、ＴＢ
Ｅ緩衝液中で１５０ｍＡ、で２時間抽出する。次いでサ
ンプルは、 フェノール抽出、エタノール沈殿を行い
滅菌水に希釈し、ＤＮＡシーケンサ ーを用いて塩基
配列を解析した。1; Suspend the bacteria cultured in a flat medium overnight in 200 μl of sterilized water using a sterilized toothpick and boil at 100 ° C. for 5 minutes. 2; Centrifuge the boiled sample at 14000 rpm for 5 minutes, collect the DNA in the supernatant, and use this supernatant for PCR. PCR is performed as follows (FIG. 2). 3; Reaction system Boiled DNA 38 μl 10 × PCR buffer 5 μl Primer 2 μl Nucleotide mix 3 μl RNaseA 1 μl VENT (Taq polymerase) 1 μl A total of 50 μl was mixed well and amplified by the PCR method. 4; The PCR method program is as shown below. 94 ℃ 2 minutes 48 ℃ 2 minutes 72 ℃ 2 minutes
Once 94 ° C 30 seconds 48 ° C 30 seconds 72 ° C 2 minutes
29 times at 72 ° C. 2 minutes once 5; In order to confirm the amplified DNA, electrophoresis is performed using a 1.5% agarose gel and staining with EtBr solution is performed for confirmation. 6; Dissolve the PCR reaction solution in 50 μl of sterile distilled water, and use 100 μl of the total amount for hybridization. 7; PCR sample amplified as described above was confirmed by mini gel, separated and purified by 4% polyacrylamide gel electrophoresis, and the excised gel was put in a dialysis tube and TB was added.
Extract for 2 hours at 150 mA in E buffer. Next, the sample was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation, diluted with sterilized water, and the nucleotide sequence was analyzed using a DNA sequencer.

【００１４】（Ｂ）オリゴヌクレオチドプローブの配列
決定 上記により解析した配列を図３に示す。図３には、クレ
ブシエラ属菌以外の大腸菌群に属する細菌の配列も示し
た。なお略号は次の菌種を表わす。(B) Sequencing of oligonucleotide probe The sequence analyzed above is shown in FIG. FIG. 3 also shows the sequences of bacteria belonging to the coliform group other than Klebsiella. The abbreviations represent the following bacterial species.

【００１５】 Ｃ ：Ｃｉｔｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ Ａ ：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ Ｅｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓ ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｋ２：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ Ｋ２ Ｋ７：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ Ｋ７ Ｐ２：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｐ２ Ｐ３：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
Ｐ３ Ｅｎ：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅC: Citobacter frundii A: Aeromonas hydrophila Es: Escherichia coli S: Salmonella typhimurium K2: Klebsiella oxytoca kelp K2: Klebsiella oxytoca K2 K2
P2 P3: Klebsiella pneumoniae
P3 En: Enterobacter cloacae

【００１６】これらの配列により、プローブとなり得る
領域を選択し、１８塩基のオリゴヌクレオチドプローブ
をそれぞれ合成するとともに、各菌種に共通の領域から
１８塩基のコントロールプローブも合成した。A region that can serve as a probe was selected based on these sequences, and 18-base oligonucleotide probes were synthesized, and a 18-base control probe was synthesized from a region common to each bacterial species.

【００１７】すなわち、本発明において使用するオリゴ
ヌクレオチドプローブの配列は次のとおりであって、い
ずれも従来未知の新規物質である。That is, the sequences of the oligonucleotide probes used in the present invention are as follows, all of which are novel substances which have hitherto been unknown.

【００１８】Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａを特異的に結合する配
列 ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧ−３’ ５’−ＡＡＴＡＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＴＧＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列K. Sequence specifically binding oxytoca 5'-AATAACCTCATCACATTG-3 '5'-AATAACCTTTGCGATTGA-3' Also, a sequence complementary to these sequences.

【００１９】Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを特異的に結合
する配列 ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡ−３’ ５’−ＧＧＡＡＧＧＣＡＴＴＡＡＧＧＴＴＡＡ−３’ また、これらの配列に相補的な配列K. Pneumoniae-specific binding sequence 5′-GGAAGGCGGGTGAGGTTAA-3 ′ 5′-GGAAGGCATTAAGGTTAA-3 ′ Further, a sequence complementary to these sequences.

【００２０】次に、このようにして合成したオリゴプロ
ーブを、下記（Ｃ）、（Ｄ）にしたがい、ナイロンメン
ブレンへ固定する（図４）。Next, the oligo probe thus synthesized is immobilized on a nylon membrane according to the following (C) and (D) (FIG. 4).

【００２１】（Ｃ）オリゴヌクレオチドのＴ−ｔａｉｌ
ｉｎｇ 以下に示す試薬を用いて、オリゴプローブの３’末端に
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の作用によりデオキシＴＴＰを結合させる。(C) Oligonucleotide T-tail
ing Deoxy TTP is bound to the 3'end of the oligo probe by the action of terminal deoxynucleotidyl transferase using the reagents shown below.

【００２２】１．Terminal deoxynucleotidyltranferas
e（TOYOBO） ２．10×Cacodylate buffer［1M sodium Cacodylate(pH
7.6), 0.25M Tris-HCl(pH7.6), 2mM DTT］ ３．1M Tris-HCl(pH7.6) ４．200mM DTT ５．100mM CoCl₂ ６．dTTP ７．20×SSPE［20mM Na₂EDTA, 0.16M NaOH, 0.2M NaH₂P
O₄(H₂O), 3.6M NaCl］ ８．20×SSC［3.0M NaCl, 0.3M Sodium Citrate］ ９．10％SDS 10．Duralon ＵＶ(STRATAGENE) 11．ブロッター 12．ＵＶ stratalinker 1800(STRATAGENE)1. Terminal deoxynucleotidyltranferas
e (TOYOBO) 2.10 x Cacodylate buffer [1M sodium Cacodylate (pH
7.6), 0.25M Tris-HCl ( pH7.6), 2mM DTT] 3.1M Tris-HCl (pH7.6) 4.200mM DTT 5.100mM CoCl 2 6. dTTP 7.20 × SSPE [20mM Na ₂ EDTA, 0.16M NaOH, 0.2M NaH ₂ P
O ₄ (H ₂ O), 3.6M NaCl] 8.20 × SSC [3.0M NaCl, 0.3M Sodium Citrate] 9.10% SDS 10. Duralon UV (STRATAGENE) 11. Blotter 12. UV stratalinker 1800 (STRATAGENE)

【００２３】その結合方法は次のとおりである。The connecting method is as follows.

【００２４】１；以下に示す組成でＤＮＡの３’末端に
ポリｄＴを付加する。 １０×Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌ １００ｍＭ ｄＴＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ＣｏＣｌ₂ １０μｌ ２５Units／μl ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２μｌ ２μＭ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 全量１００μｌ ２；以上の試薬をエッペンドルフに入れて３７℃で２時
間インキュベートする。 ３；等量のフェノール／クロロフォルム１００μｌを加
えＶｏｒｔｅｘし室温で３分間１３０００ｒｐｍで遠心
する。 ４；除蛋白された上清をとり３Ｍ酢酸ナトリウム１０μ
ｌ、１００％エタノール３３０μｌ、グリコーゲン１μ
ｌを加えて混和。 ５；軽く遠心し−２０℃で３０分放置する。 ６；４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し上清を除
く。 ７；７０％エタノールを加え遠心し上清を除き乾燥す
る。 ８；１０８μｌの水に溶かし８μｌを用いてアガロース
電気泳動を行いポリｄＴが約４００ｍｅｒ．ついている
ことを確認する。1; PolydT is added to the 3'end of DNA with the following composition. 10 × Cacodylate buffer 10 μl 100 mM dTTP 4 μl 10 mM CoCl ₂ 10 μl 25 Units / μl terminal transferase 2 μl 2 μM oligonucleoside total amount 100 μl 2; 3; 100 μl of an equal amount of phenol / chloroform was added, Vortexed, and centrifuged at room temperature for 3 minutes at 13,000 rpm. 4; Remove the deproteinized supernatant and take 3M sodium acetate 10μ
1, 100% ethanol 330μl, glycogen 1μ
Add 1 and mix. 5; Centrifuge gently and leave at -20 ° C for 30 minutes. 6; Centrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. and remove the supernatant. 7: Add 70% ethanol, centrifuge, remove the supernatant, and dry. 8: Dissolved in 108 μl of water and subjected to agarose electrophoresis using 8 μl, and poly dT was about 400 mer. Make sure it is on.

【００２５】（Ｄ）プローブのフィルターへの固定 ナイロンメンブレンにプローブをドットブロッターで吸
引し、ＵＶ照射でＴＴＰポリマーを固定する。その具体
的方法は次のとおりである。(D) Fixing the probe to the filter The probe is sucked onto the nylon membrane with a dot blotter, and the TTP polymer is fixed by UV irradiation. The specific method is as follows.

【００２６】１；あらかじめ１０×ＳＳＣにフィルター
を浸しておく。 ２；プローブ溶液１００μｌを１５ｍｌのチューブにい
れ１０×ＳＳＣを４ｍｌ加える。 ３；６５℃で５分間インキュベーションし次いで５分氷
冷する。 ４；それを、２００μｌずつブロッティングする。 ５；１０×ＳＳＣ ４５０μｌで洗い５分間吸引する。 ６；フィルターをＵＶ ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １
８００でＵＶ照射する。（２４０ｎｍ） ７；５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（試薬はその都度作
成する。２０×ＳＳＰＥ２５ｍｌいれ、滅菌水８０ｍｌ
メスアップ、１０％ＳＤＳ １ｍｌ入れて１００ｍｌに
する。結晶化することがあるので注意）で３７℃、１５
分間フィルターを洗う。 ８；水で１分間洗い、乾燥させる。1; The filter is immersed in 10 × SSC in advance. 2; Add 100 μl of the probe solution to a 15 ml tube and add 4 ml of 10 × SSC. 3; Incubate at 65 ° C for 5 minutes, then chill on ice for 5 minutes. 4; Blot it in 200 μl aliquots. 5; Wash with 450 μl of 10 × SSC and aspirate for 5 minutes. 6; Filter the UV straightlinker 1
UV irradiation at 800. (240 nm) 7; 5 × SSPE, 0.1% SDS (reagent is prepared each time. Add 20 ml of 20 × SSPE, sterilized water 80 ml
Make up to 100 ml by adding 1 ml of mess up and 10% SDS. It may crystallize, so be careful) at 37 ℃, 15
Wash the filter for a minute. 8; Wash with water for 1 minute and dry.

【００２７】（Ｅ）菌ＤＮＡの増幅及び標識 上記により調製、固定化したプローブとハイブリダイゼ
ーションする菌、つまり検出しようとする対象菌のＤＮ
Ａの増幅及び標識は、図５のようにして行う。それには
先ず、保存領域より合成された１８塩基のプライマーを
用いる。番号はＥ．ｃｏｌｉ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓ
ｙｓｔｅｍによるものである。反応系にフルオレセイン
のついたｄＵＴＰヌクレオチドミックスを加えることで
フルオレセインラベルされたリボソームＲＮＡ遺伝子の
増幅フラグメント約３６２ｂｐが得られる。この反応液
を５分間煮沸し１本鎖にしハイブリダイゼーションを行
う。(E) Amplification and Labeling of Bacterial DNA Bacteria that hybridize with the probe prepared and immobilized as described above, that is, DN of the target bacterium to be detected
Amplification and labeling of A are performed as in FIG. First, an 18-base primer synthesized from the conserved region is used. The number is E. coli numbering
system. By adding dUTP nucleotide mix with fluorescein to the reaction system, an amplified fragment of 362 bp of fluorescein-labeled ribosomal RNA gene is obtained. This reaction solution is boiled for 5 minutes to form a single strand and hybridized.

【００２８】ここで、プライマーとしては、下記する２
種類の配列が例示されるが、これらはいずれも従来未知
のプライマーである。 ５’ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ３’ ３’ＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＴＴＡＣＧＣＡＴ５’Here, as the primer, the following 2
Examples of the types of sequences are shown, but these are all conventionally unknown primers. 5'CCTACGGGAGGCAGCAGT3 '3'CATCGCCACTTTTACGCAT5'

【００２９】（Ｆ）ハイブリダイゼーション 以下に示す試薬を用いて、例えばリバースドットブロッ
トハイブリダイゼーション（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ
ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）等のハイブリ
ダイゼーションを行う。(F) Hybridization Using the reagents shown below, for example, reverse dot blot hybridization (Reverse dot)
hybridization such as blot hybridization).

【００３０】１．ラピッドハイブリダイゼーションバッ
ファー（アマシャムジャパン） ２．Antibody wash buffer（100mM Tris-HCl (7.5)，15
0mM NaCl） ３．Blocking buffer(0.5％w/v blocking agent in ant
ibody wash buffer) ４．0.5％w/v BSA(fraction V)in antibody wash buffe
r ５．anti-fluorescein-HRP (ホースラディッシュパーオ
キシデース)conjugate ６．Tween201. Rapid hybridization buffer (Amersham Japan) 2. Antibody wash buffer (100mM Tris-HCl (7.5), 15
0 mM NaCl) 3. Blocking buffer (0.5% w / v blocking agent in ant
ibody wash buffer) 4.0.5% w / v BSA (fraction V) in antibody wash buffe
r 5. anti-fluorescein-HRP (Horse Radish Peroxidase) conjugate 6. Tween20

【００３１】その方法は、次のとおりであって（図
６）、先ずナイロンメンブレンに固定されたオリゴプロ
ーブと１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで標識させたも
のをハイブリダイゼーションバッファー中で４２℃、１
時間反応させる。その後、抗フルオレセインコンジュゲ
イトのホースラディッシュパーオキシデースを加え室温
で１時間反応させる。ハイブリダイズしたＤＮＡに酵素
標識する。そして、基質の過酸化水素を反応させること
によりルミノールの発光が生じＸ線フィルムに検出する
システムである。その具体的な方法は次のとおりであ
る。The method is as follows (FIG. 6). First, an oligo probe immobilized on a nylon membrane and a 16S rRNA gene labeled by PCR were subjected to PCR in a hybridization buffer at 42 ° C. for 1 hour.
React for hours. Then, anti-fluorescein conjugate gate horseradish peroxidase is added and reacted for 1 hour at room temperature. The hybridized DNA is enzymatically labeled. Then, by reacting with hydrogen peroxide as a substrate, luminescence of luminol is generated to detect it on the X-ray film. The specific method is as follows.

【００３２】１；（プレハイブリダイゼーション） ４２℃で加温したラピッドハイブリダイゼーションバッ
ファーをメンブレンに１２．５ｍｌ／１００ｃｍ²の濃
度で加え１５分間ハイブリダイゼーションを行う。 ２；（ハイブリダイゼーション） 増幅したＰＣＲ産物を５分間煮沸し１５分間氷冷する。 ３；ハイブリダイゼーションバッファーに加え４２℃で
６０分間ハイブリダイゼーションを行う。 ４；（メンブレンの洗浄） ５×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで室温で２０分間軽く洗浄
する。１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで５５℃で１５分間
洗浄する。 ５；（抗体標識準備） 室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２
ｍｌ／ｃｍ²）で１分間洗浄する。５５℃で溶解したｂ
ｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍｌ／ｃｍ²）
で６０分間洗浄する。室温でａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ
ｈ ｂｕｆｆｅｒ（２ｍｌ／ｃｍ²）で１分間洗浄す
る。 ６；（ＨＲＰ標識） ＢＳＡ ０．０５ｇをａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈ ｂ
ｕｆｆｅｒ １０ｍｌに溶解する。１０００分の１のＨ
ＲＰ ａｎｔｉｂｏｄｙを加える。０．２５ｍｌ／ｃｍ
²で室温で６０分間反応させる。０．１％ｖ／ｖ Ｔｗ
ｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂｕ
ｆｆｅｒで１０分間２回洗浄する。０．１％ｖ／ｖ Ｔ
ｗｅｅｎ ２０ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓｈｂ
ｕｆｆｅｒで５分間２回洗浄する。 ７；（検出） 検出試薬１と２（アマシャムジャパン社）を０．１２５
ｍｌ／ｃｍ²の量になるように等量混ぜ合わせメンブレ
ンにかける。１分間静置し余分な試薬を除きフィルムカ
セットにはさむ。約５分感光させて検出する。1; (Prehybridization) Rapid hybridization buffer heated at 42 ° C. is added to the membrane at a concentration of 12.5 ml / 100 cm ² and hybridization is carried out for 15 minutes. 2; (Hybridization) The amplified PCR product is boiled for 5 minutes and ice-cooled for 15 minutes. 3; Add to hybridization buffer and perform hybridization at 42 ° C. for 60 minutes. 4; (Washing of Membrane) Lightly wash with 5 × SSC, 0.1% SDS for 20 minutes at room temperature. Wash with 1 × SSC, 0.1% SDS at 55 ° C. for 15 minutes. 5; (Preparation of antibody labeling) At room temperature, antibody wash buffer (2
(ml / cm ² ) for 1 minute. B melted at 55 ° C
locking buffer (0.5 ml / cm ² )
For 60 minutes. At room temperature antibody was
Wash with h buffer (2 ml / cm ² ) for 1 minute. 6; (HRP labeling) 0.05 g of BSA was added to antibody wash b
Dissolve in 10 ml of buffer. 1/1000 H
Add RP antibody. 0.25 ml / cm
React at 60 for ² minutes at room temperature. 0.1% v / v Tw
een 20 in antibody washbu
Wash twice for 10 minutes with FFer. 0.1% v / v T
ween 20 in antibody washb
Wash twice for 5 minutes. 7; (Detection) 0.125 with detection reagents 1 and 2 (Amersham Japan)
Mix in equal volumes to give a volume of ml / cm ² and apply to the membrane. Let stand for 1 minute, remove excess reagent, and insert into film cassette. Detect by exposing for about 5 minutes.

【００３３】（Ｇ）結果 ハイブリダイゼーションの結果を図７、図８に示す。す
なわち、発光しているメンブレンに５分間感光させた結
果である。左に各メンブレン毎の菌種名を示し（クレブ
シエラ属菌以外の菌種も示した）、プローブは、メンブ
レンの左からそれぞれ、コントロールプローブ、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ，
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（異なる菌株由来のもの）、
Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ特異的プローブである。これらの結
果よりコントロールは全菌種とハイブリダイゼーション
しているためＤＮＡは増幅していることが言える。Ｅ．
ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｌｏａｃａｅはそれぞれ検出されてい
る。また、シュードモナス、バチルスでは検出されなか
った。(G) Results The results of hybridization are shown in FIGS. That is, it is the result of exposing the membrane that is emitting light for 5 minutes. The bacterial species name for each membrane is shown on the left side (the bacterial species other than Klebsiella spp. Are also shown), and the probes are control probe, E. c
oli, Salmonella, K .; oxytoca,
K. pneumoniae (from different strains),
E. It is a cloacae-specific probe. From these results, it can be said that the control is hybridized with all bacterial species and therefore the DNA is amplified. E.
coli, E. cloacae is detected respectively. It was not detected in Pseudomonas or Bacillus.

【００３４】上記した結果から明らかなように、本方法
によれば、クレブシエラ属菌がきわめて短時日のうちに
正確に検出することができる。しかも本方法によれば、
例えばＰＣＲを１回だけ行うと１０²ＣＦＵの菌が検出
され、更にＰＣＲを２回行ってハイブリダイゼーション
をすることにより１０の０乗のオーダーの菌数でも検出
でき、したがってＰＣＲをくり返すことによって検出精
度を更に向上させることができる。As is clear from the above results, according to this method, Klebsiella can be accurately detected within a very short time. Moreover, according to this method,
For example, if PCR is carried out only once, 10 ² CFU of bacteria can be detected, and further hybridization can be carried out by performing PCR twice to detect bacteria of the order of 10 0, and therefore by repeating PCR, The detection accuracy can be further improved.

【００３５】したがって、本方法によれば各種の検体、
サンプル中のクレブシエラ属菌を自由に検出することが
可能となるが、例えば食品中での検出は図９のようにし
て行えばよく、約８時間というきわめて短い時間で菌の
同定ができることから、本方法は食品中の菌の迅速同定
にもきわめて有効である。Therefore, according to the present method, various samples,
It is possible to freely detect Klebsiella spp. In the sample. For example, detection in food may be carried out as shown in FIG. 9, and since the bacteria can be identified in an extremely short time of about 8 hours, This method is also very effective for rapid identification of fungi in foods.

【００３６】[0036]

【発明の効果】本発明に係る配列は、従来未知の新規物
質であって、クレブシエラ属菌種に対して特異的に分子
結合するものであり他の菌種とは結合しないという特徴
を有するものである。また、この合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いることで、食品その他臨床検体からの
菌種検出にハイブリダイゼーション法と共に利用でき、
すぐれた検出試薬も提供することができる。EFFECTS OF THE INVENTION The sequence according to the present invention is a novel substance which has not been heretofore known, and has a characteristic that it specifically binds to Klebsiella species and does not bind to other species. Is. Further, by using this synthetic oligonucleotide probe, it can be used together with the hybridization method for detecting bacterial species from foods and other clinical specimens,
Excellent detection reagents can also be provided.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】１６Ｓ ｒＲＮＡの２次構造を示す。FIG. 1 shows the secondary structure of 16S rRNA.

【図２】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子からのＰＣＲ法の概要
を示す。FIG. 2 shows an outline of a PCR method using 16S rRNA gene.

【図３】オリゴヌクレオチドプローブ及びコントロール
プローブの位置とＤＮＡ配列を示す。FIG. 3 shows the positions and DNA sequences of oligonucleotide probes and control probes.

【図４】オリゴヌクレオチドプローブのＴ−ｔａｉｌｉ
ｎｇ及びナイロンメンブレンへの固定化を示す。FIG. 4: T-tail of the oligonucleotide probe
ng and immobilization on nylon membrane.

【図５】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｖａｒｉａｂｌｅ
ｒｅｇｉｏｎの増幅と標識を示す。FIG. 5: Variable of 16S rRNA gene
Amplification of region and labeling are shown.

【図６】リバースドットブロットハイブリダイゼーショ
ンを示す。FIG. 6 shows reverse dot blot hybridization.

【図７】ハイブリダイゼーションの結果を示す。FIG. 7 shows the results of hybridization.

【図８】同じくハイブリダイゼーションの結果（続き）
を示す。FIG. 8: Results of hybridization (continued)
Indicates.

【図９】食品サンプルからの菌の検出システムを示す。FIG. 9 shows a detection system for bacteria from food samples.

フロントページの続き (72)発明者 壇原 宏文 神奈川県横浜市港北区篠原西町30−40 (72)発明者 阿部 章夫 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法 人 北里研究所内 (72)発明者 川原 一芳 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法 人 北里研究所内 (72)発明者 松井 英則 東京都港区白金五丁目９番１号 社団法 人 北里研究所内 (56)参考文献 国際公開88／00618（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)Front page continued (72) Inventor Hirofumi Danbara 30-40 Shinohara Nishimachi, Kohoku Ward, Yokohama City, Kanagawa Prefecture (72) Inventor Akio Abe 5-9-1, Shirokane, Minato-ku, Tokyo Inside the Hojin Kitasato Institute (72) Inventor Kazuyoshi Kawahara 5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo Incorporated Hojin Kitasato Institute (72) Inventor Hidenori Matsui 5-9-1 Shirokane, Minato-ku, Tokyo Incorporated Person Kitasato Institute (56) Reference Literature International Publication 88/00618 (WO, A1) (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/09 ZNA C12Q 1/68 JSTPlus (JOIS) REGISTRY (STN)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 以下に示す４種の配列及び／又はそれに
相補的な配列の少なくともひとつからなるＤＮＡ配列を
有するオリゴヌクレオチドプローブ。 ａａｔａａｃｃｔｃａｔｃａｃａｔｔｇ ａａｔａａｃｃｔｔｇｔｃｇａｔｔｇａ ｇｇａａｇｇｃｇｇｔｇａｇｇｔｔａａ ｇｇａａｇｇｃａｔｔａａｇｇｔｔａａ1. An oligonucleotide probe having a DNA sequence comprising at least one of the following four types of sequences and / or a sequence complementary thereto. aataacctcatcacatttg aataacctttgtcgattga ggaaggcgggtgaaggttaa ggaaaggcattaaggttaa 【請求項２】 該オリゴヌクレオチドプローブがクレブ
シエラ属菌検出用プローブである請求項１に記載のプロ
ーブ。2. The probe according to claim 1, wherein the oligonucleotide probe is a probe for detecting Klebsiella sp. 【請求項３】 請求項２に記載したプローブを用いるこ
とを特徴とするクレブシエラ属菌検出試薬。3. A Klebsiella spp. Detection reagent comprising the probe according to claim 2. 【請求項４】 該クレブシエラ属菌検出試薬がリバース
ドットブロットハイブリダイゼーシヨンシステムに基づ
くものであることを特徴とする請求項３に記載の検出試
薬。4. The detection reagent according to claim 3, wherein the Klebsiella genus detection reagent is based on a reverse dot blot hybridization system.