JP3495375B2 - 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ） - Google Patents
真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ）Info
- Publication number
- JP3495375B2 JP3495375B2 JP52544497A JP52544497A JP3495375B2 JP 3495375 B2 JP3495375 B2 JP 3495375B2 JP 52544497 A JP52544497 A JP 52544497A JP 52544497 A JP52544497 A JP 52544497A JP 3495375 B2 JP3495375 B2 JP 3495375B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- expression
- nucleotides
- dna
- seq
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Control Of Indicators Other Than Cathode Ray Tubes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Error Detection And Correction (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、真核細胞内で組換えタンパク質の発現を増
大させるDNA配列エレメントに関する。
大させるDNA配列エレメントに関する。
発明の背景
組換えタンパク質を生産する発現システムの開発は、
研究用または医療用用途に供されるタンパク質源の開発
に重要である。発現システムは、大腸菌のような原核細
胞、ならびに、酵母（Saccharomyces、PichiaおよびKlu
yveromyces種）および哺乳動物細胞の両方を含む真核細
胞、の両方で開発されている。しかし、時として、哺乳
動物細胞での発現は、医療用タンパク質の製造に好まし
い。なぜなら、そのような発現システムでの翻訳後修飾
は、微生物（原核生物）発現システムで起こる翻訳後修
飾の型より、哺乳動物に見られる翻訳後修飾の型に、よ
り似ていると考えられるためである。
研究用または医療用用途に供されるタンパク質源の開発
に重要である。発現システムは、大腸菌のような原核細
胞、ならびに、酵母（Saccharomyces、PichiaおよびKlu
yveromyces種）および哺乳動物細胞の両方を含む真核細
胞、の両方で開発されている。しかし、時として、哺乳
動物細胞での発現は、医療用タンパク質の製造に好まし
い。なぜなら、そのような発現システムでの翻訳後修飾
は、微生物（原核生物）発現システムで起こる翻訳後修
飾の型より、哺乳動物に見られる翻訳後修飾の型に、よ
り似ていると考えられるためである。
真核生物遺伝子の転写は、様々なシス−およびトラン
ス−作用調節エレメントによって調節されている（Dill
onおよびGrosveld、Trends Genet.,9,134,1993）。最
も良く特徴付けられた２つのシスエレメントは、プロモ
ーターとエンハンサーである。プロモーターは、遺伝子
のコード配列の5'側すぐのDNA配列であり、トランス−
作用転写因子のための複数の結合部位を包含し、基礎的
転写装置を形成する。エンハンサーもまた、トランス−
作用転写因子のための複数の結合部位から構成される
が、コード配列の上流あるいは下流から遠くに見出され
るか、またはイントロン内に見出すこともできる。ま
た、これらのエレメントは、方向非依存性様式で作用す
ることができる。プロモーターおよびエンハンサーの活
性は、一過性の発現システム内で検出することができ、
組織特異的であるかまたは組織特異的でないエレメント
を含む；それらは、安定細胞系またはトランスジェニッ
ク動物内で研究する場合、位置の影響を受けやすい。
ス−作用調節エレメントによって調節されている（Dill
onおよびGrosveld、Trends Genet.,9,134,1993）。最
も良く特徴付けられた２つのシスエレメントは、プロモ
ーターとエンハンサーである。プロモーターは、遺伝子
のコード配列の5'側すぐのDNA配列であり、トランス−
作用転写因子のための複数の結合部位を包含し、基礎的
転写装置を形成する。エンハンサーもまた、トランス−
作用転写因子のための複数の結合部位から構成される
が、コード配列の上流あるいは下流から遠くに見出され
るか、またはイントロン内に見出すこともできる。ま
た、これらのエレメントは、方向非依存性様式で作用す
ることができる。プロモーターおよびエンハンサーの活
性は、一過性の発現システム内で検出することができ、
組織特異的であるかまたは組織特異的でないエレメント
を含む；それらは、安定細胞系またはトランスジェニッ
ク動物内で研究する場合、位置の影響を受けやすい。
シス−調節エレメントのもう一つのカテゴリーは、座
制御領域（locus control regions）（LCR）（Grosveld
F.ら、Cell,51,975,1987）、マトリックス付着領域
（matrix attachment regions）（MAR）（Phi−Vanら、
Mol.Cell Biol.,10,2302,1980）、骨格付着領域（Scaf
fold attachment regions）（SAR）（GasserおよびLaem
mli、Trends.Genet.,3,16,1987）、および絶縁エレメン
ト（insulator element）（KellumおよびSchedl、Cell,
64,941,1991）を含む、クロマチン構造を調節すると信
じられているエレメントである。これらのエレメント
は、離れていても作用できると言う点でエンハンサーと
同様であり、それらの効果は安定な形質転換細胞系また
はトランスジェニック動物内でのみ検出できると言う点
でユニークなものである。また、LCRも、それらが位置
および方向依存性であり、組織特異的様式で活性である
という点で、エンハンサーとに類似していない。さら
に、LCRおよびSAR配列は、Ａボックス、Ｔボックスおよ
びトポイソメラーゼII部位を特徴とし、それらは、エン
ハンサーまたはプロモーター配列内には典型的には認め
られない（GasserおよびLaemmli、上記;Klehr,D.ら、Bi
ochemistry,30,1264,1991）。
制御領域（locus control regions）（LCR）（Grosveld
F.ら、Cell,51,975,1987）、マトリックス付着領域
（matrix attachment regions）（MAR）（Phi−Vanら、
Mol.Cell Biol.,10,2302,1980）、骨格付着領域（Scaf
fold attachment regions）（SAR）（GasserおよびLaem
mli、Trends.Genet.,3,16,1987）、および絶縁エレメン
ト（insulator element）（KellumおよびSchedl、Cell,
64,941,1991）を含む、クロマチン構造を調節すると信
じられているエレメントである。これらのエレメント
は、離れていても作用できると言う点でエンハンサーと
同様であり、それらの効果は安定な形質転換細胞系また
はトランスジェニック動物内でのみ検出できると言う点
でユニークなものである。また、LCRも、それらが位置
および方向依存性であり、組織特異的様式で活性である
という点で、エンハンサーとに類似していない。さら
に、LCRおよびSAR配列は、Ａボックス、Ｔボックスおよ
びトポイソメラーゼII部位を特徴とし、それらは、エン
ハンサーまたはプロモーター配列内には典型的には認め
られない（GasserおよびLaemmli、上記;Klehr,D.ら、Bi
ochemistry,30,1264,1991）。
内在性リボソームエントリー部位（internal ribosom
e entry sites）は、いくつかのウイルスおよび細胞内R
NA内に認めることのできるもう一つの型の調節エレメン
トである（McBratneyら、Current Opinion in Cell
Biology.5.961、1993に概説）。IRESは、バイシスト
ロニック（bicistronic）真核生物発現カセット中の第
二の遺伝子生成物の翻訳を強化するために有用である
（Kaufman,R.J.ら、Nucleic Acids Res.,19,4485,199
1）。
e entry sites）は、いくつかのウイルスおよび細胞内R
NA内に認めることのできるもう一つの型の調節エレメン
トである（McBratneyら、Current Opinion in Cell
Biology.5.961、1993に概説）。IRESは、バイシスト
ロニック（bicistronic）真核生物発現カセット中の第
二の遺伝子生成物の翻訳を強化するために有用である
（Kaufman,R.J.ら、Nucleic Acids Res.,19,4485,199
1）。
哺乳動物宿主内で発現させるためのいくつかのベクタ
ーであって、そのそれぞれが、最少の時間枠内に組換え
タンパク質を高レベルにするための、シス−およびある
場合にはトランス−の調節エレメントを様々な組み合わ
せで含む、ベクターは入手可能である。しかしながら、
そのようなベクターは数多く入手可能であるにもかかわ
らず、哺乳動物システム内で達成される組換えタンパク
質の発現レベルが、微生物発現システムで得られるそれ
より低いこともしばしばある。さらに、望ましいタンパ
ク質を高レベルで発現する形質転換された細胞系の開発
は、時間を浪費するクローニングおよび増幅を時として
必要とすることもある。従って、哺乳動物細胞内での発
現を改善し改良するための、および組み換えタンパク質
の発現を増大させ、組換えタンパク質生産への哺乳動物
細胞の使用を容易にするエレメントを同定するための、
技術が必要とされる。
ーであって、そのそれぞれが、最少の時間枠内に組換え
タンパク質を高レベルにするための、シス−およびある
場合にはトランス−の調節エレメントを様々な組み合わ
せで含む、ベクターは入手可能である。しかしながら、
そのようなベクターは数多く入手可能であるにもかかわ
らず、哺乳動物システム内で達成される組換えタンパク
質の発現レベルが、微生物発現システムで得られるそれ
より低いこともしばしばある。さらに、望ましいタンパ
ク質を高レベルで発現する形質転換された細胞系の開発
は、時間を浪費するクローニングおよび増幅を時として
必要とすることもある。従って、哺乳動物細胞内での発
現を改善し改良するための、および組み換えタンパク質
の発現を増大させ、組換えタンパク質生産への哺乳動物
細胞の使用を容易にするエレメントを同定するための、
技術が必要とされる。
発明の概要
短期間の内に哺乳動物宿主細胞内での組換えタンパク
質の高い発現を容易にする、新規の転写調節配列であ
る、発現増大配列エレメント（expression augmenting
sequence element）（EASE）を開示する。本発明の一つ
の実施態様は、短期間の内に哺乳動物宿主細胞内での組
換えタンパク質の高い発現を容易にする発現増大配列エ
レメント（EASE）であって、一過性の発現システム内で
は活性でなく、タンパク質をコードするDNAの特徴を示
さず、LCR、MARまたはSARに認められるヌクレオチド配
列特性を示さない、発現増大配列エレメントである。本
発明の望まし実施態様は、チャイニーズハムスター卵巣
（Chinese hamster ovary）（CHO）細胞のゲノムDNA
の、哺乳動物の組換えタンパク質の唯一の組込み部位の
近傍から得られるEASEである。
質の高い発現を容易にする、新規の転写調節配列であ
る、発現増大配列エレメント（expression augmenting
sequence element）（EASE）を開示する。本発明の一つ
の実施態様は、短期間の内に哺乳動物宿主細胞内での組
換えタンパク質の高い発現を容易にする発現増大配列エ
レメント（EASE）であって、一過性の発現システム内で
は活性でなく、タンパク質をコードするDNAの特徴を示
さず、LCR、MARまたはSARに認められるヌクレオチド配
列特性を示さない、発現増大配列エレメントである。本
発明の望まし実施態様は、チャイニーズハムスター卵巣
（Chinese hamster ovary）（CHO）細胞のゲノムDNA
の、哺乳動物の組換えタンパク質の唯一の組込み部位の
近傍から得られるEASEである。
本発明の最も好ましい実施態様では、EASEは、配列番
号:1のヌクレオチド１から14507、ヌクレオチド5980か
ら14507、ヌクレオチド8671から14507、ヌクレオチド86
71から10515、ヌクレオチド9277から10515、ヌクレオチ
ド8672から12273、ヌクレオチド10100から14923を含むD
NA、発現増大活性を持つ前述のDNAのフラグメント、前
述のDNAに相補性をもつDNA、発現増大活性を持つ前述の
DNAに対してヌクレオチド配列で少なくとも約80％同一
であるDNA、ならびに、発現増大活性を持つ前述のDNAの
組み合わせからなる群より選択される。一つの実施態様
は、EASE DNAを、配列番号:1のヌクレオチド14290から
14507を含むDNAと連結する；代わりの方法では、EASE
DNAを、配列番号:1のヌクレオチド12592から14507を含
むDNAと連結する。
号:1のヌクレオチド１から14507、ヌクレオチド5980か
ら14507、ヌクレオチド8671から14507、ヌクレオチド86
71から10515、ヌクレオチド9277から10515、ヌクレオチ
ド8672から12273、ヌクレオチド10100から14923を含むD
NA、発現増大活性を持つ前述のDNAのフラグメント、前
述のDNAに相補性をもつDNA、発現増大活性を持つ前述の
DNAに対してヌクレオチド配列で少なくとも約80％同一
であるDNA、ならびに、発現増大活性を持つ前述のDNAの
組み合わせからなる群より選択される。一つの実施態様
は、EASE DNAを、配列番号:1のヌクレオチド14290から
14507を含むDNAと連結する；代わりの方法では、EASE
DNAを、配列番号:1のヌクレオチド12592から14507を含
むDNAと連結する。
新規のEASEを含む発現ベクターは、組換えタンパク質
を高発現させるようにCHO細胞を形質転換することがで
きる。このように、本発明のもう一つの実施態様は、EA
SEを含む発現ベクターである。望ましい実施態様では、
発現ベクターは、さらに、興味あるタンパク質を発現さ
せる真核生物プロモーター／エンハンサーを含む。最も
好ましい実施態様では、発現ベクターは、第一のエクソ
ンが興味ある遺伝子をコードし、そして第二のエキソン
が増幅可能な優性選択可能マーカー（amplifyable domi
nant selectable marker）をコードする、バイシストロ
ニックプラスミドからなる。好ましいマーカーはジヒド
ロホレートレダクターゼ（dihydrofolate reductase）
（DHFR）であり、その他の増幅可能マーカーもまた、本
発明の発現ベクター内での使用に適当である。さらに、
発現ベクターは、二つのエキソン間にIRES配列を含む。
を高発現させるようにCHO細胞を形質転換することがで
きる。このように、本発明のもう一つの実施態様は、EA
SEを含む発現ベクターである。望ましい実施態様では、
発現ベクターは、さらに、興味あるタンパク質を発現さ
せる真核生物プロモーター／エンハンサーを含む。最も
好ましい実施態様では、発現ベクターは、第一のエクソ
ンが興味ある遺伝子をコードし、そして第二のエキソン
が増幅可能な優性選択可能マーカー（amplifyable domi
nant selectable marker）をコードする、バイシストロ
ニックプラスミドからなる。好ましいマーカーはジヒド
ロホレートレダクターゼ（dihydrofolate reductase）
（DHFR）であり、その他の増幅可能マーカーもまた、本
発明の発現ベクター内での使用に適当である。さらに、
発現ベクターは、二つのエキソン間にIRES配列を含む。
哺乳動物宿主細胞は、本発明の発現ベクターで形質転
換することができ、短期間内に高レベルの組換えタンパ
ク質を生産するであろう。従って、本発明のもう一つの
実施態様では、本発明の発現ベクターで形質転換した哺
乳動物宿主細胞が提供される。最も好ましい実施態様で
は、宿主細胞はCHO細胞である。
換することができ、短期間内に高レベルの組換えタンパ
ク質を生産するであろう。従って、本発明のもう一つの
実施態様では、本発明の発現ベクターで形質転換した哺
乳動物宿主細胞が提供される。最も好ましい実施態様で
は、宿主細胞はCHO細胞である。
また、本発明は、組換えタンパク質を得るための方法
であって、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現を促進
する条件下で培養し、そしてタンパク質を回収すること
を含む、前記の方法を提供する。本発明の好ましい適用
では、形質転換された宿主細胞系は、二段階の選択段
階；優性増幅可能マーカーを発現する細胞を選択するた
めの第一の選択段階、および、マーカー遺伝子ならびに
興味ある遺伝子の高レベル発現および／または増幅のた
めの第二段階；で選択される。最も好ましい実施態様で
は、選択または増幅剤は、メトトレキセート、内因性DH
FR遺伝子およびトランスフェクトされたDHFR配列の増幅
を生じることが示されたDHFRのインヒビターである。
であって、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換
し、形質転換された宿主細胞をタンパク質の発現を促進
する条件下で培養し、そしてタンパク質を回収すること
を含む、前記の方法を提供する。本発明の好ましい適用
では、形質転換された宿主細胞系は、二段階の選択段
階；優性増幅可能マーカーを発現する細胞を選択するた
めの第一の選択段階、および、マーカー遺伝子ならびに
興味ある遺伝子の高レベル発現および／または増幅のた
めの第二段階；で選択される。最も好ましい実施態様で
は、選択または増幅剤は、メトトレキセート、内因性DH
FR遺伝子およびトランスフェクトされたDHFR配列の増幅
を生じることが示されたDHFRのインヒビターである。
さらに、本発明は、さらなる発現増大配列エレメント
を、例えば他の形質転換細胞系から同定する方法も提供
する。そのような細胞系は、遺伝子の高コピー数に依存
しない高レベルの発現を示すであろう。本発明の技術
は、そのようなEASE、ならびに、非形質転換細胞内に存
在するEASEの同定および単離（例えば、ハイブリダイゼ
ーション研究または配列分析によって）に有用であろ
う。
を、例えば他の形質転換細胞系から同定する方法も提供
する。そのような細胞系は、遺伝子の高コピー数に依存
しない高レベルの発現を示すであろう。本発明の技術
は、そのようなEASE、ならびに、非形質転換細胞内に存
在するEASEの同定および単離（例えば、ハイブリダイゼ
ーション研究または配列分析によって）に有用であろ
う。
図面の簡単な説明
図１は、2A5−３ CHOゲノムDNAから誘導された様々
な長さの挿入物を示す。図1Aは、実施例１に記載した、
クローニングベクターλFix II内にクローン化されたTN
FrFc組込み部位の制限地図である；サブクローニングに
用いられた制限部位も示している。挿入物は、配列番
号:1のヌクレオチド１から14507に相当する。図1Bは、
図1Aに示したファージクローンから実施例７に記載した
ように誘導され、pGEM1内にクローン化された挿入物に
ついて示している。太い黒線はCMVプロモーターであ
り、ドット打ちした箱はアデノウイルスの３文節系リー
ダー配列であり、左向きのハッチングを引いた箱はTNFr
Fcコード領域であり、そしてより間隔の狭いハッチング
を引いた箱はDHFR−コード配列である。配列番号:1に対
応させると、PG8.5中の挿入物はヌクレオチド5980から1
4507に相当し、PG5.7中の挿入物はヌクレオチド8671か
ら14507に相当し、PG5.7ΔＳ中の挿入物は、ヌクレオチ
ド12592から14507に連結させたヌクレオチド8671から10
515に相当し、PG.2SE1.8中の挿入物はヌクレオチド1429
0から14507に連結させたヌクレオチド8671から10515に
相当し、PG.2SH1.2中の挿入物はヌクレオチド14291から
14507に連結させたヌクレオチド9277から10515に相当
し、PG.2.2中の挿入物はヌクレオチド12269から14507に
相当し、そしてPG.2中の挿入物はヌクレオチド14290か
ら14507に相当する。
な長さの挿入物を示す。図1Aは、実施例１に記載した、
クローニングベクターλFix II内にクローン化されたTN
FrFc組込み部位の制限地図である；サブクローニングに
用いられた制限部位も示している。挿入物は、配列番
号:1のヌクレオチド１から14507に相当する。図1Bは、
図1Aに示したファージクローンから実施例７に記載した
ように誘導され、pGEM1内にクローン化された挿入物に
ついて示している。太い黒線はCMVプロモーターであ
り、ドット打ちした箱はアデノウイルスの３文節系リー
ダー配列であり、左向きのハッチングを引いた箱はTNFr
Fcコード領域であり、そしてより間隔の狭いハッチング
を引いた箱はDHFR−コード配列である。配列番号:1に対
応させると、PG8.5中の挿入物はヌクレオチド5980から1
4507に相当し、PG5.7中の挿入物はヌクレオチド8671か
ら14507に相当し、PG5.7ΔＳ中の挿入物は、ヌクレオチ
ド12592から14507に連結させたヌクレオチド8671から10
515に相当し、PG.2SE1.8中の挿入物はヌクレオチド1429
0から14507に連結させたヌクレオチド8671から10515に
相当し、PG.2SH1.2中の挿入物はヌクレオチド14291から
14507に連結させたヌクレオチド9277から10515に相当
し、PG.2.2中の挿入物はヌクレオチド12269から14507に
相当し、そしてPG.2中の挿入物はヌクレオチド14290か
ら14507に相当する。
発明の詳細な説明
発現ベクター内に挿入した場合に、安定な細胞プール
内でレポータータンパク質の発現を２から８倍に改良す
ることのできる新規の配列エレメントを単離同定した。
そのような配列エレメントの一つは、組換え二量体であ
る腫瘍壊死因子レセプター／イムノグロブリンFc融合タ
ンパク質（Tumor Necrosis Factor receptor/immunoglo
burin Fc fusion protein）（TNFrFc）をコードする唯
一の発現カセットの組み込み部位を、このタンパク質を
高レベルで発現する細胞系のゲノムDNAからクローニン
グすることによって、同定された。本発明の配列エレメ
ントは、以前から特徴付けられているプロモーター、エ
ンハンサー、座調節領域、骨格付着領域またはマトリッ
クス付着領域のようなシス−作用エレメントとは、その
発現増強活性の動向が類似していないため、新規の機能
をコードすると考えられる。さらに、この配列エレメン
トはいかなるオープンリーディングフレーム（open rea
ding frame）（ORF）も含まず、それらが新規のトラン
ス−活性化タンパク質をコードするとは考えられない。
我々は、これらの新規の配列エレメントを「発現増大配
列エレメント」（EASE）と名付ける。
内でレポータータンパク質の発現を２から８倍に改良す
ることのできる新規の配列エレメントを単離同定した。
そのような配列エレメントの一つは、組換え二量体であ
る腫瘍壊死因子レセプター／イムノグロブリンFc融合タ
ンパク質（Tumor Necrosis Factor receptor/immunoglo
burin Fc fusion protein）（TNFrFc）をコードする唯
一の発現カセットの組み込み部位を、このタンパク質を
高レベルで発現する細胞系のゲノムDNAからクローニン
グすることによって、同定された。本発明の配列エレメ
ントは、以前から特徴付けられているプロモーター、エ
ンハンサー、座調節領域、骨格付着領域またはマトリッ
クス付着領域のようなシス−作用エレメントとは、その
発現増強活性の動向が類似していないため、新規の機能
をコードすると考えられる。さらに、この配列エレメン
トはいかなるオープンリーディングフレーム（open rea
ding frame）（ORF）も含まず、それらが新規のトラン
ス−活性化タンパク質をコードするとは考えられない。
我々は、これらの新規の配列エレメントを「発現増大配
列エレメント」（EASE）と名付ける。
EASEの物理的機能的特徴
EASE活性は、このタンパク質を高レベルで発現する細
胞系のゲノムから、CHOゲノムDNAのTNFrFcコード配列の
唯一の組込み部位の5'側の14.5kb内に同定された。（2A
5−３と名付けられた）。この単離された14.5kb領域お
よびそのより短いフラグメントを含む発現ベクターは、
DXB11 CHO細胞を、組換えタンパク質の発現を頻度＞50
％の高レベルに形質転換することができた。マッピング
の研究から、＞50％の活性は、1.8kbのDNA領域内（配列
番号:1のヌクレオチド8671からヌクレオチド10515ま
で）に位置することが分かった。さらに、配列番号:1の
ヌクレオチド8671からヌクレオチド9276の配列（EcoR1
からHpa1までの604bpフラグメント）は、もしこの領域
がベクター内に存在しない場合には発現増強が著しく減
少すると言う理由から、活性に必須であると考えられ
る。本発明のEASEは、それを連結させるプロモーター／
エンハンサー領域によって操縦（drive）される組換え
タンパク質の発現を改良することができる。
胞系のゲノムから、CHOゲノムDNAのTNFrFcコード配列の
唯一の組込み部位の5'側の14.5kb内に同定された。（2A
5−３と名付けられた）。この単離された14.5kb領域お
よびそのより短いフラグメントを含む発現ベクターは、
DXB11 CHO細胞を、組換えタンパク質の発現を頻度＞50
％の高レベルに形質転換することができた。マッピング
の研究から、＞50％の活性は、1.8kbのDNA領域内（配列
番号:1のヌクレオチド8671からヌクレオチド10515ま
で）に位置することが分かった。さらに、配列番号:1の
ヌクレオチド8671からヌクレオチド9276の配列（EcoR1
からHpa1までの604bpフラグメント）は、もしこの領域
がベクター内に存在しない場合には発現増強が著しく減
少すると言う理由から、活性に必須であると考えられ
る。本発明のEASEは、それを連結させるプロモーター／
エンハンサー領域によって操縦（drive）される組換え
タンパク質の発現を改良することができる。
さらに、本明細書中に記載の方法に従って、EASE活性
を示す14.5kbのCHOゲノムDNAのさらなるフラグメントを
同定することもでき、あるいはその他の細胞系または形
質転換された細胞内のその他の組込み部位から類似のEA
SEモチーフを同定することもできる。さらに、この技術
分野では、制限酵素消化によって調製されたDNAフラグ
メントをさらに処理することによって、フラグメント末
端からいくつかのヌクレオチドをさらに除去できること
も知られている。したがって、本明細書中に記載された
および請求の範囲に記載されたDNAフラグメントは、列
挙したヌクレオチドの５塩基対内で終わるフラグメント
をも含む。
を示す14.5kbのCHOゲノムDNAのさらなるフラグメントを
同定することもでき、あるいはその他の細胞系または形
質転換された細胞内のその他の組込み部位から類似のEA
SEモチーフを同定することもできる。さらに、この技術
分野では、制限酵素消化によって調製されたDNAフラグ
メントをさらに処理することによって、フラグメント末
端からいくつかのヌクレオチドをさらに除去できること
も知られている。したがって、本明細書中に記載された
および請求の範囲に記載されたDNAフラグメントは、列
挙したヌクレオチドの５塩基対内で終わるフラグメント
をも含む。
本明細書中に記載のフラグメントのその他の組み合わ
せ（例えば、本明細書中に開示されたEASEの複数のコピ
ーを含む配列、または開示されたEASEをその他のヌクレ
オチド配列と組み合わせることによって誘導された配
列）を開発し、調節エレメントの最適な組み合わせを達
成することができる。このような組み合わせを隣接して
連結または配置すると、（即ち、エレメント間に「スペ
ーサー」ヌクレオチドを導入することによって）EASEフ
ラグメントに最適な間隔を提供することができる。ま
た、調節エレメントを配置することで、他の調節領域か
らの最適な間隔をEASEに提供することができる。同様
に、ベクター内のEASEの方向を最適化すると、高レベル
のタンパク質発現を提供することができる。
せ（例えば、本明細書中に開示されたEASEの複数のコピ
ーを含む配列、または開示されたEASEをその他のヌクレ
オチド配列と組み合わせることによって誘導された配
列）を開発し、調節エレメントの最適な組み合わせを達
成することができる。このような組み合わせを隣接して
連結または配置すると、（即ち、エレメント間に「スペ
ーサー」ヌクレオチドを導入することによって）EASEフ
ラグメントに最適な間隔を提供することができる。ま
た、調節エレメントを配置することで、他の調節領域か
らの最適な間隔をEASEに提供することができる。同様
に、ベクター内のEASEの方向を最適化すると、高レベル
のタンパク質発現を提供することができる。
本明細書中に記載のEASEは、チャイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞から単離された。相同の発現増大エレ
メントが、他の哺乳動物種からの細胞内、ならびにその
他の組織型から誘導された細胞系内にも存在すると予想
され、この技術分野で周知の技術、例えば、種間ハイブ
リダイゼーションまたはPCRに基づいた技術によって単
離することができる。さらに、この技術分野で周知の部
位特異的またはランダム突然変異誘発技術によって、配
列番号:1に示したヌクレオチド配列に変更を加えること
もできる。次いで、そうして得られたEASE変異体を、本
明細書中に記載の方法に従って、EASE活性について試験
することができる。配列番号:1のヌクレオチド配列また
はEASE活性を持つそのフラグメントと少なくとも約80％
同一、より好ましくは少なくとも約90％同一であるDNA
は、日常的に行われている実験によって単離可能であ
り、EASE活性を持つと予想される。EASEのフラグメント
について、同一性の％とは、EASEフラグメント内に認め
られる天然配列と関連する部分の％をさす。従って、EA
SEの同族体およびEASEの変異体もまた、本発明に包含さ
れる。
卵巣（CHO）細胞から単離された。相同の発現増大エレ
メントが、他の哺乳動物種からの細胞内、ならびにその
他の組織型から誘導された細胞系内にも存在すると予想
され、この技術分野で周知の技術、例えば、種間ハイブ
リダイゼーションまたはPCRに基づいた技術によって単
離することができる。さらに、この技術分野で周知の部
位特異的またはランダム突然変異誘発技術によって、配
列番号:1に示したヌクレオチド配列に変更を加えること
もできる。次いで、そうして得られたEASE変異体を、本
明細書中に記載の方法に従って、EASE活性について試験
することができる。配列番号:1のヌクレオチド配列また
はEASE活性を持つそのフラグメントと少なくとも約80％
同一、より好ましくは少なくとも約90％同一であるDNA
は、日常的に行われている実験によって単離可能であ
り、EASE活性を持つと予想される。EASEのフラグメント
について、同一性の％とは、EASEフラグメント内に認め
られる天然配列と関連する部分の％をさす。従って、EA
SEの同族体およびEASEの変異体もまた、本発明に包含さ
れる。
組換えタンパク質の発現は、適当な真核生物のプロモ
ーター／エンハンサーおよび本発明のEASEによって操縦
される。例えば、選択培地中にメトトレキセート（MT
X）、DHFRインヒビターを用いることによって、優性の
選択可能マーカーについて低いストリンジェンシーの下
で選択されたプラスミドを、細胞にトランスフェクト
し、次いで、より高いストリンジェンシーで再度選択す
る。最初の選択で、陽性の形質転換株（即ち、メトトレ
キセート選択の場合にはDHFR+形質転換株）が得られ、
そして、第二の選択で、興味ある遺伝子を高レベルで発
現する形質転換株が得られる。
ーター／エンハンサーおよび本発明のEASEによって操縦
される。例えば、選択培地中にメトトレキセート（MT
X）、DHFRインヒビターを用いることによって、優性の
選択可能マーカーについて低いストリンジェンシーの下
で選択されたプラスミドを、細胞にトランスフェクト
し、次いで、より高いストリンジェンシーで再度選択す
る。最初の選択で、陽性の形質転換株（即ち、メトトレ
キセート選択の場合にはDHFR+形質転換株）が得られ、
そして、第二の選択で、興味ある遺伝子を高レベルで発
現する形質転換株が得られる。
EASEを含むベクター内にIRES配列を挿入することは、
いくつかのタンパク質の発現を強化するために有益であ
ろう。IRES配列は、高選択圧下での興味ある遺伝子の発
現を安定化すると考えられる（Kaufmanら、1991、上
記）。細胞によって十分にプロセスされるタンパク質に
ついては、高発現レベルを達成するために、IRES配列は
必要ではない。
いくつかのタンパク質の発現を強化するために有益であ
ろう。IRES配列は、高選択圧下での興味ある遺伝子の発
現を安定化すると考えられる（Kaufmanら、1991、上
記）。細胞によって十分にプロセスされるタンパク質に
ついては、高発現レベルを達成するために、IRES配列は
必要ではない。
組換えタンパク質を高レベルで発現する細胞集団は、
本明細書中に記載の二段階の選択プロトコールを用い
て、５から７週間で開発することができる。高発現の絶
対的レベルは、具体的なタンパク質に応じて変化し、細
胞によってタンパク質がどれだけ充分にプロセスされる
かに依存する。我々は、様々なサイトカインおよびサイ
トカインレセプターを用いて、少なくとも約0.2μg/106
細胞／日で、多くの場合には、約12μg/106細胞／日で
発現する安定な細胞のプールを得た。このレベルのタン
パク質発現を達成するために必要な時間は、EASEを含ま
ないベクターを用いて行った同様の形質転換株で認めら
れる時間のほぼ半分である。さらに、EASEで開発された
細胞のプールは、期間中ずっと安定であり、ほとんどす
べての目的のための細胞系として扱うことができる。通
例の組換えタンパク質に比べると、開発プロセスのより
後期まで、クローニングの段階を遅らせることもでき
る。さらなるクローニング段階を踏むことによって、約
24μg/106/日より大きく発現する細胞系を開発すること
も可能である。
本明細書中に記載の二段階の選択プロトコールを用い
て、５から７週間で開発することができる。高発現の絶
対的レベルは、具体的なタンパク質に応じて変化し、細
胞によってタンパク質がどれだけ充分にプロセスされる
かに依存する。我々は、様々なサイトカインおよびサイ
トカインレセプターを用いて、少なくとも約0.2μg/106
細胞／日で、多くの場合には、約12μg/106細胞／日で
発現する安定な細胞のプールを得た。このレベルのタン
パク質発現を達成するために必要な時間は、EASEを含ま
ないベクターを用いて行った同様の形質転換株で認めら
れる時間のほぼ半分である。さらに、EASEで開発された
細胞のプールは、期間中ずっと安定であり、ほとんどす
べての目的のための細胞系として扱うことができる。通
例の組換えタンパク質に比べると、開発プロセスのより
後期まで、クローニングの段階を遅らせることもでき
る。さらなるクローニング段階を踏むことによって、約
24μg/106/日より大きく発現する細胞系を開発すること
も可能である。
トランスフェクション実験から、これらのDNA配列内
に認められるEASEは、従来報告されているシス−作用エ
レメントのある種の特徴を有しているが、従来の報告の
定義内に入るものではないことが判明した。LCR、MARお
よびSAR配列と同様に、EASE活性は、一過性のアッセイ
では検出されない。しかしながら、これらの配列とは異
なり、EASEは、これらのエレメント内で典型的に認めら
れるＡボックス、Ｔボックスまたはトポイソメラーゼ２
部位（Klehrら、上記）を持たない。一過性のアッセイ
ではEASE活性が検出されないので、それらはまた、これ
らの方法で検出されるプロモーターおよびエンハンサー
エレメントとも異なると考えられる。
に認められるEASEは、従来報告されているシス−作用エ
レメントのある種の特徴を有しているが、従来の報告の
定義内に入るものではないことが判明した。LCR、MARお
よびSAR配列と同様に、EASE活性は、一過性のアッセイ
では検出されない。しかしながら、これらの配列とは異
なり、EASEは、これらのエレメント内で典型的に認めら
れるＡボックス、Ｔボックスまたはトポイソメラーゼ２
部位（Klehrら、上記）を持たない。一過性のアッセイ
ではEASE活性が検出されないので、それらはまた、これ
らの方法で検出されるプロモーターおよびエンハンサー
エレメントとも異なると考えられる。
組換えタンパク質の発現
組換え発現ベクターは、哺乳動物、ウイルスまたは昆
虫の遺伝子より誘導された適当な転写または翻訳調節エ
レメントに機能可能なように連結された、タンパク質を
コードする合成またはcDNA−誘導のDNAフラグメントを
含む。そのような調節エレメントは、転写プロモータ
ー、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、
ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む
（詳細を以下に記載する）。また、哺乳動物発現ベクタ
ーは、発現される遺伝子に連結された複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーのような非転写エレ
メント、その他の転写されない5'または3'フランキング
配列、必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位のような
翻訳されない5'または3'配列、ならびに転写終止配列を
含み得る。また、宿主内で複製する能力を授ける複製開
始点および形質転換株の認識を容易にする選択可能遺伝
子を取り入れることもできる。
虫の遺伝子より誘導された適当な転写または翻訳調節エ
レメントに機能可能なように連結された、タンパク質を
コードする合成またはcDNA−誘導のDNAフラグメントを
含む。そのような調節エレメントは、転写プロモータ
ー、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、
ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む
（詳細を以下に記載する）。また、哺乳動物発現ベクタ
ーは、発現される遺伝子に連結された複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサーのような非転写エレ
メント、その他の転写されない5'または3'フランキング
配列、必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位のような
翻訳されない5'または3'配列、ならびに転写終止配列を
含み得る。また、宿主内で複製する能力を授ける複製開
始点および形質転換株の認識を容易にする選択可能遺伝
子を取り入れることもできる。
DNA領域は、それらが互いに機能的に関連する場合に
は、機能できるように連結される。例えば、もしポリペ
プチドがその分泌に関与する前駆体として発現される場
合には、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAをポ
リペプチドのDNAに機能できるように連結する；プロモ
ーターが配列の転写を調節する場合には、プロモーター
をコード配列に機能できるように連結する；または、翻
訳を可能にするようにリボソーム結合部位を配置する場
合には、それをコード配列に機能するように連結する。
一般的には、「機能できるように連結された」とは、隣
接を意味し、分泌リーダーの場合には隣接しおよび読み
枠内であることを意味する。
は、機能できるように連結される。例えば、もしポリペ
プチドがその分泌に関与する前駆体として発現される場
合には、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAをポ
リペプチドのDNAに機能できるように連結する；プロモ
ーターが配列の転写を調節する場合には、プロモーター
をコード配列に機能できるように連結する；または、翻
訳を可能にするようにリボソーム結合部位を配置する場
合には、それをコード配列に機能するように連結する。
一般的には、「機能できるように連結された」とは、隣
接を意味し、分泌リーダーの場合には隣接しおよび読み
枠内であることを意味する。
脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター内
の転写および翻訳調節配列は、ウイルス起源から提供で
きる。例えば、共通に用いられるプロモーターおよびエ
ンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サルの
ウイルス40（SV40）およびヒトのサイトメガロウイルス
から誘導される。ウイルスゲノムプロモーター、調節お
よび／またはシグナル配列は、そのような調節配列が選
ばれた宿主細胞と適合するならば、発現を操縦するため
に利用することができる。模範的ベクターは、Okayama
およびBerg（Mol.Cell Biol.,3,280,1983）に開示の方
法に従って、構築することができる。組換えタンパク質
を発現させる細胞型によっては、非ウイルス細胞プロモ
ーター（即ち、β−グロビンおよびEF−１αプロモータ
ー）もまた、用いることができる。
の転写および翻訳調節配列は、ウイルス起源から提供で
きる。例えば、共通に用いられるプロモーターおよびエ
ンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サルの
ウイルス40（SV40）およびヒトのサイトメガロウイルス
から誘導される。ウイルスゲノムプロモーター、調節お
よび／またはシグナル配列は、そのような調節配列が選
ばれた宿主細胞と適合するならば、発現を操縦するため
に利用することができる。模範的ベクターは、Okayama
およびBerg（Mol.Cell Biol.,3,280,1983）に開示の方
法に従って、構築することができる。組換えタンパク質
を発現させる細胞型によっては、非ウイルス細胞プロモ
ーター（即ち、β−グロビンおよびEF−１αプロモータ
ー）もまた、用いることができる。
異種DNA配列の発現に必要なその他の遺伝子エレメン
トを提供するために、SV40ウイルスゲノムより誘導され
たDNA配列（例えば、SV40開始点、早期および後期プロ
モーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデ
ニル化部位）を用いることができる。早期および後期プ
ロモーターは、両方ともSV40ウイルス複製開始点をも含
むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるた
め、特に有用である（Fierら、Nature,273,113,197
8）。ウイルスの複製開始点内に位置するHind III部位
からBg1 I部位方向に伸びるおよそ250bpの配列を含む限
りにおいて、より小さいまたはより大きいSV40フラグメ
ントを用いることもできる。
トを提供するために、SV40ウイルスゲノムより誘導され
たDNA配列（例えば、SV40開始点、早期および後期プロ
モーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデ
ニル化部位）を用いることができる。早期および後期プ
ロモーターは、両方ともSV40ウイルス複製開始点をも含
むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるた
め、特に有用である（Fierら、Nature,273,113,197
8）。ウイルスの複製開始点内に位置するHind III部位
からBg1 I部位方向に伸びるおよそ250bpの配列を含む限
りにおいて、より小さいまたはより大きいSV40フラグメ
ントを用いることもできる。
複数の転写物を発現させるために用いられるバイシス
トロニックな発現ベクターについては、すでに記載され
ている（Kim,S.K.およびWold,B.J.,Cell,42,129,1985;K
aufmanら、1991、上記）。pCAVDHFRは、マウスのDHFRの
コード配列（Subramaniら、Mol.Cell Biol.,1,854,198
1）を含むpCD302（Mosleyら、Cell、1989）の誘導体で
ある。pCDEベクターは、アデノウイルスの３文節系リー
ダー配列とDHFR cDNAコード配列との間にクローン化さ
れたマウスの脳心筋炎ウイルスの内在性リボソームエン
トリー部位（ヌクレオチド260から824;JangおよびWimme
r,Genes and Dev.,4,1560,1990）を含むpCAVDHFRの誘
導体である。例えば、米国特許第4,634,665号（Axel
ら）および第4,656,134号（Ringoldら）に記載されてい
るようなその他の型の発現ベクターもまた、本発明のEA
SEと組み合わせると有用である。
トロニックな発現ベクターについては、すでに記載され
ている（Kim,S.K.およびWold,B.J.,Cell,42,129,1985;K
aufmanら、1991、上記）。pCAVDHFRは、マウスのDHFRの
コード配列（Subramaniら、Mol.Cell Biol.,1,854,198
1）を含むpCD302（Mosleyら、Cell、1989）の誘導体で
ある。pCDEベクターは、アデノウイルスの３文節系リー
ダー配列とDHFR cDNAコード配列との間にクローン化さ
れたマウスの脳心筋炎ウイルスの内在性リボソームエン
トリー部位（ヌクレオチド260から824;JangおよびWimme
r,Genes and Dev.,4,1560,1990）を含むpCAVDHFRの誘
導体である。例えば、米国特許第4,634,665号（Axel
ら）および第4,656,134号（Ringoldら）に記載されてい
るようなその他の型の発現ベクターもまた、本発明のEA
SEと組み合わせると有用である。
宿主細胞
形質転換された宿主細胞とは、組換えDNA技術を用い
て構築された発現ベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた細胞であって、組換えタンパク質をコード
する配列を含む細胞である。発現したタンパク質は、選
択されたDNAによっては、培養液上清内に分泌されるの
が好ましいであろうが、細胞膜内に蓄積することもでき
る。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳
動物細胞培養システムを用いることができる。適当な哺
乳動物宿主細胞系の例としては、サルの腎臓細胞COS−
７系（Gluzman,Cell,175,1981に記載）、ならびに、例
えば、CV−1/EBNA（ATCC CRL10478）、Ｌ細胞、C127、
3T3、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）、HeLaおよ
びBHK細胞系を含む適当なベクターを発現する能力を持
つその他の細胞系が含まれる。
て構築された発現ベクターで形質転換またはトランスフ
ェクトされた細胞であって、組換えタンパク質をコード
する配列を含む細胞である。発現したタンパク質は、選
択されたDNAによっては、培養液上清内に分泌されるの
が好ましいであろうが、細胞膜内に蓄積することもでき
る。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳
動物細胞培養システムを用いることができる。適当な哺
乳動物宿主細胞系の例としては、サルの腎臓細胞COS−
７系（Gluzman,Cell,175,1981に記載）、ならびに、例
えば、CV−1/EBNA（ATCC CRL10478）、Ｌ細胞、C127、
3T3、チャイニーズハムスターの卵巣（CHO）、HeLaおよ
びBHK細胞系を含む適当なベクターを発現する能力を持
つその他の細胞系が含まれる。
共通に用いられる細胞系は、グリシン、チミジンおよ
びヒポキサンチンに対する栄養素要求性を持つDHFR- C
HO細胞であり、増幅可能な優性マーカーとしてDHFR cD
NAを用いてDHFR+表現型に形質転換することができる。
そのようなDHFR- CHO細胞系の一つであるDXB11は、Url
aubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216,19
80に記載されている。選択または増大スキームのために
開発されたその他の特定の細胞系もまた、本発明のEASE
と共に有用であろう。
びヒポキサンチンに対する栄養素要求性を持つDHFR- C
HO細胞であり、増幅可能な優性マーカーとしてDHFR cD
NAを用いてDHFR+表現型に形質転換することができる。
そのようなDHFR- CHO細胞系の一つであるDXB11は、Url
aubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216,19
80に記載されている。選択または増大スキームのために
開発されたその他の特定の細胞系もまた、本発明のEASE
と共に有用であろう。
形質転換された哺乳動物細胞の調製
この技術分野では、いくつかの形質転換のプロトコー
ルが知られており、Kaufman,R.J.,Meth.Enzymology,18
5,537,1988に論評されている。形質転換プロトコールの
選択は、宿主細胞系および興味ある遺伝子の性質に依存
するであろうし、日常的に行われる実験を基本に選択す
ることができる。任意のそのようなプロトコールに基本
的に必要とされることは、第一に適当な宿主細胞内に興
味あるタンパク質をコードするDNAを導入することであ
り、次に、安定で発現可能な様式で異種のDNAを取り入
れる宿主細胞を同定および単離することである。
ルが知られており、Kaufman,R.J.,Meth.Enzymology,18
5,537,1988に論評されている。形質転換プロトコールの
選択は、宿主細胞系および興味ある遺伝子の性質に依存
するであろうし、日常的に行われる実験を基本に選択す
ることができる。任意のそのようなプロトコールに基本
的に必要とされることは、第一に適当な宿主細胞内に興
味あるタンパク質をコードするDNAを導入することであ
り、次に、安定で発現可能な様式で異種のDNAを取り入
れる宿主細胞を同定および単離することである。
異種DNAの導入に共通して用いられる方法の一つは、
例えば、Wiglerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3567,1
980に記載されているような、リン酸カルシウム沈殿で
ある。この方法によって宿主細胞内に導入されるDNA
は、しばしば再配列を受け、その結果、この方法は、独
立した遺伝子のコトランスフェクション（cotransfecti
on）に有用である。
例えば、Wiglerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3567,1
980に記載されているような、リン酸カルシウム沈殿で
ある。この方法によって宿主細胞内に導入されるDNA
は、しばしば再配列を受け、その結果、この方法は、独
立した遺伝子のコトランスフェクション（cotransfecti
on）に有用である。
哺乳動物細胞と細菌プロトプラストのポリエチレン−
誘導融合（Schaffnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,2
163、1980）は、異種DNAを導入するためのもう一つの有
用な方法である。プロトプラスト融合プロトコールから
は、時として、哺乳動物宿主細胞ゲノム内に組込まれた
プラスミドDNAの複数コピーが得られる；しかしなが
ら、この技術は、興味ある遺伝子と同一のプラスミド上
に選択および増幅マーカーが存在することを必要とす
る。
誘導融合（Schaffnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,2
163、1980）は、異種DNAを導入するためのもう一つの有
用な方法である。プロトプラスト融合プロトコールから
は、時として、哺乳動物宿主細胞ゲノム内に組込まれた
プラスミドDNAの複数コピーが得られる；しかしなが
ら、この技術は、興味ある遺伝子と同一のプラスミド上
に選択および増幅マーカーが存在することを必要とす
る。
また、例えば、Potterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
1,7161,1988、または、ShigekawaおよびDower,BioTechn
iques,6,742,1988に記載のように、エレクトロポレーシ
ョンを用いて、DNAを宿主細胞の細胞質内に直接導入す
ることもできる。プロトプラスト融合とは異なって、エ
レクトロポレーションは選択マーカーと興味ある遺伝子
が同一のプラスミド上に存在することを要求しない。
1,7161,1988、または、ShigekawaおよびDower,BioTechn
iques,6,742,1988に記載のように、エレクトロポレーシ
ョンを用いて、DNAを宿主細胞の細胞質内に直接導入す
ることもできる。プロトプラスト融合とは異なって、エ
レクトロポレーションは選択マーカーと興味ある遺伝子
が同一のプラスミド上に存在することを要求しない。
より最近には、哺乳動物細胞内への異種DNAの導入に
有用ないくつかの試薬について、記載されている。これ
らには、リポフェクチン（LipofectinR）試薬およびリ
ポフェクタミン（lipofectamineTM）試薬（Gibco BR
L、Gaithersburg,MD）が含まれる。これらの試薬は両方
とも、培養細胞に適用する場合には、細胞内への核酸の
取り込みを容易にする、脂質−核酸複合体（またはリポ
ソーム）を形成するために用いられている試薬として市
販されている。
有用ないくつかの試薬について、記載されている。これ
らには、リポフェクチン（LipofectinR）試薬およびリ
ポフェクタミン（lipofectamineTM）試薬（Gibco BR
L、Gaithersburg,MD）が含まれる。これらの試薬は両方
とも、培養細胞に適用する場合には、細胞内への核酸の
取り込みを容易にする、脂質−核酸複合体（またはリポ
ソーム）を形成するために用いられている試薬として市
販されている。
興味ある遺伝子を増幅させる方法もまた、組換えタン
パク質の発現に望ましく、典型的には、選択マーカー
（Kaufman,R.J.、上記）の使用を含む。細胞毒性薬剤に
対する耐性は、選択マーカーとして最も頻繁に用いられ
る特性であり、優性な特質（即ち、宿主細胞系のいかん
にかかわらず用いることができる）か、または劣性の特
質（即ち、選択される活性が欠損している特別な宿主細
胞系に有用である）のいずれかの結果であることができ
る。いくつかの増幅可能マーカーが本発明の発現ベクタ
ー内での使用に適当である（例えば、Maniatis,Molecul
ar Biology:A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,NY,1989,16.9−16.14に記載されてい
る）。
パク質の発現に望ましく、典型的には、選択マーカー
（Kaufman,R.J.、上記）の使用を含む。細胞毒性薬剤に
対する耐性は、選択マーカーとして最も頻繁に用いられ
る特性であり、優性な特質（即ち、宿主細胞系のいかん
にかかわらず用いることができる）か、または劣性の特
質（即ち、選択される活性が欠損している特別な宿主細
胞系に有用である）のいずれかの結果であることができ
る。いくつかの増幅可能マーカーが本発明の発現ベクタ
ー内での使用に適当である（例えば、Maniatis,Molecul
ar Biology:A Laboratory Manual,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,NY,1989,16.9−16.14に記載されてい
る）。
薬剤耐性哺乳動物細胞内での遺伝子増幅に有用な選択
可能マーカーは、Kaufman,R.J.（上記）の表１に示され
ており、DHFR−MTX耐性、Ｐ−糖タンパク質および複数
の薬剤耐性（Maltiple drug resistance）（MDR）−様
々な親油性細胞毒性薬剤（即ち、アドリアマイシン、コ
ルヒチン、ビンクリスチン）、およびアデノシンデアミ
ナーゼ（ADA）−Xyl−Ａまたはアデノシンおよび2'−デ
オキシコホルマイシンが含まれる。
可能マーカーは、Kaufman,R.J.（上記）の表１に示され
ており、DHFR−MTX耐性、Ｐ−糖タンパク質および複数
の薬剤耐性（Maltiple drug resistance）（MDR）−様
々な親油性細胞毒性薬剤（即ち、アドリアマイシン、コ
ルヒチン、ビンクリスチン）、およびアデノシンデアミ
ナーゼ（ADA）−Xyl−Ａまたはアデノシンおよび2'−デ
オキシコホルマイシンが含まれる。
その他の優性選択可能マーカーには、微生物誘導抗生
物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、カナマイシン
またはヒグロマイシン耐性が含まれる。しかしながら、
これらの選択マーカーが、増幅可能であることは示され
ていない（Kaufman,R.J.、上記）。哺乳動物宿主のため
に、いくつかの適当な選択システムがある（Maniatis、
上記、16.9−16.15）。２つの優性選択可能マーカーを
用いる共移入（コトランスフェクション）プロトコール
もまた、OkayamaおよびBerg,Mol.Cell Biol.,5,1136,1
985、に記載されている。
物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン、カナマイシン
またはヒグロマイシン耐性が含まれる。しかしながら、
これらの選択マーカーが、増幅可能であることは示され
ていない（Kaufman,R.J.、上記）。哺乳動物宿主のため
に、いくつかの適当な選択システムがある（Maniatis、
上記、16.9−16.15）。２つの優性選択可能マーカーを
用いる共移入（コトランスフェクション）プロトコール
もまた、OkayamaおよびBerg,Mol.Cell Biol.,5,1136,1
985、に記載されている。
特に有用な選択および増幅スキームは、DHFR−MTX耐
性を用いている。MTXは、内因性のDHFR遺伝子（Alt,F.
W.ら、Journal of Biological Chemistry,253,1357,
1978）および移入（トランスフェクト）されたDHFR配列
（Wigler,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3567,198
0）の増幅を起こすことが判明しているDHFRのインヒビ
ターである。一つの発現カッセト内の興味ある遺伝子を
含むDNAを、第二の発現カッセト内のDHFR遺伝子に連結
させるかまたはこれとは連結させずして、細胞を形質転
換する。また、２つの遺伝子は、一つのバイシストロニ
ック発現ユニット内に存在することもできる（Kaufman
ら、1991、上記、およびKaufman,R.J.ら、EMBO J.,6,1
87,1987）。形質転換された細胞を、連続的に増加する
量のMTXを含む培地内で増殖させ、結果として、DHFR遺
伝子ならびに興味ある遺伝子をより多く発現させる。
性を用いている。MTXは、内因性のDHFR遺伝子（Alt,F.
W.ら、Journal of Biological Chemistry,253,1357,
1978）および移入（トランスフェクト）されたDHFR配列
（Wigler,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,3567,198
0）の増幅を起こすことが判明しているDHFRのインヒビ
ターである。一つの発現カッセト内の興味ある遺伝子を
含むDNAを、第二の発現カッセト内のDHFR遺伝子に連結
させるかまたはこれとは連結させずして、細胞を形質転
換する。また、２つの遺伝子は、一つのバイシストロニ
ック発現ユニット内に存在することもできる（Kaufman
ら、1991、上記、およびKaufman,R.J.ら、EMBO J.,6,1
87,1987）。形質転換された細胞を、連続的に増加する
量のMTXを含む培地内で増殖させ、結果として、DHFR遺
伝子ならびに興味ある遺伝子をより多く発現させる。
また、前記の有用な調節エレメントを、哺乳動物細胞
を形質転換するために用いられるプラスミド内に含ませ
ることもできる。選ばれた形質転換プロトコールおよび
そこに用いるために選択されたエレメントは、用いられ
る宿主細胞の型に依存するであろう。当業者らは、数多
くの異なるプロトコールおよび宿主細胞を知っており、
それらの細胞培養システムの要求に基づいて、所望のタ
ンパク質の発現に適当なシステムを選択することができ
る。
を形質転換するために用いられるプラスミド内に含ませ
ることもできる。選ばれた形質転換プロトコールおよび
そこに用いるために選択されたエレメントは、用いられ
る宿主細胞の型に依存するであろう。当業者らは、数多
くの異なるプロトコールおよび宿主細胞を知っており、
それらの細胞培養システムの要求に基づいて、所望のタ
ンパク質の発現に適当なシステムを選択することができ
る。
本明細書中に引用されたすべての参考文献に関連した
開示は、特に参照として援用される。以下の実施例は、
本発明の実施態様を詳細に説明するつもりのものであっ
て、本発明の範囲を制限するものではない。
開示は、特に参照として援用される。以下の実施例は、
本発明の実施態様を詳細に説明するつもりのものであっ
て、本発明の範囲を制限するものではない。
実施例
実施例1:ゲノムライブラリーのスクリーニングおよびサ
ブクローニング 腫瘍壊死因子の80Kdレセプターの細胞外ドメインを含
むイムノグロブリンFc融合タンパク質（TNFrFc;Mohler
ら、J.Immunol.,151,1548,1993;米国特許第5,395,760
号、1995年３月７日発行；これらの開示は両方共参照と
して援用する）を高レベルで発現するように形質転換さ
れたCHO細胞系（2A5−３細胞系と名付ける）は、サザン
ブロット分析から、この細胞系に認められるTNFrFc発現
がTNFrFcをコードする発現カセットの単一組込みによっ
て高く発現することが示されたため、ゲノムライブラリ
ーの調製用として選ばれた。DNAをこれらの細胞から単
離し、特にMbo Iで部分消化し、そしてlambda FIX II
クローニングベクター（Stratagene custom genomic
library;Stratagene La Jolla,CA）内にクローン化
し、ライブラリーを作成した。p80 TNFレセプターコー
ド配列は、14,4kbの細胞内フランキング配列と共に、以
下に記載した方法に従って、ライブラリーからクローン
化した。
ブクローニング 腫瘍壊死因子の80Kdレセプターの細胞外ドメインを含
むイムノグロブリンFc融合タンパク質（TNFrFc;Mohler
ら、J.Immunol.,151,1548,1993;米国特許第5,395,760
号、1995年３月７日発行；これらの開示は両方共参照と
して援用する）を高レベルで発現するように形質転換さ
れたCHO細胞系（2A5−３細胞系と名付ける）は、サザン
ブロット分析から、この細胞系に認められるTNFrFc発現
がTNFrFcをコードする発現カセットの単一組込みによっ
て高く発現することが示されたため、ゲノムライブラリ
ーの調製用として選ばれた。DNAをこれらの細胞から単
離し、特にMbo Iで部分消化し、そしてlambda FIX II
クローニングベクター（Stratagene custom genomic
library;Stratagene La Jolla,CA）内にクローン化
し、ライブラリーを作成した。p80 TNFレセプターコー
ド配列は、14,4kbの細胞内フランキング配列と共に、以
下に記載した方法に従って、ライブラリーからクローン
化した。
ライブラリーをスクリーニングするために、250cmの
プレート当たり、おおよそ2x104プラーク形成ユニット
（plaque forming units）（pfu）に形成させた。プラ
ークをニトロセルロース膜（SchleicherおよびSchuell,
Keene,NH）に移し、Stratageneによって供給された標準
プロトコールを用いて溶解した。p80 TNFレセプターの
細胞外ドメインの細胞表面部分（Mohlerら、上記）をコ
ードするランダムプライムしたNot1−Pvu II DNAフラグ
メントで、フィルターをプローブ処理した。ハイブリダ
イゼーションは、ハイブリダイゼーションバッファー
［10x Denharts溶液（Maniatis、上記、9.49）、0.05M
Tris pH7.5、1M NaCl、0.1％のピロリン酸ナトリウ
ム、１％ SDS、４μg/mlサケ***DNA］中、63℃で行っ
た。フィルターを以下の方法に従って洗浄した；最初に
0.1％ SDS、0.1％ SSC（Maniatis、上記、B.13）中、
42℃で30分間洗浄し、次に、同溶液、63℃、60分間で、
さらに二回洗浄した。最後に、0.1％ SDSおよび0.01％
SSCを用いて、63℃で60分間、二度洗浄した。約4x105
組換え体をスクリーニングした後、一つの陽性組換えク
ローンを同定した。このクローンは、2A5−３λと名付
けられ、以下の分析のすべてに用いられた。このクロー
ンからのCHOゲノムDNAのヌクレオチド配列を配列番号:1
に示す。2A5−３λは、1996年１月４日にブダペスト条
約の条件下でAmerican Type Culture Collection,Ro
ckville MDに寄託した（寄託番号97411）。
プレート当たり、おおよそ2x104プラーク形成ユニット
（plaque forming units）（pfu）に形成させた。プラ
ークをニトロセルロース膜（SchleicherおよびSchuell,
Keene,NH）に移し、Stratageneによって供給された標準
プロトコールを用いて溶解した。p80 TNFレセプターの
細胞外ドメインの細胞表面部分（Mohlerら、上記）をコ
ードするランダムプライムしたNot1−Pvu II DNAフラグ
メントで、フィルターをプローブ処理した。ハイブリダ
イゼーションは、ハイブリダイゼーションバッファー
［10x Denharts溶液（Maniatis、上記、9.49）、0.05M
Tris pH7.5、1M NaCl、0.1％のピロリン酸ナトリウ
ム、１％ SDS、４μg/mlサケ***DNA］中、63℃で行っ
た。フィルターを以下の方法に従って洗浄した；最初に
0.1％ SDS、0.1％ SSC（Maniatis、上記、B.13）中、
42℃で30分間洗浄し、次に、同溶液、63℃、60分間で、
さらに二回洗浄した。最後に、0.1％ SDSおよび0.01％
SSCを用いて、63℃で60分間、二度洗浄した。約4x105
組換え体をスクリーニングした後、一つの陽性組換えク
ローンを同定した。このクローンは、2A5−３λと名付
けられ、以下の分析のすべてに用いられた。このクロー
ンからのCHOゲノムDNAのヌクレオチド配列を配列番号:1
に示す。2A5−３λは、1996年１月４日にブダペスト条
約の条件下でAmerican Type Culture Collection,Ro
ckville MDに寄託した（寄託番号97411）。
実施例2:サザンブロッティング
サザンブロット技術を用いて、遺伝子のコピー数をモ
ニターした。適当な細胞系からの全細胞DNAは、前記の
方法（Mitchell,P.J.ら、Mol.Cell Biol.,6,425,198
6）を用いて調製された。供給者（New England Biola
bs,Beverly,MAまたはBoehringer Mannheim,Indianapol
is,IN）が記載している条件下、適当な酵素でDNAを消化
した後、例えば、Maniatis、上記、pg.6.20に記載の方
法に従って、１％のTAE（Tris−酢酸バッファー化）ア
ガロースゲル上で、DNAを泳動した。電気泳動後、DNAを
Zetaprobeフィルターに移し、供給者（Bio−Rad Labor
atories,Richmond,CA）の推奨する条件下でハイブリダ
イズした。フィルターを0.1％ SDSおよび0.1xSSCで３
回、各々30分間洗浄した。最初の洗浄は、37℃で行い、
それに続く２回の洗浄は、63℃で行った。ランダムプラ
イミングキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis,
IN）を用いて、プローブを調製した。ブロットについ
て、ライブラリースクリーンに記載したのと同じプロー
ブを用いて、TNFr配列を検出した。同様に、興味あるそ
の他の任意のタンパク質（またはそのフラグメント）を
コードするDNA領域から誘導されたプローブは、遺伝子
のコピー数をモニターするサザンブロット技術に有用で
あろう。
ニターした。適当な細胞系からの全細胞DNAは、前記の
方法（Mitchell,P.J.ら、Mol.Cell Biol.,6,425,198
6）を用いて調製された。供給者（New England Biola
bs,Beverly,MAまたはBoehringer Mannheim,Indianapol
is,IN）が記載している条件下、適当な酵素でDNAを消化
した後、例えば、Maniatis、上記、pg.6.20に記載の方
法に従って、１％のTAE（Tris−酢酸バッファー化）ア
ガロースゲル上で、DNAを泳動した。電気泳動後、DNAを
Zetaprobeフィルターに移し、供給者（Bio−Rad Labor
atories,Richmond,CA）の推奨する条件下でハイブリダ
イズした。フィルターを0.1％ SDSおよび0.1xSSCで３
回、各々30分間洗浄した。最初の洗浄は、37℃で行い、
それに続く２回の洗浄は、63℃で行った。ランダムプラ
イミングキット（Boehringer Mannheim,Indianapolis,
IN）を用いて、プローブを調製した。ブロットについ
て、ライブラリースクリーンに記載したのと同じプロー
ブを用いて、TNFr配列を検出した。同様に、興味あるそ
の他の任意のタンパク質（またはそのフラグメント）を
コードするDNA領域から誘導されたプローブは、遺伝子
のコピー数をモニターするサザンブロット技術に有用で
あろう。
実施例3:組織培養
ジヒドロホレートレダクターゼ（dihydrofolate redu
ctase）（DHFR）欠損チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞DXB11（ChasinおよびUrlaub、上記）細胞を、Du
lbeccoの最少必須培地、ならびに7.5％のウシ胎児血清
（FBS;Hyclone,Logan,UT;またはSigma,St.Louis,MO）、
2mM Ｌ−グルタミン、90μＭのチミジン（Ｔ）、90μ
Ｍのヒポキサンチン（Ｈ）および120μＭのグリシン
（Ｇ）を補充したF12（DMEM:F12）中に維持した。DHFR
選択研究およびメトトレキセート選択を行うため、細胞
を、DMEM:F12欠損GHT中で培養し、7.5％の透析FBS、6mM
Ｌ−グルタミンおよび1mM アスパラギンを補充し
た。メトトレキセート選択を行うため、メトトレキセー
ト（MTX;Lederle Laboratories,Pearl River,NY）を
適当な濃度で選択培地に加えた。ネオマイシン選択を用
いる場合には、400μg/mlのG418（Gibco,Grand Islan
d,NY）を培地に加えた。供給者（Gibco BRL、Gaithers
burg,MD）の薦めに従って、リン酸カルシウムトランス
フェクション（Wiglerら、上記）、またはLipofectamin
eTMトランスフェクションを用いて、細胞にトランスフ
ェクトした。
ctase）（DHFR）欠損チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞DXB11（ChasinおよびUrlaub、上記）細胞を、Du
lbeccoの最少必須培地、ならびに7.5％のウシ胎児血清
（FBS;Hyclone,Logan,UT;またはSigma,St.Louis,MO）、
2mM Ｌ−グルタミン、90μＭのチミジン（Ｔ）、90μ
Ｍのヒポキサンチン（Ｈ）および120μＭのグリシン
（Ｇ）を補充したF12（DMEM:F12）中に維持した。DHFR
選択研究およびメトトレキセート選択を行うため、細胞
を、DMEM:F12欠損GHT中で培養し、7.5％の透析FBS、6mM
Ｌ−グルタミンおよび1mM アスパラギンを補充し
た。メトトレキセート選択を行うため、メトトレキセー
ト（MTX;Lederle Laboratories,Pearl River,NY）を
適当な濃度で選択培地に加えた。ネオマイシン選択を用
いる場合には、400μg/mlのG418（Gibco,Grand Islan
d,NY）を培地に加えた。供給者（Gibco BRL、Gaithers
burg,MD）の薦めに従って、リン酸カルシウムトランス
フェクション（Wiglerら、上記）、またはLipofectamin
eTMトランスフェクションを用いて、細胞にトランスフ
ェクトした。
実施例4:酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）
組換えタンパク質の生成は、結合アッセイ、阻害アッ
セイおよび生物学的アッセイを含む、所望のタンパク質
の検出に適した任意のアッセイによって、モニターする
ことができる。特に有用なアッセイは、当業者に周知の
（例えば、Engvallら、Immunochem.,8,871,1971および
米国特許第4,703,004号に開示された技術を応用した）
抗体サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ
（ELISA）である。このアッセイでは、興味あるタンパ
ク質に特異的な第一抗体（通常はモノクローナル抗体）
を、支持体上（最も頻繁には、96−穴のミクロタイター
プレート）に固定化し、次いで、タンパク質を含むサン
プルを加え、インキュベートした。また、既知濃度のタ
ンパク質の一連の希釈物を加え、インキュベートし、標
準曲線を得た。非結合タンパク質およびその他の物質を
除去する洗浄段階の後、タンパク質に対する第二抗体を
加えた。第二抗体は、タンパク質の異なるエピトープに
対して作られ、モノクローナル抗体であっても、または
ポリクローナル抗体であっても良い。
セイおよび生物学的アッセイを含む、所望のタンパク質
の検出に適した任意のアッセイによって、モニターする
ことができる。特に有用なアッセイは、当業者に周知の
（例えば、Engvallら、Immunochem.,8,871,1971および
米国特許第4,703,004号に開示された技術を応用した）
抗体サンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ
（ELISA）である。このアッセイでは、興味あるタンパ
ク質に特異的な第一抗体（通常はモノクローナル抗体）
を、支持体上（最も頻繁には、96−穴のミクロタイター
プレート）に固定化し、次いで、タンパク質を含むサン
プルを加え、インキュベートした。また、既知濃度のタ
ンパク質の一連の希釈物を加え、インキュベートし、標
準曲線を得た。非結合タンパク質およびその他の物質を
除去する洗浄段階の後、タンパク質に対する第二抗体を
加えた。第二抗体は、タンパク質の異なるエピトープに
対して作られ、モノクローナル抗体であっても、または
ポリクローナル抗体であっても良い。
西洋わさびのペルオキシダーゼ（horse radish perox
idase）（HRP）のような酵素と複合させた第二抗体と結
合する抗体を含む複合試薬を、非結合タンパク質を除去
する第二の洗浄段階の後か、または第二抗体を加えるの
と同時に加える。適当なインキュベーション期間の後、
非結合複合試薬を洗浄によって除去し、酵素複合体の基
質を含む発色溶液をプレートに加えて、発色させる。適
正な波長での光学濃度の読みによって、それぞれの穴の
数値が分かる。サンプルの値を標準曲線の値と比較する
と、所望のタンパク質のレベルが定量できる。
idase）（HRP）のような酵素と複合させた第二抗体と結
合する抗体を含む複合試薬を、非結合タンパク質を除去
する第二の洗浄段階の後か、または第二抗体を加えるの
と同時に加える。適当なインキュベーション期間の後、
非結合複合試薬を洗浄によって除去し、酵素複合体の基
質を含む発色溶液をプレートに加えて、発色させる。適
正な波長での光学濃度の読みによって、それぞれの穴の
数値が分かる。サンプルの値を標準曲線の値と比較する
と、所望のタンパク質のレベルが定量できる。
三量体のCD40リガンドを定量するために、２つのモノ
クローナル抗体（MAb）を用いるCD40L ELISAを開発し
た。一つの抗体は、三量体のタンパク質内に存在するオ
リゴマー化ジッパードメインに対応し、第二の抗体は、
分子のヒトCD40リガンド部分に対応した。第一のMAbを
プレート上に一晩吸収させ、そして第二の抗体と複合さ
せたペルオキシダーゼ（HRP）を、洗浄段階の後に加え
た。数回行った実験では、0.78と50ng/mlの間の量のCD4
0Lが検出された。
クローナル抗体（MAb）を用いるCD40L ELISAを開発し
た。一つの抗体は、三量体のタンパク質内に存在するオ
リゴマー化ジッパードメインに対応し、第二の抗体は、
分子のヒトCD40リガンド部分に対応した。第一のMAbを
プレート上に一晩吸収させ、そして第二の抗体と複合さ
せたペルオキシダーゼ（HRP）を、洗浄段階の後に加え
た。数回行った実験では、0.78と50ng/mlの間の量のCD4
0Lが検出された。
同様のELISAを用いて、組換えヒト腫瘍壊死因子レセ
プター融合タンパク質（TNFrFc）を定量した。このELIS
Aでは、TNFrFcの異なるエピトープに対する２つのモノ
クローナル抗体を用いた。この場合も、第一のMAbをプ
レート上に一晩吸収させ、第二の抗体と複合させたペル
オキシダーゼ（HRP）を洗浄段階の後に加えた。数回の
実験では、0.78と50ng/mlの間の量のTNFrFcが検出され
た。
プター融合タンパク質（TNFrFc）を定量した。このELIS
Aでは、TNFrFcの異なるエピトープに対する２つのモノ
クローナル抗体を用いた。この場合も、第一のMAbをプ
レート上に一晩吸収させ、第二の抗体と複合させたペル
オキシダーゼ（HRP）を洗浄段階の後に加えた。数回の
実験では、0.78と50ng/mlの間の量のTNFrFcが検出され
た。
組換えFlt−３リガンド（Flt−3L）を検出するため
に、モノクローナル抗体およびウサギのポリクローナル
抗血清を用いる、やや異なるELISAを行った。前記のよ
うに、MAbをプレート上に一晩吸収させた。ポリクロー
ナル抗−Flt−3Lおよびペルオキシダーゼ（HRP）−複合
第二抗体（ロバ抗−ウサギイムノグロブリン）の両方を
含む溶液を、第一の洗浄段階の後に加えて、非結合タン
パク質を除去した。数回の実験では、1.56と100ng/mlの
間の量のFlt−3Lが検出された。
に、モノクローナル抗体およびウサギのポリクローナル
抗血清を用いる、やや異なるELISAを行った。前記のよ
うに、MAbをプレート上に一晩吸収させた。ポリクロー
ナル抗−Flt−3Lおよびペルオキシダーゼ（HRP）−複合
第二抗体（ロバ抗−ウサギイムノグロブリン）の両方を
含む溶液を、第一の洗浄段階の後に加えて、非結合タン
パク質を除去した。数回の実験では、1.56と100ng/mlの
間の量のFlt−3Lが検出された。
実施例5:シークエンシングおよびデータベース調査
文献に報告されているショットガンシークエンシング
（Bankier,Meth.Mol.Biol.,23,47,1993）またはABI Ta
q Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencingキット
を用いたプライマーウォーキング（primer walking）を
用いて、自動DNAシークエンサー（model 373a、Applie
d Biosystems.Foster City,CA）でDNAを配列決定し
た。いくつかの異なる型のコンピューター分析を行うこ
とによって、2A5−３λ DNAの特徴を調べた。
（Bankier,Meth.Mol.Biol.,23,47,1993）またはABI Ta
q Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencingキット
を用いたプライマーウォーキング（primer walking）を
用いて、自動DNAシークエンサー（model 373a、Applie
d Biosystems.Foster City,CA）でDNAを配列決定し
た。いくつかの異なる型のコンピューター分析を行うこ
とによって、2A5−３λ DNAの特徴を調べた。
（ａ） 組成分析
the Genetics Computer GroupからのWisconsin P
ackage（Program Manual for the Wisconsin Pack
age,Version 8,1994年９月、Genetics Computer Gro
up,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 5371
1）で市販されている、SIMPLIFY、WINDOWおよびSTATPLO
Tと呼ばれる３つのコンピュータープログラムを組み合
わせて用い、Ａ＋Ｔの高含有領域について、2A5−３λ
配列を詳しく調べた。Ａ＋Ｔ高含有領域を調べるため
に、50塩基対のスライディングウインドウを、１塩基対
づつ増加させながら、2A5−３λ配列にわたってスライ
ドさせ、そのウインドウ内のＡ＋Ｔの％をプロットし
た。興味ある領域は、Ａ＋Ｔの平均含有量が一貫して70
％より多い領域である。＞70％のＡ＋Ｔを持つ＞200塩
基対の一つの領域が、２つのSwa1に挟まれた部位（配列
番号:1のヌクレオチド10517から12591）に認められた。
この領域は、EASE活性に重要であるとは考えられない
（実施例７および８を参照のこと）。
ackage（Program Manual for the Wisconsin Pack
age,Version 8,1994年９月、Genetics Computer Gro
up,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 5371
1）で市販されている、SIMPLIFY、WINDOWおよびSTATPLO
Tと呼ばれる３つのコンピュータープログラムを組み合
わせて用い、Ａ＋Ｔの高含有領域について、2A5−３λ
配列を詳しく調べた。Ａ＋Ｔ高含有領域を調べるため
に、50塩基対のスライディングウインドウを、１塩基対
づつ増加させながら、2A5−３λ配列にわたってスライ
ドさせ、そのウインドウ内のＡ＋Ｔの％をプロットし
た。興味ある領域は、Ａ＋Ｔの平均含有量が一貫して70
％より多い領域である。＞70％のＡ＋Ｔを持つ＞200塩
基対の一つの領域が、２つのSwa1に挟まれた部位（配列
番号:1のヌクレオチド10517から12591）に認められた。
この領域は、EASE活性に重要であるとは考えられない
（実施例７および８を参照のこと）。
（ｂ）転写増強モチーフ
GCGプログラムモチーフを用いた３つの転写増強モチ
ーフ；“Topo−II"［GTNWAYATTNATNNR］、“Ｔ−box"
［ATATTT/AATATT］、および“Ａ−box"［AATAAAYAAA］
（Klehrら、上記）について、調査を行った。このプロ
グラムは、インプットされたおのおの特定のモチーフと
の正確な対合を、線状様式（linear fashion）で探すこ
とにより、求める配列をスキャンする。それぞれのモチ
ーフについて、International Union of Biochemist
ry（IUB）の命名規定を用いて、縮重をシンボルで示
す。“topo−II box"は、2A5−３λ DNA内の14.5kbの
CHO DNA内には見出されなかった。２つの“Ａ−box"お
よび26の“Ｔ−box"が、CHO DNAのこの領域を通して分
散していることが分かった。これらのモチーフは、EASE
活性に必要とされる604bpのEcoR1からHpa1フラグメント
内には見出されなかった。
ーフ；“Topo−II"［GTNWAYATTNATNNR］、“Ｔ−box"
［ATATTT/AATATT］、および“Ａ−box"［AATAAAYAAA］
（Klehrら、上記）について、調査を行った。このプロ
グラムは、インプットされたおのおの特定のモチーフと
の正確な対合を、線状様式（linear fashion）で探すこ
とにより、求める配列をスキャンする。それぞれのモチ
ーフについて、International Union of Biochemist
ry（IUB）の命名規定を用いて、縮重をシンボルで示
す。“topo−II box"は、2A5−３λ DNA内の14.5kbの
CHO DNA内には見出されなかった。２つの“Ａ−box"お
よび26の“Ｔ−box"が、CHO DNAのこの領域を通して分
散していることが分かった。これらのモチーフは、EASE
活性に必要とされる604bpのEcoR1からHpa1フラグメント
内には見出されなかった。
（ｃ）類似性についての配列データベース調査
Altschulら、J.Mol.Biol.,215,403,1990のBLAST ア
ルゴリズムを用いて、GenBank DNA配列データベースお
よびSwissProtおよびPIRタンパク質配列のデータベース
のデータベース調査を行った。このアルゴリズムは、ア
ライメント内にギャップを挿入することなく位置類似性
セグメントを見つけ出すために、最適化されている。2A
5−３λ DNA配列およびすべての６リーディングフレー
ム内の動的タンパク質翻訳の両方についてのBLAST調査
は、いかなる既知の転写活性化配列とも有意の対合を作
り出さなかった。
ルゴリズムを用いて、GenBank DNA配列データベースお
よびSwissProtおよびPIRタンパク質配列のデータベース
のデータベース調査を行った。このアルゴリズムは、ア
ライメント内にギャップを挿入することなく位置類似性
セグメントを見つけ出すために、最適化されている。2A
5−３λ DNA配列およびすべての６リーディングフレー
ム内の動的タンパク質翻訳の両方についてのBLAST調査
は、いかなる既知の転写活性化配列とも有意の対合を作
り出さなかった。
（ｄ）コード配列分析
コンピュータープログラムGRAIL（Uberbacher,E.C.お
よびMural,R.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,11261,199
1）、神経ネットワークに基づいた遺伝子−認識システ
ムを用いて、コード領域の可能性について2A5−３λ配
列を詳細に調べた。GRAIL調査は、スライドする100bpウ
インドウ内でDNA配列のコード可能性を評価する。偏り
を避けるために、コード領域可能性についての調査は、
さらなるゲノムの特性（例えば、スプライス接合点およ
び翻訳開始点）に関しておよび関せずに行われた。GRAI
L調査の結果、2A5−３λ配列内にはタンパク質をコード
する可能性の高い領域は認められなかった。
よびMural,R.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,11261,199
1）、神経ネットワークに基づいた遺伝子−認識システ
ムを用いて、コード領域の可能性について2A5−３λ配
列を詳細に調べた。GRAIL調査は、スライドする100bpウ
インドウ内でDNA配列のコード可能性を評価する。偏り
を避けるために、コード領域可能性についての調査は、
さらなるゲノムの特性（例えば、スプライス接合点およ
び翻訳開始点）に関しておよび関せずに行われた。GRAI
L調査の結果、2A5−３λ配列内にはタンパク質をコード
する可能性の高い領域は認められなかった。
実施例6:クローン化配列を用いたタンパク質の発現
この実験の目的は、CHL細胞系2A5−３内のTNFrFc組み
込み部位の周辺配列が、DXB11細胞内にランダムに組み
込まれた場合に、このタンパク質の高発現を授与するこ
とができるかどうかについて決定することである。実施
例１記載の方法に従って、この組み込み部位をクローン
化し、リン酸カルシウム形質転換法を用いて、DXB11 C
HO細胞に５μｇの2A5−３λDNAまたは５μｇの対照プラ
スミドのいずれか、および１μｇのpSV3NEO（この発現
ベクターは、SV40プロモーターによって操縦されるG418
耐性マーカー遺伝子を含む）DNAを、コトランスフェク
トした。対照細胞は、第一のイントロンがTNFrFcをコー
ドする配列であり第二のイントロンがマウスのDHFRをコ
ードするバイシストロニックメッセージの発現を操縦す
るCMVプロモーター／エンハンサーからなるpCAVDHFRp80
と呼ばれるTNFrFcの発現ベクターで形質転換された。pC
AVDHFRp80は、2A5−３細胞系を構築するために用いられ
たプラスミドである。48時間の回収期間の後、細胞を、
400μg/mlのG418を含む培地内、10cmの皿内に、1:3また
は1:2にスプリットした。G418−含有培地内で７から９
日間選択した後、耐性コロニーを検出し、１から３コロ
ニーからなる24のプールを選択し、24穴プレート内に種
付けした。
込み部位の周辺配列が、DXB11細胞内にランダムに組み
込まれた場合に、このタンパク質の高発現を授与するこ
とができるかどうかについて決定することである。実施
例１記載の方法に従って、この組み込み部位をクローン
化し、リン酸カルシウム形質転換法を用いて、DXB11 C
HO細胞に５μｇの2A5−３λDNAまたは５μｇの対照プラ
スミドのいずれか、および１μｇのpSV3NEO（この発現
ベクターは、SV40プロモーターによって操縦されるG418
耐性マーカー遺伝子を含む）DNAを、コトランスフェク
トした。対照細胞は、第一のイントロンがTNFrFcをコー
ドする配列であり第二のイントロンがマウスのDHFRをコ
ードするバイシストロニックメッセージの発現を操縦す
るCMVプロモーター／エンハンサーからなるpCAVDHFRp80
と呼ばれるTNFrFcの発現ベクターで形質転換された。pC
AVDHFRp80は、2A5−３細胞系を構築するために用いられ
たプラスミドである。48時間の回収期間の後、細胞を、
400μg/mlのG418を含む培地内、10cmの皿内に、1:3また
は1:2にスプリットした。G418−含有培地内で７から９
日間選択した後、耐性コロニーを検出し、１から３コロ
ニーからなる24のプールを選択し、24穴プレート内に種
付けした。
細胞が集密に達したならば、培地をGHT欠乏培地に変
換し、DHFR+細胞を選択した。二重に選択した８つのプ
ールは、実施例５記載のようなELISAによって、TNFrFc
の比生産性についてアッセイしたところ、プールの40％
が親細胞系のそれより75％大きい又はそれ以上の発現レ
ベルであることが分かった（以下の表１参照）。
換し、DHFR+細胞を選択した。二重に選択した８つのプ
ールは、実施例５記載のようなELISAによって、TNFrFc
の比生産性についてアッセイしたところ、プールの40％
が親細胞系のそれより75％大きい又はそれ以上の発現レ
ベルであることが分かった（以下の表１参照）。
これらのプールの内３つは、10継代以上モニターさ
れ、以下の表２に示すように、親細胞系の発現より大き
いまたはそれと等しい発現を維持していることが分かっ
た。
れ、以下の表２に示すように、親細胞系の発現より大き
いまたはそれと等しい発現を維持していることが分かっ
た。
第二のコトランスフェクションを行うことによって、
この実験を繰り返し、同様の結果を得た。両方のコトラ
ンスフェクション実験に於いて、プール継代時に比生産
量の減少が認められ、このことは、おそらく、混ざった
細胞集団のプールの内、より少量の組換えタンパク質し
か生産しないより増殖のはやい細胞が、生産性は高いが
増殖の遅い細胞より多くなると言う事実によるものと考
えられる。具体的生産性が減少するにもかかわらず、す
べての細胞プールは、親細胞系の生産レベルより多いま
たは等しい生産レベルを維持していた。結果から、2A5
−３λDNA挿入物又は、DXB11 CHO細胞DNA内にランダム
に組み込まれた場合に、高頻度（≧40％）で親細胞系に
近い指標タンパク質の発現を授与できることが示され
た。
この実験を繰り返し、同様の結果を得た。両方のコトラ
ンスフェクション実験に於いて、プール継代時に比生産
量の減少が認められ、このことは、おそらく、混ざった
細胞集団のプールの内、より少量の組換えタンパク質し
か生産しないより増殖のはやい細胞が、生産性は高いが
増殖の遅い細胞より多くなると言う事実によるものと考
えられる。具体的生産性が減少するにもかかわらず、す
べての細胞プールは、親細胞系の生産レベルより多いま
たは等しい生産レベルを維持していた。結果から、2A5
−３λDNA挿入物又は、DXB11 CHO細胞DNA内にランダム
に組み込まれた場合に、高頻度（≧40％）で親細胞系に
近い指標タンパク質の発現を授与できることが示され
た。
実施例7:EASE活性を持つフラグメントの同定
コトランスフェクション実験の第二のシリーズでは、
2A5−３λDNAのより短いセグメントは組換えタンパク質
の高発現を授与できるが、その頻度は2A5−３λより低
いことが分かった。シークエンシングおよび制限酵素地
図のために、制限酵素切断および連結反応の標準技術を
用いて、ファージ挿入物の様々な部分をbluescript II
（Strategene,La Jolla,CA）、またはpGEM−11Zf
（−）（Pomega,Madison,WI）内にサブクローン化した
（図１を参照のこと）。タンパク質の発現について研究
するために、様々な挿入物を図1Aに示すファージクロー
ンから誘導し、pGEM1（Promega,Madison,WI）内にサブ
クローン化した。サブクローン化に用いた制限部位を図
1Aに示す制限地図内に示している。
2A5−３λDNAのより短いセグメントは組換えタンパク質
の高発現を授与できるが、その頻度は2A5−３λより低
いことが分かった。シークエンシングおよび制限酵素地
図のために、制限酵素切断および連結反応の標準技術を
用いて、ファージ挿入物の様々な部分をbluescript II
（Strategene,La Jolla,CA）、またはpGEM−11Zf
（−）（Pomega,Madison,WI）内にサブクローン化した
（図１を参照のこと）。タンパク質の発現について研究
するために、様々な挿入物を図1Aに示すファージクロー
ンから誘導し、pGEM1（Promega,Madison,WI）内にサブ
クローン化した。サブクローン化に用いた制限部位を図
1Aに示す制限地図内に示している。
DXB11 CHO細胞に、LipofectamineTM試薬（Gibco BR
L,Gaithersburg,MD）を用いて、それぞれのTNFrFc発現
プラスミドの配列をコードする0.2μｇのTNFrFcおよび
0.1μｇのpSV3neoをトランスフェクトした。48時間の
後、G418選択培地内で、細胞を1:4または1:40にスプリ
ットした。培地を−Ｈまたは−GHT DHFR選択培地に変
換した時点で、７−10日の期間、コロニーを可視化し
た。DHFR選択培地中で10−13日間選別の後、１−３コロ
ニーのプールを取り上げ、24穴の容器に蒔いた。集密時
に培養物をサンプリングし、高発現の頻度について評価
した（表３参照）。高発現は、最少でCMVプロモーター
から3.9kbのEcoR1からSwa1までの2.8kbおよびCMVプロモ
ーターのすぐ5'側の1.9kb配列（PG5.7ΔＳ）を含むベク
ターで達成できることが分かった。より多量の挿入物を
含むプラスミド（PG8.5およびPG5.7）もまた、発現の増
強に有効であった。
L,Gaithersburg,MD）を用いて、それぞれのTNFrFc発現
プラスミドの配列をコードする0.2μｇのTNFrFcおよび
0.1μｇのpSV3neoをトランスフェクトした。48時間の
後、G418選択培地内で、細胞を1:4または1:40にスプリ
ットした。培地を−Ｈまたは−GHT DHFR選択培地に変
換した時点で、７−10日の期間、コロニーを可視化し
た。DHFR選択培地中で10−13日間選別の後、１−３コロ
ニーのプールを取り上げ、24穴の容器に蒔いた。集密時
に培養物をサンプリングし、高発現の頻度について評価
した（表３参照）。高発現は、最少でCMVプロモーター
から3.9kbのEcoR1からSwa1までの2.8kbおよびCMVプロモ
ーターのすぐ5'側の1.9kb配列（PG5.7ΔＳ）を含むベク
ターで達成できることが分かった。より多量の挿入物を
含むプラスミド（PG8.5およびPG5.7）もまた、発現の増
強に有効であった。
Flt−３リガンド（Lymanら、Blood,83,2795,1994およ
びUSSN08/242,545、1994年５月11日出願）の細胞外部分
をコードするDNAを含む発現プラスミドの同様のセット
を調製し、上記の方法に従って試験した。TNFrFcで認め
られるように、高レベルの発現は、PG5.7Δベクターで
達成できたが、PG2.2ベクターまたはPG.2ベクターでは
達成できなかった。これらの実験の結果から、高頻度の
組換えタンパク質高発現は、タンパク質に特異的なもの
ではなく、1.8kbのEcoR1からSwa1のバンドがこの活性に
重要であることが示された。
びUSSN08/242,545、1994年５月11日出願）の細胞外部分
をコードするDNAを含む発現プラスミドの同様のセット
を調製し、上記の方法に従って試験した。TNFrFcで認め
られるように、高レベルの発現は、PG5.7Δベクターで
達成できたが、PG2.2ベクターまたはPG.2ベクターでは
達成できなかった。これらの実験の結果から、高頻度の
組換えタンパク質高発現は、タンパク質に特異的なもの
ではなく、1.8kbのEcoR1からSwa1のバンドがこの活性に
重要であることが示された。
さらなるフラグメントを調製し、発現増大活性につい
て試験した。構築物PG3.6は、配列番号:1のヌクレオチ
ド8672から12273によって表されるEcoR1フラグメントを
含んでおり、PG.2SE1.8およびPG.2SH1.2の構築物と同様
の様式で、ヌクレオチド14290から14507に連結させた。
また、配列番号:1のヌクレオチド10100から14293で表さ
れるBbs1フラグメントから、同様の構築物を調製した。
これらの構築物は両方共、構築物PG5.7の発現増大活性
に匹敵する、発現増大活性を示した。PG3.8と呼ばれる
構築物は、配列番号:1のヌクレオチド14290から14507に
連結したBamH1フラグメント（ヌクレオチド2221−598
4）からなるが、活性を示さなかった。
て試験した。構築物PG3.6は、配列番号:1のヌクレオチ
ド8672から12273によって表されるEcoR1フラグメントを
含んでおり、PG.2SE1.8およびPG.2SH1.2の構築物と同様
の様式で、ヌクレオチド14290から14507に連結させた。
また、配列番号:1のヌクレオチド10100から14293で表さ
れるBbs1フラグメントから、同様の構築物を調製した。
これらの構築物は両方共、構築物PG5.7の発現増大活性
に匹敵する、発現増大活性を示した。PG3.8と呼ばれる
構築物は、配列番号:1のヌクレオチド14290から14507に
連結したBamH1フラグメント（ヌクレオチド2221−598
4）からなるが、活性を示さなかった。
これらの実験の結果から、発現増大活性を示す2A5−
３λDNAの領域は、ヌクレオチド5980（図１のBamH1サイ
ト）と14290（図１のBbs Iサイト）の間に主に存在する
ことが示された。SV40プロモーター／エンハンサーを用
いたさらなる実験から、発現増大活性はプロモーター依
存性でないことが分かった。さらに、EASE−含有構築物
もまた、エレクトロポレーションによって成功裡に細胞
内に導入され、発現増大活性を示した。しかしながら、
発現増大活性は、EASE−含有構築物をサル細胞系（Ver
o）内にトランスフェクトした場合には認められず、こ
のことは、配列番号:1のEASEが種特異性または細胞型特
異性のいずれかである可能性を示している。
３λDNAの領域は、ヌクレオチド5980（図１のBamH1サイ
ト）と14290（図１のBbs Iサイト）の間に主に存在する
ことが示された。SV40プロモーター／エンハンサーを用
いたさらなる実験から、発現増大活性はプロモーター依
存性でないことが分かった。さらに、EASE−含有構築物
もまた、エレクトロポレーションによって成功裡に細胞
内に導入され、発現増大活性を示した。しかしながら、
発現増大活性は、EASE−含有構築物をサル細胞系（Ver
o）内にトランスフェクトした場合には認められず、こ
のことは、配列番号:1のEASEが種特異性または細胞型特
異性のいずれかである可能性を示している。
実施例8:比生産性（specific productivity）の比較
長さのより短い組み込み部位DNAを含むプラスミドを
トランスフェクトしたクローンからの発現をより正確に
定量し、そしてファージDNAのトランスフェクションか
ら誘導したクローンとそれを比較するために、PG5.7ΔS
TNFrFc構築物で形質転換された最も高発現の３つのプー
ルおよびファージDNAで形質転換された最も高発現の３
つのプールの比生産性を比較した（表４）。この実験で
は、標準Ｔ検定（ｐ＝0.14）を用いて比較した場合、６
プールすべての発現レベルに有意な差は認められないこ
とが分かった。
トランスフェクトしたクローンからの発現をより正確に
定量し、そしてファージDNAのトランスフェクションか
ら誘導したクローンとそれを比較するために、PG5.7ΔS
TNFrFc構築物で形質転換された最も高発現の３つのプー
ルおよびファージDNAで形質転換された最も高発現の３
つのプールの比生産性を比較した（表４）。この実験で
は、標準Ｔ検定（ｐ＝0.14）を用いて比較した場合、６
プールすべての発現レベルに有意な差は認められないこ
とが分かった。
これらの結果は、表３に示す頻度のデータと共に、PG
5.7ΔＳベクターが高レベル発現に必要な配列情報をす
べて含んでいることを示している。
5.7ΔＳベクターが高レベル発現に必要な配列情報をす
べて含んでいることを示している。
実施例9:EASEの特徴
2A5−３ λ−誘導発現ベクター内で認められる発現
増強活性をさらに特徴付けるために、コロニー形成アッ
セイを行った。ここでは、プラスミドPG8.5、PG5.7Δ
Ｓ、PG.2SE1.8、PG.2SH1.2およびPG.2からのDHFRコード
配列0.16μｇを、LipofectamineTMを用いて、DXB11細胞
内にトランスフェクトした。48時間の発現期間の後、様
々な濃度のMTXを含む−GHT培地内に、細胞を1x104細胞
／プレートで蒔Ｅ。９−11日後にプレートをメタノール
で固定化し、そしてコロニー形成をメチレンブルーで染
色した。コロニーの形成は、0nMおよび10nM MTXで実験
を行った場合、プラスミドPG.2SH1.2およびPG.2プラス
ミドと比べて、プラスミドPG8.5、PG5.7ΔＳおよびPG.2
SE1.8でより多く検出された（表５参照）。
増強活性をさらに特徴付けるために、コロニー形成アッ
セイを行った。ここでは、プラスミドPG8.5、PG5.7Δ
Ｓ、PG.2SE1.8、PG.2SH1.2およびPG.2からのDHFRコード
配列0.16μｇを、LipofectamineTMを用いて、DXB11細胞
内にトランスフェクトした。48時間の発現期間の後、様
々な濃度のMTXを含む−GHT培地内に、細胞を1x104細胞
／プレートで蒔Ｅ。９−11日後にプレートをメタノール
で固定化し、そしてコロニー形成をメチレンブルーで染
色した。コロニーの形成は、0nMおよび10nM MTXで実験
を行った場合、プラスミドPG.2SH1.2およびPG.2プラス
ミドと比べて、プラスミドPG8.5、PG5.7ΔＳおよびPG.2
SE1.8でより多く検出された（表５参照）。
これらのデータは、PG.2E1.8に含まれる1.8kbのEcoR1
からSwa1フラグメントがEASE機能に重要であることを示
している。さらに、この領域に含まれる0.6kbのHpa1か
らEcoR1フラグメントは、EASE活性に必須である（PG.2S
H1.2およびPG.2の結果を比較せよ）。長さのより長いCH
OゲノムDNAを持つプラスミド、即ちPG8.5およびPG5.7Δ
Ｓ、は、プラスミドPG.2SE1.8と比較した場合、選択圧
力を増加（25nMおよび50nMのMTX）させた場合に、より
多くコロニーを形成した。より高い選択圧でのこのコロ
ニー形成の差から、プラスミド内のより長く伸びるCHO
ゲノムDNAの存在は、より短いCHOゲノムDNAよりも、よ
り高頻度高発現を授与することが示唆される。
からSwa1フラグメントがEASE機能に重要であることを示
している。さらに、この領域に含まれる0.6kbのHpa1か
らEcoR1フラグメントは、EASE活性に必須である（PG.2S
H1.2およびPG.2の結果を比較せよ）。長さのより長いCH
OゲノムDNAを持つプラスミド、即ちPG8.5およびPG5.7Δ
Ｓ、は、プラスミドPG.2SE1.8と比較した場合、選択圧
力を増加（25nMおよび50nMのMTX）させた場合に、より
多くコロニーを形成した。より高い選択圧でのこのコロ
ニー形成の差から、プラスミド内のより長く伸びるCHO
ゲノムDNAの存在は、より短いCHOゲノムDNAよりも、よ
り高頻度高発現を授与することが示唆される。
実施例10:一過性発現アッセイ
発現増大活性が、非染色体DNA内での一過性発現の発
現を増加させることのできる古典的なエンハンサーまた
はプロモーターの様に作用するか否かを決定するため
に、一過性発現アッセイを行った。プラスミドPG8.5お
よびプラスミドPG2.2（前者はEASE活性を持つことが示
されたが、後者は（実施例７に示すように）活性を持た
なかった）を、前記のようなLipofectamineTM技術を用
いて、CH0細胞内に一過性でトランスフェクトした。48
時間後、上清を集め、前記のようにELISAを用いてTNFrF
c発現について試験した。実施例７の安定な発現実験と
は対照的に、これらの２つのプラスミドは、一過性の発
現アッセイで、組換えTNFrFcと同レベルの発現を示した
（表６を参照のこと）。
現を増加させることのできる古典的なエンハンサーまた
はプロモーターの様に作用するか否かを決定するため
に、一過性発現アッセイを行った。プラスミドPG8.5お
よびプラスミドPG2.2（前者はEASE活性を持つことが示
されたが、後者は（実施例７に示すように）活性を持た
なかった）を、前記のようなLipofectamineTM技術を用
いて、CH0細胞内に一過性でトランスフェクトした。48
時間後、上清を集め、前記のようにELISAを用いてTNFrF
c発現について試験した。実施例７の安定な発現実験と
は対照的に、これらの２つのプラスミドは、一過性の発
現アッセイで、組換えTNFrFcと同レベルの発現を示した
（表６を参照のこと）。
これらのデータは、EASE機能が、既知のエンハンサー
および／またはプロモーターとは違って、染色体組み込
みを必要としていることを示している。
および／またはプロモーターとは違って、染色体組み込
みを必要としていることを示している。
実施例11:タンパク質生産に必要な時間の短縮
Flt−3Lを、３つの異なる発現ベクター、pCDE（「組
換えタンパク質の発現」を参照のこと）、PG5.7およびP
G5.71を用いて、CHO細胞内で発現させた。ベクターPG5.
71は、PG5.7のアデノウイルス三分節（tripartite）リ
ーダーとDHFR cDNAの間にクローン化されたマウスの脳
心筋炎ウイルスIRESを含むPG5.7の誘導体である。Lipof
ectamineTM法を用いて、DXB11 CHO細胞に上記三つのFl
t−3L発現プラスミドをトランスフェクトし、−GHT培地
中でDHFR発現について選択した。次に、DHFR+クローン
をプールし、0nM、25nM、50nMおよび100nM MTXと共に
蒔き、集密まで増殖させ、その時点で、それぞれの構築
物をトランスフェクトしたプールの比生産性を定量し
た。それぞれの構築物からの発現は、それぞれのMTXレ
ベルで類似していたが、分析を完了させるのに必要な時
間は、pCDEおよびPG5.7ベクターでは７から８週間を要
するのと比べて、PG5.71ベクターから作られた細胞のプ
ールでは、たった４から５週間であった。
換えタンパク質の発現」を参照のこと）、PG5.7およびP
G5.71を用いて、CHO細胞内で発現させた。ベクターPG5.
71は、PG5.7のアデノウイルス三分節（tripartite）リ
ーダーとDHFR cDNAの間にクローン化されたマウスの脳
心筋炎ウイルスIRESを含むPG5.7の誘導体である。Lipof
ectamineTM法を用いて、DXB11 CHO細胞に上記三つのFl
t−3L発現プラスミドをトランスフェクトし、−GHT培地
中でDHFR発現について選択した。次に、DHFR+クローン
をプールし、0nM、25nM、50nMおよび100nM MTXと共に
蒔き、集密まで増殖させ、その時点で、それぞれの構築
物をトランスフェクトしたプールの比生産性を定量し
た。それぞれの構築物からの発現は、それぞれのMTXレ
ベルで類似していたが、分析を完了させるのに必要な時
間は、pCDEおよびPG5.7ベクターでは７から８週間を要
するのと比べて、PG5.71ベクターから作られた細胞のプ
ールでは、たった４から５週間であった。
EASEが存在する場合により短い時間で同様の発現レベ
ルが得られるというこの傾向は、多くの異なるタンパク
質、少なくともpCDEベクター内で発現した少なくとも３
つのタンパク質およびPG5.71ベクター内で発現した６つ
より多くのタンパク質、で認められた。一般的に、IRES
配列のみを含む類似の発現ベクターと比較して、EASEお
よびIRES配列を含む発現ベクターを用いると、組換えタ
ンパク質の生成に要する時間が２から５週間少なくて済
む。さらに、EASEから得られた細胞プールは、長時間安
定で、多くの目的のために細胞系として扱うことができ
た。開発プロセスのかなり後までクローニング段階を遅
らせることが可能であり、短期間に大量の組換えタンパ
ク質を得るために、有意の利益を提供した。
ルが得られるというこの傾向は、多くの異なるタンパク
質、少なくともpCDEベクター内で発現した少なくとも３
つのタンパク質およびPG5.71ベクター内で発現した６つ
より多くのタンパク質、で認められた。一般的に、IRES
配列のみを含む類似の発現ベクターと比較して、EASEお
よびIRES配列を含む発現ベクターを用いると、組換えタ
ンパク質の生成に要する時間が２から５週間少なくて済
む。さらに、EASEから得られた細胞プールは、長時間安
定で、多くの目的のために細胞系として扱うことができ
た。開発プロセスのかなり後までクローニング段階を遅
らせることが可能であり、短期間に大量の組換えタンパ
ク質を得るために、有意の利益を提供した。
実施例12:生産規模での発現におけるEASEの使用
PG5.71ベクターを用いた製造を行うため、組換えHuCD
40LをCHO細胞内で発現させた。ここでは、三量体型のhu
CD40LをコードするDNAをPG5.71ベクター内にクローン化
し、その結果得られたCD40L発現プラスミドから得られ
たDNAをLipofectamineTMを用いて、CHO細胞内にトラン
スフェクトした。最初に、細胞をDHFR+表現型で選択
し、次いで、プールし、そして50nM MTX中で選択し
た。50nM MTX内で増殖した細胞を、軟寒天クローニン
グ法を用いてクローン化した（Gibsonら、BioTechnique
s,15:594,1993）。18コロニーを取り上げ、huCD40Lの比
生産性についてスクリーニングし、懸濁液適応性および
流加バイオリアクター走行内での生産走行について、２
つの細胞系を選択した。細胞系の一つ（50−B4細胞系）
を用いてそれぞれ10日間および８日間の２つの生産走行
の間、細胞は、それぞれ、おおよそ24および25μg/106
細胞／日の平均比生産性を維持した。ELISAによる最終
力価は、それぞれ10日間走行および８日間走行で、1.02
および1.09g/Lであった。この実施例では、組換えタン
パク質の高レベル発現が最少のスクリーニング（18細胞
系がスクリーニングされた）および選択段階（二段階）
で測定可能フォーマットに達したので、製造開発にこの
ベクターを用いると、この技術分野の改良が起こること
を、示している。
40LをCHO細胞内で発現させた。ここでは、三量体型のhu
CD40LをコードするDNAをPG5.71ベクター内にクローン化
し、その結果得られたCD40L発現プラスミドから得られ
たDNAをLipofectamineTMを用いて、CHO細胞内にトラン
スフェクトした。最初に、細胞をDHFR+表現型で選択
し、次いで、プールし、そして50nM MTX中で選択し
た。50nM MTX内で増殖した細胞を、軟寒天クローニン
グ法を用いてクローン化した（Gibsonら、BioTechnique
s,15:594,1993）。18コロニーを取り上げ、huCD40Lの比
生産性についてスクリーニングし、懸濁液適応性および
流加バイオリアクター走行内での生産走行について、２
つの細胞系を選択した。細胞系の一つ（50−B4細胞系）
を用いてそれぞれ10日間および８日間の２つの生産走行
の間、細胞は、それぞれ、おおよそ24および25μg/106
細胞／日の平均比生産性を維持した。ELISAによる最終
力価は、それぞれ10日間走行および８日間走行で、1.02
および1.09g/Lであった。この実施例では、組換えタン
パク質の高レベル発現が最少のスクリーニング（18細胞
系がスクリーニングされた）および選択段階（二段階）
で測定可能フォーマットに達したので、製造開発にこの
ベクターを用いると、この技術分野の改良が起こること
を、示している。
配列表
（２）配列情報SEQ ID NO:1:
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ:14507塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー:not relevant
（ii）配列の種類:DNA（genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iv）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名:Chinese hamster
（vii）直接の起源：
（Ｂ）クローン名:2A5−３ lambda CHO sequence
（xi）配列:SEQ ID NO:1:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 リー，チーチャン
アメリカ合衆国ニューヨーク州10591―
6707，タリータウン，オールド・ソーミ
ル・リバー・ロード 777
(72)発明者 トーマス，ジェイムズ・エヌ
アメリカ合衆国ワシントン州98052，レ
ッドモンド，フォーティセカンド・コー
ト，ノース・イースト 16123
(56)参考文献 Ｃｅｌｌ，1991年，64，941−950
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12P 21/02
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】ｉ） 配列番号１のヌクレオチド１から14
507を含むDNA; ii） 配列番号１のヌクレオチド5980から14507を含むD
NA; iii） 配列番号１のヌクレオチド8671から14507を含む
DNA; iv） 配列番号１のヌクレオチド8671から10515を含むD
NA; ｖ） 配列番号１のヌクレオチド8672から12273を含むD
NA; vi） 組換えタンパク質の増加された発現を与え、そし
て少なくとも配列番号１のヌクレオチド8671から9276を
含む、ｉ）ないしｖ）のDNAのフラグメント； vii） 配列番号１のヌクレオチド10100から14293を含
むDNA; viii） 配列番号１のヌクレオチド14293から14507に結
合された、iv）、ｖ）及びvii）のDNAを含むDNA; ix） ｉ）ないしviii）のDNAと完全に相補的であるDN
A;並びに ｘ） 組換えタンパク質の増加された発現を与える、
ｉ）ないしix）のDNAの組み合わせ、 からなる群より選択された、単離された発現増大配列エ
レメント（EASE）。 - 【請求項２】配列番号１のヌクレオチド１から14507か
らなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド5980から14507からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド8671から14507からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド8671から10515からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド8672から12273からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド10100から14293からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド8671から10515及びヌクレオ
チド14293から14507からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド8672から12273及びヌクレオ
チド14293から14507からなるDNA; 配列番号１のヌクレオチド10100から14293及びヌクレオ
チド14293から14507からなるDNA、 からなるDNAからなる群より選択された、単離された発
現増大配列エレメント（EASE）。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の単離された発現増
大配列エレメント（EASE）を含む発現ベクター。 - 【請求項４】第一のエキソンが興味あるタンパク質をコ
ードし、第二のエキソンが増幅可能な優性選択可能マー
カーをコードする、バイシストロニックプラスミドであ
る、請求項３記載の発現ベクター。 - 【請求項５】増幅可能優性選択可能マーカーがジヒドロ
ホレートレダクターゼ（DHFR）である、請求項４記載の
発現ベクター。 - 【請求項６】２つのエキソン間にさらに内在性リボソー
ムエントリー部位（IRES）配列を含む、請求項５記載の
発現ベクター。 - 【請求項７】請求項３ないし６のいずれか１項に記載の
発現ベクターで形質転換されたCHO細胞。 - 【請求項８】タンパク質の発現を促進する条件下で請求
項７記載の形質転換された宿主細胞を培養し、タンパク
質を回収することを含む、組換えタンパク質を得る方
法。 - 【請求項９】タンパク質の発現を促進する条件下で請求
項７記載のCHO細胞を培養し、タンパク質を回収するこ
とを含む、組換えタンパク質を得る方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58650996A | 1996-01-11 | 1996-01-11 | |
| US08/586,509 | 1996-01-11 | ||
| PCT/US1997/000483 WO1997025420A1 (en) | 1996-01-11 | 1997-01-10 | Expression augmenting sequence elements (ease) for eukaryotic expression systems |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000503205A JP2000503205A (ja) | 2000-03-21 |
| JP3495375B2 true JP3495375B2 (ja) | 2004-02-09 |
Family
ID=24346030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52544497A Expired - Fee Related JP3495375B2 (ja) | 1996-01-11 | 1997-01-10 | 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ） |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6027915A (ja) |
| EP (1) | EP0873405B1 (ja) |
| JP (1) | JP3495375B2 (ja) |
| KR (1) | KR19990077015A (ja) |
| AT (1) | ATE275628T1 (ja) |
| AU (1) | AU708981B2 (ja) |
| CA (1) | CA2241174C (ja) |
| DE (1) | DE69730592T2 (ja) |
| DK (1) | DK0873405T3 (ja) |
| ES (1) | ES2227669T3 (ja) |
| NO (1) | NO323277B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ330926A (ja) |
| PT (1) | PT873405E (ja) |
| WO (1) | WO1997025420A1 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596514B2 (en) * | 1996-01-11 | 2003-07-22 | Immunex Corporation | Expression augmenting sequence elements (EASE) for eukaryotic expression systems |
| CA2241174C (en) * | 1996-01-11 | 2006-09-12 | Immunex Corporation | Expression augmenting sequence elements (ease) for eukaryotic expression systems |
| EP2371962A3 (en) | 1996-12-23 | 2011-12-21 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-KAPPA B, receptor is member of TNF receptor superfamily |
| US6521419B1 (en) | 1998-09-22 | 2003-02-18 | Kanakaraju Koduri | Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells |
| US6800457B2 (en) | 1998-09-22 | 2004-10-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells |
| IL148785A0 (en) | 1999-10-13 | 2002-09-12 | Immunex Corp | Vectors and methods for recombinant protein expression |
| EP1616575B1 (en) | 1999-12-23 | 2012-06-06 | ZymoGenetics, Inc. | Method for treating inflammation |
| KR100450266B1 (ko) * | 2002-01-16 | 2004-09-30 | 주식회사 엘지생명과학 | 유전자 발현 동물세포 제조용 바이시스트로닉 벡터 및이를 포함하는 세포주 그리고 이를 이용한 항체단백질의생산방법 |
| AU2003228383A1 (en) * | 2002-04-09 | 2003-10-27 | Global Biotech Inc. | Human tissue urokinase type plasminogen activator production |
| AU2003278695A1 (en) * | 2002-05-28 | 2004-02-02 | Maxygen, Inc. | Nucleic acid vectors |
| JP2005031812A (ja) * | 2003-07-08 | 2005-02-03 | Toshiba Corp | 画像形成装置およびその制御方法 |
| KR100807312B1 (ko) | 2005-10-22 | 2008-02-28 | (주)리즈바이오텍 | 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3의 생산정제 방법 |
| US20080124760A1 (en) | 2006-07-26 | 2008-05-29 | Barbara Enenkel | Regulatory Nucleic Acid Elements |
| BRPI0716762A2 (pt) | 2006-09-13 | 2013-09-24 | Abbott Lab | melhorias da cultura celular |
| EP2500416A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
| BRPI0809361A2 (pt) | 2007-03-30 | 2014-09-02 | Abbott Lab | Elementos de vetor de expressão recombinante (reves) para melhorar a expressão de proteínas recombinantes em células hospedeiras |
| WO2010024927A2 (en) | 2008-08-28 | 2010-03-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Treatment of amyloidoses using myelin basic protein and fragments thereof |
| JP4568378B2 (ja) * | 2008-08-29 | 2010-10-27 | 東洋紡績株式会社 | 遺伝子発現安定化エレメント |
| CA2744555A1 (en) | 2008-11-26 | 2010-06-03 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for regulating collagen and smooth muscle actin expression by serpine2 |
| WO2010147464A1 (en) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | Cellagenics B.V. | Use of a cysteine synthesizing enzyme as selectable marker |
| EP2582816B1 (en) | 2010-06-15 | 2017-12-20 | Cellagenics B.V. | Novel intergenic elements for enhancing gene expression |
| KR101599138B1 (ko) * | 2014-06-17 | 2016-03-03 | 한국생명공학연구원 | 재조합 단백질 발현 증진을 위한 유전자 절편을 포함하는 벡터 및 이의 용도 |
| WO2016003368A1 (en) * | 2014-07-01 | 2016-01-07 | Agency For Science, Technology And Research | Optimized vectors for the production of recombinant proteins |
| US20220033845A1 (en) * | 2018-09-24 | 2022-02-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Expression vectors for eukaryotic expression systems |
| MX2021006783A (es) | 2018-12-10 | 2021-07-15 | Amgen Inc | Transposasa de piggybac mutada. |
| EP3898965A4 (en) | 2018-12-21 | 2022-10-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | EXPRESSION VECTORS FOR EUKARYOT EXPRESSION SYSTEMS |
| AU2020288407A1 (en) * | 2019-06-07 | 2021-12-16 | Biocon Biologics Limited | Mammalian expression vectors |
| TW202233660A (zh) | 2020-10-30 | 2022-09-01 | 美商安進公司 | 過表現胰島素樣生長因子受體突變體以調節ｉｇｆ補充 |
| MX2023006998A (es) | 2020-12-22 | 2023-06-26 | Amgen Inc | Metodo de cultivo celular. |
| CA3222782A1 (en) | 2021-06-10 | 2022-12-15 | Amgen Inc. | Engineered nrg-1 variants with improved selectivity toward erbb4 but not against erbb3 |
| TW202328442A (zh) | 2021-09-10 | 2023-07-16 | 美商安進公司 | 平臺宿主對ｉｇｆ—培養基之適應 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3730246A1 (de) * | 1987-09-09 | 1989-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Expressionsvektor und verfahren zur expression von heterologen proteinen in saeugerzellen |
| CA2241174C (en) * | 1996-01-11 | 2006-09-12 | Immunex Corporation | Expression augmenting sequence elements (ease) for eukaryotic expression systems |
-
1997
- 1997-01-10 CA CA002241174A patent/CA2241174C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-10 AT AT97902909T patent/ATE275628T1/de active
- 1997-01-10 ES ES97902909T patent/ES2227669T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-10 EP EP97902909A patent/EP0873405B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-10 AU AU16973/97A patent/AU708981B2/en not_active Ceased
- 1997-01-10 KR KR1019980705146A patent/KR19990077015A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-01-10 JP JP52544497A patent/JP3495375B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-10 DK DK97902909T patent/DK0873405T3/da active
- 1997-01-10 DE DE69730592T patent/DE69730592T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-10 NZ NZ330926A patent/NZ330926A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-01-10 WO PCT/US1997/000483 patent/WO1997025420A1/en active IP Right Grant
- 1997-01-10 PT PT97902909T patent/PT873405E/pt unknown
- 1997-01-13 US US08/785,150 patent/US6027915A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-07-03 NO NO19983102A patent/NO323277B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-05 US US09/435,377 patent/US6312951B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-12 US US09/660,299 patent/US6309841B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，１９９１年，６４，９４１−９５０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997025420A1 (en) | 1997-07-17 |
| NZ330926A (en) | 1999-11-29 |
| US6312951B1 (en) | 2001-11-06 |
| EP0873405A1 (en) | 1998-10-28 |
| EP0873405B1 (en) | 2004-09-08 |
| CA2241174A1 (en) | 1997-07-17 |
| DK0873405T3 (da) | 2005-01-17 |
| NO323277B1 (no) | 2007-02-26 |
| AU708981B2 (en) | 1999-08-19 |
| EP0873405A4 (en) | 2001-10-17 |
| DE69730592D1 (de) | 2004-10-14 |
| KR19990077015A (ko) | 1999-10-25 |
| NO983102D0 (no) | 1998-07-03 |
| JP2000503205A (ja) | 2000-03-21 |
| PT873405E (pt) | 2005-01-31 |
| DE69730592T2 (de) | 2005-09-29 |
| NO983102L (no) | 1998-09-08 |
| AU1697397A (en) | 1997-08-01 |
| ATE275628T1 (de) | 2004-09-15 |
| ES2227669T3 (es) | 2005-04-01 |
| CA2241174C (en) | 2006-09-12 |
| US6027915A (en) | 2000-02-22 |
| US6309841B1 (en) | 2001-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3495375B2 (ja) | 真核生物発現システムの発現増大配列エレメント（ｅａｓｅ） | |
| CA2005016C (en) | Dna fragment containing promoter region for human polypeptide chain elongation factor-1.alpha. and expression plasmid containing the dna fragment | |
| RU2711505C2 (ru) | Улучшенные экспрессия и процессинг трансгена | |
| US5885827A (en) | Eukaryotic high rate mutagenesis system | |
| KR101183764B1 (ko) | 프로모터 | |
| JP4489424B2 (ja) | 染色体に基くプラットホーム | |
| KR20180132705A (ko) | 단백질 생산 및 라이브러리(Library) 생성을 위한 포유동물 세포주 | |
| Mortensen et al. | Embryonic stem cells lacking a functional inhibitory G-protein subunit (alpha i2) produced by gene targeting of both alleles. | |
| Wasylyk et al. | Transcription Elements and Factors of Rna Polymerase B Promoters of Higher Eukaryote | |
| US6306605B1 (en) | Methods for making recombinant cells | |
| WO2002048379A1 (en) | Expression vector for animal cell containing nuclear matrix attachment region fo interferon beta | |
| JP2002262879A (ja) | 新規動物細胞用ベクターおよびその使用 | |
| US20150025128A1 (en) | Method for Producing Protein | |
| WO2021204787A1 (en) | Methods for the selection of nucleic acid sequences | |
| JP2004141025A (ja) | 細胞発現用合成ｄｎａ断片及び作成方法 | |
| CN109790214B (zh) | 用于选择产生多肽的细胞的改进方法 | |
| EP4079858A1 (en) | Expression cassette including intron for high expression of protein of interest and use thereof | |
| US6183984B1 (en) | Sequences for promoting epidermal cell-specific transcription | |
| JP4555373B2 (ja) | 新規なネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及び高生産組換え細胞の選抜方法 | |
| WO1988009809A2 (en) | Cell system for expression of recombinant protein without production of virus | |
| Grétarsson | Generation of stable cell lines with doxycycline inducible MITF expression | |
| US9315565B2 (en) | Method for producing protein | |
| CN114350625A (zh) | 对抑制剂msx亲和力增强的谷氨酰胺合成酶突变体及其用途 | |
| TWI475109B (zh) | 通過抑制報告基因表現量的手段進行高產量細胞株選殖之策略 | |
| Kollmus et al. | [24] Frameshifting assay to characterize RNA-protein Interactions in eukaryotic cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071121 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081121 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091121 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091121 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101121 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111121 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111121 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121121 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121121 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131121 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |