JP3492935B2 - Plasmid vector - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子発現を促進
させるプラスミドベクター及びこのプラスミドベクター
を用いたタンパク質の製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plasmid vector for promoting gene expression and a method for producing a protein using this plasmid vector.

【０００２】[0002]

【従来の技術】最近、遺伝子工学の研究が盛んに行われ
てきており、遺伝子組換え体微生物を用いて、有用タン
パク質を大量に生産させる例が報告されている。これに
用いるベクターとしては、アミラーゼ、プロテアーゼや
レバンシュークラーゼ等の菌体外酵素の生産に関与する
遺伝子の各種のプロモーター領域及びこれらのタンパク
質の菌体外への分泌に関するシグナルペプチドをコード
する領域を応用した発現・分泌ベクターが用いられてい
る。このプロモーター領域や分泌シグナルペプチド領域
の下流に目的のタンパク質をコードする構造遺伝子を連
結し、これを大腸菌、枯草菌、パン酵母菌等の適当な宿
主菌に導入することによって目的のタンパク質を大量に
分泌生産することが可能となる。2. Description of the Related Art Recently, studies on genetic engineering have been actively conducted, and an example in which a useful protein is produced in a large amount by using a recombinant microorganism has been reported. Vectors used for this include various promoter regions of genes involved in the production of extracellular enzymes such as amylase, protease and levansucrase, and regions encoding signal peptides for extracellular secretion of these proteins. The applied expression / secretion vector is used. By ligating a structural gene encoding a target protein downstream of this promoter region or secretory signal peptide region and introducing this into an appropriate host bacterium such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, or baker's yeast, a large amount of the target protein can be obtained. It becomes possible to secrete and produce.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ベクターを用いたタンパク質生産に於いては、その発現
ベクターの種類は限られており、また、高生産され得る
タンパク質の種類も限られたものとなっている。However, in conventional protein production using vectors, the types of expression vectors are limited, and the types of proteins that can be produced at high levels are also limited. Has become.

【０００４】従って本発明は、有用なタンパク質をコー
ドする各種の構造遺伝子の発現を促進するプラスミドベ
クター、及び該プラスミドベクターを用いたタンパク質
の製造法を提供することを目的とする。Therefore, it is an object of the present invention to provide a plasmid vector which promotes the expression of various structural genes encoding useful proteins, and a method for producing a protein using the plasmid vector.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは配列番号１
で示されるＤＮＡ断片とｐＡＭα１またはｐＵＢ１１０
プラスミドとを組み合せて用いることにより、取り扱い
が容易なバチルス属細菌中で安定かつ目的タンパク質の
生産性を増大できる新規なプラスミドベクターを見出し
た。Means for Solving the Problems We have set out SEQ ID NO: 1.
And the DNA fragment represented by pAMα1 or pUB110
We have found a novel plasmid vector that can be used in combination with a plasmid in a stable and easy-to-handle Bacillus bacterium to increase the productivity of the target protein.

【０００６】 すなわち本発明は、配列番号１で示され
る塩基配列または該塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、
置換もしくは付加した塩基配列からなるＤＮＡ断片
（Ａ）と、プラスミドｐＡＭα１またはｐＵＢ１１０の
複製起点を含むＤＮＡ領域またはそれらの複製起点と薬
剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域を有するプラスミドベク
ター、該プラスミドベクターを含む組換えプラスミド及
び組換え微生物、並びに該組換え微生物を用いたタンパ
ク質の製造法を提供するものである。That is, the present invention relates to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a deletion of 1 to several bases in the base sequence,
A plasmid vector having a DNA fragment (A) consisting of a substituted or added nucleotide sequence, a DNA region containing a replication origin of the plasmid pAMα1 or pUB110, or a DNA region containing a replication origin thereof and a drug resistance gene, and a set containing the plasmid vector The present invention provides a modified plasmid, a recombinant microorganism, and a method for producing a protein using the recombinant microorganism.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明に用いるＤＮＡ断片（Ａ）
は、下流領域に結合した構造遺伝子の発現を促進し、構
造遺伝子産物の大量生産を可能にする。このＤＮＡ断片
（Ａ）は、例えば、バチルス属細菌由来のアルカリセル
ラーゼ遺伝子の上流領域に由来するものであり、より具
体的にはバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−
６４（FERM P-10482）株のアルカリセルラーゼＫ−６４
遺伝子上流領域に存在し、配列番号１に示した塩基配列
を有する。この塩基配列は５９９塩基からなる。本発明
にはこの塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置換または
付加した塩基配列を有するＤＮＡ断片も用いられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION DNA fragment (A) used in the present invention
Promotes the expression of the structural gene bound to the downstream region and enables the large-scale production of the structural gene product. This DNA fragment (A) is derived, for example, from the upstream region of the alkaline cellulase gene derived from Bacillus bacterium, and more specifically, Bacillus sp. KSM-
64 (FERM P-10482) strain of alkaline cellulase K-64
It exists in the upstream region of the gene and has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This base sequence consists of 599 bases. In the present invention, a DNA fragment having a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added to this base sequence is also used.

【０００８】このＤＮＡ断片（Ａ）は、バチルス エス
ピー ＫＳＭ−６４（FERM P-10482）株の染色体ＤＮＡ
から、例えば特開平６−２１７７８１号に記載の方法に
より単離される。This DNA fragment (A) is a chromosomal DNA of Bacillus sp. KSM-64 (FERM P-10482) strain.
From, for example, the method described in JP-A-6-217781.

【０００９】一方、プラスミドｐＡＭα１エンテロコッ
カス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）由来のプ
ラスミドであり、プラスミドｐＵＢ１１０はスタフィロ
コッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来
のプラスミドである。これらのプラスミドの一部のＤＮ
Ａ領域を用いるのが好ましく、これらのプラスミドの複
製起点を含むＤＮＡ領域を用いるのがより好ましく、こ
れらのプラスミドの薬剤耐性遺伝子及び複製起点を含む
ＤＮＡ領域を用いるのがさらに好ましい。また、これら
のプラスミドの複製起点を含むＤＮＡ領域を用いた場合
には、他のプラスミド由来の薬剤耐性遺伝子（例えばｐ
Ｃ１９４由来クロラムフェニコール耐性遺伝子）を連結
して用いてもよい。On the other hand, the plasmid pAMα1 is a plasmid derived from Enterococcus faecalis , and the plasmid pUB110 is a plasmid derived from Staphylococcus aureus . DN of some of these plasmids
It is preferable to use the A region, more preferably the DNA region containing the origin of replication of these plasmids, and even more preferably the DNA region containing the drug resistance gene and the origin of replication of these plasmids. When the DNA region containing the origin of replication of these plasmids is used, drug resistance genes derived from other plasmids (eg p
C194-derived chloramphenicol resistance gene) may be ligated and used.

【００１０】プラスミドｐＡＭα１は図１に示す制限酵
素地図を有する。ｐＡＭα１の一部のＤＮＡ領域として
は、テトラサイクリン耐性遺伝子及び複製起点を含むＤ
ＮＡ領域を用いるのがより好ましく、ＡｃｃＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。プラスミドｐＵＢ１１０の塩基配列はマッケンジー
ら（McKenzie, T, et. al., Plasmids 15, 93-103(198
6)）により示されている。ｐＵＢ１１０の一部のＤＮＡ
領域としては、ネオマイシン耐性遺伝子及び複製起点を
含むＤＮＡ領域を用いるのが好ましく、ＮｃｉＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ制限酵素処理ＤＮＡ断片を用いるのが特に好まし
い。The plasmid pAMα1 has the restriction map shown in FIG. As a part of the DNA region of pAMα1, D containing a tetracycline resistance gene and an origin of replication
It is more preferable to use the NA region, and Acc I- Eco
It is particularly preferable to use a RI restriction enzyme treated DNA fragment. The nucleotide sequence of the plasmid pUB110 is (McKenzie, T, et. Al., Plasmids 15, 93-103 (198
6)). Partial DNA of pUB110
As the region, it is preferable to use a DNA region containing a neomycin resistance gene and an origin of replication. Nci I- Ec
o It is particularly preferable to use a DNA fragment treated with RI restriction enzyme.

【００１１】ＤＮＡ断片（Ａ）とｐＡＭα１またはｐＵ
Ｂ１１０との連結は、例えばｐＡＭα１の場合ＡｃｃＩ
−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ｐＵＢ１１０の場
合ＮｃｉＩ−ＥｃｏＲＩ断片の末端を平滑化し、ＤＮＡ
断片（Ａ）を導入すればよい。得られたプラスミドベク
ターは、バチルス属細菌、特に枯草菌で自己複製可能で
あり、かつ安定性が極めて高い。例としてはｐＡＳＰ６
４、ｐＡＳＰ６４Ｒ等が挙げられる（図１）。DNA fragment (A) and pAMα1 or pU
For example, in the case of pAMα1, ligation with B110 is Acc I
-Blunting the ends of the Eco RI fragment, blunting the ends of the Nci I- Eco RI fragment in the case of pUB110 ,
The fragment (A) may be introduced. The obtained plasmid vector is capable of self-replication in Bacillus bacteria, particularly Bacillus subtilis, and has extremely high stability. PASP6 as an example
4, pASP64R and the like (FIG. 1).

【００１２】斯くして得られたプラスミドベクターのＤ
ＮＡ断片（Ａ）の下流領域に目的タンパク質の構造遺伝
子を種々組み合せて挿入することにより、目的のタンパ
ク質を大量に生産させ得る組換えプラスミドが構築でき
る。例えば、アルカリセルラーゼのＳＤ配列、翻訳開始
コドン及びシグナル配列の一部（１０アミノ酸）を含む
形（配列番号１にＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴ
ＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＧが連
結した配列）で作製されたプラスミドベクターｐＡＳＰ
６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの場合、ＤＮＡ断片（Ａ）の下流
領域には、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ等の制限酵素部位が構築
されており、外来タンパク質構造遺伝子のクローニング
に有用である。また、ｐＡＳＰ６４、ｐＡＳＰ６４Ｒの
ＤＮＡ断片（Ａ）の下流領域には、バチルス エスピー
ＫＳＭ−６４株のアルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子
由来のＳＤ配列、翻訳開始コドン及びシグナル領域の一
部（１０アミノ酸）が存在しており、ＤＮＡ断片（Ａ）
のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をこのシグ
ナル領域のＯＲＦと一致させ、融合タンパクとして発現
させることも可能である。D of the plasmid vector thus obtained
By inserting the structural genes of the target protein in various combinations in the downstream region of the NA fragment (A), a recombinant plasmid capable of producing the target protein in a large amount can be constructed. For example, a form containing the SD sequence of alkali cellulase, a translation initiation codon and a part (10 amino acids) of the signal sequence (SEQ ID NO: 1 is AGGAGGTAATATGATGT
(A sequence in which TAAGAAAGAAAACAAAGCAGTTG is linked)
In the case of 64 and pASP64R, restriction enzyme sites such as Sal I and Sma I are constructed in the downstream region of the DNA fragment (A), which is useful for cloning a foreign protein structural gene. Further, in the downstream region of the DNA fragments (A) of pASP64 and pASP64R, there is an SD sequence derived from the alkaline cellulase K-64 gene of Bacillus sp. KSM-64 strain, a translation initiation codon and a part of the signal region (10 amino acids). And DNA fragment (A)
It is also possible to match the open reading frame (ORF) with the ORF of this signal region and express it as a fusion protein.

【００１３】ＤＮＡ断片（Ａ）の下流に結合する遺伝子
として、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパ
ーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ等の酵素、インシュリ
ン、人成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニ
ン、インターロイキン等の生理活性ペプチドをコードす
る遺伝子が挙げられるが、遺伝子の種類は特に限定され
ない。構造遺伝子を結合した組換えプラスミドの例とし
て、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株のセルラ
ーゼ遺伝子を含む１．０kbの断片をｐＡＳＰ６４Ｒに挿
入して構築した組換えプラスミドｐＡＣＥＬＲ（図
２）、バチルス エスピーＫＳＭ−Ａ３６６株のペクチ
ン酸リアーゼ遺伝子を含む１．２kbの断片をｐＡＳＰ６
４Ｒに挿入して構築した組換えプラスミドｐＡＳＰ３６
６ＰＡＬ（図３）、さらには、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−１３７８株由来のα−アミラーゼ遺伝子を含む
１．６kb断片をプラスミドベクターｐＡＳＰ６４または
ｐＡＳＰ６４Ｒに挿入した組換えプラスミドｐＡＬＡ４
またはｐＡＬＡ４Ｒ（図４）などが挙げられる。Genes that bind downstream of the DNA fragment (A) include enzymes such as amylase, protease, cellulase, lipase, pectinase, pullulanase, peroxidase, oxygenase, catalase, insulin, human growth hormone, interferon, calcitonin, interleukin, etc. Although the gene encoding the physiologically active peptide of E. coli is mentioned, the type of gene is not particularly limited. As an example of a recombinant plasmid having a structural gene linked thereto, a recombinant plasmid pACELR (FIG. 2) constructed by inserting a 1.0 kb fragment containing the cellulase gene of Bacillus sp. KSM-A366 strain into pASP64R (FIG. 2), Bacillus sp. KSM-A366 The 1.2 kb fragment containing the pectate lyase gene of the strain was designated as pASP6.
Recombinant plasmid pASP36 constructed by inserting into 4R
6PAL (Fig. 3), and Bacillus SP K
Recombinant plasmid pALA4 in which a 1.6 kb fragment containing the α-amylase gene derived from strain SM-1378 was inserted into plasmid vector pASP64 or pASP64R.
Alternatively, pALA4R (FIG. 4) and the like can be mentioned.

【００１４】斯くして得られる組換えプラスミドで、宿
主微生物、例えばバチルス属細菌を形質転換すれば、本
発明組換え微生物が得られ、この組換え微生物を培養
し、該培養物から目的とするタンパク質を採取すれば目
的タンパク質が大量に生産できる。用いる培地の種類と
しては、当該組換え微生物が生育し、当該酵素を生産す
ることのできるものであれば良く、特に限定されるもの
ではない。窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組み合わ
せ、この他に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加し
た培地でよい。また、培地のpHに関しては、用いる組換
え微生物が生育し得る範囲内のpHであれば、特に限定さ
れないが、pH６〜８に調整することが好適である。さら
に、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ましくは
２０℃〜４０℃で１〜４日間振盪または、通気攪拌培養
すれば良い。さらに、生産されたタンパク質の単離は常
法により行われ、必要により精製、結晶化、造粒化でき
る。By transforming a host microorganism, for example, a bacterium of the genus Bacillus, with the recombinant plasmid thus obtained, the recombinant microorganism of the present invention can be obtained. The recombinant microorganism is cultivated and the desired product is obtained from the culture. The target protein can be produced in large quantities by collecting the protein. The type of medium used is not particularly limited as long as the recombinant microorganism can grow and the enzyme can be produced. A medium in which a nitrogen source and a carbon source are appropriately combined at appropriate concentrations and an inorganic salt, a metal salt or the like at an appropriate concentration is added may be used. The pH of the medium is not particularly limited as long as it is within the range in which the recombinant microorganism used can grow, but it is preferable to adjust the pH to 6-8. Furthermore, regarding the culture conditions, it may be carried out by shaking at 15 ° C. to 50 ° C., preferably at 20 ° C. to 40 ° C. for 1 to 4 days or by aeration stirring culture. Furthermore, the produced protein is isolated by a conventional method, and can be purified, crystallized and granulated if necessary.

【００１５】[0015]

【実施例】セルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）活性は以下のよ
うに測定した。即ち、２．５％カルボキシメチルセルロ
ース（ＣＭＣ；山陽国策パルプ社製 サンローズＡ０１
ＭＣ）０．４mL、０．５Ｍ グリシン緩衝液（pH９．
０）０．２mL、及び脱イオン水０．３mLからなる基質溶
液に酵素液０．１mLを加え、４０℃で２０分間反応した
後、これによって生成した還元糖を３，５−ジニトロサ
リチル酸法［G. L.Millerら、Anal. Biochem., 2, 127-
132(1960)］によって定量した。酵素力価は、上記の条
件で一分間に１μmol のグルコースに相当する還元糖を
生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。ペクチン酸リア
ーゼ活性は以下のように測定した。即ち、終濃度０．２
％のポリガラクツロン酸（シグマ社製）、１mM塩化カル
シウムを含む１００mMトリス−塩酸緩衝液pH９を酵素反
応液とし、この反応液３mLを試験管に分注した。３０℃
で恒温した後、酵素液１００μＬを添加し、添加後直ち
に攪拌、反応開始とした。恒温セルホルダーにより反応
系の温度を３０℃に一定に保ち、２３５nmの吸光度の増
加を分光光度計Ｕ−２０００（日立製作所社製）を用い
て経時的に測定した。活性はポリガラクツロン酸の切断
非還元末端のＣ４位とＣ５位の間に生じる不飽和結合に
由来する２３５nmの吸光度の増加量を測定し、不飽和ジ
ガラクツロニドのモル分子係数（ε）４６００を用いて
生成する不飽和オリゴガラクツロニドを求めた。酵素１
単位（Ｕ）は上記反応条件において１分間に１μmol の
不飽和オリゴガラクツロニドを生じる酵素量と定義し
た。EXAMPLE Cellulase (CMCase) activity was measured as follows. That is, 2.5% carboxymethyl cellulose (CMC; Sunrose A01 manufactured by Sanyo Kokusaku Pulp Co., Ltd.)
MC) 0.4 mL, 0.5 M glycine buffer (pH 9.
0) 0.1 mL of the enzyme solution was added to a substrate solution consisting of 0.2 mL and 0.3 mL of deionized water and reacted at 40 ° C. for 20 minutes, and then the reducing sugar produced thereby was treated with the 3,5-dinitrosalicylic acid method [ GLMiller et al., Anal. Biochem., 2, 127-
132 (1960)]. Regarding the enzyme titer, 1 unit (U) was the amount of enzyme that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under the above conditions. Pectate lyase activity was measured as follows. That is, the final concentration is 0.2
% Polygalacturonic acid (manufactured by Sigma), 100 mM Tris-HCl buffer pH 9 containing 1 mM calcium chloride was used as an enzyme reaction solution, and 3 mL of this reaction solution was dispensed into a test tube. 30 ° C
After incubating at 100 ° C., 100 μL of enzyme solution was added, and immediately after the addition, the reaction was stirred to start the reaction. The temperature of the reaction system was kept constant at 30 ° C. with a constant temperature cell holder, and the increase in absorbance at 235 nm was measured with time using a spectrophotometer U-2000 (manufactured by Hitachi, Ltd.). The activity was measured by measuring the increase in absorbance at 235 nm resulting from the unsaturated bond generated between the C4 position and the C5 position of the cleavage non-reducing end of polygalacturonic acid, and using the molar molecular coefficient (ε) 4600 of unsaturated digalacturonide. The resulting unsaturated oligogalacturonide was determined. Enzyme 1
The unit (U) is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of unsaturated oligogalacturonide in 1 minute under the above reaction conditions.

【００１６】またα−アミラーゼ活性は以下のように測
定した。即ち、０．５％ 可溶性澱粉（シグマ社製）
０．５mL、１００mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH１０．０）０．４mLからなる基質溶液に酵素液
０．１mLを加え、５０℃で１５分間反応した後、これに
よって生成した還元糖を３，５−ジニトロサリチル酸法
によって定量した。酵素力価は、上記の条件で一分間に
１μmol のグルコースに相当する還元糖を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とした。タンパク量はバイオ・ラッド
プロテイン アッセイ キット（バイオ・ラッド社
製）を用いて行い、牛血清アルブミンを標準タンパクと
して算出した。特開平６−２１７７８１号の記載に従っ
て、配列番号１で示される塩基配列を有するプラスミド
ｐＵＳ６４を得ることができる。The α-amylase activity was measured as follows. That is, 0.5% soluble starch (manufactured by Sigma)
0.1 mL of the enzyme solution was added to a substrate solution consisting of 0.5 mL and 0.4 mL of 100 mM glycine-sodium hydroxide buffer (pH 10.0), and the mixture was reacted at 50 ° C. for 15 minutes, and then the reducing sugar produced thereby was mixed with 3 mL. , 5-Dinitrosalicylic acid method. Regarding the enzyme titer, 1 unit (U) was the amount of enzyme that produced a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute under the above conditions. The amount of protein was determined by using a Bio-Rad protein assay kit (manufactured by Bio-Rad) and calculated using bovine serum albumin as a standard protein. According to the description of JP-A-6-217781, the plasmid pUS64 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be obtained.

【００１７】実施例１ アルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域は以下の様
にＰＣＲ法を用いて増幅し取得した。即ち、特開平６−
２１７７８１号記載の組換えプラスミドｐＵＳ６４約１
ng、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５μＬ（ベーリ
ンガー社製）、ＰＣＲバッファー（ベーリンガー Ｐｗ
ｏ ＤＮＡポリメラーゼ添付）１０μＬ、２種類のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号２と３）各２０pmol、及び４
種類のヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）各２０pmolを加
え脱イオン水で１００μＬに調製した。９４℃ ２分間
の処理後、９４℃ １分、５７℃ ０．５分、７２℃
４分の反応を１サイクルとして２８サイクル繰り返し、
最後に７２℃ ３分間の反応をＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン エルマー社）を用いて増幅
した後、アガロースゲル電気泳動［J. A. Meyersら、J.
Bacteriol., 127,1529-1537(1976)］を行い、アルカリ
セルラーゼＫ−６４遺伝子上流領域６７９bpを含むＤＮ
Ａ断片をThe GENECLEAN キット（バイオ１０１社製）を
用いて単離した。次に本発明プラスミドベクターは以下
の様に構築した。即ち、単離したアルカリセルラーゼＫ
−６４遺伝子上流領域の６７９bpを含むＤＮＡ断片と、
エンテロコッカス フェーカリス由来プラスミドｐＡＭ
α１をＡｃｃＩ及びＥｃｏＲＩ処理後Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより末端の平滑化を行った３．０kb断片とＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合した。この結合反応物による枯草
菌ＩＳＷ１２１４株（leu A8, metB8, hsrM1 ）の形質
転換をプロトプラスト法［S. ChangとS. N. Choen、Mo
l. Gen. Genct., 168, 111-115(1978)］に従って行い、
５μｇ／mL テトラサイクリンを含むプロトプラスト再
生用ＤＭ３培地［０．５％コハク酸ナトリウム（pH７．
３）、０．５％ カザミノ酸、０．５％ 酵母エキス、
０．３５％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．１５％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．
５％ グルコース、２０mM ＭｇＣｌ₂、０．０１％
牛血清アルブミン（シグマ社製）］を用いて形質転換体
を選択した。組換え枯草菌の保持する組換えプラスミド
を常法［例えばD. M. Glover、DNA cloning Volume II.
IRL PRESS, Oxford, Washington DC,(1985)］に従って
調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の
解析をアガロースゲル電気泳動法を用いて行って、プラ
スミドベクターｐＡＳＰ６４またはｐＡＳＰ６４Ｒ（図
１）を保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ
６４）株、ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ６４Ｒ）株を選択
した。Example 1 The alkaline cellulase K-64 gene upstream region was obtained by amplification using the PCR method as follows. That is, JP-A-6-
Recombinant plasmid pUS64 about 1 described in 217781
ng, Pwo DNA polymerase 0.5 μL (manufactured by Boehringer), PCR buffer (Boehringer Pw
o DNA polymerase attached) 10 μL, two kinds of oligonucleotides (SEQ ID NOS: 2 and 3) 20 pmol each, and 4
20 pmol of each type of nucleotide (A, T, G, C) was added and the volume was adjusted to 100 μL with deionized water. 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 1 minute, 57 ° C for 0.5 minutes, 72 ° C
The reaction of 4 minutes is defined as one cycle, and 28 cycles are repeated.
Finally, the reaction at 72 ° C for 3 minutes was performed with DNA Thermal.
After amplification using Cycler (Perkin Elmer), agarose gel electrophoresis [JA Meyers et al., J.
Bacteriol., 127, 1529-1537 (1976)], and DN containing the alkaline cellulase K-64 gene upstream region 679 bp.
The A fragment was isolated using The GENECLEAN kit (Bio 101). Next, the plasmid vector of the present invention was constructed as follows. That is, the isolated alkaline cellulase K
A DNA fragment containing 679 bp of the -64 gene upstream region,
Enterococcus faecalis derived plasmid pAM
α1 was treated with Acc I and Eco RI, and the ends were blunted with T4 DNA polymerase.
Ligated with DNA ligase. Transformation of Bacillus subtilis ISW1214 strain ( leuA8 , metB8 , hsrM1 ) with this ligation reaction was carried out by the protoplast method [S. Chang and SN Choen, Mo.
l. Gen. Genct., 168, 111-115 (1978)],
DM3 medium for protoplast regeneration containing 5 μg / mL tetracycline [0.5% sodium succinate (pH 7.
3), 0.5% casamino acid, 0.5% yeast extract,
0.35% K ₂ HPO ₄ , 0.15% KH ₂ PO ₄ , 0.
5% glucose, 20 mM MgCl ₂ , 0.01%
The transformant was selected using bovine serum albumin (Sigma). Recombinant plasmids harbored by recombinant Bacillus subtilis can be prepared by standard methods [eg DM Glover, DNA cloning Volume II.
IRL PRESS, Oxford, Washington DC, (1985)] and analyzed the restriction enzyme cleavage points of the resulting recombinant plasmid by agarose gel electrophoresis to obtain plasmid vector pASP64 or pASP64R (FIG. 1). Bacillus subtilis ISW1214 (pASP
64) strain and ISW1214 (pASP64R) strain were selected.

【００１８】実施例２ 発明者らが土壌中より分離したセルラーゼ生産菌バチル
ス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株（FERM P-14772）を
０．５％ ポリペプトン（日本製薬社製）、０．５％
酵母エキス（ディフコ社製）、０．１％ ＫＨ₂ＰＯ₄、
０．０２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及び０．５％ Ｎａ
₂ＣＯ₃ からなる培地１００mLで３０℃で１２時間振盪
培養した。遠心分離によって集めた菌体から、Ｓａｉｔ
ｏとＭｉｕｒａの方法［Biochim. Biophys. Acta, 72,
619-629(1963)］に従って染色体ＤＮＡを取得した。得
られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、制限
酵素ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９と混合し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行った。コン
ピテントセル法による大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造社
製）の形質転換処理を行い、処理後の菌懸濁液を５０μ
ｇ／mL アンピシリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プ
レート培地［１．０％ トリプトン（ディフコ社製）、
０．５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ Ｎ
ａＣｌ、１．５％ バクト寒天（ディフコ社製）］に塗
抹し、３７℃で１２時間培養した。出現した形質転換体
の集落上に０．５％ カルボキシメチルセルロース（Ｃ
ＭＣ）、１mg／mL リゾチーム（シグマ社製）及び、５
０mMグリシン緩衝液（pH９）を含む１．０％ 寒天を重
層した後、約６時間放置した。この後、集落周辺のＣＭ
Ｃを分解した菌株をコンゴー・レッド法［R. M. Teathe
r とP. J. Wood. Appl. Environ. Microbiol., 43, 777
-780(1982)］を用いて検出し、目的とする組換え大腸菌
を分離した。得られた組換え大腸菌より常法に従い組換
えプラスミドを調製し、制限酵素切断点の解析をアガロ
ースゲル電気泳動法を用いて行い、バチルス エスピー
ＫＳＭ−Ａ３６６株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む約３．１kbのＰｓｔＩ断片が挿入された組換えプ
ラスミド、ｐＵＣ−Ｃｌを取得した。Example 2 0.5% of the cellulase-producing bacterium Bacillus sp. KSM-A366 strain (FERM P-14772) isolated by the inventors from polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.5%
Yeast extract (manufactured by Difco), 0.1% KH ₂ PO ₄ ,
_{0.02% MgSO 4 · 7H 2 O} , and 0.5% Na
_The cells were cultured with shaking in 100 mL of a medium containing ₂ CO ₃ at 30 ° C. for 12 hours. From the cells collected by centrifugation, Sait
O and Miura [Biochim. Biophys. Acta, 72,
619-629 (1963)] to obtain chromosomal DNA. After cutting the obtained chromosomal DNA with restriction enzyme Pst I, and mixed with plasmid pUC19 which had been cleaved with restriction enzyme Pst I, subjected to ligation reaction by T4DNA ligase. Escherichia coli HB101 strain (Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed by the competent cell method, and the treated bacterial suspension was 50 μm.
LB agar plate medium containing g / mL ampicillin (manufactured by Sigma) [1.0% tryptone (manufactured by Difco),
0.5% yeast extract (manufactured by Difco), 1.0% N
aCl, 1.5% Bact agar (manufactured by Difco)], and cultured at 37 ° C. for 12 hours. 0.5% carboxymethyl cellulose (C
MC), 1 mg / mL lysozyme (manufactured by Sigma) and 5
After overlaying with 1.0% agar containing 0 mM glycine buffer (pH 9), the mixture was allowed to stand for about 6 hours. After this, CM around the village
Strains degrading C were treated with the Congo Red method [RM Teathe
r and PJ Wood. Appl. Environ. Microbiol., 43, 777
-780 (1982)], and the target recombinant E. coli was isolated. A recombinant plasmid was prepared from the obtained recombinant Escherichia coli according to a conventional method, the restriction enzyme digestion point was analyzed using agarose gel electrophoresis, and about 3. containing the alkaline cellulase gene derived from Bacillus sp. KSM-A366 strain. A recombinant plasmid, pUC-Cl, in which a 1 kb Pst I fragment was inserted was obtained.

【００１９】実施例３ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ａ３６６株から実施例２
に従い染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡ
５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド（配列番
号４と５）各２０pmolを用いたＰＣＲを実施例１に従っ
て行った。増幅したＤＮＡ断片の解析をアガロースゲル
電気泳動法を用いて行った。ＫＳＭ−Ａ３６６株由来セ
ルラーゼ構造遺伝子を含む１．０kb ＤＮＡ増幅断片を
High Pure PCR Product Purification Kit（ベーリンガ
ー マンハイム社製）を用いて精製した。制限酵素Ｓａ
ｌＩ処理したＫＳＭ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子
増幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐ
ＡＳＰ６４ＲをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。この結
合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を実
施例１と同様にプロトプラスト法に従って行った。テト
ラサイクリン５μｇ／mL、ＣＭＣ １．０％（ｗ／ｖ）
及びトリパンブルー０．００５％（ｗ／ｖ）を含むプロ
トプラスト再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成したプ
ラスミドｐＡＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１
２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。また、
特開平６−２１７７８１号記載のプラスミドｐＨＳＰ６
４をプラスミドｐＡＳＰ６４Ｒと同様に処理し、プラス
ミドｐＨＣＥＬＲを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１
４（ｐＨＣＥＬＲ）株を選択した（図２）。Example 3 Example 2 from Bacillus sp. KSM-A366 strain
Chromosomal DNA was prepared according to Obtained chromosomal DNA
PCR was carried out according to Example 1 using 5 ng of the template and 20 pmol of each of the two types of oligonucleotides (SEQ ID NOS: 4 and 5). The amplified DNA fragment was analyzed using agarose gel electrophoresis. A 1.0 kb amplified DNA fragment containing the cellulase structural gene derived from KSM-A366 strain
It was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim). Restriction enzyme Sa
l I-treated KSM-A366 strain-derived cellulase gene amplified fragment and restriction enzymes Sal I and Sma I-treated p
ASP64R was ligated with T4 DNA ligase. Transformation of the Bacillus subtilis ISW1214 strain with this ligation product was performed according to the protoplast method as in Example 1. Tetracycline 5 μg / mL, CMC 1.0% (w / v)
And recombinant Bacillus subtilis ISW1 carrying the halo-forming plasmid pACELR on DM3 medium for protoplast regeneration containing 0.005% (w / v) trypan blue.
The 214 (pACELR) strain was selected (Fig. 2). Also,
Plasmid pHSP6 described in JP-A-6-217781
Recombinant Bacillus subtilis ISW121 harboring plasmid pHCELR treated with 4 as in plasmid pASP64R
The 4 (pHCELR) strain was selected (Fig. 2).

【００２０】実施例４ 得られた組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）
株またはＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株をＬＢ培地
（バクトトリプトン（ディフコ社製） １．０％、酵母
エキス（ディフコ社製） ０．５％、塩化ナトリウム
１．０％）に植菌し、２４時間、３４℃にて振盪培養
後、新たなＬＢ培地に１％（ｖ／ｖ）と成るように植菌
した。振盪培養後の菌液を植え継ぐ操作を計３回行った
後、セルラーゼ生産判定寒天培地〔ＣＭＣ １．０％、
トリパンブルー ０．００５％、寒天 １．０％を含む
ＬＢ培地〕に塗抹し、３４℃で一晩培養した。生育して
きたコロニーの中でハローを形成したコロニーの割合
（ハロー出現率）を測定した。表１より、プラスミドｐ
ＡＳＰ６４Ｒをプラスミドベクターとして用いること
で、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いる場合より挿入遺伝
子の安定性が向上することが示された。Example 4 Obtained recombinant Bacillus subtilis ISW1214 (pACELR)
Strain or ISW1214 (pHCELR) strain in LB medium (Bactotryptone (manufactured by Difco) 1.0%, yeast extract (manufactured by Difco) 0.5%, sodium chloride)
1.0%), the cells were shaken and cultured at 34 ° C. for 24 hours, and then inoculated into a new LB medium at 1% (v / v). After repeating the operation of substituting the bacterial solution after shaking culture three times in total, cellulase production determination agar medium [CMC 1.0%,
LB medium containing 0.005% trypan blue and 1.0% agar], and cultured overnight at 34 ° C. The proportion of colonies that formed halos among the grown colonies (halo appearance rate) was measured. From Table 1, plasmid p
It was shown that the use of ASP64R as the plasmid vector improves the stability of the inserted gene more than the case of using the plasmid pHSP64.

【００２１】[0021]

【表１】 [Table 1]

【００２２】実施例５ テトラサイクリン１５μｇ／mLを含むまたは含まないＣ
Ｍ培地（ＣＳＬ １４％、マルトース ７％、魚肉エキ
ス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ ₂ＰＯ₄
０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％）に組換え
枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株またはＩＳＷ
１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株を接種し、３４℃で、振盪
培養を行った結果（表２）、プラスミドｐＡＳＰ６４Ｒ
をプラスミドベクターとして用いた組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるアルカリセルラーゼ
の生産性は、プラスミドｐＨＳＰ６４を用いた組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＣＥＬＲ）株の生産性の、テ
トラサイクリンを添加した場合約１．４倍であり、テト
ラサイクリンを添加しない場合約１．６倍であることが
明らかになり、ここにプラスミドベクターｐＡＳＰ６４
Ｒの有効性が示された。Example 5 C with or without tetracycline 15 μg / mL
M medium (CSL 14%, maltose 7%, fish meat
0.5% yeast, 0.05% yeast extract, KH ₂PO_Four  
0.1%, MgSO_Four・ 7H₂O 0.02%)
Bacillus subtilis ISW1214 (pACELR) strain or ISW
Inoculate strain 1214 (pHCELR) and shake at 34 ° C.
Results of culturing (Table 2), plasmid pASP64R
Bacillus subtilis ISW using Escherichia coli as a plasmid vector
Alkaline cellulase by 1214 (pACELR) strain
Productivity is determined by recombination with plasmid pHSP64.
The productivity of the herb fungus ISW1214 (pHCELR) strain
It was about 1.4 times that with the addition of tracycline.
If you do not add lacycline, it will be about 1.6 times.
It became clear that the plasmid vector pASP64
The effectiveness of R was shown.

【００２３】[0023]

【表２】 [Table 2]

【００２４】実施例６ 実施例２で得られた約３．１kb ＰｓｔＩ断片からＫＳ
Ｍ−Ａ３６６株由来セルラーゼ遺伝子及びそのプロモー
ター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクターｐＨＹ３
００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミドｐＨＹ
−Ｃｌｔを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨ
Ｙ−Ｃｌｔ）株と、実施例３で取得した組換え枯草菌Ｉ
ＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株を、テトラサイクリン
を含むＣＭ培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行った
結果、ＤＮＡ断片（Ａ）がアルカリセルラーゼＡ３６６
構造遺伝子の上流に存在する プラスミドを保持する組
換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＣＥＬＲ）株によるア
ルカリセルラーゼの生産性は、ＤＮＡ断片（Ａ）を含ま
ない組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＹ−Ｃｌｔ）株
の約２９倍であることが明らかになり（表３）、ここに
於いて本発明プラスミドの有効性が示された。Example 6 KS from the approximately 3.1 kb Pst I fragment obtained in Example 2
The cellulase gene derived from the M-A366 strain and its promoter region are used as a shuttle vector pHY3 for Bacillus subtilis and E. coli.
Plasmid pHY ligated to the Sma I site of 00PLK
Recombinant Bacillus subtilis ISW1214 (pH
Y-Clt) strain and the recombinant Bacillus subtilis I obtained in Example 3
The SW1214 (pACELR) strain was inoculated into a CM medium containing tetracycline and cultured at 34 ° C. with shaking. As a result, the DNA fragment (A) was alkaline cellulase A366.
The productivity of alkaline cellulase by the recombinant Bacillus subtilis ISW1214 (pACELR) strain carrying the plasmid existing upstream of the structural gene is about 29 times that of the recombinant Bacillus subtilis ISW1214 (pHY-Clt) strain containing no DNA fragment (A). Doublings (Table 3), showing the efficacy of the plasmids of the invention.

【００２５】[0025]

【表３】 [Table 3]

【００２６】実施例７ 配列番号６、７に示す配列のオリゴヌクレオチドと、実
施例２で調製したＫＳＭ−３６６株染色体ＤＮＡ約５０
ngを用いて、実施例３に従ってＰＣＲ法を用いてＫＳＭ
−３６６ペクチン酸リアーゼ遺伝子を増幅し、精製し
た。得られた増幅ＤＮＡ断片及びプラスミドベクターｐ
ＡＳＰ６４Ｒを制限酵素ＳａｌＩ、ＸｂａＩ消化後、フ
ェノール／クロロホルム抽出を行い、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼにより結合した。この結合反応物を用いて、実施例１
に従い枯草菌ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行い、得ら
れた形質転換体の中から、Ｍｃｖｏｙらの方法（J. Bac
teriol., 72, 3284-3292, 1990）に準じてペクチン酸リ
アーゼ活性を有する株を選択した。得られたプラスミド
をｐＡＳＰ３６６ＰＡＬと命名した（図３）。Example 7 Oligonucleotides having the sequences shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 and about 50 KSM-366 strain chromosomal DNAs prepared in Example 2
ng with KSM using the PCR method according to Example 3.
The -366 pectate lyase gene was amplified and purified. Obtained amplified DNA fragment and plasmid vector p
ASP64R was digested with restriction enzymes Sal I and Xba I, extracted with phenol / chloroform, and ligated with T4 DNA ligase. Using this ligation reactant, Example 1
Bacillus subtilis ISW1214 strain according to the method of McVoy et al. (J. Bac
Teriol., 72, 3284-3292, 1990), and a strain having pectate lyase activity was selected. The resulting plasmid was named pASP366PAL (Fig. 3).

【００２７】実施例８ 実施例７で得られたペクチン酸リアーゼ活性を有する形
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）をテ
トラサイクリンを含有するＬＢ培地に接種し、３０℃で
一夜振盪培養した。５０mLのポリペプトン ２．８％、
魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、ＫＨ
₂ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０２％、マ
ルトース ４％、テトラサイクリン ７．５μｇ／mLを
含む５００mL容坂口フラスコに、得られた培養液を１％
（ｖ／ｖ）接種し、３０℃、３日間振盪培養行った。形
質転換体ＩＳＷ１２１４（ｐＡＳＰ３６６ＰＡＬ）のペ
クチン酸リアーゼ生産性は、ＫＳＭ−３６６野生型株の
約３００倍となり、約６００Ｕ／Ｌの非常に高い生産性
が得られた。Example 8 The transformant ISW1214 (pASP366PAL) having the pectate lyase activity obtained in Example 7 was inoculated into LB medium containing tetracycline, and cultured at 30 ° C. with shaking overnight. 50 mL polypeptone 2.8%,
Fish meat extract 0.5%, yeast extract 0.05%, KH
_{2 PO 4 0.1%, MgSO 4} · 7H 2 O0.02%, maltose 4%, in 500mL Sakaguchi flask containing tetracycline 7.5 [mu] g / mL, the resulting culture 1%
(V / v) was inoculated, and shake culture was carried out at 30 ° C. for 3 days. The pectate lyase productivity of the transformant ISW1214 (pASP366PAL) was about 300 times that of the KSM-366 wild type strain, and a very high productivity of about 600 U / L was obtained.

【００２８】実施例９ 実施例２に従って、バチルス エスピー ＫＳＭ−１３
７８株由来の染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体
ＤＮＡ５ngを鋳型とし、２種類のオリゴヌクレオチド
（配列番号８と９）を用いたＰＣＲを実施例３に従って
行った。制限酵素ＳａｌＩ処理した約１．６kb遺伝子増
幅断片と、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｍａＩ処理したｐＡ
ＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒとを各々Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼで結合した。この結合反応物による枯草菌ＩＳＷ１２
１４株の形質転換を実施例１と同様にプロトプラスト法
に従って行った。テトラサイクリン５μｇ／mL及びスタ
ーチアズレ ０．５％（ｗ／ｖ）を含むプロトプラスト
再生用ＤＭ３培地上で、ハローを形成した再生体を実施
例２に従って解析し、アミラーゼ遺伝子がｐＡＳＰ６４
及びｐＡＳＰ６４ＲのＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限酵素部
位に挿入されたプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ、そ
れぞれのプラスミドを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２
１４（ｐＡＬＡ）株及び枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＡＬ
ＡＲ）株を単離した（図４）。Example 9 Bacillus sp. KSM-13 according to Example 2.
Chromosomal DNA from 78 strains was prepared. PCR was performed according to Example 3 using 5 ng of the obtained chromosomal DNA as a template and two kinds of oligonucleotides (SEQ ID NOS: 8 and 9). A restriction enzyme Sal I treated about 1.6kb gene amplified fragment, restriction enzymes Sal I and Sma I treated pA
SP64 and pASP64R were each ligated with T4 DNA ligase. Bacillus subtilis ISW12 due to this binding reaction
The 14 strains were transformed according to the protoplast method as in Example 1. The halo-forming regenerant was analyzed according to Example 2 on DM3 medium for protoplast regeneration containing 5 μg / mL tetracycline and 0.5% (w / v) Starch azure, and the amylase gene was identified as pASP64.
And plasmids pALA and pALAR inserted into Sal I and Sma I restriction enzyme sites of pASP64R and recombinant Bacillus subtilis ISW12 carrying the respective plasmids.
14 (pALA) strain and Bacillus subtilis ISW1214 (pAL
The (AR) strain was isolated (FIG. 4).

【００２９】実施例１０ ＫＳＭ−１３７８株由来α−アミラーゼ遺伝子及びその
プロモーター領域を枯草菌と大腸菌のシャトルベクター
ｐＨＹ３００ＰＬＫのＳｍａＩ部位に結合したプラスミ
ドｐＨＹ−ＬＡを保持する組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４
（ｐＨＹ−ＬＡ）株と、実施例９で取得した各組換え枯
草菌株を、実施例６に示すテトラサイクリンを含むＣＭ
培地に接種し、３４℃で、振盪培養を行い、α−アミラ
ーゼの生産性を比較した結果を表４に示す。Example 10 Recombinant Bacillus subtilis ISW1214 carrying a plasmid pHY-LA in which the α-amylase gene derived from the KSM-1378 strain and its promoter region are ligated to the Sma I site of the shuttle vector pHY300PLK of Bacillus subtilis and Escherichia coli.
The (pHY-LA) strain and the recombinant Bacillus subtilis strains obtained in Example 9 are CM containing tetracycline shown in Example 6.
Table 4 shows the results of comparing the productivity of α-amylase by inoculating the medium and culturing with shaking at 34 ° C.

【００３０】[0030]

【表４】 [Table 4]

【００３１】表４より本発明プラスミドにα−アミラー
ゼ構造遺伝子を導入したプラスミドを保持する組換え枯
草菌ＩＳＷ１２１４株ではα−アミラーゼの高い生産性
（それぞれ５０００Ｕ／mL、１００００Ｕ／mL）が認め
られ、ここに本発明プラスミドの有用性が示された。From Table 4, a high productivity of α-amylase (5,000 U / mL and 10,000 U / mL, respectively) was observed in the recombinant Bacillus subtilis ISW1214 strain carrying the plasmid in which the α-amylase structural gene was introduced into the plasmid of the present invention. Here, the utility of the plasmid of the present invention was shown.

【００３２】[0032]

【発明の効果】本発明により、構造遺伝子の発現が促進
され、有用なタンパク質を安定かつ大量に生産すること
が可能となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, expression of a structural gene is promoted, and a useful protein can be produced stably and in large quantities.

【００３３】[0033]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Plasmid Vector <130> P01291104 <160> 9 <210> 1 <211> 599 <212> DNA <213> Bacillus <400> 1 agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60 cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120 cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180 acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240 tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300 tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360 atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420 tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480 aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540 aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttt 599[Sequence list]             SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> Plasmid Vector <130> P01291104 <160> 9 <210> 1 <211> 599 <212> DNA <213> Bacillus <400> 1 agtacttacc attttagagt caaaagatag aagccaagca ggatttgccg atgcaaccgg 60 cttatattta gagggaattt ctttttaaat tgaatacgga ataaaatcag gtaaacaggt 120 cctgatttta tttttttgaa tttttttgag aactaaagat tgaaatagaa gtagaagaca 180 acggacataa gaaaattgta ttagttttaa ttatagaaaa cgcttttcta taattattta 240 tacctagaac gaaaatactg tttcgaaagc ggtttactat aaaaccttat attccggctc 300 tttttttaaa cagggggtga aaattcactc tagtattcta atttcaacat gctataataa 360 atttgtaaga cgcaatatac atcttttttt tatgatattt gtaagcggtt aaccttgtgc 420 tatatgccga tttaggaagg gggtagattg agtcaagtag tcataattta gataacttat 480 aagttgttga gaagcaggag agaatctggg ttactcacaa gttttttaaa acattatcga 540 aagcactttc ggttatgctt atgaatttag ctatttgatt caattacttt aataatttt 599

【００３４】 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agtacttacc attttagagt caaaagatag aag 33[0034] <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 agtacttacc attttagagt caaaagatag aag 33

【００３５】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 cccggggatc ctctagagtc gac 23[0035] <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 cccggggatc ctctagagtc gac 23

【００３６】 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gggtcgacct gcaggcatgc aagcatcagc agcagggaca aaa 43 [0036] <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gggtcgacct gcaggcatgc aagcatcagc agcagggaca aaa 43

【００３７】 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggagatctag gtgttgcgtt tggaggata 29 [0037] <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggagatctag gtgttgcgtt tggaggata 29

【００３８】 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 actggtcgac tcgcgaacgc agctgattta ggccacc 37 [0038] <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 actggtcgac tcgcgaacgc agctgattta ggccacc 37

【００３９】 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gcttctagaa agctttactg ctgactgttt tcctg 35 [0039] <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gcttctagaa agctttactg ctgactgttt tcctg 35

【００４０】 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30 [0040] <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30

【００４１】 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aagcttccaa tttatattgg gtgtat 26[0041] <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aagcttccaa tttatattgg gtgtat 26

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ＤＮＡ断片（Ａ）を含むプラスミドベクターｐ
ＡＳＰ６４及びｐＡＳＰ６４Ｒの構築の過程を示すもの
である。FIG. 1 is a plasmid vector p containing a DNA fragment (A).
4 shows a process of constructing ASP64 and pASP64R.

【図２】ＫＳＭ−Ａ３６６株のアルカリセルラーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＡＣＥＬＲ及びｐＨＣＥＬＲの構
築の過程を示すものである。FIG. 2 shows a process of constructing plasmids pACELR and pHCELR containing an alkaline cellulase gene of KSM-A366 strain.

【図３】ＫＳＭ−Ａ３６６株のペクチン酸リアーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＡＳＰ３６６ＰＡＬの構築の過程
を示すものである。FIG. 3 shows a process of constructing a plasmid pASP366PAL containing a pectate lyase gene of KSM-A366 strain.

【図４】ＫＳＭ−１３７８株のα−アミラーゼ遺伝子を
含むプラスミドｐＡＬＡ及びｐＡＬＡＲ作製の過程を示
すものである。図１から図４に於いて太線部分は挿入遺
伝子のＤＮＡ断片であり、細線部分はプラスミドｐＵＣ
１９またはｐＡＭα１由来のＤＮＡ断片である。矢印は
投入した各種遺伝子の構造遺伝子領域及び転写方向また
はプラスミドの複製方向であり、また、網線部分はＤＮ
Ａ断片（Ａ）の領域を示す。FIG. 4 shows a process of preparing plasmids pALA and pALAR containing an α-amylase gene of KSM-1378 strain. 1 to 4, the bold line portion is the DNA fragment of the inserted gene, and the thin line portion is the plasmid pUC.
19 or a DNA fragment derived from pAMα1. Arrows indicate the structural gene regions of various introduced genes and the transcription direction or the replication direction of the plasmid.
The region of the A fragment (A) is shown.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

ａｍｐ；アンピシリン耐性遺伝子 ｔｅｔ；テトラサイクリン遺伝子 ｃｅｌ；セルラーゼ遺伝子 ａｍｙ；アミラーゼ遺伝子 ｐａｌ；ペクチン酸リアーゼ遺伝子 ｏｒｉ；複製起点 amp; ampicillin resistance gene tet; tetracycline gene cel; cellulase gene amy; amylase gene pal; pectate lyase gene ori; origin of replication

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 林 康弘 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 尾崎 克也 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 川合 修次 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (56)参考文献 特開 平６−217781（ＪＰ，Ａ) 特開 平12−78981（ＪＰ，Ａ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (51) Int.Cl. ⁷ Identification FI (C12N 15/09 ZNA C12R 1: 445 C12R 1:07) C12P 21/02 (C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA C12R 1 : 01) (C12N 15/09 ZNA C12R 1: 445) (C12P 21/02 C12R 1: 125) (72) Inventor Yasuhiro Hayashi 2606 Akabane Kai, Cho, Haga-gun, Tochigi Prefecture Kao Corporation Research Institute (72) Inventor Ozaki Katsuya 2606, Akabane, Kai-cho, Haga-gun, Tochigi Prefecture Kao Institute of Stock Companies (72) Inventor Toru Kobayashi 2606 Akabane, Kaiga-cho, Haga-gun Tochigi Prefecture (56) References JP-A-6-217781 (JP, A) JP-A-12-78981 (JP, A)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列番号１で示される塩基配列または該
塩基配列に１〜数個の塩基が欠失、置換もしくは付加し
た塩基配列からなるＤＮＡ断片と、プラスミドｐＡＭα
１またはｐＵＢ１１０の複製起点を含むＤＮＡ領域また
はそれらの複製起点と薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域
を有するプラスミドベクター。1. A DNA fragment comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added to the base sequence, and a plasmid pAMα.
1 or a plasmid vector having a DNA region containing the replication origin of pUB110 or a DNA region containing the replication origin and a drug resistance gene. 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドベクターに目
的タンパク質の構造遺伝子を挿入してなる組換えプラス
ミド。2. A recombinant plasmid obtained by inserting the structural gene of a target protein into the plasmid vector according to claim 1. 【請求項３】 請求項２記載の組換えプラスミドを含む
組換え微生物。3. A recombinant microorganism containing the recombinant plasmid according to claim 2. 【請求項４】 請求項３記載の組換え微生物を培養し、
該培養物から目的タンパク質を採取するタンパク質の製
造法。4. Culturing the recombinant microorganism according to claim 3,
A method for producing a protein, wherein a target protein is collected from the culture.