JP3488459B2 - Monocyte or macrophage migration factor - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規な単球又はマクロファージ遊走因子及
びその製法並びに免疫賦活剤若しくは創傷治療剤に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel monocyte or macrophage chemotactic factor, a method for producing the same, and an immunostimulant or a wound healing agent.

背景技術 細菌による感染症に対し、生体は単球又はマクロファ
ージあるいは好中球などの食細胞を感染局所に浸潤集積
させ、侵入した細菌を殺菌及び貪食することにより生体
防御を行う。更に、単球又はマクロファージは細菌の構
成物質を分解し、Ｔリンパ球に抗原として提示し、Ｂリ
ンパ球が抗原特異的な抗体産生を行うのを促すのみなら
ず、自らも種々のサイトカイン類を産生することにより
炎症や免疫反応を増幅させる。このように単球又はマク
ロファージは、細菌感染に対する生体防御において中心
的な役割を演ずる細胞である。Background Art In response to bacterial infections, the living body protects the body by infiltrating and accumulating phagocytes such as monocytes or macrophages or neutrophils in the infected area, and killing and phagocytosing the invading bacteria. Furthermore, monocytes or macrophages not only decompose the constituents of bacteria and present them to T lymphocytes as antigens, and not only promote B lymphocytes to produce antigen-specific antibodies, but they themselves also produce various cytokines. By producing it, inflammation and immune reaction are amplified. Monocytes or macrophages are thus cells that play a central role in the body's defense against bacterial infection.

この単球又はマクロファージを感染局所に呼び寄せる
物質であるところの遊走因子として、Macrophage Chemo
attractant Protein−１（MCP−1:FEBS 1ett.,244,487
−493,1989）、RANTES/SIS（Nature,347,669−671,199
0）などの分子がこれまでに明らかにされているが、こ
れらの遊走因子以外にも単球又はマクロファージの遊走
活性を有する因子の存在が示されている。Macrophage Chemo is a migration factor that is a substance that attracts these monocytes or macrophages to the infected area.
attractant Protein-1 (MCP-1: FEBS 1ett., 244,487
−493,1989), RANTES / SIS (Nature, 347,669−671,199)
Molecules such as 0) have been clarified so far, but the presence of factors having chemotactic activity for monocytes or macrophages in addition to these migration factors has been shown.

一方、生体は本来、創傷や熱傷に対して自然治癒力を
備えているが、重度の熱傷、反復して発生する床ズレ、
他の疾病の合併症として発生する潰瘍、化学療法の副作
用としての粘膜障害等については、生体の自然治癒力で
は回復しきれないものが多く、創傷、熱傷、潰瘍等の治
療剤を用いる必要がある。On the other hand, the living body originally has a natural healing power against wounds and burns, but severe burns, repeated floor displacement,
Regarding ulcers that occur as a complication of other diseases, mucosal disorders as a side effect of chemotherapy, etc., many cannot be recovered by the natural healing power of the living body, and it is necessary to use therapeutic agents for wounds, burns, ulcers, etc. is there.

特に、創傷の中でも、床ズレは寝たきりの老人等に起
こりやすいため、高齢化を迎えるこれからの社会にとっ
て大きな問題となりつつある。また、潰瘍の中でも、糖
尿病の合併症として発症しやすい下肢の潰瘍は、糖尿病
の患者数が増加しつつある現在、有効な治療剤に欠ける
点で大きな問題となっている。更に、癌の化学療法や放
射線療法の副作用として発症する粘膜障害も、患者のク
オリティーオブライフ（QOL）を低下させる点で大きな
問題となっている。In particular, even among wounds, floor slippage is likely to occur in bedridden elderly people and the like, and this is becoming a major problem for the future aging society. Among the ulcers, lower limb ulcers, which are more likely to develop as a complication of diabetes, are a major problem in that effective therapeutic agents are lacking as the number of patients with diabetes is increasing. In addition, mucosal disorders that develop as a side effect of cancer chemotherapy and radiation therapy have become a major problem in that they reduce the quality of life (QOL) of patients.

従って、上記各種創傷・熱傷・潰瘍に対して早期回復
を図る治療剤の開発が望まれている。Therefore, development of a therapeutic agent for early recovery of the above-mentioned various wounds, burns and ulcers is desired.

また、上記の他、角膜損傷や白内障手術後の創傷に対
しても生体の自然治癒力では回復しきれず、治療剤の開
発が待たれている。In addition to the above, the natural healing power of the living body cannot completely recover the wound after corneal injury or cataract surgery, and development of a therapeutic agent is awaited.

現在までに開発された創傷治療剤としては、トコフェ
ロール誘導体（特公昭49−25632号公報）が挙げられ、
また、現在までの創傷治療剤として開発中の高分子とし
ては、上皮成長因子（Epidermal Growth Factor:EGF;Ca
rpenter,G.and Cohen,S.,Annu.Rev.Biochem.,48,193−2
16,1979）、繊維芽細胞増殖因子（Fibroblast Growth F
actor:FGF;Gospodarowiczら、Mol.Cell.Endocrinol.,4
6,187−204,1986）、血小板由来増殖因子（Platelet De
rived Growth Factor:PDGF;Betsholtzら、Nature,320,6
95−699,1986）等があるが、現在前臨床試験段階であ
り、有効な創傷治療剤の開発が待たれている。Examples of wound healing agents developed to date include tocopherol derivatives (Japanese Patent Publication No. Sho 49-25632),
In addition, epidermal growth factor (EGF; Ca;
rpenter, G. and Cohen, S., Annu.Rev.Biochem., 48,193-2
16,1979), Fibroblast Growth F
actor: FGF; Gospodarowicz et al., Mol.Cell.Endocrinol., 4
6,187-204,1986), Platelet-derived growth factor (Platelet De
rived Growth Factor: PDGF; Betsholtz et al., Nature, 320,6
95-699, 1986), etc., but they are currently in the preclinical trial stage, and development of effective wound healing agents is awaited.

また、インスリン様増殖因子（Insulin−like growth
factor;IGF）−Ｉ及びIIの物質も知られており（Froes
ch,E.R.ら;Ann.Rev.Physiol.47,443−467,1985）、有効
な創傷治療剤としての開発が期待される。Insulin-like growth factor
factor; IGF) -I and II substances are also known (Froes
ch, ER et al .; Ann. Rev. Physiol. 47, 443-467, 1985), and is expected to be developed as an effective wound therapeutic agent.

発明の開示 本発明は、従来にない新規な単球又はマクロファージ
の遊走活性を有する因子及びその製法を提供することを
目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a novel factor having monocyte or macrophage migration activity, which has never been seen, and a method for producing the same.

また、本発明は、細菌による感染症等に有用な免疫賦
活剤を提供し、更に、まだ有効な医薬品が開発されてい
ない創傷治療市場に新たな創傷治療剤を提供することを
目的とする。Another object of the present invention is to provide an immunostimulant useful for bacterial infections and the like, and to provide a new wound therapeutic agent in the wound therapeutic market for which an effective drug has not yet been developed.

そこで、本発明者らは単球又はマクロファージ遊走因
子について鋭意研究を行い、各種培養細胞の培養上清を
スクリーニングした結果、大腸菌の内毒素であるリポ多
糖（LPS）で処理したHT−1376細胞を１日から３日間培
養した培養液から、これまでに報告の無い全く新しい単
球又はマクロファージの遊走活性を有する蛋白質を検出
・精製し、自動エドマン分解により蛋白質のアミノ末端
アミノ酸配列および、蛋白分解酵素によって分解するこ
とにより得られる部分ペプチドのアミノ酸配列を決定し
た。アミノ酸配列の情報をもとに、この蛋白質をコード
するcDNAをクローニングし、その全構造を決定した。ク
ローニングしたcDNAを解析した結果、このcDNAがコード
すると考えられる蛋白質は、求める遊走因子蛋白質をそ
のＮ末端部分に含む前駆体蛋白質の構造を持つことが予
想された。クローニングしたcDNA全体を発現ベクターに
つなぎCos1細胞で発現させ、培養上清中に分泌された遊
走活性を有するＮ末端部分の蛋白質を精製する方法を開
発した。更に、HT−1376細胞あるいはCos1細胞培養上清
中に分泌され遊走活性を示すと考えられた、前駆体Ｎ末
端部分の蛋白質をコードするcDNAのみを、発現ベクター
につないで大腸菌内で大量に発現させ精製する方法も開
発し、本遊走因子HT−LCF（HT−1376 cell derived Leu
kocyte Chemotactic Factor）の製造法を確立した。得
られた遺伝子組換え型HT−LCFを用いて各種検査法によ
り生物活性を検討した結果、遺伝子組換え型HT−LCFは
好中球には作用せず、単球又はマクロファージに対して
特異的に作用する遊走因子であることが明らかとなっ
た。また、遺伝子組換え型HT−LCFは創傷並びに熱傷に
対する治療効果があることが確認され、本発明を完成さ
せた。Therefore, the present inventors conducted extensive research on monocyte or macrophage chemotactic factors, and as a result of screening the culture supernatants of various cultured cells, HT-1376 cells treated with lipopolysaccharide (LPS), which is an endotoxin of Escherichia coli, were examined. A novel protein that has not been reported so far, which has a monocyte or macrophage migration activity, was detected and purified from the culture medium that had been cultured for 1 to 3 days, and the amino-terminal amino acid sequence of the protein and the proteolytic enzyme were detected by automated Edman degradation. The amino acid sequence of the partial peptide obtained by degrading with was determined. Based on the information on the amino acid sequence, a cDNA encoding this protein was cloned and its entire structure was determined. As a result of analysis of the cloned cDNA, it was expected that the protein considered to be encoded by this cDNA had the structure of a precursor protein containing the desired migration factor protein in its N-terminal portion. A method was developed in which the entire cloned cDNA was ligated to an expression vector, expressed in Cos1 cells, and the protein of the N-terminal portion having migration activity secreted in the culture supernatant was purified. Furthermore, only the cDNA encoding the protein of the N-terminal portion of the precursor, which was considered to be secreted into the culture supernatant of HT-1376 cells or Cos1 cells and showed migration activity, was expressed in Escherichia coli in a large amount by connecting it to an expression vector. We have also developed a method for purification of the chemotactic factor HT-LCF (HT-1376 cell derived Leu
kocyte Chemotactic Factor) has been established. As a result of examining biological activity by various test methods using the obtained recombinant HT-LCF, the recombinant HT-LCF does not act on neutrophils and is specific to monocytes or macrophages. It has been revealed that it is a migration factor that acts on. In addition, it was confirmed that the recombinant HT-LCF has a therapeutic effect on wounds and burns, and the present invention was completed.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。  That is, the present invention includes the following inventions.

（１）：配列番号No.1で表されるアミノ酸配列を実質的
に含み、単球又はマクロファージ遊走活性を有する蛋白
質、（２）：配列番号No.2で表されるアミノ酸配列を実
質的に含み、単球又はマクロファージ遊走活性を有する
蛋白質、（３）：配列番号No.1で表されるアミノ酸配列
を実質的にコードするDNAを含む遺伝子、（４）：配列
番号No.2で表されるアミノ酸配列を実質的にコードする
DNAを含む遺伝子、（５）：配列番号No.3で表されるア
ミノ酸配列を実質的にコードするDNAを含む遺伝子、
（６）：前記（３）〜（５）いずれかに記載の遺伝子を
含む発現用組換えベクター、（７）：前記（６）記載の
発現用組換えベクターにより形質転換された形質転換
体、（８）：前記（７）記載の形質転換体を培養し、得
られた培養物から前記（１）記載の蛋白質を分離するこ
とを特徴とする前記（１）記載の蛋白質を製造方法、
（９）：前記（７）記載の形質転換体を培養し、得られ
た培養物から前記（２）記載の蛋白質を分離することを
特徴とする前記（２）記載の蛋白質の製造方法、（1
0）：前記（１）記載の蛋白質を有効成分として含む免
疫賦活剤、（11）：前記（２）記載の蛋白質を有効成分
として含む免疫賦活剤、（12）：前記（２）記載の蛋白
質を有効成分として含む創傷治療剤、（13）：有効成分
である前記（１）又は（２）記載の蛋白質及び医薬的に
許容できる賦形剤を含む医薬組成物、（14）：創傷の治
療に用いる前記（13）記載の医薬組成物、（15）：免疫
賦活に用いる前記（13）記載の医薬組成物、（16）：有
効量の単球又はマクロファージ遊走活性を有する蛋白質
をヒトに投与することを特徴とする創傷の治療方法、
（17）：有効量の単球又はマクロファージ遊走活性を有
する蛋白質をヒトに投与することを特徴とする免疫賦活
方法、（18）：創傷の治療のための、有効量の単球又は
マクロファージ遊走活性を有する蛋白質のヒトへの使
用、（19）：免疫賦活のための、有効量の単球又はマク
ロファージ遊走活性を有する蛋白質のヒトへの使用。(1): a protein substantially containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having monocyte or macrophage migration activity, (2): substantially the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A protein having a monocyte or macrophage migration activity, (3): a gene containing a DNA substantially encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (4): represented by SEQ ID NO: 2 Substantially encodes an amino acid sequence
A gene containing DNA, (5): a gene containing DNA substantially encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3,
(6): A recombinant expression vector containing the gene according to any one of (3) to (5), (7): a transformant transformed with the expression recombinant vector according to (6), (8): A method for producing the protein according to (1), which comprises culturing the transformant according to (7) and separating the protein according to (1) from the obtained culture.
(9): The method for producing a protein according to (2) above, which comprises culturing the transformant according to (7) above and separating the protein according to (2) from the resulting culture. 1
0): an immunostimulant containing the protein described in (1) above as an active ingredient, (11): an immunostimulant containing the protein described in (2) above as an active ingredient, (12): a protein described in (2) above. (13): A pharmaceutical composition containing the active ingredient, the protein according to (1) or (2) above, and a pharmaceutically acceptable excipient, (14): Wound treatment (15): The pharmaceutical composition according to (13) used for immunostimulation, (16): An effective amount of a protein having monocyte or macrophage migration activity is administered to a human. A method for treating a wound characterized by:
(17): An immunostimulatory method comprising administering an effective amount of a protein having monocyte or macrophage migration activity to a human, (18): An effective amount of monocyte or macrophage migration activity for treating a wound (19): Use of a protein having monocyte or macrophage migration activity for immunostimulation in human.

ここで、本発明において「創傷」とは、広く物理的、
生物・化学的なメカニズムによる組織損傷の総称をい
い、体表面部、体内部のいずれに起こっているかを問わ
ない。Here, in the present invention, “wound” is broadly physical,
A general term for tissue damage caused by biological and chemical mechanisms, regardless of whether it occurs on the body surface or inside the body.

物理的メカニズムには、打撲、切開、ひっかき、破
断、外科的手術等外力がかかるもの、その他、熱、放射
線、電気等の外部エネルギーがかかるもの等があり、物
理的メカニズムによる創傷の具体例としては切り傷、打
撲傷、やけど、床ズレ、放射線療法の副作用として発症
する粘膜障害、角膜損傷、白内障手術後の傷等が挙げら
れる。Physical mechanisms include bruising, incision, scratching, rupture, external force such as surgical operation, and other external energy such as heat, radiation, electricity, etc. Examples include cuts, bruises, burns, floor slippage, mucosal disorders that occur as a side effect of radiation therapy, corneal damage, and scratches after cataract surgery.

生物・化学的メカニズムには酸、アルカリ、有機化合
物、生体内恒常性の攪乱、治癒力の低下、ストレス、免
疫機能の昂進等があり、生物・化学的メカニズムによる
創傷の具体例としてはただれ、潰瘍、他の疾病との合併
症として発生する潰瘍、脱水化等が挙げられる。より具
体的には、消化器潰瘍、糖尿病性の皮膚潰瘍、化学療法
の副作用として発症する粘膜障害等が挙げられる。Biological and chemical mechanisms include acids, alkalis, organic compounds, disturbance of in vivo homeostasis, reduction of healing power, stress, enhancement of immune function, etc. Examples include ulcers, ulcers that occur as a complication of other diseases, and dehydration. More specifically, there are digestive ulcers, diabetic skin ulcers, mucosal disorders that develop as a side effect of chemotherapy, and the like.

また、アミノ酸配列を「実質的に含む」あるいは「実
質的にコードする」とは、このペプチドが単球又はマク
ロファージ遊走活性を有する限りアミノ酸のいくつかに
ついて欠失、置換、付加等があっても良いことを示すも
のである。The term “substantially includes” or “substantially encodes” an amino acid sequence means that there are deletions, substitutions, additions, etc. of some amino acids as long as this peptide has monocyte or macrophage migration activity. It shows good things.

更に、「培養物」とは、培養液、培養菌体・細胞もし
くはその破砕物、あるいは培養上清液のいずれをも意味
するものである。Furthermore, the "culture" means any of a culture solution, cultured bacterial cells / cells or a disrupted product thereof, or a culture supernatant solution.

以下、本発明について詳細に説明する。  Hereinafter, the present invention will be described in detail.

単球又はマクロファージの遊走活性は、ポリカーボネ
ート製又はセルロース製のマイクロポアメンブレンフィ
ルターなどで仕切られたケモタキシスチャンバーの上室
にヒト、ラットなど必要に応じた各種動物種由来の単球
又はマクロファージの懸濁液を入れ、下室には遊走因子
を含むサンプル溶液を入れて試験した場合に、上室の単
球又はマクロファージがどの程度下室に引き寄せられる
かを計測することで測定できる（J.Exp.Med.,115,453−
466,1962）。The migration activity of monocytes or macrophages is as high as human, rat, or other monocytes or macrophages derived from various animal species as necessary in the upper chamber of a chemotaxis chamber partitioned by a micropore membrane filter made of polycarbonate or cellulose. It can be measured by measuring how much monocytes or macrophages in the upper chamber are attracted to the lower chamber when a suspension is placed and a sample solution containing a migration factor is placed in the lower chamber (J. Exp.Med., 115,453−
466,1962).

上記の測定方法を用いて各種培養細胞や初代細胞の培
養上清、又はヒト尿、血清、血漿中の遊走活性の有無・
強弱を測定することにより、単球又はマクロファージの
遊走因子を産生する培養細胞、組織を選択することがで
き、また、遊走因子精製のための天然の供給源を特定す
ることができる。Presence or absence of migration activity in the culture supernatant of various cultured cells or primary cells, or human urine, serum or plasma using the above-mentioned measurement method
By measuring the strength, it is possible to select a cultured cell or tissue that produces a monocyte or macrophage migration factor, and to identify a natural source for the migration factor purification.

ここで用いられる培養細胞はヒト由来の細胞に限定さ
れない。また、株化された細胞に限らず、初代培養の細
胞も含まれる。Cultured cells used here are not limited to human-derived cells. Further, not only the established cells but also primary culture cells are included.

細胞の培養上清サンプルの調製は、１〜10％のウシ胎
児血清又は0.1〜0.5％ウシ血清アルブミンを含む培地等
で行われる。更にLPS、ホルボルエステル等による刺激
下においての調製も行われる。The cell culture supernatant sample is prepared in a medium containing 1 to 10% fetal bovine serum or 0.1 to 0.5% bovine serum albumin. Furthermore, preparation under stimulation with LPS, phorbol ester, etc. is also performed.

このようにして得られた遊走因子を含有する培養物を
材料にして、蛋白質の分離、精製に通常用いられる方法
により、遊走因子を得ることができる。例えば、塩析
法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動等
を適当に組み合わせて精製が行われる。各種クロマトグ
ラフィーとしては、疎水、ゲルろ過、イオン交換、逆
相、およびアフィニティークロマトグラフィーなどが用
いられる。また、精製品の純度並びにおよその分子量の
確認はSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法、質量分析機などを用いて行われ
る。Using the thus obtained culture containing the migration factor as a material, the migration factor can be obtained by a method usually used for separating and purifying proteins. For example, salting out, centrifugation, various chromatographies, electrophoresis and the like are appropriately combined for purification. As various kinds of chromatography, hydrophobicity, gel filtration, ion exchange, reverse phase, affinity chromatography and the like are used. Further, the purity and the approximate molecular weight of the purified product are confirmed by using SDS (sodium lauryl sulfate) polyacrylamide gel electrophoresis, a mass spectrometer and the like.

なお、精製された蛋白質のアミノ酸配列の解析は、気
相プロテインシークエンサーを用いた自動エドマン分解
法によって行われる。アミノ酸配列の解析は通常精製し
た蛋白質のＮ末端側から順次行われるが、トリプシンな
どの蛋白質分解酵素でサンプルを消化した後、精製した
ペプチド断片についてそのＮ末端側から順次行うことも
できる。The analysis of the amino acid sequence of the purified protein is performed by the automatic Edman degradation method using a gas phase protein sequencer. The amino acid sequence is usually analyzed sequentially from the N-terminal side of the purified protein, but it is also possible to sequentially analyze the purified peptide fragment from the N-terminal side after digesting the sample with a proteolytic enzyme such as trypsin.

解析されたアミノ酸配列をもとに、その配列をコード
すると考えられるDNAの塩基配列を予測することができ
る。その予測に基づき、cDNAライブラリーから目的のcD
NAクローンをスクリーニングするための縮重オリゴヌク
レオチドプローブあるいはPCR（ポリメラーゼ・チェイ
ン・リアクション）に用いる縮重オリゴヌクレオチドプ
ライマーをDNA合成機（Vu,H.and Hirschbein,B.L.らの
方法;Tetrahedron Lett.,32,3005−3008,1991）で合成
することができる。Based on the analyzed amino acid sequence, it is possible to predict the base sequence of DNA that is considered to encode the sequence. Based on that prediction, the desired cDNA
Degenerate oligonucleotide probes for screening NA clones or degenerate oligonucleotide primers used in PCR (polymerase chain reaction) are DNA synthesizers (Vu, H. and Hirschbein, BL et al .; Tetrahedron Lett., 32 , 3005-3008, 1991).

cDNAをクローニングするためにcDNAライブラリーの作
製が行われる。cDNAライブラリーは、遊走因子を産生し
ている細胞から精製したmRNAをもとに合成したcDNAを、
微生物由来のレプリコンを持つ適当なベクターにつない
だ後、適合する宿主に導入することで作製される。精製
したmRNAからcDNAを合成する方法としては、オリゴdTを
プライマーとする場合や、ランダムプライマーを用いる
場合、特定塩基配列を持つ合成プライマーを使用する場
合などが通常用いられる。ライブラリー作製に用いられ
るベクターとしてはプラスミドベクター、ファージベク
ター、コスミドベクター、ファージミドベクター、YAC
ベクター等が主に使われる。宿主として、大腸菌、酵
母、枯草菌等が主に使用される（Molecular Cloning;Sa
mbrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press,198
9）。A cDNA library is prepared for cloning the cDNA. The cDNA library is a cDNA synthesized from mRNA purified from cells producing migration factor,
It is prepared by ligating to a suitable vector having a replicon derived from a microorganism and introducing it into a compatible host. As a method for synthesizing cDNA from purified mRNA, a method using oligo dT as a primer, a case using a random primer, a case using a synthetic primer having a specific base sequence, etc. are usually used. Vectors used for library construction are plasmid vector, phage vector, cosmid vector, phagemid vector, YAC.
Vectors are mainly used. E. coli, yeast, Bacillus subtilis, etc. are mainly used as hosts (Molecular Cloning; Sa
mbrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198.
9).

ライブラリーを作製する際のcDNAとしては合成したも
のをそのまま使用する場合もあるが、mRNAの大きさが予
めわかっている場合には、それに対応する大きさのmRNA
を密度勾配遠心法によって分画するか、cDNAを電気泳動
的に分画する事で、求めるクローンの含有頻度を高める
事ができる。The synthesized cDNA may be used as it is when creating a library, but if the size of the mRNA is known in advance, the mRNA of the corresponding size will be used.
It is possible to increase the frequency of inclusion of desired clones by fractionating C. by density gradient centrifugation or fractionating cDNA electrophoretically.

作製したcDNAライブラリーから、求める遊走因子cDNA
をコードするクローンを選択する方法としては、アミノ
酸配列から合成した縮重プローブを³²Pや酵素等で標識
した後スクリーニングする方法の他に、縮重プライマー
を使用して行ったPCRによって得られたDNA断片をプロー
ブとして使用することもできる。また、活性の評価系の
感度と特異性が高い場合には、動物細胞でcDNAを発現さ
せた培養上清中の活性を指標として発現クローニングを
行うこともできる。遊走因子を検出する抗体が利用でき
る場合には、大腸菌を宿主とした発現クローニングも可
能である。The migration factor cDNA to be sought from the prepared cDNA library
As a method of selecting a clone encoding the gene, a degenerate probe synthesized from an amino acid sequence was labeled with ³² P, an enzyme, etc. and then screened, or a PCR was performed using a degenerate primer. A DNA fragment can also be used as a probe. When the activity evaluation system has high sensitivity and specificity, expression cloning can be performed using the activity in the culture supernatant in which cDNA is expressed in animal cells as an index. When an antibody that detects a migration factor is available, expression cloning using E. coli as a host is also possible.

このようにしてクローニングされたcDNAの塩基配列
は、放射標識あるいは蛍光標識を用いるジデオキシ法、
マキサム−ギルバート法等により解析することができ
る。The nucleotide sequence of the cDNA thus cloned is determined by the dideoxy method using a radiolabel or a fluorescent label,
It can be analyzed by the Maxam-Gilbert method or the like.

解析したDNAの塩基配列からその配列がコードするア
ミノ酸配列を予測することができる。得られたcDNAクロ
ーンが求める遊走因子をコードする物であるかの確認
は、精製した蛋白質のアミノ酸配列が、クローンにコー
ドされているかどうかで判断できる。From the base sequence of the analyzed DNA, the amino acid sequence encoded by the sequence can be predicted. Whether or not the obtained cDNA clone encodes the migration factor required can be confirmed by whether or not the amino acid sequence of the purified protein is encoded by the clone.

尚、本発明のDNAは、その一部又は全部をVu,H.and Hi
rschbein,B.L.らの方法〔Tetrahedron Lett.32（26）,3
005−3008（1991）〕による化学合成によっても得るこ
とができる。In addition, the DNA of the present invention is partially or wholly Vu, H. and Hi.
rschbein, BL et al. [Tetrahedron Lett. 32 (26), 3
[005-3008 (1991)].

求めるクローンが得られた場合には、そのcDNAを発現
ベクターにつなぎ直し、発現させることによって活性の
確認を行うことができる。この場合の宿主細胞として
は、動物細胞や蚕細胞、酵母、大腸菌等が主に用いられ
る。宿主によって使用するベクターも使い分けられる。When the desired clone is obtained, its activity can be confirmed by reconnecting its cDNA to an expression vector and expressing it. Animal cells, silkworm cells, yeast, Escherichia coli and the like are mainly used as host cells in this case. The vector used depends on the host.

この場合の宿主細胞としては、原核生物（例えば大腸
菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動
物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例とし
ては、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese
Hamster Ovary）細胞、Ｃ−127細胞、BHK（Baby Hamst
er Kidney）細胞等が挙げられる。酵母の例としては、
パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やメタノール資
化性酵母（Pichia pastoris）等が挙げられる。昆虫細
胞の例としては、蚕培養細胞等が挙げられる。In this case, prokaryotic (eg Escherichia coli) or eukaryotic (eg yeast, insect or mammalian) cells can be used as host cells. Examples of mammalian cells include COS cells, Chinese hamster ovary (Chinese
Hamster Ovary) cells, C-127 cells, BHK (Baby Hamst)
er Kidney) cells and the like. As an example of yeast,
Examples include baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) and methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris). Examples of insect cells include silkworm cultured cells.

これらの宿主細胞を形質転換させるために用いられる
ベクターには、大腸菌用としてpKC30（Shimatake H.and
M.Rosenberg,Nature,292,128−132,1981）、pTrc99A
（Amann E.ら、Gene,69,301−315,1988）等が挙げられ
る。哺乳動物細胞用としてはpSV2−neo（Southern and
Berg;J.Mol.Appl.Genet.,1,327−341,1982）、pCAGGS
（Niwaら;Gene,108,193−200,1991）あるいはpcDL−SR
α296（Takabeら;Mol.Cell.Biol.,8,466−472,1988）等
が挙げられる。酵母用としては、pG−１（Schena M.and
Yamamoto K.R.;Science,241,965−967,1988）等が挙げ
られる。蚕細胞としては、組換えウイルス作製用トラン
スファーベクターpAc373（Luckowら;Bio/Technology,6,
47−55,1988）等が挙げられる。Vectors used to transform these host cells include pKC30 (Shimatake H. and
M. Rosenberg, Nature, 292, 128-132, 1981), pTrc99A
(Amann E. et al., Gene, 69, 301-315, 1988). For mammalian cells, pSV2-neo (Southern and
Berg; J.Mol.Appl.Genet., 1,327-341,1982), pCAGGS
(Niwa et al .; Gene, 108, 193-200, 1991) or pcDL-SR
α296 (Takabe et al .; Mol. Cell. Biol., 8, 466-472, 1988). For yeast, pG-1 (Schena M. and
Yamamoto KR; Science, 241, 965-967, 1988) and the like. As a silkworm cell, a transfer vector pAc373 (Luckow et al .; Bio / Technology, 6,
47-55, 1988) and the like.

これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マー
カー、プロモーターを含み、更に真核細胞用のベクター
には、必要に応じてRNAスプライス部位、ポリアデニル
化シグナル等が付加される。These vectors include an origin of replication, a selectable marker, and a promoter as needed, and further, a vector for eukaryotic cells is provided with an RNA splice site, a polyadenylation signal, etc., if necessary.

複製起点として、哺乳動物細胞用ベクターには、SV4
0、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のも
の等を用いることができる。大腸菌用ベクターにはCo1E
1、Ｒ因子、Ｆ因子由来のもの等を用いることができ
る。酵母用ベクターには２μmDNA、ARS1由来のもの等を
用いることができる。As an origin of replication, SV4
Those derived from 0, adenovirus, bovine papilloma virus and the like can be used. Co1E for E. coli vector
Those derived from 1, R factor, F factor and the like can be used. As the yeast vector, those derived from 2 μm DNA, ARS1 and the like can be used.

遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物細胞用ベク
ターには、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデ
ノウイルス、SV40由来のもの等を用いることができる。
大腸菌用ベクターにはバクテリオファージλ由来のもの
や、trp、lpp、lac、tacプロモーター等を用いることが
できる。パン酵母用ベクターにはADH、PHO5、GPD、PG
K、MAFαプロモーター、メタノール資化性酵母について
はAOX1プロモーター等を用いることができる。蚕細胞用
ベクターには核多角体病ウイルス由来のもの等を用いる
ことができる。As a vector for mammalian cells as a promoter for gene expression, those derived from retrovirus, polyoma virus, adenovirus, SV40 and the like can be used.
As the vector for E. coli, those derived from bacteriophage λ, the trp, lpp, lac, tac promoters and the like can be used. Vectors for baker's yeast include ADH, PHO5, GPD, PG
For K, MAFα promoter, and methanol-assimilating yeast, AOX1 promoter and the like can be used. As the vector for silkworm cells, those derived from nuclear polyhedrosis virus can be used.

選択マーカーとして、哺乳動物細胞用ベクターにはネ
オマイシン（neo）耐性遺伝子、チミジンキナーゼ（T
K）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子、大
腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ecogpt）遺伝子等を用いることができる。大腸菌
用ベクターにはカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン
耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いるこ
とができる。酵母用ベクターにはLeu2、Trp1、Ura3遺伝
子等を用いることができる。As a selectable marker, vectors for mammalian cells include neomycin (neo) resistance gene, thymidine kinase (T
K) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene, Escherichia coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene and the like can be used. As a vector for E. coli, a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a tetracycline resistance gene or the like can be used. As the yeast vector, Leu2, Trp1, Ura3 genes and the like can be used.

以上の様な宿主−ベクター系を適当に組み合わせて本
発明の遺伝子を発現させ、遊走活性を有する蛋白質の得
ることができる。A protein having migration activity can be obtained by expressing the gene of the present invention by appropriately combining the above host-vector systems.

遊走活性の確認にはボイデン法（J.Exp.Med.,115,453
−466,1962）等が使用される。Boyden method (J.Exp.Med., 115,453) was used to confirm the migration activity.
−466,1962) is used.

このようにして発現させた遊走因子を含む培養物より
分離精製することにより、遊走因子を製造することがで
きる。The migration factor can be produced by separating and purifying from the culture containing the migration factor thus expressed.

この際には、通常の蛋白質の分離、精製に用いられる
方法を組み合わせて使用される。例えば、塩析法、遠心
分離法、各種クロマトグラフィーを適当に組み合わせて
行われる。各種クロマトグラフィーとしては、疎水、ゲ
ルろ過、イオン交換、逆相、およびアフィニティークロ
マトグラフィーなどが用いられる。また、精製品の純度
の確認はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法などに
より確認できる。In this case, the methods generally used for separating and purifying proteins are used in combination. For example, the salting out method, the centrifugation method, and various chromatographies are appropriately combined. As various kinds of chromatography, hydrophobicity, gel filtration, ion exchange, reverse phase, affinity chromatography and the like are used. The purity of the purified product can be confirmed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.

なお、精製された蛋白質のアミノ酸配列の確認は、気
相プロテインシークエンサーを用いた自動エドマン分解
法によって行われる。The amino acid sequence of the purified protein is confirmed by the automatic Edman degradation method using a gas phase protein sequencer.

このようにして得られる遊走因子の活性成分は、その
まま本発明の免疫賦活剤若しくは創傷治療剤又はその有
効成分として用いることができる。また、更に噴霧乾
燥、凍結乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥してもよい。The active ingredient of the migration factor thus obtained can be used as it is as an immunostimulant or a wound healing agent of the present invention or an active ingredient thereof. Further, it may be dried by a method such as spray drying, freeze drying or hot air drying.

上記のごとくして得られる本因子を免疫賦活剤又は創
傷治療剤として投与する場合は、投与する対象を特に限
定しない。例えば、個々の疾病を予防あるいは治療する
ことを特異目的として用いることができる。また、投与
する方法は経口又は非経口でもよく、経口投与には舌下
投与を包含する。非経口投与には、注射、例えば皮下、
筋肉、静脈注射、点滴、座剤の他、クリーム剤等を含
む。また、その投与量は動物か人間かによって、また、
年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変え
ることができる。この場合、本発明の遊走因子の有効量
と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体の組成物
として投与される有効量は１〜1000μg/kg体重／日であ
り、１日１回から数回に分けて投与される。When the present factor obtained as described above is administered as an immunostimulant or a wound healing agent, the subject to be administered is not particularly limited. For example, it can be used for the specific purpose of preventing or treating individual diseases. The method of administration may be oral or parenteral, and oral administration includes sublingual administration. For parenteral administration, injection, eg subcutaneous,
Including muscle, intravenous injection, drip, suppository, cream, etc. Also, depending on whether the dose is animal or human,
It varies depending on the age, administration route, and administration frequency, and can be widely varied. In this case, the effective amount of the migration factor of the present invention and an effective amount administered as a composition of a suitable diluent and pharmacologically usable carrier are 1 to 1000 μg / kg body weight / day, and once a day It is administered in several divided doses.

本発明の免疫賦活剤又は創傷治療剤を経口投与する場
合、それに適用される錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カ
プセル剤等は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使
用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿
潤剤のような添加物を含有する。また、経口用液体製剤
としては、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等いず
れの状態であってもよく、また、使用する際に再溶解さ
せる乾燥生成物であってもよい。更に、その組成物は添
加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。When the immunostimulant or wound healing agent of the present invention is orally administered, the tablets, granules, fine granules, powders, capsules and the like applied to it are usually used in their composition as a binding agent generally used for formulation. It contains additives such as agents, inclusion agents, excipients, lubricants, disintegrants, and wetting agents. The liquid preparation for oral use may be in any form such as an aqueous solution for internal use, a suspension, an emulsion or a syrup, or may be a dry product to be redissolved when used. Further, the composition may contain either an additive or a preservative.

また、非経口投与の場合には、安定剤、緩衝剤、保存
剤、等張化剤等の添加剤を含有し、通常単位投与量アン
プル若しくは多投与量容器又はチューブの状態で提供さ
れる。上記の組成物は使用する際に適当な担体、例えば
発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であって
もよい。In the case of parenteral administration, additives such as a stabilizer, a buffer, a preservative, an isotonicity agent, etc. are included and usually provided in a unit dose ampoule or a multi-dose container or tube. The composition may be in powder form for reconstitution with a suitable carrier, eg, pyrogen-free, sterile water, when used.

創傷治療剤の場合は、更に本発明の蛋白質に加えて、
EGF、FGF、IGF−Ｉ、IGF−II、PDGF、トコフェロール誘
導体等の物質の１つ以上を付加的に含有させることもで
きる。In the case of a wound healing agent, in addition to the protein of the present invention,
One or more substances such as EGF, FGF, IGF-I, IGF-II, PDGF, and tocopherol derivative may be additionally contained.

図面の簡単な説明 図１は、C18逆相HPLCカラムによるHT−LCFの精製の結
果を示す図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the results of purification of HT-LCF by a C18 reverse phase HPLC column.

図２は、精製したHT−LCFのSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の結果を示す図である。FIG. 2 shows the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of purified HT-LCF.

図３は、縮重プライマー１及び２の設計図である。  FIG. 3 is a design diagram of degenerate primers 1 and 2.

図４は、Cos1細胞由来遺伝子組換え型HT−LCFのSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis of Cos1 cell-derived gene recombinant HT-LCF.

図５は、V8プロテアーゼ消化後のCos1細胞由来遺伝子
組換え型HT−LCFの逆相HPLCによる精製の結果を示す図
である。FIG. 5 is a diagram showing the results of purification of recombinant Cos1 cell-derived recombinant HT-LCF after digestion with V8 protease by reverse phase HPLC.

図６は、Cos1細胞由来遺伝子組換え型HT−LCFの質量
分析装置による解析結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing analysis results of Cos1 cell-derived gene recombinant HT-LCF by a mass spectrometer.

図７は、V8プロテアーゼ消化で得られたピークＡペプ
チドの質量分析装置による解析結果を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing the analysis results of the peak A peptide obtained by digesting V8 protease with a mass spectrometer.

図８は、Cos1細胞由来遺伝子組換え型HT−LCFの単球
又はマクロファージに対する遊走活性の結果を示す図で
ある。FIG. 8 is a diagram showing the results of migration activity of Cos1 cell-derived gene recombinant HT-LCF on monocytes or macrophages.

図９は、Cos1細胞由来遺伝子組換え型HT−LCFの好中
球に対する遊走活性の結果を示す図である。FIG. 9 is a diagram showing the results of the migration activity of Cos1 cell-derived gene recombinant HT-LCF on neutrophils.

図10は、PCRに用いたプライマーを示す図である。  FIG. 10 is a diagram showing the primers used for PCR.

図11は、大腸菌由来遺伝子組換え型HT−LCFのヒト単
球に対する遊走活性の結果を示す図である。FIG. 11 is a graph showing the results of the migration activity of Escherichia coli-derived recombinant HT-LCF on human monocytes.

発明を実施するための最良の形態 以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術的範
囲が制限されるものではない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.

〔実施例１〕 HT−LCFの単球又はマクロファージ遊走
活性の測定法。[Example 1] A method for measuring the monocyte or macrophage migration activity of HT-LCF.

ヒト単核球は以下のようにしてヒト末梢血より調製し
た。血液100mlにPBS（リン酸緩衝生理食塩水）100mlを
混合し、Ficoll−Paque（登録商標;Pharmacia LKB Biot
echnology Inc.製、以下「ファルマシア社製」とする）
17mlに対し、希釈血液33mlの割合で、両者が混じり合わ
ないように静かに重層し、1,700rpmで20分間、室温で遠
心分離した。Human mononuclear cells were prepared from human peripheral blood as follows. 100 ml of blood was mixed with 100 ml of PBS (phosphate buffered saline), and Ficoll-Paque (registered trademark; Pharmacia LKB Biot
echnology Inc., hereinafter "Pharmacia")
33 ml of diluted blood was gently layered on 17 ml so as not to mix them, and centrifuged at 1,700 rpm for 20 minutes at room temperature.

浮遊している単核球層を回収し、RPMI1640培地（LIFE
TECHNOLOGIES,Inc.製、以下「ギブコ社製」とする）に
拡散させ、1,700rpm,室温で10分間遠心分離処理を行っ
た。沈澱をRPMI1640培地に拡散させ、更に1,200rpm,室
温で３分間の遠心を行った。得られた沈澱を単球が1ml
あたり100〜150万個の濃度になるようにRPMI1640培地に
懸濁した。その細胞浮遊液50μｌを48穴マイクロケモタ
キシスチャンバー（ニューロプローブ社製）の上室に入
れ、下室にはHT−LCFを含むと考えられる検体を25μｌ
入れた。フィルターはポリカーボネート製で５μｍの小
孔を持つものを用いた。この装置をCO₂インキュベータ
ー内にて、37℃で３時間インキュベーションした。イン
キュベーション後上室の液を除き、フィルターの上室側
をスクレイパーでこすり上室側に付着している細胞を除
いた。フィルターを風乾後にディフクイック染色液（ミ
ドリ十字社製）を用いて染色し、強拡大対物レンズ（×
40）を用いて無作為に選択した５視野の全細胞数を数え
た。また、下室側にこぼれ落ちた細胞も数えた。The floating mononuclear cell layer was collected, and RPMI1640 medium (LIFE
TECHNOLOGIES, Inc., hereinafter referred to as "Gibco"), and subjected to centrifugation at 1,700 rpm at room temperature for 10 minutes. The precipitate was dispersed in RPMI1640 medium and further centrifuged at 1,200 rpm and room temperature for 3 minutes. 1 ml of monocytes was added to the resulting precipitate.
The cells were suspended in RPMI1640 medium to a concentration of 1 to 1.5 million. 50 μl of the cell suspension was placed in the upper chamber of a 48-well micro chemotaxis chamber (manufactured by Neuroprobe), and the lower chamber contained 25 μl of a sample considered to contain HT-LCF.
I put it in. The filter used was made of polycarbonate and had small pores of 5 μm. This device was incubated at 37 ° C. for 3 hours in a CO ₂ incubator. After the incubation, the liquid in the upper chamber was removed, and the upper chamber side of the filter was scraped with a scraper to remove cells attached to the upper chamber side. The filter was air-dried and then stained with Diffquick stain (Midori Cross), and the high-magnification objective lens (×
40) was used to count the total number of cells in 5 fields selected randomly. The number of cells spilled to the lower chamber was also counted.

〔実施例２〕 HT−1376細胞の培養液からのHT−LCFの
精製 天然型HT−LCFは、ヒト膀胱移行上皮癌由来の細胞株H
T−1376細胞（ATCC CRL−1472）の培養液より精製し
た。この細胞の細胞学的性状はRasheedらによって報告
されている（J.Natl.Cancer Inst.,58,881−890,197
7）。[Example 2] Purification of HT-LCF from a culture solution of HT-1376 cells Native HT-LCF is a human bladder transitional cell carcinoma-derived cell line H.
It was purified from the culture medium of T-1376 cells (ATCC CRL-1472). The cytological properties of this cell have been reported by Rasheed et al. (J. Natl. Cancer Inst., 58, 881-890, 197).
7).

HT−1376細胞の培養は、通常の動物細胞を培養する培
地中で行った。すなわち、DMEM培地（ダルベッコ改変イ
ーグル最小必須培地；ギブコ社製）を用い、通常の培養
にはこの培地に５％ウシ胎児血清（ギブコ社製）を含有
させたものを使用した。培養は、CO₂インキュベーター
を用い、５％のCO₂濃度及び37℃の温度の条件で行っ
た。Culturing of HT-1376 cells was performed in a medium for culturing ordinary animal cells. That is, DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium; manufactured by Gibco) was used, and for normal culture, a medium containing 5% fetal calf serum (manufactured by Gibco) was used. Culturing was performed using a CO ₂ incubator under the conditions of a CO ₂ concentration of 5% and a temperature of 37 ° C.

HT−1376細胞よりHT−LCFを産生させるために次の通
り行った。The procedure for producing HT-LCF from HT-1376 cells was performed as follows.

ウシ胎児血清５％を含むDMEM培地を用いてHT−1376細
胞を３×10⁵個/mlの濃度で、直径10cmのシャーレに14ml
ずつまき、５％CO₂濃度で37℃で３日間培養した。次に
培地をLPS（10μg/ml:SIGMA Chemical Company製、以下
「シグマ社製」とする;No.L−3254）およびウシ胎児血
清（１％）を含む培地に代えて更に２日間、同じ条件で
培養した。HT-1376 cells at a concentration of 3 × 10 ⁵ cells / ml in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum, 14 ml in a petri dish with a diameter of 10 cm.
Each of them was sprinkled and cultured at 5% CO ₂ concentration at 37 ° C. for 3 days. Then, the medium was replaced with a medium containing LPS (10 μg / ml: SIGMA Chemical Company, hereinafter “Sigma”; No. L-3254) and fetal calf serum (1%) for another 2 days under the same conditions. It was cultured in.

このようにして得られた培養液30リットルに対し80％
飽和硫酸アンモニウムによる塩析を行った。沈澱した蛋
白質を蒸留水に溶解させ、蒸留水に対して透析（４℃,2
日間）を行った後、更にNaClを0.05M含む0.05Mトリス−
HCl（pH7.0）緩衝液に対して透析（４℃,30時間）し
た。同じ緩衝液で平衡化したCM−Sephadex（登録商標）
Ｃ−25カラム（2.5×20cm;ファルマシア社製）に透析し
た試料110mlを通し、洗浄後塩濃度を0.8Mの濃度まで直
線的に上昇させることにより蛋白質を溶出させた。遊走
因子の活性が含まれる画分を集め、アミコンダイアフロ
ーメンブレン（YM−５）を用いて限外ろ過を行い、2ml
まで９倍に濃縮した。80% for 30 liters of the culture thus obtained
Salting out with saturated ammonium sulfate was performed. The precipitated protein is dissolved in distilled water and dialyzed against distilled water (4 ℃, 2
For 0.05 days, and then 0.05 M Tris-containing 0.05 M NaCl.
It was dialyzed against HCl (pH 7.0) buffer (4 ° C., 30 hours). CM-Sephadex® equilibrated with the same buffer
The protein was eluted by passing 110 ml of the dialyzed sample through a C-25 column (2.5 × 20 cm; manufactured by Pharmacia) and linearly increasing the salt concentration to 0.8 M after washing. Fractions containing the activity of migration factor were collected and ultrafiltered using Amicon Diaflow Membrane (YM-5) to give 2 ml.
Up to 9 times.

次にSephadex（登録商標）Ｇ−75（ファルマシア社
製）を充填したカラムを用いたゲルろ過を行った。緩衝
液としてはPBSを用いた。分子量6,000〜20,000の蛋白質
が溶出する位置に回収される活性画分を集め、蒸留水に
対して透析（４℃,30時間）した。凍結乾燥させたの
ち、試料をTSK ODS 120T C18逆相HPLCカラム（トーソー
社製;4.6×200mm）を用いて最終精製を行った。溶離液
Ａとして0.05％トリフルオロ酢酸（TFA）溶液、溶離液
Ｂとして0.05％TFAを含有する80％アセトニトリル溶液
を用い、60分間に０％から50％までアセトニトリル濃度
を直線的に増加させ蛋白質を溶出させた。溶出液は220n
mの波長を用いてモニターした。流速は0.8ml/分で行っ
た。溶出する蛋白質をピークごとに分画し、得られた分
画を実施例１の方法に基づき測定した結果、単核球の遊
走を誘導する活性を示す近接する４つのピーク（A,B,C,
D）を得た（図１）。Next, gel filtration was performed using a column packed with Sephadex (registered trademark) G-75 (manufactured by Pharmacia). PBS was used as the buffer. The active fractions collected at the position where proteins having a molecular weight of 6,000 to 20,000 were eluted were collected and dialyzed against distilled water (4 ° C., 30 hours). After freeze-drying, the sample was finally purified using a TSK ODS 120T C18 reverse-phase HPLC column (manufactured by Tosoh Corporation; 4.6 × 200 mm). Using 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) solution as eluent A and 80% acetonitrile solution containing 0.05% TFA as eluent B, linearly increase the acetonitrile concentration from 0% to 50% in 60 minutes to increase the protein content. It was eluted. 220n eluate
It was monitored using a wavelength of m. The flow rate was 0.8 ml / min. The eluted protein was fractionated for each peak, and the obtained fractions were measured according to the method of Example 1, and as a result, four adjacent peaks (A, B, C) showing the activity of inducing migration of mononuclear cells were detected. ,
D) was obtained (Fig. 1).

〔実施例３〕 HT−1376細胞の培養液から精製したHT−
LCFのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 0.1％のSDSを含有する分離用ゲル（17.5％アクリルア
ミド）を用いて、実施例２で得られた試料について電気
泳動を行った。ゲル中の緩衝液として0.1％SDSを含む37
5mMトリス−HCl（pH8.8）緩衝液、泳動槽中の緩衝液と
して25mMトリス−200mMグリシン（pH6.8）緩衝液を用い
た。15mAの定電流で１時間泳動した後に、ゲル中の蛋白
質を銀染色キット（バイオラッド社製）で染色した。[Example 3] HT- purified from a culture solution of HT-1376 cells
SDS polyacrylamide gel electrophoresis of LCF Electrophoresis was performed on the sample obtained in Example 2 using a separating gel (17.5% acrylamide) containing 0.1% SDS. 37 with 0.1% SDS as buffer in gel
A 5 mM Tris-HCl (pH 8.8) buffer was used, and a 25 mM Tris-200 mM glycine (pH 6.8) buffer was used as a buffer in the electrophoresis tank. After running for 1 hour at a constant current of 15 mA, the proteins in the gel were stained with a silver staining kit (Bio-Rad).

結果を図２に示す。標準分子量マーカーの分子量（kD
a）を左側に記載した。レーン上段のM.W.Std.は標準分
子量マーカー、A,B,C,DはHPLCで溶出された４つのピー
クフラクションにそれぞれ対応する。標準分子量マーカ
ーとの相対的位置から算定した結果、４つのピークとも
分子量12,000〜15,000の位置に蛋白質バンドが観察され
た。The results are shown in Figure 2. Standard molecular weight marker molecular weight (kD
a) is described on the left side. MW Std. In the upper lane corresponds to the standard molecular weight marker, and A, B, C, and D correspond to the four peak fractions eluted by HPLC, respectively. As a result of calculation from the relative position with respect to the standard molecular weight marker, a protein band was observed at the molecular weights of 12,000 to 15,000 in all four peaks.

〔実施例４〕 HT−1376細胞の培養液から精製したHT−
LCFのアミノ酸配列の決定 精製したHT−LCF約20μｇを0.5μｇのリシルエンドペ
プチダーゼ（シグマ社製）とともに0.05Mトリス−HCl
（pH8.5）緩衝液（100μｌ）中で、水浴を用いて37℃20
時間のインキュベーションを行った。エバポレーターに
よって乾燥後、TSK ODS 120T C18逆相HPLCカラムを用い
て部分ペプチドを分離した。逆相クロマトグラフィー
は、実施例２の逆相クロマトグラフィーと径が24mmの大
口径のカラムを使用したことを除いて同一条件で行っ
た。精製したHT−LCFおよび部分ペプチドのアミノ酸配
列を（株）島津製作所社製PSQ−１気相プロテインシー
クエンサーを用いて自動エドマン分解を行った。その結
果、以下に示すようなアミノ酸配列が決定された。[Example 4] HT-purified from a culture solution of HT-1376 cells
Determination of amino acid sequence of LCF About 20 μg of purified HT-LCF was added together with 0.5 μg of lysyl endopeptidase (Sigma) to 0.05 M Tris-HCl.
(PH8.5) buffer (100 μl) in a water bath at 37 ℃
Incubation for hours was performed. After drying with an evaporator, partial peptides were separated using a TSK ODS 120T C18 reverse phase HPLC column. Reversed phase chromatography was performed under the same conditions as the reversed phase chromatography of Example 2 except that a large diameter column with a diameter of 24 mm was used. The purified HT-LCF and partial peptide amino acid sequences were subjected to automatic Edman degradation using PSQ-1 gas phase protein sequencer manufactured by Shimadzu Corporation. As a result, the amino acid sequence shown below was determined.

アミノ末端：配列番号No.5のアミノ酸配列 Fr.26:配列番号No.6のアミノ酸配列 Fr.32:配列番号No.7のアミノ酸配列 Fr.38:配列番号No.8のアミノ酸配列 アミノ末端：配列番号No.9のアミノ酸配列 Fr.とは逆相クロマトグラフィーにて溶出した画分
（フラクション）を表す。Amino terminus: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 Fr.26: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Fr.32: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 Fr.38: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 Amino terminus: The amino acid sequence Fr. of SEQ ID NO: 9 represents a fraction (fraction) eluted by reverse phase chromatography.

なお、アミノ末端の配列には配列番号No.9のアミノ酸
配列で示される１残基目のアラニンを欠く、システイン
から始まる配列も同時に解析された。その存在比は、ア
ラニンから始まるもの１に対して、システインから始ま
るもの３の割合であった。The amino-terminal sequence lacked alanine at the first residue shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and a sequence starting with cysteine was also analyzed. The abundance ratio was a ratio of 3 starting from cysteine to 1 starting from alanine.

〔実施例５〕 縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設
計と調製 実施例４において決定したアミノ酸配列をもとにそれ
らをコードすると考えられる塩基配列の組み合わせを予
想した。更に、それらの組み合わせのうちから、ヒトに
おいて使用頻度の高いコドンを選び、縮重プライマー１
及び２を設計した（図３）。すなわち、プライマー１
は、アミノ末端配列より20ヌクレオチド,144ミックス
を、プライマー２は、Fr.38配列より17ヌクレオチド,32
ミックスをそれぞれ設計した。ヒトにおけるコドンの使
用頻度はWadaら、Nucleic Acids Res.,18,2367−2411,1
990を参照した。[Example 5] Design and preparation of degenerate oligonucleotide primer Based on the amino acid sequences determined in Example 4, a combination of nucleotide sequences considered to encode them was predicted. Furthermore, from among these combinations, codons that are frequently used in humans are selected, and degenerate primer 1 is used.
And 2 were designed (Fig. 3). That is, primer 1
Is 20 nucleotides from amino terminal sequence, 144 mix, and primer 2 is 17 nucleotides from Fr.38 sequence, 32 mix
Each mix was designed. The frequency of codon usage in humans is Wada et al., Nucleic Acids Res., 18, 2367-2411, 1
See 990.

設計したプライマーはアプライドバイオシステムズ社
（ABI）製DNA自動合成機型式380Bを用いて合成し、同社
製の合成DNA精製用OPCカラムを使用して精製した。合成
並びに精製は説明書に従って行った。精製したDNAはTE
バッファー（10mMトリス,1mM EDTA,pH7.4）に50μＭと
なるように溶かし、使用時まで−20℃に凍結保存した。The designed primers were synthesized using an automatic DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems (ABI) and purified using an OPC column for synthetic DNA purification manufactured by the same. Synthesis and purification were performed according to the instructions. The purified DNA is TE
It was dissolved in a buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4) so as to have a concentration of 50 µM, and stored frozen at -20 ° C until use.

〔実施例６〕 HT−1376細胞からのmRNAの調製とcDNAへ
の変換 HT−1376細胞は５％のウシ胎児血清を含むDMEM培地中
で培養した。[Example 6] Preparation of mRNA from HT-1376 cells and conversion into cDNA HT-1376 cells were cultured in DMEM medium containing 5% fetal bovine serum.

細胞が培養フラスコ〔FALCON（登録商標）フラスコ，
培養面積175cm²,No.3028;Becton Dickinso（ベクトン
ディッキンソン）社製〕の培養面積を全ておおうまで培
養（48時間）後、LPSを最終濃度10μg/mlとなるように
加え12時間培養した。培養後培地を取り除き、得られた
細胞約５×10⁸個をPBSで一回洗浄した後、Chomczynski
らのAGPC法（Acid Guanidium Phenol Chroloform Metho
d:Anal.Biochem.,162:156−159,1987）で全RNAを抽出し
た。When the cells are in a culture flask [FALCON (registered trademark) flask,
Culture area 175 cm ² , No.3028; Becton Dickinso (Becton
(Manufactured by Dickinson) was cultivated to cover the entire culture area (48 hours), and then LPS was added to a final concentration of 10 μg / ml and cultivated for 12 hours. After culturing, the medium was removed, and about 5 × 10 ⁸ cells thus obtained were washed once with PBS, and then Chomczynski
AGPC method (Acid Guanidium Phenol Chroloform Metho
d: Anal.Biochem., 162: 156-159, 1987), and total RNA was extracted.

約５×10⁸個の細胞に40mlの変性溶液（4Mグアニジン
チオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、0.5％サル
コシル、0.1M 2−メルカプトエタノール、pH7.0）を加
えて細胞を溶解させた後、4mlの2M酢酸ナトリウム、40m
lの水飽和フェノール、8mlのクロロホルムを加えて攪拌
した。氷中に15分静置後10,000×ｇ、20分間４℃で遠心
し、その後水相を回収し、40mlのイソプロパノールを加
えて−20℃に１時間静置した。10,000×ｇ、20分間４℃
で遠心後上清を捨て、ペレットを5mlの変性溶液に溶か
し、5mlのイソプロパノールを加えて−20℃に１時間静
置した。10,000×ｇ、20分間４℃で遠心後、75％のエタ
ノールでペレットをリンスした後自然乾燥させ、1mlのT
Eバッファーに溶解させた。このようにして得られたRNA
量は約5mgであった。このRNAのうち１μｇを用いてcDNA
を合成した。cDNAの合成には、200μＭのdNTP（dATP,dC
TP,dGTP,dTTPから成る４種デオキシヌクレオシド三リン
酸；宝酒造社製）、20ユニットのRNアーゼ阻害剤（ベー
リンガーマンハイムヤマノウチ社製）、１μＭのランダ
ムプライマー（宝酒造社製）、200ユニットの逆転写酵
素（MMLV由来、BRL社製）を使用し（反応液量20μ
ｌ）、37℃で90分間保温後70℃で10分間加熱して酵素を
失活させ、−20℃で使用時まで凍結保存した。To about 5 × 10 ⁸ cells, 40 ml of denaturing solution (4M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0.5% sarcosyl, 0.1M 2-mercaptoethanol, pH 7.0) was added to lyse the cells, and then 4 ml 2M sodium acetate, 40m
l of water-saturated phenol and 8 ml of chloroform were added and stirred. The mixture was allowed to stand in ice for 15 minutes, then centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes at 4 ° C, then the aqueous phase was recovered, 40 ml of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at -20 ° C for 1 hour. 10,000 xg, 4 minutes for 20 minutes
After centrifuging with, the supernatant was discarded, the pellet was dissolved in 5 ml of denaturing solution, 5 ml of isopropanol was added, and the mixture was allowed to stand at -20 ° C for 1 hour. Centrifuge at 10,000 xg for 20 minutes at 4 ° C, rinse the pellet with 75% ethanol, and allow to air dry, then add 1 ml of T
It was dissolved in E buffer. RNA thus obtained
The amount was about 5 mg. 1 μg of this RNA is used to produce cDNA
Was synthesized. For cDNA synthesis, 200 μM dNTP (dATP, dC
4 kinds of deoxynucleoside triphosphates consisting of TP, dGTP, dTTP; manufactured by Takara Shuzo, 20 units of RNase inhibitor (Boehringer Mannheim Yamanouchi), 1 μM random primer (Takara Shuzo), 200 units reverse transcription Use enzyme (MMLV origin, BRL) (reaction volume 20μ
l), the mixture was kept at 37 ° C for 90 minutes, heated at 70 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme, and stored frozen at -20 ° C until use.

〔実施例７〕 HT−1376細胞cDNAを鋳型とするPCRの実
施 実施例６で合成したcDNA1μｌを鋳型としてPCRを実施
した。プライマーには実施例５で設計したオリゴマーを
終濃度各２μＭで使用した。反応系は100μｌで行い、
上記の他に200μMdNTP、AmpliTaq（登録商標）DNAポリ
メラーゼ用反応バッファー〔10mMトリス−HCl（pH8.
3）,50mM KCl,1.5mM MgCl₂,0.001％ゼラチンを含有〕、
AmpliTaqDNAポリメラーゼ10ユニットを加えた〔これら
はPerkin−Elmer Cetus Instruments社製（以下「パー
キンエルマーシータス社製」とする）のGeneAmp（登録
商標）PCR リージェントキット（Reagent Kit）を使用
した〕。[Example 7] PCR using HT-1376 cell cDNA as a template PCR was performed using 1 µl of the cDNA synthesized in Example 6 as a template. The oligomer used in Example 5 was used as a primer at a final concentration of 2 μM each. The reaction system is 100 μl,
In addition to the above, 200 μM dNTP, reaction buffer for AmpliTaq (registered trademark) DNA polymerase (10 mM Tris-HCl (pH 8.
3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl ₂ , containing 0.001% gelatin],
10 units of AmpliTaq DNA polymerase were added (these were used GeneAmp (registered trademark) PCR Regent Kit (Reagent Kit) manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instruments (hereinafter referred to as “Perkin-Elmer Cetus”)).

反応は、順に92℃１分間、40℃１分間、72℃２分間の
条件を１サイクルとしてこれを30サイクル、DNA サー
マルサイクラー（Thermal Cycler;パーキンエルマーシ
ータス社製）を用いて行った。The reaction was carried out by sequentially using a condition of 92 ° C. for 1 minute, 40 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes as one cycle, and 30 cycles of this using a DNA thermal cycler (Thermal Cycler; manufactured by Perkin Elmer Cetus).

〔実施例８〕 PCR断片のベクターへのサブクローニン
グと塩基配列の決定 実施例７で行ったPCR反応液100μｌのうち10μｌを２
％のアガロースゲル中で電気泳動後エチジウムブロマイ
ドによってDNAを染色した結果、170塩基対（以下、「塩
基対」を「bp」とする）位のDNA断片が観察された。そ
こで、この反応液を等量のクロロホルムで一回抽出後、
5M NaCl 20分の１量及び２倍量のエタノールを加えてDN
Aを沈澱させた。このDNAを50mMトリス緩衝液（pH7.
6）、10mM塩化マグネシウム、10mM ２−メルカプトエ
タノール、100μＭ ATPの組成を持つ溶液20μｌに溶か
し、10UのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）
を加えた後37℃で30分間反応させた。70℃10分間加熱
後、終濃度が各250μＭとなるようにdNTPを加え、更に5
UのT4DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を加えて37℃30分
間反応させた。70℃10分間加熱後、等量の水飽和フェノ
ールで１回抽出した後エタノール沈澱によってDNAを回
収した。回収したDNAを20μｌのTEバッファーに溶か
し、うち２μｌを10ngの平滑末端を持つクローニングベ
クター（制限酵素Sma Iで消化したpUC13:ファルマシア
社製）とライゲイション（宝酒造社製DNA Ligation Ki
t:Nucleic Acids Res.,14,7617−7631,1986;を説明書通
りに使用した）した後、10分の１量を大腸菌コンピテン
トセルJM109（Gene,33,103−119,1985,ATCC No.53323;
宝酒造社製）の説明書に従って導入後、抗生物質アンピ
シリン（100μg/ml）を含む寒天培地上で16時間培養
し、コロニーを生育させた。これらのコロニーからラン
ダムに３個を選び培養（16時間,37℃）後、プラスミドD
NAをアルカリSDS法（Nucleic Acids Res.,7,1513−152
3,1979）で抽出し、その塩基配列を³²Pで放射標識を行
うジデオキシ法で決定した（Sangerら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,74,5463−5467,1977）。プライマーには宝酒
造社製の正方向（M4）並びに逆方向（RV）プライマーを
利用した。その結果３個のプラスミドの配列は一致し、
両末端にPCRに用いたプライマーの配列を持ち、内部に
精製した蛋白質から決定したアミノ酸配列に対応する塩
基配列が確認された。[Example 8] Subcloning of PCR fragment into vector and determination of nucleotide sequence 10 µl of 100 µl of the PCR reaction solution obtained in Example 7
As a result of electrophoresing in 100% agarose gel and staining the DNA with ethidium bromide, a DNA fragment at 170 base pairs (hereinafter, “bp” is referred to as “bp”) was observed. Therefore, after extracting this reaction solution once with an equal volume of chloroform,
DN by adding 1/20 and 5 times amount of 5M NaCl ethanol
A was allowed to settle. This DNA was added to 50 mM Tris buffer (pH 7.
6), 10 mM magnesium chloride, 10 mM 2-mercaptoethanol, dissolved in 20 μl of a solution having a composition of 100 μM ATP, and 10 U of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo)
After adding, the mixture was reacted at 37 ° C for 30 minutes. After heating at 70 ℃ for 10 minutes, add dNTPs to a final concentration of 250 μM each, and add 5 more
U T4 DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo) was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes. After heating at 70 ° C. for 10 minutes, extraction was performed once with an equal amount of water-saturated phenol, and then DNA was recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA was dissolved in 20 μl of TE buffer, and 2 μl of this was cloned with 10 ng of blunt-ended cloning vector (pUC13 digested with restriction enzyme Sma I: Pharmacia) and ligation (Takara Shuzo DNA Ligation Ki).
t: Nucleic Acids Res., 14,7617-7631,1986; was used as instructed), and 1/10 amount of E. coli competent cell JM109 (Gene, 33, 103-119, 1985, ATCC No. 53323 was used. ;
After introduction according to the instruction of Takara Shuzo Co., Ltd., the cells were cultured on an agar medium containing the antibiotic ampicillin (100 μg / ml) for 16 hours to grow colonies. After randomly selecting 3 from these colonies and culturing (16 hours, 37 ° C), plasmid D
NA for alkaline SDS method (Nucleic Acids Res., 7, 1513-152
3, 1979) and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method with ³² P radiolabelling (Sanger et al., Proc. Natl. Aca.
d. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977). As the primer, the forward (M4) and reverse (RV) primers manufactured by Takara Shuzo were used. As a result, the sequences of the three plasmids matched,
The nucleotide sequences corresponding to the amino acid sequences determined from the purified protein were confirmed with the sequences of the primers used for PCR at both ends.

結果を配列番号No.4に示す。  The results are shown in SEQ ID NO: 4.

アミノ酸配列に対応する塩基配列部分は、配列表中、
配列番号No.4のアミノ酸配列番号の第１〜８番目、第41
〜47番目、及び第50〜55番目であった。The base sequence portion corresponding to the amino acid sequence is
1st to 8th and 41st of the amino acid sequence number of SEQ ID NO: 4
~ 47th, and 50th to 55th.

従って、ここでサブクローニングされたDNA断片はHT
−LCFcDNAの一部をコードするDNA断片であると考えられ
た。そこで、このDNA断片をcDNAのスクリーニング用の
プローブとして用いることとし、プラスミドDNAを大量
に調製した。調製したDNAはTEバッファーに溶解後、制
限酵素EcoR I並びにBamH Iで消化し、２％のSea Plaque
Agarose（宝酒造社製；登録商標）で泳動後、切断され
た約170bpの断片を切り出し、65℃10分間加熱しゲルを
溶解後、等量の水飽和フェノールで３回抽出後エタノー
ル沈澱を行って精製し、実施例10でのスクリーニングの
ためのプローブとして使用した。Therefore, the DNA fragment subcloned here is HT
-It was considered to be a DNA fragment encoding a part of LCF cDNA. Therefore, this DNA fragment was used as a probe for screening cDNA, and a large amount of plasmid DNA was prepared. The prepared DNA was dissolved in TE buffer, digested with restriction enzymes EcoR I and BamH I, and digested with 2% Sea Plaque.
After running on Agarose (Takara Shuzo; registered trademark), the cleaved fragment of about 170 bp was cut out, heated at 65 ° C. for 10 minutes to dissolve the gel, and extracted with an equal amount of water-saturated phenol three times, followed by ethanol precipitation. Purified and used as a probe for screening in Example 10.

〔実施例９〕 HT−1376細胞cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリー作製のためのmRNA調製の材料として
は、LPS処理後12時間目のHT−1376細胞を使用した。こ
の細胞約５×10⁸個よりAGPC法により全RNAを抽出した。
このRNA500μｇを500μｌのTEバッファーに溶解後、Oli
gotex−dT30（登録商標；宝酒造社製;Nucleic Acids Re
s.Sympo.ser.no.19,61−64,1988）を用いてポリA⁺RNAを
精製した（方法は説明書に従った）。精製したポリA⁺RN
A5μｇを使用してcDNAを合成した。プライマーにはオリ
ゴdTを用い、cDNA合成システムプラス（アマーシャム社
製;Gene,25,263−269,1983）を使用してcDNAを合成し
た。合成したcDNAは平滑末端とした後、制限酵素EcoR I
及びNot Iの配列を含むアダプター（ファルマシア社
製）を付加した。アダプターを付加したcDNAは末端を燐
酸化した後、EcoR I消化したファージベクターλZAP II
アーム（ストラタジーン社製；登録商標）に導入しパッ
ケージング後〔GIGAPACK（登録商標）II ゴールドを説
明書通りに使用；ストラタジーン社製〕、宿主菌XL−1B
lue株（ストラタジーン社製;Biotechniques,5,376,198
7）に形質導入し、ファージプラークを形成させ、５×1
0⁵個のcDNAライブラリーを作製した。[Example 9] Preparation of HT-1376 cell cDNA library HT-1376 cells 12 hours after LPS treatment were used as a material for preparing mRNA for preparing a cDNA library. Total RNA was extracted from about 5 × 10 ⁸ cells by the AGPC method.
After dissolving 500 μg of this RNA in 500 μl of TE buffer,
gotex-dT30 (registered trademark; manufactured by Takara Shuzo; Nucleic Acids Re
s.Sympo.ser.no.19, 61-64, 1988) was used to purify poly A ⁺ RNA (method was according to the instruction). Purified poly A ⁺ RN
CDNA was synthesized using 5 μg of A. Oligo dT was used as a primer, and cDNA was synthesized using a cDNA synthesis system plus (manufactured by Amersham; Gene, 25, 263-269, 1983). The synthesized cDNA was blunt-ended and then the restriction enzyme EcoRI
And an adapter (Pharmacia) containing Not I sequences were added. The cDNA with the adapter added was phosphorylated at the ends and then digested with EcoR I. The phage vector λZAP II
After introducing into an arm (Stratagene; registered trademark) and packaging [GIGAPACK (registered trademark) II Gold according to instructions; Stratagene], host strain XL-1B
lue strain (Stratagene; Biotechniques, 5,376,198
7) transduced to form phage plaques, 5 x 1
A cDNA library of 0 ⁵ was prepared.

〔実施例10〕 PCR断片をプローブとするcDNAライブラ
リーのスクリーニング 実施例９で作製したcDNAライブラリーを直径15cmのペ
トリ皿中の寒天培地上に約２万個となるようにまき、37
℃で培養し，プラークが確認できるようになるまで成長
させた。上記プレートを10枚調製後、ナイロンフィルタ
ー（Colony/Plaque Screen:デュポン社製；登録商標）
へ転写した。転写したフィルターは1.5M NaCl,0.5M NaO
Hの溶液中に２分間、1.5M NaCl,0.5Mトリス−HCl（pH8.
0）溶液中に５分間、0.2Mトリス−HCl（pH7.5）,2×SSC
溶液〔SSCとは0.15M NaCl,0.15Mクエン酸ナトリウムを
含む水溶液（pH7.0）をいう。２×SSCとはその２倍の濃
度のものをいう。〕中に30秒間順次浸漬したのち、真空
オーブン中で80℃２時間加熱した。これらのフィルター
をハイブリッド溶液〔0.8M NaCl,20mMピペス（pH6.5）,
50％ホルムアミド、0.5％SDS,及び100μg/mlサケ***由
来DNA〕中で42℃２時間保温後、ランダムプライマーDNA
ラベリングキット（登録商標；宝酒造社製;Anal.Bioche
m.,132,6−13,1983）を用いて³²PラベルしたDNAプロー
ブ（実施例８参照）10⁷cpmを含むハイブリッド溶液中で
42℃20時間保温した。その後２×SSC,0.1％SDSを含む溶
液中で42℃15分間の洗いを２回行った。フィルターを増
強スクリーン及びイーストマン コダック カンパニー
（EASTMAN KODAK COMPANY）製 Ｘ−OMAT（登録商標）A
Rフィルムにより−70℃16時間オートラジオグラフィー
に付した。このオートラジオグラフの結果23個の陽性シ
グナルが得られた。陽性シグナルを含む領域をマスター
プレートから拾い上げ二次スクリーニングに移った。二
次スクリーニングの条件は一次スクリーニングのものと
同一であった。その結果、３個の強いシグナルが得られ
た。これらのクローンは同一の制限酵素パターンを示し
たが、長さが一部異なっていた。最長の長さを持つクロ
ーンを塩基配列決定のために選択した。[Example 10] Screening of cDNA library using PCR fragment as a probe The cDNA library prepared in Example 9 was spread on an agar medium in a Petri dish having a diameter of 15 cm to give about 20,000 cells, and 37
The cells were cultured at 0 ° C and grown until plaques were visible. After preparing the above 10 plates, nylon filter (Colony / Plaque Screen: DuPont; registered trademark)
Transferred to. Transferred filter is 1.5M NaCl, 0.5M NaO
1.5M NaCl, 0.5M Tris-HCl (pH 8.
0) In solution for 5 minutes, 0.2M Tris-HCl (pH7.5), 2xSSC
Solution [SSC refers to an aqueous solution (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl and 0.15 M sodium citrate. 2 × SSC means a double concentration. ] It was immersed in the solution for 30 seconds, and then heated in a vacuum oven at 80 ° C. for 2 hours. Apply these filters to a hybrid solution [0.8M NaCl, 20mM pipes (pH6.5),
50% formamide, 0.5% SDS, and 100 μg / ml salmon sperm-derived DNA] at 42 ° C for 2 hours, then random primer DNA
Labeling kit (registered trademark; manufactured by Takara Shuzo; Anal.Bioche
m., 132, 6-13, 1983) in a hybrid solution containing 10 ⁷ cpm of ³² P-labeled DNA probe (see Example 8).
The temperature was kept at 42 ° C for 20 hours. After that, washing was carried out twice at 42 ° C. for 15 minutes in a solution containing 2 × SSC and 0.1% SDS. Enhance filter and screen X-OMAT (registered trademark) A from Eastman KODAK COMPANY
R film was subjected to autoradiography at -70 ° C for 16 hours. As a result of this autoradiograph, 23 positive signals were obtained. Areas containing positive signals were picked up from the master plate for secondary screening. The conditions for the secondary screen were the same as those for the primary screen. As a result, three strong signals were obtained. These clones showed the same restriction enzyme pattern but partly different lengths. The clone with the longest length was selected for sequencing.

〔実施例11〕 HT−LCFcDNAの塩基配列 実施例10で得たファージクローンを大量に培養し、Sa
mbrookらのMolecular Cloning,2nd.edition,2.60−2.8
0,1989の方法でファージDNAを調製した。このDNAを制限
酵素Not Iで消化したところ、cDNA内部にはNot Iの認識
配列は存在せず、Not I消化によってcDNA断片がそのま
ま切り出されることが明らかとなった。そこで、この約
3.5kbpのcDNA断片のみを回収しプラスミドベクターpBlu
escript II（登録商標；ストラタジーン社製）のNot I
部位に導入した。Example 11 Nucleotide sequence of HT-LCF cDNA The phage clone obtained in Example 10 was cultivated in a large amount, and Sa
Mbrook et al. Molecular Cloning, 2nd.edition, 2.60−2.8
Phage DNA was prepared by the method of 0,1989. When this DNA was digested with the restriction enzyme Not I, it was revealed that there is no Not I recognition sequence inside the cDNA and the cDNA fragment is excised as it is by Not I digestion. So about this
Only the 3.5 kbp cDNA fragment was recovered and plasmid vector pBlu
Not I of escript II (registered trademark; Stratagene)
Introduced into the site.

³²Pを用いたジデオキシ法により、サブクローニング
したDNA断片の両末端より塩基配列の解析を行った。更
に内部の配列決定は解析した部分の配列をもとに合成し
たプライマーを使用して同様にジデオキシ法で決定し
た。DNAの相補鎖の配列を比較する事で解析した塩基配
列の確認を兼ねた。 ^The nucleotide sequence was analyzed from both ends of the subcloned DNA fragment by the dideoxy method using ³² P. Further, the internal sequence was determined by the dideoxy method similarly using a primer synthesized based on the analyzed sequence. It also served as confirmation of the base sequence analyzed by comparing the sequences of complementary strands of DNA.

その結果、サブクローニングしたcDNA断片約3,500dp
の全塩基配列が決定された。As a result, the subcloned cDNA fragment was approximately 3,500 dp.
The whole nucleotide sequence of

結果を配列番号No.3に示す。  The results are shown in SEQ ID NO: 3.

このcDNA断片は唯一の長いオープンリーディングフレ
ームをコードしており、コードされるアミノ酸配列もあ
わせて配列表の配列番号No.3に示した。This cDNA fragment encodes the only long open reading frame, and the encoded amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.

精製されたペプチドのアミノ酸配列に対応する部分
は、配列表中のアミノ酸配列番号の第１〜21番目、第54
〜60番目、第63〜69番目、第78,79,81〜84番目、及び第
86〜87番目であった。The portion corresponding to the amino acid sequence of the purified peptide is the 1st to 21st and 54th amino acid sequence numbers in the sequence listing.
~ 60th, 63rd-69th, 78th, 79th, 81-84th, and
It was 86th to 87th.

実施例４で決定したアミノ酸配列は全てcDNAから予想
される配列に含まれており、ここで得られたcDNAクロー
ンは目的のものである事が確認された。また、プローブ
として用いたPCR断片はクローニングされたcDNAの196〜
362塩基目にあたることが確認された。All the amino acid sequences determined in Example 4 were included in the sequence predicted from the cDNA, and it was confirmed that the cDNA clone obtained here was the desired one. In addition, the PCR fragment used as a probe was cloned cDNA of 196-
It was confirmed that it corresponds to the 362nd base.

〔実施例12〕 Cos1細胞でのHT−LCFの発現 動物細胞での高効率発現ベクターpcDL−SRα296（武
部ら,Mol.Cell.Biol.,8,466−472,1988,;以下「SRα」
とする）にクローニングしたcDNA全体を導入した。制限
酵素Not Iで切り出されるcDNA断片をSRαに導入するた
めに、SRαのPst I部位にNot Iリンカー（5'GCGGCCGCTG
CA3':ABI社製DNA自動合成機にて合成）をつなぎこん
だ。このNot I部位に同制限酵素で消化したcDNA断片を
導入し、プロモーターの向きと同方向につながっている
プラスミドクローンを選択し、発現実験に供した。Cos1
細胞に導入するためのDNA調製は実施例８と同様に行っ
た。DNAの導入担体としてはTRANSFECTAM（登録商標;IB
F;Proc.Natl.Acac.Sci.,USA,86,6982−6986,1989）を説
明書通りに使用した。すなわち、直径10cmの培養皿あた
り10mlの培養液（インスリン５μg/ml,トランスフェリ
ン５μg/ml,モノエタノールアミン10μM,亜セレン酸ナ
トリウム2.5×10^-8Mを含むIMDM:イスコフ改変DMEM）を
用い、そこに10μｇのプラスミドDNAと30μｌのTRANSFE
CTAM溶液（10％エタノール水溶液）を混ぜたものを加
え、37℃で培養した。72時間後に培養液を回収し、HT−
LCF精製用のサンプルとした。この導入実験を繰り返
し、培養上清を900mlプールした。回収した上清は、1,5
00×g,10分間室温で遠心し、沈澱を除いた後−70℃で使
用するまで凍結保存した。以下、Cos1細胞の培養液から
精製した「Cos1細胞由来遺伝子組換え型HT−LCF」を「r
HT−LCF」と表すことにする。[Example 12] Expression of HT-LCF in Cos1 cells High-efficiency expression vector pcDL-SRα296 in animal cells (Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8,466-472,1988 ,; hereinafter "SRα")
The whole cDNA cloned in In order to introduce a cDNA fragment excised by the restriction enzyme Not I into SRα, the Not I linker (5'GCGGCCGCTG
CA3 ': Synthesized by ABI's automatic DNA synthesizer). A cDNA fragment digested with the same restriction enzyme was introduced into this Not I site, and a plasmid clone linked in the same direction as the promoter direction was selected and subjected to an expression experiment. Cos1
DNA preparation for introduction into cells was carried out as in Example 8. As a carrier for introducing DNA, TRANSFECTAM (registered trademark; IB
F; Proc.Natl.Acac.Sci., USA, 86,6982-6986,1989) was used according to the instructions. That is, 10 ml of culture solution (IMDM containing insulin 5 μg / ml, transferrin 5 μg / ml, monoethanolamine 10 μM, sodium selenite 2.5 × 10 ⁻⁸ M: Iscove's modified DMEM) was used per culture dish with a diameter of 10 cm. 10 μg plasmid DNA and 30 μl TRANSFE
A mixture of CTAM solution (10% ethanol aqueous solution) was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. After 72 hours, the culture solution was collected and HT-
The sample was used for LCF purification. This introduction experiment was repeated, and 900 ml of the culture supernatant was pooled. The collected supernatant is 1,5
After centrifuging at 00 xg for 10 minutes at room temperature to remove the precipitate, it was stored frozen at -70 ° C until use. Hereinafter, "Cos1 cell-derived recombinant HT-LCF" purified from the culture solution of Cos1 cells was treated with "r
HT-LCF ".

〔実施例13〕 rHT−LCFの精製 Cos1細胞の培養液約900mlをミリＱ水（脱イオン水）
で２倍希釈した後塩酸でpHを5.6まで下げ、25mMクエン
酸−25mM NaCl（pH5.6）緩衝液で平衡化したCM−Sephar
ose（登録商標）CL−6Bカラムに通した。同緩衝液で洗
浄した後、0.8M NaClまで塩濃度を上げたバッファーで
一段階溶出を行った。溶出する蛋白質のピークを集め、
蒸留水に対して透析した。凍結乾燥後の試料をPBSで平
衡化したSuperdex（登録商標）H75ゲルろ過カラム（フ
ァルマシア社製）に通した。単球又はマクロファージに
対し遊走活性を誘導する画分を集め、蒸留水に対して透
析を行った（４℃,20時間）。凍結乾燥後、試料をフェ
ニル 5PW RP逆相HPLCカラム（トーソー社製;4.6×75m
m）に通し最終精製を行った。すなわち、溶離液Ａとし
て0.05％TFA溶液、溶離液Ｂとして0.05％TFAを含有する
80％アセトニトリル溶液を用い、60分間に０％から50％
までアセトニトリル濃度を直線的に増加させて蛋白質を
溶出させた。溶出液は220nmの波長を用いてモニターし
た。流速は1ml/分で行い、単球又はマクロファージに対
して遊走活性を誘導するピークを分取した。[Example 13] Purification of rHT-LCF About 900 ml of a culture solution of Cos1 cells was added to Milli-Q water (deionized water).
CM-Sephar was diluted 2-fold with water, pH was lowered to 5.6 with hydrochloric acid, and equilibrated with 25 mM citric acid-25 mM NaCl (pH 5.6) buffer.
It was passed through an ose® CL-6B column. After washing with the same buffer, one-step elution was performed with a buffer having a salt concentration increased to 0.8 M NaCl. Collect the eluted protein peaks,
It was dialyzed against distilled water. The freeze-dried sample was passed through a Superdex (registered trademark) H75 gel filtration column (Pharmacia) equilibrated with PBS. Fractions that induce migration activity to monocytes or macrophages were collected and dialyzed against distilled water (4 ° C., 20 hours). After freeze-drying, the sample was phenyl 5PW RP reverse phase HPLC column (Tosoh; 4.6 × 75m).
Final purification was carried out through m). That is, the eluent A contains 0.05% TFA solution and the eluent B contains 0.05% TFA.
80% acetonitrile solution, 0% to 50% in 60 minutes
The protein was eluted by linearly increasing the acetonitrile concentration up to. The eluate was monitored using a wavelength of 220 nm. The flow rate was 1 ml / min, and the peak that induced the migration activity on monocytes or macrophages was collected.

最終的に精製されたrHT−LCFは100〜200μｇであっ
た。The final purified rHT-LCF was 100-200 μg.

〔実施例14〕 rHT−LCFのSDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動 0.1％のSDSを含有する分離ゲル（17.5％アクリルアミ
ド）を用いて、実施例13で得られた試料について電気泳
動を行った。ゲル中の緩衝液として0.1％SDSを含む375m
Mトリス−HCl（pH8.8）緩衝液、泳動槽中の緩衝液とし
て25mMトリス−192mMグリシン（pH8.3）緩衝液を用い
た。200Vの定電圧で45分間泳動した後に、蛋白質をクマ
シーブリリアントブルーで染色した。マーカーの分子量
を左側に示す。分子量マーカーとの相対的位置から算定
して、分子量12,000〜15,000の位置に単一バンドが確認
された（図４）。[Example 14] SDS polyacrylamide gel electrophoresis of rHT-LCF The sample obtained in Example 13 was subjected to electrophoresis using a separation gel (17.5% acrylamide) containing 0.1% SDS. 375m with 0.1% SDS as buffer in gel
M Tris-HCl (pH 8.8) buffer, 25 mM Tris-192 mM glycine (pH 8.3) buffer was used as a buffer in the electrophoresis tank. After running at a constant voltage of 200 V for 45 minutes, the protein was stained with Coomassie Brilliant Blue. The molecular weight of the marker is shown on the left. A single band was confirmed at the position of molecular weight 12,000 to 15,000 as calculated from the relative position with the molecular weight marker (Fig. 4).

〔実施例15〕 rHT−LCFのアミノ酸配列の決定 実施例４の方法と同様にしてアミノ末端のアミノ酸配
列の決定を行った。その結果、配列番号No.10に示すア
ミノ酸配列が確認された。[Example 15] Determination of amino acid sequence of rHT-LCF The amino terminal amino acid sequence was determined in the same manner as in Example 4. As a result, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 was confirmed.

〔実施例16〕 rHT−LCFのＣ末端部分アミノ酸配列及び
ジスルフィド結合形成部位の決定 rHT−LCFの精製品30μｇを0.05M酢酸アンモニア緩衝
液（pH4.0）中でV8プロテアーゼ（0.8μｇ）と37℃で18
時間保温した。このサンプルをODS 120TC18（トーソー
社製）を用いた逆相HPLCを行い、生成したペプチドを分
離した。溶出はＡ液に0.05％TFA溶液、Ｂ液に80％アセ
トニトリルを含む0.05％TFA溶液を用い、60分間に０％
から50％までアセトニトリル濃度を直線的に増加させて
蛋白質を溶出させた。cDNAの塩基配列から推定されるrH
T−LCFのアミノ酸配列のV8プロテアーゼによる予想限定
分解箇所を下記に示す。Example 16 Determination of C-terminal partial amino acid sequence of rHT-LCF and disulfide bond formation site 30 μg of purified rHT-LCF was mixed with V8 protease (0.8 μg) in 0.05M ammonia acetate buffer (pH 4.0) and 37 18 at ℃
I kept it warm for an hour. This sample was subjected to reverse phase HPLC using ODS 120TC18 (manufactured by Tosoh Corporation) to separate the produced peptide. For elution, 0.05% TFA solution in solution A and 0.05% TFA solution containing 80% acetonitrile in solution B were used.
The protein was eluted with a linear increase in acetonitrile concentration from 50 to 50%. rH deduced from the nucleotide sequence of cDNA
The predicted limited cleavage site of the amino acid sequence of T-LCF by V8 protease is shown below.

ペプチド＃1:配列番号No.11のアミノ酸配列 ペプチド＃2:配列番号No.12のアミノ酸配列 ペプチド＃3:Glu ペプチド＃4:配列番号No.13のアミノ酸配列 ペプチド＃5:配列番号No.14のアミノ酸配列 ペプチド＃6:配列番号No.15のアミノ酸配列 ペプチド＃7:配列番号No.16のアミノ酸配列 その結果、未分解のrHT−LCFのピークを含めて、５つ
の部分ペプチドのピークが確認できた（図５）。図５
は、逆相HPLCにおいて０〜40％のアセトニトリルによる
溶出パターンを示す。Peptide # 1: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 Peptide # 2: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 Peptide # 3: Glu Peptide # 4: Amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 Peptide # 5: SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence of peptide # 6: amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 peptide # 7: amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 As a result, peaks of five partial peptides including the peak of undegraded rHT-LCF were confirmed. It was done (Fig. 5). Figure 5
Shows an elution pattern with 0-40% acetonitrile in reverse phase HPLC.

溶出する順番にピークA,B,C,D及びＥ（未分解rHT−LC
F）とし、実施例４の方法と同様にしてそれぞれのピー
クのＮ末端アミノ酸配列の決定を行った結果を下記に示
す。Peaks A, B, C, D and E (undegraded rHT-LC
The results of determination of the N-terminal amino acid sequence of each peak as F) are shown below in the same manner as in Example 4.

ピークA:配列番号No.17（ペプチド＃６の一部）のアミ
ノ酸配列 ピークB:配列番号No.18（ペプチド＃２）のアミノ酸配
列 ピークC:配列番号No.19（ペプチド＃５）のアミノ酸配
列 ピークＤ（１）：配列番号No.20（ペプチド＃１）のア
ミノ酸配列 ピークＤ（２）：配列番号No.21（ペプチド＃３とペプ
チド＃４の一部）のアミノ酸配列 ピークＤでは、ペプチド＃１と＃４にはシステイン
（cysteine）が一残基ずつあり、ジスルフィド結合が形
成されているために同時に溶出した。エドマン分解の１
サイクル目には検出できなかったシスチン（cystine）
の分解ピークが、２サイクル目に検出できた事から、ジ
スルフィド結合を形成している事を確認した。ペプチド
＃３はグルタミン酸一残基であるが、遊離せずペプチド
＃４に結合したままであった。また、ペプチド＃６より
もＣ末端側に位置するペプチド＃７以降のペプチドは確
認できなかった。Peak A: amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (part of peptide # 6) peak B: amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (peptide # 2) peak C: amino acid of SEQ ID NO: 19 (peptide # 5) Sequence peak D (1): amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (peptide # 1) peak D (2): amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (part of peptide # 3 and peptide # 4) peak D: Peptides # 1 and # 4 each have one cysteine residue, and co-eluted due to the formation of disulfide bonds. Edman decomposition 1
Cystine that could not be detected in the second cycle
The decomposition peak of was detected in the second cycle, confirming that a disulfide bond was formed. Peptide # 3 is a glutamic acid single residue but was not released and remained bound to peptide # 4. In addition, peptides after peptide # 7 located on the C-terminal side of peptide # 6 could not be confirmed.

従って、確認された部分ペプチドの中で最もＣ末端側
のものは、ピークＡのペプチド＃６に相当する部分であ
ったが、予想されるＣ末端の２残基であるアルギニン，
グルタミン酸を確認することができなかった。Accordingly, among the confirmed partial peptides, the one at the most C-terminal side was the portion corresponding to peptide # 6 of peak A, but the predicted C-terminal two residues arginine,
Glutamic acid could not be confirmed.

以上のことから、rHT−LCFのＣ末端アミノ酸は、ペプ
チド＃６のトレオニン（全体ではＮ末端のシステインか
ら数えて94残基目）であることがわかった。From the above, it was found that the C-terminal amino acid of rHT-LCF was threonine of peptide # 6 (94th residue counting from the N-terminal cysteine as a whole).

〔実施例17〕 質量分析によるrHT−LCFのＣ末端部の決
定 質量分析装置（フィニガンマット社製;TSQ−700）を
用いてエレクトロンスプレーイオン化法により、rHT−L
CF及び実施例16で得られたピークＡの質量分析及び、ピ
ークＡのアミノ酸配列の決定を行った。測定されたrHT
−LCF及びピークＡペプチドの平均質量は、それぞれ10,
780.7（図６）及び1,349.1（図７）で、実施例16で得ら
れた94残基より構成され、かつ１本のジスルフィド結合
を持つと仮定した理論値の10,783.5及び1,348.8とほぼ
一致した。また、ピークＡの一次構造は、配列番号No.2
2で示されるとおりで、実施例16で得られた結果と一致
した。従って、rHT−LCFは実施例16の結果と同じく、シ
ステインから始まり94残基目のトレオニンで終わる構造
である事がわかった。[Example 17] Determination of C-terminal part of rHT-LCF by mass spectrometry rHT-L was determined by electron spray ionization using a mass spectrometer (manufactured by Finniganmat; TSQ-700).
Mass spectrometry of CF and peak A obtained in Example 16 and determination of the amino acid sequence of peak A were performed. Measured rHT
-The average mass of LCF and peak A peptide is 10, respectively.
At 780.7 (Fig. 6) and 1,349.1 (Fig. 7), they were almost in agreement with theoretical values of 10,783.5 and 1,348.8, which were composed of 94 residues obtained in Example 16 and were assumed to have one disulfide bond. The primary structure of peak A is SEQ ID NO: 2.
As shown in 2, consistent with the results obtained in Example 16. Therefore, it was found that rHT-LCF had a structure starting from cysteine and ending with threonine at the 94th residue, similar to the result of Example 16.

〔実施例18〕 rHT−LCFの単球又はマクロファージに対
する遊走活性の測定 実施例１の方法を用いて、精製したrHT−LCFについて
単球又はマクロファージの遊走活性を測定した。その結
果、広い用量範囲（0.01〜100nM）で用量依存的に単球
又はマクロファージの遊走を引き起こしていることが確
認された（図８）。図中、横軸はボイデンチャンバー下
室に入れた精製rHT−LCFの濃度を、縦軸は染色したフィ
ルターを顕微鏡下で５視野分観察し計測された単球又は
マクロファージの総数を示す。[Example 18] Measurement of migration activity of rHT-LCF on monocytes or macrophages The method of Example 1 was used to measure the migration activity of monocytes or macrophages on the purified rHT-LCF. As a result, it was confirmed that a wide dose range (0.01 to 100 nM) causes monocyte or macrophage migration in a dose-dependent manner (Fig. 8). In the figure, the horizontal axis represents the concentration of purified rHT-LCF placed in the lower chamber of the Boyden chamber, and the vertical axis represents the total number of monocytes or macrophages measured by observing the stained filter for 5 fields of view under a microscope.

〔実施例19〕 rHT−LCFの好中球に対する遊走活性の測
定 ヒト末梢血白血球は以下の様に調整した。血液100ml
に3.5％のデキストランＴ−500を含む生理食塩水100ml
を加え室温で30分間静置し、上層の白濁部分を回収後遠
心し（1,200rpm,5分間,4℃）、沈澱させた。沈澱を0.2
％NaCl 30mlに懸濁後、1.6％NaCl 30mlを加え、攪拌後
遠心した（1,200rpm,5分間,4℃）。沈澱を20mlのPBSに
懸濁し、30mlのFicoll−Paque溶液に両者が混じり合わ
ないように静かに重層して遠心（1,300rpm,15分間，室
温）後、得られた沈澱を好中球分画として回収した。[Example 19] Measurement of migration activity of rHT-LCF on neutrophils Human peripheral blood leukocytes were prepared as follows. 100 ml of blood
100 ml saline containing 3.5% dextran T-500
Was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the cloudy portion in the upper layer was recovered and then centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes, 4 ° C.) to precipitate. 0.2 precipitate
After suspending in 30 ml of 30% NaCl, 30 ml of 1.6% NaCl was added, and the mixture was stirred and then centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes, 4 ° C.). The precipitate was suspended in 20 ml of PBS, gently layered with 30 ml of Ficoll-Paque solution so that they would not mix, and centrifuged (1,300 rpm, 15 minutes, room temperature), and the resulting precipitate was fractionated with neutrophils. Was collected as.

回収した細胞をRPMI1640培地に懸濁し、遠心を行った
（1,200rpm,5分間，室温）。得られた沈澱を1mlあたり1
00〜150万個の細胞密度となるようにRPMI1640培地に懸
濁した。その細胞浮遊液50μｌを48穴マイクロケモタキ
シスチャンバーの上室に入れ、下室には精製したrHT−L
CFを含む検体を25μｌ入れた。フィルターはポリカーボ
ネート製で、３μｍの小孔を持つものを用いた。この装
置を５％CO₂インキュベーター内にて37℃で３時間イン
キュベーションした。インキュベーション後、下室に遊
走した細胞をコールターカウンターを用いて粒子径6.26
7μｍ以上の細胞を好中球としてカウントした。その結
果、精製したrHT−LCFは全ての濃度において好中球を遊
走しなかった（図９）。図９中、横軸はボイデンチャン
バー下室に入れた精製rHT−LCFの濃度を、縦軸は下室に
遊走した好中球の総数を上室に入れた細胞に対する％
（遊走率）で表示した。The collected cells were suspended in RPMI1640 medium and centrifuged (1,200 rpm, 5 minutes, room temperature). 1 per ml of the obtained precipitate
The cells were suspended in RPMI1640 medium to a cell density of 00 to 1.5 million cells. 50 μl of the cell suspension was placed in the upper chamber of a 48-well microchemotaxis chamber, and the lower chamber was purified rHT-L.
Twenty-five μl of the sample containing CF was added. The filter used was made of polycarbonate and had small pores of 3 μm. The device was incubated at 37 ° C. for 3 hours in a 5% CO ₂ incubator. After incubation, migrate the cells that migrated to the lower chamber to a particle size of 6.26 using a Coulter counter.
Cells of 7 μm or larger were counted as neutrophils. As a result, the purified rHT-LCF did not migrate to neutrophils at all concentrations (Fig. 9). In FIG. 9, the horizontal axis represents the concentration of purified rHT-LCF placed in the lower chamber of the Boyden chamber, and the vertical axis represents the total number of neutrophils that migrated to the lower chamber relative to the cells placed in the upper chamber.
Displayed as (migration rate).

〔実施例20〕 HT−LCFの大腸菌での発現と精製 遊走活性を担うと考えられた蛋白質部分（配列番号N
o.2で示されるアミノ酸配列を実質的に含む蛋白質）を
大量に得る目的で大腸菌での発現を行った。この蛋白質
に対応するDNA断片を大腸菌用発現ベクターに挿入し、
発現に供した。DNA断片の取得にはPCRを利用した。PCR
に用いたプライマーは図10の通りであり、ベクターへの
つなぎこみに便利なようにそれぞれの5'側末端に制限酵
素配列を付加した。また、Ｎ末端側のプライマーにおい
ては最初のアミノ酸であるアラニンの前にメチオニンの
コドン（ATG）を導入し、制限酵素としてNco I部位（CC
ATGG）を付加した。Ｃ末側のプライマーにおいては、最
後のアミノ酸であるアルギニンの直後に停止コドン（TA
A）を付加し、その後にBamH I部位（GGATCC）を導入し
た。これらプライマーは、実施例５と同様ABI社製DNA自
動合成機を用いて合成し、実験に使用した。PCRの鋳型
には、配列番号No.3で示されるcDNA断片を含むプラスミ
ドDNAを10ng使用した。反応条件は実施例７と同様であ
るが、アニーリング温度のみ変更し、45℃で行った。こ
こで得られた330bp前後のバンドを回収し、制限酵素Nco
I及びBamH Iで消化後、同様に制限酵素で消化した大腸
菌用発現ベクターpTrc99A（ファルマシア社製：コード
番号27−0971−01）につなぎ込み、Hanahanらの方法
（J.Mol.Biol.,166,557−580,1983）によりコンピテン
トにした宿主大腸菌YA21（Mutoh N.ら、J.Bacteriol.,1
36,693−699,1978）に導入した。得られた形質転換体の
うちHT−LCFのDNA断片を含むクローンを選択し、HT−LC
F部分の塩基配列を決定した。[Example 20] Expression and purification of HT-LCF in Escherichia coli A protein portion (SEQ ID NO: N) that was considered to be responsible for the migration activity.
Expression was carried out in E. coli for the purpose of obtaining a large amount of a protein substantially containing the amino acid sequence shown in o.2. Insert a DNA fragment corresponding to this protein into an E. coli expression vector,
It was subjected to expression. PCR was used to obtain the DNA fragment. PCR
The primers used in Fig. 10 are as shown in Fig. 10, and a restriction enzyme sequence was added to the 5'end of each to facilitate the connection to the vector. In addition, in the N-terminal side primer, a methionine codon (ATG) was introduced before the first amino acid alanine, and the Nco I site (CC
ATGG) was added. In the C-terminal primer, a stop codon (TA
A) was added, followed by the introduction of the BamHI site (GGATCC). These primers were synthesized in the same manner as in Example 5 using the ABI DNA automatic synthesizer and used in the experiment. As the PCR template, 10 ng of plasmid DNA containing the cDNA fragment shown in SEQ ID NO: 3 was used. The reaction conditions were the same as in Example 7, except that the annealing temperature was changed and the reaction was carried out at 45 ° C. The band around 330 bp obtained here was recovered and the restriction enzyme Nco
After digestion with I and BamHI, it was ligated to the expression vector pTrc99A for Escherichia coli (Pharmacia: Code No. 27-0971-01) which was also digested with restriction enzymes, and the method of Hanahan et al. (J. Mol. Biol., 166, 557) was used. −580,1983) made host E. coli YA21 (Mutoh N. et al., J. Bacteriol., 1) made competent.
36,693-699,1978). Among the obtained transformants, a clone containing the HT-LCF DNA fragment was selected, and HT-LC
The base sequence of the F portion was determined.

その結果、得られたクローンYsHT21は、メチオニンで
始まり、配列番号No.2で示されるHT−LCFのアミノ酸１
番（アラニン）から105番目（アルギニン）までを含
み、直後に停止コドンを持つ目的のDNAが発現ベクター
に組み込まれたものであることが確認された（配列番号
No.23）。また、途中の配列に、読み間違い等に起因す
る塩基の置換等は認められなかった。As a result, the obtained clone YsHT21 starts with methionine and has amino acid 1 of HT-LCF shown in SEQ ID NO: 2.
It was confirmed that the target DNA including the numbered (alanine) to the 105th (arginine) and having a stop codon was immediately inserted into the expression vector (SEQ ID NO:
No.23). No substitution of bases due to misreading was found in the sequence.

このクローンYsHT21を10リットルのLB培地で振盪培養
し（37℃）、600nmの吸光度が0.8になった時点でIsopro
pyl beta−Ｄ−Thiogalactoside（IPTG:終濃度1mM）を
加え、更に５時間培養した。培養後、遠心分離により菌
体を回収し、1mM phenylmethylsulfonyl fluoride（PM
SF;和光純薬;No.164−12181）を含む6M塩酸グアニジン
（和光純薬;No.070−01825）溶液に懸濁した。懸濁液を
20mlずつプラスチック遠心管に分注し、菌体の超音波破
砕処理を行った。即ち、超音波発振機Sonifier model 2
50（BRANSON）にマイクロチップを装着し、氷冷した懸
濁液中に入れてから出力を上げ、２分間処理懸濁液を再
び氷冷して更に２分間処理した。処理後の懸濁液の一部
を採って検鏡し、菌体の破砕を確認した後、懸濁液を遠
心し、上清を蒸留水に対して透析した。This clone YsHT21 was shake-cultured in 10 liters of LB medium (37 ° C), and when the absorbance at 600 nm reached 0.8, Isopro was isolated.
Pyl beta-D-Thiogalactoside (IPTG: final concentration 1 mM) was added, and the mixture was further cultured for 5 hours. After culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PM
It was suspended in a 6M guanidine hydrochloride (Wako Pure Chemical Industries; No. 070-01825) solution containing SF; Wako Pure Chemical Industries; No. 164-1181). Suspension
20 ml each was dispensed into a plastic centrifuge tube, and the cells were ultrasonically disrupted. That is, the ultrasonic oscillator Sonifier model 2
A microchip was attached to 50 (BRANSON), put in an ice-cooled suspension, the output was increased, and the treated suspension was ice-cooled again for 2 minutes and further treated for 2 minutes. After a part of the treated suspension was taken and examined under a microscope to confirm that the cells were disrupted, the suspension was centrifuged and the supernatant was dialyzed against distilled water.

更に、25mMクエン酸−25mM NaCl（pH5.6）で平衡化し
た後、透析時に析出した不溶物を遠心分離で除去した。Further, after equilibration with 25 mM citric acid-25 mM NaCl (pH 5.6), insoluble matter precipitated during dialysis was removed by centrifugation.

25mMクエン酸−25mM NaCl（pH5.6）で平衡化したCM−
Sepharose−CL−6B（ファルマシア社製;No.17−0720−0
1）カラム（25×200mm）に試料を通し、洗浄後塩濃度を
0.8Mの濃度まで直線的に上昇させることにより蛋白質を
溶出させた。溶出後は20mlづつ分取し280nmの波長に対
し吸収を示すフラクションを採って10mM酢酸に対して透
析した。凍結乾燥させた後、試料をCOSMOSIL 5C18−AR
−300逆相HPLCカラム（ナカライテスク社製、10×250m
m）を用いて精製した。即ち、溶離液Ａとして0.05％TFA
溶液（和光純薬;No.206−10731）、溶離液Ｂとして0.05
％TFA溶液を含有する80％アセトニトリル（和光純薬;N
o.019−08631）溶液を用い、60分間に０％から50％まで
アセトニトリル濃度を直線的に増加させ蛋白質を溶出さ
せた。溶出液は220nmの吸光度をモニターした。流速は
3.5ml/分で行った。溶出する蛋白質をピークごとに分画
し、島津PSQ−１プロテインシークエンサーを用いてＮ
末端アミノ酸配列の分析を行った。その結果、HT−LCF
のＮ末端アミノ酸配列10残基が一致するピークを得た。
即ち、配列番号No.3で示すところの、アミノ酸番号１
（アラニン）から10（プロリン）が検出され、この精製
品は、大腸菌での発現を意図した配列番号No.2記載され
た蛋白質と同一のＮ末端配列を持っていることが確認さ
れた。25 mM citric acid-CM equilibrated with 25 mM NaCl (pH 5.6)-
Sepharose-CL-6B (Pharmacia Co .; No.17-0720-0
1) Pass the sample through the column (25 x 200 mm) and wash to determine the salt concentration.
The protein was eluted by linearly increasing it to a concentration of 0.8M. After elution, 20 ml aliquots were collected, and a fraction showing absorption at a wavelength of 280 nm was collected and dialyzed against 10 mM acetic acid. After lyophilization, the sample is COSMOSIL 5C18-AR
-300 reverse phase HPLC column (Nacalai Tesque, 10 x 250m
m) was used for purification. That is, 0.05% TFA as the eluent A
Solution (Wako Pure Chemical Industries; No.206-10731), 0.05 as eluent B
% TFA solution in 80% acetonitrile (Wako Pure Chemicals; N
o.019-08631) solution was used to elute the protein by linearly increasing the acetonitrile concentration from 0% to 50% in 60 minutes. The eluate was monitored for absorbance at 220 nm. The flow velocity is
Performed at 3.5 ml / min. The eluted protein was fractionated for each peak, and N was obtained using a Shimadzu PSQ-1 protein sequencer.
The terminal amino acid sequence was analyzed. As a result, HT-LCF
A peak corresponding to 10 residues of the N-terminal amino acid sequence of
That is, amino acid No. 1 shown in SEQ ID No. 3
10 (proline) was detected from (alanine), and this purified product was confirmed to have the same N-terminal sequence as the protein described in SEQ ID NO: 2 intended for expression in E. coli.

この精製ピークには単球／マクロファージ遊走活性が
みられなかったが、これは大腸菌に発現させたHT−LCF
が動物細胞に発現させたものとは異なる立体構造を持つ
ことに起因すると考えられたので、それを修正するため
に以下のようにリフォールディング処理を行った。No monocyte / macrophage migration activity was observed in this purified peak, which was due to HT-LCF expression in E. coli.
It was thought that this was due to the fact that the protein has a three-dimensional structure different from that expressed in animal cells, so in order to correct it, refolding treatment was performed as follows.

塩酸グアニジン3.1gを10ml蒸留水に溶解し、水酸化ナ
トリウム溶液を加えてpHを８に調製した。これに還元型
グルタチオン（和光純薬;No.073−02013）を61.5mg添加
し攪拌した後、再度pH8に調製した。更に、上記精製品
を1mg/ml含む6M塩酸グアニジン溶液を1ml加え攪拌した
後、酸化型グルタチオン（ナカライテスク;No.170−1
0）12.3mgを添加し、pHを８に調製した。蒸留水を加え
最終的に20mlにし、室温下で一晩放置した後、再度逆相
HPLCカラムで分画し、単球／マクロファージに対し遊走
活性を誘導するピークを得た。最終的に、大腸菌由来遺
伝子組換え型HT−LCF（以下、「Ｅ−rHT−LCF」とす
る。）を６〜9mg精製することができた。単球／マクロ
ファージ遊走活性の試験を行い、最終的に得られたＥ−
rHT−LCFが10^-11Mから10^-7Mの濃度で用量依存的に活性
を有することを確認した（図11）。図11において、横軸
はＥ−rHT−LCFの濃度を、縦軸は遊走細胞数を示す。Guanidine hydrochloride (3.1 g) was dissolved in 10 ml of distilled water, and sodium hydroxide solution was added to adjust the pH to 8. To this, 61.5 mg of reduced glutathione (Wako Pure Chemical Industries; No. 073-02013) was added, and the mixture was stirred and then adjusted to pH 8 again. Furthermore, 1 ml of a 6 M guanidine hydrochloride solution containing 1 mg / ml of the purified product was added and stirred, and then oxidized glutathione (Nacalai Tesque; No. 170-1
0) 12.3 mg was added to adjust the pH to 8. Add distilled water to make the final volume 20 ml, leave it at room temperature overnight, and then reverse phase again.
Fractionation with an HPLC column gave a peak that induced migration activity on monocytes / macrophages. Finally, 6-9 mg of E. coli-derived recombinant HT-LCF (hereinafter referred to as "E-rHT-LCF") could be purified. Monocyte / macrophage migration activity was tested and finally obtained E-
It was confirmed that rHT-LCF had a dose-dependent activity at a concentration of 10 ⁻¹¹ M to 10 ⁻⁷ M (FIG. 11). In FIG. 11, the horizontal axis represents the concentration of E-rHT-LCF and the vertical axis represents the number of migrated cells.

ここで得られたＥ−rHT−LCFの比活性は、Cos1細胞で
発現させたrHT−LCFのものとほぼ同一のものであり、Ｅ
−rHT−LCFの大量発現、精製、活性体取得方法が確立さ
れたといえる。The specific activity of E-rHT-LCF obtained here was almost the same as that of rHT-LCF expressed in Cos1 cells.
It can be said that a method for large-scale expression, purification, and acquisition of an active form of -rHT-LCF has been established.

〔実施例21〕 Ｅ−rHT−LCFの創傷治療効果 Ｅ−rHT−LCFの創傷治療に対する効果を調べる目的で
創傷治療法による試験を行った。実験はSchulte and Do
menjozらの方法に従った（Med.Phamacol.Expt.16,453−
458,1967）。[Example 21] Wound treatment effect of E-rHT-LCF A test by a wound treatment method was conducted for the purpose of investigating the effect of E-rHT-LCF on wound treatment. Experiment is Schulte and Do
According to the method of menjoz et al. (Med.Phamacol.Expt.16,453-
458,1967).

体重110〜130gのSD系雄性ラットを１群10匹用いた。
背部被毛をバリカンで除毛した後、硫化バリウム４容、
トラガント末（和光純薬;206−02242）１容の懸濁液を
塗布し、３分後に洗浄して脱毛した。その後、エーテル
麻酔下において、正中線に沿って左又は右1.5cmの皮膚
切開を施した。切開部中央を１ヵ所縫合後、化膿防止に
ストレプトマイシンを筋注した。初回はＥ−rHT−LCFの
生理食塩水溶解液を切開部に100μｌ注入し、その後は
Ｅ−rHT−LCF含有クリームを１日１回５日間切開部位に
ミクロスパーテルを用いて0.1g塗布した。対照群には初
回は生理食塩水のみ、その後はクリーム基剤のみを注入
又は塗布した。クリーム基剤の処方は以下の通り。One group of 10 SD male rats weighing 110 to 130 g was used.
After removing hair from the back with hair clippers, 4 volumes of barium sulfide,
A 1 volume suspension of tragacanth powder (Wako Pure Chemicals Co., Ltd .; 206-02242) was applied, and after 3 minutes, the hair was removed by washing. Then, under ether anesthesia, a skin incision of 1.5 cm left or right was made along the midline. After suturing one place at the center of the incision, streptomycin was intramuscularly injected to prevent purulence. First, 100 μl of a physiological saline solution of E-rHT-LCF was injected into the incision, and then 0.1 g of E-rHT-LCF-containing cream was applied to the incision once a day for 5 days using a microspatel. The control group was initially infused or applied with physiological saline alone and then with cream base only. The cream base formulation is as follows.

クリーム基剤100g中 セタノール 8.0 g ステアリルアルコール 2.0 g 流動パラフィン 7.0 g MYS−40（日光ケミカルズ） 3.0 g プロピルパラペン 0.05g 精製水 80.0 g Ｅ−rHT−LCFは生理食塩水あるいは上記のクリーム基
剤に１μg/g又は10μg/gになるよう調製したものを実験
に供した。４日目に抜糸し、６日目に頭部打撲後、放血
により致死させ皮膚を剥離した。創傷部位が中央になる
ように30×10mmの皮膚切片を作製し、両端を牽引して創
傷治癒部が開裂するまでの張力をFDピックアップ（TB−
612T;日本光電）を用いて測定し、得られた値はDunnett
の多重比較決定を用い、危険率５％で検定した。Cream base 100g Cetanol 8.0 g Stearyl alcohol 2.0 g Liquid paraffin 7.0 g MYS-40 (Nikko Chemicals) 3.0 g Propylparapen 0.05 g Purified water 80.0 g E-rHT-LCF is 1 μg in physiological saline or the above cream base. What was prepared so that it might be / g or 10 microg / g was used for the experiment. The yarn was removed on the 4th day, and after bruising the head on the 6th day, the animal was killed by exsanguination and the skin was peeled off. Prepare a 30 × 10 mm skin section so that the wound site is in the center, and pull the tension at both ends until the wound healing site is cleaved by FD pickup (TB-
612T; Nihon Kohden) and the obtained values are Dunnett
Tested at 5% risk using multiple comparison determinations of.

その結果、対照群の抗張力に対して１μg/gの濃度で
は治療促進傾向は観られたが有意ではなかった。しかし
ながら、10μg/gの濃度では有意な治療促進効果が認め
られた（表１参照）。As a result, a treatment-promoting tendency was observed at a concentration of 1 μg / g with respect to the tensile strength of the control group, but it was not significant. However, a significant treatment promoting effect was observed at a concentration of 10 μg / g (see Table 1).

表１中、「※」は、試験群が対照群と比較して有意
（ｐ＜0.05）な差を有することを意味する。 In Table 1, "*" means that the test group had a significant (p <0.05) difference compared with the control group.

〔実施例22〕 Ｅ−rHT−LCFの熱傷治療効果 Ｅ−rHT−LCFの熱傷に対する治療効果を調べる目的で
以下の実験を行った。方法は主に鴨志田らの実験的熱傷
治療実験に従った（臨床医薬、４巻、７号、1245−125
1、1988）。[Example 22] Effect of E-rHT-LCF on burn injury The following experiment was conducted in order to examine the effect of E-rHT-LCF on burn injury. The method was mainly based on the experimental burn treatment experiment of Kamoshida et al. (Clinical Medicine, Vol. 4, No. 7, 1245-125).
1, 1988).

体重190〜210gのSD系雄性のラットを１群10匹用い
た。実施例21と同様に脱毛した。その後、ペントバルビ
タールナトリウム（40mg/kg;腹腔投与）麻酔下におい
て、乾熱器で加熱したステンレス製円筒（φ10mm×5m
m）を用いて正中線に沿って２ヵ所に熱傷を作成した。
熱傷は重篤な症状を想定し、ステンレス製円筒を300℃
に加熱し、10秒間円筒の自重（6g）によって圧迫した。
Ｅ−rHT−LCF含有クリームは、作成した熱傷部位及び周
辺に１日１回15日間ミクロスパーテルを用いて塗布し
た。対照群にはクリーム基剤のみを塗布した。クリーム
基剤の組成は実施例21に記載のものと同一である。One group of 10 SD male rats weighing 190 to 210 g was used. Hair was removed in the same manner as in Example 21. Then, under anesthesia with sodium pentobarbital (40 mg / kg; intraperitoneal administration), a stainless steel cylinder (φ10 mm × 5 m
m) was used to make two burns along the midline.
Burns are assumed to be serious, and stainless steel cylinders are heated to 300 ° C.
It was heated to and pressed by the self-weight of the cylinder (6 g) for 10 seconds.
The E-rHT-LCF-containing cream was applied to the created burn site and its periphery once a day for 15 days using a microspatel. Only the cream base was applied to the control group. The composition of the cream base is the same as described in Example 21.

効果の判定は、熱傷部位の障害度を経時的に観察し
て、下記の熱傷障害度基準により１ヵ所につき０から５
までのスコアを付け、熱傷部位２ヵ所の平均を求めた。
更に、壊死組織又は上皮硬化組織の脱落に要した日数を
算出した。得られた値はDunnetの多重比較検定を用い、
危険率５％で検定した。Efficacy is determined by observing the degree of injury at the burn site over time, and from 0 to 5 per location according to the burn injury criteria below.
The average of two burn sites was calculated.
Further, the number of days required for the necrotic tissue or epithelial sclerosis tissue to fall off was calculated. The obtained value uses Dunnet's multiple comparison test,
It was tested at a risk rate of 5%.

熱傷障害度基準 0:完全治癒（熱傷痕のみ） 1:上皮硬化組織が脱落し熱傷部位の潰瘍 2:上皮硬化組織一部脱落 3:熱傷部位の壊死組織脱落 4:熱傷部位の壊死組織一部脱落 5:熱傷部位の組織壊死 その結果、熱傷障害度においては１μg/gの濃度で塗
布６日目より、10μg/gでは塗布５日目より有意な治療
効果が認められた（表２参照）。Burn injury criteria 0: Complete healing (burn scars only) 1: Epithelial sclerosing tissue falls off, ulcer at burn site 2: Partial loss of epithelial sclerosing tissue 3: Loss of necrotic tissue at burn site 4: Part of necrosis at burn site Loss 5: Tissue necrosis at burn site As a result, a significant therapeutic effect was observed from the 6th day of application at a concentration of 1 μg / g and from the 5th day of application at 10 μg / g in terms of burn injury level (see Table 2) .

また、壊死組織脱落日数においては両濃度とも有意に
脱落日数の短縮が認められた。しかしながら、上皮硬化
組織脱落日数においては、対照群に対して差は認められ
なかった（表３参照）。 In terms of the number of days of necrotic tissue loss, both concentrations were significantly shortened. However, there was no difference in the number of days of epithelial sclerosis loss from the control group (see Table 3).

尚、表２及び表３に記載された「※」の意味は、表１
の場合と同様である。 In addition, the meaning of “*” described in Table 2 and Table 3 is as shown in Table 1.
It is similar to the case of.

産業上の利用可能性 本発明により、従来にない新規な単球又はマクロファ
ージ遊走因子を提供することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a novel monocyte or macrophage chemotactic factor that has never existed can be provided.

本発明の遊走因子は、血清、血漿、尿や各種体液に含
まれる本遊走因子の濃度測定時の対照物質とすることが
できる。すなわち、本発明の遊走因子を酵素免疫測定法
（ELISA又はEIA）やラジオアイソトープを用いた免疫測
定法（RIA）により測定するときの標準物質として用い
られ得る。また、上記測定法の作製に不可欠な特異抗体
作製時の抗原として用いられ得る。従って、感染防御シ
ステムにおいて遊走因子が関与する機構を解析すること
が可能となる。The migration factor of the present invention can be used as a reference substance when measuring the concentration of the migration factor contained in serum, plasma, urine or various body fluids. That is, it can be used as a standard substance when the migration factor of the present invention is measured by an enzyme immunoassay (ELISA or EIA) or an immunoassay (RIA) using a radioisotope. In addition, it can be used as an antigen when producing a specific antibody, which is essential for producing the above-mentioned assay method. Therefore, it becomes possible to analyze the mechanism involved in the migration factor in the infection defense system.

また、本発明の遊走因子を各種感染症、各種免疫不全
症、各種癌疾患に投与することにより、予防効果及び治
療効果を得ることができる。In addition, a prophylactic effect and a therapeutic effect can be obtained by administering the migration factor of the present invention to various infectious diseases, various immunodeficiency diseases, and various cancer diseases.

本因子はまた、様々な創傷（切り傷、手術の傷、床ズ
レ、火傷、潰瘍等）の治療剤として用いることができ
る。更に、同様の効果を期待して他の治療剤・治療法
（糖尿病、各種潰瘍、癌化学療法、各種手術等）と併用
することで予防効果並びに治療効果を得ることができ
る。This factor can also be used as a therapeutic agent for various wounds (cuts, surgical wounds, floor slippage, burns, ulcers, etc.). Furthermore, in anticipation of the same effect, the preventive effect and the therapeutic effect can be obtained by using it in combination with other therapeutic agents / treatment methods (diabetes, various ulcers, cancer chemotherapy, various operations, etc.).

配列表 配列番号:1 配列の長さ:94 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:2 配列の長さ:105 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:3 配列の長さ:3551 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:4 配列の長さ:167 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:5 配列の長さ:21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:6 配列の長さ:7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:7 配列の長さ:10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:8 配列の長さ:8 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:9 配列の長さ:20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:10 配列の長さ:19 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:11 配列の長さ:13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:12 配列の長さ:11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:13 配列の長さ:52 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:14 配列の長さ:6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:15 配列の長さ:13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:16 配列の長さ:19 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:17 配列の長さ:11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:C末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:18 配列の長さ:11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:19 配列の長さ:6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:20 配列の長さ:13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:21 配列の長さ:13 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:22 配列の長さ:11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型:C末端フラグメント 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： 配列番号:23 配列の長さ:321 配列の型:cDNA to mRNA トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 起源：ホモ サピエンス（Homo Sapiens） セルライン:HT−1376 配列： Sequence Listing SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 94 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Protein Origin: Homo Sapiens Cell Line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 2 sequence length: 105 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: protein origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 3551 Sequence Type: Nucleic Acid Strand Count: Double-Strand Topology: Linear Sequence Type: cDNA to mRNA Origin: Homo Sapiens Cell Line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 4 Sequence length: 167 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin: Homo Sapiens Cell line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 5 sequence length: 21 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: N-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 6 sequence length: 7 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: middle fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 7 Sequence Length: 10 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Peptide Fragment Type: Intermediate Fragment Origin: Homo Sapiens Cell Line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 8 Sequence Length: 8 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Peptide Fragment Type: Intermediate Fragment Origin: Homo Sapiens Cell Line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 9 sequence length: 20 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: N-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 10 sequence length: 19 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: N-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 11 Sequence Length: 13 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Peptide Origin: Homo Sapiens Cell Line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 12 sequence length: 11 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 13 sequence length: 52 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 14 sequence length: 6 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 15 Sequence length: 13 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Origin: Homo Sapiens Cell line: HT-1376 Sequence: SEQ ID NO: 16 sequence length: 19 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 17 sequence length: 11 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: C-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 18 sequence length: 11 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: middle fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 19 sequence length: 6 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: middle fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 20 sequence length: 13 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: N-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 21 sequence length: 13 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: middle fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 22 sequence length: 11 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide fragment type: C-terminal fragment origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence: SEQ ID NO: 23 sequence length: 321 sequence type: cDNA to mRNA topology: linear sequence type: nucleic acid origin: Homo Sapiens cell line: HT-1376 sequence:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 266，Ｎｏ．16（1991）ｐ．10438− 10445 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，Ｖ ｏｌ．37，Ｎｏ．１（1993．Ｍａｒ．) ｐ．101−110 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI C12N 15/09 ZNA C12N 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/02 (56) References J. Biol. Chem. , Vol. 266, No. 16 (1991) p. 10438-10445 Int. J. Dev. Biol. , Vol. 37, No. 1 (1993. Mar.) p. 101-110 (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) SwissProt / PIR / GeneSeq GenBank / EMBL / DDBJ / GeneSeq BIOSIS / WPI (DIALOG) PubMed

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつ単球又はマクロファージ遊走
活性を有する蛋白質1. The following protein (a) or (b): (A) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and Protein having sphere or macrophage migration activity 【請求項２】以下の（ｃ）又は（ｄ）の蛋白質。 （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつ単球又はマクロファージ遊走
活性を有する蛋白質2. The following protein (c) or (d). (C) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and Protein having sphere or macrophage migration activity 【請求項３】以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコード
する遺伝子。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつ単球又はマクロファージ遊走
活性を有する蛋白質3. A gene encoding the following protein (a) or (b). (A) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and Protein having sphere or macrophage migration activity 【請求項４】以下の（ｃ）又は（ｄ）の蛋白質をコード
する遺伝子。 （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 （ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつ単球又はマクロファージ遊走
活性を有する蛋白質4. A gene encoding the following protein (c) or (d). (C) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (d) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and Protein having sphere or macrophage migration activity 【請求項５】以下の（ｅ）又は（ｆ）の蛋白質をコード
する遺伝子。 （ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質 （ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつ単球又はマクロファージ遊走
活性を有する蛋白質5. A gene encoding the following protein (e) or (f). (E) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (f) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and Protein having sphere or macrophage migration activity 【請求項６】請求項３〜５のいずれかの項記載の遺伝子
を含む発現用組換えベクター。6. A recombinant expression vector containing the gene according to any one of claims 3 to 5. 【請求項７】請求項６記載の発現用組換えベクターによ
り形質転換された形質転換体。7. A transformant transformed with the recombinant vector for expression according to claim 6. 【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培養し、得ら
れた培養物から請求項１記載の蛋白質を分離することを
特徴とする請求項１記載の蛋白質の製造方法。8. The method for producing the protein according to claim 1, which comprises culturing the transformant according to claim 7 and separating the protein according to claim 1 from the obtained culture. 【請求項９】請求項７記載の形質転換体を培養し、得ら
れた培養物から請求項２記載の蛋白質を分離することを
特徴とする請求項２記載の蛋白質の製造方法。9. The method for producing a protein according to claim 2, which comprises culturing the transformant according to claim 7 and separating the protein according to claim 2 from the obtained culture. 【請求項１０】請求項１又は２記載の蛋白質を有効成分
として含む免疫賦活剤。10. An immunostimulant containing the protein according to claim 1 or 2 as an active ingredient. 【請求項１１】請求項１又は２記載の蛋白質を有効成分
として含む創傷治療剤。11. A wound healing agent containing the protein according to claim 1 or 2 as an active ingredient. 【請求項１２】有効成分である請求項１又は２記載の蛋
白質及び医薬的に許容できる賦形剤を含む、創傷の治療
に用いるための医薬組成物。12. A pharmaceutical composition for use in treating a wound, which comprises the protein according to claim 1 or 2 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable excipient. 【請求項１３】有効成分である請求項１又は２記載の蛋
白質及び医薬的に許容できる賦形剤を含む、免疫賦活に
用いるための医薬組成物。13. A pharmaceutical composition for use in immunostimulation, which comprises the protein according to claim 1 or 2 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable excipient.