JP3485024B2 - Nucleotide compounds - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は新規なヌクレオチド
化合物に関するものであり、本発明のヌクレオチド化合
物は、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチドの製造
中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業
上、有用な化合物である。 【０００２】 【従来の技術】従来のオリゴデオキシリボヌクレオチド
およびオリゴリボヌクレオチドの合成に関しては、固相
合成法が採用されている。この方法に従えば、ヌクレオ
シドの３’−水酸基を多孔質ガラスなどの不溶性担体上
に固定した出発物質を用い、オリゴヌクレオチド鎖を
３’末端から５’末端方向に１塩基ずつ伸長していくの
が一般的であり、任意の配列のオリゴヌクレオチドの合
成が可能である（ケスターら、特公昭６２−５０４７９
号公報、およびカルザースら特公昭６３−２８４３９号
公報を参照）。しかしながら、上記の方法では、すべて
の工程が逐次反応によって構成されているため、どの工
程も反応収率１００％か限りなくそれに近く進行しなけ
れば、目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドは得
られないという点が技術的に難しい。特に、ヌクレオチ
ド鎖伸長工程であるリン酸化反応工程（縮合反応）は、
現在の最高レベルでも各伸長反応毎の収率が９８．５〜
９９．５％であって、この反応収率の高低が、目的とす
る配列を有するオリゴヌクレオチドの全収率を決定す
る。最近、全収率を向上させる方策として、縮合回数を
減らすことの出来る２量体ヌクレオチドをヌクレオチド
鎖を構築する際のビルディングブロックとする合成法が
有効であるとする報告がなされている｛クロッツら，バ
イオオルガニックアンドメディシナルケミストリーレタ
ーズ（Bioorg. Med. Chem. Lett.,），1997，7，73-7
8.｝。また、上記以外にも、２量体以上をビルディング
ブロックとしたオリゴヌクレオチドの化学合成法は多く
見受けられる（例えば総説として日本化学会編, 「核酸
の化学と分子生物学−化学総説４６」, 学会出版センタ
ー, 1985, pp. 209-240.など）。しかしながら、これら
のビルディングブロックは水酸基の保護・脱保護および
リン酸化という一連の工程が非常に複雑であり、しかも
各工程で副生物や不純物を除去するために、抽出やクロ
マトグラフィーなどの操作が必要である。これらは操作
上の繁雑さを招くだけでなく、ビルディングブロックを
合成するためのコストを高くしている。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、オリ
ゴヌクレオチドの製造において、その原料となる２量体
など短鎖オリゴマーの出発原料となる、新規なヌクレオ
チド化合物を提供することである。 【０００４】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヌクレオシドの核
酸塩基の保護基部分にポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）が導入されたヌクレオチド化合物を短鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドの製造に利用した場合、上記課題
が解決されることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるヌク
レオチド化合物である。 【０００５】 【化２】 【０００６】（式中、Ｂはヌクレオチド化学において通
常用いられる核酸塩基を示し、Ｒ¹およびＲ²は水素原
子、ヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロ
アルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示し、
Ｒ¹とＲ²は同一であっても異なっていても良く、Ｒ³は
ヌクレオチド化学において通常用いられる保護基を示
し、Ｒ⁴は水素原子、水酸基、アルコキシ基またはトリ
アルキルシリルオキシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ
基、アゾリル基もしくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３
以上の整数、Ａは２価基でアリレン基もしくはヘテロ原
子を含んでも良い直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン
基を示す。） 【０００７】 【発明の実施の形態】本発明におけるヌクレオチド化合
物は、前記式（１）で表されるように、核酸塩基のアミ
ノ基またはイミノ基の保護基にポリエチレングリコール
鎖を含む化合物である。前記式（１）におけるＢとして
は、下記式（２）で表されるアデニン、グアニン、シト
シン、チミンおよびウラシルの誘導体が挙げられる。 【０００８】 【化３】【０００９】また、前記式（１）におけるＲ¹およびＲ²
としては、水素原子、メチル基、プロピル基、ブチル
基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基などが挙げら
れ、Ｒ³としては４，４’−ジメトキシトリチル基など
が挙げられ、Ｒ⁴としては水素原子、メトキシ基、t-ブ
チルジメチルシリルオキシ基などが挙げられ、Ｘとして
はジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、イミダ
ゾリル基および４−メチルイミダゾリル基などが挙げら
れ、Ａとしてはフェニレン基、メチレン基およびジメチ
ルエチレン基などが挙げられる。 【００１０】本発明のヌクレオチド化合物は下記式
（３）で表されるヌクレオシドを適当なリン酸化剤と反
応させることによって得られる。 【００１１】 【化４】 【００１２】（式中、Ｂ、Ｒ³、Ｒ⁴、Ａおよびｎは前記
式（１）と同じである） 【００１３】前記リン酸化剤との反応については、前記
ケスターおよびカルザースらの方法を用いることもでき
るし、本発明者らの別の報告による方法（北村ら、特願
平１０−３６７３８４号公報）を利用することもでき
る。 【００１４】例えば、前記反応は、前記式（３）で表さ
れる５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシドを減圧乾燥する
か、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の
有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピ
リジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムおよびアセ
トニトリル等の有機溶媒溶液中、−８０℃〜室温の条件
下、０．９〜１．２当量の下記式（４）で表される化合
物を反応させることにより達成される。低温で反応させ
た方が、ヌクレオチド化合物の収率は良く、有機溶媒は
乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。
この反応溶液の³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを測定して反応
が完了したことを確認すれば良い。 【００１５】 【化５】 【００１６】（式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＸは前記式（１）
と同じである） 【００１７】上記反応で得られたヌクレオチド化合物
は、分離・精製すること無く、次の反応に用いれば良
い。例えば、少なくとも核酸塩基だけは適当に保護され
たヌクレオシド化合物を、別に減圧乾燥するか共沸操作
を行い、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、ク
ロロホルムおよびアセトニトリル等の有機溶媒の溶液と
して、−８０℃〜室温の条件下、上記の反応溶液に混合
し反応させることにより２量化反応は達成される。この
場合、上記反応で用いるヌクレオシド化合物の３’水酸
基は、必ずしも保護されている必要はない。 【００１８】本発明のヌクレオチド化合物は、アセトニ
トリル、テトラヒドロフラン、ピリジンおよび有機塩素
系溶媒などには可溶であり、これらポリエチレングリコ
ールに対する良溶媒中、適当に保護された第２番目のヌ
クレオシドを反応させることにより、２量体を得ること
ができる。一方、２量体成分を含む溶液に、ポリエチレ
ングリコールに対する貧溶媒、例えば、ジエチルエーテ
ルやジイソプロピルエーテルを、その溶液量に対して５
〜２０倍容量加えると、２量体成分は沈澱し容易に回収
できる。このためポリエチレングリコールを有しない従
来の保護ヌクレオチドを利用して２量体成分を得るとき
に必要であった分離・精製操作の大半が不要となる。か
つ、この分離・精製方法は、後工程であるヌクレオチド
鎖構築に対して十分なものであり、この分離・精製方法
は２量体ヌクレオチドを大量に得るためにも好都合であ
る。従って、本発明におけるヌクレオチド化合物は、２
量体および多量体ビルディングブロックを調製する上に
おいて、極めて簡便なオリゴデオキシリボヌクレオチド
の合成方法の提供を可能にする。 【００１９】 【実施例】以下、実施例により本発明の化合物について
詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。 （実施例１） 前記式（１）において、Ｂ＝シトシン誘導体、Ｒ¹＝水
素原子、Ｒ²＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ³
＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ⁴＝水素原子、
Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物
の合成例 （ａ）２−シアノ−１−（１，１−ジエチル−３−ブテ
ニル）エトキシジクロロホスフィン（３５０ｍｇ，１．
２５ｍｍｏｌ）のトルエン（５ｍｌ）溶液に、アルゴン
雰囲気下、室温の条件で、トリメチルシリルイミダゾー
ル（０．４０ｍｌ，２．７５ｍｍｏｌ）を加え５分間反
応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトル
エンを室温で１０分間減圧留去した後、残留トルエンお
よび過剰のトリメチルシリルイミダゾールを３５℃の条
件で2時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−
１−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビス
イミダゾリルホスフィンを得た。この化合物の³¹Ｐ Ｎ
ＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ₃Ｏ）₃Ｐ＝
１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１０９．３であっ
た。 【００２０】（ｂ）上記で得られた２−シアノ−１−
（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシビスイミ
ダゾリルホスフィンを重クロロホルム（２．５ｍｌ）に
溶解させて、０．５０Ｍ溶液とし、室温で２時間減圧乾
燥した５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシシチジン−
ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコー
ルの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、式（３）においてＢ
＝シトシン誘導体，Ｒ³＝４，４’−ジメトキシトリチ
ル，Ｒ⁴＝水素，Ａ＝フェニレンのもの，１．２０ｇ、
１．２５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、室温の条件
下で加えた。均一にさせた後、そのまま一晩静置して反
応させ、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾ
リル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合
物の³¹Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（Ｃ
Ｈ₃Ｏ）₃Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１３
４．３，１３１．５，１３０．８，１２７．４であっ
た。 【００２１】（実施例２） 前記式（１）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ¹＝水素原
子、Ｒ²＝イソプロピル基、Ｒ³＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ⁴＝水素原子、Ｘ＝４−メチルイミダゾ
リル基、Ａ＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−イソプロピ
ルエトキシジクロロホスフィン（１９６ｍｇ，０．９２
ｍｍｏｌ）、トリメチルシリル−４−メチルイミダゾー
ル（０．３１ｍｌ，２．０２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩
基保護−チミジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポ
リエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０、
式（３）においてＢ＝チミン誘導体、Ｒ³＝４，４’−
ジメトキシトリチル，Ｒ⁴＝水素原子，Ａ＝フェニレン
のもの，１．１９ｇ、１．２３ｍｍｏｌ）より、目的の
ホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝４−メチルイミダゾリ
ル，insitu ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物
の³¹Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ
₃Ｏ）₃Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１３
８．２，１２７．９，１２４．４であった。 【００２２】（実施例３） 前記式（１）においてＢ＝アデニン誘導体、Ｒ¹＝水素
原子、Ｒ²＝ｔ−ブチル基、Ｒ³＝４，４’−ジメトキシ
トリチル基、Ｒ⁴＝水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ
＝フェニレン基の場合の化合物の合成 実施例１と同様な方法で、２−シアノ−１−ｔ−ブチル
エトキシジクロロホスフィン（２４０ｍｇ，１．０５ｍ
ｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール（０．３４ｍ
ｌ，２．３２ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−
デオキシアデノシン−ポリエチレングリコール誘導体
（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５
０、式（３）においてＢ＝アデニン誘導体，Ｒ³＝４，
４’−ジメトキシトリチル，Ｒ⁴＝水素原子，Ａ＝フェ
ニレンのもの，１．４１ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）より、
目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in
situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物の³¹Ｐ
ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ₃Ｏ）₃
Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１３２．１，
１２９．２，１２８．９，１２８．５であった。 【００２３】（実施例４） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ¹＝水素
原子、Ｒ²＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ³＝
４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ⁴＝水素原子、Ｘ
＝イミダゾリル基、Ａ＝ベンジレン基の場合の化合物の
合成 実施例１と同様の方法に従い、２−シアノ−１−（１，
１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフ
ィン（３７９ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）、トリメチルシ
リルイミダゾール（０．４３ｍｌ，２．９６ｍｍｏ
ｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−２’−デオキシグアノシン
−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレングリコ
ールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）において
Ｂ＝グアニン誘導体，Ｒ³＝４，４'-ジメトキシトリチ
ル，Ｒ⁴＝水素原子，Ａ＝ベンジレンのもの，１．６２
ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）より、目的のホスホルアゾリド
化合物（Ｘ＝イミダゾリル，in situ ＤＮＡ合成試薬）
を得た。得られた化合物の³¹ＰＮＭＲ（１６１．９ＭＨ
ｚ，外部標準；（ＣＨ₃Ｏ）₃Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣ
ｌ₃）は、δ＝１３２．５，１３１．６，１２８．６，
１２８．４であった。 【００２４】（実施例５） 前記式（１）においてＢ＝グアニン誘導体、Ｒ¹＝水素
原子、Ｒ²＝１，１−ジメチル−３−メチル−３−ブテ
ニル基、Ｒ³＝４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｒ⁴＝
水素原子、Ｘ＝イミダゾリル基、Ａ＝メチレン基の場合
の化合物の合成実施例１と同様な方法により、２−シア
ノ−１−（１，１−ジメチル−３−メチル−３−ブテニ
ル）エトキシジクロロホスフィン（３８３ｍｇ，１．４
３ｍｍｏｌ）、トリメチルシリルイミダゾール（０．４
６ｍｌ，３．１４ｍｍｏｌ）、５’−Ｏ，塩基保護−
２’−デオキシグアノシン−ポリエチレングリコール誘
導体（ポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）
３５０，式（３）においてＢ＝グアニン誘導体，Ｒ³＝
４，４’−ジメトキシトリチル，Ｒ⁴＝水素原子，Ａ＝
メチレン基のもの，１．５０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）よ
り、目的のホスホルアゾリド化合物（Ｘ＝イミダゾリ
ル，in situ ＤＮＡ合成試薬）を得た。得られた化合物
の³¹Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ
₃Ｏ）₃Ｐ＝１４０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１３
２．４，１２９．０，１２８．５，１２８．４であっ
た。 【００２５】（応用例１） 実施例１で得られたホスホルアゾリド化合物（in situ
ＤＮＡ合成試薬）の重クロロホルム反応溶液（２．０ｍ
ｌ，約１ｍｍｏｌ）に、塩基保護−２’−デオキシシチ
ジン−ポリエチレングリコール誘導体（ポリエチレング
リコールの数平均分子量（Ｍｎ）３５０，式（３）にお
いてＢ＝シトシン誘導体，Ｒ³＝Ｒ⁴＝水素原子，Ａ＝フ
ェニレンのもの，６５０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）の重クロロ
ホルム溶液（２ｍｌ）をアルゴン雰囲気下、０℃で加
え、そのまま一晩４℃で静置して反応させ２量体を得
た。この時の第２番目のヌクレオシドの水酸基の反応選
択性は、³¹Ｐ ＮＭＲによると５’水酸基／３’水酸基
＝９２／８であった。得られた化合物の³¹Ｐ ＮＭＲ
（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ₃Ｏ）₃Ｐ＝１４
０ｐｐｍ，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝１４１．７，１４１．
０，１４０．８，１４０．４であった。上記の反応溶液
の一部（２ｍｌ，総重量２．９５ｇ，約０．５ｍｍｏ
ｌ）を測り取り、これを無水ジエチルエーテル（３０ｍ
ｌ）に攪拌しながら加えると、２〜５分で白色の固体が
析出した。更に１０分間激しく攪拌した後、４℃で一晩
放置した。デカンテーションしてエーテルを除去し、残
査は無水エーテル（５ｍｌ）で３回洗浄した。この残査
を減圧乾燥し、³¹Ｐ ＮＭＲを測定した結果、上記で得
られたスペクトルと同様であり、目的とした２量体が回
収されたことが確認できた（８８２mg，回収率８８
％）。 【００２６】（応用例２）実施例１で得られたホスホル
アゾリド化合物（in situ ＤＮＡ合成試薬）のクロロホ
ルム反応溶液（５ｍｌ，約２．５ｍｍｏｌ）に、Ｎ−ベ
ンゾイル−２’−デオキシアデノシン（８９０ｍｇ，
２．５ｍｍｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液
（１／２（ｖ／ｖ），５ｍｌ）をアルゴン雰囲気下、０
℃で加え、そのまま一晩４℃で静置して反応させ２量化
させた。この反応溶液に、室温条件下、予め別に３時間
以上減圧乾燥させておいた硫黄粉末（１６０ｍｇ，５ｍ
ｍｏｌ）を投入し、更に１２時間攪拌した。溶媒を室温
以下の温度で減圧留去し、残査をクロロホルム（２０ｍ
ｌ）に再溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（クロロホルム／メタノール＝１００／３）で精製する
と、目的とする２量体（チオリン酸トリエステル）が得
られた（３．４３ｇ，収率８８％）。得られた化合物の
³¹Ｐ ＮＭＲ（１６１．９ＭＨｚ，外部標準；（ＣＨ₃
Ｏ）₃Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣｌ₃）は、δ＝６６．３，
６６．０，６５．６であった。同様にＮ−イソブチリル
−２’−デオキシグアノシン（８９０ｍｇ，２．５ｍｍ
ｏｌ）のクロロホルム／ピリジン混合溶液（１／２（ｖ
／ｖ），５ｍｌ）を用いても、目的とする２量体（チオ
リン酸トリエステル）が得られた（３．１５ｇ，収率８
１％）。得られた化合物の³¹Ｐ ＮＭＲ（１６１．９Ｍ
Ｈｚ，外部標準；（ＣＨ₃Ｏ）₃Ｐ＝１４０ppm，ＣＤＣ
ｌ₃）は、δ＝６６．６，６６．２，６５．８，６５．
４であった。 【００２７】 【発明の効果】本発明のヌクレオチド化合物は、オリゴ
ヌクレオチドの製造において、ヌクレオチド鎖を構築す
る際の出発原料として、あるいは鎖長を伸長する基本構
成単位（ビルディングブロック）として利用できる。こ
れを利用して調製する多量体は、ポリエチレングリコー
ルの性質を利用して分離・精製することが可能で、従来
法のそれと比較すると生成物の取り扱いが極めて容易と
なる。従って本発明のヌクレオチド化合物は新たな多量
体ビルディングブロックの調製に対して極めて有用であ
る。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel nucleotide compound. The nucleotide compound of the present invention can be used, for example, as an intermediate in the production of oligodeoxyribonucleotides, using synthetic organic chemistry, It is a useful compound in the biochemical and pharmaceutical industries. [0002] For the synthesis of conventional oligodeoxyribonucleotides and oligoribonucleotides, a solid phase synthesis method has been employed. According to this method, using a starting material in which the 3'-hydroxyl group of a nucleoside is immobilized on an insoluble carrier such as porous glass, the oligonucleotide chain is extended one base at a time from the 3 'end to the 5' end. And the synthesis of oligonucleotides of any sequence is possible ( Kester et al., JP-B-62-50479).
And Kalzers et al., JP-B-63-28439). However, in the above-mentioned method, since all the steps are constituted by sequential reactions, an oligonucleotide having a target sequence cannot be obtained unless all the steps proceed as close as possible to a reaction yield of 100%. That is technically difficult. In particular, the phosphorylation reaction step (condensation reaction), which is the nucleotide chain extension step,
Even at the current highest level, the yield per each extension reaction is 98.5-
99.5%, and the degree of the reaction yield determines the overall yield of the oligonucleotide having the target sequence. Recently, it has been reported that as a measure for improving the overall yield, a synthesis method in which dimer nucleotides capable of reducing the number of times of condensation are used as building blocks when constructing nucleotide chains is effective. , Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (Bioorg. Med. Chem. Lett.,), 1997, 7, 73-7.
8.｝. In addition to the above, there are many methods for chemically synthesizing oligonucleotides using a dimer or more as a building block (for example, as a review, edited by The Chemical Society of Japan, "Review of Chemistry and Nucleic Acid Chemistry and Molecular Biology-Chemistry 46", Publishing Center, 1985, pp. 209-240.). However, these building blocks are extremely complicated in the series of steps of protecting / deprotecting and phosphorylating the hydroxyl groups, and require operations such as extraction and chromatography to remove by-products and impurities in each step. It is. These not only cause operational complexity, but also increase the cost of synthesizing the building blocks. [0003] An object of the present invention is to provide a novel nucleotide compound which is used as a starting material for a short-chain oligomer such as a dimer as a starting material in the production of an oligonucleotide. is there. Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, polyethylene glycol (PE) was added to the protecting group of the nucleobase of nucleoside.
When the nucleotide compound into which G) was introduced was used for the production of a short-chain oligodeoxyribonucleotide, it was found that the above problems were solved, and the present invention was completed. That is, the present invention is a nucleotide compound represented by the following formula (1). [0005] (Wherein B represents a nucleobase commonly used in nucleotide chemistry, and R ¹ and R ² represent a hydrogen atom, an alkyl group optionally containing a hetero atom, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl group. Show,
R ¹ and R ² may be the same or different, R ³ represents a protecting group commonly used in nucleotide chemistry, R ⁴ represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group or a trialkylsilyloxy group, X represents a dialkylamino group, an azolyl group or a saturated nitrogen heterocycle, and n represents 3
In the above integer, A represents a divalent group, an arylene group or a linear or branched alkylene group which may contain a hetero atom. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The nucleotide compound according to the present invention is a compound having a polyethylene glycol chain as a protecting group for an amino or imino group of a nucleobase as represented by the above formula (1). . B in the above formula (1) includes adenine, guanine, cytosine, thymine and uracil derivatives represented by the following formula (2). [0008] Further, R ¹ and R ² in the above formula (1)
The hydrogen atom, a methyl group, propyl group, butyl group, etc. 1,1-diethyl-3-butenyl group and the like, as R ³ is is the like 4,4'-dimethoxytrityl group, as R ⁴ Represents a hydrogen atom, a methoxy group, a t-butyldimethylsilyloxy group and the like; X includes a dimethylamino group, a diisopropylamino group, an imidazolyl group and a 4-methylimidazolyl group; and A represents a phenylene group, a methylene And a dimethylethylene group. [0010] The nucleotide compound of the present invention can be obtained by reacting a nucleoside represented by the following formula (3) with an appropriate phosphorylating agent. [0011] (Wherein B, R ³ , R ⁴ , A and n are the same as in the above formula (1)). The reaction with the phosphorylating agent is carried out according to the method of Kester and Calzas et al. It can be used, or a method according to another report of the present inventors (Kitamura et al., Japanese Patent Application No. 10-369384) can be used. For example, the reaction is carried out by drying the 5′-O, base-protected nucleoside represented by the formula (3) under reduced pressure or dissolving it in an organic solvent such as pyridine or 1,4-dioxane. After azeotropic dehydration, 0.9-1.2 equivalents of a compound represented by the following formula (4) in an organic solvent solution such as toluene, pyridine, tetrahydrofuran, chloroform and acetonitrile at -80 ° C to room temperature. Is achieved by reacting When the reaction is carried out at a low temperature, the yield of the nucleotide compound is better, and it is better to use an organic solvent which is dried with a desiccant and then purified by distillation.
The completion of the reaction may be confirmed by measuring the ³¹ P NMR spectrum of the reaction solution. Embedded image (Wherein R ¹ , R ² and X represent the above formula (1)
The nucleotide compound obtained in the above reaction may be used for the next reaction without separation and purification. For example, at least only the nucleobase is appropriately protected nucleoside compound, separately dried under reduced pressure or azeotropic operation, as a solution of an organic solvent such as toluene, pyridine, tetrahydrofuran, chloroform and acetonitrile, at -80 ° C to room temperature. The dimerization reaction is achieved by mixing and reacting with the above reaction solution under the conditions. In this case, the 3 ′ hydroxyl group of the nucleoside compound used in the above reaction need not necessarily be protected. The nucleotide compound of the present invention is soluble in acetonitrile, tetrahydrofuran, pyridine, an organic chlorine-based solvent and the like, and is reacted with a suitably protected second nucleoside in a good solvent for polyethylene glycol. Thereby, a dimer can be obtained. On the other hand, a poor solvent for polyethylene glycol, for example, diethyl ether or diisopropyl ether is added to the solution containing the dimer component in an amount of 5 to the amount of the solution.
Upon addition of up to 20 volumes, the dimer component precipitates and can be easily recovered. For this reason, most of the separation / purification operations required for obtaining a dimer component using a conventional protected nucleotide having no polyethylene glycol are unnecessary. Moreover, this separation / purification method is sufficient for the subsequent step of nucleotide chain construction, and this separation / purification method is also advantageous for obtaining a large amount of dimer nucleotides. Therefore, the nucleotide compound in the present invention is 2
It is possible to provide a very simple method for synthesizing oligodeoxyribonucleotides in preparing multimeric and multimeric building blocks. The compounds of the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the scope of the present invention. (Example 1) In the above formula (1), B = cytosine derivative, R ¹ = hydrogen atom, R ² = 1,1-diethyl-3-butenyl group, R ³
= 4,4′-dimethoxytrityl group, R ⁴ = hydrogen atom,
Example of Synthesis of Compound Where X = Imidazolyl Group and A = Phenylene Group (a) 2-Cyano-1- (1,1-diethyl-3-butenyl) ethoxydichlorophosphine (350 mg, 1.
Trimethylsilyl imidazole (0.40 ml, 2.75 mmol) was added to a solution of 25 mmol) in toluene (5 ml) under an argon atmosphere at room temperature and reacted for 5 minutes. After distilling off by-produced chlorotrimethylsilane and toluene at room temperature under reduced pressure for 10 minutes, residual toluene and excess trimethylsilylimidazole were distilled off under reduced pressure at 35 ° C. for 2 hours to obtain colorless, transparent, oily 2-cyano-
1- (1,1-Diethyl-3-butenyl) ethoxybisimidazolylphosphine was obtained. ³¹ PN of this compound
MR (161.9 MHz, external standard; (CH ₃ O) ₃ P =
140 ppm, CDCl ₃ ) was δ = 109.3. (B) 2-Cyano-1- obtained above
(1,1-diethyl-3-butenyl) was dissolved ethoxy bis imidazolylmethyl phosphine deuterochloroform (2.5 ml), and 0.50M solution, 5'-O, base protection was dried under reduced pressure for 2 hours at room temperature -2'-deoxycytidine-
Polyethylene glycol derivatives (number average molecular weight (Mn) of polyethylene glycol 350, B in the formula (3)
= Cytosine derivative, R ³ = 4,4'-dimethoxytrityl, R ⁴ = hydrogen, those where A = phenylene, 1.20 g,
1.25 mmol) under an argon atmosphere at room temperature. After homogenization, the mixture was allowed to stand still overnight for reaction to obtain a target phosphorazolide compound (X = imidazolyl, in situ DNA synthesis reagent). ³¹ P NMR of the obtained compound (161.9 MHz, external standard; (C
H ₃ O) ₃ P = 140 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 13
4.3, 131.5, 130.8, and 127.4. Example 2 In the above formula (1), B = thymine derivative, R ¹ = hydrogen atom, R ² = isopropyl group, R ³ = 4,4′-dimethoxytrityl group, R ⁴ = hydrogen atom, X = Synthesis of compound when 4-methylimidazolyl group and A = phenylene group In the same manner as in Example 1, 2-cyano-1-isopropylethoxydichlorophosphine (196 mg, 0.92
mmol), trimethylsilyl-4-methylimidazole (0.31 ml, 2.02 mmol), 5′-O, base-protected-thymidine-polyethylene glycol derivative (number average molecular weight (Mn) of polyethylene glycol 350,
In the formula (3) , B = thymine derivative, R ³ = 4,4′-
From dimethoxytrityl, R ⁴ = hydrogen atom, A = phenylene, 1.19 g, 1.23 mmol), the desired phosphorazolide compound (X = 4-methylimidazolyl, insitu DNA synthesis reagent) was obtained. ³¹ P NMR of the obtained compound (161.9 MHz, external standard; (CH
₃ O) ₃ P = 140 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 13
8.2, 127.9 and 124.4. Example 3 In the above formula (1), B = adenine derivative, R ¹ = hydrogen atom, R ² = t-butyl group, R ³ = 4,4′-dimethoxytrityl group, R ⁴ = hydrogen atom , X = imidazolyl group, A
= Synthesis of compound in the case of phenylene group In the same manner as in Example 1, 2-cyano-1-tert-butylethoxydichlorophosphine ( 240 mg, 1.05 m
mol), trimethylsilylimidazole (0.34 m
1, 2.32 mmol), 5'-O, base protection-2'-
Deoxyadenosine-polyethylene glycol derivative (number average molecular weight (Mn) of polyethylene glycol 35)
0, in formula (3) , B = adenine derivative, R ³ = 4
4′-dimethoxytrityl, R ⁴ = hydrogen atom, A = phenylene, 1.41 g, 1.40 mmol)
The desired phosphorazolide compound (X = imidazolyl, in
situ DNA synthesis reagent). ³¹ P of the obtained compound
NMR (161.9 MHz, external standard; (CH ₃ O) ₃
P = 140 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 132.1,
129.2, 128.9, 128.5. Example 4 In the above formula (1), B = guanine derivative, R ¹ = hydrogen atom, R ² = 1,1-diethyl-3-butenyl group, R ³ =
4,4′-dimethoxytrityl group, R ⁴ = hydrogen atom, X
= Synthesis of compound in the case of = imidazolyl group and A = benzylene group According to the same method as in Example 1, 2-cyano-1- (1,
1-diethyl-3-butenyl) ethoxydichlorophosphine (379 mg, 1.34 mmol), trimethylsilylimidazole (0.43 ml, 2.96 mmol)
l), 5'-O, base-protected 2'-deoxyguanosine - B = guanine derivative in a polyethylene glycol derivative (number average molecular weight of polyethylene glycol (Mn) 350, Equation ^(3), R 3 = 4,4'- Dimethoxytrityl, R ⁴ = hydrogen atom, A = benzylene, 1.62
g, 1.56 mmol) from the target phosphorazolide compound (X = imidazolyl, in situ DNA synthesis reagent)
Got. ³¹ P NMR (161.9 MH) of the obtained compound
z, external standard; (CH ₃ O) ₃ P = 140 ppm, CDC
l ₃ ) is δ = 132.5, 131.6, 128.6,
It was 128.4. Example 5 In the above formula (1), B = guanine derivative, R ¹ = hydrogen atom, R ² = 1,1- dimethyl -3-methyl-3-butenyl group, R ³ = 4,4 ′ -Dimethoxytrityl group, R ⁴ =
Synthesis of compound in which hydrogen atom, X = imidazolyl group, and A = methylene group By a method similar to that in Example 1, 2-cyano-1- (1,1- dimethyl -3-methyl-3-butenyl) ethoxydichloro Phosphine (383 mg, 1.4
3 mmol), trimethylsilylimidazole (0.4
6ml, 3.14mmol), 5'-O, base protection-
2'-deoxyguanosine-polyethylene glycol derivative (number average molecular weight (Mn) of polyethylene glycol)
350, in formula (3) , B = guanine derivative, R ³ =
4,4′-dimethoxytrityl, R ⁴ = hydrogen atom, A =
From the methylene group, 1.50 g, 1.56 mmol), the desired phosphorazolide compound (X = imidazolyl, in situ DNA synthesis reagent) was obtained. ³¹ P NMR of the obtained compound (161.9 MHz, external standard; (CH
₃ O) ₃ P = 140 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 13
2.4, 129.0, 128.5, and 128.4. (Application Example 1) The phosphorazolide compound obtained in Example 1 (in situ
DNA synthesis reagent) in deuterated chloroform (2.0 m
1, about 1 mmol), a base-protected-2′-deoxycytidine-polyethylene glycol derivative (polyethylene glycol number average molecular weight (Mn) 350, B = cytosine derivative in the formula (3) , R ³ = R ⁴ = hydrogen atom, A = phenylene, 650 mg, 1 mmol) in deuterated chloroform (2 ml) was added at 0 ° C. under an argon atmosphere, and the mixture was allowed to stand still at 4 ° C. overnight to obtain a dimer. At this time, the reaction selectivity of the hydroxyl group of the second nucleoside was 5'hydroxyl / 3'hydroxyl = 92/8 according to ³¹ P NMR. ³¹ P NMR of the obtained compound
(161.9 MHz, external standard; (CH ₃ O) ₃ P = 14
0 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 141.7, 141.
0, 140.8 and 140.4. Part of the above reaction solution (2 ml, total weight 2.95 g, about 0.5 mmol
l) was weighed, and this was dried with anhydrous diethyl ether (30 m
When l) was added with stirring, a white solid precipitated out in 2 to 5 minutes. After vigorous stirring for another 10 minutes, the mixture was left at 4 ° C. overnight. The ether was removed by decantation, and the residue was washed three times with anhydrous ether (5 ml). The residue was dried under reduced pressure, and ³¹ P NMR was measured. As a result, the spectrum was the same as that obtained above, and it was confirmed that the desired dimer was recovered (882 mg, recovery rate 88
%). (Application Example 2) N-benzoyl-2'-deoxyadenosine (890 mg, 5 ml, about 2.5 mmol) was added to a chloroform reaction solution (5 ml, about 2.5 mmol) of the phosphorazolide compound (in situ DNA synthesis reagent) obtained in Example 1.
2.5 mmol) of a mixed solution of chloroform / pyridine (1/2 (v / v), 5 ml) in an argon atmosphere under a 0 atmosphere atmosphere.
C., and allowed to stand still at 4 ° C. overnight for reaction to dimerize. To this reaction solution, sulfur powder (160 mg, 5 m
mol), and the mixture was further stirred for 12 hours. The solvent was distilled off under reduced pressure at a temperature lower than room temperature.
l) and purified by silica gel column chromatography (chloroform / methanol = 100/3) to obtain the desired dimer (thiophosphoric acid triester) (3.43 g, yield 88%). . Of the resulting compound
³¹ P NMR (161.9 MHz, external standard; (CH ₃
O) ₃ P = 140 ppm, CDCl ₃ ) is δ = 66.3
66.0 and 65.6. Similarly, N-isobutyryl-2′-deoxyguanosine (890 mg, 2.5 mm
ol) in a mixed solution of chloroform / pyridine (1/2 (v
/ V), 5 ml), the desired dimer (thiophosphoric acid triester) was obtained (3.15 g, yield 8).
1%). ³¹ P NMR of the obtained compound (161.9 M
Hz, external standard; (CH ₃ O) ₃ P = 140 ppm, CDC
l ₃ ) is δ = 66.6, 66.2, 65.8, 65.
It was 4. The nucleotide compound of the present invention can be used as a starting material for constructing a nucleotide chain or as a basic structural unit (building block) for elongating the chain length in the production of oligonucleotides. Multimers prepared using this can be separated and purified by utilizing the properties of polyethylene glycol, and the handling of the product is extremely easy as compared with that of the conventional method. Therefore, the nucleotide compounds of the present invention are extremely useful for preparing new multimeric building blocks.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，1989年，Ｖｏｌ．17， Ｎ ｏ．12，ｐ．4863−4871 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 19/16 - 19/10 C07H 19/16 - 19/207 C07H 21/00 - 21/04 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References Nucleic Acids Research, 1989, Vol. 17, No. 12, p. 4863-4871 (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁷ , DB name) C07H 19/16-19/10 C07H 19/16-19/207 C07H 21/00-21/04 REGISTRY (STN) CA (STN ) CAOLD (STN)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】 【請求項１】下記式（１）で表されるヌクレオチド化合
物。 【化１】 （式中、Ｂはヌクレオチド化学において通常用いられる
核酸塩基を示し、Ｒ¹およびＲ²は水素原子、ヘテロ原子
を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、ア
リール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ¹とＲ²は同一
であっても異なっていても良く、Ｒ³はヌクレオチド化
学において通常用いられる保護基を示し、Ｒ⁴は水素原
子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオ
キシ基を示し、Ｘはジアルキルアミノ基、アゾリル基も
しくは飽和窒素複素環を示し、ｎは３以上の整数、Ａは
２価基でアリレン基もしくはヘテロ原子を含んでも良い
直鎖あるいは分岐鎖を含むアルキレン基を示す。）(57) [Claim 1] A nucleotide compound represented by the following formula (1). Embedded image (Wherein B represents a nucleobase commonly used in nucleotide chemistry, R ¹ and R ² represent a hydrogen atom, an alkyl group optionally containing a hetero atom, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl group; ¹ and R ² may be the same or different; R ³ represents a protecting group commonly used in nucleotide chemistry; R ⁴ represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group or a trialkylsilyloxy group; Represents a dialkylamino group, an azolyl group or a saturated nitrogen heterocyclic ring, n represents an integer of 3 or more, and A represents a bivalent group, an arylene group or a linear or branched alkylene group which may contain a hetero atom.)