JP3482140B2 - Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method - Google Patents

Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method

Info

Publication number
JP3482140B2
JP3482140B2 JP28414898A JP28414898A JP3482140B2 JP 3482140 B2 JP3482140 B2 JP 3482140B2 JP 28414898 A JP28414898 A JP 28414898A JP 28414898 A JP28414898 A JP 28414898A JP 3482140 B2 JP3482140 B2 JP 3482140B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
electrode
acid chain
electrodes
potential
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP28414898A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2000106874A (en
Inventor
幸二 橋本
義雄 石森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toshiba Corp
Original Assignee
Toshiba Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toshiba Corp filed Critical Toshiba Corp
Priority to JP28414898A priority Critical patent/JP3482140B2/en
Publication of JP2000106874A publication Critical patent/JP2000106874A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP3482140B2 publication Critical patent/JP3482140B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00653—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to electrodes embedded in or on the solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709—Type of synthesis
    • B01J2219/00713—Electrochemical synthesis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸鎖合成方法、
この方法を用いて作成した核酸固定化チップおよびこの
核酸固定化チップを用いた核酸鎖検出方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nucleic acid chain synthesis method,
The present invention relates to a nucleic acid-immobilized chip prepared using this method and a nucleic acid chain detection method using this nucleic acid-immobilized chip.

【０００２】[0002]

【従来の技術】最近、ＤＮＡチップによる遺伝子検査技
術が注目を集めている（Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．
１９９３， Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ． １９９１，
Ｋｈｒａｐｋｏ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ． １９９４）。ＤＮＡチップ
は、１０１〜１０５種類の配列が異なるＤＮＡプローブ
を固定化した、数ｃｍ角の硝子やシリコンのチップから
できており、チップ上で蛍光色素や放射線同位元素（Ｒ
Ｉ）等で標識した試料遺伝子、あるいは未標識の試料遺
伝子と標識オリゴヌクレオチドの混合物を反応させる。
試料中にチップ上のＤＮＡプローブと相補的な配列が存
在すると、チップ上の特定部位で標識に由来する信号が
得られる。固定化しておいたＤＮＡプローブの配列と位
置があらかじめ分っていれば、試料遺伝子中に存在する
塩基配列を簡単に調べることができる。ＤＮＡチップ
は、１回の試験で塩基配列に関する多くの情報が得られ
ることから、単なる遺伝子検出技術に止まらずシーケン
ス技術としても大いに期待されている（Ｐｅａｓｅ ｅ
ｔ ａｌ． １９９４， Ｐａｒｉｎｏｖ ｅｔ ａ
ｌ． １９９６）。チップ上へのＤＮＡプローブの固定
化に関しては、（１）チップ上でＤＮＡプローブを合成
する方法、（２）あらかじめ合成しておいたＤＮＡプロ
ーブをチップ上に固定化する方法の２種類が報告されて
いる。前者の方法はフォトリソグラフィー技術を利用し
て、１／２インチ角のチップ内に配列の異なるＤＮＡ
プローブを１００Ａ（オングストローム）の間隔で２０
×２０μｍ毎に固定化できるので、約４×１０５種類の
プローブからなるチップを作製できる（Ｃｈｅｅ ｅｔ
ａｌ． １９９６）。フォトリソグラフィー技術は現
在０．１μｍ程度のパターニングも可能になりつつある
ことから、今後更にプローブの集積化が進む可能性があ
る。また、後者の方法はあらかじめ多種類のプローブを
用意する必要があること、プローブの集積度が前者の方
法より低い（１２０μｍの間隔で６０×６０μｍ毎）等
の問題はあるものの、ゲルのマトリックス内に３次元的
にプローブを固定化できるので、反応効率の点では優れ
ている（Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）。
また、ゲルの代わりに多孔質のシリコンに３次元的にプ
ローブを固定化する方法も報告されている（Ｂｅａｔｔ
ｉｅ ｅｔａｌ． １９９５）。2. Description of the Related Art Recently, a genetic testing technique using a DNA chip has been attracting attention (Beattie et al.
1993, Fodor et al. 1991,
Khrapko et al. 1989, Sou
then et al. 1994). The DNA chip is made of a glass or silicon chip of several cm square on which DNA probes of 101 to 105 different sequences are immobilized, and a fluorescent dye or a radioisotope (R
A sample gene labeled with I) or the like or a mixture of an unlabeled sample gene and a labeled oligonucleotide is reacted.
When the sample has a sequence complementary to the DNA probe on the chip, a signal derived from the label is obtained at a specific site on the chip. If the sequence and the position of the immobilized DNA probe are known in advance, the nucleotide sequence present in the sample gene can be easily examined. Since a large amount of information on the nucleotide sequence can be obtained in a single test, a DNA chip is highly expected as a sequencing technique as well as a mere gene detection technique (Pease e).
t al. 1994, Parinov et a
l. 1996). Regarding the immobilization of the DNA probe on the chip, two types of methods have been reported: (1) a method of synthesizing the DNA probe on the chip, and (2) an method of immobilizing the DNA probe previously synthesized on the chip. ing. The former method uses photolithography technology and uses different DNA sequences in a 1/2 inch square chip.
20 probes at 100 A (Angstrom) intervals
Since it can be fixed every × 20 μm, a chip composed of about 4 × 105 kinds of probes can be manufactured (Chee et.
al. 1996). Since the photolithography technique is now capable of patterning about 0.1 μm, there is a possibility that the probe will be further integrated in the future. In addition, the latter method has problems that it is necessary to prepare many kinds of probes in advance and that the degree of probe integration is lower than that of the former method (every 60 × 60 μm at intervals of 120 μm), but in the gel matrix. Since the probe can be immobilized three-dimensionally on the surface, it is superior in terms of reaction efficiency (Guschin et al. 1997).
Also, a method of three-dimensionally immobilizing a probe on porous silicon instead of gel has been reported (Beatt).
ie et al. 1995).

【０００３】この様なＤＮＡチップは、１回の試験で複
数の情報が得られる等の特徴を持つが、その作製には複
雑な反応制御が必要なため、ＤＮＡチップは非常に高価
なものであった。また、検出には蛍光や放射線同位元素
などを用いる為に、検出に高価な光学系が必要であった
り、使用できる設備が限定されるなどの問題があった。
更に、感度が低い為に、解析にはＰＣＲ反応などで増幅
した核酸を用いる必要があった。Such a DNA chip is characterized in that a plurality of pieces of information can be obtained in one test. However, the production of the DNA chip requires complicated reaction control, so that the DNA chip is very expensive. there were. Further, since fluorescence or radioisotope is used for the detection, there are problems that an expensive optical system is necessary for the detection, or the equipment that can be used is limited.
Furthermore, because of its low sensitivity, it was necessary to use nucleic acids amplified by PCR reaction or the like for analysis.

【０００４】また、一方で電気化学的な信号を検出する
手法遺伝子検出法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．
１９９３， Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｍ
ｉｌｌａｎ ａｎｄ Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ １９９３，
Ｍｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｍｉｓｈ
ｉｍａ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｗａｎｇ ｅｔａ
ｌ． １９９７）が開発されている。電気化学的な手法
は、操作が簡便であり、ＤＮＡチップよりも測定感度が
高い特長を持つが、得られる情報（塩基配列）は単一の
ものであった。On the other hand, a method for detecting an electrochemical signal, a gene detection method (Hashimoto et al.
1993, Liu et al. 1996, M
illan and Mikkelsen 1993,
Millan et al. 1994, Mish
ima et al. 1997, Wang eta
l. 1997) has been developed. The electrochemical method has the features that the operation is simple and the measurement sensitivity is higher than that of the DNA chip, but the information (base sequence) obtained is single.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明は前記問題点を
解決するためになされたものであり、新しい核酸鎖合成
方法、コスト、簡便性、感度の点で優れたＤＮＡチップ
およびこれを用いた核酸鎖検出方法を提供することを目
的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and uses a novel nucleic acid chain synthesis method, a DNA chip excellent in cost, simplicity, and sensitivity, and a DNA chip using the same. An object is to provide a method for detecting a nucleic acid chain.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明の核酸鎖合成方法
は、基板上に互いに絶縁された複数個の電極を形成する
工程と、これらの複数個の電極上に、ヂメトキシトリチ
ルチオールを固定化する工程と、プロトン性溶媒中で前
記複数個の電極のうち、核酸合成を行う部位の電極に電
位を選択的に印加して、この電極上の前記ヂメトキシト
リチルチオールを除去するとともに、この電極上に活性
なヒドロキシル基を発生させるステップと、この電極上
の前記ヒドロキシル基にホスホアミダイトおよびテトラ
ゾール溶液を反応させる工程と、未反応の前記ヒドロキ
シル基を除去する工程と、これらの工程を繰り返すこと
により、特定の電極位置に特定の配列の核酸鎖を合成す
る工程と、を備えたことを特徴とする。本発明の核酸鎖
固定化チップは、上記核酸鎖合成方法により、核酸鎖が
固定されたことを特徴とする。本発明の核酸鎖検出方法
は、上記核酸鎖固定化チップの電極上に固定された核酸
鎖にＤＮＡ結合物質と反応させる工程と、これらの電極
に前記ＤＮＡ結合物質が電気化学的に反応する電位以上
の電位を印加し、反応電流を測定する工程と、を備えた
ことを特徴とする。A method for synthesizing a nucleic acid chain according to the present invention comprises a step of forming a plurality of electrodes insulated from each other on a substrate and immobilizing dimethoxytritylthiol on the plurality of electrodes. Of the plurality of electrodes in a protic solvent, a potential is selectively applied to the electrode at the site for nucleic acid synthesis to remove the dimethoxytritylthiol on the electrode, and Generating active hydroxyl groups on the electrode, reacting the hydroxyl groups on the electrode with a solution of phosphoramidite and tetrazole, removing the unreacted hydroxyl groups, and repeating these steps And synthesizing a nucleic acid chain having a specific sequence at a specific electrode position. The nucleic acid chain-immobilized chip of the present invention is characterized in that the nucleic acid chain is immobilized by the above-described nucleic acid chain synthesis method. A method for detecting a nucleic acid chain of the present invention comprises a step of reacting a nucleic acid chain fixed on an electrode of the above-mentioned nucleic acid chain-immobilized chip with a DNA binding substance, and a potential at which the DNA binding substance electrochemically reacts with these electrodes. And a step of measuring the reaction current by applying the above potential.

【０００７】本発明で使用する基板材料は特に限定され
るものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミ
ナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪
素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、
ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブ
チレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエス
テル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリ
デン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリ
ル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネー
ト、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキ
シ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共
重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合
体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリ
スルホン等の有機材料を用いることができる。The substrate material used in the present invention is not particularly limited. For example, inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used. Also,
Polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate Organic materials such as polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone can be used.

【０００８】電極材料は特に限定されるものではない。
例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケ
ル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、
タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいは
グラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこ
れらの酸化物、化合物を用いる事ができる。更に、酸化
珪素等の半導体化合物や、ＣＣＤ、ＦＥＴ、ＣＭＯＳな
ど各種半導体デバイスを用いることが可能である。電極
は、メッキ、印刷、スパッタ、蒸着などでも作製するこ
とができる。蒸着を行う場合は、抵抗加熱法、高周波加
熱法、電子ビーム加熱法により電極膜を形成することが
できる。また、スパッタリングを行う場合は、直流２極
スパッタリング、バイアススパッタリング、非対称交流
スパッタリング、ゲッタスパッタリング、高周波スパッ
タリングで電極膜を形成することが可能である。更に、
ポリピロール、ポリアニリンなどの電解重合膜や導電性
高分子も用いることが可能である。The electrode material is not particularly limited.
For example, gold, gold alloys, silver, platinum, mercury, nickel, palladium, silicon, germanium, gallium,
It is possible to use simple metals such as tungsten and alloys thereof, carbon such as graphite and glassy carbon, and oxides and compounds thereof. Furthermore, it is possible to use semiconductor compounds such as silicon oxide and various semiconductor devices such as CCD, FET, and CMOS. The electrodes can also be manufactured by plating, printing, sputtering, vapor deposition, or the like. When vapor deposition is performed, the electrode film can be formed by a resistance heating method, a high frequency heating method, or an electron beam heating method. When sputtering is performed, the electrode film can be formed by DC bipolar sputtering, bias sputtering, asymmetric AC sputtering, getter sputtering, and high frequency sputtering. Furthermore,
It is also possible to use an electropolymerized film such as polypyrrole or polyaniline or a conductive polymer.

【０００９】本発明で用いられる絶縁材料は特に限定さ
れるものではないが、フォトポリマー、フォトレジスト
材料であることが好ましい。レジスト材料としては、光
露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジスト、Ｘ線
用フォトレジスト、電子線用フォトレジストが用いられ
る。光露光用フォトレジストには、主原料が環化ゴム、
ポリけい皮酸、ノボラック樹脂があげられる。遠紫外用
フォトレジストには、環化ゴム、フェノール樹脂、ポリ
メチルイソプロペニルケトン（ＰＭＩＰＫ），ポリメチ
ルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等が用いられる。また、
Ｘ線用レジストには、ＣＯＰ、メタルアクリレートほ
か、薄膜ハンドブック（オーム社）に記載の物質を用い
ることができる、更に電子線用レジストには、ＰＭＭＡ
等上記文献に記載の物質を用いることが可能である。こ
こで用いるレジストは１００Ａ（オングストローム）以
上１ｍｍ以下であることが望ましい。フォトレジストで
電極を被覆し、リソグラフィーを行うことで、面積を一
定にすることが可能になる。これにより、ＤＮＡプロー
ブの固定化量がそれぞれの電極間で均一になり、再現性
に優れた測定を可能にする。従来、レジスト材料は最終
的には除去するのが一般的であるが、遺伝子検出用電極
ではレジスト材料は除去することなく電極の一部として
用いることも可能である。この場合は、用いるレジスト
材料に耐水性の高い物質を使用する必要がある。電極上
部に形成する絶縁層にはフォトレジスト材料以外でも用
いることが可能である。例えば、Ｓｉ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｚ
ｎ、Ｐｂ、Ｃｄ、Ｗ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｔａ、Ｎｉ等の酸化
物、窒化物、炭化物、その他合金を用いることも可能で
ある。これらの材料をスパッタ、蒸着あるいはＣＶＤ等
を用いて薄膜を形成した後、フォトリソグラフィーで電
極露出部のパターニングを行い、面積を一定に制御す
る。The insulating material used in the present invention is not particularly limited, but photopolymer and photoresist materials are preferable. As the resist material, a photo-exposure photoresist, a far-ultraviolet photoresist, an X-ray photoresist, and an electron beam photoresist are used. The main raw material for photoexposure photoresist is cyclized rubber,
Examples include polycinnamic acid and novolac resins. Cyclic rubber, phenolic resin, polymethyl isopropenyl ketone (PMIPK), polymethyl methacrylate (PMMA), etc. are used for the far ultraviolet photoresist. Also,
For the X-ray resist, COP, metal acrylate, and other substances described in the Thin Film Handbook (Ohm Co.) can be used. For the electron beam resist, PMMA can be used.
It is possible to use the substances described in the above documents. The resist used here is preferably 100 A (angstrom) or more and 1 mm or less. By coating the electrodes with photoresist and performing lithography, it is possible to make the area constant. As a result, the immobilized amount of the DNA probe becomes uniform between the respective electrodes, which enables measurement with excellent reproducibility. Conventionally, it is general that the resist material is finally removed, but in the gene detection electrode, the resist material can be used as a part of the electrode without being removed. In this case, it is necessary to use a highly water-resistant substance as the resist material used. It is possible to use materials other than the photoresist material for the insulating layer formed on the electrodes. For example, Si, Ti, Al, Z
It is also possible to use oxides, nitrides, carbides and other alloys of n, Pb, Cd, W, Mo, Cr, Ta, Ni and the like. After forming a thin film using these materials by sputtering, vapor deposition, CVD, or the like, the electrode exposed portion is patterned by photolithography to control the area to be constant.

【００１０】電極は１つの素子上に幾つかの電極部を構
成し、異なったプローブを固定化することで、一度に数
種類の標的に対して検査を行うことができる。また、１
つの素子上に幾つかの電極部を構成し、同じプローブを
固定化することで、一度に数検体の検査を行うことも可
能である。この場合、フォトリソグラフィーを利用し
て、あらかじめ基板上複数の電極をパターニングしてお
く。この際、隣同士の電極が接触しないように、絶縁膜
で仕切りを付けることは有効である。仕切りの高さは
０．１ミクロンから１００ミクロン程度が望ましい。Electrodes can be used to test several types of targets at once by imposing several electrodes on one element and immobilizing different probes. Also, 1
It is also possible to test several samples at once by forming several electrode parts on one element and immobilizing the same probe. In this case, a plurality of electrodes are patterned on the substrate in advance by using photolithography. At this time, it is effective to partition with an insulating film so that adjacent electrodes do not come into contact with each other. The partition height is preferably about 0.1 to 100 microns.

【００１１】電極表面で直接あるいは間接的に核酸鎖の
合成を行う。直接合成を行う場合には、あらかじめ電極
表面に官能基を修飾する必要がある。また間接的に行う
場合には、核酸合成用の担体を電極表面に吸着すること
で、核酸鎖の合成を行うことが可能になる。たとえば、
核酸鎖合成で良く用いられている、デオキシヌクレオシ
ド−オキサリル−コントロールポアガラス（ＣＰＧ）や
デオキシヌクレオシド−長鎖アルキルアミン−ＣＰＧを
電極表面に吸着、包括、あるいは膜などで挟み込み、電
極表面に固定する。核酸鎖の合成には、β−シアノエチ
ルホスホアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法を用いるこ
とができる。通常、上記２種類の合成法においては５'
−ヒドロキシ基の保護にジメトキシトリチル基あるいは
モノメトキシトリチル基などが用いられている。そし
て、たとえば脱保護反応には、ジクロロ酢酸などの酸が
用いられるが、電気化学的にプロトンを発生させれば、
同様の効果を期待できる。電気化学的にプロトンを発生
させる手段としては、溶媒の電気化学的な反応、あるい
は溶媒中に溶解している電解質の電気化学的な反応によ
り発生させることができる。たとえば、プロトンを発生
する溶媒として、水や、メタノール、エタノール、プロ
ピルアルコールなどのアルコール類、フェノール類等の
プロトン性溶媒と、更にこれらの混合溶媒が挙げられ
る。また、電解質としては、芳香族化合物類、カルボン
酸類、アルデヒド類等が挙げられる。また、電気化学的
な反応を使って直接保護基を脱離させることも可能であ
る。試薬は連続的に供給することが可能であるので、核
酸鎖の合成も連続的行うことが可能である。Nucleic acid chains are synthesized directly or indirectly on the electrode surface. When performing direct synthesis, it is necessary to modify the surface of the electrode with a functional group in advance. Further, in the case of performing indirectly, the nucleic acid chain can be synthesized by adsorbing a carrier for nucleic acid synthesis on the electrode surface. For example,
Deoxynucleoside-oxalyl-controlled pore glass (CPG) and deoxynucleoside-long-chain alkylamine-CPG, which are often used in nucleic acid chain synthesis, are adsorbed on, entrapped with, or sandwiched with a membrane on the electrode surface, and fixed on the electrode surface. . The β-cyanoethylphosphoamidite method and the H-phosphonate method can be used for the synthesis of the nucleic acid chain. Usually, in the above two kinds of synthesis methods, 5 '
-A dimethoxytrityl group or a monomethoxytrityl group is used for protecting the hydroxy group. Then, for example, an acid such as dichloroacetic acid is used in the deprotection reaction, but if an electrochemically generated proton is generated,
The same effect can be expected. As a means for electrochemically generating a proton, it can be generated by an electrochemical reaction of a solvent or an electrochemical reaction of an electrolyte dissolved in the solvent. Examples of the solvent that generates a proton include water, alcohols such as methanol, ethanol and propyl alcohol, protic solvents such as phenols, and a mixed solvent thereof. Further, examples of the electrolyte include aromatic compounds, carboxylic acids, aldehydes and the like. It is also possible to remove the protecting group directly using an electrochemical reaction. Since the reagents can be continuously supplied, the nucleic acid chain can be continuously synthesized.

【００１２】検出する遺伝子は特に限定されるものでは
ない。例えば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｆ、Ｇ型）、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ヘルペ
ス群ウイルス、アデノウイルス、ヒトポリオーマウイル
ス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ム
ンプスウイル素、ヒトロタウイルス、エンテロウイル
ス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイル
ス、ＨＴＬＶ、等のウイルス感染症、黄色ブドウ球菌、
溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ菌、ヘリ
コバクターピロリ菌、カンピロバクター、コレラ菌、赤
痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、リステリア
菌、レプトスピラ、レジオネラ菌、スピロヘータ、肺炎
マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、マラリア、
赤痢アメーバ、病原真菌、等の細菌感染症、寄生虫、真
菌の検出に用いることができる。また、遺伝性疾患、網
膜芽細胞腫、ウイルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシ
ス、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、神経腺維腫症、家族
性乳ガン、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃
ガン、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺ガン、甲状腺腫瘍、
乳腺腫瘍、泌尿器腫瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚
腫瘍、骨・軟部腫瘍、白血病、リンパ腫、固形腫瘍、等
の腫瘍性疾患を検査することが可能である。また、医療
以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農
業、畜産、漁業、林業などで遺伝子検査が必要なものに
全て適応可能である。また、ＰＣＲ等で増幅した遺伝子
の検出に対しても用いることは可能である。更に、標的
遺伝子はあらかじめ電気化学的に活性な物質や、ＦＩＴ
Ｃ、ローダミン、アクリジン等の蛍光物質、アルカリホ
スファターゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ等の酵素、ハプテン、発光物質、抗体、抗原、金コ
ロイドなどのコロイド粒子、金属、金属イオン更にはト
リスビピリジン、トリスフェナントロリン、ヘキサアミ
ン等との金属キレート等で標識しておくことも可能であ
る、遺伝子検出用電極で使用する試料は特に限定される
物ではなく、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精
液、唾液、組織、培養細胞、喀痰等を用いることができ
る。これら検体試料から核酸成分の抽出を行う。抽出方
法は特に限定される物ではなく、フェノールー−クロロ
ホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を
用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡ
ａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、スマイテスト（住友金属
社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した
核酸成分と遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーショ
ン反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の
範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶
液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキ
ストランや、サケ***ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴ
Ａ、界面活性剤などを添加することが可能である。ここ
に抽出した核酸成分を添加し、９０℃以上で熱変性させ
る。遺伝子検出用電極の挿入は、変性直後、あるいは０
℃に急冷後に行うことができる。また、基板上に液を滴
下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも
可能である。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操
作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃
〜９０℃の範囲で、また反応時間は１分以上１晩程度行
う。ハイブリダイゼーション反応後、電極を取り出し洗
浄を行う。洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲
で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。The gene to be detected is not particularly limited. For example, hepatitis virus (A, B, C, D, E,
F, G type), HIV, influenza virus, herpes group virus, adenovirus, human polyoma virus, human papilloma virus, human parvovirus, mumps virus, human rotavirus, enterovirus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, rubella virus, HTLV. , Viral infections, Staphylococcus aureus, etc.
Streptococcus haemolyticus, pathogenic E. coli, Vibrio parahaemolyticus, Helicobacter pylori, Campylobacter, Cholera, Shigella, Salmonella, Yersinia, gonorrhea, Listeria, Leptospira, Legionella, Spirocheta, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia, Chlamydia, malaria,
It can be used for detection of bacterial infections, parasites and fungi such as dysentery amoeba and pathogenic fungi. In addition, hereditary diseases, retinoblastoma, Wilms tumor, familial colorectal polyposis, hereditary non-polyposis colorectal cancer, neurofibromatosis, familial breast cancer, xeroderma pigmentosum, brain tumor, oral cancer, esophageal cancer, Gastric cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, lung cancer, thyroid tumor,
It is possible to test for neoplastic diseases such as breast tumor, urinary organ tumor, male organ tumor, female organ tumor, skin tumor, bone / soft tissue tumor, leukemia, lymphoma, solid tumor and the like. In addition to medical treatment, it can be applied to food inspection, quarantine, pharmaceutical inspection, forensic medicine, agriculture, livestock, fisheries, forestry, etc. that require genetic inspection. It can also be used for detection of genes amplified by PCR or the like. Furthermore, the target gene may be an electrochemically active substance or FIT in advance.
C, rhodamine, acridine, and other fluorescent substances, alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, and other enzymes, haptens, luminescent substances, antibodies, antigens, colloidal particles such as gold colloids, metals, metal ions, and also trisbipyridine, trisphenanthroline, It is also possible to label with a metal chelate with hexaamine or the like, and the sample used in the electrode for gene detection is not particularly limited, and examples thereof include blood, serum, white blood cells, urine, feces, semen, saliva. , Tissue, cultured cells, sputum, etc. can be used. Nucleic acid components are extracted from these specimen samples. The extraction method is not particularly limited, and a liquid-liquid extraction method such as a phenol-chloroform method or a solid-liquid extraction method using a carrier can be used. In addition, a commercially available nucleic acid extraction method QIA
It is also possible to use amp (manufactured by QIAGEN), Sumitest (manufactured by Sumitomo Metal Co., Ltd.) and the like. Next, a hybridization reaction is performed between the extracted nucleic acid component and the gene detection electrode. The reaction solution is carried out in a buffer solution having an ionic strength of 0.01 to 5 and a pH of 5 to 10. In this solution, dextran sulfate, which is a hybridization promoter, salmon sperm DNA, calf thymus DNA, EDT
It is possible to add A, a surfactant and the like. The extracted nucleic acid component is added thereto, and heat denatured at 90 ° C. or higher. Insert the gene detection electrode immediately after denaturation or 0
It can be performed after quenching to ℃. It is also possible to carry out the hybridization reaction by dropping the liquid on the substrate. During the reaction, the reaction rate can be increased by an operation such as stirring or shaking. Reaction temperature is 10 ℃
The reaction is carried out at a temperature range of up to 90 ° C. for a reaction time of 1 minute or longer and about overnight. After the hybridization reaction, the electrode is taken out and washed. For washing, a buffer solution having an ionic strength of 0.01 to 5 and a pH of 5 to 10 is used.

【００１３】電気化学的に活性なＤＮＡ結合物質を用い
た検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。
基板は洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的
に結合するＤＮＡ結合物質を作用させ、電気化学的な測
定を行う。ここで用いられるＤＮＡ結合物質は特に限定
される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、ア
クリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタ
ロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインタ
ーカレーター、トリスインターカレーター、ポリインタ
ーカレーター等を用いることが可能である。ＤＮＡ結合
物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には
１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この
際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０
の範囲の緩衝液を用いる。電極をＤＮＡ結合物質と反応
させた後、洗浄し、電気化学的な測定を行う。電気化学
的な測定は、３電極タイプ、すなわち参照電極、対極、
作用極、あるいは２電極タイプ、すなわち対極、作用極
で行う。測定では、ＤＮＡ結合物質が電気化学的に反応
する電位以上の電位を印加し、ＤＮＡ結合物質に由来す
る反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引す
るか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位
を印加することができる。測定には、ポテンショスタッ
ト、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレ
ーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られ
た電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出す
る。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝
子抽出部、遺伝子反応部、ＤＮＡ結合物質反応部、電気
化学測定部、洗浄部等から構成される。When detection is performed using an electrochemically active DNA-binding substance, detection is carried out by the following procedure.
After washing the substrate, a DNA binding substance that selectively binds to the double-stranded portion formed on the electrode surface is made to act, and electrochemical measurement is performed. The DNA-binding substance used here is not particularly limited, and examples thereof include Hoechst 33258, acridine orange, quinacrine, dounomycin, metallointercalator, bisintercalator such as bisacridine, tris intercalator, polyintercalator and the like. It can be used. The concentration of the DNA-binding substance varies depending on its type, but it is generally used in the range of 1 ng / ml to 1 mg / ml. At this time, in the range of ionic strength 0.001-5, pH 5-10
A buffer solution in the range of is used. After the electrode is reacted with the DNA-binding substance, it is washed and electrochemically measured. Electrochemical measurements are of three-electrode type: reference electrode, counter electrode,
The working electrode or the two-electrode type, that is, the counter electrode and the working electrode is used. In the measurement, a potential higher than the potential at which the DNA-binding substance electrochemically reacts is applied, and the reaction current value derived from the DNA-binding substance is measured. At this time, the potential can be swept at a constant speed, pulsed, or a constant potential can be applied. For measurement, current and voltage are controlled using a device such as a potentiostat, a digital multimeter, and a function generator. The concentration of the target gene is calculated from the calibration curve based on the obtained current value. A gene detection device using a gene detection electrode is composed of a gene extraction part, a gene reaction part, a DNA binding substance reaction part, an electrochemical measurement part, a washing part and the like.

【００１４】また、サンプルをあらかじめ蛍光標識する
かあるいはセカンドプローブとして蛍光標識した核酸鎖
を用いることで、蛍光強度を指標に遺伝子の検出が可能
になる。この際、蛍光顕微鏡など組み合わせて用いる
と、核酸鎖の集積度を高めることが可能になる。Further, by preliminarily fluorescently labeling a sample or using a fluorescently labeled nucleic acid chain as a second probe, it becomes possible to detect a gene using fluorescence intensity as an index. At this time, when used in combination with a fluorescence microscope or the like, the degree of accumulation of nucleic acid chains can be increased.

【００１５】[0015]

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を、実施例に
基づいて説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments of the present invention will be described based on Examples.

【００１６】（実施例 １）：電極上での直接的な核酸
鎖の合成 あらかじめ、１ｃｍ角のガラス基板上に１００ミクロン
角の金電極を３０ｘ３０個パターニングする（図１）。
各電極間は５０ミクロンの絶縁膜で仕切られた構造を取
る。金電極上にはヂメトキシトリチル（ＤＭＴ）チオー
ルを固定化しておく。次にメタノールを溶媒として流
し、その際、核酸鎖の合成を行う部位の電極に２Ｖの電
位を印加する（図２）。電位を印加した部位のＤＭＴは
電極上で発生したプロトンにより脱離し、電極表面には
活性なヒドロキシル基が現れる。次に、ホスホアミダイ
トとテトラゾール溶液を反応させ、電極表面が活性な部
位にのみ核酸が導入される。次に、未反応のヒドロキシ
ル基をキャッピングする為に無水酢酸／イミダゾール溶
液と反応させる。更に、よう素でりん酸基を安定化させ
る。このサイクルを連続して行うと、特定の位置に特定
の配列の核酸鎖を合成することが可能になる。Example 1 Direct Synthesis of Nucleic Acid Chain on Electrode 30 × 30 100 micron square gold electrodes are patterned on a 1 cm square glass substrate in advance (FIG. 1).
The electrodes are separated from each other by an insulating film of 50 μm. Dimethoxytrityl (DMT) thiol is immobilized on the gold electrode. Next, methanol is caused to flow as a solvent, and a potential of 2 V is applied to the electrode at the site where the nucleic acid chain is synthesized (FIG. 2). The DMT at the site to which a potential is applied is desorbed by the protons generated on the electrode, and an active hydroxyl group appears on the electrode surface. Next, the phosphoramidite is reacted with a tetrazole solution, and the nucleic acid is introduced only into the active site on the electrode surface. Then react with acetic anhydride / imidazole solution to cap unreacted hydroxyl groups. Further, iodine stabilizes the phosphate group. When this cycle is continuously performed, it becomes possible to synthesize a nucleic acid chain having a specific sequence at a specific position.

【００１７】（実施例 ２）：電極上での間接的な核酸
鎖の合成 あらかじめ、２ｃｍ角のガラス基板上に５０ミクロン角
のグラファイト電極を１００ｘ１００個パターニングす
る。各電極間は５０ミクロンの絶縁膜で仕切られた構造
を取る。各電極上には、ＤＭＴヌクレオシド−長鎖アル
キルアミン−ＣＰＧを固定化しておく（図３）。次にメ
タノールを溶媒として流し、その際、核酸鎖の合成を行
う部位の電極に２Ｖの電位を印加する。電位を印加した
部位のＤＭＴは電極上で発生したプロトンにより脱離
し、電極表面には活性なヒドロキシル基が現れる。次
に、ホスホアミダイトとテトラゾール溶液を反応させ、
電極表面が活性な部位にのみ核酸が導入される。次に、
未反応のヒドロキシル基をキャッピングする為に無水酢
酸／イミダゾール溶液と反応させる。更に、よう素でり
ん酸基を安定化させる。このサイクルを連続して行う
と、特定の位置に特定の配列の核酸鎖を合成することが
可能になる。Example 2 Indirect Synthesis of Nucleic Acid Chain on Electrode In advance, 100 × 100 50 μm square graphite electrodes were patterned on a 2 cm square glass substrate. The electrodes are separated from each other by an insulating film of 50 μm. DMT nucleoside-long-chain alkylamine-CPG was immobilized on each electrode (FIG. 3). Next, methanol is caused to flow as a solvent, and at that time, a potential of 2 V is applied to the electrode at the site where the nucleic acid chain is synthesized. The DMT at the site to which a potential is applied is desorbed by the protons generated on the electrode, and an active hydroxyl group appears on the electrode surface. Next, react the phosphoramidite with the tetrazole solution,
Nucleic acid is introduced only into the site where the electrode surface is active. next,
React with acetic anhydride / imidazole solution to cap unreacted hydroxyl groups. Further, iodine stabilizes the phosphate group. When this cycle is continuously performed, it becomes possible to synthesize a nucleic acid chain having a specific sequence at a specific position.

【００１８】[0018]

【発明の効果】本発明に基づく核酸鎖合成方法を用いる
ことで、同一担体上で連続的に配列の異なる核酸鎖を合
成する事ができるようになり、核酸鎖合成の操作が簡便
になると共に、核酸鎖合成を低コストで行えるようにな
る。更に、本方法で作製した核酸鎖固定化電極を用いる
と、電気化学的な遺伝子検出が可能になり、簡便・高感
度な核酸配列検査を行う事が可能になる。By using the method for synthesizing a nucleic acid chain according to the present invention, it becomes possible to successively synthesize nucleic acid chains having different sequences on the same carrier, which simplifies the operation of nucleic acid chain synthesis. Thus, nucleic acid chain synthesis can be performed at low cost. Furthermore, when the nucleic acid chain-immobilized electrode produced by this method is used, electrochemical gene detection becomes possible, and simple and highly sensitive nucleic acid sequence inspection becomes possible.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の実施例１を説明するための図である。FIG. 1 is a diagram for explaining a first embodiment of the present invention.

【図２】本発明の実施例１を説明するための図である。FIG. 2 is a diagram for explaining the first embodiment of the present invention.

【図３】本発明の実施例２を説明するための図である。FIG. 3 is a diagram for explaining a second embodiment of the present invention.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

Ｘ：ジメトキシトリチル基、 ●：コントロールポアガラス（ＣＰＧ） X: dimethoxytrityl group, ●: Control pore glass (CPG)

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開97／042207（ＷＯ，Ａ１) 特表 平８−508311（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，1994年，ｖｏｌ．22， ｎ ｏ．15，ｐ．2915−2921 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｄＭｅｄ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)─────────────────────────────────────────────────── --Continued Front Page (56) References International Publication 97/042207 (WO, A1) Tokuyohei 8-508311 (JP, A) Nucleic Acids Research, 1994, vol. 22, no. 15, p. 2915-2921 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C12N 15/00-15/90 C12Q 1/68 BIOSIS / WPI (DIALOG) PudMed JISST file (JOIS)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 基板上に互いに絶縁された複数個の電極
を形成する工程と、これらの複数個の電極上に、ヂメト
キシトリチルチオールを固定化する工程と、プロトン性
溶媒中で前記複数個の電極のうち、核酸合成を行う部位
の電極に電位を選択的に印加して、この電極上の前記ヂ
メトキシトリチルチオールを除去するとともに、この電
極上に活性なヒドロキシル基を発生させるステップと、
この電極上の前記ヒドロキシル基にホスホアミダイトお
よびテトラゾール溶液を反応させる工程と、未反応の前
記ヒドロキシル基を除去する工程と、これらの工程を繰
り返すことにより、特定の電極位置に特定の配列の核酸
鎖を合成する工程と、を備えたことを特徴とする核酸鎖
合成方法。 1. A plurality of electrodes insulated from each other on a substrate.
And the step of forming the
The process of immobilizing xytrityl thiol
The site of nucleic acid synthesis in the plurality of electrodes in a solvent
A potential is selectively applied to the electrode of the
While removing methoxytrityl thiol,
A step of generating an active hydroxyl group on the very best,
Phosphoamidite or hydroxyl group on the hydroxyl group on this electrode
And the step of reacting the tetrazole solution and before the unreacted
Repeat the steps to remove the hydroxyl groups and these steps.
Nucleic acid with a specific sequence at a specific electrode position
A step of synthesizing a chain, and a nucleic acid chain comprising:
Synthesis method. 【請求項２】 請求項１に記載された核酸鎖合成方法に
より、核酸鎖が固定されたことを特徴とする核酸固定化
チップ。 2. The method for synthesizing a nucleic acid chain according to claim 1.
Nucleic acid immobilization characterized by immobilization of nucleic acid chains
Chips. 【請求項３】 請求項２に記載された核酸固定化チップ
の電極上に固定された核酸鎖にＤＮＡ結合物質と反応さ
せる工程と、これらの電極に前記ＤＮＡ結合物質が電気
化学的に反応する電位以上の電位を印加し、反応電流を
測定する工程と、を備えたことを特徴とする核酸鎖検出
方法。 3. The nucleic acid-immobilized chip according to claim 2.
Nucleic acid chains fixed on the electrodes of the
And the DNA binding substance is electrically connected to these electrodes.
Apply a potential higher than the potential to chemically react and change the reaction current.
Nucleic acid chain detection comprising the step of measuring
Method.
JP28414898A 1998-10-06 1998-10-06 Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method Expired - Fee Related JP3482140B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28414898A JP3482140B2 (en) 1998-10-06 1998-10-06 Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28414898A JP3482140B2 (en) 1998-10-06 1998-10-06 Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2000106874A JP2000106874A (en) 2000-04-18
JP3482140B2 true JP3482140B2 (en) 2003-12-22

Family

ID=17674804

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP28414898A Expired - Fee Related JP3482140B2 (en) 1998-10-06 1998-10-06 Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3482140B2 (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2772050C (en) * 2002-12-26 2016-09-06 Meso Scale Technologies, Llc. Assay cartridges and methods of using the same
DE10315640A1 (en) * 2003-04-04 2004-10-14 Ignatov, Konstantin Process for the controlled release of components into a solution
FR2855269B1 (en) * 2003-05-21 2007-06-08 Commissariat Energie Atomique DEVICE AND METHODS FOR HANGING / REMOVING A TARGET OR OBJECT PRESENT IN A SAMPLE
CA2513340A1 (en) * 2004-08-25 2006-02-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Reusable substrate for dna microarray production
EP4139368A4 (en) * 2020-04-20 2024-03-27 Lc Sciences Devices and methods for multiplexing chemical synthesis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４年，ｖｏｌ．２２， ｎｏ．１５，ｐ．２９１５−２９２１

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000106874A (en) 2000-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6489160B2 (en) Method for producing nucleic acid strand immobilized carrier
US6670131B2 (en) Nucleic acid detection method and apparatus, and vessel for detecting nucleic acid
US6818109B2 (en) Nucleic acid detections sensor
CA2331688C (en) Detection of a target in a sample
Guschin et al. Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and protein microchips
JP2007020568A (en) Self-addressable and self-assembling microelectronic system and device for molecular biological analysis and diagnostics
JP4398953B2 (en) Nucleic acid detection sensor
JP2002195997A (en) Sensor for detecting nucleic acid
JP4122854B2 (en) Hybridization method and hybridization apparatus for selective binding substance and substrate for fixing selective binding substance
US20030203394A1 (en) Detection of a target in a sample
JP3482140B2 (en) Nucleic acid chain synthesis method, nucleic acid immobilized chip and nucleic acid chain detection method
US20090227476A1 (en) Amplification and microarray detection apparatus and methods of making
JP4143046B2 (en) Nucleic acid detection substrate and nucleic acid detection method using the apparatus
JP4427525B2 (en) Nucleic acid detection sensor
JP4261077B2 (en) Method for producing nucleic acid chain-immobilized carrier
Seliger et al. Arrays of immobilized oligonucleotides-contributions to nucleic acids technology
JP3677237B2 (en) Nucleic acid detection method and apparatus, and nucleic acid detection container
JP4054272B2 (en) Electrolyte contact electrode, manufacturing method thereof, and gene detection chip
JP2003156471A (en) Biological material detecting element, biological material detection method and device therefor
JP3842600B2 (en) Charged mass transfer device
SOSNOWSKI et al. MICHAEL J. HELLER, EUGENE TU, ANITA HOLMSEN

Legal Events

Date Code Title Description
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081010

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081010

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091010

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091010

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101010

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111010

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121010

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121010

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131010

Year of fee payment: 10

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313114

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees