JP3481706B2 - 肝細胞癌判定用マーカー及び該マーカーを用いる肝細胞癌の判定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本願発明は肝細胞癌を生化学的な
検査法によって判定する方法に関する。詳しくは、Ｇｌ
ａ不全血液凝固第VII因子を本態とする肝細胞癌判定用
マーカー及び該マーカーの存在を確認することにより肝
細胞癌を判定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】肝臓
に原発する悪性腫瘍には、肝細胞に発生する肝細胞癌
と、胆管上皮細胞に発生する胆管癌の二型が存在する
が、両者の混合型とみるべきものもある。また、幼少児
に発生する肝癌は肝細胞癌の一種ではあるが、成人型の
ものとは異なり、一種の過誤牙腫とみられ、肝牙腫と呼
ばれる。成人型肝細胞癌の８０〜９０％には肝硬変症が
先行するといわれ、肝炎ウイルスとの因果関係が深い。
肝臓に発生する癌の約半数は他の臓器に発生した癌が肝
臓に転移したもので、特に胃、腸管、膵臓、胆道などに
原発した癌が門脈血流によって肝臓に転移する場合が多
い。

【０００３】現在、α₁フェトプロティン(以下、ＡＦＰ
と称することがある)が判定に有効な肝細胞癌の腫瘍マ
ーカーとして臨床的に汎用されている。ＡＦＰとは、電
気泳動的にα₁-グロブリン領域に泳動される胎児性タン
パク質の意であり、１９５６年に胎児血清のα₁領域に
母体血清には観られない血漿タンパク質成分として見出
された。ＡＦＰは沈降定数４.５Ｓ，分子量約７万の一
本鎖のタンパク質で、約４％の糖を含み、等電点は４.
７で血清アルブミンと非常に類似した物理化学的性状を
示す。その後１９６０年代の初めに、胎生期に特有なタ
ンパク質と思われていたＡＦＰが肝細胞癌患者の血清中
に出現してくることが認められ、肝細胞癌のマーカーと
して注目されるに至った("肝癌" 服部 信著、"生化学
辞典"第１版 東京化学同人)。

【０００４】また、１９８４年にLiebmanらが、肝細胞
癌の腫瘍マーカーとしてＰＩＶＫＡ-IIが有用であるこ
とを報告(New Eng.J.Med.,310:p.1427-1431(1984))して
以来、ＰＩＶＫＡ-IIの有用性が臨床的に注目されるよ
うになった。ＰＩＶＫＡ-IIとは、プロトロンビン前駆
物質およびプロトロンビン前駆物質のグルタミン酸残基
についてのγカルボキシル化体(γカルボキシルグルタ
ミン酸:Ｇｌａ)に関して、当該カルボキシル化の程度が
不完全なものを言う。これに対して、プロトロンビン前
駆物質のグルタミン酸残基についてのカルボキシル化体
に関して、当該カルボキシル化の程度が完全なものを正
常プロトロンビン(血液凝固第II因子)という。従って、
ＰＩＶＫＡ-IIとは正常プロトロンビンのγ-カルボキシ
グルタミン酸残基についての脱カルボキシル化体である
ということもできる。他方、ＰＩＶＫＡ-IIは生理的、
臨床的にはビタミンＫの不足する状態あるいはビタミン
Ｋ拮抗剤の投与によってビタミンＫ作用の抑制された状
態に出現することが判明している。即ち、プロトロンビ
ン前駆物質はそのグルタミン酸残基がビタミンＫ及びカ
ルボキシラーゼの存在下においてカルボキシル化され、
活性体正常プロトロンビンになるのであるが、ビタミン
Ｋの不足状態あるいは抑制状態においては当該カルボキ
シル化が不完全となり、その結果ＰＩＶＫＡ-IIが血液
中に出現する。ＰＩＶＫＡ-IIとはProtein Induced by
Vitamin K Absence or Antagonist-IIの略称であり、こ
れは上記生理的観点に基づいて命名されたものである。

【０００５】ＡＦＰとＰＩＶＫＡ-IIの検出は肝細胞癌
の判定においては相補的である。つまりＡＦＰ陰性例を
ＰＩＶＫＡ-II陽性でカバーし、逆にＰＩＶＫＡ-II陰性
例をＡＦＰでカバーする例が多い("肝癌" 服部 信
著)。相補的なＡＦＰとＰＩＶＫＡ-IIの検出の出現によ
り、１９７０年代の肝細胞癌の判定スクーニング率に比
較すると現在のスクリーニング率は確実に高くなった。
しかし、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ-IIの両者を併用しても、
肝細胞癌の判定スクリーニング率は６０〜７０％であ
り、なお満足できる状況ではない。

【０００６】肝癌細胞の腫瘍マーカーとしてのＰＩＶＫ
Ａ-IIに関する知見を契機に、ＰＩＶＫＡ-II以外のＧｌ
ａ不全血液凝固関連因子について、これらが肝細胞癌に
特異的な新しい腫瘍マーカーに成り得るかどうかが検討
されたが、可能性は示唆されたものの単一で良好な肝細
胞癌スクリーニング用マーカーとなり得るものは見いだ
されていない(１９８８年度日本消化器病学会大会)。

【０００７】かかる状況に鑑み、本願発明者らはＧｌａ
不全血液凝固関連因子の一種であるＰＩＶＫＡ-VIIが他
の肝細胞癌のマーカーよりも特異性の高いマーカーと成
り得るかどうかを検討した。ＰＩＶＫＡ-VIIは、Ｇｌａ
不全血液凝固第VII因子である。血液凝固第VII因子は、
Ｇｌａドメイン、第１及び第２ＥＧＦ様ドメイン、セリ
ンプロテアーゼドメインから構成され、分子量約５０,
０００を有する外因系血液凝固に主要な役割を演ずる一
本鎖糖蛋白質である。Ｇｌａドメインにはヒトでは１０
個のＧｌａ残基を含み、実際には、例えば血液中におい
ては前述の定義に属しながらカルボキシル化の程度の異
なる複数の物質が混在した状態で存在しており、当該混
在物質群についてこれを包括的にＰＩＶＫＡ-VIIと呼
ぶ。

【０００８】その結果、驚いたことに生物学的試料中の
ＰＩＶＫＡ-VIIの存在はＡＦＰ陽性かつＰＩＶＫＡ-II
陽性患者では１００％、ＡＦＰ陰性ＰＩＶＫＡ-II陽性
患者でも１００％の陽性率を示した。さらに、ＡＦＰ及
びＰＩＶＫＡ-II両マーカー陰性患者(６例)においても
５例(８３％)の患者で陽性を示した。なお、肝細胞癌以
外の肝臓疾患である肝炎(Ｂ型，Ｃ型肝炎)及び肝硬変例
については全て陰性であった。また、正常人についても
陰性を示した。これらの結果から、発明者らはＰＩＶＫ
Ａ-VIIが肝細胞癌に特異的であり、肝細胞癌患者を極め
て高い確立でスクリーニング可能な腫瘍マーカーである
ことを見出し、この知見を基に本願発明を完成した。

【０００９】肝細胞癌の進展の測定や肝細胞癌の判定
に、肝細胞癌マーカーとしてＰＩＶＫＡ-VIIが有用であ
ることは以下に述べる方法で確認することができる。血
漿または血清等の生物学的試料中のＰＩＶＫＡ-VIIの存
否を確認する方法としては、酵素免疫測定法、放射免疫
測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、免疫比濁法、
免疫拡散法等免疫学的測定方法を用いてＰＩＶＫＡ-VII
を直接的もしくは間接的に検出する。また、高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて抗体カラムとゲルろ過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
等電点クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動等
の生化学的分析方法を組み合わせてＰＩＶＫＡ-VIIを検
出し、本願発明を達成することもできる。

【００１０】しかしながら、ＰＩＶＫＡ-VIIを正確に、
かつ簡便に測定することができ、とりわけ臨床検査の場
において多数の生物学的試料を同時に処理することので
きる実用的な方法の観点から、二抗体サンドイッチ法に
基づく酵素免疫測定法及び放射免疫測定法が推奨され
る。血液凝固第VII因子には反応せずＰＩＶＫＡ-VIIに
対してのみ反応性を有するモノクーナル抗体を調製し、
二抗体サンドイッチ法に基づく酵素免疫測定法もしくは
放射免疫測定法における固相抗体あるいは標識抗体とし
て使用し、ＰＩＶＫＡ-VIIを直接的に定性あるいは定量
的に検出する方法。あるいは、血液凝固第VII因子及び
ＰＩＶＫＡ-VIIが混在する生物学的試料に対して、両者
に反応性を有する抗体を用いた系で先ず両者を総合的に
測定し、次に血液凝固第VII因子のみに反応する抗体を
用いた第二の測定系で同じ生物学的試料を測定して二つ
の測定値の差によって間接的に定性あるいは定量的にＰ
ＩＶＫＡ-VIIを検出する方法等が実際上可能であり、Ｐ
ＩＶＫＡ-VIIの存在を検出するという究極の目的が達成
されさえすれば、本願発明はいずれの方法に限定される
ものではない。

【００１１】以下に、本願発明の生物試料中のＰＩＶＫ
Ａ-VIIの存否を確認するに際しての好適な実施態様であ
る二抗体サンドイッチ法を利用する酵素免疫測定法を例
示し、その概説を試みる。

【００１２】直接的ＰＩＶＫＡ-VII検出系 測定系全体の構成要素は固相、固相コート用抗体(第一
抗体)、標準抗原または被検血漿、標識用抗体(第二抗
体)、酵素及び基質である。固相としてはエンザイムイ
ムノアッセイ用のマイクロタイタープレートのウエルを
用いればよい。測定に先立ち、モノクローナル抗ＰＩＶ
ＫＡ-VII抗体を細胞融合法によるハイブリドーマより調
製し、これを第一抗体として例えば炭酸緩衝液(ｐＨ８.
５)のような好適な緩衝液に溶解し、例えばポリスチロ
ール製エンザイムイムノアッセイ用ウエルに入れ、４℃
で一夜靜置すれば固相表面はコートされる。次に、未コ
ート部分のブロッキングとして、牛血清アルブミンをリ
ン酸緩衝液に溶解してウエルに加え同様に静置して牛血
清アルブミンをコートする。

【００１３】標準抗原または被検血漿をコートされたウ
エルに加えて反応させ、引続き洗浄する。標識用抗体
(第二抗体)としては適当な抗ヒト凝固第VII因子抗体を
選択すればよく、例えば抗ヒト凝固第VII因子ウサギＩ
ｇＧが用いられ得る。第二抗体に標識される酵素として
は、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ等を使用することができる。測定
に先立ち、グルタールアルデヒドに代表される結合剤に
よって、第二抗体に酵素を結合させコンジュゲートと
し、本願発明測定方法の実施のための試薬の一部として
予め準備しておく。基質は選択した酵素に応じて適宜使
用すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファタ
ーゼを選択した場合はｐ-ニトロフェニルホスフェート
を使用することができる。

【００１４】測定は二抗体サンドイッチ法を利用する酵
素免疫測定法における通常の手順に従って行なう。即
ち、第一抗体をコートしたウエルに標準抗原または被検
血漿を加えてインキュベートし、続いて酵素標識抗体を
加えてインキュベートし、最後に基質を加えてインキュ
ベート後、反応を停止してから基質の反応量を分光光度
計によって測定する。なお、本検出系においては第一抗
体と第二抗体の種類を逆にすることも可能である。即ち
第一抗体に抗ヒト凝固第VII因子抗体を、第二抗体にモ
ノクローナル抗ＰＩＶＫＡ-VII抗体を用いることもでき
る。

【００１５】間接的ＰＩＶＫＡ-VII検出系 基本的な構成並びに手順は直接的検出系と同じである
が、構造的に類似する血液凝固第VII因子とＰＩＶＫＡ-
VIIの双方に反応性を有する抗体を用いて両者を総合的
に検出する測定系(Ａ)と、血液凝固第VII因子のみを選
択的に検出し得る測定系(Ｂ)の二つからなり、測定系
(Ａ)の数値から測定系(Ｂ)の数値を減じた値を指標とし
てＰＩＶＫＡ-VIIの存否を確認する。直接的検出系に比
較してより煩雑な操作を要求されるが、ＰＩＶＫＡ-VII
の多様性を考慮すると実際的な数値が得られることが期
待される。

【００１６】本願発明によって、肝細胞癌の進行度や発
病の危険性を知るための簡便性並びに正確性を満足する
検査方法が提供される。以下に実施例により本発明を詳
述するが、本発明は該実施例によって何等限定されるも
のではない。

【００１７】

【実施例】調製例 １ (ヒト血液凝固第VII因子の調製)新鮮凍結血漿を３７℃
で迅速に融解した後、４℃で緩やかに撹拌しながら、１
／１０容の塩化バリウムを滴加し、２時間放置した。４
℃で４,０００rpm、５分間遠心処理を行ない沈澱を回収
して、Ｔｒｉｓ-塩酸緩衝液に懸濁した。この溶液を３
０％〜７０％の硫酸アンモニウム塩析沈澱を行ない、得
られた沈澱を再懸濁後、ＤＥＡＥ-セファローズクロマ
トグラフィーを行なった。ｐＨ６.０のリン酸緩衝液で
０.０５Ｍ〜０.５Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配で血液
凝固第VII因子を含有する画分を得た。当該画分を透析
後、ＱＡＥ-セファデックスカラムに通液し、洗浄後塩
化カルシウム含有緩衝液で溶出した。さらにセファデッ
クスＧ-１００カラムでゲル濾過処理し、精製後、アミ
コンの限外濾過器で濃縮した。精製した血液凝固第VII
因子はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で単
一バンドを示した。

【００１８】調製例 ２ (ヒト血液凝固第VII因子に対するポリクローナル抗体の
調製)ヒト血液凝固第VII因子に対するポリクローナル抗
体を調製するために、常法に従い、調製例１で得られた
ヒト血液凝固第VII因子をフロイントの完全アジュバン
ト(DIFCO社製)と混合し、ウサギの皮下に初回投与し以
後２〜３週間毎にフロイントの不完全アジュバントと混
合したヒト血液凝固第VII因子を皮下投与して、抗ヒト
血液凝固第VII因子抗血清を調製した。抗ヒト血液凝固
第VII因子抗体は、先ず、抗血清からプロテインＡゲル
(Pharmacia-LKB)によるアフィニティークロマトグラフ
ィーで常法により精製し、さらにヒト血液凝固第VII因
子に対する特異抗体を調製するために、ヒト血液凝固第
VII因子を結合させたゲル(２mgヒト血液凝固第VII因子
／mlゲル)によるアフィニティークロマトグラフィーを
行なった。

【００１９】調製例 ３ (ヒト血液凝固第VII因子に対するモノクローナル抗体の
調製)調製例１で得られた精製ヒト血液凝固第VII因子の
５０μgを５０μlの生理食塩水に溶解し、アジュバント
としてフロイントの完全アジュバント(DIFCO社製)１０
０μlを加えて油中水滴型としたものを基礎免疫抗原と
した。また、追加免疫抗原として前述の精製ヒト血液凝
固第VII因子５０μgを５０μlの生理食塩水に溶解し調
製したものを用いた。７週齢のＢＡＬＢ/Ｃマウス(雌)
を用い、基礎免疫原を接種後、追加免疫用抗原を６０日
目に免疫したマウスより得られた脾臓細胞を、通常の方
法によりマウスミエローマ細胞(P3-X63-Ag8-U1)と融合
させクローニングして血液凝固第VII因子特異性モノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ５種を得た。各
々をマウス腹腔内で増殖させることによってハイブリド
ーマを大量に調製し、これより各モノクローナル抗体
(クローンNo.１〜５)を得た。

【００２０】得られたモノクローナル抗体の抗原特異性
をＥＬＩＳＡ法を用いて検討したところ、全てのクロー
ンは、２価のカルシウムイオンの存在下で、ヒト血液凝
固第VII因子のみに結合し、他のビタミンＫ依存性凝固
因子(プロトロンビン、凝固第IX因子、凝固第X因子、プ
ロテインＣ、プロテインＳ)およびウシ血清アルブミン
との反応性は示さなかった。なお、金属キレート剤を用
いて系からカルシウムイオンを除去すると、クローンN
o.３〜５のヒト血液凝固第VII因子に対する反応性は消
失し、これらが金属イオン依存的に凝固第VII因子に反
応していることが判明した。クローンNo.３のモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、工業技術院微
生物工業技術研究所(微工研:現、工業技術院生命工学工
業技術研究所)に１０８３４号(ＦＥＲＭ Ｐ-１０８３
４)の寄託番号で寄託されている。

【００２１】実施例 １ (測定系の構築)ヒト凝固第VII因子を認識するポリクロ
ーナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、
ヒト凝固第VII因子とＧｌａ不全の凝固第VII因子の両物
質を検出できる測定系を作製し、この測定から得られる
凝固第VII因子値をＡ％とした。 ９６穴マイクロプレ
ートに調製例２で得られたヒト凝固第VII因子特異的ポ
リクローナル抗体を１０μg／mlの濃度で１００μlを加
え、４℃で１６時間インキュエートすることで一次抗体
を固相化した。次に、４倍希釈したブロックエース溶液
２００μlを加え同様にインキュベーションしてウエル
をマスキングした。このように調製したプレートに、
０.１％ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)、５mＭ塩化カルシ
ウム、１００mＭベンズアミジンを含有するＴＢＳ緩衝
液で希釈した血漿検体を１００μl加え、３７℃で２時
間インキュベートした。その後、０.０５％Tween２０と
５mＭ塩化カルシウムを含有するＴＢＳ緩衝液で４回洗
浄し、次に二次抗体としてＨＲＰ(Horse Radish Peroxi
dase)ラベルしたヒト凝固第VII因子特異的ポリクローナ
ル抗体を０.１％ＢＳＡと５mＭ塩化カルシウムを含有す
るＴＢＳ緩衝液で１０μg／mlに希釈した溶液を１００
μl添加して３７℃で２時間インキュベートした。反応
終了後、再度洗浄し、ＯＰＤＡ(Ortho Phenilen DiAmin
e)基質を添加して、常法により発色させた。３Ｎ硫酸で
反応を停止し、波長４９２nmでの吸光度で発色量を測定
した。

【００２２】次に、ヒト凝固第VII因子を認識するポリ
クローナル抗体を１次抗体としてコートし、２次抗体と
して調製例３で得られたヒト凝固第VII因子のみ認識
し、Ｇｌａ不全の凝固第VII因子は認識しないモノクロ
ーナル抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、
ヒト凝固第VII因子は検出するがＧｌａ不全の凝固第VII
因子は検出しない測定系を作製した。この測定から得ら
れる凝固第VII因子値をＢ％とした。操作手順は前記に
準ずる。

【００２３】各々のＥＬＩＳＡでＧｌａ不全凝固第VII
因子(ＰＩＶＫＡ-VII)が検出されるかどうかを確認し
た。凝固第VII因子のＧｌａ領域の１〜３０番目のアミ
ノ酸配列のペプチドにおいてＧｌａ残基をＧｌｕに変換
したＧｌａ不全合成凝固第VII因子ペプチドを合成し、
上記２種のＥＬＩＳＡで該Ｇｌａ不全合成凝固第VII因
子ペプチドが検出されるかどうかを確認したところ、二
次抗体にポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ(系Ａ)
ではＧｌａ不全ペプチドが検出されたが、モノクローナ
ル抗体を用いたＥＬＩＳＡ(系Ｂ)では検出されることは
なかった。これは、系Ａでは凝固第VII因子とＰＩＶＫ
Ａ-VIIの両者を検出するが、凝固第VII因子特異的モノ
クローナル抗体を用いた系ＢではＰＩＶＫＡ-VIIは検出
しないことを意味する。そこで、系Ａで得られる凝固第
VII因子値をＡ％とし、系Ｂでの凝固第VII因子値をＢ％
として、ＰＩＶＫＡ-VII値はＡ％−Ｂ％から得られる値
とし、正常人の場合０〜６％を示すことから、上記Ａ％
−Ｂ％値が７％以上をＰＩＶＫＡ-VII陽性の基準とし
た。なお、凝固第VII因子値１００％は正常人プール標
準血漿を用いた。

【００２４】実施例 ２ (肝細胞癌患者血漿を用いたＰＩＶＫＡ-VIIの検出)上記
のＥＬＩＳＡを用いて実際に、肝細胞癌患者の血漿中に
含まれるＰＩＶＫＡ-VII量を測定した。また、対照測定
検体として、正常人、肝炎患者(Ｂ型、Ｃ型)、肝硬変患
者の血漿についても調べ、結果を表１に示した。表１に
示した結果から明らかなように、ＰＩＶＫＡ-VIIは、肝
細胞癌に特異的に陽性を示した。

【００２５】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−313186（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−217996（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−209297（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−20127（ＪＰ，Ａ) 臨床病理，1992年，第40巻第７号，ｐ 783−788 Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，1985年，Ｖｏｌ．19， Ｎｏ．４, ｐ357−357 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏ ｌｏｇｙ，1987年，Ｖｏｌ．４，ｐ357 −363 肝臓，1990年，Ｖｏｌ．31， Ｎｏ. １，ｐ110 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｇｌａ不全血液凝固第ＶＩＩ因子を本態
   とする肝細胞癌判定用マーカー。
2. 【請求項２】 生物学的試料中のＧｌａ不全血液凝固第
   ＶＩＩ因子の存否を確認し、該物質の存在により陽性と
   判断することを特徴とする肝細胞癌の判定方法。
3. 【請求項３】 生物学的試料中のＧｌａ不全血液凝固第
   ＶＩＩ因子を測定するにあたり、酵素免疫測定法、放射
   免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、免疫比濁
   法および免疫拡散法より選択される測定方法により構成
   される請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 生物学的試料中のＧｌａ不全血液凝固第
   ＶＩＩ因子を測定するにあたり、二抗体サンドイッチ法
   を利用する酵素免疫測定法を用い、Ｇｌａ不全血液凝固
   第ＶＩＩ因子と反応するが正常血液凝固第ＶＩＩ因子と
   は反応しないモノクローナル抗Ｇｌａ不全血液凝固第Ｖ
   ＩＩ因子抗体を使用することを特徴とするＧｌａ不全血
   液凝固第ＶＩＩ因子の測定方法。
5. 【請求項５】 生物学的試料中のＧｌａ不全血液凝固第
   ＶＩＩ因子を測定するにあたり、二抗体サンドイッチ法
   を利用する酵素免疫測定法に基づき正常血液凝固第ＶＩ
   Ｉ因子とＧｌａ不全血液凝固第ＶＩＩ因子の双方に反応
   性を有する抗体を用いて両者を総合的に検出する測定系
   （Ａ）と、正常血液凝固第ＶＩＩ因子と反応するがＧｌ
   ａ不全血液凝固第ＶＩＩ因子とは反応しないモノクロー
   ナル抗正常血液凝固第ＶＩＩ因子抗体を使用する正常血
   液凝固第ＶＩＩ因子のみを選択的に検出し得る測定系
   （Ｂ）の二つの測定系を構築し、測定系（Ａ）の測定値
   から測定系（Ｂ）の測定値を減じた値を指標としてＧｌ
   ａ不全血液凝固第ＶＩＩ因子を測定する方法。