JP3464357B2 - Method for producing immunological agglutination reagent - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は抗原抗体反応を利用
する診断用試薬を効率的かつ簡便に製造する方法に関す
る。 【０００２】 【従来の技術】免疫学的凝集反応試薬は、抗原抗体反応
に伴う凝集反応を利用した代表的な試薬である。即ち、
免疫学的凝集反応試薬では、不溶性担体に特定の抗原又
は抗体が固定化されており、該固定化された抗原（又は
抗体）に対応する抗体（又は抗原）が存在すると抗原抗
体反応により凝集が起こるため、上記の抗体（又は抗
原）が検知できる。最近は、抗原精製技術の進歩により
固定化される抗原や抗体として特異性の高いものが得ら
れるようになり、免疫学的凝集反応試薬の臨床検査にお
ける応用範囲がさらに拡大している。 【０００３】また、近年は、自動分析装置の発展に伴
い、自動分析装置による定量分析のニーズが高まってお
り、免疫学的凝集反応試薬を用いた検査においても鋭敏
性、正確性が求められている。特に、感染症等の診断に
おいては、更に高感度な検査ができる免疫学的凝集反応
試薬が求められている。 【０００４】原理的には、不溶性担体に多くの抗原ある
いは抗体を吸着させれることができれば、免疫学的凝集
反応の感度を高めることができる。しかし、抗原や抗体
の不溶性担体への吸着効率はさほど高くなく、吸着量を
増やすためには高価な抗原や抗体を多量に使用する必要
がある。そこで、試薬の凝集性を高めるために凝集促進
剤として検体希釈液にポリエチレングリコール等の高分
子化合物を添加したり、不溶性担体として凝集力の高い
粒子を使用したりする方法が一般に行なわれている。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
では、試薬の凝集性は高くなるものの、感度低下の原因
となる非特異的な凝集反応も促進されてしまう。また、
凝集促進剤として高分子化合物を添加する方法を採用し
た場合には、その添加量を多くすると試薬粘度が高くな
り、撹拌効率が悪化して測定の再現性が低下するという
問題点があった。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく免疫学的凝集反応試薬を製造する方法につ
いて種々検討した結果、ブロッキング剤として高分子量
化または会合した変性タンパクを用いることによって、
より高感度で且つ非特異的反応が少なく、測定再現性の
良い免疫学的凝集反応試薬が製造できるという知見を
得、本発明を完成するに至った。 【０００７】即ち本発明は、トレポネーマ・パリダム菌
由来の抗原をラテックス粒子に担持させる処理およびブ
ロッキング処理をして免疫学的凝集反応ラテックス試薬
を製造する方法において、ブロッキング剤として、処理
温度（Ｔ）と処理時間（ｔ）との関係が、１５．０＞３
ｌnＴ＋ｌｎｔ＞１２．０（但し、１５０＞Ｔ＞３０）
となるような条件下で加熱処理を行って高分子量化また
は会合した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることを
特徴とする免疫学的凝集反応ラテックス試薬の製造方法
である。 【０００８】本発明では上記の手段によって、感度が高
く且つ非特異反応が少ない免疫学的凝集反応試薬を簡便
に製造することが可能となる。その詳細な理由は明らか
ではないが、ブロッキング剤として、例えば加熱処理す
ることによって得られる高分子量化または会合した変性
タンパクを用いると、該変性タンパクが不溶性担体に吸
着し、非特異的な凝集を引き起こす吸着サイトを覆って
しまうため、非特異的な凝集が抑制されるものと推定さ
れる。そして、その結果として、目的の抗原抗体反応に
対して鋭敏に凝集反応を起こすことが可能になるものと
推察される。 【０００９】 【発明の実施の形態】本発明の製造方法では、抗原又は
抗体を不溶性担体に担持させる処理とブロッキング処理
を行う。 【００１０】本発明で使用される不溶性担体としては、
少なくとも測定試料（検体）溶液並びに担持処理時およ
びブロッキング処理時に使用する分散媒となる溶液に不
溶であり、抗原（又は抗体）を担持した後に、対応する
抗体（又は抗原）と抗原抗体反応を起こして凝集するも
のであれば公知の担体が特に制限されずに使用できる。 【００１１】好適に使用できる不溶性担体を例示すれ
ば、ポリスチレン、スチレン-ブタジエン共重合体、ス
チレン-メタクリル酸共重合体、スチレン-グリシジルメ
タクリレート共重合体、スチレン-スチレンスルホン酸
塩共重合体、メタクリル酸重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクリロニトリル-ブタジエン共重合体、
ポリ酢酸ビニルアクリレート、アクロレイン-エチレン
グリコールジメタクリレート共重合体の様な乳化重合に
より得られる有機高分子ラテックス等の有機高分子物質
の微粒子、あるいはシリカ、シリカ-アルミナ、アルミ
ナの様な無機酸化物又は該無機酸化物等にシランカップ
リング処理等を施し、官能基を導入した無機粒子さらに
はヒトO型血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒子等が
挙げられる。 【００１２】上記不溶性担体の粒径は特に制限されるも
のではないが、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝
集の判別のし易さの観点から、平均粒径が0.05〜10μm
の不溶性担体を使用するのが好適である。自動分析装置
での分析に適し、かつ粒子が自然沈降しにくいという点
で0.05〜0.4μｍの担体が特に好適である。 【００１３】本発明で上記の不溶性担体に担持される抗
原（又は抗体）とは、それぞれ検査対象となる抗体（又
は抗原）と抗原抗体反応を起こすものであれば特に限定
されない。本発明で好適に使用される抗原又は抗体を例
示すれば、梅毒診断のためのトレポネーマ・パリダム
（Treponema Pallidum；以下TPと略すこともある。）菌
体成分由来の抗原、Ｂ型肝炎診断のためのＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原（HBs）の他、抗ヒトアルブミン抗体、抗
ヒト免疫グロブリン（IgG）抗体、抗ヒトC反応性タンパ
ク（CRP）抗体、抗α-フェトプロテイン（AFP）抗体、
抗インシュリン抗体、抗β2ーマイクログロブリン（β2ー
m）抗体、抗フィブリノーゲン分解産物（FDP）抗体等が
挙げられる。 【００１４】抗原又は抗体を不溶性担体に担持させる処
理方法としては、既知の方法が特に制限されずに使用で
きる。基本的な担持方法としては物理吸着法と化学的結
合法があり、担持操作の簡便性という点で物理的吸着法
が好適に使用される。 【００１５】物理吸着法では、抗原（又は抗体）を分散
させた分散液に不溶性担体を浸漬し、液中の抗原（又は
抗体）を不溶性担体に物理的に吸着させるのが一般的で
ある。この時使用される溶媒はこれらの物質を溶解もし
くは均一に分散させるものであれば特に限定されず公知
の溶媒が何ら制限なく使用できるが、使用する抗原又は
抗体の生理活性を有効に保つために生理食塩水、あるい
はpHが調節された緩衝作用を持つ水溶液、例えば、pH6
〜8に調節された10mMから200mM程度のリン酸緩衝液、あ
るいはpH7〜9に調節された10mMから200mM程度のグリシ
ン緩衝液、トリス緩衝液等を使用するのが好適である。
上記の分散液中の抗原又は抗体の濃度は特に限定されな
いが、担持効率や担持の均一性等の観点から１（μｇ−
抗原又は抗体／ｍｌ−液）〜１０（ｍｇ−抗原又は抗体
／ｍｌ−液）となるように分散させるのが好適である。
該分散液に不溶性担体を浸漬し、抗原（又は抗体）を吸
着させる条件は、使用する不溶性担体の種類や担持させ
る抗体や抗原の種類ごとに、担持効率や操作性を勘案し
て適宜決定すればよいが、一般的な条件は次の通りであ
る。 【００１６】即ち、該分散液に浸漬する際の担体の使用
量は、抗原や抗体の種類によって適宜決定すればよい
が、担持効率や操作性等の観点から該分散液に浸漬した
ときの重量％で表して、０．００１〜１０wt%であるの
が好適である。なお、これら担体は、懸濁液の形で使用
されるのが一般的である。該分散液に担体を浸漬させる
温度は担体の性質や緩衝液の成分によって適宜選択すれ
ば良いが、一般には４℃〜５０℃が好適に用いられる。
該分散液に担体を浸漬する時間は３０分〜一昼夜行うの
が一般的である。 【００１７】本発明におけるブロッキング処理とは、測
定において目的とする抗体（又は抗原）以外の試料中に
存在するタンパクが担体に吸着して非特異的な反応を起
こすのを抑制するために行う処理で、目的とする抗原抗
体反応に対して不活性なブロッキング処理剤を不溶性担
体に吸着させる処理のことを言う。本発明において、ブ
ロッキング処理は、前述の担持処理を行う際にブロッキ
ング処理剤を共存させて担持処理と同時に行うこともで
きるし、担持処理後に別に行うこともできる。 【００１８】本発明は、ブロッキング処理剤として高分
子量化または会合した変性タンパクを用いることを最大
の特徴としている。 【００１９】本発明でブロッキング処理剤として使用す
る高分子量化または会合した変性タンパクとは、加熱処
理や超音波処理の様な物理的処理法や酸又はアルカリ等
による化学的処理法によって化学結合を介して高分子量
化したタンパク、又はタンパクが水素結合、疎水性相互
作用等により可逆的あるいは不可逆的に会合したもので
ある。 【００２０】上記変性タンパクの原料となるタンパク
（以下、「原料タンパク」ともいう。）は、目的とする
抗原抗体反応に対して不活性で且つ不溶性担体に吸着可
能なタンパクであれば特に限定されないが、入手し易さ
や経済性の点で牛血清アルブミンやカゼイン等が好適に
用いられる。 【００２１】原料タンパクを加熱処理して変性する場合
は、変性効率の観点から0.01%〜20%、好ましくは0.1%〜
5%の原料タンパク溶液を加熱処理する。ここで、加熱と
は３０℃を越える温度で保持することをいう。室温で長
時間保存しても高分子量化あるいは会合は起こるが、要
する時間が長すぎるため実用性に欠ける。３０℃より高
い温度で保持すれば数十時間以内の操作で効果が得られ
る。原料タンパク溶液の濃度が低すぎると変性しにくく
なり、高すぎるとゲル状に凝固したりして変性効率が低
くなることがある。処理時間は、処理温度に応じて適宜
決定すればよい。好適な処理温度および処理時間は、37
℃〜120℃および10分〜24時間である。一般に比較的低
い温度を採用した場合には長時間の処理を要する。十分
な効果をもたらす変性を行うためには、0.1%〜5%の原料
タンパク溶液を摂氏（℃）で表した処理温度Ｔと時間
（ｈ）で表した処理時間ｔとの関係が、15.0＞３lnＴ＋
lnｔ＞12.00（但し、150＞Ｔ＞30）となるような条件で
加熱処理を行うことが特に好適である。例えば100℃で
加熱する場合には、1/6〜１時間程度（３lnＴ＋lnｔ＝1
2.02〜13.82）処理すればよい。処理する温度が低すぎ
ると変性あるいは会合しにくいし、高すぎるとタンパク
が凝固したり着色したりする。 【００２２】原料タンパクを超音波処理や化学的な処理
を行って変性する場合も原料タンパクの濃度、処理温度
および処理時間は加熱処理と同様の条件範囲から適宜選
択すればよい。 【００２３】超音波処理を行う場合は使用する原料タン
パクによって多少異なるが、超音波洗浄機のような比較
的穏やかな条件で30分から数時間処理するのが好まし
い。化学的処理を行う場合も同様に比較的穏やかな条
件、例えば酸性ならばpH3〜6、アルカリ性ならpH9〜12
程度の範囲が好ましい。pHが低すぎると原料タンパクが
凝固したり、pHが高すぎると原料タンパクがかえって低
分子化したりする場合がある。 【００２４】以上のような処理をして得た変性タンパク
は、例えばポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動を
行ない、原料タンパクと分子量を比較することにより、
高分子量化あるいは会合していることが確認できる。ま
た、原料タンパクが変性した場合には、分光光度計によ
り波長λ＝280nmで該ブロッキング液の吸光度変化を測
定することによって変性の有無を確認することもでき
る。このようなタンパクの変性はブロッキング処理後に
おいても、電気泳動等によって確認することができる。 【００２５】ブロッキング処理は、前記の担持処理時
に、分散液中に上記ブロッキング処理剤を共存させる
か、或いは、ブロッキング剤が溶解した溶液に担持処理
をした不溶性担体を浸漬することによって行う。 【００２６】上記ブロッキング処理に用いるブロッキン
グ剤溶液の溶媒は特に制限されないが、生理食塩水、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩
衝液又はグッド緩衝液等が一般に使用される。溶液のｐ
Ｈは変性の方法や用いるタンパクによって適宜選択され
るが、一般的にはｐＨ５〜９の範囲であるのが好まし
い。 【００２７】ブロッキング処理時の変性タンパク（ブロ
ッキング剤）の濃度は使用する免疫凝集反応試薬によっ
て異なるが、ブロッキング後に不溶性担体に吸着（保
持）される変性タンパクの量が不溶性担体1mgに対し
て、0.1mg〜10mg となる濃度であることが好ましい。ま
た、不溶性担体に吸着される変性タンパクの量は、必ず
しも溶液の初期濃度で制御する必要はなく、ブロッキン
グ処理中に変性タンパクを適宜溶液に添加して吸着量を
制御しても良い。 【００２８】この様にして抗原又は抗体が担持された担
体はブロッキング処理を行なった後、遠心分離等により
分離洗浄し、最終的に、抗原抗体反応あるいは粒子の凝
集性、保存性等を勘案して適宜選択した緩衝液に分散さ
せて、免疫学的凝集反応試薬とされる。 【００２９】上記のような方法により、感度の高い免疫
凝集反応試薬を得ることができる。 【００３０】本発明の方法によって得られる免疫凝集反
応試薬は、検体中の抗体又は抗原と接触させた時に起こ
る抗原抗体反応に伴い担体が凝集する現象を利用した試
薬であり、定性試薬としては、ラテックス凝集試薬、マ
イクロタイター試薬などが、また定量試薬としては凝集
の度合いを光学的に測定するラテックス定量試薬が例示
できる。 【００３１】次に、本発明の免疫学的凝集反応試薬の例
としてラテックス定量試薬の二液（甲剤、乙剤）からな
る試薬形態を示し、該試薬を用いた検査方法について具
体的に説明する。なお、下記の例示における各物質の濃
度は、試薬として使いやすい範囲を例示するものであっ
て、本発明を限定するものではない。 【００３２】甲剤：下記（１）、（２）及び（３）を基
本成分とする混合液 （１）緩衝液 20〜1000mM、ｐＨ4〜12 （２）抗原（又は抗体）と高分子量化あるいは会合した
変性タンパクを担持した担体0.01％〜0.5％（ｗ/ｖ；甲
剤基準） （３）塩化ナトリウム 50〜300mM 乙剤：下記（４）及び（５）を基本成分とする混合液 （４）緩衝液 20〜1000mM 、pH4〜12 （５）塩化ナトリウム 50〜300mM 緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン
緩衝液、ホウ酸緩衝液又はグッド緩衝液等が例示でき
る。 【００３３】上記免疫学的凝集反応試薬の測定方法は被
検液を乙剤で10倍から30倍程度に希釈して37℃で５分程
度静置する。次いで甲剤を添加し、適当な波長を選択し
て吸光度の経時変化を測定し、試薬の凝集状態を検知す
る。甲剤の使用量は抗体や抗原の種類によって適宜決定
すればよいが、担持効率や操作性の観点から、測定時の
溶液中の担体の濃度が0.001〜15wt%となるように用いる
のが好適であり、懸濁液の形で使用されるのが一般的で
ある。 【００３４】 【発明の効果】高分子量化あるいは会合した変性タンパ
クをブロッキング剤として用いることにより非特異的な
凝集反応を起こすことなく、未処理のタンパクを用いた
ときよりも凝集性に優れた、即ち感度が高い免疫凝集反
応試薬とすることができる。 【００３５】 【実施例】以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 【００３６】実施例１〜８ （１）加熱処理牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の調製 市販のＢＳＡ（シグマ）1gを50mMグリシン緩衝液100gに
溶解した。次いで表１に示す温度と時間でゆっくり振と
うした後、4℃に冷却し、保存した。 【００３７】（２）ＴＰ抗原担持ラテックス懸濁液（甲
剤）の調製 平均粒径0.3μｍ、ラテックス濃度5%のポリスチレン粒
子懸濁液0.1mlをpH8.6の20mMグリシン緩衝液で10μg/ml
に希釈したＴＰ抗原液0.9mlに加えて混合した。4℃で4
時間静置した後、上述の加熱処理ＢＳＡを含む水溶液2m
lを添加し、さらに1.5時間静置した。次いで遠心分離に
より得られた沈さ（ＴＰ抗原担持ラテックス）に2mlの1
00mM塩化ナトリウムと0.1%アジ化ナトリウムを含むpH8
の１００ｍＭトリス緩衝液（以下この混合液をＴＢＳと
略す）を加えて懸濁して甲剤を調製した。 【００３８】（３）緩衝液（乙剤）の調製 １％のＰＥＧ-20000（和光純薬工業）を含むＴＢＳを調
製して乙剤とした。 【００３９】（４）被検液の調製 ヒト正常血清で梅毒陽性コントロール血清（国際試薬）
を２倍に希釈し被検液とした。 【００４０】（５）測定法 乙剤240μlに被検液10μlをガラスセル中で添加攪拌し
た後、37℃で5分間静置した。次いで甲剤を80μl添加攪
拌し、30秒後から200秒までの波長700nmにおける光学密
度変化量を測定した。以上の操作には、自動分析装置Ｔ
ＢＡ−３０Ｒ（東芝メディカル）を用いた。 【００４１】（６）加熱処理条件と光学密度変化量との
関係 異なる温度、処理時間条件で処理した加熱処理ＢＳＡを
ブロッキング剤として使用して調製した甲剤と乙剤を組
み合わせて、梅毒コントロール血清を測定した結果を表
１に示した。 【００４２】なお、各ブロッキング剤の変性の状態は、
界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
含まない緩衝溶液を用いて電気泳動（ｎｏｎ−ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を行い、次いで銀染色を行って、タンパクの
分画されたバンドを観察することによって確認、評価し
た。即ち、(1)未処理のものと比較して、分子量が２倍
以上の高分子バンドが明瞭に観察されたもの、(2)未処
理のものと比較して、それぞれのバンドに分子量の増加
が観察されたもの及び(3)高分子量のタンパクが多くな
り、バンドがブロード（Broad Band）になって明瞭なバ
ンドが観察されなくなったものをそれぞれ、「＋＋」、
「＋」及び「ＢＢ」として評価した。 【００４３】 【表１】 【００４４】加熱処理したＢＳＡを用いた試薬の光学密
度変化量は、△ＯＤ＝0.271〜0.472であり、未処理のＢ
ＳＡを用いた試薬の光学密度変化量が△ＯＤ＝0.251で
あるのに対して大きいことが判る。 【００４５】この光学密度変化量の大小は凝集性の高低
を意味し、大きいほど凝集性に優れ、ひいては感度が高
いことを示すので、本発明の試薬は感度が向上している
ことが判る。 【００４６】比較例１ （１）未処理ＢＳＡの調製 市販のＢＳＡ（シグマ）1gを２５℃で100mMトリス緩衝
液100gに溶解し、次いで4℃に冷却し、保存した。 【００４７】（２）ＢＳＡの調製以外は実施例１と同様
な操作で行った。 【００４８】（３）加熱処理条件と光学密度変化量との
関係 未処理のＢＳＡをブロッキング剤として使用して調製し
た甲剤と乙剤を組み合わせて、梅毒コントロール血清を
測定した結果を表１に示した。 【００４９】尚、正常血清を測定した時の非特異凝集は
実施例１〜８および比較例１のいずれの試薬でも起こら
なかった。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for efficiently and conveniently producing a diagnostic reagent utilizing an antigen-antibody reaction. [0002] An immunological agglutination reagent is a typical reagent utilizing an agglutination reaction accompanying an antigen-antibody reaction. That is,
In the immunological agglutination reagent, a specific antigen or antibody is immobilized on an insoluble carrier, and when an antibody (or antigen) corresponding to the immobilized antigen (or antibody) is present, agglutination is caused by an antigen-antibody reaction. As it occurs, the above antibody (or antigen) can be detected. In recent years, with the advance of antigen purification technology, highly specific antigens and antibodies can be obtained as immobilized antigens and antibodies, and the range of application of immunological agglutination reagents in clinical tests has been further expanded. [0003] In recent years, with the development of automatic analyzers, the need for quantitative analysis by automatic analyzers has been increasing, and sensitivity and accuracy have been required even in tests using immunological agglutination reagents. I have. In particular, in the diagnosis of infectious diseases and the like, there is a demand for an immunological agglutination reagent capable of performing a more sensitive test. [0004] In principle, if a large number of antigens or antibodies can be adsorbed on an insoluble carrier, the sensitivity of immunological agglutination can be increased. However, the efficiency of adsorption of the antigen or antibody to the insoluble carrier is not so high, and it is necessary to use a large amount of expensive antigen or antibody to increase the amount of adsorption. Therefore, a method of adding a high molecular compound such as polyethylene glycol to a sample diluent as an agglutination accelerator or using particles having a high aggregating power as an insoluble carrier to increase the aggregability of the reagent is generally performed. . [0005] However, in these methods, although the aggregating property of the reagent is increased, a non-specific agglutination reaction which causes a decrease in sensitivity is also promoted. Also,
When a method of adding a polymer compound as an aggregation promoter is employed, when the amount of addition is increased, the viscosity of the reagent is increased, the stirring efficiency is deteriorated, and the reproducibility of measurement is lowered. The present inventors have conducted various studies on a method for producing an immunological agglutination reagent in order to solve the above-mentioned problems. By using protein,
It has been found that an immunological agglutination reagent with higher sensitivity and less nonspecific reaction and good measurement reproducibility can be produced, and the present invention has been completed. That is, the present invention relates to Treponema pallidum
In a method for producing an immunological agglutination reaction latex reagent by performing a treatment for supporting the derived antigen on latex particles and a blocking treatment, the treatment is performed as a blocking agent.
The relationship between the temperature (T) and the processing time (t) is 15.0> 3.
InT + Int> 12.0 (150>T> 30)
A method for producing an immunological agglutination reaction latex reagent , comprising using bovine serum albumin (BSA) which has been subjected to a heat treatment under such conditions to have a high molecular weight or an associated bovine serum albumin (BSA) . In the present invention, the above means makes it possible to easily produce an immunological agglutination reagent having high sensitivity and little nonspecific reaction. Although the detailed reason is not clear, when a modified or associated protein having a high molecular weight obtained by, for example, heat treatment is used as a blocking agent, the modified protein is adsorbed on an insoluble carrier, and non-specific aggregation is prevented. It is presumed that nonspecific aggregation is suppressed because it covers the induced adsorption site. Then, as a result, it is presumed that an agglutination reaction can be caused sharply with respect to the target antigen-antibody reaction. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In the production method of the present invention, a treatment for carrying an antigen or an antibody on an insoluble carrier and a blocking treatment are carried out. The insoluble carrier used in the present invention includes:
It is insoluble in at least the measurement sample (specimen) solution and the solution serving as the dispersion medium used during the loading treatment and the blocking treatment, and after carrying the antigen (or antibody), causes an antigen-antibody reaction with the corresponding antibody (or antigen). Any known carrier can be used without particular limitation as long as the carrier aggregates. Examples of insoluble carriers that can be suitably used include polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl methacrylate copolymer, styrene-styrene sulfonate copolymer, and methacrylic acid. Acid polymer, polyglycidyl methacrylate, acrylonitrile-butadiene copolymer,
Polyvinyl acetate acrylate, fine particles of an organic polymer substance such as an organic polymer latex obtained by emulsion polymerization such as acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, or an inorganic oxide such as silica, silica-alumina, or alumina; Inorganic particles obtained by subjecting the inorganic oxide or the like to a silane coupling treatment or the like to introduce a functional group, and biological particles such as human O-type blood cells and sheep erythrocytes. Although the particle size of the insoluble carrier is not particularly limited, the average particle size is 0.05 to 10 μm from the viewpoint of easy aggregation after the antigen-antibody reaction and easy determination of the aggregation.
It is preferred to use an insoluble carrier of Carriers of 0.05 to 0.4 μm are particularly preferred in that they are suitable for analysis with an automatic analyzer and that particles are unlikely to settle spontaneously. In the present invention, the antigen (or antibody) carried on the insoluble carrier is not particularly limited as long as it causes an antigen-antibody reaction with the antibody (or antigen) to be tested. Examples of antigens or antibodies suitably used in the present invention include Treponema Pallidum (hereinafter sometimes abbreviated as TP) cell component antigen for syphilis diagnosis, and hepatitis B diagnosis for hepatitis B diagnosis. Hepatitis B virus surface antigens (HBs), anti-human albumin antibody, anti-human immunoglobulin (IgG) antibody, anti-human C-reactive protein (CRP) antibody, anti-α-fetoprotein (AFP) antibody,
Anti-insulin antibody, anti-β2-microglobulin (β2-
m) Antibodies, anti-fibrinogen degradation product (FDP) antibodies and the like. As a treatment method for supporting an antigen or antibody on an insoluble carrier, a known method can be used without any particular limitation. Basic loading methods include a physical adsorption method and a chemical bonding method, and the physical adsorption method is suitably used in terms of simplicity of the loading operation. In the physical adsorption method, generally, an insoluble carrier is immersed in a dispersion in which an antigen (or antibody) is dispersed, and the antigen (or antibody) in the solution is physically adsorbed to the insoluble carrier. The solvent used at this time is not particularly limited as long as it dissolves or uniformly disperses these substances, and known solvents can be used without any limitation, but in order to effectively maintain the physiological activity of the antigen or antibody to be used. Physiological saline or an aqueous solution having a buffering action with adjusted pH, for example, pH 6
It is preferable to use a phosphate buffer of about 10 to 200 mM adjusted to 8, or a glycine buffer or Tris buffer of about 10 to 200 mM adjusted to pH 7 to 9.
The concentration of the antigen or antibody in the dispersion is not particularly limited, but may be 1 (μg-
It is preferable to disperse so as to have an antigen or antibody / ml-solution) to 10 (mg-antigen or antibody / ml-solution).
Conditions for immersing the insoluble carrier in the dispersion and adsorbing the antigen (or antibody) may be appropriately determined in consideration of the loading efficiency and operability for each type of the insoluble carrier to be used and each type of the antibody or antigen to be supported. The general conditions are as follows. That is, the amount of the carrier used when immersed in the dispersion may be appropriately determined depending on the type of the antigen or antibody, but the weight when immersed in the dispersion is considered from the viewpoint of the loading efficiency and operability. %, It is preferably 0.001 to 10% by weight. In addition, these carriers are generally used in the form of a suspension. The temperature at which the carrier is immersed in the dispersion may be appropriately selected depending on the properties of the carrier and the components of the buffer solution. Generally, 4 ° C to 50 ° C is suitably used.
The time for immersing the carrier in the dispersion is generally 30 minutes to 24 hours. [0017] The blocking treatment in the present invention is a treatment performed in order to prevent a protein present in a sample other than a target antibody (or antigen) in a measurement from adsorbing to a carrier and causing a nonspecific reaction. This refers to a process in which a blocking treatment agent that is inactive against a target antigen-antibody reaction is adsorbed to an insoluble carrier. In the present invention, the blocking treatment can be carried out simultaneously with the carrying treatment with the blocking treatment agent coexisting when carrying out the above-mentioned carrying treatment, or separately after the carrying treatment. The most characteristic feature of the present invention is that a modified protein having a high molecular weight or associated is used as a blocking agent. The denatured protein having a high molecular weight or an association used as a blocking agent in the present invention may be chemically bonded by a physical treatment such as heat treatment or ultrasonic treatment or a chemical treatment with an acid or alkali. Or a protein having a high molecular weight via reversible or irreversible association by hydrogen bonding, hydrophobic interaction or the like. The protein used as a raw material of the modified protein (hereinafter, also referred to as "raw material protein") is not particularly limited as long as it is inert to a target antigen-antibody reaction and can be adsorbed on an insoluble carrier. However, bovine serum albumin, casein, etc. are preferably used in terms of availability and economy. When the raw material protein is denatured by heat treatment, from the viewpoint of denaturation efficiency, 0.01% to 20%, preferably 0.1% to 20%.
A 5% raw protein solution is heat treated. Here, the heating means to maintain the temperature at a temperature exceeding 30 ° C. Even if stored at room temperature for a long time, the molecular weight or association occurs, but the time required is too long, and thus lacks practicality. If the temperature is maintained at a temperature higher than 30 ° C., an effect can be obtained by an operation within several tens of hours. If the concentration of the raw material protein solution is too low, it is difficult to denature, and if it is too high, the denaturation efficiency may be reduced due to coagulation into a gel or the like. The processing time may be appropriately determined according to the processing temperature. Preferred processing temperatures and times are 37
C. to 120 C. and 10 minutes to 24 hours. Generally, when a relatively low temperature is employed, a long process is required. In order to carry out denaturation that provides a sufficient effect, the relationship between the processing temperature T expressed in degrees Celsius (° C.) and the processing time t expressed in time (h) of a 0.1% to 5% raw protein solution is 15.0> 3lnT +
It is particularly preferable to perform the heat treatment under such a condition that Int> 12.00 (where 150>T> 30). For example, when heating at 100 ° C., about 1/6 to 1 hour (3 lnT + Int = 1
2.02 to 13.82) If the treatment temperature is too low, denaturation or association is difficult, and if it is too high, the protein is coagulated or colored. When the raw material protein is denatured by ultrasonic treatment or chemical treatment, the concentration of the raw material protein, the processing temperature and the processing time may be appropriately selected from the same condition ranges as in the heat treatment. When the ultrasonic treatment is carried out, it is preferable that the treatment is carried out for 30 minutes to several hours under relatively mild conditions such as an ultrasonic cleaner, although it varies somewhat depending on the raw material protein used. Similarly, when performing chemical treatment, relatively mild conditions such as pH 3 to 6 for acidic and pH 9 to 12 for alkaline.
The range of the degree is preferable. If the pH is too low, the raw material protein may coagulate, or if the pH is too high, the raw material protein may be reduced in molecular weight. The denatured protein obtained by the above treatment is subjected to electrophoresis using, for example, a polyacrylamide gel, and the molecular weight is compared with that of the raw material protein.
It can be confirmed that the molecular weight is increased or the molecular weight is associated. When the starting protein is denatured, the presence or absence of denaturation can be confirmed by measuring the change in the absorbance of the blocking solution at a wavelength of λ = 280 nm using a spectrophotometer. Such denaturation of the protein can be confirmed by electrophoresis or the like even after the blocking treatment. The blocking treatment is carried out by coexisting the above-mentioned blocking treatment agent in the dispersion during the loading treatment or by immersing the loaded insoluble carrier in a solution in which the blocking agent is dissolved. The solvent of the blocking agent solution used in the above-mentioned blocking treatment is not particularly limited, but physiological saline, phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer or Good buffer are generally used. . Solution p
H is appropriately selected depending on the method of denaturation and the protein used, but is generally preferably in the range of pH 5 to 9. Although the concentration of the denatured protein (blocking agent) at the time of the blocking treatment varies depending on the immunoagglutination reagent used, the amount of the denatured protein adsorbed (held) on the insoluble carrier after blocking is 0.1 to 1 mg of the insoluble carrier. It is preferred that the concentration be from mg to 10 mg. Further, the amount of the denatured protein adsorbed on the insoluble carrier does not necessarily need to be controlled by the initial concentration of the solution, and the amount of the adsorbed protein may be controlled by appropriately adding the denatured protein to the solution during the blocking treatment. The carrier carrying the antigen or antibody in this manner is subjected to a blocking treatment, followed by separation and washing by centrifugation or the like, and finally, taking into consideration the antigen-antibody reaction or the agglutination and storage properties of the particles. The resultant is dispersed in an appropriately selected buffer to obtain an immunological agglutination reagent. According to the above method, a highly sensitive immunoagglutination reagent can be obtained. The immunoagglutination reagent obtained by the method of the present invention is a reagent utilizing a phenomenon that a carrier agglutinates due to an antigen-antibody reaction that occurs when the reagent is brought into contact with an antibody or an antigen in a sample. Latex agglutinating reagents, microtiter reagents, and the like, and examples of the quantitative reagent include a latex quantitative reagent that optically measures the degree of aggregation. Next, as an example of the immunological agglutination reagent of the present invention, a reagent form composed of two parts of a latex quantitative reagent (A and B) will be described, and a test method using the reagent will be specifically described. I do. The concentrations of the respective substances in the following examples exemplify the ranges that can be easily used as reagents, and do not limit the present invention. Inhibitor: A mixture containing the following (1), (2) and (3) as basic components (1) Buffer solution 20 to 1000 mM, pH 4 to 12 (2) Antigen (or antibody) and high molecular weight Carrier supporting the associated modified protein 0.01% to 0.5% (w / v; based on the agent A) (3) Sodium chloride 50 to 300 mM Other agent: A mixed solution (4) containing the following (4) and (5) as basic components ) Buffer 20 to 1000 mM, pH 4 to 12 (5) Sodium chloride 50 to 300 mM The buffer includes phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer and Good buffer. In the method for measuring the above-mentioned immunological agglutination reagent, a test solution is diluted about 10 to 30 times with a second agent and left at 37 ° C. for about 5 minutes. Next, an instep agent is added, an appropriate wavelength is selected, and the change over time in absorbance is measured to detect the aggregation state of the reagent. The amount of the instep agent may be appropriately determined depending on the type of the antibody or the antigen, but from the viewpoint of loading efficiency and operability, it is preferable to use the carrier so that the concentration of the carrier in the solution at the time of measurement is 0.001 to 15 wt%. And is generally used in the form of a suspension. By using a denatured protein having a high molecular weight or associated as a blocking agent, non-specific agglutination does not occur, and the agglutinability is superior to that of the untreated protein. That is, an immunoagglutination reagent having high sensitivity can be obtained. EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Examples 1 to 8 (1) Preparation of heat-treated bovine serum albumin (BSA) 1 g of commercially available BSA (Sigma) was dissolved in 100 g of 50 mM glycine buffer. Then, the mixture was slowly shaken at the temperature and time shown in Table 1, cooled to 4 ° C., and stored. (2) Preparation of TP antigen-carrying latex suspension (supplement) 0.1 ml of a polystyrene particle suspension having an average particle diameter of 0.3 μm and a latex concentration of 5% was added to a 20 mM glycine buffer at pH 8.6 at 10 μg / ml.
Was added to 0.9 ml of the diluted TP antigen solution and mixed. 4 at 4 ° C
After standing still for 2 hours, 2m of aqueous solution containing the above-mentioned heat-treated BSA
l was added and allowed to stand for another 1.5 hours. Then, 2 ml of 1 ml was added to the sediment (TP antigen-carrying latex) obtained by centrifugation.
PH 8 containing 00 mM sodium chloride and 0.1% sodium azide
A 100 mM Tris buffer (hereinafter, this mixed solution is abbreviated as TBS) was added and suspended to prepare an A-1 preparation. (3) Preparation of Buffer Solution (Otsu) TBS containing 1% of PEG-20000 (Wako Pure Chemical Industries) was prepared as Otsu. (4) Preparation of test solution Normal human serum and syphilis positive control serum (International reagent)
Was diluted twice to obtain a test solution. (5) Measurement method 10 μl of the test solution was added to 240 μl of the second agent in a glass cell, and the mixture was stirred and then allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes. Next, 80 μl of the former was added and stirred, and the change in optical density at a wavelength of 700 nm from 30 seconds to 200 seconds was measured. The above operations include the automatic analyzer T
BA-30R (Toshiba Medical) was used. (6) Relationship between heat treatment conditions and change in optical density The syphilis control serum was prepared by combining the inoculum prepared with the heat-treated BSA treated under different temperature and treatment time conditions as a blocking agent and the second agent. Are shown in Table 1. The state of denaturation of each blocking agent is as follows:
Electrophoresis using a buffer solution containing no sodium dodecyl sulfate (SDS) as a surfactant (non-SDS-
PAGE), followed by silver staining to confirm and evaluate by observing the fractionated bands of protein. That is, (1) a polymer band having a molecular weight of 2 times or more was clearly observed as compared with the untreated one, and (2) an increase in the molecular weight of each band as compared with the untreated one. And (3) high-molecular-weight protein increased, the band became broad (Broad Band), and no clear band was observed.
The evaluation was "+" and "BB". [Table 1] The change in the optical density of the reagent using the heat-treated BSA is ΔOD = 0.271 to 0.472, and the untreated BSA
It can be seen that the change in optical density of the reagent using SA is large compared to ΔOD = 0.251. The magnitude of the change in the optical density means the level of the cohesiveness, and the larger the change, the higher the cohesiveness and the higher the sensitivity. Thus, it can be seen that the reagent of the present invention has improved sensitivity. Comparative Example 1 (1) Preparation of Untreated BSA 1 g of commercially available BSA (Sigma) was dissolved in 100 g of 100 mM Tris buffer at 25 ° C., then cooled to 4 ° C. and stored. (2) The same operation as in Example 1 was carried out except for the preparation of BSA. (3) Relationship between heat treatment conditions and change in optical density Table 1 shows the results of measurement of syphilis control serum by combining inoculum prepared using untreated BSA as a blocking agent and bile preparation. Indicated. Incidentally, non-specific agglutination when measuring normal serum did not occur with any of the reagents of Examples 1 to 8 and Comparative Example 1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/543 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Field surveyed (Int.Cl. ⁷ , DB name) G01N 33/531 G01N 33/543

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 トレポネーマ・パリダム菌由来の抗原を
ラテックス粒子に担持させる処理およびブロッキング処
理をして免疫学的凝集反応ラテックス試薬を製造する方
法において、ブロッキング剤として、処理温度（Ｔ）と
処理時間（ｔ）との関係が、１５．０＞３ｌnＴ＋ｌｎ
ｔ＞１２．０（但し、１５０＞Ｔ＞３０）となるような
条件下で加熱処理を行って高分子量化または会合した牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることを特徴とする免
疫学的凝集反応ラテックス試薬の製造方法。(57) [Claims] [Claim 1] Antigen derived from Treponema pallidum
In a method for producing an immunological agglutination latex reagent by carrying out a treatment carried on latex particles and a blocking treatment, the treatment temperature (T)
The relationship with the processing time (t) is 15.0> 3lnT + ln
t> 12.0 (where 150>T> 30)
Cows that have undergone heat treatment to high molecular weight or associated
Immune, which comprises using a serum albumin (BSA)
A method for producing an epidemiological agglutination latex reagent .