JP3462339B2 - キャピラリー電気泳動用検出器 - Google Patents
キャピラリー電気泳動用検出器Info
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- JP3462339B2 JP3462339B2 JP08642096A JP8642096A JP3462339B2 JP 3462339 B2 JP3462339 B2 JP 3462339B2 JP 08642096 A JP08642096 A JP 08642096A JP 8642096 A JP8642096 A JP 8642096A JP 3462339 B2 JP3462339 B2 JP 3462339B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質、ペプ
チド、DNA (核酸)、糖質、神経伝達物質などの検出に用
いられるキャピラリー電気泳動の検出器に係り、特に、
微少量の試料の分析に好適なキャピラリー電気泳動法用
検出器に関する。
チド、DNA (核酸)、糖質、神経伝達物質などの検出に用
いられるキャピラリー電気泳動の検出器に係り、特に、
微少量の試料の分析に好適なキャピラリー電気泳動法用
検出器に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物の機能を分子レベルで明らかにする
ために、生体内のタンパク質、ペプチド、DNA (核酸)、
糖質、神経伝達関連物質などの解析が進められている。
その強力な手段として用いられているのが、ポリアクリ
ルアミドを支持体とするゲル電気泳動である。しかし、
ゲル電気泳動を実施してみると、ゲルの調整、染色、定
量など極めて多くの手操作の段階があり、高い分解能を
得ることは容易ではない。そのため、支持体としてゲル
を用いず、緩衝液中を移動する分子を直接検出し、分析
手順を省く試みがなされたが、発生するジュール熱によ
って液中に対流が生じることなどの問題があった。
ために、生体内のタンパク質、ペプチド、DNA (核酸)、
糖質、神経伝達関連物質などの解析が進められている。
その強力な手段として用いられているのが、ポリアクリ
ルアミドを支持体とするゲル電気泳動である。しかし、
ゲル電気泳動を実施してみると、ゲルの調整、染色、定
量など極めて多くの手操作の段階があり、高い分解能を
得ることは容易ではない。そのため、支持体としてゲル
を用いず、緩衝液中を移動する分子を直接検出し、分析
手順を省く試みがなされたが、発生するジュール熱によ
って液中に対流が生じることなどの問題があった。
【０００３】これに対し、内径100μm以下のキャピラリ
ーを用いて電気泳動を行えば、緩衝液の対流を無視する
ことができ、また、電気浸透流は発生するが、管内での
速度分布が均一であるので、分離性能を損なうことはな
い。さらに、このキャピラリー電気泳動法では、ジュー
ル熱の放散も容易なため高電圧を印加できるので、短時
間に高分解能が得られる。また、キャピラリーが細いた
めに試料の絶対量は nl (10-9l)程度と少なくて済み、
微量分析に適しているという利点を有することが注目さ
れ、神経伝達物質など微量分析への適用が期待されてい
る。検出法には、可視紫外吸収法、蛍光法、質量分析
法、ラマン分光法など様々な検出法が用いられている。
これらのキャピラリー電気泳動の全般については、例え
ば「ぶんせき」誌、第４号、281〜289頁 (1994年) (Bun
seki,No.8,pp.281〜289(1994))や、「キャピラリー電気
泳動・基礎と実際」、本多進・寺部茂編、講談社サイエン
ティフィック(1995年)に記載されている。
ーを用いて電気泳動を行えば、緩衝液の対流を無視する
ことができ、また、電気浸透流は発生するが、管内での
速度分布が均一であるので、分離性能を損なうことはな
い。さらに、このキャピラリー電気泳動法では、ジュー
ル熱の放散も容易なため高電圧を印加できるので、短時
間に高分解能が得られる。また、キャピラリーが細いた
めに試料の絶対量は nl (10-9l)程度と少なくて済み、
微量分析に適しているという利点を有することが注目さ
れ、神経伝達物質など微量分析への適用が期待されてい
る。検出法には、可視紫外吸収法、蛍光法、質量分析
法、ラマン分光法など様々な検出法が用いられている。
これらのキャピラリー電気泳動の全般については、例え
ば「ぶんせき」誌、第４号、281〜289頁 (1994年) (Bun
seki,No.8,pp.281〜289(1994))や、「キャピラリー電気
泳動・基礎と実際」、本多進・寺部茂編、講談社サイエン
ティフィック(1995年)に記載されている。
【０００４】上記のように、キャピラリー電気泳動法は
原理的には微少量分析に適しているが、検出器に問題が
ある。例えば、キャピラリー電気泳動の検出器として現
在広く用いられている可視紫外吸収法では、適用範囲は
広いものの、光路長が短いことによる検出感度の不十分
さが指摘されている。これに対して、レーザ励起蛍光法
を用いることによって検出感度の向上が試みられている
(例えば、「化学と工業」誌、第47巻、1551〜1554頁(1994
年) (Kagaku To Kogyou,47,pp.1551‐1554))が、目的物
質と高い効率で反応し、かつ、レーザの発振波長におい
て大きなモル吸収係数を有する誘導化剤が必要で、その
開発は容易ではなく、また、誘導化による分離効率に低
下といった問題点がある。また、手順も複雑化し、不純
物の混入によるノイズの発生や反応時間、温度のばらつ
きによる再現性の低下が心配される。一方、電気化学的
に検出する「アナリティカルケミストリー」誌、第61
巻、292A〜303A頁(1989年) (Analytical Chemistry,61,
pp.292A‐303A)記載のように、キャピラリーカラムの出
口付近に検出器を置くエンドキャピラリー型と呼ばれる
方法で、高感度な検出が実現されている。この方法によ
って、誘導化なしに数十amol(10-18mol)のカテコールア
ミン類やセロトニンなど神経伝達物質の検出が可能とな
った。しかし、検出できる試料は電極で反応する化学種
に限定されることや、紫外線吸収法に比べて化学種の同
定能力が低いという問題があった。また、質量分析法を
キャピラリー電気泳動法の検出器として用いる場合は、
試料の絶対量が多く必要なため、微少量分析には適さ
ず、また、装置が大がかりになるという欠点がある。
原理的には微少量分析に適しているが、検出器に問題が
ある。例えば、キャピラリー電気泳動の検出器として現
在広く用いられている可視紫外吸収法では、適用範囲は
広いものの、光路長が短いことによる検出感度の不十分
さが指摘されている。これに対して、レーザ励起蛍光法
を用いることによって検出感度の向上が試みられている
(例えば、「化学と工業」誌、第47巻、1551〜1554頁(1994
年) (Kagaku To Kogyou,47,pp.1551‐1554))が、目的物
質と高い効率で反応し、かつ、レーザの発振波長におい
て大きなモル吸収係数を有する誘導化剤が必要で、その
開発は容易ではなく、また、誘導化による分離効率に低
下といった問題点がある。また、手順も複雑化し、不純
物の混入によるノイズの発生や反応時間、温度のばらつ
きによる再現性の低下が心配される。一方、電気化学的
に検出する「アナリティカルケミストリー」誌、第61
巻、292A〜303A頁(1989年) (Analytical Chemistry,61,
pp.292A‐303A)記載のように、キャピラリーカラムの出
口付近に検出器を置くエンドキャピラリー型と呼ばれる
方法で、高感度な検出が実現されている。この方法によ
って、誘導化なしに数十amol(10-18mol)のカテコールア
ミン類やセロトニンなど神経伝達物質の検出が可能とな
った。しかし、検出できる試料は電極で反応する化学種
に限定されることや、紫外線吸収法に比べて化学種の同
定能力が低いという問題があった。また、質量分析法を
キャピラリー電気泳動法の検出器として用いる場合は、
試料の絶対量が多く必要なため、微少量分析には適さ
ず、また、装置が大がかりになるという欠点がある。
【０００５】一方、キャピラリー電気泳動の分離効率を
さらに向上させるため、振動分光学的検出器も考案され
ている。その一つがラマン分光法である。ラマン分光法
とは、入射光が分子に当るとその分子固有のエネルギー
状態を反映した光に変調される現象を利用して、化学種
の同定及び定量を行う分析法である。ラマン分光法は分
子の構造情報が得られるため、紫外可視吸収法や蛍光分
光法と比べて化学種の同定能力が優れている。これらラ
マン分光法を用いた検出器は、例えば「アプライドスペ
クトロスコピー」誌、第42巻、515〜518頁(1988年) (Ap
plied Spectroscopy,42,pp.515‐518 (1988))に記載さ
れている。しかし、ラマン分光法の感度は本質的に低い
ために、微少量の試料分析には適していない。ところ
が、アメリカ合衆国特許 US 005306403A(Apr.26,1994)
の中で、Vo‐Dinhらは電気泳動法においてラマンを用い
た高感度の検出を試みている。その中で、彼等は、ラマ
ン分光法の感度が一般に低いことを克服するため、表面
増強ラマン散乱(以下、SERSと略称する)効果を有する銀
基板をカラムの内壁に取り付けるという工夫をしてい
る。しかし、ゲル電気泳動法では上述したように、試料
の絶対量はキャピラリー電気泳動法に比べて極めて多
く、微少量の試料の分析には適さない。その上、彼等の
方法では、SERS 効果が十分に利用されていない。すな
わち、1) SERS 効果を用いたラマン分光法は、本来、SE
RS 基板のごく近傍の試料を検出するために用いられる
表面分析法の一つであり、一般の電気泳動に用いるよう
な大きなカラムに SERS 基板を配置した場合、、試料の
大部分は検出に用いられず、検出効率が非常に悪い、2)
SERS 基板は、電極電位を制御できる電極として用いる
ことによって、試料の吸着量や電極の表面状態を変化さ
せ、SERS 効果を高めることができるが、彼等のような
オンキャピラリーの検出ではそれが不可能である。
さらに向上させるため、振動分光学的検出器も考案され
ている。その一つがラマン分光法である。ラマン分光法
とは、入射光が分子に当るとその分子固有のエネルギー
状態を反映した光に変調される現象を利用して、化学種
の同定及び定量を行う分析法である。ラマン分光法は分
子の構造情報が得られるため、紫外可視吸収法や蛍光分
光法と比べて化学種の同定能力が優れている。これらラ
マン分光法を用いた検出器は、例えば「アプライドスペ
クトロスコピー」誌、第42巻、515〜518頁(1988年) (Ap
plied Spectroscopy,42,pp.515‐518 (1988))に記載さ
れている。しかし、ラマン分光法の感度は本質的に低い
ために、微少量の試料分析には適していない。ところ
が、アメリカ合衆国特許 US 005306403A(Apr.26,1994)
の中で、Vo‐Dinhらは電気泳動法においてラマンを用い
た高感度の検出を試みている。その中で、彼等は、ラマ
ン分光法の感度が一般に低いことを克服するため、表面
増強ラマン散乱(以下、SERSと略称する)効果を有する銀
基板をカラムの内壁に取り付けるという工夫をしてい
る。しかし、ゲル電気泳動法では上述したように、試料
の絶対量はキャピラリー電気泳動法に比べて極めて多
く、微少量の試料の分析には適さない。その上、彼等の
方法では、SERS 効果が十分に利用されていない。すな
わち、1) SERS 効果を用いたラマン分光法は、本来、SE
RS 基板のごく近傍の試料を検出するために用いられる
表面分析法の一つであり、一般の電気泳動に用いるよう
な大きなカラムに SERS 基板を配置した場合、、試料の
大部分は検出に用いられず、検出効率が非常に悪い、2)
SERS 基板は、電極電位を制御できる電極として用いる
ことによって、試料の吸着量や電極の表面状態を変化さ
せ、SERS 効果を高めることができるが、彼等のような
オンキャピラリーの検出ではそれが不可能である。
【０００６】これら SERS の全般にわたっては、「表
面」誌、第30巻、528〜545頁(1992年)(Hyoumen,30,pp.5
28‐545(1992)）に記載されている。さらに、彼等はラ
マン分光用の検出器としてシングルチャンネル型を用い
ているため、オンラインでスペクトルを得ることは測定
時間の点から困難であり、化学種の同定能力は低い。ま
た、Morris らは、「アプライドスペクトロスコピー」
誌、第47巻、855〜857頁(1993年) (Applied Spectrosco
py,47,pp.855‐857)に記載されているように、ゲル電気
泳動法やキャピラリー電気泳動法などの分離手法と組み
合わせずに、直接試料を検出できる微小 SERS 活性電極
を作製した。彼等は、この検出器が対物レンズを用いた
顕微ラマン分光装置を用いているため、電極を小さくし
たときの損失が殆どないことを報告している。また、こ
の手法では SERS 効果を十分に利用しており、微少量の
試料には有効であると思われる。しかしながら、電気泳
動等の分離手法と組み合わせていないために、複数の化
学種が混在している生体試料等ではその同定が困難であ
ることは明白である。
面」誌、第30巻、528〜545頁(1992年)(Hyoumen,30,pp.5
28‐545(1992)）に記載されている。さらに、彼等はラ
マン分光用の検出器としてシングルチャンネル型を用い
ているため、オンラインでスペクトルを得ることは測定
時間の点から困難であり、化学種の同定能力は低い。ま
た、Morris らは、「アプライドスペクトロスコピー」
誌、第47巻、855〜857頁(1993年) (Applied Spectrosco
py,47,pp.855‐857)に記載されているように、ゲル電気
泳動法やキャピラリー電気泳動法などの分離手法と組み
合わせずに、直接試料を検出できる微小 SERS 活性電極
を作製した。彼等は、この検出器が対物レンズを用いた
顕微ラマン分光装置を用いているため、電極を小さくし
たときの損失が殆どないことを報告している。また、こ
の手法では SERS 効果を十分に利用しており、微少量の
試料には有効であると思われる。しかしながら、電気泳
動等の分離手法と組み合わせていないために、複数の化
学種が混在している生体試料等ではその同定が困難であ
ることは明白である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】キヤピラリー電気泳動
装置は、タンパク質、ペプチド、DNA (核酸)、神経伝達
関連物質などの微少量の試料に対して有効な成分分離の
手法とはなり得るが、従来の検出手法では、適用できる
試料の範囲、簡便さ等に問題がある。本発明の目的は、
上記従来技術の有していた課題を解決して、極少量の試
料の検出に対して有効な高感度検出器を提供することに
ある。
装置は、タンパク質、ペプチド、DNA (核酸)、神経伝達
関連物質などの微少量の試料に対して有効な成分分離の
手法とはなり得るが、従来の検出手法では、適用できる
試料の範囲、簡便さ等に問題がある。本発明の目的は、
上記従来技術の有していた課題を解決して、極少量の試
料の検出に対して有効な高感度検出器を提供することに
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明においては、表面増強ラマン散乱活性を誘起
する微小電極とラマン分光装置とから構成し、上記表面
増強ラマン散乱活性微小電極の電極電位を変えられるよ
うにする。この場合、上記表面増強ラマン散乱活性微小
電極の形状をファイバー状としてもよい。また、表面増
強ラマン散乱活性を誘起する微小電極とラマン分光装置
とから構成し、上記ラマン分光装置の検出器としてマル
チチャンネル型を用いることにより、オンラインでスペ
クトルが得られるようにする。 つまり、上記目的は、以
下の手段によって解決することができる。すなわち、キ
ャピラリー電気泳動の検出器として、SERS 効果を用い
たラマン分光法を利用する。この手法は表面分析法の一
つで、電極ごく近傍の試料を高感度に検出できる。ま
た、水溶液中での測定に有利なだけでなく、キャピラリ
ーを通しての測定が可能である。よって、キャピラリー
電気泳動によって分離された微少量の試料を薄層化する
ことでこの効果を利用することができる。具体的には、
キャピラリー電気泳動によって分離された成分がファイ
バー状の微小電極の周りを薄層状に流れるようにする。
さらに、SERS 効果を有効に利用するために、微小 SERS
電極はキャピラリーカラムの出口付近に置くエンドキ
ャピラリー型に配置する。
め、本発明においては、表面増強ラマン散乱活性を誘起
する微小電極とラマン分光装置とから構成し、上記表面
増強ラマン散乱活性微小電極の電極電位を変えられるよ
うにする。この場合、上記表面増強ラマン散乱活性微小
電極の形状をファイバー状としてもよい。また、表面増
強ラマン散乱活性を誘起する微小電極とラマン分光装置
とから構成し、上記ラマン分光装置の検出器としてマル
チチャンネル型を用いることにより、オンラインでスペ
クトルが得られるようにする。 つまり、上記目的は、以
下の手段によって解決することができる。すなわち、キ
ャピラリー電気泳動の検出器として、SERS 効果を用い
たラマン分光法を利用する。この手法は表面分析法の一
つで、電極ごく近傍の試料を高感度に検出できる。ま
た、水溶液中での測定に有利なだけでなく、キャピラリ
ーを通しての測定が可能である。よって、キャピラリー
電気泳動によって分離された微少量の試料を薄層化する
ことでこの効果を利用することができる。具体的には、
キャピラリー電気泳動によって分離された成分がファイ
バー状の微小電極の周りを薄層状に流れるようにする。
さらに、SERS 効果を有効に利用するために、微小 SERS
電極はキャピラリーカラムの出口付近に置くエンドキ
ャピラリー型に配置する。
【０００９】ここで、微小 SERS 電極の材料としては、
SERS 活性を得られるものとして最も良く知られてい
る、金、銀、銅をはじめニッケル、パラジウム、白金、
チタン、水銀などの金属や、酸化ニッケルや酸化チタン
等の半導体を用いることができるが、キャピラリーに挿
入できるようファイバー状にする。ファイバー化しにく
い材料では、炭素繊維などにスパッタ法等の真空薄膜形
成技術により SERS 活性を得られる材料を被覆して用い
ることもできる。さらに、キャピラリーに挿入しない部
分はガラス管等に封入することによって取扱いを容易に
し、微小電極とする。また、SERS 効果は、電極表面に
原子オーダーから100nm程度の粗さを付加することによ
って十分に利用することができるので、微小電極に対し
て、1) 電気化学的に溶解するかまたは酸化還元処理を
繰り返す、2) アルミナ等の研磨材で擦る、3) 真空のエ
ッチング装置にアルゴン等のガスを導入したミリング装
置を使う、4) 表面に回折格子を切るなどの処理を行う
か、または、5) 1)〜 4)のような処理を行ったファイバ
ー状の材料にスパッタ法等の真空薄膜形成技術によりSE
RS 活性を得られる材料を被覆して微小 SERS 活性電極
を得る。
SERS 活性を得られるものとして最も良く知られてい
る、金、銀、銅をはじめニッケル、パラジウム、白金、
チタン、水銀などの金属や、酸化ニッケルや酸化チタン
等の半導体を用いることができるが、キャピラリーに挿
入できるようファイバー状にする。ファイバー化しにく
い材料では、炭素繊維などにスパッタ法等の真空薄膜形
成技術により SERS 活性を得られる材料を被覆して用い
ることもできる。さらに、キャピラリーに挿入しない部
分はガラス管等に封入することによって取扱いを容易に
し、微小電極とする。また、SERS 効果は、電極表面に
原子オーダーから100nm程度の粗さを付加することによ
って十分に利用することができるので、微小電極に対し
て、1) 電気化学的に溶解するかまたは酸化還元処理を
繰り返す、2) アルミナ等の研磨材で擦る、3) 真空のエ
ッチング装置にアルゴン等のガスを導入したミリング装
置を使う、4) 表面に回折格子を切るなどの処理を行う
か、または、5) 1)〜 4)のような処理を行ったファイバ
ー状の材料にスパッタ法等の真空薄膜形成技術によりSE
RS 活性を得られる材料を被覆して微小 SERS 活性電極
を得る。
【００１０】一方、ラマン分光測定装置は、微小電極に
対しての効率を上げるため、対物レンズ等を用いた顕微
ラマン分光装置で測定を行うか、または、細い光ファイ
バー型のプローブを通して微小域での励起及び検出を行
う。また、光学系を全反射配置にすることによって粗さ
がなくても増強効果を得ることができる(特に、表面プ
ラズモンポラリトン増強ラマン散乱と呼ぶ)。また、化
学種の同定能力を高めるために、ラマン分光用の検出器
としてマルチチャンネル型を用い、オンラインでスペク
トルを得ることを可能にする。
対しての効率を上げるため、対物レンズ等を用いた顕微
ラマン分光装置で測定を行うか、または、細い光ファイ
バー型のプローブを通して微小域での励起及び検出を行
う。また、光学系を全反射配置にすることによって粗さ
がなくても増強効果を得ることができる(特に、表面プ
ラズモンポラリトン増強ラマン散乱と呼ぶ)。また、化
学種の同定能力を高めるために、ラマン分光用の検出器
としてマルチチャンネル型を用い、オンラインでスペク
トルを得ることを可能にする。
【００１１】また、キャピラリー内にファイバー状のプ
ローブを配置したことによって、分離された微少量の成
分が薄層化され、SERS 効果を用いたラマン分光法を表
面分析として有効に活用することができる。また、エン
ドキャピラリー型であることにより、電極電位を制御す
ることができ、試料の吸着量や電極の表面状態を変化さ
せ、SERS 効果を高めることができる。よって、従来の
技術の項で述べた Vo‐Dinh 等の方法に比べて、感度を
非常に高めることができる。さらに、ラマン分光法本来
の特徴である化学種の優れた同定能力によってさらに成
分の分離効率を高めることができる。
ローブを配置したことによって、分離された微少量の成
分が薄層化され、SERS 効果を用いたラマン分光法を表
面分析として有効に活用することができる。また、エン
ドキャピラリー型であることにより、電極電位を制御す
ることができ、試料の吸着量や電極の表面状態を変化さ
せ、SERS 効果を高めることができる。よって、従来の
技術の項で述べた Vo‐Dinh 等の方法に比べて、感度を
非常に高めることができる。さらに、ラマン分光法本来
の特徴である化学種の優れた同定能力によってさらに成
分の分離効率を高めることができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明の内容について、発
明の実施の形態の例によって具体的に説明する。なお、
本発明は、以下の実施の形態の例にのみ限定されるもの
ではない。
明の実施の形態の例によって具体的に説明する。なお、
本発明は、以下の実施の形態の例にのみ限定されるもの
ではない。
【００１３】
【実施の形態１】外径50μm、長さ２cmの銀のワイヤ(フ
ルウチ化学製)を外径0.5mm、長さ７cmの金リード線(フ
ルウチ化学製)にスポット溶接した。該リード線つきワ
イヤをテーパ付き軟質ガラスキャピラリー(先端部の内
径0.5mm、外径１mm、テーパ部の長さ１cm、全長５cm)に
挿入し、テーパ部から銀ワイヤが１cmほど突き出るよう
にセットし、テーパ部を電気炉に挿入して温度を徐々に
上昇(20℃/分)させ、650℃で５分間保持してテーパ部を
封入した。次に、先端の銀ワイヤをキャピラリー先端か
ら１〜２mm残して切断し、キャピラリーのテーパ部と反
対側の先端はエポキシ樹脂で封入し、金リード線を固定
した。次に、上記キャピラリーと別途用意した白金のワ
イヤ、銀/塩化銀参照電極をマイクロマニピュレータ(日
本マイクロニクス製)に装着し、0.1 M の硝酸カリウム
水溶液の入ったペトリ皿に、顕微鏡下でこれを浸漬し、
銀ワイヤを作用極、白金ワイヤを対極としてポテンシオ
スタット(扶桑製作所製)に接続した。参照電極に対して
＋0.3 V の電位を銀ワイヤに10秒間印加し、先端を溶解
させて先鋭化した。この結果、先端径が10μm程度、長
さ500μm程度の微小 SERS 活性銀電極が得られた。
ルウチ化学製)を外径0.5mm、長さ７cmの金リード線(フ
ルウチ化学製)にスポット溶接した。該リード線つきワ
イヤをテーパ付き軟質ガラスキャピラリー(先端部の内
径0.5mm、外径１mm、テーパ部の長さ１cm、全長５cm)に
挿入し、テーパ部から銀ワイヤが１cmほど突き出るよう
にセットし、テーパ部を電気炉に挿入して温度を徐々に
上昇(20℃/分)させ、650℃で５分間保持してテーパ部を
封入した。次に、先端の銀ワイヤをキャピラリー先端か
ら１〜２mm残して切断し、キャピラリーのテーパ部と反
対側の先端はエポキシ樹脂で封入し、金リード線を固定
した。次に、上記キャピラリーと別途用意した白金のワ
イヤ、銀/塩化銀参照電極をマイクロマニピュレータ(日
本マイクロニクス製)に装着し、0.1 M の硝酸カリウム
水溶液の入ったペトリ皿に、顕微鏡下でこれを浸漬し、
銀ワイヤを作用極、白金ワイヤを対極としてポテンシオ
スタット(扶桑製作所製)に接続した。参照電極に対して
＋0.3 V の電位を銀ワイヤに10秒間印加し、先端を溶解
させて先鋭化した。この結果、先端径が10μm程度、長
さ500μm程度の微小 SERS 活性銀電極が得られた。
【００１４】次に、上記銀電極を図２に示すキャピラリ
ー電気泳動装置にセットした。該泳動装置において、キ
ャピラリー１の一端はバッファバイエル２に浸漬し、も
う一端は、図３に示すように、クラック３の入った非被
覆キャピラリー部の外側が多孔質ガラス４で覆われ、該
多孔質ガラスの両端はエポキシ樹脂５で覆い、スライド
ガラス６に固定し、さらに、電解液に浸漬されてキャピ
ラリーの泳動液と電解液とが液絡されているセル７を通
って検出器に接続した。電気泳動用のキャピラリー１
は、内径25μm、長さ50cmのフューズドシリカ(ジーエル
サイエンス製)を使用した。また、泳動用の電圧は、図
２に示すように、定電圧電流供給装置(松定プレシジョ
ン製 : HCZ‐30PN‐M)８にてバッファバイエル２と液絡
セル７との間に印加した。
ー電気泳動装置にセットした。該泳動装置において、キ
ャピラリー１の一端はバッファバイエル２に浸漬し、も
う一端は、図３に示すように、クラック３の入った非被
覆キャピラリー部の外側が多孔質ガラス４で覆われ、該
多孔質ガラスの両端はエポキシ樹脂５で覆い、スライド
ガラス６に固定し、さらに、電解液に浸漬されてキャピ
ラリーの泳動液と電解液とが液絡されているセル７を通
って検出器に接続した。電気泳動用のキャピラリー１
は、内径25μm、長さ50cmのフューズドシリカ(ジーエル
サイエンス製)を使用した。また、泳動用の電圧は、図
２に示すように、定電圧電流供給装置(松定プレシジョ
ン製 : HCZ‐30PN‐M)８にてバッファバイエル２と液絡
セル７との間に印加した。
【００１５】ここで、検出器は、図１に示す構造をして
おり、キャピラリー１の終端を参照電極９を内蔵したガ
ラスセルに接続し、銀電極はキャピラリーの終端からキ
ャピラリー内に挿入した。一方、レーザ等ラマン分光用
光源12を集光系(レニショー製)13によって銀電極11上に
集光し、集光系(レニショー製)14を用いて散乱光を集光
し、ラマン分光用マルチチャンネル検出器(レニショー
製)15で測定した。試料の注入は、バッファバイエルの
隣に試料バイエルを置き、キャピラリー端を浸漬した後
試料バイエルを10cmの高さに30秒間持ち上げ、直ちに元
の高さに戻し、キャピラリー先端をバッファバイエルに
戻して行った。この時の注入量は約５ナノリットルであ
った。泳動液としては、50mMの硫酸ドデシルナトリウム
を含む50mMのリン酸緩衝液(pH 6.8)を用いた。
おり、キャピラリー１の終端を参照電極９を内蔵したガ
ラスセルに接続し、銀電極はキャピラリーの終端からキ
ャピラリー内に挿入した。一方、レーザ等ラマン分光用
光源12を集光系(レニショー製)13によって銀電極11上に
集光し、集光系(レニショー製)14を用いて散乱光を集光
し、ラマン分光用マルチチャンネル検出器(レニショー
製)15で測定した。試料の注入は、バッファバイエルの
隣に試料バイエルを置き、キャピラリー端を浸漬した後
試料バイエルを10cmの高さに30秒間持ち上げ、直ちに元
の高さに戻し、キャピラリー先端をバッファバイエルに
戻して行った。この時の注入量は約５ナノリットルであ
った。泳動液としては、50mMの硫酸ドデシルナトリウム
を含む50mMのリン酸緩衝液(pH 6.8)を用いた。
【００１６】試料として、１μMのグリシンとα‐アラ
ニンとの混合溶液を注入し、泳動用の電圧は10kVとして
電気泳動を行った。銀電極の電位はポテンシオスタット
(扶桑製作所製)で、０〜−0.8 V に制御した。ラマン分
光用光源としては、アルゴンイオンレーザ(日本電気
製、514.5nm、50mW)を用いた。1380〜1410cm-1付近のCO
2 -ラマンバンドの強度を連続的に測定したところ、泳動
開始５分でグリシンによる、10分でα‐アラニンの CO2
-ラマンバンドによるピークが観測された。得られたそ
れぞれの典型的なラマンスペクトルを図４に示す。銀電
極の電位を変化させると、ラマン強度も変化し、−0.6
V の時に最も大きな強度が得られた。同様の実験を SER
S 活性のない白金の電極で行ったが、ラマン強度変化は
測定下限以下であった。
ニンとの混合溶液を注入し、泳動用の電圧は10kVとして
電気泳動を行った。銀電極の電位はポテンシオスタット
(扶桑製作所製)で、０〜−0.8 V に制御した。ラマン分
光用光源としては、アルゴンイオンレーザ(日本電気
製、514.5nm、50mW)を用いた。1380〜1410cm-1付近のCO
2 -ラマンバンドの強度を連続的に測定したところ、泳動
開始５分でグリシンによる、10分でα‐アラニンの CO2
-ラマンバンドによるピークが観測された。得られたそ
れぞれの典型的なラマンスペクトルを図４に示す。銀電
極の電位を変化させると、ラマン強度も変化し、−0.6
V の時に最も大きな強度が得られた。同様の実験を SER
S 活性のない白金の電極で行ったが、ラマン強度変化は
測定下限以下であった。
【００１７】
【実施の形態２】実施の形態１の場合と同様の微小電極
を用い、試料として数μM程度のα‐アラニンとβ‐ア
ラニンの混合溶液(混合比は未知)を用いて同様の条件で
実験を行った。測定するラマンバンドは、実施の形態１
の CO2 ラマンバンドに加えて840〜860cm-1付近の C‐C
H3ラマンバンドの強度を同時に連続的に測定したとこ
ろ、泳動開始10分でα‐アラニンとβ‐アラニン両方に
よる CO2 -ラマンバンドによるピークが観測されたが、C
‐CH3ラマンバンドの相対強度はα‐アラニンのみの場
合の約半分で、これにより、α‐アラニンとβ‐アラニ
ンとは同量含まれていることが判った。得られたそれぞ
れの典型的なラマンスペクトルを図５に示す。
を用い、試料として数μM程度のα‐アラニンとβ‐ア
ラニンの混合溶液(混合比は未知)を用いて同様の条件で
実験を行った。測定するラマンバンドは、実施の形態１
の CO2 ラマンバンドに加えて840〜860cm-1付近の C‐C
H3ラマンバンドの強度を同時に連続的に測定したとこ
ろ、泳動開始10分でα‐アラニンとβ‐アラニン両方に
よる CO2 -ラマンバンドによるピークが観測されたが、C
‐CH3ラマンバンドの相対強度はα‐アラニンのみの場
合の約半分で、これにより、α‐アラニンとβ‐アラニ
ンとは同量含まれていることが判った。得られたそれぞ
れの典型的なラマンスペクトルを図５に示す。
【００１８】
【実施の形態３】実施の形態１における銀ワイヤに代え
て金のワイヤを用いて、同様に先端を先鋭化した微小電
極を作製し、さらに、SERS 効果を高めるために、0.1M
の塩化カリウム溶液中で参照電極に対して＋1.2〜−0.5
Vまで電位を数回周期的にかけ、微小 SERS 活性金電極
を得た。試料として１μMのアルギニン、トリプトファ
ン、チロシンの混合溶液を用い、実施の形態１の場合と
同様の条件で実験を行い、ラマン分光用光源としては、
ヘリウムネオンレーザ(日本電気製、632.8nm、25mW)を
用いた。1380〜1410cm-1付近の CO2 -ラマンバンドの強
度を連続的に測定したところ、泳動開始２分でアルギニ
ンによる、３分でトリプトファンによる、４分でチロシ
ンによるピークがそれぞれ観測された。
て金のワイヤを用いて、同様に先端を先鋭化した微小電
極を作製し、さらに、SERS 効果を高めるために、0.1M
の塩化カリウム溶液中で参照電極に対して＋1.2〜−0.5
Vまで電位を数回周期的にかけ、微小 SERS 活性金電極
を得た。試料として１μMのアルギニン、トリプトファ
ン、チロシンの混合溶液を用い、実施の形態１の場合と
同様の条件で実験を行い、ラマン分光用光源としては、
ヘリウムネオンレーザ(日本電気製、632.8nm、25mW)を
用いた。1380〜1410cm-1付近の CO2 -ラマンバンドの強
度を連続的に測定したところ、泳動開始２分でアルギニ
ンによる、３分でトリプトファンによる、４分でチロシ
ンによるピークがそれぞれ観測された。
【００１９】
【発明の効果】以上述べてきたように、キャピラリー電
気泳動装置において、SERS 活性を有する微小電極をそ
の検出器に用いることによって、従来法に比べ格段に感
度を高めることができた。さらに、スペクトルを得るこ
とができることから、キャピラリー電気泳動では分離で
きない試料も分光学的に分離することが可能になり、そ
の分離性能を向上させることができた。以上のことは、
分析化学の分野だけでなく、神経科学、基礎医学、バイ
オケミストリーなどの分野での利用価値が高い。
気泳動装置において、SERS 活性を有する微小電極をそ
の検出器に用いることによって、従来法に比べ格段に感
度を高めることができた。さらに、スペクトルを得るこ
とができることから、キャピラリー電気泳動では分離で
きない試料も分光学的に分離することが可能になり、そ
の分離性能を向上させることができた。以上のことは、
分析化学の分野だけでなく、神経科学、基礎医学、バイ
オケミストリーなどの分野での利用価値が高い。
【図１】微小 SERS 活性電極 を用いた検出器の概略拡
大図。
大図。
【図２】キャピラリー電気泳動用検出器の装置図。
【図３】図２における液絡法部分の拡大図。
【図４】実施の形態１におけるラマンスペクトルの例
(a:グリシン、b:α‐アラニン)。
(a:グリシン、b:α‐アラニン)。
【図５】実施の形態２におけるラマンスペクトルの例
(a:α‐アラニン、b：β‐アラニン)。
(a:α‐アラニン、b：β‐アラニン)。
１…キャピラリー(電気泳動用)、２…バッファバイエ
ル、３…クラック、４…多孔質ガラス、５…エポキシ樹
脂、６…スライドグラス、７…液絡セル、８…定電圧電
流供給装置、９…参照極、10…ガラスセル(検出用)、11
…微小 SERS 活性電極、12…ラマン分光用光源、13…集
光系(ラマン分光励起用)、14…集光系(ラマン分光検出
用)、15…ラマン分光用マルチチャンネル検出器、16…
リード線、17…キャピラリー(電極固定用)、18…導電性
エポキシ樹脂。
ル、３…クラック、４…多孔質ガラス、５…エポキシ樹
脂、６…スライドグラス、７…液絡セル、８…定電圧電
流供給装置、９…参照極、10…ガラスセル(検出用)、11
…微小 SERS 活性電極、12…ラマン分光用光源、13…集
光系(ラマン分光励起用)、14…集光系(ラマン分光検出
用)、15…ラマン分光用マルチチャンネル検出器、16…
リード線、17…キャピラリー(電極固定用)、18…導電性
エポキシ樹脂。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３５Ｅ
(72)発明者 森田 雅夫
東京都新宿区西新宿三丁目19番２号 日
本電信電話株式会社内
(56)参考文献 米国特許5306403（ＵＳ，Ａ)
ＣＨＡＮ−ＴＵＨ ＣＨＥＮ，ＭＩＣ
ＨＡＥＬ Ｄ．ＭＯＲＲＩＳ，Ｒａｍａ
ｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＡＰＰＬＩＥＤ Ｓ
ＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ，1988年，ＶＯ
Ｌ．42 ＮＯ．３，515−518
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 27/447
G01J 3/44
G01N 21/64
G01N 21/65
G01N 21/69
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】表面増強ラマン散乱活性を誘起する微小電
極とラマン分光装置とから構成され、上記表面増強ラマ
ン散乱活性微小電極の電極電位を変えられるようにして
あることを特徴とするキャピラリー電気泳動用検出器。 - 【請求項２】上記表面増強ラマン散乱活性微小電極の形
状がファイバー状であることを特徴とする請求項１記載
のキャピラリー電気泳動用検出器。 - 【請求項３】表面増強ラマン散乱活性を誘起する微小電
極とラマン分光装置とから構成され、上記ラマン分光装
置の検出器としてマルチチャンネル型を用いることによ
り、オンラインでスペクトルが得られることを特徴とす
るキャピラリー電気泳動用検出器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08642096A JP3462339B2 (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | キャピラリー電気泳動用検出器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08642096A JP3462339B2 (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | キャピラリー電気泳動用検出器 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09281076A JPH09281076A (ja) | 1997-10-31 |
| JP3462339B2 true JP3462339B2 (ja) | 2003-11-05 |
Family
ID=13886403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08642096A Expired - Fee Related JP3462339B2 (ja) | 1996-04-09 | 1996-04-09 | キャピラリー電気泳動用検出器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3462339B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050148098A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-07 | Xing Su | Methods for using raman spectroscopy to obtain a protein profile of a biological sample |
| JP5731960B2 (ja) * | 2011-11-25 | 2015-06-10 | 国立大学法人群馬大学 | ラマン分光測定用反応容器及びこれを用いたラマン分光測定方法 |
-
1996
- 1996-04-09 JP JP08642096A patent/JP3462339B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣＨＡＮ−ＴＵＨ ＣＨＥＮ，ＭＩＣＨＡＥＬ Ｄ．ＭＯＲＲＩＳ，Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ，１９８８年，ＶＯＬ．４２ ＮＯ．３，５１５−５１８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09281076A (ja) | 1997-10-31 |
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Legal Events
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