JP3461448B2 - Specific substance introduction apparatus, observation apparatus using the same, and substance introduction method - Google Patents
Specific substance introduction apparatus, observation apparatus using the same, and substance introduction methodInfo
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- C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ベシクルを細胞試
料の特定位置に近づけて、ベシクルに内包される特定物
質を細胞に導入するための導入装置に関し、さらには、
この導入装置を備えた観察装置に関する。さらに、ベシ
クルを細胞に近づけ接触させることで特定物質を細胞内
に導入する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an introduction device for bringing a vesicle close to a specific position of a cell sample to introduce a specific substance contained in the vesicle into cells, and further,
The present invention relates to an observation device provided with the introduction device. Furthermore, the present invention relates to a method for introducing a specific substance into cells by bringing the vesicles closer to and contacting the cells.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＤＮＡや膜タンパクや細胞質、細胞間の
情報伝達物質等の特定物質を細胞試料に導入する代表的
な手法には、以下に述べる三つがある。第一の手法は、
最初に特定物質が細胞試料と同じ構造の膜で囲まれたベ
シクルと呼ばれる物質を用意し、これを細胞試料の培養
液中に特定濃度で共存させ、細胞試料とベシクルとが接
触した後に、ベシクルが細胞試料に取り込まれるのを待
つことで、ベシクルに内包された特定物質を細胞試料に
導入させる方法である。2. Description of the Related Art There are the following three typical methods for introducing a specific substance such as DNA, membrane protein, cytoplasm and intercellular signaling substance into a cell sample. The first method is
First, prepare a substance called a vesicle in which the specific substance is surrounded by a membrane with the same structure as the cell sample, and make it coexist in the culture medium of the cell sample at a specific concentration, and after the cell sample and the vesicles come into contact, the vesicle In this method, the specific substance encapsulated in the vesicles is introduced into the cell sample by waiting until it is taken up by the cell sample.
【０００３】ここで、ベシクルについて説明する。ベシ
クルは、脂質膜の内側もしくは脂質膜上に、細胞試料を
導入させたい特定物質を取り込んだものを指し、例え
ば、特開平６−２９８６３８号公報に記載された「リポ
ソーム」はその一つである。Here, the vesicle will be described. The vesicle refers to one in which a specific substance to be introduced into a cell sample is incorporated inside or on the lipid membrane, and for example, "liposome" described in JP-A-6-298638 is one of them. .
【０００４】この特開平６−２９８６３８号公報には、
「リポソーム」が内部に水相を含むリン脂質二重層の微
小ベシクルであると記載されている。また、ベシクルに
取り込まれた特定物質については、水溶性薬物（特定物
質）はその内水相へ、油溶性のものは二重膜部分へ取り
込むことができると記載がある。これは脂質膜の内側も
しくは脂質膜上に、特定物質が取り込まれた状態を示し
ている。また、特定物質がベシクルに取り込まれた状態
を内包と呼んでいる。Japanese Patent Laid-Open No. 6-298638 discloses that
"Liposomes" are described as microvesicles of phospholipid bilayers containing an aqueous phase inside. Further, regarding the specific substance taken into the vesicle, it is described that the water-soluble drug (specific substance) can be taken into the inner aqueous phase and the oil-soluble substance can be taken into the double membrane part. This indicates a state in which the specific substance is taken up inside the lipid membrane or on the lipid membrane. In addition, a state in which a specific substance is taken up by a vesicle is called an internal inclusion.
【０００５】第二の手法は、同じく最初にベシクルを用
意し、ガラスチューブの先端にベシクルを吸着し、これ
を細胞試料に押し付けて融合させるやり方である。第三
の手法は、先端が尖ったガラスチューブ内に特定物質を
含ませ、ガラスチューブの先端を細胞試料に突き刺し、
中に含んでいる特定物質を細胞試料に注入するやり方で
ある。The second method is to prepare vesicles first, adsorb the vesicles to the tip of the glass tube, and press the vesicles against the cell sample to fuse them. The third method is to include a specific substance in a glass tube with a sharp tip, pierce the tip of the glass tube into a cell sample,
It is a method of injecting a specific substance contained therein into a cell sample.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】第一の手法では、特定
物質が細胞試料のどこに導入されたかが分からないた
め、のちの観察の際に不便がある。第二の手法では、ガ
ラスチューブで吸着できるベシクルの大きさは精々１０
μｍであり、これよりも小さいベシクルを導入すること
ができない。In the first method, it is not known where the specific substance was introduced into the cell sample, which is inconvenient for later observation. In the second method, the size of vesicles that can be adsorbed by the glass tube is at most 10
μm, and vesicles smaller than this cannot be introduced.
【０００７】第三の手法では、細胞試料の細胞膜に穴を
開けるため、細胞が破壊されるおそれがある。また、ガ
ラスチューブの先端は非常に細いことが要求されるが、
その加工にも限界がある。In the third method, since the cell membrane of the cell sample is pierced, the cells may be destroyed. Also, the tip of the glass tube is required to be very thin,
There is a limit to the processing.
【０００８】本発明の目的は、ベシクルを、特に１０μ
ｍよりも小さいベシクルであっても、細胞試料の所望位
置に選択的に接触配置でき、これにより所望位置に特定
物質を導入できる特定物質の導入装置と方法を提供する
ことである。本発明の目的は、また、細胞試料へのベシ
クルの導入の際に働く相互作用をも解析可能な観察装置
と方法を提供することである。It is an object of the invention to use vesicles, especially 10 μm.
It is an object of the present invention to provide an apparatus and method for introducing a specific substance that allows even a vesicle smaller than m to be selectively placed in contact with a desired position of a cell sample, thereby introducing the specific substance to the desired position. An object of the present invention is also to provide an observation device and method capable of analyzing the interaction that acts when introducing vesicles into a cell sample.
【０００９】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明の装置は、ベシク
ルを細胞に近づけ接触させることで特定物質を細胞内に
導入するための装置であり、先端部にベシクルを保持可
能で、弾性変形し得るレバー部を持つカンチレバーチッ
プと、ベシクルの入った容器を載置するステージと、カ
ンチレバーチップとステージの間に相対的な上下方向の
移動を与える上下移動機構と、カンチレバーチップとス
テージの間に相対的な水平方向の移動を与える水平移動
機構とを有している。また、本発明の方法は、ベシクル
を細胞に近づけ接触させることで特定物質を細胞内に導
入するために、弾性変形し得るレバー部を持つカンチレ
バーチップの先端部にベシクルを保持するステップと、
ステージにベシクルの入った容器を載置するステップ
と、カンチレバーチップとステージの間に相対的な上下
方向の移動を与えるステップ、および、カンチレバーチ
ップとステージの間に相対的な水平方向の移動を与える
ステップとを含んでいる。The device of the present invention is a device for introducing a specific substance into a cell by bringing the vesicle close to and in contact with the cell, which can hold the vesicle at its tip and elastically deforms. A cantilever tip with a lever part to obtain, a stage on which a container containing vesicles is placed, a vertical movement mechanism that provides relative vertical movement between the cantilever tip and the stage, and a relative movement between the cantilever tip and the stage. And a horizontal movement mechanism for providing a horizontal movement. Further, the method of the present invention, in order to introduce a specific substance into the cells by bringing the vesicles close to the cells and bringing them into contact with the cells, a step of holding the vesicles at the tip of the cantilever tip having a lever portion capable of elastic deformation, and
Place a container containing vesicles on the stage, give relative vertical movement between the cantilever tip and the stage, and give relative horizontal movement between the cantilever tip and the stage. It includes steps and.
【００１０】同装置は、好ましくは、カンチレバーチッ
プのレバー部の弾性変形量を検出し、これに基づいてレ
バー部が受けている力を特定する変位センサーを更に有
している。また、同方法は、更に、カンチレバーチップ
のレバー部の弾性変形量を検出するステップと、これに
基づいてレバー部が受けている力を特定するステップを
含んでいる。The apparatus preferably further includes a displacement sensor that detects the amount of elastic deformation of the lever portion of the cantilever tip and identifies the force received by the lever portion based on this. Further, the method further includes a step of detecting an elastic deformation amount of the lever portion of the cantilever tip, and a step of specifying a force received by the lever portion based on the step.
【００１１】また、本発明の装置は、特定物質の細胞へ
の導入および導入前後の細胞を観察するための装置であ
り、上述した特定物質の導入装置に加えて、細胞および
ベシクルを光学的に観察するための光学系とを有してい
る。また、本発明の方法は、更に、特定物質の細胞への
導入および導入前後の細胞およびベシクルを光学的に観
察するステップを含んでいる。Further, the device of the present invention is a device for observing a cell of a specific substance and cells before and after the transfer, and in addition to the above-mentioned device for introducing a specific substance, cells and vesicles are optically And an optical system for observation. In addition, the method of the present invention further includes the step of optically observing the cells and vesicles before and after the introduction of the specific substance into the cells.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】以下、図面を参照しながら本発明
の実施の形態について説明する。導入装置を備えた観察
装置の全体構成を図１に概略的に示す。本実施形態の観
察装置は導入装置と倒立型光学顕微鏡とを含んでおり、
以下では、先ず導入装置について述べ、続いて倒立型光
学顕微鏡について述べることにする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. FIG. 1 schematically shows the overall structure of an observation device equipped with an introduction device. The observation device of the present embodiment includes an introduction device and an inverted optical microscope,
In the following, the introduction device will be described first, and then the inverted optical microscope will be described.
【００１３】［導入装置］図１に示されるように、ベー
ス２に立てられた支柱４にはＺステージ２０が設けられ
ている。Ｚステージ２０は、支柱４に固定された固定部
２０ａと、固定部２０ａに対して移動可能に支持された
移動部２０ｂとを有しており、移動部２０ｂに固定され
たアーム２２には、一般にチューブスキャナーと呼ばれ
る円筒型圧電アクチュエーター２４の上端部が固定され
ている。円筒型圧電アクチュエーター２４の下端にはヘ
ッド３０が固定されている。円筒型圧電アクチュエータ
ー２４は、その自由端が三次元的に変位し得、従ってヘ
ッド３０を三次元的に移動し得る。[Introducing Device] As shown in FIG. 1, a Z stage 20 is provided on the column 4 standing on the base 2. The Z stage 20 has a fixed portion 20a fixed to the support column 4 and a moving portion 20b movably supported with respect to the fixed portion 20a, and the arm 22 fixed to the moving portion 20b includes: An upper end of a cylindrical piezoelectric actuator 24 generally called a tube scanner is fixed. A head 30 is fixed to the lower end of the cylindrical piezoelectric actuator 24. The cylindrical piezoelectric actuator 24 can displace its free end in three dimensions, and thus can move the head 30 in three dimensions.
【００１４】ヘッド３０の下側にはカンチレバーチップ
４０が取り付けられる。カンチレバーチップ４０は、支
持部４２から延びたレバー部４４を有し、その先端は、
分子間力により液中に存在するベシクルを良好に吸着し
得るように表面処理されている。この表面処理は、ベシ
クルの膜の状態に合わせて、例えば、親水化処理、疎水
化処理が施される。また、ベシクルの膜に官能基や蛋白
質分子が導入される場合を考慮し、レバー部４４の先端
部に対応する官能基や蛋白質分子を導入する処理が施さ
れる。更に、ベシクルの膜が電荷を有している場合を考
慮し、レバー部４４を導電化する処理が施される。な
お、導電化処理については、レバー部４４の表面を処理
するのではなく、レバー部４４の材料として導電材料を
用いてもよい。A cantilever tip 40 is attached to the lower side of the head 30. The cantilever tip 40 has a lever portion 44 extending from the support portion 42, and its tip has
The surface is treated so that the vesicles existing in the liquid can be favorably adsorbed by the intermolecular force. This surface treatment is, for example, hydrophilic treatment or hydrophobic treatment according to the state of the vesicle film. Further, in consideration of the case where a functional group or protein molecule is introduced into the vesicle membrane, a treatment for introducing a functional group or protein molecule corresponding to the tip of the lever portion 44 is performed. Further, in consideration of the case where the vesicle film has an electric charge, a treatment for making the lever portion 44 conductive is performed. Regarding the conductive treatment, instead of treating the surface of the lever portion 44, a conductive material may be used as the material of the lever portion 44.
【００１５】ヘッド３０は、取り付けられたカンチレバ
ーチップ４０のレバー部４４の変位を検出する変位検出
系を内部に備えている。この変位検出系は、レーザーダ
イオード３２、フォーカスレンズ３４、全反射ミラー
（もしくはダイクロイックミラー）３６、複数の受光領
域を持つフォトダイオード３８とで構成されている。カ
ンチレバーチップ４０のレバー部４４の変位は、フォト
ダイオード３８に入射するレバー部４４からの反射光ビ
ームの位置に基づいて求められる。The head 30 internally has a displacement detection system for detecting the displacement of the lever portion 44 of the attached cantilever tip 40. This displacement detection system is composed of a laser diode 32, a focus lens 34, a total reflection mirror (or dichroic mirror) 36, and a photodiode 38 having a plurality of light receiving regions. The displacement of the lever portion 44 of the cantilever chip 40 is obtained based on the position of the reflected light beam from the lever portion 44 which is incident on the photodiode 38.
【００１６】試料台５２は支柱４に支持されており、こ
の上には、ＤＮＡ等の物質を含んだベシクルを入れたシ
ャーレ等の透明な容器や細胞試料を入れたシャーレ等の
透明な容器が例えば代わる代わる置かれる。あるいは、
一つの透明な容器の内部を区切り、ベシクルと細胞試料
を異なる部分に別々に入れることが可能な容器を置いて
もよい。さらには、ベシクルと細胞試料を異なる箇所に
載せたスライドガラスが置かれてもよい。本明細書では
透明な容器に代表的にシャーレを想定して説明する。The sample table 52 is supported by the support column 4, on which a transparent container such as a petri dish containing vesicles containing a substance such as DNA or a transparent container such as a petri dish containing cell samples is placed. For example, placed one after another. Alternatively,
You may put the container which can separate the inside of one transparent container and can put a vesicle and a cell sample into a different part separately. Furthermore, a slide glass on which the vesicle and the cell sample are placed at different positions may be placed. In the present specification, the description will be made assuming a petri dish as a typical transparent container.
【００１７】試料台５２は好適には水平方向に移動可能
に支持されており、そこに載せられるシャーレとカンチ
レバーチップとの間に水平方向の相対的な移動を与え、
レバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料との間の
位置合わせに利用される。The sample table 52 is preferably movably supported in the horizontal direction, and provides relative horizontal movement between the petri dish and the cantilever tip mounted thereon.
It is used for alignment between the tip of the lever and the vesicle or cell sample.
【００１８】なお、レバー部の先端部とベシクルあるい
は細胞試料との間の位置合わせは、試料台５２を水平方
向に移動するだけでなく、円筒型圧電アクチュエータ４
２を用いてもよい。このようにレバー部の先端部とベシ
クルあるいは細胞試料との間に相対的な水平方向の移動
を与える機構を総称して水平移動機構とする。The alignment between the tip of the lever portion and the vesicle or cell sample does not only move the sample table 52 in the horizontal direction, but also the cylindrical piezoelectric actuator 4
2 may be used. The mechanism for providing relative horizontal movement between the tip of the lever portion and the vesicle or cell sample in this manner is generically referred to as a horizontal movement mechanism.
【００１９】さらに、試料台５２が垂直方向に移動可能
に支持され、円筒型圧電アクチュエータ４２と共に上下
方向移動機構を構成し、シャーレとカンチレバーチップ
との間に垂直方向の相対的な移動を与えることも可能で
ある。この構成は、水平移動機構により位置合わせの終
了したレバー部の先端部とベシクルあるいは細胞試料と
の距離制御に利用される。Further, the sample stage 52 is supported so as to be movable in the vertical direction, constitutes a vertical movement mechanism together with the cylindrical piezoelectric actuator 42, and provides relative movement in the vertical direction between the petri dish and the cantilever tip. Is also possible. This configuration is used to control the distance between the tip of the lever portion whose position has been adjusted by the horizontal movement mechanism and the vesicle or cell sample.
【００２０】［倒立型光学顕微鏡］続いて、倒立型光学
顕微鏡を構成する要素について述べる。透過照明のため
の照明系１０は、位相差観察法による観察を可能にする
ものであり、ベース２に立てられた支柱４の上端に設け
られたアーム６に支持されている。照明系１０は、光源
１２、コレクタレンズ１４、スライダ１６、コンデンサ
レンズ１８を有している。スライダ１６は、位相差観察
用のリング開口１６ａと光を透過する透光部１６ｂを持
ち、光路を横切って移動可能であり、必要に応じてリン
グ開口１６ａを光路中に配置することができる。[Inverted Optical Microscope] Next, the elements constituting the inverted optical microscope will be described. An illumination system 10 for transmitted illumination enables observation by a phase difference observation method, and is supported by an arm 6 provided on an upper end of a column 4 standing on the base 2. The illumination system 10 has a light source 12, a collector lens 14, a slider 16, and a condenser lens 18. The slider 16 has a ring opening 16a for observing a phase difference and a light transmitting portion 16b that transmits light, is movable across the optical path, and the ring opening 16a can be arranged in the optical path as necessary.
【００２１】試料台５２の下には、複数の対物レンズが
取り付け可能で、そのうちの一つを選択的に試料の下方
に配置させるレボルバー５６が配置されている。レボル
バー５６には、位相差観察法による観察のための比較的
低倍率の対物レンズ５８と、蛍光観察のための高倍率高
ＮＡの対物レンズ６０が取り付けられている。Below the sample table 52, a plurality of objective lenses can be attached, and a revolver 56 for selectively arranging one of them is disposed below the sample. The revolver 56 is provided with an objective lens 58 having a relatively low magnification for observation by a phase difference observation method and an objective lens 60 having a high magnification and a high NA for fluorescence observation.
【００２２】試料下に配置された対物レンズの下方に
は、ハーフミラー６２が配置されており、さらにその下
方に別のハーフミラー６４（あるいはダイクロイックミ
ラー）が配置されている。ハーフミラー６２は、蛍光用
光源７０からの光を対物レンズに向けて偏向するととも
に、対物レンズからの光を透過する。ハーフミラー６４
は、対物レンズからの光を部分的に顕微鏡像観察用のＣ
ＣＤカメラ６６へ向けて偏向するとともに、残りの光を
透過する。A half mirror 62 is arranged below the objective lens arranged under the sample, and another half mirror 64 (or dichroic mirror) is arranged further below the half mirror 62. The half mirror 62 deflects the light from the fluorescent light source 70 toward the objective lens and transmits the light from the objective lens. Half mirror 64
Is a C for partially observing light from the objective lens for observing a microscope image.
It deflects toward the CD camera 66 and transmits the remaining light.
【００２３】蛍光用励起光源７０は、光源７２、コレク
タレンズ７４、シャッター７６、コンデンサレンズ７８
を有している。ハーフミラー６４の下方には、蛍光を検
出するため、レンズ８６とフォトマルチプライヤー８８
が配置されている。蛍光観察の際には、励起光源７０と
ハーフミラー６２の間の光路上に励起光フィルター８２
が挿入されるとともに、ハーフミラー６２とハーフミラ
ー６４の間の光路上に吸収フィルター８４が挿入され
る。The fluorescence excitation light source 70 includes a light source 72, a collector lens 74, a shutter 76, and a condenser lens 78.
have. Below the half mirror 64, a lens 86 and a photomultiplier 88 are provided to detect fluorescence.
Are arranged. During fluorescence observation, an excitation light filter 82 is placed on the optical path between the excitation light source 70 and the half mirror 62.
And the absorption filter 84 is inserted in the optical path between the half mirrors 62 and 64.
【００２４】［細胞試料へのベシクルに内包される特定
物質の導入］Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を十
分に上げておき、ＤＮＡ等の特定物質を内包するベシク
ル１１２を含む溶液１１４を入れた透明な容器、例えば
シャーレ１１０を試料台５２の上に置く。Ｚステージ２
０を操作してヘッド３０を下げ、図２に示されるよう
に、カンチレバーチップ４０を溶液１１４中に沈め、レ
バー部４４の先端部が対物レンズ５８の焦点深度内に入
るまでシャーレ１１０の底に近づける。[Introduction of Specific Substance Encapsulated in Vesicle into Cell Sample] The Z stage 20 is operated to raise the head 30 sufficiently, and a solution 114 containing a vesicle 112 encapsulating a specific substance such as DNA is added. A transparent container such as a petri dish 110 is placed on the sample table 52. Z stage 2
2, the head 30 is lowered to lower the head 30, and the cantilever tip 40 is submerged in the solution 114 as shown in FIG. 2, and the tip of the lever portion 44 is placed on the bottom of the petri dish 110 until it enters the depth of focus of the objective lens 58. Get closer.
【００２５】透過位相差観察や微分干渉観察によりベシ
クル１１２を観察して、細胞試料に特定物質を導入する
のに適したベシクル１１２を選び、カンチレバーチップ
４０のレバー部４４の先端部を、選んだベシクル１１２
の上に合わせる。By observing the vesicles 112 by transmission phase difference observation or differential interference observation, a vesicle 112 suitable for introducing a specific substance into the cell sample is selected, and the tip of the lever portion 44 of the cantilever tip 40 is selected. Vesicle 112
Align on top.
【００２６】このレバー部４４の先端部と選んだベシク
ル１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。Positioning of the tip end portion of the lever portion 44 and the selected vesicle 112 is carried out by relatively moving both of them using a horizontal movement mechanism. Note that this alignment is performed by the sample table 52 or the cylindrical piezoelectric actuator 42.
It is also possible to move at least one of the above.
【００２７】圧電アクチュエーター２４を伸ばしてカン
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分を
ベシクル１１２に押し付ける。前述したように、カンチ
レバーチップ４０のレバー部４４の先端部分はベシクル
を良好に吸着し得るように表面処理が施されているた
め、分子間力によりベシクル１１２を吸着する。吸着
後、Ｚステージ２０でヘッド３０を上昇させる。The piezoelectric actuator 24 is extended to lower the cantilever tip 40, and the tip portion of the lever portion 44 is pressed against the vesicle 112. As described above, since the tip portion of the lever portion 44 of the cantilever tip 40 is surface-treated so that the vesicles can be favorably adsorbed, the vesicles 112 are adsorbed by the intermolecular force. After adsorption, the head 30 is raised on the Z stage 20.
【００２８】ベシクルの入ったシャーレ１１０を試料台
５２から取り除き、代わりに特定物質を導入したい細胞
試料１２２の溶液１２４の入ったシャーレ１２０を試料
台５２に置く。Ｚステージ２０を操作してヘッド３０を
下げ、図３に示されるように、カンチレバーチップ４０
を溶液１２４中に沈める。The petri dish 110 containing the vesicles is removed from the sample table 52, and the petri dish 120 containing the solution 124 of the cell sample 122 into which the specific substance is to be introduced is placed on the sample table 52 instead. The Z stage 20 is operated to lower the head 30, and as shown in FIG.
Are submerged in solution 124.
【００２９】透過位相差観察や微分干渉観察により、ベ
シクル１１２に内包された特定物質（以下、単に特定物
質と呼ぶ）を導入する細胞試料１２２を選び、カンチレ
バーチップ４０のレバー部４４の先端部分を、選んだ細
胞試料１２２の上に合わせる。A cell sample 122 into which a specific substance (hereinafter, simply referred to as a specific substance) contained in the vesicle 112 is introduced by transmission phase difference observation or differential interference observation, and the tip portion of the lever portion 44 of the cantilever tip 40 is selected. , On the selected cell sample 122.
【００３０】このレバー部４４の先端部と選んだ細胞試
料１１２との位置合わせは、水平方向移動機構を用いて
両者を相対的に移動して行なう。なお、この位置合わせ
は、試料台５２もしくは円筒型圧電アクチュエータ４２
の内の少なくとも一方を移動するだけでも可能である。The position of the tip of the lever portion 44 and the selected cell sample 112 is adjusted by moving the both relatively using a horizontal movement mechanism. Note that this alignment is performed by the sample table 52 or the cylindrical piezoelectric actuator 42.
It is also possible to move at least one of the above.
【００３１】圧電アクチュエーター２４を伸ばしてカン
チレバーチップ４０を下げ、レバー部４４の先端部分に
付着しているベシクル１１２を細胞試料１２２に押し付
ける。細胞試料１２２に押し付けられたベシクル１１２
は、やがて細胞試料１２２に取り込まれ、特定物質が細
胞試料１２２に導入される。The piezoelectric actuator 24 is extended to lower the cantilever tip 40, and the vesicle 112 attached to the tip of the lever portion 44 is pressed against the cell sample 122. Vesicle 112 pressed against cell sample 122
Is eventually taken up by the cell sample 122, and the specific substance is introduced into the cell sample 122.
【００３２】この時、対向電極等の共存により、細胞膜
内外を脱分極状態とすることができる。また、ベシクル
中の溶媒にＣａ2+を含ませるなどの操作を行なうことも
可能である。このような構成を取ることにより、擬似的
に神経細胞の情報伝達状態等を作り出せるので、細胞試
料に様々な状態を誘起させる特定物質の導入が可能とな
る。At this time, the inside and outside of the cell membrane can be brought into a depolarized state by coexistence of a counter electrode and the like. It is also possible to carry out an operation such as adding Ca 2+ to the solvent in the vesicle. By adopting such a configuration, it is possible to artificially create a signal transmission state of nerve cells and the like, so that it becomes possible to introduce a specific substance that induces various states in a cell sample.
【００３３】本装置では、倒立型光学顕微鏡を利用し
て、レバー部４４と細胞試料１２２の位置合わせを行な
うため、細胞試料１２２の所望の位置に高い位置精度を
もって特定物質を導入できる。In this apparatus, since the lever portion 44 and the cell sample 122 are aligned by using the inverted optical microscope, the specific substance can be introduced into a desired position of the cell sample 122 with high positional accuracy.
【００３４】ベシクル１１２を吸着する際および特定物
質を細胞試料１２２に導入する際、好ましくは、ヘッド
３０内の変位検出系はレバー部４４の先端部の変位を検
出し、検出される変位情報に基づいてレバー部４４に働
いている力を求める。これにより、ベシクル１１２を吸
着する際にレバー部４４がベシクル１１２を押す力が分
かり、また特定物質を細胞試料１２２に導入する際にベ
シクル１１２が細胞試料１２２を押す力が分かる。When adsorbing the vesicles 112 and introducing the specific substance into the cell sample 122, preferably, the displacement detection system in the head 30 detects the displacement of the tip of the lever portion 44, and the detected displacement information is obtained. Based on this, the force acting on the lever portion 44 is calculated. This makes it possible to know the force with which the lever portion 44 pushes the vesicle 112 when adsorbing the vesicle 112, and the force with which the vesicle 112 pushes the cell sample 122 when introducing a specific substance into the cell sample 122.
【００３５】特定物質を細胞試料１２２に導入する際の
アプローチは、好ましくは、自動近接プログラムによっ
て行なわれ、任意の力でベシクル１１２を細胞試料１２
２に押し付けることができる。例えば、ベシクル１１２
を細胞試料１２２に押し付ける力は、０．１ｎＮ程度に
設定することが可能であり、設定値に達した時点で両者
の接近は停止する。この時、レバー部４４は押し付ける
力を受けて変位した状態で停止する。そのままレバー部
４４の変位を監視し続けることによって、特定物質が細
胞試料１２２に導入されたかどうかが判定できる。The approach for introducing the specific substance into the cell sample 122 is preferably carried out by an automatic proximity program, and the vesicle 112 is applied to the cell sample 12 with an arbitrary force.
It can be pressed against 2. For example, vesicle 112
The force pressing the cell sample 122 against the cell sample 122 can be set to about 0.1 nN, and when the set value is reached, the approach of the two stops. At this time, the lever portion 44 receives the pressing force and stops in a state of being displaced. By continuing to monitor the displacement of the lever portion 44 as it is, it can be determined whether or not the specific substance is introduced into the cell sample 122.
【００３６】このように、本装置では、カンチレバーチ
ップ４０のレバー部４４に働く力が分かるので、過剰な
力により、ベシクル１１２や細胞試料１２２を破壊した
り傷付けたりすることを未然に防ぐことができる。As described above, in this device, the force acting on the lever portion 44 of the cantilever tip 40 can be known, so that it is possible to prevent the vesicle 112 and the cell sample 122 from being destroyed or scratched by an excessive force. it can.
【００３７】また、これまでの装置ではベシクルを細胞
試料に押し付ける力を知る術が無かったが、本装置は導
入時にベシクルが細胞試料を押す力を知ることができ、
導入時にベシクルと細胞試料に働く力の情報は、ベシク
ル１１２が細胞試料１２２に取り込まれる反応の解明に
とって大いに役立つであろう。Further, in the conventional devices, there was no way to know the force of pushing the vesicle against the cell sample, but this device can know the force of the vesicle pushing the cell sample at the time of introduction,
Information on the forces acting on the vesicle and the cell sample at the time of introduction will be very useful for elucidating the reaction in which the vesicle 112 is taken up by the cell sample 122.
【００３８】［浮遊する細胞試料への特定物質の導入］
上では図３に関連付けてシャーレの底に固定した細胞試
料に対する特定物質の導入について述べた。シャーレ内
の溶液中を浮遊する細胞試料に対する特定物質の導入で
は、図４に示されるように、マニピュレータに支持され
た三次元的に位置決め可能なキャピラリ１３０を用いて
細胞試料１２２を保持し、キャピラリ１３０に保持され
た細胞試料１２２に対して、カンチレバーチップ４０の
レバー部４４に吸着されたベシクル１１２を押し付け
る。この一連の動作は、細胞試料１２２の位置決めが三
次元マニピュレータによって行なわれる点の他は、全く
同様である。[Introduction of Specific Substance into Floating Cell Sample]
In the above, the introduction of the specific substance into the cell sample fixed to the bottom of the petri dish was described with reference to FIG. In the introduction of the specific substance into the cell sample floating in the solution in the petri dish, the cell sample 122 is held by using the three-dimensionally positionable capillary 130 supported by the manipulator as shown in FIG. The vesicle 112 adsorbed on the lever portion 44 of the cantilever chip 40 is pressed against the cell sample 122 held by the cell 130. This series of operations is exactly the same except that the positioning of the cell sample 122 is performed by the three-dimensional manipulator.
【００３９】［原子間力顕微鏡への拡張］カンチレバー
チップ４０は、レバー部４４の先端に探針部４６を備え
ていてもよい。探針部４６は、平坦部４６ｂから突出し
た先鋭な突起部４６ａを有しており、平坦部４６ｂを基
準にした突起部４６ａの高さは吸着するベシクル１１２
の直径よりも小さい。[Expansion to Atomic Force Microscope] The cantilever tip 40 may include a probe portion 46 at the tip of the lever portion 44. The probe portion 46 has a sharp protrusion 46a protruding from the flat portion 46b, and the height of the protrusion 46a with respect to the flat portion 46b is used as the vesicle 112 for suction.
Smaller than the diameter of.
【００４０】ベシクル１１２は、突起部４６ａと平坦部
４６ｂの境部分に吸着される。突起部４６ａの高さは、
ベシクル１１２の直径よりも小さい寸法が選ばれている
ので、ベシクル１１２を細胞試料に近づける際に、ベシ
クル１１２が細胞試料に接触する前に、先鋭な突起部４
６ａが細胞試料に触れることがない。The vesicle 112 is adsorbed on the boundary between the protrusion 46a and the flat portion 46b. The height of the protrusion 46a is
Since the size smaller than the diameter of the vesicle 112 is selected, when the vesicle 112 is brought close to the cell sample, the sharp protrusion 4 is formed before the vesicle 112 comes into contact with the cell sample.
6a does not touch the cell sample.
【００４１】先鋭な突起部４６ａは、特定物質が細胞試
料に導入される前後の観察に利用される。本装置は、原
子間力顕微鏡の構成に必要な要素、すなわち、円筒型圧
電アクチュエーター２４とカンチレバーチップ４０とそ
のレバー部の変位を検出する変位検出系を含んでいる。
従って、図５に示される探針部４６を備えたカンチレバ
ーチップ４０を用いることにより、突起部４６ａをプロ
ーブとする原子間力顕微鏡観察が行なえ、特定物質の導
入前後の細胞試料を高分解能で観察することができる。The sharp protrusion 46a is used for observation before and after the specific substance is introduced into the cell sample. The present apparatus includes elements necessary for constructing an atomic force microscope, that is, a cylindrical piezoelectric actuator 24, a cantilever tip 40, and a displacement detection system for detecting displacement of the lever portion.
Therefore, by using the cantilever tip 40 having the probe portion 46 shown in FIG. 5, atomic force microscope observation using the protrusion 46a as a probe can be performed, and the cell sample before and after the introduction of the specific substance can be observed with high resolution. can do.
【００４２】［照明系］本装置は、透過明視野照明、透
過位相差照明、微分干渉照明、落射蛍光照明等の特殊観
察法の利用が可能である。[Illumination system] This apparatus can be used for special observation methods such as transmission bright-field illumination, transmission phase difference illumination, differential interference illumination, and epifluorescence illumination.
【００４３】［透過明視野照明］透過明視野照明は、カ
ンチレバーの位置を明瞭に示すので、主に、カンチレバ
ー裏面に照射されるレバー部４４の変位検出用のレーザ
ー光スポットのカンチレバー上における位置調整に用い
られる。[Transparent bright-field illumination] Since the transparent bright-field illumination clearly indicates the position of the cantilever, the position adjustment of the laser beam spot for detecting the displacement of the lever portion 44 irradiated on the back surface of the cantilever is mainly performed on the cantilever. Used for.
【００４４】［透過位相差照明］透過位相差照明は、試
料の屈折率の違いを元にコントラストを付ける観察法で
有り、この照明法は数μｍ以下の厚さの光学的に透明な
試料に対して有効である。また、培養細胞の周辺部分の
境界を見つけるなどの薄い試料（細胞）の形態を低分解
能で観察する方法として有効である。[Transmission Phase Difference Illumination] The transmission phase difference illumination is an observation method for providing contrast based on the difference in the refractive index of the sample. This illumination method is applied to an optically transparent sample having a thickness of several μm or less. Effective against It is also effective as a method for observing the morphology of a thin sample (cell) at low resolution, such as finding the boundary of the peripheral portion of a cultured cell.
【００４５】なお、透過位相差照明は、リング照明を用
いているため、照明のＮＡを対物レンズのＮＡに比べて
充分利用していないめ、高解像の観察に適した観察法で
はない。Since the transmission phase difference illumination uses the ring illumination, the NA of the illumination is not sufficiently used as compared with the NA of the objective lens, which is not an observation method suitable for high resolution observation.
【００４６】また、高解像の観察を行うのであれば、透
過微分干渉照明を用いた観察が適している。この照明は
屈折率分布の位置的な変化を元に光学的に透明な試料に
コントラストを付ける観察法である。透過微分干渉照明
の一例が、特開平９−１５５０４号に記載されている。
同文献に含まれる開示内容は、ここに引用することによ
り、すべて本明細書に組み込まれるものとする。If high resolution observation is to be performed, observation using transmission differential interference illumination is suitable. This illumination is an observation method that contrasts an optically transparent sample based on the positional change of the refractive index distribution. An example of transmission differential interference illumination is described in JP-A-9-15504.
The disclosure content contained in the same document is incorporated herein by reference in its entirety.
【００４７】この照明方法は、光源からの光を偏光子
（ポラライザー）で直線偏光にして第１のノマルスキー
プリズムに入射させ、ここで常光と異常光とに分離して
コンデンサーレンズを経て、試料を透過した常光及び異
常光を対物レンズを経て第２のノマルスキープリズムで
合波し、その合波した常光及び異常光を、検光子（アナ
ライザー）を経て干渉させて結像面に微分干渉像を形成
している。In this illuminating method, light from a light source is linearly polarized by a polarizer (polarizer) and made incident on a first Nomarski prism, where it is separated into ordinary light and extraordinary light, passed through a condenser lens, and the sample The transmitted ordinary and extraordinary rays are combined by the second Nomarski prism through the objective lens, and the combined ordinary and extraordinary rays are made to interfere through the analyzer to form a differential interference image on the image plane. is doing.
【００４８】この構成を図１の装置に追加することによ
り透過微分干渉照明を実現できる。この微分干渉照明は
位相差照明と比べて、照明のＮＡに原理的には限定が無
いため、対物レンズのＮＡすべてを利用でき、高倍率の
観察が可能である。従って、試料の細かい構造まで形態
を確認したい場合に利用できる。Transmission differential interference illumination can be realized by adding this configuration to the apparatus of FIG. This differential interference illumination is not limited in principle to the illumination NA as compared with the phase-difference illumination, so that all NAs of the objective lens can be used and high-magnification observation is possible. Therefore, it can be used when it is desired to confirm the morphology of even a fine structure of a sample.
【００４９】上述した透過位相差照明及び透過微分干渉
照明を総称して透過コントラスト照明という。
［落射蛍光照明］落射蛍光照明は、ベシクルの中に目的
物質が十分な量入っているかを確認するために用いられ
る。また、ベシクルを試料（細胞）に接触させた後の試
料の反応・状態変化を観察するのに適している。更に、
ベシクルと接触させたい試料の特定部位を蛍光染色し、
あるいは試料（細胞）のＤＮＡに例えばＧＦＰ（Green
Flourescent Protein ）を発現させるＤＮＡを導入し、
蛍光を発している部分あるいはＧＦＰを生成し蛍光を発
している細胞を特定するために利用できる。The above-mentioned transmission phase difference illumination and transmission differential interference illumination are collectively referred to as transmission contrast illumination. [Epi-illumination] Epi-illumination is used to confirm that the vesicle contains a sufficient amount of the target substance. Further, it is suitable for observing the reaction / state change of the sample after the vesicle is brought into contact with the sample (cell). Furthermore,
Fluorescently stain a specific part of the sample you want to contact with the vesicle,
Alternatively, for example, GFP (Green
Introducing DNA that expresses Flourescent Protein),
It can be used to identify a fluorescent portion or a fluorescent cell that produces GFP.
【００５０】なお、蛍光顕微鏡としては図１に示した構
成以外に、走査型レーザー顕微鏡を用いてベシクルの観
察を行うことも有効である。また、透過位相差照明、透
過微分干渉照明、落射蛍光照明は、試料の観察だけでは
なく、ベシクルを探針先端に取り付けるための位置調整
及び探針先端にベシクルが取り付けられた状態での探針
と試料との位置調整に用いられる。As the fluorescence microscope, it is effective to use a scanning laser microscope to observe the vesicles in addition to the structure shown in FIG. In addition, transmission phase difference illumination, transmission differential interference illumination, and epi-fluorescence illumination are not only for observing the sample, but also for position adjustment to attach the vesicle to the tip of the probe and the probe with the vesicle attached to the tip of the probe. It is used to adjust the position of the sample and the sample.
【００５１】上述した通り、蛍光照明は試料とベシクル
との反応・状態変化を観察測定するのに適しており、透
過コントラスト照明は試料の形態・構造を観察測定する
のに適している。従って、試料の形態とベシクルによる
試料の反応等を関連づけて測定したい場合には、蛍光照
明と透過コントラスト照明とを組み合わせた照明方法が
好ましい。本発明は、上述した実施の形態に限定される
ものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれる
すべての実施を含む。As described above, the fluorescent illumination is suitable for observing and measuring the reaction / state change between the sample and the vesicle, and the transmission contrast illumination is suitable for observing and measuring the morphology / structure of the sample. Therefore, when it is desired to measure the morphology of the sample and the reaction of the sample by the vesicles in association with each other, an illumination method combining fluorescence illumination and transmission contrast illumination is preferable. The present invention is not limited to the above-described embodiments, but includes all implementations performed within the scope of the invention.
【００５２】[0052]
【発明の効果】本発明によれば、特定物質を含むベシク
ル、特に１０μｍよりも小さいベシクルをも、細胞試料
の所望位置に押し付け、特定物質を導入し得るの導入装
置と導入方法が提供される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there are provided an introducing device and an introducing method capable of introducing a specific substance by pressing even a vesicle containing the specific substance, particularly a vesicle smaller than 10 μm, to a desired position of a cell sample. .
【図１】本発明による導入装置を備えた観察装置の全体
構成を概略的に示している。FIG. 1 schematically shows the overall configuration of an observation device equipped with an introduction device according to the present invention.
【図２】カンチレバーチップのレバー部にベシクルを吸
着する様子を示している。FIG. 2 shows a state in which a vesicle is adsorbed on a lever portion of a cantilever tip.
【図３】カンチレバーチップのレバー部に吸着されたベ
シクルを細胞試料に導入する様子を示している。FIG. 3 shows how vesicles adsorbed on the lever portion of a cantilever chip are introduced into a cell sample.
【図４】浮遊する細胞試料に対するベシクルの導入の様
子を示している。FIG. 4 shows how vesicles are introduced into a floating cell sample.
【図５】原子間力顕微鏡への拡張を可能にするカンチレ
バーチップのレバー部の構造を示している。FIG. 5 shows a structure of a lever portion of a cantilever tip that enables extension to an atomic force microscope.
２０ Ｚステージ ２４ 圧電アクチュエーター ３０ ヘッド ４０ カンチレバーチップ ４２ 支持部 ４４ レバー部 ５２ 試料台 20 Z stage 24 Piezoelectric actuator 30 heads 40 cantilever tip 42 Support 44 Lever part 52 sample table
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 - 3/10 C12N 15/00 - 15/90 G01B 21/30 G02B 21/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄContinuation of the front page (58) Fields surveyed (Int.Cl. 7 , DB name) C12M 1/00-3/10 C12N 15/00-15/90 G01B 21/30 G02B 21/00 BIOSIS / MEDLINE / WPID S (STN) PubMed
Claims (6)
特定物質を細胞内に導入するための装置であって、先端
部にベシクルを保持可能で、弾性変形し得るレバー部を
持つカンチレバーチップと、ベシクルの入った容器を載
置するステージと、カンチレバーチップとステージの間
に相対的な上下方向の移動を与える上下移動機構と、カ
ンチレバーチップとステージの間に相対的な水平方向の
移動を与える水平移動機構とを有している特定物質導入
装置。1. A device for introducing a specific substance into a cell by bringing the vesicle close to and in contact with the cell, the cantilever tip having a lever portion capable of holding the vesicle at its tip and elastically deformable, A stage on which a container containing vesicles is placed, a vertical movement mechanism that provides relative vertical movement between the cantilever tip and the stage, and a horizontal movement mechanism that provides relative horizontal movement between the cantilever tip and the stage. A specific substance introducing device having a moving mechanism.
形量を検出し、これに基づいてレバー部が受けている力
を特定する変位センサーを更に有している、請求項１に
記載の特定物質導入装置。2. The specific substance introduction according to claim 1, further comprising a displacement sensor that detects the amount of elastic deformation of the lever portion of the cantilever tip and specifies the force received by the lever portion based on this. apparatus.
の細胞を観察するための装置であり、請求項１に記載の
特定物質導入装置と、細胞およびベシクルを光学的に観
察するための光学系とを有している、細胞およびベシク
ルの観察装置。3. An apparatus for observing a specific substance into cells and cells before and after the introduction, and the specific substance introducing apparatus according to claim 1 and an optical for optically observing cells and vesicles. An observation device for cells and vesicles having a system.
特定物質を細胞内に導入するために、弾性変形し得るレ
バー部を持つカンチレバーチップの先端部にベシクルを
保持するステップと、ステージにベシクルの入った容器
を載置するステップと、カンチレバーチップとステージ
の間に相対的な上下方向の移動を与えるステップ、およ
び、カンチレバーチップとステージの間に相対的な水平
方向の移動を与えるステップと、を含む特定物質導入方
法。4. A step of holding a vesicle at the tip of a cantilever tip having a lever portion that can be elastically deformed in order to introduce a specific substance into the cell by bringing the vesicle close to and in contact with the cell, and the vesicle on the stage. The step of placing the container in which it is placed, the step of giving a relative vertical movement between the cantilever tip and the stage, and the step of giving a relative horizontal movement between the cantilever tip and the stage. Method of introducing specific substances including.
って、更に、カンチレバーチップのレバー部の弾性変形
量を検出するステップと、これに基づいてレバー部が受
けている力を特定するステップを含む特定物質導入方
法。5. The method for introducing a specific substance according to claim 4, further comprising the step of detecting the amount of elastic deformation of the lever portion of the cantilever tip, and based on this, the force received by the lever portion is specified. A method for introducing a specific substance including steps.
って、更に、特定物質の細胞への導入および導入前後の
細胞およびベシクルを光学的に観察するステップを含む
特定物質導入方法。6. The method for introducing a specific substance according to claim 4, further comprising the step of optically introducing the specific substance into cells and observing the cells and vesicles before and after the introduction.
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