JP3458251B2 - 固相に繊維状物質を用いた化学発光測定法 - Google Patents
固相に繊維状物質を用いた化学発光測定法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的な検出法の一
般的なものの一つである化学発光測定法に関する。
般的なものの一つである化学発光測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫学的測定法は、ホモジニアス法とヘ
テロジニアス法とに大別される。そのうち、腫瘍マーカ
ー，ホルモン等の微量成分を測定するためには、高感度
に測定が可能であるヘテロジニアス法が採用される。ヘ
テロジニアス法では、一般的には抗原を特異的に認識し
固相上に予め固定化された生理活性物質（例えば、抗
体，酵素，阻害物質など）と、抗原と、抗原を特異的に
認識し検出可能に標識された抗体を容器中で混合し一定
条件下で保持することで、生理活性物質と抗原と標識さ
れた抗体との複合物を形成させる。この複合物が固相に
結合していることを利用して洗浄作業を行うことで、反
応に関与しなかった抗原を特異的に認識し検出可能な標
識を行った抗体を分離する。この後に検出可能な標識の
量を測定することで、測定の目的の抗原の量を検出す
る。
テロジニアス法とに大別される。そのうち、腫瘍マーカ
ー，ホルモン等の微量成分を測定するためには、高感度
に測定が可能であるヘテロジニアス法が採用される。ヘ
テロジニアス法では、一般的には抗原を特異的に認識し
固相上に予め固定化された生理活性物質（例えば、抗
体，酵素，阻害物質など）と、抗原と、抗原を特異的に
認識し検出可能に標識された抗体を容器中で混合し一定
条件下で保持することで、生理活性物質と抗原と標識さ
れた抗体との複合物を形成させる。この複合物が固相に
結合していることを利用して洗浄作業を行うことで、反
応に関与しなかった抗原を特異的に認識し検出可能な標
識を行った抗体を分離する。この後に検出可能な標識の
量を測定することで、測定の目的の抗原の量を検出す
る。
【０００３】検出可能な標識物質として、酵素，蛍光物
質，発光物質，放射性同位体等が挙げられる。なかでも
取扱が安全であるという長所から、酵素，蛍光物質また
は発光物質が用いられることが多い。しかし、酵素を用
いる方法では酵素と基質とが反応する時間が相当量必要
であり、測定時間が短縮できないという短所がある。蛍
光物質を用いる方法では、感度に限界があり高感度測定
はできないという短所がある。これに対して発光物質を
用いる方法は、短時間で測定ができ、また高感度での測
定が可能であるので、よく使用される。
質，発光物質，放射性同位体等が挙げられる。なかでも
取扱が安全であるという長所から、酵素，蛍光物質また
は発光物質が用いられることが多い。しかし、酵素を用
いる方法では酵素と基質とが反応する時間が相当量必要
であり、測定時間が短縮できないという短所がある。蛍
光物質を用いる方法では、感度に限界があり高感度測定
はできないという短所がある。これに対して発光物質を
用いる方法は、短時間で測定ができ、また高感度での測
定が可能であるので、よく使用される。
【０００４】発光物質の中でも、一般的に取扱の容易さ
から化学発光物質が用いられる。化学発光物質としては
アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノー
ル、シュウ酸エステル等が一般的に知られている。これ
らの発光物質は一般的に過酸化水素を含むアルカリ性の
溶液中で発光が起きる。
から化学発光物質が用いられる。化学発光物質としては
アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノー
ル、シュウ酸エステル等が一般的に知られている。これ
らの発光物質は一般的に過酸化水素を含むアルカリ性の
溶液中で発光が起きる。
【０００５】化学発光物質としてアクリジニウムエステ
ルを用いることは有効な方法である。アクリジニウムエ
ステルの使用に関してはクリニカル・ケミストリー（Ｃ
ＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）２９／８，１４
７４−１４７９（１９８３）に記載されており、放射性
同位体の標識物質であるＩ１２５と同等あるいはそれ以
上の感度の高さである。
ルを用いることは有効な方法である。アクリジニウムエ
ステルの使用に関してはクリニカル・ケミストリー（Ｃ
ＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）２９／８，１４
７４−１４７９（１９８３）に記載されており、放射性
同位体の標識物質であるＩ１２５と同等あるいはそれ以
上の感度の高さである。
【０００６】アクリジニウムエステルを発光させるため
には、一般的に次の手順を行う必要がある。まず、アク
リジニウムエステルを含む溶液に酸性の溶液を加えて酸
性状態とし、そしてこの状態で一定時間保持した後に、
過酸化水素を含むアルカリ性の溶液を加えることで発光
が生じる。酸性条件にすることでアクリジニウムエステ
ルは非発光型から発光型に変化し、中性に近いほど発光
型への変化の量が少ないことが知られている。このため
に、高感度の測定を行うためには充分な酸性条件下にす
る必要がある。一方、抗原と抗体の結合は酸性にするこ
とで解離しやすくなることは一般的に知られている。
には、一般的に次の手順を行う必要がある。まず、アク
リジニウムエステルを含む溶液に酸性の溶液を加えて酸
性状態とし、そしてこの状態で一定時間保持した後に、
過酸化水素を含むアルカリ性の溶液を加えることで発光
が生じる。酸性条件にすることでアクリジニウムエステ
ルは非発光型から発光型に変化し、中性に近いほど発光
型への変化の量が少ないことが知られている。このため
に、高感度の測定を行うためには充分な酸性条件下にす
る必要がある。一方、抗原と抗体の結合は酸性にするこ
とで解離しやすくなることは一般的に知られている。
【０００７】この様な条件のために、免疫学的測定法に
アクリジニウムエステルを用いる場合には、一般的には
次のような測定手順で測定されている。
アクリジニウムエステルを用いる場合には、一般的には
次のような測定手順で測定されている。
【０００８】まず、抗原を特異的に認識し固相上に予め
固定化された生理活性物質と、抗原と、抗原を特異的に
認識しアクリジニウムエステルで標識された抗体とを、
容器中で混合し一定条件下で保持することで、生理活性
物質と、抗原と、標識された抗体との複合物を形成させ
る。次に、この複合物が固相に結合していることを利用
して、洗浄を行うことで反応に関与しなかったアクリジ
ニウムエステルで標識を行った抗体を分離する。さら
に、酸性の溶液を加えて一定時間保持することでアクリ
ジニウムエステルを発光型にする。さらにここへ、過酸
化水素を含むアルカリ性の溶液を加えて発光させる。こ
の発光量を測定することで抗原の濃度を知ることができ
る。
固定化された生理活性物質と、抗原と、抗原を特異的に
認識しアクリジニウムエステルで標識された抗体とを、
容器中で混合し一定条件下で保持することで、生理活性
物質と、抗原と、標識された抗体との複合物を形成させ
る。次に、この複合物が固相に結合していることを利用
して、洗浄を行うことで反応に関与しなかったアクリジ
ニウムエステルで標識を行った抗体を分離する。さら
に、酸性の溶液を加えて一定時間保持することでアクリ
ジニウムエステルを発光型にする。さらにここへ、過酸
化水素を含むアルカリ性の溶液を加えて発光させる。こ
の発光量を測定することで抗原の濃度を知ることができ
る。
【０００９】ここで使用される固相というのは、代表的
なものとして濾紙のような繊維状のものが挙げられる
が、あるいはマイクロプレートのような容器状のものな
ど、公知の不溶性担体を使用することもある。
なものとして濾紙のような繊維状のものが挙げられる
が、あるいはマイクロプレートのような容器状のものな
ど、公知の不溶性担体を使用することもある。
【００１０】
【発明が解決しようとする問題】濾紙やガラスフィルタ
ーのような繊維状の固相を用いる場合、濾紙やガラスフ
ィルターの内側がそのまま測定系となる。こういった固
相の場合、上記の様な従来の測定手順で測定する際に
は、以下の様ないくつかの問題を含んでいる。 酸性の溶液を加えることで抗原と抗体の結合が解離
するために、抗原と抗体の結合が解離してもアクリジニ
ウムで標識された抗体が測定系外に流出しないような工
夫をしなければならない。もし流出すると、測定物質で
ある抗原の正確な測定ができない。 酸性の溶液を単に加えただけでは酸性の溶液が充分
に繊維の中まで浸透しないために、アクリジニウムエス
テルを非発光型から発光型に変化させるのに時間がかか
る。 酸性の溶液により、投入するアルカリ性の溶液が中
和されるために充分な発光が生じない状態が生じる。 入り組んだ繊維の中で、酸性の溶液とアルカリ性の
溶液が充分に混合できないために発光が生じない部分が
存在することから精度が低下する、等である。
ーのような繊維状の固相を用いる場合、濾紙やガラスフ
ィルターの内側がそのまま測定系となる。こういった固
相の場合、上記の様な従来の測定手順で測定する際に
は、以下の様ないくつかの問題を含んでいる。 酸性の溶液を加えることで抗原と抗体の結合が解離
するために、抗原と抗体の結合が解離してもアクリジニ
ウムで標識された抗体が測定系外に流出しないような工
夫をしなければならない。もし流出すると、測定物質で
ある抗原の正確な測定ができない。 酸性の溶液を単に加えただけでは酸性の溶液が充分
に繊維の中まで浸透しないために、アクリジニウムエス
テルを非発光型から発光型に変化させるのに時間がかか
る。 酸性の溶液により、投入するアルカリ性の溶液が中
和されるために充分な発光が生じない状態が生じる。 入り組んだ繊維の中で、酸性の溶液とアルカリ性の
溶液が充分に混合できないために発光が生じない部分が
存在することから精度が低下する、等である。
【００１１】
【問題を解決するための手段】これらの問題を解決する
ために鋭意研究を重ねた結果、以下の工程、すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
抗体とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗原と抗原
抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成する工程 （ｃ）該免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を洗浄液を用いて分離す
る際、除去する洗浄液が固相の保水量の１５％以下とな
るように除去する工程 （ｅ）酸性の溶液を固相の保水量の体積比１５〜３０％
の量を添加し、アクリジニウムエステルを非発光型から
発光型に変化させる工程 （ｆ）アルカリ性の溶液を保水量の３０％以上となるよ
うに加えて発光させ、発光量を測定する工程 の各工程を順に持つ測定方法を採用すれば、先述の欠点
を解消することが判り、アクリジニウムエステルを標識
物質とする化学発光測定法を発明するに至った。
ために鋭意研究を重ねた結果、以下の工程、すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
抗体とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗原と抗原
抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成する工程 （ｃ）該免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を洗浄液を用いて分離す
る際、除去する洗浄液が固相の保水量の１５％以下とな
るように除去する工程 （ｅ）酸性の溶液を固相の保水量の体積比１５〜３０％
の量を添加し、アクリジニウムエステルを非発光型から
発光型に変化させる工程 （ｆ）アルカリ性の溶液を保水量の３０％以上となるよ
うに加えて発光させ、発光量を測定する工程 の各工程を順に持つ測定方法を採用すれば、先述の欠点
を解消することが判り、アクリジニウムエステルを標識
物質とする化学発光測定法を発明するに至った。
【００１２】測定試料の濃度が非常に低い場合には、希
釈を必要とせず、（ａ）の工程を省略することもでき
る。
釈を必要とせず、（ａ）の工程を省略することもでき
る。
【００１３】本発明は、従来の測定手順における洗浄液
と酸性溶液そしてアルカリ性の溶液において、固相の保
水量に着目し、各々のその値のうち最適な値を見出すこ
とで、発光量および精度を安定に向上させるというもの
である。従来技術では、洗浄液残存量にバラツキが生じ
易く、また洗浄液が十分に除去されないなどの問題があ
り、精度の悪化となる。続いて酸性の溶液とアルカリ性
の溶液をそれぞれ許容保水量の近くまで加えることによ
り、測定物質が測定系外に流出してしまうため正確な測
定が出来なくなる。発光反応のために最適とされる、洗
浄液と酸性溶液およびアルカリ性の溶液の具体的な保水
量の値は、洗浄液では１５％以下、酸性の溶液では１５
〜３０％の範囲内、アルカリ性の溶液では３０％以上で
あり、これらの保水量にすることで本発明は達成され
る。
と酸性溶液そしてアルカリ性の溶液において、固相の保
水量に着目し、各々のその値のうち最適な値を見出すこ
とで、発光量および精度を安定に向上させるというもの
である。従来技術では、洗浄液残存量にバラツキが生じ
易く、また洗浄液が十分に除去されないなどの問題があ
り、精度の悪化となる。続いて酸性の溶液とアルカリ性
の溶液をそれぞれ許容保水量の近くまで加えることによ
り、測定物質が測定系外に流出してしまうため正確な測
定が出来なくなる。発光反応のために最適とされる、洗
浄液と酸性溶液およびアルカリ性の溶液の具体的な保水
量の値は、洗浄液では１５％以下、酸性の溶液では１５
〜３０％の範囲内、アルカリ性の溶液では３０％以上で
あり、これらの保水量にすることで本発明は達成され
る。
【００１４】緩衝剤としては、リン酸ナトリウムのよう
な公知の緩衝剤であればなんでもよい。その濃度は、緩
衝能力を維持できる濃度であればよい。
な公知の緩衝剤であればなんでもよい。その濃度は、緩
衝能力を維持できる濃度であればよい。
【００１５】洗浄方法は、洗浄液を投入後、抗原と抗体
の結合が解離しない程度の吸引力で洗浄液を吸引除去す
るという、通常の洗浄の方法と全く同じ様に行うことが
できる。ただし、本発明に従って、洗浄液の残量は１５
％以下とする必要がある。
の結合が解離しない程度の吸引力で洗浄液を吸引除去す
るという、通常の洗浄の方法と全く同じ様に行うことが
できる。ただし、本発明に従って、洗浄液の残量は１５
％以下とする必要がある。
【００１６】化学発光開始剤である酸化性物質（例え
ば、過酸化水素）は、アクリジニウムエステルを発光さ
せることができるだけの量を含有させればよい。その量
は、アクリジニウムエステルの量に対して１０倍以上の
量であることが望ましい。測定に用いるアクリジニウム
エステルは、公知のアクリジニウムエステルが使用でき
る。例えば、アクリジニウムＩのようなものである。
ば、過酸化水素）は、アクリジニウムエステルを発光さ
せることができるだけの量を含有させればよい。その量
は、アクリジニウムエステルの量に対して１０倍以上の
量であることが望ましい。測定に用いるアクリジニウム
エステルは、公知のアクリジニウムエステルが使用でき
る。例えば、アクリジニウムＩのようなものである。
【００１７】洗浄液の残量を少なくすることで、酸性溶
液の浸透性が良くなり、繊維細部の充分に溶液が浸透し
ない部分に存在するアクリジニウムエステルに対しても
効率よく非発光型から発光型に変化させることが可能と
なる。従って、変化に要する時間の短縮にもなり、また
酸性溶液の量を少なくすることができる。酸性の溶液の
量と洗浄液の量を固相の保水量の４５％以下とすること
で、これらの液とアルカリ性の溶液が速やかに混合さ
れ、酸がアルカリに置換されることから、アクリジニウ
ムエステルがより効率良く発光反応が生じる。また同時
に、混合が不十分であるために生じる精度の悪化を防ぐ
ことができる。さらに中和されることもなくなる。アル
カリ性の溶液の添加量が減少することで、全体の液量が
固相の保水量を越えないことから、解離したアクリジニ
ウムエステル標識抗体が固相の外に流出しなくなり、測
定物質の抗原の正確な測定ができる。
液の浸透性が良くなり、繊維細部の充分に溶液が浸透し
ない部分に存在するアクリジニウムエステルに対しても
効率よく非発光型から発光型に変化させることが可能と
なる。従って、変化に要する時間の短縮にもなり、また
酸性溶液の量を少なくすることができる。酸性の溶液の
量と洗浄液の量を固相の保水量の４５％以下とすること
で、これらの液とアルカリ性の溶液が速やかに混合さ
れ、酸がアルカリに置換されることから、アクリジニウ
ムエステルがより効率良く発光反応が生じる。また同時
に、混合が不十分であるために生じる精度の悪化を防ぐ
ことができる。さらに中和されることもなくなる。アル
カリ性の溶液の添加量が減少することで、全体の液量が
固相の保水量を越えないことから、解離したアクリジニ
ウムエステル標識抗体が固相の外に流出しなくなり、測
定物質の抗原の正確な測定ができる。
【００１８】
【発明の効果】測定時間の短縮が可能となり、酸性溶液
の量も少なくなることから経済的で、従来と比較しても
アクリジニウムエステルがより効率良く発光する。ま
た、精度の悪化を防ぐこともでき、もしもアクリジニウ
ムエステル標識抗体が解離しても固相の外に流出せず、
正確な測定が可能となった。以下にその実施例を示す。
の量も少なくなることから経済的で、従来と比較しても
アクリジニウムエステルがより効率良く発光する。ま
た、精度の悪化を防ぐこともでき、もしもアクリジニウ
ムエステル標識抗体が解離しても固相の外に流出せず、
正確な測定が可能となった。以下にその実施例を示す。
【００１９】
【実施例１】特開平４−２０３９６８号公報に記載のガ
ラス繊維の集合体を用いる測定法に準じ、αフェトプロ
テイン（以下、ＡＦＰとする）を用いて発光量と洗浄液
の残存量の関係を調べた。
ラス繊維の集合体を用いる測定法に準じ、αフェトプロ
テイン（以下、ＡＦＰとする）を用いて発光量と洗浄液
の残存量の関係を調べた。
【００２０】１）アビジン結合ガラス繊維濾紙の作製
ガラス繊維濾紙（ワットマン製Ｆ１４５−０３；厚さ
１．３ｍｍ）を３−アミノプロピルトリエトキシシラン
の２％アセトン溶液中に、室温で３０分間浸せきしてガ
ラスと３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応さ
せ、アミノ化ガラス繊維濾紙を得た。アミノ化ガラス繊
維濾紙を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（同仁化学製）０．
０１２５ｍｇ／ｍｌを含む０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナト
リウム緩衝液（以下、ＮａＰＢとする）ｐＨ８．０中
に、室温で３０分間浸せきし、反応させた。蒸留水で洗
浄した後、ビオチンを導入したガラス繊維濾紙をアビジ
ン０．１ｍｇ／ｍｌを含む、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰ
Ｂ ｐＨ７．０中に、室温で３０分間浸せきした。蒸留
水で洗浄した後、アビジンを導入したガラス繊維濾紙を
溶液状ブロックエース（雪印製）に室温で３０分間浸せ
きすることで、アビジン結合ガラス繊維濾紙を得た。
１．３ｍｍ）を３−アミノプロピルトリエトキシシラン
の２％アセトン溶液中に、室温で３０分間浸せきしてガ
ラスと３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応さ
せ、アミノ化ガラス繊維濾紙を得た。アミノ化ガラス繊
維濾紙を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（同仁化学製）０．
０１２５ｍｇ／ｍｌを含む０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナト
リウム緩衝液（以下、ＮａＰＢとする）ｐＨ８．０中
に、室温で３０分間浸せきし、反応させた。蒸留水で洗
浄した後、ビオチンを導入したガラス繊維濾紙をアビジ
ン０．１ｍｇ／ｍｌを含む、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰ
Ｂ ｐＨ７．０中に、室温で３０分間浸せきした。蒸留
水で洗浄した後、アビジンを導入したガラス繊維濾紙を
溶液状ブロックエース（雪印製）に室温で３０分間浸せ
きすることで、アビジン結合ガラス繊維濾紙を得た。
【００２１】２）アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体の
作製 抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
ｐＨ８．０に溶解し１ｍｇ／ｌの溶液を調製した。ア
クリジニウムＩをジメチルスルホキシドに溶解し０．５
ｍｍｏｌ／ｌの溶液を調製した。ＤＬ−リジンを０．１
ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ ｐＨ８．０に溶解し５０ｇ／ｌ
の溶液を調製した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌにアク
リジニウムＩ溶液を０．１ｍｌを添加し、室温で３０分
間反応させる。ＤＬ−リジン溶液を０．１ｍｌ添加し、
室温で１５分反応させた。ウルトラフリーＣ３・ＣＬ
（ミリポア製）を用いて、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
ｐＨ８．０で洗浄し、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度に
調整することで、アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体を
得た。
作製 抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
ｐＨ８．０に溶解し１ｍｇ／ｌの溶液を調製した。ア
クリジニウムＩをジメチルスルホキシドに溶解し０．５
ｍｍｏｌ／ｌの溶液を調製した。ＤＬ−リジンを０．１
ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ ｐＨ８．０に溶解し５０ｇ／ｌ
の溶液を調製した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌにアク
リジニウムＩ溶液を０．１ｍｌを添加し、室温で３０分
間反応させる。ＤＬ−リジン溶液を０．１ｍｌ添加し、
室温で１５分反応させた。ウルトラフリーＣ３・ＣＬ
（ミリポア製）を用いて、０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
ｐＨ８．０で洗浄し、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度に
調整することで、アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体を
得た。
【００２２】３）ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体の作製
抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素
ナトリウム（以下、ＮａＨＣＯ３とする。）に溶解し１
ｍｇ／ｌの溶液を調製した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを
ジメチルスルホキシドに溶解し３ｇ／ｌの溶液を調製し
た。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌにＮＨＳ−ＬＣ−ビオ
チン溶液を０．１ｍｌを添加し、室温で２時間反応させ
た。セロファンの透析膜に入れて、１００倍量の０．０
１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ ｐＨ８．０の溶液で透析を３
回行い、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整することで、
ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を得た。
ナトリウム（以下、ＮａＨＣＯ３とする。）に溶解し１
ｍｇ／ｌの溶液を調製した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを
ジメチルスルホキシドに溶解し３ｇ／ｌの溶液を調製し
た。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌにＮＨＳ−ＬＣ−ビオ
チン溶液を０．１ｍｌを添加し、室温で２時間反応させ
た。セロファンの透析膜に入れて、１００倍量の０．０
１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ ｐＨ８．０の溶液で透析を３
回行い、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整することで、
ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を得た。
【００２３】４）洗浄液の作製
りん酸水素二ナトリウム１２水和物（ナカライテスク
製）、１ｇのＴｗｅｅｎ２０（ナカライテスク製）を適
量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテス
ク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ７．４に調整し、精
製水で１１に調整した。
製）、１ｇのＴｗｅｅｎ２０（ナカライテスク製）を適
量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテス
ク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ７．４に調整し、精
製水で１１に調整した。
【００２４】５）酸性溶液の作製
クエン酸一水和物（ナカライテスク製）、１０ｍｌの３
０％過酸化水素水（ナカライテスク製）を適量の精製水
で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテスク製）でｐ
Ｈメーターを用いてｐＨ４．０に調整し、精製水で１１
に調整した。
０％過酸化水素水（ナカライテスク製）を適量の精製水
で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテスク製）でｐ
Ｈメーターを用いてｐＨ４．０に調整し、精製水で１１
に調整した。
【００２５】６）ＡＦＰ溶液の作製
ＡＦＰを０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ ｐＨ８．０の溶
液に溶解して１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＡＦＰ溶液を作製
した。
液に溶解して１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＡＦＰ溶液を作製
した。
【００２６】７）各々の洗浄液残存量での発光量の測定
アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、ビオ
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートにろ紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間を２秒、１０秒、３０秒に変化させた。
酸性溶液を１２μｌ加えて１５分間室温で保持した。１
Ｎ−ＮａＯＨを０．０５ｍｌ加えて発光を行わせ、その
時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）を用いて測定
した。ただし、ここで使用するガラス繊維濾紙の許容保
水量は約６２μｌであり、この値が保水量１００％とな
る。
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートにろ紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間を２秒、１０秒、３０秒に変化させた。
酸性溶液を１２μｌ加えて１５分間室温で保持した。１
Ｎ−ＮａＯＨを０．０５ｍｌ加えて発光を行わせ、その
時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）を用いて測定
した。ただし、ここで使用するガラス繊維濾紙の許容保
水量は約６２μｌであり、この値が保水量１００％とな
る。
【００２７】実施例１の結果を表１に示す。この結果か
ら、洗浄液残存量が１５％のあたりで発光量が最大とな
り、それ以下では、値に変化はないことが判る。
ら、洗浄液残存量が１５％のあたりで発光量が最大とな
り、それ以下では、値に変化はないことが判る。
【００２８】
【実施例２】発光量と酸性溶液量との関係を調べた。
１）アビジン結合ガラス繊維濾紙の作製
２）アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体の作製
３）ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体の作製
４）洗浄液の作製
５）酸性溶液の作製
６）ＡＦＰ溶液の作製
以上、１）〜６）は実施例１で作製したものを用いた。
【００２９】７）各々の酸性溶液量での発光量の測定
アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、ビオ
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートに濾紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間は１０秒とした。加える酸性溶液の量を
７μ１，１２μｌ，１７μｌ，２３μｌと変化させ、そ
の量を加えて１５分間室温で保持した。１Ｎ−ＮａＯＨ
を０．０５ｍｌ加えて発光を行わせ、その時の発光量を
極微弱光測定装置（自社製）を用いて測定した。ただ
し、ここで使用するガラス繊維濾紙の許容保水量は約６
２μｌであり、この値が保水量１００％となる。
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートに濾紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間は１０秒とした。加える酸性溶液の量を
７μ１，１２μｌ，１７μｌ，２３μｌと変化させ、そ
の量を加えて１５分間室温で保持した。１Ｎ−ＮａＯＨ
を０．０５ｍｌ加えて発光を行わせ、その時の発光量を
極微弱光測定装置（自社製）を用いて測定した。ただ
し、ここで使用するガラス繊維濾紙の許容保水量は約６
２μｌであり、この値が保水量１００％となる。
【００３０】実施例２の結果を表２に示す。この結果か
ら、酸性溶液の量が１５〜３０％の間で、発光量が最大
となり、この間で発光量に変化がないことが判る。
ら、酸性溶液の量が１５〜３０％の間で、発光量が最大
となり、この間で発光量に変化がないことが判る。
【００３１】
【実施例３】発光量とアルカリ性溶液量との関係を調べ
た。 １）アビジン結合ガラス繊維濾紙の作製 ２）アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体の作製 ３）ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体の作製 ４）洗浄液の作製 ５）酸性溶液の作製 ６）ＡＦＰ溶液の作製 以上、１）〜６）は実施例１で作製したものを用いた。
た。 １）アビジン結合ガラス繊維濾紙の作製 ２）アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体の作製 ３）ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体の作製 ４）洗浄液の作製 ５）酸性溶液の作製 ６）ＡＦＰ溶液の作製 以上、１）〜６）は実施例１で作製したものを用いた。
【００３２】７）各々のアルカリ性溶液量での発光量の
測定 アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、ビオ
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートに濾紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間は１０秒とした。酸性溶液を１２μｌ加
えて１５分間室温で保持した。１Ｎ−ＮａＯＨを１０μ
ｌ，２０μｌ，３０μｌ，５０μｌに変化させたものを
加えて発光を行わせ、その時の発光量を極微弱光測定装
置（自社製）を用いて測定した。ただし、ここで使用す
るガラス繊維濾紙の許容保水量は約６２μｌであり、こ
の値が保水量１００％となる。
測定 アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、ビオ
チン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、１０ｎｇ／ｍｌに
調整したＡＦＰ溶液０．８ｍｌを混合し、３０分間室温
で反応させた。この反応液の０．０６ｍｌを、直径９ｍ
ｍの大きさに切ったアビジン結合ガラス繊維濾紙に分注
し、１０分間室温で反応させた。１０ｍｌの洗浄液でブ
フナーロートに濾紙を置き、この上に先に反応させたア
ビジン結合ガラス繊維濾紙を置き、水流ポンプで吸引し
ながら１０ｍｌの洗浄液を上から添加して洗浄した。洗
浄後の吸引時間は１０秒とした。酸性溶液を１２μｌ加
えて１５分間室温で保持した。１Ｎ−ＮａＯＨを１０μ
ｌ，２０μｌ，３０μｌ，５０μｌに変化させたものを
加えて発光を行わせ、その時の発光量を極微弱光測定装
置（自社製）を用いて測定した。ただし、ここで使用す
るガラス繊維濾紙の許容保水量は約６２μｌであり、こ
の値が保水量１００％となる。
【００３３】実施例３の結果を表３に示す。この結果か
らアルカリ性の溶液が３０％以上の時発光量値に大きな
変化はなく、そこでの値がほぼ最大となっていることが
判る。
らアルカリ性の溶液が３０％以上の時発光量値に大きな
変化はなく、そこでの値がほぼ最大となっていることが
判る。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/543 575
G01N 21/76
Claims (2)
- 【請求項１】 測定試料中に含まれる抗原を定量するた
めに、固相に繊維状物質を使用し、アクリジニウムエス
テルを標識物質として用いる免疫学的な発光測定法であ
り、以下の工程すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
生理活性物質とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗
原と抗原抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成
する工程（ｃ）該免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を洗浄液を用いて分離す
る際、除去する洗浄液が固相の保水量の１５％以下とな
るように除去する工程 （ｅ）酸性の溶液を固相の保水量の体積比１５〜３０％
の量を添加し、アクリジニウムエステルを非発光型から
発光型に変化させる工程 （ｆ）アルカリ性の溶液を保水量の３０％以上となるよ
うに加えて発光させ、発光量を測定する工程 の各工程を順に持つことを特徴とする化学発光測定法。 - 【請求項２】 測定試料に対して希釈を必要としない場
合には、（ａ）の工程を省略する、特許請求の範囲１に
記載の化学発光測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31232294A JP3458251B2 (ja) | 1994-11-09 | 1994-11-09 | 固相に繊維状物質を用いた化学発光測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31232294A JP3458251B2 (ja) | 1994-11-09 | 1994-11-09 | 固相に繊維状物質を用いた化学発光測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08136544A JPH08136544A (ja) | 1996-05-31 |
| JP3458251B2 true JP3458251B2 (ja) | 2003-10-20 |
Family
ID=18027849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31232294A Expired - Fee Related JP3458251B2 (ja) | 1994-11-09 | 1994-11-09 | 固相に繊維状物質を用いた化学発光測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3458251B2 (ja) |
-
1994
- 1994-11-09 JP JP31232294A patent/JP3458251B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08136544A (ja) | 1996-05-31 |
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