JP3454432B2 - 核酸増幅生成物の検出のための受動的内部参照 - Google Patents
核酸増幅生成物の検出のための受動的内部参照Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、核酸増幅の分野、そしてより詳細
には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような核酸増幅
プロセスからのポリヌクレオチド生成物のリアルタイム
での測定のためのシステムに関する。
には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような核酸増幅
プロセスからのポリヌクレオチド生成物のリアルタイム
での測定のためのシステムに関する。
背景
核酸配列分析は、多くの研究、医学分野、および工業
分野において、ますます重要になっている（例えば、Ca
skey,Science 236:1223−1228（1987）;Landegrenら,Sc
ience 242:229−237（1988）；および、ArnheimらAnn.R
ev.Biochem.,61:131−156（1992）を参照のこと）。い
くつかの核酸増幅系の開発が、この流行において重大な
役割を担ってきた（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）、Innisら編PCR Protocols（Academic Press,New Yo
rk,1990）;McPhersonら編,PCR:A Practical Approach
（IRL Press,Oxford,1991）；連結ベース（ligation−b
ased）増幅技術,Barany,PCR Methods and Applications
1:5−16（1991）；などを参照のこと）。
分野において、ますます重要になっている（例えば、Ca
skey,Science 236:1223−1228（1987）;Landegrenら,Sc
ience 242:229−237（1988）；および、ArnheimらAnn.R
ev.Biochem.,61:131−156（1992）を参照のこと）。い
くつかの核酸増幅系の開発が、この流行において重大な
役割を担ってきた（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）、Innisら編PCR Protocols（Academic Press,New Yo
rk,1990）;McPhersonら編,PCR:A Practical Approach
（IRL Press,Oxford,1991）；連結ベース（ligation−b
ased）増幅技術,Barany,PCR Methods and Applications
1:5−16（1991）；などを参照のこと）。
PCRは特に、クローン化、遺伝子発現分析、DNA配列決
定、遺伝子地図化、薬物の発見などにおける応用に関し
て、非常に重要な研究ツールになった（例えば、Arnhei
mら（上記で引用）;Gillilandら,Proc.Natl.Acad.Sci.,
87:2725−2729（1990）;Bevanら,PCR Methods and Appl
ications,1:222−228（1992）;Greenら,PCR Methods an
d Applications,1:77−90（1991）;Blackwellら,Scienc
e,250:1104−1110（1990）を参照のこと）。
定、遺伝子地図化、薬物の発見などにおける応用に関し
て、非常に重要な研究ツールになった（例えば、Arnhei
mら（上記で引用）;Gillilandら,Proc.Natl.Acad.Sci.,
87:2725−2729（1990）;Bevanら,PCR Methods and Appl
ications,1:222−228（1992）;Greenら,PCR Methods an
d Applications,1:77−90（1991）;Blackwellら,Scienc
e,250:1104−1110（1990）を参照のこと）。
多種多様の機器が、核酸増幅、特にPCRを実行するた
めに開発されてきた（例えば、Johnsonら，米国特許第
5,038,852号（コンピュータ制御熱サイクラー）;Wittwe
rら,Nucleic Acids Research,17:4353−4357（1989）
（キャピラリーチューブPCR）;Hallsby,米国特許第5,18
7,084号（空気ベース温度制御）;Garnerら,Biotechniqu
es,14:112−115（1993）（864ウェルプレートの高処理P
CR）;Wildingら，国際特許出願第PCT/US93/04039号（マ
イクロマシーン構造のPCR）;Schnipelskyら，欧州特許
出願第90301061.9号（公開第0381501 A2号）（ディスポ
ーザブル単使用PCR装置）などを参照のこと）。PCR機器
開発に基本的な重要な設計目標は、精密な温度制御、多
試料熱サイクルにおける試料−試料間の変動の最小化、
PCR前プロセシング工程およびPCR後プロセシング工程の
自動化、高速サイクル、試料容量の最小化、増幅生成物
のリアルタイム測定、交差汚染の最小化、または試料の
持ち越しなどを含む。特に、PCRが閉鎖反応チャンバー
で実施され、そしてリアルタイムでモニターされるのを
可能にする機器の設計が、非常に所望される。閉鎖反応
チャンバーは、交差汚染を防ぐために所望される（例え
ば、Higuchiら,Biotechnology,10:413−417（1992）お
よび11:1026−1030（1993）；およびHollandら,Proc.Na
tl.Acad.Sci.,88:7276−7280（1991）を参照のこと）。
明らかに、このような設計目標の実現の成功は、特に診
断試料の分析（ここでは、高頻度の偽陽性および偽陰性
が、PCRベース手順の価値を著しく減少させる）におい
て所望される。PCRのリアルタイムのモニタリングは、
隣接濃度の相対値がPCR間の相対濃度値の履歴を考慮す
ることによって決定され得る場合、多標的増幅における
初期標的DNA濃度の、さらにより正確な定量を可能にす
る。リアルタイムモニタリングはまた、PCRの有効性が
評価されるのを可能し、このことは、試料中にPCR阻害
剤が存在するかどうかを示し得る。
めに開発されてきた（例えば、Johnsonら，米国特許第
5,038,852号（コンピュータ制御熱サイクラー）;Wittwe
rら,Nucleic Acids Research,17:4353−4357（1989）
（キャピラリーチューブPCR）;Hallsby,米国特許第5,18
7,084号（空気ベース温度制御）;Garnerら,Biotechniqu
es,14:112−115（1993）（864ウェルプレートの高処理P
CR）;Wildingら，国際特許出願第PCT/US93/04039号（マ
イクロマシーン構造のPCR）;Schnipelskyら，欧州特許
出願第90301061.9号（公開第0381501 A2号）（ディスポ
ーザブル単使用PCR装置）などを参照のこと）。PCR機器
開発に基本的な重要な設計目標は、精密な温度制御、多
試料熱サイクルにおける試料−試料間の変動の最小化、
PCR前プロセシング工程およびPCR後プロセシング工程の
自動化、高速サイクル、試料容量の最小化、増幅生成物
のリアルタイム測定、交差汚染の最小化、または試料の
持ち越しなどを含む。特に、PCRが閉鎖反応チャンバー
で実施され、そしてリアルタイムでモニターされるのを
可能にする機器の設計が、非常に所望される。閉鎖反応
チャンバーは、交差汚染を防ぐために所望される（例え
ば、Higuchiら,Biotechnology,10:413−417（1992）お
よび11:1026−1030（1993）；およびHollandら,Proc.Na
tl.Acad.Sci.,88:7276−7280（1991）を参照のこと）。
明らかに、このような設計目標の実現の成功は、特に診
断試料の分析（ここでは、高頻度の偽陽性および偽陰性
が、PCRベース手順の価値を著しく減少させる）におい
て所望される。PCRのリアルタイムのモニタリングは、
隣接濃度の相対値がPCR間の相対濃度値の履歴を考慮す
ることによって決定され得る場合、多標的増幅における
初期標的DNA濃度の、さらにより正確な定量を可能にす
る。リアルタイムモニタリングはまた、PCRの有効性が
評価されるのを可能し、このことは、試料中にPCR阻害
剤が存在するかどうかを示し得る。
Hollandら（上記で引用）および他は、PCR間の増幅生
成物のリアルタイム測定を提供するために蛍光ベースア
プローチを提案している。このようなアプローチは、存
在する二本鎖DNAの量を示すインターカレート色素（例
えば、エチジウムブロマイド）を使用するか（Higuchi
ら,Biotechnology 10:413−417（1992）,Higuchiら,Bio
technology 11:1026−1030（1993），米国特許第5,210,
015号）、または存在する二本鎖DNAの量に比例する濃度
の蛍光生成物を放出するように、増幅間に開裂されるフ
ルオレッサー（fluorescer）−クエンチャー（quenche
r）対を含有するプローブを使用するかのいずれかであ
る。そのようなシステムの１つの例は、TaqmanTMLS−50
PCR Detectionシステム（Perkin−Elmer）である。フ
ルオレッサー−クエンチャープローブアッセイは、レポ
ーター（reporter）（すなわち、フルオレッサー）の蛍
光をクエンチャーの蛍光で割った比の測定を含む。フル
オレッサー−クエンチャープローブは、２個（または２
個より多い）の異なる蛍光指示薬で標識したポリヌクレ
オチドである。第１の蛍光指示薬は、励起の際、検出可
能な蛍光発光を生成するというよりむしろ、クエンチャ
ーを励起するように働く。フルオレッサー−クエンチャ
ープローブは、PCRまたは類似の増幅反応における増幅
用ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。増幅反
応を触媒するために使用される酵素の5'−3'エキソヌク
レアーゼ活性は、ポリヌクレオチドプローブを開裂する
のに役立ち、それによってクエンチャーをフルオレッサ
ーに非常に近接したとこらから除去し、フルオレッサー
からのシグナルがもはやクエンチされないようにする。
フルオレッサー−クエンチャープローブを使用する核酸
増幅反応およびフルオレッサー−クエンチャープローブ
の詳細な記載は、多くの刊行物（Leeら,Nucleic Acid R
esearch,21:3761−3766（1993）,Livakら,PCR Methods
and Applications,4:357−362（1995）を含む）で見出
され得る。
成物のリアルタイム測定を提供するために蛍光ベースア
プローチを提案している。このようなアプローチは、存
在する二本鎖DNAの量を示すインターカレート色素（例
えば、エチジウムブロマイド）を使用するか（Higuchi
ら,Biotechnology 10:413−417（1992）,Higuchiら,Bio
technology 11:1026−1030（1993），米国特許第5,210,
015号）、または存在する二本鎖DNAの量に比例する濃度
の蛍光生成物を放出するように、増幅間に開裂されるフ
ルオレッサー（fluorescer）−クエンチャー（quenche
r）対を含有するプローブを使用するかのいずれかであ
る。そのようなシステムの１つの例は、TaqmanTMLS−50
PCR Detectionシステム（Perkin−Elmer）である。フ
ルオレッサー−クエンチャープローブアッセイは、レポ
ーター（reporter）（すなわち、フルオレッサー）の蛍
光をクエンチャーの蛍光で割った比の測定を含む。フル
オレッサー−クエンチャープローブは、２個（または２
個より多い）の異なる蛍光指示薬で標識したポリヌクレ
オチドである。第１の蛍光指示薬は、励起の際、検出可
能な蛍光発光を生成するというよりむしろ、クエンチャ
ーを励起するように働く。フルオレッサー−クエンチャ
ープローブは、PCRまたは類似の増幅反応における増幅
用ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。増幅反
応を触媒するために使用される酵素の5'−3'エキソヌク
レアーゼ活性は、ポリヌクレオチドプローブを開裂する
のに役立ち、それによってクエンチャーをフルオレッサ
ーに非常に近接したとこらから除去し、フルオレッサー
からのシグナルがもはやクエンチされないようにする。
フルオレッサー−クエンチャープローブを使用する核酸
増幅反応およびフルオレッサー−クエンチャープローブ
の詳細な記載は、多くの刊行物（Leeら,Nucleic Acid R
esearch,21:3761−3766（1993）,Livakら,PCR Methods
and Applications,4:357−362（1995）を含む）で見出
され得る。
増幅生成物の形成に起因し得る蛍光レベルにおける変
化の正確かつ厳密な測定を提供するために、内部蛍光参
照を用いてフルオレッサー−クエンチャープローブアッ
セイを実施することが、興味深い。このようなアッセ
イ、特にリアルタイムアッセイに適した内部参照を開発
することは、標準からのシグナルにゆらぎがあるため
に、困難であることがわかっている。フルオレッサー−
クエンチャープローブアッセイの結果の分析は、開裂後
にフルオレッサーの量子収量は増加し、クエンチャーの
量子収量は減少するために、複雑化されている。従っ
て、クエンチャーの蛍光測定は、比較的一定の基底線測
定を提供するというよりむしろ、増幅に伴って減少す
る。さらなる蛍光色素が、内部参照として働くように加
えられ得る。この内部参照の制限は、それが増幅過程を
阻害しないこと、それが増幅の熱レジメを通じて安定な
蛍光シグナルを生成すること、ならびにその蛍光発光
が、フルオレッサー−クエンチャープローブ中で使用さ
れるすべてのフルオレッサーおよびクエンチャーと識別
可能であることを含む。この最後の制限は、一般に内部
参照として使用可能である化合物が、プローブ中でフル
オレッサーを励起するために使用される波長で、あまり
効率的に励起されないことを意味する。この問題は、内
部参照色素の濃度を増大させることによって解決され得
るが、必要とされる高レベルの蛍光化合物は、増幅過程
に有害な影響を有し得る。さらに、高濃度の内部参照色
素は、インターフィルター効果によってフルオレッサー
からのシグナルを遮幣し得る。さらに、多くの発蛍光団
は、水溶液にそれほど高く可溶ではない。
化の正確かつ厳密な測定を提供するために、内部蛍光参
照を用いてフルオレッサー−クエンチャープローブアッ
セイを実施することが、興味深い。このようなアッセ
イ、特にリアルタイムアッセイに適した内部参照を開発
することは、標準からのシグナルにゆらぎがあるため
に、困難であることがわかっている。フルオレッサー−
クエンチャープローブアッセイの結果の分析は、開裂後
にフルオレッサーの量子収量は増加し、クエンチャーの
量子収量は減少するために、複雑化されている。従っ
て、クエンチャーの蛍光測定は、比較的一定の基底線測
定を提供するというよりむしろ、増幅に伴って減少す
る。さらなる蛍光色素が、内部参照として働くように加
えられ得る。この内部参照の制限は、それが増幅過程を
阻害しないこと、それが増幅の熱レジメを通じて安定な
蛍光シグナルを生成すること、ならびにその蛍光発光
が、フルオレッサー−クエンチャープローブ中で使用さ
れるすべてのフルオレッサーおよびクエンチャーと識別
可能であることを含む。この最後の制限は、一般に内部
参照として使用可能である化合物が、プローブ中でフル
オレッサーを励起するために使用される波長で、あまり
効率的に励起されないことを意味する。この問題は、内
部参照色素の濃度を増大させることによって解決され得
るが、必要とされる高レベルの蛍光化合物は、増幅過程
に有害な影響を有し得る。さらに、高濃度の内部参照色
素は、インターフィルター効果によってフルオレッサー
からのシグナルを遮幣し得る。さらに、多くの発蛍光団
は、水溶液にそれほど高く可溶ではない。
核酸増幅生成物の検出のための従来の内部参照に関す
るこれらの問題を考慮して、新しい内部参照およびその
ような標準物を使用する改良した増幅方法を開発するこ
とが、興味深い。本明細書中に記載の発明は、そのよう
な内部参照および方法を提供する。
るこれらの問題を考慮して、新しい内部参照およびその
ような標準物を使用する改良した増幅方法を開発するこ
とが、興味深い。本明細書中に記載の発明は、そのよう
な内部参照および方法を提供する。
発明の要旨
本発明は、核酸増幅反応における増幅生成物の形成を
定量する際に使用するための、受動的内部参照に関す
る。本発明の内部増幅参照分子は、バックボーンコネク
ターを通して共に結合された、第１の発蛍光団（fluoro
phore）および第２の発蛍光団を含む。この第１の発蛍
光団および第２の発蛍光団は、第１の発蛍光団から第２
の発蛍光団へエネルギーが移動するのを可能にする配置
で、バックボーン上で結合される。バックボーンコネク
ターは、核酸増幅条件下では標的核酸配列に結合しない
ように選択される。好ましくは、バックボーンコネクタ
ーはポリヌクレオチドである。
定量する際に使用するための、受動的内部参照に関す
る。本発明の内部増幅参照分子は、バックボーンコネク
ターを通して共に結合された、第１の発蛍光団（fluoro
phore）および第２の発蛍光団を含む。この第１の発蛍
光団および第２の発蛍光団は、第１の発蛍光団から第２
の発蛍光団へエネルギーが移動するのを可能にする配置
で、バックボーン上で結合される。バックボーンコネク
ターは、核酸増幅条件下では標的核酸配列に結合しない
ように選択される。好ましくは、バックボーンコネクタ
ーはポリヌクレオチドである。
本発明の別の局面は、核酸増幅反応に使用するため
の、受動的内部参照分子含有試薬組成物を提供すること
である。この組成物は、本発明の内部増幅参照分子、お
よび核酸増幅反応緩衝液を含む。この試薬組成物は、必
要に応じて核酸増幅反応に必要とされる、さらなる成分
を含む。
の、受動的内部参照分子含有試薬組成物を提供すること
である。この組成物は、本発明の内部増幅参照分子、お
よび核酸増幅反応緩衝液を含む。この試薬組成物は、必
要に応じて核酸増幅反応に必要とされる、さらなる成分
を含む。
本発明はまた、フルオレッサー−クエンチャープロー
ブアッセイを使用する、核酸増幅反応における増幅生成
物の量を測定する改良された方法を提供し、増幅生成物
形成のリアルタイム測定のための方法を含む。この方法
は、本発明の内部参照分子を、増幅反応混合物に添加す
る工程を含む。次いで、内部参照の第２の発蛍光団の蛍
光が、測定され得、そしてフルオレッサー−クエンチャ
ープローブの発蛍光団の蛍光における変化を算出するた
めに使用され得る。本発明の内部参照の使用は、フルオ
レッサー−クエンチャープローブアッセイでの多フルオ
レッサー−クエンチャープローブの同時使用を可能にす
る。
ブアッセイを使用する、核酸増幅反応における増幅生成
物の量を測定する改良された方法を提供し、増幅生成物
形成のリアルタイム測定のための方法を含む。この方法
は、本発明の内部参照分子を、増幅反応混合物に添加す
る工程を含む。次いで、内部参照の第２の発蛍光団の蛍
光が、測定され得、そしてフルオレッサー−クエンチャ
ープローブの発蛍光団の蛍光における変化を算出するた
めに使用され得る。本発明の内部参照の使用は、フルオ
レッサー−クエンチャープローブアッセイでの多フルオ
レッサー−クエンチャープローブの同時使用を可能にす
る。
本発明はまた、核酸増幅生成物のリアルタイム蛍光ベ
ース測定を実行するためのシステムに関する。本発明の
好ましい実施態様では、励起光線は、以下を含む反応混
合物中に集束される：（ｉ）その強度が、励起光線によ
って照射された反応混合物の容量中の増幅生成物の量に
比例する第１蛍光シグナルを生成することが可能な蛍光
指示薬、および（ii）反応混合物中に均一に分散され、
そして励起光線によって照射された反応混合物の容量に
比例する第２蛍光シグナルを生成することが可能な内部
増幅参照分子に存在する発蛍光団（すなわち、第２の発
蛍光団）。蛍光強度の比例は、有機色素の蛍光発光に独
立的に影響をおよぼすパラメータ（例えば、温度、pH、
塩濃度など）の定常のセットについてであることが、理
解される。
ース測定を実行するためのシステムに関する。本発明の
好ましい実施態様では、励起光線は、以下を含む反応混
合物中に集束される：（ｉ）その強度が、励起光線によ
って照射された反応混合物の容量中の増幅生成物の量に
比例する第１蛍光シグナルを生成することが可能な蛍光
指示薬、および（ii）反応混合物中に均一に分散され、
そして励起光線によって照射された反応混合物の容量に
比例する第２蛍光シグナルを生成することが可能な内部
増幅参照分子に存在する発蛍光団（すなわち、第２の発
蛍光団）。蛍光強度の比例は、有機色素の蛍光発光に独
立的に影響をおよぼすパラメータ（例えば、温度、pH、
塩濃度など）の定常のセットについてであることが、理
解される。
好ましくは、励起光線は、反応混合物を含む閉鎖反応
チャンバーの壁の一部を通して、レンズによって反応混
合物に集束される。さらに好ましくは、同じレンズが、
励起光線に応答してプローブ上のフルオレッサーおよび
内部参照の第２の発蛍光団によって生成される蛍光シグ
ナルを収集する；このようにして、励起の不整合および
収集光による、収集シグナルにおける変動は避けられ
る。この実施態様において、レンズが、反応混合物に接
触しない閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通すように励
起光線を向ける場合はいつも、壁のその部分は、反応混
合物からの凝縮が、レンズによって収集される蛍光シグ
ナルの光路中で形成しないように加熱され、それによっ
て収集シグナルにおける別の変動源を除去する。
チャンバーの壁の一部を通して、レンズによって反応混
合物に集束される。さらに好ましくは、同じレンズが、
励起光線に応答してプローブ上のフルオレッサーおよび
内部参照の第２の発蛍光団によって生成される蛍光シグ
ナルを収集する；このようにして、励起の不整合および
収集光による、収集シグナルにおける変動は避けられ
る。この実施態様において、レンズが、反応混合物に接
触しない閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通すように励
起光線を向ける場合はいつも、壁のその部分は、反応混
合物からの凝縮が、レンズによって収集される蛍光シグ
ナルの光路中で形成しないように加熱され、それによっ
て収集シグナルにおける別の変動源を除去する。
本装置の最も好ましい実施態様において、反応チャン
バーは閉鎖末端（本明細書中では、チューブの底部と呼
ぶ）および開放末端（本明細書中では、チューブの上部
と呼ぶ）を有するチューブであり、これは耐漏出シール
が形成されるようなキャップを用いて封をされ得る。言
い換えれば、いったん反応混合物がチューブ内に入れら
れ、そしてキャップが付けられると、閉鎖反応チャンバ
ーが形成される。この最も好ましい実施態様において、
（１）チューブのキャップと反応混合物の上部表面との
間に空間を残すように、反応混合物をチューブの一部、
一般には、チューブの底部に満たし、ならびに（２）キ
ャップを接触させないレンズか、キャップを通る励起光
線を、その上部表面を通して反応混合物中に集束させ、
そしてプローブおよび内部参照によって生成される生じ
た蛍光を収集する。上記に記載のように、励起光線が通
るチューブの一部（この実施態様ではキャップ）は加熱
され、収集される蛍光シグナルの測定におけるさらなる
変動源を導入する凝縮の形成を防ぐ。第１蛍光シグナル
および第２蛍光シグナルの系列分析から生じ得る潜在的
変動は、シグナル光を光検出器のアレイ上にスペクトル
分離させること（例えば、シグナルを電荷結合素子（CC
D）アレイ上に回析させることによる）によって、シグ
ナルを同時分析することによって除去される。
バーは閉鎖末端（本明細書中では、チューブの底部と呼
ぶ）および開放末端（本明細書中では、チューブの上部
と呼ぶ）を有するチューブであり、これは耐漏出シール
が形成されるようなキャップを用いて封をされ得る。言
い換えれば、いったん反応混合物がチューブ内に入れら
れ、そしてキャップが付けられると、閉鎖反応チャンバ
ーが形成される。この最も好ましい実施態様において、
（１）チューブのキャップと反応混合物の上部表面との
間に空間を残すように、反応混合物をチューブの一部、
一般には、チューブの底部に満たし、ならびに（２）キ
ャップを接触させないレンズか、キャップを通る励起光
線を、その上部表面を通して反応混合物中に集束させ、
そしてプローブおよび内部参照によって生成される生じ
た蛍光を収集する。上記に記載のように、励起光線が通
るチューブの一部（この実施態様ではキャップ）は加熱
され、収集される蛍光シグナルの測定におけるさらなる
変動源を導入する凝縮の形成を防ぐ。第１蛍光シグナル
および第２蛍光シグナルの系列分析から生じ得る潜在的
変動は、シグナル光を光検出器のアレイ上にスペクトル
分離させること（例えば、シグナルを電荷結合素子（CC
D）アレイ上に回析させることによる）によって、シグ
ナルを同時分析することによって除去される。
下記でより十分に考察されるように、単一光源によっ
て生成される励起光線（例えば、レーザー）は、好都合
には、光ファイバ（fiber optics）によって複数の閉鎖
反応チャンバーに分離される。同様に、同じ光ファイバ
は、単一の検出および分析システムによって、複数の分
析用反応チャンバーから蛍光シグナルを収集し得る。
て生成される励起光線（例えば、レーザー）は、好都合
には、光ファイバ（fiber optics）によって複数の閉鎖
反応チャンバーに分離される。同様に、同じ光ファイバ
は、単一の検出および分析システムによって、複数の分
析用反応チャンバーから蛍光シグナルを収集し得る。
好ましくは、システムは核酸のPCR増幅と共に使用さ
れる。
れる。
本発明のシステムは、増幅生成物の量に比例し、そし
て反応混合物の容量における変化に独立である、安定な
蛍光シグナルを生成するための、装置および蛍光試薬を
提供することによって、核酸増幅反応の正確なリアルタ
イムモニタリングを可能にする。増幅反応の進行を示す
データの利用可能性は、標的核酸の相対開始濃度のより
正確な概算、増幅反応の効率性の迅速な評価につなが
り、そして還元試薬の使用およびフィードバック反応の
制御の可能性を開く。
て反応混合物の容量における変化に独立である、安定な
蛍光シグナルを生成するための、装置および蛍光試薬を
提供することによって、核酸増幅反応の正確なリアルタ
イムモニタリングを可能にする。増幅反応の進行を示す
データの利用可能性は、標的核酸の相対開始濃度のより
正確な概算、増幅反応の効率性の迅速な評価につなが
り、そして還元試薬の使用およびフィードバック反応の
制御の可能性を開く。
図面の簡単な説明
図１は、本発明のシステムの試料インターフェース成
分の好ましい実施態様を図示する。
分の好ましい実施態様を図示する。
図２は、光ファイバマルチプレクサーを介して反応を
順次問い合わせることにより複数の増幅反応を同時にモ
ニタリングするための、好ましい実施態様を図示する。
順次問い合わせることにより複数の増幅反応を同時にモ
ニタリングするための、好ましい実施態様を図示する。
図３は、下記に記載の好ましい実施態様であるCCDア
レイによって記録された、テトラメチルローダミン発蛍
光団、フルオレセイン発蛍光団、および機器バックグラ
ウンドのスペクトル分離された発光強度データを示す。
レイによって記録された、テトラメチルローダミン発蛍
光団、フルオレセイン発蛍光団、および機器バックグラ
ウンドのスペクトル分離された発光強度データを示す。
図４は、増幅生成物（第１の発蛍光団）に比例するフ
ルオレセイン色素および典型的なPCR間で第２の発蛍光
団として使用されるテトラメチルローダミン色素からの
蛍光シグナルの時間依存性を示す。
ルオレセイン色素および典型的なPCR間で第２の発蛍光
団として使用されるテトラメチルローダミン色素からの
蛍光シグナルの時間依存性を示す。
図５は、図３に時間依存性データが示されているもの
と同じPCR由来のフルオレセインおよびテトラメチルロ
ーダミン色素の強度比のサイクル依存性を示す。
と同じPCR由来のフルオレセインおよびテトラメチルロ
ーダミン色素の強度比のサイクル依存性を示す。
図６は、増幅生成物の量を、同じ標的核酸の異なる開
始濃度を有する別個のPCRにおけるサイクル数と関連づ
けるデータを示す。
始濃度を有する別個のPCRにおけるサイクル数と関連づ
けるデータを示す。
定義
本明細書中で使用されるように、蛍光シグナルに関す
る用語「安定な」は、ノイズによるシグナルでのルート
平均平方根（RMS）偏差が、平均シグナル大きさの２％
以下であることを意味する。より好ましくは、安定なは
ノイズによるシグナルでのRMS偏差が、平均シグナル大
きさの１％以下であることを意味する。
る用語「安定な」は、ノイズによるシグナルでのルート
平均平方根（RMS）偏差が、平均シグナル大きさの２％
以下であることを意味する。より好ましくは、安定なは
ノイズによるシグナルでのRMS偏差が、平均シグナル大
きさの１％以下であることを意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸増幅反応の進行のリアルタイムでのモ
ニタリングのための蛍光ベースシステムに関する；しか
し、そのようなシステムはまた、終点測定に使用され得
る。特に、本発明は、核酸増幅反応のリアルタイムモニ
タリングの正確さおよび厳密さを改良するために使用さ
れ得る、受動的内部参照分子に関する。対象参照分子
は、参照分子の蛍光が、核酸増幅反応間で有意に変化し
ないという点において「受動的」である。本発明の内部
参照分子の使用は、フルオレッサー−クエンチャープロ
ーブアッセイでのプローブ上のクエンチャーの蛍光の測
定のみよりも重要な利点を有する。１つ以上のそのよう
な利点は、本発明の選択された実施態様において見出さ
れ得る。そのような利点の１つは、内部参照由来の蛍光
シグナルのレベルが、フルオレッサー−クエンチャープ
ローブアッセイの間中、本質的に一定であることであ
る。本発明の内部参照の別の利点は、それらが単一増幅
反応において、多数のフルオレッサー−クエンチャープ
ローブの同時使用を可能にすることである。本発明の内
部増幅参照分子の別の利点は、クエンチャーがフルオレ
ッサーである必要のないフルオレッサー−クエンチャー
プローブの使用を可能にすることであり、それによって
フルオレッサーとして使用され得る蛍光分子の範囲を増
やすことである。
ニタリングのための蛍光ベースシステムに関する；しか
し、そのようなシステムはまた、終点測定に使用され得
る。特に、本発明は、核酸増幅反応のリアルタイムモニ
タリングの正確さおよび厳密さを改良するために使用さ
れ得る、受動的内部参照分子に関する。対象参照分子
は、参照分子の蛍光が、核酸増幅反応間で有意に変化し
ないという点において「受動的」である。本発明の内部
参照分子の使用は、フルオレッサー−クエンチャープロ
ーブアッセイでのプローブ上のクエンチャーの蛍光の測
定のみよりも重要な利点を有する。１つ以上のそのよう
な利点は、本発明の選択された実施態様において見出さ
れ得る。そのような利点の１つは、内部参照由来の蛍光
シグナルのレベルが、フルオレッサー−クエンチャープ
ローブアッセイの間中、本質的に一定であることであ
る。本発明の内部参照の別の利点は、それらが単一増幅
反応において、多数のフルオレッサー−クエンチャープ
ローブの同時使用を可能にすることである。本発明の内
部増幅参照分子の別の利点は、クエンチャーがフルオレ
ッサーである必要のないフルオレッサー−クエンチャー
プローブの使用を可能にすることであり、それによって
フルオレッサーとして使用され得る蛍光分子の範囲を増
やすことである。
本発明の内部参照分子は、第１の発蛍光団から第２の
発蛍光団へのエネルギーの移動を可能にするように、バ
ックボーンコネクターを通して共に結合された、第１の
発蛍光団および第２の発蛍光団を含む。バックボーン
は、核酸増幅反応間に、与えられた特定のフルオレッサ
ー−クエンチャープローブアッセイにおける増幅用ポリ
ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないよう
に選択される。
発蛍光団へのエネルギーの移動を可能にするように、バ
ックボーンコネクターを通して共に結合された、第１の
発蛍光団および第２の発蛍光団を含む。バックボーン
は、核酸増幅反応間に、与えられた特定のフルオレッサ
ー−クエンチャープローブアッセイにおける増幅用ポリ
ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズしないよう
に選択される。
第１の発蛍光団は、オリゴヌクレオチドのようなバッ
クボーンコネクターに共有結合的に結合した適切な発光
特性を有する任意の色素であり得る。オリゴヌクレオチ
ドに共有結合的に結合した発蛍光団の例は、とりわけ、
例えば、Hollandら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:7276−728
0（1991）によって記載されたフルオレッサー−クエン
チャープローブアプローチ、および国際特許出願公開公
報第WO95/21266号に見出され得る。
クボーンコネクターに共有結合的に結合した適切な発光
特性を有する任意の色素であり得る。オリゴヌクレオチ
ドに共有結合的に結合した発蛍光団の例は、とりわけ、
例えば、Hollandら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:7276−728
0（1991）によって記載されたフルオレッサー−クエン
チャープローブアプローチ、および国際特許出願公開公
報第WO95/21266号に見出され得る。
第２の発蛍光団として使用される色素は、蛍光特性が
核酸（特に二本鎖DNA）の存在またはそれとの会合によ
って実質的に影響を受けない蛍光色素を含む。そのよう
な色素は、フルオレッサー−クエンチャープローブに使
用されるどの発蛍光団からもスペクトル分解され得ると
いう基準を満たす任意の蛍光色素を実際含み得る。第１
の発蛍光団として適した色素はまた、第２の発蛍光団と
して適し得る。同様に、第２の発蛍光団として適した色
素はまた、第１の発蛍光団として適し得る。好ましい第
２の発蛍光団は、ローダミン色素およびフルオレセイン
色素を含む。より好ましくは、第２の発蛍光団は、Menc
henら、米国特許第5,188,934号によって開示される後者
である。
核酸（特に二本鎖DNA）の存在またはそれとの会合によ
って実質的に影響を受けない蛍光色素を含む。そのよう
な色素は、フルオレッサー−クエンチャープローブに使
用されるどの発蛍光団からもスペクトル分解され得ると
いう基準を満たす任意の蛍光色素を実際含み得る。第１
の発蛍光団として適した色素はまた、第２の発蛍光団と
して適し得る。同様に、第２の発蛍光団として適した色
素はまた、第１の発蛍光団として適し得る。好ましい第
２の発蛍光団は、ローダミン色素およびフルオレセイン
色素を含む。より好ましくは、第２の発蛍光団は、Menc
henら、米国特許第5,188,934号によって開示される後者
である。
本発明の１つの実施態様では、この第１の発蛍光団お
よび第２の発蛍光団の１つは、Leeら,Nucleic Acid Res
earch,21:3761−3766（1993）によって記載されるよう
に、両方がオリゴヌクレオチド、すなわちバックボーン
コネクターに共有結合的に結合する。より詳細には、フ
ルオレセインが第１の発蛍光団として使用され、そして
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX）が第２の発蛍
光団として使用され、その結果ROX部分はフルオレセイ
ン部分による全ての蛍光発光を実質的に消光する。好ま
しくは、この実施態様において、励起光線はアルゴンイ
オンレーザーの488nmの輝線から生成される。この実施
態様において、好ましくは第１の発蛍光団は、フルオレ
セイン（例えば、６−FAM（Applied Biosystems,Foster
Cityから入手可能））であり、そして第２の発蛍光団
は、テトラメチルローダミン、2',4',5',7',−テトラク
ロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、または６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのいずれかである。
よび第２の発蛍光団の１つは、Leeら,Nucleic Acid Res
earch,21:3761−3766（1993）によって記載されるよう
に、両方がオリゴヌクレオチド、すなわちバックボーン
コネクターに共有結合的に結合する。より詳細には、フ
ルオレセインが第１の発蛍光団として使用され、そして
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX）が第２の発蛍
光団として使用され、その結果ROX部分はフルオレセイ
ン部分による全ての蛍光発光を実質的に消光する。好ま
しくは、この実施態様において、励起光線はアルゴンイ
オンレーザーの488nmの輝線から生成される。この実施
態様において、好ましくは第１の発蛍光団は、フルオレ
セイン（例えば、６−FAM（Applied Biosystems,Foster
Cityから入手可能））であり、そして第２の発蛍光団
は、テトラメチルローダミン、2',4',5',7',−テトラク
ロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、または６−カル
ボキシ−Ｘ−ローダミンのいずれかである。
内部参照のバックボーンコネクターは、第１の発蛍光
団を第２の発蛍光団に非常に接近させるように設計さ
れ、その結果、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団への
効率的なエネルギー移動を可能にする。適切なバックボ
ーンコネクターの設計において、発蛍光団間のエネルギ
ー移動が1/R6（ここで、Ｒは発蛍光団間の距離である）
の関数であることを念頭におくことが重要である。所定
の実施態様に適した距離の選択に関する指針は、蛍光分
子と消光分子（ときにはそれぞれ「ドナー」分子および
「アクセプター」分子としても言及される）との間の共
鳴エネルギー移動に関する多くの参考文献で見出される
（例えば、StryerおよびHaugland,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,58:719−726（1967）;Clegg,Meth.Enzymol.,211:353
−388（1992）;Cardulloら,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:87
90−8794（1988）;Ozakiら（上記で引用）;Haugland
（上記で引用）;Hellerら,Fed.Proc.,46:1968（1987）;
Livakら,PCR Methods and Applications,4:357−362（1
995）など）。バックボーンは通常、ポリマー鎖である
が、必ずしもそうではない。種々のバックボーン（例え
ば、核酸（RNAおよびDNAの両方）、種々の合成ポリヌク
レオチドアナログ（例えば、ここで酸素は硫黄、炭素、
または窒素によって置換され得、リン酸は、硫酸塩また
はカルボン酸塩などによって置換され得る）、ポリペプ
チド、ポリサッカライドなど）が使用され得る。発蛍光
団は、発蛍光団および／またはポリマービルディングブ
ロックの適切な官能化によって、バックボーンに結合さ
れる。種々のバックボーンへの発蛍光団の結合方法の詳
細な記載は、とりわけ、G.HermansonによるBioconjugat
e Techniques,Academic Press,San Diego（1996），欧
州特許出願公報第0 229 943号（1987年公開）、およびJ
uら,Analytical Biochemistry,231:131−140（1995）に
おいて見出され得る。
団を第２の発蛍光団に非常に接近させるように設計さ
れ、その結果、第１の発蛍光団から第２の発蛍光団への
効率的なエネルギー移動を可能にする。適切なバックボ
ーンコネクターの設計において、発蛍光団間のエネルギ
ー移動が1/R6（ここで、Ｒは発蛍光団間の距離である）
の関数であることを念頭におくことが重要である。所定
の実施態様に適した距離の選択に関する指針は、蛍光分
子と消光分子（ときにはそれぞれ「ドナー」分子および
「アクセプター」分子としても言及される）との間の共
鳴エネルギー移動に関する多くの参考文献で見出される
（例えば、StryerおよびHaugland,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,58:719−726（1967）;Clegg,Meth.Enzymol.,211:353
−388（1992）;Cardulloら,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:87
90−8794（1988）;Ozakiら（上記で引用）;Haugland
（上記で引用）;Hellerら,Fed.Proc.,46:1968（1987）;
Livakら,PCR Methods and Applications,4:357−362（1
995）など）。バックボーンは通常、ポリマー鎖である
が、必ずしもそうではない。種々のバックボーン（例え
ば、核酸（RNAおよびDNAの両方）、種々の合成ポリヌク
レオチドアナログ（例えば、ここで酸素は硫黄、炭素、
または窒素によって置換され得、リン酸は、硫酸塩また
はカルボン酸塩などによって置換され得る）、ポリペプ
チド、ポリサッカライドなど）が使用され得る。発蛍光
団は、発蛍光団および／またはポリマービルディングブ
ロックの適切な官能化によって、バックボーンに結合さ
れる。種々のバックボーンへの発蛍光団の結合方法の詳
細な記載は、とりわけ、G.HermansonによるBioconjugat
e Techniques,Academic Press,San Diego（1996），欧
州特許出願公報第0 229 943号（1987年公開）、およびJ
uら,Analytical Biochemistry,231:131−140（1995）に
おいて見出され得る。
バックボーンコネクターは、増幅反応の間、所定の増
幅反応における増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異的
様式で有意にハイブリダイズしないように設計される。
本発明のいくつかの実施態様において、バックボーンコ
ネクターは、増幅プロセスの前または後ろのいずれか
に、増幅用のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし
得る。一般的に、この潜在的な問題は、バックボーンコ
ネクターがポリヌクレオチド（またはその誘導体）であ
る場合にのみ存在する。バックボーンが増幅用の配列に
特異的にハイブリダイズする場合、バックボーンは、フ
ルオレッサー−クエンチャープローブが増幅用のポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする能力を有意に妨害
し得る。バックボーンコネクターとして使用するための
ハイブリダイズしないポリヌクレオチドは、増幅用のポ
リヌクレオチド配列に対する有意な配列相同性を欠くポ
リヌクレオチドを使用することによって、容易に得られ
得る。
幅反応における増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異的
様式で有意にハイブリダイズしないように設計される。
本発明のいくつかの実施態様において、バックボーンコ
ネクターは、増幅プロセスの前または後ろのいずれか
に、増幅用のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし
得る。一般的に、この潜在的な問題は、バックボーンコ
ネクターがポリヌクレオチド（またはその誘導体）であ
る場合にのみ存在する。バックボーンが増幅用の配列に
特異的にハイブリダイズする場合、バックボーンは、フ
ルオレッサー−クエンチャープローブが増幅用のポリヌ
クレオチド配列にハイブリダイズする能力を有意に妨害
し得る。バックボーンコネクターとして使用するための
ハイブリダイズしないポリヌクレオチドは、増幅用のポ
リヌクレオチド配列に対する有意な配列相同性を欠くポ
リヌクレオチドを使用することによって、容易に得られ
得る。
内部参照分子（バックボーンとしてポリヌクレオチド
を有する）は、多くのアプローチ（例えば、Ozakiら,Nu
cleic Acids Research,20:5205−5214（1992）;Agrawal
ら,Nucleic Acids Research,18:5419−5423（1990）；
など）によって合成され得る。そのような合成方法はま
た、フルオレッサー−クエンチャープローブの合成に適
用可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプロー
ブは、ホスホルアミダイト化学を使用した自動化固相DN
A合成機（例えば、Applied Biosystems,Inc.モデル392
または394DNA合成機（Foster City,CA））上で合成され
る。第１および第２の発蛍光団は、反応基を含むヌクレ
オシドホスホルアミダイトモノマーを使用することによ
って、オリゴヌクレオチドの所定のヌクレオチドに共有
結合され得る。例えば、そのような反応基は、リン酸部
分またはリン酸アナログ部分（例えば、Agrawalら（上
記で引用））上、結合が5'末端ヌクレオチドに対するも
のである場合（例えば、Fungら、米国特許第4,757,141
号、またはHobbs Jr.,米国特許第4,997,928号）5'水酸
基部分上に、および塩基部分に存在し得る（例えば、Ru
th,米国特許第4,948,882号;Haralambidisら,Nucleic Ac
ids Research,15:4857−4876（1987）;Urdeaら，米国特
許第5,093,232号;Cruickshank米国特許第5,091,519号;H
obbs Jr.ら，米国特許第5,151,507号などに開示される
ように）。最も好ましくは、ピリミジン部分を有するヌ
クレオチドが誘導体化される。さらに好ましくは、オリ
ゴヌクレオチドプローブの3'末端ヌクレオチドが、核酸
ポリメラーゼによってブロックされるか、または伸長不
可能にされる。そのようなブロッキングは、例えば、Ho
rnおよびUrdea,Tetrahedron Lett.,27:4705（1986）に
よって記載され、そしてClontech Laboratories（Palo
Alto,California）から5'Phosphate−ONTMとして市販さ
れている試薬を介しての、リン酸基の結合によって好都
合に実施される。本発明の好ましい実施態様では、ROX
は内部参照での第２の発蛍光団として使用され、そして
ROX部分は、オリゴヌクレオチド上の3'位に結合され
る。オリゴヌクレオチドへのROXの3'結合は、参考とし
て援用される、米国特許出願第08/593,031号に記載され
る。
を有する）は、多くのアプローチ（例えば、Ozakiら,Nu
cleic Acids Research,20:5205−5214（1992）;Agrawal
ら,Nucleic Acids Research,18:5419−5423（1990）；
など）によって合成され得る。そのような合成方法はま
た、フルオレッサー−クエンチャープローブの合成に適
用可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチドプロー
ブは、ホスホルアミダイト化学を使用した自動化固相DN
A合成機（例えば、Applied Biosystems,Inc.モデル392
または394DNA合成機（Foster City,CA））上で合成され
る。第１および第２の発蛍光団は、反応基を含むヌクレ
オシドホスホルアミダイトモノマーを使用することによ
って、オリゴヌクレオチドの所定のヌクレオチドに共有
結合され得る。例えば、そのような反応基は、リン酸部
分またはリン酸アナログ部分（例えば、Agrawalら（上
記で引用））上、結合が5'末端ヌクレオチドに対するも
のである場合（例えば、Fungら、米国特許第4,757,141
号、またはHobbs Jr.,米国特許第4,997,928号）5'水酸
基部分上に、および塩基部分に存在し得る（例えば、Ru
th,米国特許第4,948,882号;Haralambidisら,Nucleic Ac
ids Research,15:4857−4876（1987）;Urdeaら，米国特
許第5,093,232号;Cruickshank米国特許第5,091,519号;H
obbs Jr.ら，米国特許第5,151,507号などに開示される
ように）。最も好ましくは、ピリミジン部分を有するヌ
クレオチドが誘導体化される。さらに好ましくは、オリ
ゴヌクレオチドプローブの3'末端ヌクレオチドが、核酸
ポリメラーゼによってブロックされるか、または伸長不
可能にされる。そのようなブロッキングは、例えば、Ho
rnおよびUrdea,Tetrahedron Lett.,27:4705（1986）に
よって記載され、そしてClontech Laboratories（Palo
Alto,California）から5'Phosphate−ONTMとして市販さ
れている試薬を介しての、リン酸基の結合によって好都
合に実施される。本発明の好ましい実施態様では、ROX
は内部参照での第２の発蛍光団として使用され、そして
ROX部分は、オリゴヌクレオチド上の3'位に結合され
る。オリゴヌクレオチドへのROXの3'結合は、参考とし
て援用される、米国特許出願第08/593,031号に記載され
る。
本発明の内部分子内での第１の発蛍光団と第２の発蛍
光団の隔離距離は、第１の発蛍光団および第２の発蛍光
団の性質、これらが結合する方法、照明源などに依存し
て変化し得る。第１の発蛍光団および第２の発蛍光団
は、好ましくは、第１の発蛍光団に十分接近している結
果、第１の発蛍光団由来の蛍光の実質的にすべて（例え
ば、90％）が消光されている。代表的には、エネルギー
移動に基づく消光のために、第１の発蛍光団と第２の発
蛍光団との間の距離は10〜100オングストロームの範囲
内であるべきである。好ましくは、第１の発蛍光団と第
２の発蛍光団とは、約４〜10ヌクレオチドにより隔てら
れる。しかし、本発明は、発蛍光団を隔てるヌクレオチ
ドの数が10を越え得る実施態様を含む。好ましくは、第
１または第２の発蛍光団のいずれかは、オリゴヌクレオ
チドプローブの5'末端ヌクレオチドに結合される。第１
または第２の発蛍光団はまた、3'末端ヌクレオチドに結
合され得る。本発明の参照分子の他の実施態様におい
て、第１および第２の発蛍光団は、ポリヌクレオチドの
内部部位で結合される。本発明はまた、２つの発蛍光団
の一方が内部部位に配置され、そして他方の発蛍光団
が、ポリヌクレオチドの末端に結合される実施態様を含
む。
光団の隔離距離は、第１の発蛍光団および第２の発蛍光
団の性質、これらが結合する方法、照明源などに依存し
て変化し得る。第１の発蛍光団および第２の発蛍光団
は、好ましくは、第１の発蛍光団に十分接近している結
果、第１の発蛍光団由来の蛍光の実質的にすべて（例え
ば、90％）が消光されている。代表的には、エネルギー
移動に基づく消光のために、第１の発蛍光団と第２の発
蛍光団との間の距離は10〜100オングストロームの範囲
内であるべきである。好ましくは、第１の発蛍光団と第
２の発蛍光団とは、約４〜10ヌクレオチドにより隔てら
れる。しかし、本発明は、発蛍光団を隔てるヌクレオチ
ドの数が10を越え得る実施態様を含む。好ましくは、第
１または第２の発蛍光団のいずれかは、オリゴヌクレオ
チドプローブの5'末端ヌクレオチドに結合される。第１
または第２の発蛍光団はまた、3'末端ヌクレオチドに結
合され得る。本発明の参照分子の他の実施態様におい
て、第１および第２の発蛍光団は、ポリヌクレオチドの
内部部位で結合される。本発明はまた、２つの発蛍光団
の一方が内部部位に配置され、そして他方の発蛍光団
が、ポリヌクレオチドの末端に結合される実施態様を含
む。
本発明の実施態様は、核酸増幅反応における使用のた
めの、試薬組成物を含む。本組成物は、本発明の内部参
照分子および核酸増幅緩衝液を含む。本明細書中で使用
される場合、用語「核酸増幅緩衝液」は、酵素反応また
は核酸増幅反応のために必要とされる反応を支持する緩
衝水溶液をいう。緩衝液組成の選択は、目的の核酸増幅
反応を触媒するために選択される特定の酵素によって変
化する。核酸増幅技術は、分子生物学の当業者に周知で
ある。適切な緩衝液組成の多くの例は、とりわけ、以下
のような出版物中に存在し得る:PCR:A Practical Appro
ach,第１巻,M.J.McPherson,P.Quirke,G.R.Taylor編,IRL
Press（1991）;PCR:A Practical Approach,第２巻,M.
J.McPherson,P.Quirke,G.R.Taylor編,IRL Press（199
5），およびPCR Primer,A Laboratory Manual,C.W.Diff
enbach,G.S.Dveksler編,Cold Spring Harbor Press（19
95）。Taq DNAポリメラーゼに触媒される増幅反応に適
した核酸増幅緩衝液の１例は以下の通りである:10nM Tr
is（pH8.4）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％ゼラチン,0.
01％NP40,および0.01％Tween。一般的に、本試薬組成物
中の内部参照分子の濃度は、内部参照分子の第２の発蛍
光団から容易に検出可能なシグナルを生成するのに十分
に高い。多くの要素が、本試薬組成物中の内部参照分子
濃度の選択に影響する；そのような要素は、増幅反応物
中のフルオレッサー−クエンチャープローブの量、蛍光
検出器の感度、選択された発蛍光団の量子収量などを含
む。本組成物は、目的の核酸増幅反応に必要とされる１
つ以上のさらなる化合物をさらに含み得、そのような化
合物は以下のものを含む：ヌクレオチド、増幅用鋳型、
フルオレッサー−クエンチャープローブなど。
めの、試薬組成物を含む。本組成物は、本発明の内部参
照分子および核酸増幅緩衝液を含む。本明細書中で使用
される場合、用語「核酸増幅緩衝液」は、酵素反応また
は核酸増幅反応のために必要とされる反応を支持する緩
衝水溶液をいう。緩衝液組成の選択は、目的の核酸増幅
反応を触媒するために選択される特定の酵素によって変
化する。核酸増幅技術は、分子生物学の当業者に周知で
ある。適切な緩衝液組成の多くの例は、とりわけ、以下
のような出版物中に存在し得る:PCR:A Practical Appro
ach,第１巻,M.J.McPherson,P.Quirke,G.R.Taylor編,IRL
Press（1991）;PCR:A Practical Approach,第２巻,M.
J.McPherson,P.Quirke,G.R.Taylor編,IRL Press（199
5），およびPCR Primer,A Laboratory Manual,C.W.Diff
enbach,G.S.Dveksler編,Cold Spring Harbor Press（19
95）。Taq DNAポリメラーゼに触媒される増幅反応に適
した核酸増幅緩衝液の１例は以下の通りである:10nM Tr
is（pH8.4）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％ゼラチン,0.
01％NP40,および0.01％Tween。一般的に、本試薬組成物
中の内部参照分子の濃度は、内部参照分子の第２の発蛍
光団から容易に検出可能なシグナルを生成するのに十分
に高い。多くの要素が、本試薬組成物中の内部参照分子
濃度の選択に影響する；そのような要素は、増幅反応物
中のフルオレッサー−クエンチャープローブの量、蛍光
検出器の感度、選択された発蛍光団の量子収量などを含
む。本組成物は、目的の核酸増幅反応に必要とされる１
つ以上のさらなる化合物をさらに含み得、そのような化
合物は以下のものを含む：ヌクレオチド、増幅用鋳型、
フルオレッサー−クエンチャープローブなど。
本発明の試薬組成物は、濃縮形態で、または使用前に
有意な希釈を必要としない形態で供給され得る。試薬組
成物は、目的のアッセイを実施するために必要とされる
さらなる化合物を加えることによって使用され得、その
ような化合物は、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチ
ド、増幅用鋳型、フルオレッサー−クエンチャープロー
ブなどを含む。必要なさらなる化合物を加えた後、次い
で反応混合物をしかるべく処理（例えば、熱サイクル）
し、その結果、所望の増幅結果を得る。
有意な希釈を必要としない形態で供給され得る。試薬組
成物は、目的のアッセイを実施するために必要とされる
さらなる化合物を加えることによって使用され得、その
ような化合物は、熱安定性ポリメラーゼ、ヌクレオチ
ド、増幅用鋳型、フルオレッサー−クエンチャープロー
ブなどを含む。必要なさらなる化合物を加えた後、次い
で反応混合物をしかるべく処理（例えば、熱サイクル）
し、その結果、所望の増幅結果を得る。
フルオレッサー−クエンチャープローブアッセイおよ
び本受動的内部参照分子を、種々の核酸増幅システムと
ともに使用し得る。一般的に、このアッセイは、エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、またはモ
ニターされる反応過程の間に増加する二本鎖DNA集団の
いずれかの使用を必要とする。本発明のシステムで使用
され得る例示的な増幅スキームは、PCR、リガーゼベー
スの増幅スキーム（例えば、リガーゼ連鎖反応（LC
R））、Ｑ−ベータレプリカーゼベースの増幅スキー
ム、鎖置換増幅（SDA）スキーム（例えば、Walkerら,Nu
cleic Acids Research,20:1691−1696（1992）に記載さ
れる）などを含む。核酸増幅スキームの総括的な説明
は、KellerおよびManak,DNA Probes,第２版（Stockton
Press,New York,1993）によって提供される。本発明の
好ましい実施態様では、本内部参照分子は、フルオレッ
サー−クエンチャープローブを使用するPCRで用いられ
る。
び本受動的内部参照分子を、種々の核酸増幅システムと
ともに使用し得る。一般的に、このアッセイは、エキソ
ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、またはモ
ニターされる反応過程の間に増加する二本鎖DNA集団の
いずれかの使用を必要とする。本発明のシステムで使用
され得る例示的な増幅スキームは、PCR、リガーゼベー
スの増幅スキーム（例えば、リガーゼ連鎖反応（LC
R））、Ｑ−ベータレプリカーゼベースの増幅スキー
ム、鎖置換増幅（SDA）スキーム（例えば、Walkerら,Nu
cleic Acids Research,20:1691−1696（1992）に記載さ
れる）などを含む。核酸増幅スキームの総括的な説明
は、KellerおよびManak,DNA Probes,第２版（Stockton
Press,New York,1993）によって提供される。本発明の
好ましい実施態様では、本内部参照分子は、フルオレッ
サー−クエンチャープローブを使用するPCRで用いられ
る。
本発明はまた、フルオレッサー−クエンチャープロー
ブを使用するポリヌクレオチド増幅反応におけるポリヌ
クレオチド増幅生成物の量を測定するための、改良され
た方法を提供する。本方法は、リアルタイムでモニター
される核酸増幅反応において増幅生成物形成を測定する
ために、特に有利である。本方法は、本発明の方法が増
幅反応物に本発明の内部参照を添加する工程を含むとい
うことを除いては、フルオレッサー−クエンチャープロ
ーブを使用する従来の核酸増幅反応と本質的に同じであ
る。好ましくは、添加工程は反応の開始前（例えば、DN
Aポリメラーゼの添加前）に実施される。内部参照上の
第２の発蛍光団の蛍光は、反応毎に異なるような要素
（例えば、容量または試薬の量）について反応を正規化
するために測定される。従って、フルオレッサー−クエ
ンチャープローブ上の蛍光レポーターと内部参照の第２
の発蛍光団の蛍光強度との比を調べることによって、強
度のみに明らかであるほとんどの系統的変動源の影響が
除去される。
ブを使用するポリヌクレオチド増幅反応におけるポリヌ
クレオチド増幅生成物の量を測定するための、改良され
た方法を提供する。本方法は、リアルタイムでモニター
される核酸増幅反応において増幅生成物形成を測定する
ために、特に有利である。本方法は、本発明の方法が増
幅反応物に本発明の内部参照を添加する工程を含むとい
うことを除いては、フルオレッサー−クエンチャープロ
ーブを使用する従来の核酸増幅反応と本質的に同じであ
る。好ましくは、添加工程は反応の開始前（例えば、DN
Aポリメラーゼの添加前）に実施される。内部参照上の
第２の発蛍光団の蛍光は、反応毎に異なるような要素
（例えば、容量または試薬の量）について反応を正規化
するために測定される。従って、フルオレッサー−クエ
ンチャープローブ上の蛍光レポーターと内部参照の第２
の発蛍光団の蛍光強度との比を調べることによって、強
度のみに明らかであるほとんどの系統的変動源の影響が
除去される。
核酸増幅からの生成物のリアルタイム測定のためのシ
ステムに基本的なことは、フルオレッサー−クエンチャ
ープローブ上の蛍光レポーターと、内部参照上に存在す
る第２の発蛍光団との蛍光強度比の測定である。蛍光レ
ポーターと内部参照の第２の発蛍光団とは、スペクトル
的に分離可能でなくてはならない。すなわち、それらの
それぞれの発光スペクトルは、別々の発光ピークが複合
スペクトル中に観測されるように十分に非オーバーラッ
プでなくてはならない。明らかに、このシステムは、例
えば、単一反応でいくつかの標的核酸の同時増幅をモニ
ターし、その結果多数の蛍光強度比がモニターされるた
めに、多数の蛍光レポーターを含むように一般化され得
る。そのような実施態様での使用のために適した、いく
つかのスペクトル分離可能な色素は、Fungら，米国特許
第4,855,225号;Menchenら，米国特許第5,188,934号;Ber
gotら，国際出願PCT/US90/05565;および類似の参考文献
に開示される。
ステムに基本的なことは、フルオレッサー−クエンチャ
ープローブ上の蛍光レポーターと、内部参照上に存在す
る第２の発蛍光団との蛍光強度比の測定である。蛍光レ
ポーターと内部参照の第２の発蛍光団とは、スペクトル
的に分離可能でなくてはならない。すなわち、それらの
それぞれの発光スペクトルは、別々の発光ピークが複合
スペクトル中に観測されるように十分に非オーバーラッ
プでなくてはならない。明らかに、このシステムは、例
えば、単一反応でいくつかの標的核酸の同時増幅をモニ
ターし、その結果多数の蛍光強度比がモニターされるた
めに、多数の蛍光レポーターを含むように一般化され得
る。そのような実施態様での使用のために適した、いく
つかのスペクトル分離可能な色素は、Fungら，米国特許
第4,855,225号;Menchenら，米国特許第5,188,934号;Ber
gotら，国際出願PCT/US90/05565;および類似の参考文献
に開示される。
本発明の特定の実施態様の実施の際には、内部参照上
の発蛍光団と、フルオレッサー−クエンチャープローブ
アッセイで使用される蛍光レポーターおよびクエンチャ
ーとの間の関係を考慮しなければならない。内部参照の
第２の発蛍光団は、同じアッセイで使用されるフルオレ
ッサー−クエンチャープローブ（単数または複数）上の
クエンチャーと異なっていなければならない。内部参照
の第１の発蛍光団は、フルオレッサー−クエンチャープ
ローブ上のレポーターとして使用される発蛍光団と同じ
か、または異なり得る。
の発蛍光団と、フルオレッサー−クエンチャープローブ
アッセイで使用される蛍光レポーターおよびクエンチャ
ーとの間の関係を考慮しなければならない。内部参照の
第２の発蛍光団は、同じアッセイで使用されるフルオレ
ッサー−クエンチャープローブ（単数または複数）上の
クエンチャーと異なっていなければならない。内部参照
の第１の発蛍光団は、フルオレッサー−クエンチャープ
ローブ上のレポーターとして使用される発蛍光団と同じ
か、または異なり得る。
本発明の別の局面は、本発明の改良された増幅方法を
実施するためのキットを提供することである。キット
は、本発明の方法の実施を、実施するためにより再現性
があり、そしてより容易なものにする。キットは、一般
的には本発明を実施するために必要とされる２つ以上の
試薬を含む。キットは、本方法の実施を簡便にするため
に前もって測定した量の試薬を供給し得る。さらに、代
表的には、キットは本発明の方法を実施するための詳細
な使用説明書を含む。本発明のキットの１つの実施態様
で、キットは、本発明の内部参照および１つ以上の以下
の品目を含む：フルオレッサー−クエンチャープローブ
アッセイにおいて使用するのに適した（すなわち、5'−
3'エキソヌクレアーゼ活性を有する）、フルオレッサー
−クエンチャープローブまたは熱安定性DNAポリメラー
ゼ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）。本発明のキット
は、本方法を実施するために必要なさらなる試薬をさら
に含み得、そのような試薬は、dNTP混合物、緩衝液、分
子サイズ標準、ワックスビーズなどを含むが、これらに
限定されない。
実施するためのキットを提供することである。キット
は、本発明の方法の実施を、実施するためにより再現性
があり、そしてより容易なものにする。キットは、一般
的には本発明を実施するために必要とされる２つ以上の
試薬を含む。キットは、本方法の実施を簡便にするため
に前もって測定した量の試薬を供給し得る。さらに、代
表的には、キットは本発明の方法を実施するための詳細
な使用説明書を含む。本発明のキットの１つの実施態様
で、キットは、本発明の内部参照および１つ以上の以下
の品目を含む：フルオレッサー−クエンチャープローブ
アッセイにおいて使用するのに適した（すなわち、5'−
3'エキソヌクレアーゼ活性を有する）、フルオレッサー
−クエンチャープローブまたは熱安定性DNAポリメラー
ゼ（例えば、Taq DNAポリメラーゼ）。本発明のキット
は、本方法を実施するために必要なさらなる試薬をさら
に含み得、そのような試薬は、dNTP混合物、緩衝液、分
子サイズ標準、ワックスビーズなどを含むが、これらに
限定されない。
リアルタイム検出システムは、試料インターフェース
（すなわち、閉鎖反応チャンバーに操作的に連結される
光学構成要素）を備え、そのシステムは、励起光線を反
応混合物中に集束させるためおよび生じた蛍光を収集す
るためのレンズ、ならびに励起光線を光源からレンズ
へ、そして蛍光シグナルをレンズから検出器および分析
器へと両方に伝達するための光ファイバを含む。好まし
くは、反応混合物は、閉鎖反応チャンバー内に収容さ
れ、交差試料汚染（すなわち、いわゆる「キャリーオー
バー」）を防ぐ。それゆえ、レンズは、励起光線を集束
させ、そして閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通った蛍
光を収集する。上記で言及されるように、好ましい反応
チャンバーは、チューブ（例えば、従来のエッペンドル
フチューブの外形および容量を有する）である。チュー
ブは、反応混合物が加えられた後に、キャップをチュー
ブの開放末端に取り付けることによって閉鎖される。PC
R用の試料インターフェースの好ましい実施態様では、
レンズは図１に図示されるように、励起光線を方向づ
け、そしてチューブのキャップを通して蛍光を収集す
る。図示された配置では、第１の末端光ファイバ２は、
フェルール４、ハウジング６、およびプレート10によっ
てレンズ８と共軸配向に保持される。第２の末端光ファ
イバ２（示されていない）は、以下でより十分に議論さ
れる光源ならびに検出器および分析器と操作的に連結さ
れる。光ファイバ２の端面とレンズ８との間の距離は、
いくつかの要素（光ファイバの開口数、チューブ18の外
形、レンズ８の焦点距離、レンズ８の直径などを含む）
によって決定される。任意の特定の実施態様においてそ
のような変数の値を選択するための指針は、光学設計に
関する標準的なテキスト（例えば、Optics Guide 5（Me
lles Griot,Irvine,CA,1990）、または類似の参考文献
で容易に見出される。図示された実施態様で、レンズ８
は、8mmの直径を有し、そしてEdmund Scientific（Barr
ington,NJ）から入手可能な材料BK7から構成される。光
ファイバ２は、２つの開口数を有する。好ましくは、こ
の設計は、励起光線28の反応混合物22への最大伝達を可
能にする。例えば、レンズ８、光ファイバ２の開口数、
および光ファイバ２の末端とレンズ８との間の距離は、
レンズ８の直径が、励起光線28の直径と同じかまたはそ
れより大きくなるように選択され、ここで光線28は（図
１に図示されるように）レンズに衝突する。励起光線28
は、キャップ16、間隙24、および反応混合物22の上面26
を通過して、表面26のちょうど下で光ファイバのほぼ１
〜３倍（例えば１〜3mm）の領域に集束する。この集束
の程度は、本実施態様の重要な特色ではない；集束の程
度は、試料インターフェースを市販のサーマルサイクラ
ーの試料ホルダーの外形および寸法に合わせたことの結
果である。他の実施態様では、外形および寸法は、反応
混合物へのより鋭い集束を可能にし得る。
（すなわち、閉鎖反応チャンバーに操作的に連結される
光学構成要素）を備え、そのシステムは、励起光線を反
応混合物中に集束させるためおよび生じた蛍光を収集す
るためのレンズ、ならびに励起光線を光源からレンズ
へ、そして蛍光シグナルをレンズから検出器および分析
器へと両方に伝達するための光ファイバを含む。好まし
くは、反応混合物は、閉鎖反応チャンバー内に収容さ
れ、交差試料汚染（すなわち、いわゆる「キャリーオー
バー」）を防ぐ。それゆえ、レンズは、励起光線を集束
させ、そして閉鎖反応チャンバーの壁の一部を通った蛍
光を収集する。上記で言及されるように、好ましい反応
チャンバーは、チューブ（例えば、従来のエッペンドル
フチューブの外形および容量を有する）である。チュー
ブは、反応混合物が加えられた後に、キャップをチュー
ブの開放末端に取り付けることによって閉鎖される。PC
R用の試料インターフェースの好ましい実施態様では、
レンズは図１に図示されるように、励起光線を方向づ
け、そしてチューブのキャップを通して蛍光を収集す
る。図示された配置では、第１の末端光ファイバ２は、
フェルール４、ハウジング６、およびプレート10によっ
てレンズ８と共軸配向に保持される。第２の末端光ファ
イバ２（示されていない）は、以下でより十分に議論さ
れる光源ならびに検出器および分析器と操作的に連結さ
れる。光ファイバ２の端面とレンズ８との間の距離は、
いくつかの要素（光ファイバの開口数、チューブ18の外
形、レンズ８の焦点距離、レンズ８の直径などを含む）
によって決定される。任意の特定の実施態様においてそ
のような変数の値を選択するための指針は、光学設計に
関する標準的なテキスト（例えば、Optics Guide 5（Me
lles Griot,Irvine,CA,1990）、または類似の参考文献
で容易に見出される。図示された実施態様で、レンズ８
は、8mmの直径を有し、そしてEdmund Scientific（Barr
ington,NJ）から入手可能な材料BK7から構成される。光
ファイバ２は、２つの開口数を有する。好ましくは、こ
の設計は、励起光線28の反応混合物22への最大伝達を可
能にする。例えば、レンズ８、光ファイバ２の開口数、
および光ファイバ２の末端とレンズ８との間の距離は、
レンズ８の直径が、励起光線28の直径と同じかまたはそ
れより大きくなるように選択され、ここで光線28は（図
１に図示されるように）レンズに衝突する。励起光線28
は、キャップ16、間隙24、および反応混合物22の上面26
を通過して、表面26のちょうど下で光ファイバのほぼ１
〜３倍（例えば１〜3mm）の領域に集束する。この集束
の程度は、本実施態様の重要な特色ではない；集束の程
度は、試料インターフェースを市販のサーマルサイクラ
ーの試料ホルダーの外形および寸法に合わせたことの結
果である。他の実施態様では、外形および寸法は、反応
混合物へのより鋭い集束を可能にし得る。
本発明のレンズは、特定の実施態様に依存して種々の
形状を有し得る。例えば、レンズは、球形、切断切形、
円柱状、切断円柱状、扁球形、または切断扁球形などで
あり得、そして任意の適切に透明な屈折材料（例えば、
Hlousek,米国特許第5,037,199号;Hoppeら，米国特許第
4,747,87号;Moringら，米国特許第5,239,360号;Hirschf
ield,米国特許第4,577,109号；または類似の参考文献で
開示されるような材料）から構成され得る。
形状を有し得る。例えば、レンズは、球形、切断切形、
円柱状、切断円柱状、扁球形、または切断扁球形などで
あり得、そして任意の適切に透明な屈折材料（例えば、
Hlousek,米国特許第5,037,199号;Hoppeら，米国特許第
4,747,87号;Moringら，米国特許第5,239,360号;Hirschf
ield,米国特許第4,577,109号；または類似の参考文献で
開示されるような材料）から構成され得る。
励起光線28によって生成される蛍光は、励起光線28に
よって規定されるのとほぼ同じ光路にそってレンズ８に
よって収集され、そしてシステムの光学的分離構成要素
および分析構成要素への伝達のための光ファイバ２の末
端に集束され得る。
よって規定されるのとほぼ同じ光路にそってレンズ８に
よって収集され、そしてシステムの光学的分離構成要素
および分析構成要素への伝達のための光ファイバ２の末
端に集束され得る。
さらに好ましくは、試料インターフェースはまた、励
起光線および反応混合物成分の凝縮由来のシグナルの散
乱および／または吸収による変動を減らすために、光の
透過に使用される反応チャンバーの壁の一部を加熱する
ための手段を含む。図１の実施態様では、光の透過に使
用される反応チャンバー（チューブ18）壁の一部は、キ
ャップ16である。従って、発熱体12および熱伝導性プラ
テン14が、キャップ16を加熱するために使用される。好
ましくは、発熱体12は、抵抗発熱体および温度センサー
を備え、温度センサーはキャップ16の温度のプログラム
制御を可能にする。キャップ16は、反応混合物の成分の
凝縮点より高い温度に維持される。一般的に、キャップ
16は,94℃〜110℃の範囲の温度に維持され得る。好まし
くは、キャップ16は、約102℃〜約105℃の範囲の温度に
維持される。なぜなら、反応混合物中の主な溶媒は、通
常、水であるからである。より好ましくは、キャップ16
は、130℃に維持される。好ましくは、熱サイクルを使
用する実施態様では、上記のキャップ加熱構成要素は、
反応混合物22の温度を循環的に制御するために使用され
る熱伝導性構成要素20から、熱的に隔離される。
起光線および反応混合物成分の凝縮由来のシグナルの散
乱および／または吸収による変動を減らすために、光の
透過に使用される反応チャンバーの壁の一部を加熱する
ための手段を含む。図１の実施態様では、光の透過に使
用される反応チャンバー（チューブ18）壁の一部は、キ
ャップ16である。従って、発熱体12および熱伝導性プラ
テン14が、キャップ16を加熱するために使用される。好
ましくは、発熱体12は、抵抗発熱体および温度センサー
を備え、温度センサーはキャップ16の温度のプログラム
制御を可能にする。キャップ16は、反応混合物の成分の
凝縮点より高い温度に維持される。一般的に、キャップ
16は,94℃〜110℃の範囲の温度に維持され得る。好まし
くは、キャップ16は、約102℃〜約105℃の範囲の温度に
維持される。なぜなら、反応混合物中の主な溶媒は、通
常、水であるからである。より好ましくは、キャップ16
は、130℃に維持される。好ましくは、熱サイクルを使
用する実施態様では、上記のキャップ加熱構成要素は、
反応混合物22の温度を循環的に制御するために使用され
る熱伝導性構成要素20から、熱的に隔離される。
上記の構成要素に適した材料の選択は、機械工学の当
業者に周知である。材料選択のための例示的な基準は、
（Ｉ）熱膨張の程度（特に、熱サイクルを使用する増幅
スキームの場合）、および光学的構成要素の配列へのそ
の影響、（ii）使用される励起波長および発蛍光団発光
波長における光透過特性、（iii）反応混合物の成分に
関しての反応チャンバーの化学的不活性、（iv）重要な
反応成分（例えば、ポリメラーゼ、標的核酸）がチャン
バー壁に吸着される傾向の程度、（ｖ）光路中の蛍光物
質の最小化、などを含む。代表的には、増幅反応混合物
を含むチューブは、ポリプロピレンまたは類似の材料か
ら製造される。
業者に周知である。材料選択のための例示的な基準は、
（Ｉ）熱膨張の程度（特に、熱サイクルを使用する増幅
スキームの場合）、および光学的構成要素の配列へのそ
の影響、（ii）使用される励起波長および発蛍光団発光
波長における光透過特性、（iii）反応混合物の成分に
関しての反応チャンバーの化学的不活性、（iv）重要な
反応成分（例えば、ポリメラーゼ、標的核酸）がチャン
バー壁に吸着される傾向の程度、（ｖ）光路中の蛍光物
質の最小化、などを含む。代表的には、増幅反応混合物
を含むチューブは、ポリプロピレンまたは類似の材料か
ら製造される。
図１に示される試料インターフェースは、個々に使用
され得るか、またはそれは、図２に図示されるように、
単一の機器中の多数の同一なインターフェースの一つと
して使用され得る。図示された実施態様では、ホルダー
30に配置される個々の試料インターフェース31（それ
は、例えば、Mossaら，欧州特許出願第91311090.4号，
公開番号第0488769A2号に記載されているような、サー
マルサイクラー32と連結される熱ブロックであり得る）
は、光ファイバ34によって光ファイバマルチプレクサー
36に接続され、それは個々の光ファイバとポート35との
間の伝達を、例えば、プログラムされたマイクロプロセ
ッサーを介して使用者の制御下で選択的に可能にする。
好ましい配置では、励起光線41は、光源52およびコント
ローラー54によって生成され、光線スプリッター40を通
過し、そしてポート35上にレンズ38によって集束され、
ここでそれは続いて光ファイバマルチプレクサー36によ
って、光ファイバ34の各々の予め決定されたセットまた
はサブセットに向けられる。逆に、反応チャンバー中で
生成される蛍光シグナルは、レンズ８によって収集さ
れ、そして光ファイバに集束され、それは次には、おそ
らく光ファイバマルチプレクサーを介して、シグナルを
検出手段および分析手段に伝達する。図２に戻ると、試
料インターフェースによって収集された蛍光シグナル
は、光ファイバマルチプレクサー36に向けられ、そこで
それは、ポート35を通して現れ、そしてレンズ38によっ
て収集および平行化される。レンズ38は、蛍光シグナル
を光線スプリッター40に向け、それは次にはシグナルを
カットオフフィルター42を通して選択的に向けられ、そ
のことは励起光線からの光がシグナル検出構成要素に到
達するのを防ぐ。光線スプリッター40は、従来の二色性
ミラー、励起光線を通す開口部を有する十分に反射する
ミラー（例えば、米国特許第4,577,109号で開示される
ようなミラー）、または類似の構成要素であり得る。カ
ットオフフィルター42を通過した後、蛍光シグナルは、
レンズ44によってスペクトル分析器に向けられ、それは
蛍光シグナルをスペクトルに分離し、そしてシグナルの
多数のスペクトル成分の強度を測定する。代表的には、
スペクトル分析器は、蛍光シグナルを、そのスペクトル
成分に分離するための手段（例えば、プリズム、回折格
子など）ならびに光検出器のアレイ（例えば、ダイオー
ドアレイ、電荷結合素子（CCD）システム、帯域フィル
ターおよび光電子増倍管のアレイなど）に分けるための
方法を備える。図２の好ましい実施態様では、スペクト
ル分析器は、回折格子46（例えば、model CP−140,Jobi
n−Yvon,NJ）およびCCD配列48（例えば、モデルS2135 P
rinceton Instrument,NJ）を備え、これはCCDコントロ
ーラー50に連結される。
され得るか、またはそれは、図２に図示されるように、
単一の機器中の多数の同一なインターフェースの一つと
して使用され得る。図示された実施態様では、ホルダー
30に配置される個々の試料インターフェース31（それ
は、例えば、Mossaら，欧州特許出願第91311090.4号，
公開番号第0488769A2号に記載されているような、サー
マルサイクラー32と連結される熱ブロックであり得る）
は、光ファイバ34によって光ファイバマルチプレクサー
36に接続され、それは個々の光ファイバとポート35との
間の伝達を、例えば、プログラムされたマイクロプロセ
ッサーを介して使用者の制御下で選択的に可能にする。
好ましい配置では、励起光線41は、光源52およびコント
ローラー54によって生成され、光線スプリッター40を通
過し、そしてポート35上にレンズ38によって集束され、
ここでそれは続いて光ファイバマルチプレクサー36によ
って、光ファイバ34の各々の予め決定されたセットまた
はサブセットに向けられる。逆に、反応チャンバー中で
生成される蛍光シグナルは、レンズ８によって収集さ
れ、そして光ファイバに集束され、それは次には、おそ
らく光ファイバマルチプレクサーを介して、シグナルを
検出手段および分析手段に伝達する。図２に戻ると、試
料インターフェースによって収集された蛍光シグナル
は、光ファイバマルチプレクサー36に向けられ、そこで
それは、ポート35を通して現れ、そしてレンズ38によっ
て収集および平行化される。レンズ38は、蛍光シグナル
を光線スプリッター40に向け、それは次にはシグナルを
カットオフフィルター42を通して選択的に向けられ、そ
のことは励起光線からの光がシグナル検出構成要素に到
達するのを防ぐ。光線スプリッター40は、従来の二色性
ミラー、励起光線を通す開口部を有する十分に反射する
ミラー（例えば、米国特許第4,577,109号で開示される
ようなミラー）、または類似の構成要素であり得る。カ
ットオフフィルター42を通過した後、蛍光シグナルは、
レンズ44によってスペクトル分析器に向けられ、それは
蛍光シグナルをスペクトルに分離し、そしてシグナルの
多数のスペクトル成分の強度を測定する。代表的には、
スペクトル分析器は、蛍光シグナルを、そのスペクトル
成分に分離するための手段（例えば、プリズム、回折格
子など）ならびに光検出器のアレイ（例えば、ダイオー
ドアレイ、電荷結合素子（CCD）システム、帯域フィル
ターおよび光電子増倍管のアレイなど）に分けるための
方法を備える。図２の好ましい実施態様では、スペクト
ル分析器は、回折格子46（例えば、model CP−140,Jobi
n−Yvon,NJ）およびCCD配列48（例えば、モデルS2135 P
rinceton Instrument,NJ）を備え、これはCCDコントロ
ーラー50に連結される。
フルオレセインおよびテトラメチルローダミンからの
蛍光シグナルを分析するのに適した例示的なCCDアレイ
は、500nm〜650nmのスペクトルの領域に広がる21個の収
集ビンに分配される。各ビンは、8.5nm窓を越える光を
収集する。明らかに、多くの代替配置もまた、使用され
得る。スペクトル分析のためのCCDアレイの例示的応用
は、Kargerら,Nucleic Acids Research,19:4955−4962
（1991）に記載される。
蛍光シグナルを分析するのに適した例示的なCCDアレイ
は、500nm〜650nmのスペクトルの領域に広がる21個の収
集ビンに分配される。各ビンは、8.5nm窓を越える光を
収集する。明らかに、多くの代替配置もまた、使用され
得る。スペクトル分析のためのCCDアレイの例示的応用
は、Kargerら,Nucleic Acids Research,19:4955−4962
（1991）に記載される。
スペクトル分析器によって収集されるデータに基いて
蛍光シグナルを分析することが望ましい。なぜなら、１
つ以上のレポーター発蛍光団（フルオレッサー−クエン
チャープローブの）および第２の発蛍光団（内部参照上
の）からのシグナルの成分（そこから強度比が計算され
る）は、同時に、そして複数の光線スプリッター、フィ
ルター、および光電子増倍管に基づくシステムで（例え
ば、誤整列によって）生じ得る波長特異的なシステムの
変動の導入なしに分析され得るからである。また、スペ
クトル分析器は、「仮想フィルター」または光検出器の
アレイから生成されるデータのプログラムされた操作の
使用を可能にし、ここで複数の不連続な波長範囲は、連
結されたマイクロプロセッサーを介してプログラム可能
な制御下で（物理的バンドパスフィルターと類似して）
サンプリングされる。この能力は、第１および第２の発
蛍光団としての色素の選択における高度の柔軟性を可能
にする。
蛍光シグナルを分析することが望ましい。なぜなら、１
つ以上のレポーター発蛍光団（フルオレッサー−クエン
チャープローブの）および第２の発蛍光団（内部参照上
の）からのシグナルの成分（そこから強度比が計算され
る）は、同時に、そして複数の光線スプリッター、フィ
ルター、および光電子増倍管に基づくシステムで（例え
ば、誤整列によって）生じ得る波長特異的なシステムの
変動の導入なしに分析され得るからである。また、スペ
クトル分析器は、「仮想フィルター」または光検出器の
アレイから生成されるデータのプログラムされた操作の
使用を可能にし、ここで複数の不連続な波長範囲は、連
結されたマイクロプロセッサーを介してプログラム可能
な制御下で（物理的バンドパスフィルターと類似して）
サンプリングされる。この能力は、第１および第２の発
蛍光団としての色素の選択における高度の柔軟性を可能
にする。
一般的に、検出手段および分析手段は、レポーターお
よび内部参照発蛍光団によって生成されるシグナルの強
度比を反映する読出しを提供する、任意の検出装置であ
り得る。そのような装置は、米国特許第4,577,109号お
よび同第4,786,886号、ならびにThe Photonics Design
＆ Applications Handbook,第39版（Laurin Publishing
Co.,Pittsfield,MA,1993）のような参考文献に例示さ
れるように、当該分野で周知である。
よび内部参照発蛍光団によって生成されるシグナルの強
度比を反映する読出しを提供する、任意の検出装置であ
り得る。そのような装置は、米国特許第4,577,109号お
よび同第4,786,886号、ならびにThe Photonics Design
＆ Applications Handbook,第39版（Laurin Publishing
Co.,Pittsfield,MA,1993）のような参考文献に例示さ
れるように、当該分野で周知である。
好ましくは、本発明のシステムはPCRをモニターする
ために使用されるが、それはまた、LCRのような種々の
他の増幅スキームに使用され得る。PCRを実施するため
の説明および指示は、この主題に関する多数の文献（例
えば、Innisら（上記で引用）およびMcPhersonら（上記
で引用）を含む）に提供される。簡潔には、PCRにおい
て２つのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによ
って触媒される一連の合成反応のためのプライマーとし
て使用される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的
には異なる配列を有し、そして（Ｉ）鋳型DNAまたは標
的DNAの逆鎖に存在する配列、および（ii）増幅されるD
NAのセグメントに隣接する配列に相補的である。標的DN
Aはまず、２つのオリゴヌクレオチドおよび４つのデオ
キシヌクレオシド三リン酸（dNTP）の各々の大モル過剰
の存在下で加熱することによって、変性される。次い
で、反応混合物は、オリゴヌクレオチドをそれらの標的
配列にアニールするのを可能にする温度まで冷却され、
その後アニーリングされたプライマーはDNAポリメラー
ゼを用いて伸長される。次いで、変性、アニーリング、
および伸長のサイクルは多数回（代表的には、25〜40
回）繰り返される。１回の増幅の生成物は、次回の標的
核酸として働くので、各連続したサイクルは、標的DN
A、すなわち増幅生成物の量を本質的に２倍にする。
ために使用されるが、それはまた、LCRのような種々の
他の増幅スキームに使用され得る。PCRを実施するため
の説明および指示は、この主題に関する多数の文献（例
えば、Innisら（上記で引用）およびMcPhersonら（上記
で引用）を含む）に提供される。簡潔には、PCRにおい
て２つのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼによ
って触媒される一連の合成反応のためのプライマーとし
て使用される。これらのオリゴヌクレオチドは、代表的
には異なる配列を有し、そして（Ｉ）鋳型DNAまたは標
的DNAの逆鎖に存在する配列、および（ii）増幅されるD
NAのセグメントに隣接する配列に相補的である。標的DN
Aはまず、２つのオリゴヌクレオチドおよび４つのデオ
キシヌクレオシド三リン酸（dNTP）の各々の大モル過剰
の存在下で加熱することによって、変性される。次い
で、反応混合物は、オリゴヌクレオチドをそれらの標的
配列にアニールするのを可能にする温度まで冷却され、
その後アニーリングされたプライマーはDNAポリメラー
ゼを用いて伸長される。次いで、変性、アニーリング、
および伸長のサイクルは多数回（代表的には、25〜40
回）繰り返される。１回の増幅の生成物は、次回の標的
核酸として働くので、各連続したサイクルは、標的DN
A、すなわち増幅生成物の量を本質的に２倍にする。
明らかに、第１の発蛍光団は、第２の発蛍光団の代わ
りに別の非蛍光消光分子を有するオリゴヌクレオチドプ
ローブに結合される、上記の関連する実施態様が使用さ
れ得る。そのような実施態様では、第２の発蛍光団は、
増幅生成物と相互作用しない、実質的に任意のスペクト
ル分離可能な蛍光色素であり得る。
りに別の非蛍光消光分子を有するオリゴヌクレオチドプ
ローブに結合される、上記の関連する実施態様が使用さ
れ得る。そのような実施態様では、第２の発蛍光団は、
増幅生成物と相互作用しない、実質的に任意のスペクト
ル分離可能な蛍光色素であり得る。
上記に記載した本発明は、以下の実施例を参考にする
とよりよく理解され得る。実施例は、例示のために提供
され、そして本発明の限定として解釈されるべきではな
い。
とよりよく理解され得る。実施例は、例示のために提供
され、そして本発明の限定として解釈されるべきではな
い。
実験
標的DNAの種々の出発濃度からの−アクチンをコードす
るDNAのPCR増幅のリアルタイムモニタリング ヒト−アクチンをコードする標的DNAの296塩基対セグ
メントを、PCRによって、標的DNAの５×103〜１×106コ
ピーの範囲の種々の出発量から増幅した。以下のプライ
マーおよびプローブを使用した： ここで「FAM」は、フルオレセインの６位炭素に結合
するNHS−エステル基を、オリゴヌクレオチドの5'末端
デオキシアデノシンに結合した5'アミノリン酸とFung
ら，米国特許第5,212,304号に従って反応させることに
よってオリゴヌクレオチドに結合したフルオレセイン分
子を示し；そしてここで「TMR」は、Urdeaら，米国特許
第5,093,232号によって開示されるアミノ連結剤を介し
て隣接したチミジンの塩基部分に結合したテトラメチル
ローダミン分子を示す。
るDNAのPCR増幅のリアルタイムモニタリング ヒト−アクチンをコードする標的DNAの296塩基対セグ
メントを、PCRによって、標的DNAの５×103〜１×106コ
ピーの範囲の種々の出発量から増幅した。以下のプライ
マーおよびプローブを使用した： ここで「FAM」は、フルオレセインの６位炭素に結合
するNHS−エステル基を、オリゴヌクレオチドの5'末端
デオキシアデノシンに結合した5'アミノリン酸とFung
ら，米国特許第5,212,304号に従って反応させることに
よってオリゴヌクレオチドに結合したフルオレセイン分
子を示し；そしてここで「TMR」は、Urdeaら，米国特許
第5,093,232号によって開示されるアミノ連結剤を介し
て隣接したチミジンの塩基部分に結合したテトラメチル
ローダミン分子を示す。
PCRを、以下の成分を有する0.2mLのMicroAmpチューブ
（Perkin−Elmer,Norwalk,CT）中で実施した:10mM Tris
−HCl（pH8.3）、50mM KCl、3.5mM MgCl2、200Mの各ヌ
クレオシド三リン酸（米国特許第5,035,996号に従っ
て、キャリーオーバー汚染を防ぐために、dTTPをdUTPで
置換して）、300nMの各正方向プライマーおよび逆方向
プライマー、0.05U/LのAmpliTaqTM（Perkin−Elmer,Nor
walk,CT）。この混合物に、５μＬのRaji DNA（Applied
Biosystems,Foster City,CA）を10ng/μＬで、５μＬ
のプローブを2Mで、および１μＬのウラシルＮ−グルコ
シラーゼを１ユニット／μＬで加え、反応容量を51μＬ
にした。加熱および冷却のサイクルを、本発明の試料イ
ンターフェース構成要素を含む試料ホルダーカバーを取
り付けたモデル9600 Thermal Cycler（Perkin−Elmer,N
orwalk,CT）中で実施した。以下の温度プロフィールを
使用した:50℃で２分間保持;95℃で10分間保持；以下の
温度を通すサイクルを40回:92℃で15秒間、54℃で15秒
間、72℃で１分間；その後、72℃で保持。
（Perkin−Elmer,Norwalk,CT）中で実施した:10mM Tris
−HCl（pH8.3）、50mM KCl、3.5mM MgCl2、200Mの各ヌ
クレオシド三リン酸（米国特許第5,035,996号に従っ
て、キャリーオーバー汚染を防ぐために、dTTPをdUTPで
置換して）、300nMの各正方向プライマーおよび逆方向
プライマー、0.05U/LのAmpliTaqTM（Perkin−Elmer,Nor
walk,CT）。この混合物に、５μＬのRaji DNA（Applied
Biosystems,Foster City,CA）を10ng/μＬで、５μＬ
のプローブを2Mで、および１μＬのウラシルＮ−グルコ
シラーゼを１ユニット／μＬで加え、反応容量を51μＬ
にした。加熱および冷却のサイクルを、本発明の試料イ
ンターフェース構成要素を含む試料ホルダーカバーを取
り付けたモデル9600 Thermal Cycler（Perkin−Elmer,N
orwalk,CT）中で実施した。以下の温度プロフィールを
使用した:50℃で２分間保持;95℃で10分間保持；以下の
温度を通すサイクルを40回:92℃で15秒間、54℃で15秒
間、72℃で１分間；その後、72℃で保持。
図３は、上記で指示薬として使用されるフルオレセイ
ンおよびテトラメチルローダミン色素、ならびにシステ
ム内の外部供給源による蛍光の発光スペクトルを示すデ
ータを図示する。
ンおよびテトラメチルローダミン色素、ならびにシステ
ム内の外部供給源による蛍光の発光スペクトルを示すデ
ータを図示する。
図４は、フルオレセイン蛍光強度およびテトラメチル
ローダミン蛍光強度をサイクル数の関数として示すデー
タを図示する。強度における高頻度の振動は、２つの色
素の蛍光発光の温度依存性に影響を反映する。サイクル
10〜サイクル28での両方の色素の基底線蛍光における増
加は、システムに基づく変動である。図５において、同
じデータ由来のフルオレセイン対テトラメチルローダミ
ン蛍光強度比を示しており、システムに基づく変動を除
去し、そして読出しシグナルにおけるゆらぎのRMS、す
なわち蛍光強度の比は、測定した比率の平均の大きさの
１％未満である。
ローダミン蛍光強度をサイクル数の関数として示すデー
タを図示する。強度における高頻度の振動は、２つの色
素の蛍光発光の温度依存性に影響を反映する。サイクル
10〜サイクル28での両方の色素の基底線蛍光における増
加は、システムに基づく変動である。図５において、同
じデータ由来のフルオレセイン対テトラメチルローダミ
ン蛍光強度比を示しており、システムに基づく変動を除
去し、そして読出しシグナルにおけるゆらぎのRMS、す
なわち蛍光強度の比は、測定した比率の平均の大きさの
１％未満である。
図６は、図に示されるように、5000標的分子〜10標的
分子の範囲の量から出発した−アクチンDNAのPCRからの
データを示す。
分子の範囲の量から出発した−アクチンDNAのPCRからの
データを示す。
参考としての援用
本出願は、本明細書中で言及されるすべての刊行物お
よび特許を参考として援用する。
よび特許を参考として援用する。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：リンカーン ジェイ． マックブライ
ド，ケニス リバック （ii）発明の名称：核酸増幅生成物のリアルタイム検
出のためのシステム （iii）配列数:3 （iv）連絡住所： （Ａ）住所：スコット アール．ボルトナー，パー
キン−エルマー，インコーポレイション （Ｂ）番地：リンカーン センター ドライブ 85
0 （Ｃ）市：フォスター シティー （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94404 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型:3.5インチディスク （Ｂ）コンピューター:IBM互換用 （Ｃ）OS:ウインドウズ3.1/DOS5.0 （Ｄ）ソフトウェア：ウインドウズ マイクロソフ
ト ワード,2.0版 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：同日出願 （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）名称：スコット アール．ボルトナー （Ｂ）登録番号:34,298 （Ｃ）照会／記録番号:4310 （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（415）638−6245 （Ｂ）テレファックス：（415）638−6071 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3:
ド，ケニス リバック （ii）発明の名称：核酸増幅生成物のリアルタイム検
出のためのシステム （iii）配列数:3 （iv）連絡住所： （Ａ）住所：スコット アール．ボルトナー，パー
キン−エルマー，インコーポレイション （Ｂ）番地：リンカーン センター ドライブ 85
0 （Ｃ）市：フォスター シティー （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94404 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型:3.5インチディスク （Ｂ）コンピューター:IBM互換用 （Ｃ）OS:ウインドウズ3.1/DOS5.0 （Ｄ）ソフトウェア：ウインドウズ マイクロソフ
ト ワード,2.0版 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：同日出願 （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）名称：スコット アール．ボルトナー （Ｂ）登録番号:34,298 （Ｃ）照会／記録番号:4310 （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（415）638−6245 （Ｂ）テレファックス：（415）638−6071 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:25ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:26ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 マックブライド，リンカーン ジェイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94002，ベルモント，アラメダ デ ラ
ス プルガス 400
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
Claims (21)
- 【請求項１】試薬組成物であって、該組成物は、核酸増
幅緩衝液、および内部参照分子を含み、該内部参照分子
は、 第１の発蛍光団、 第２の発蛍光団、および 核酸増幅条件下で増幅用ポリヌクレオチドに、配列特異
的な様式でハイブリダイズしない、バックボーンコネク
ター を含み、ここで該バックボーンコネクターは、該第１の
発蛍光団および該第２の発蛍光団と、該第１の発蛍光団
から該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にする
ように結合している、試薬組成物。 - 【請求項２】前記バックボーンコネクターがポリヌクレ
オチドである、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個の
ヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。 - 【請求項４】前記ポリヌクレオチドが（dT）８である、
請求項３に記載の組成物。 - 【請求項５】前記第１の発蛍光団が、フルオレセイン、
６−カルボキシフルオレセイン、2',4',5',7'−テトラ
クロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2',7'−ジメト
キシ−4',5'−６−カルボキシローダミン（JOE）、N',
N',N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン
（TAMRA）、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（R
OX）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成
物。 - 【請求項６】前記第１の発蛍光団が６−カルボキシフル
オレセインである、請求項５に記載の組成物。 - 【請求項７】前記第２の発蛍光団が、フルオレセイン、
６−カルボキシフルオレセイン、2',4',5',7'−テトラ
クロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2',7'−ジメト
キシ−4',5'−６−カルボキシローダミン（JOE）、N',
N',N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミン
（TAMRA）、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（R
OX）からなる群から選択される、請求項５に記載の組成
物。 - 【請求項８】前記第２の発蛍光団が６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミンである、請求項６に記載の組成物。 - 【請求項９】核酸増幅反応混合物における増幅用ポリヌ
クレオチドの増幅生成物の量を測定するための方法であ
って、該混合物は、その強度が増幅生成物の量に比例す
るシグナルを生成し得る蛍光指示薬を含み、該方法は、
以下の工程： 内部増幅参照分子を該増幅反応混合物に加える工程であ
って、該内部参照分子は、 第１の発蛍光団； 第２の発蛍光団；および 核酸増幅条件下で該増幅用ポリヌクレオチドに、配列特
異的な様式でハイブリダイズしないバックボーンコネク
ター を含み、ここで該バックボーンコネクターは、該第１の
発蛍光団と該第２の発蛍光団とを、該第１の発蛍光団か
ら該第２の発蛍光団へのエネルギー移動を可能にするよ
うに結合している、工程； 該混合物を励起光線によって照射する工程；ならびに もはやクエンチされない、該蛍光指示薬からのシグナル
を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１０】前記核酸増幅反応がリアルタイムで測定
される、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】前記バックボーンコネクターがポリヌク
レオチドである、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１２】前記ポリヌクレオチドが、長さ２〜25個
のヌクレオチドである、請求項10に記載の方法。 - 【請求項１３】前記ポリヌクレオチドが（dT）８であ
る、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】前記第１の発蛍光団が、フルオレセイ
ン、６−カルボキシフルオレセイン、2',4',5',7'−テ
トラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2',7'−ジ
メトキシ−4',5'−６−カルボキシローダミン（JOE）、
N',N',N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン（TAMRA）、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
（ROX）からなる群から選択される、請求項９に記載の
方法。 - 【請求項１５】前記第１の発蛍光団が６−カルボキシフ
ルオレセインである、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】前記第２の発蛍光団が、フルオレセイ
ン、６−カルボキシフルオレセイン、2',4',5',7'−テ
トラクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン、2',7'−ジ
メトキシ−4',5'−６−カルボキシローダミン（JOE）、
N',N',N',N'−テトラメチル−６−カルボキシローダミ
ン（TAMRA）、および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン
（ROX）からなる群から選択される、請求項14に記載の
方法。 - 【請求項１７】前記第２の発蛍光団が６−カルボキシ−
Ｘ−ローダミンである、請求項15に記載の方法。 - 【請求項１８】核酸増幅反応を実施するためのキット
で、該キットは、請求項１に記載の内部参照分子、なら
びに、フルオレッサー−クエンチャープローブおよび熱
安定性DNAポリメラーゼからなる群から選択される１つ
以上の試薬を含む、キット。 - 【請求項１９】前記試薬がフルオレッサー−クエンチャ
ープローブである、請求項18に記載のキット。 - 【請求項２０】前記試薬が熱安定性DNAポリメラーゼで
ある、請求項18に記載のキット。 - 【請求項２１】前記キットがフルオレッサー−クエンチ
ャープローブをさらに含む、請求項20に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/657,989 US5736333A (en) | 1996-06-04 | 1996-06-04 | Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products |
| US08/657,989 | 1996-06-04 | ||
| PCT/US1997/009648 WO1997046708A1 (en) | 1996-06-04 | 1997-06-03 | Passive internal references for the detection of nucleic acid amplification products |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000503857A JP2000503857A (ja) | 2000-04-04 |
| JP3454432B2 true JP3454432B2 (ja) | 2003-10-06 |
Family
ID=24639453
Family Applications (1)
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