JP3440954B2 - DNA polymerase gene - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野で有用
なＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、及び該ＤＮ
Ａポリメラーゼの遺伝子工学的製造方法に関する。The present invention relates to a gene encoding a DNA polymerase useful in the field of genetic engineering, and the DN.
The present invention relates to a method for genetically engineering A polymerase.

【０００２】[0002]

【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージやＴ７ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、サー
マス アクアティカス（Thermus aquaticus)、ピロコッ
カス フリオサス（Pyrococcus furiosus)、サーモコッ
カス リトラリス（Thermococcus litoralis) 、バチル
ス カルドテナックス（Bacillus caldotenax)などの好
熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ等がある。これらの
酵素は、その有する性質に応じて特定のＤＮＡの標識化
や、ＤＮＡ塩基配列決定法、ＰＣＲ法などにそれぞれ利
用されている。一般にＤＮＡポリメラーゼは、その起源
による酵素特異性を有しており、その特性を生かした利
用法がある。例えば７０℃以上でも生育可能な高度好熱
性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは高温で安定であり、
その代表的なサーマス アクアティカス由来のＤＮＡポ
リメラーゼはＰＣＲ技術に欠くことができない酵素とし
て広く普及している。また、バクテリオファージが持つ
ＤＮＡポリメラーゼは、伸長性に優れたものが多く、ま
た天然の４種のヌクレオチド基質以外のアナログを取り
込む能力も高い。代表的なものとして大腸菌に感染する
Ｔ７ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼはジデオキシチ
ェーンターミネーション法による塩基配列決定実験に広
く用いられている。2. Description of the Related Art DNA polymerase which has been generally used as a reagent for genetic engineering research is E. coli DN.
A polymerase, its modified Klenow fragment, T4
There are DNA polymerases derived from phages and T7 phage-derived DNA polymerase, Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Thermococcus litoralis, Bacillus caldotenax and other thermophilic bacteria. . These enzymes are used for labeling of specific DNAs, DNA base sequence determination methods, PCR methods, etc., depending on their properties. In general, a DNA polymerase has an enzyme specificity depending on its origin, and there is a utilization method utilizing its characteristics. For example, a DNA polymerase derived from an extremely thermophilic bacterium that can grow at 70 ° C or higher is stable at high temperatures,
The typical DNA polymerase derived from Thermus aquaticus is widely used as an enzyme indispensable for PCR technology. In addition, many DNA polymerases possessed by bacteriophage have excellent extendibility, and also have a high ability to incorporate analogs other than the four natural nucleotide substrates. As a typical example, a DNA polymerase derived from T7 phage which infects E. coli is widely used in a nucleotide sequence determination experiment by the dideoxy chain termination method.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】一般に、好熱性細菌に
感染する好熱性バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメ
ラーゼは高温で安定でかつ、遺伝子操作実験に有用な性
質を持つことが予想されるが、好熱性ファージ由来のＤ
ＮＡポリメラーゼについての詳細は全く明らかでない。
本発明の目的は好熱性ファージ由来の新規なＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を特定し、該ＤＮＡ断片を含有させた組
換えプラスミドを導入させた形質転換体を用いた新規な
ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提供するこ
とにある。Generally, a DNA polymerase derived from a thermophilic bacteriophage that infects a thermophilic bacterium is expected to be stable at high temperature and have properties useful for genetic engineering experiments. Phage-derived D
No details are given about NA polymerase.
The object of the present invention is to identify a novel DNA polymerase gene derived from a thermophilic phage, and to provide a method for genetically engineering a novel DNA polymerase using a transformant introduced with a recombinant plasmid containing the DNA fragment. To provide.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、配列表の配列番号１３で表される
アミノ酸配列、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸の
置換、欠失、挿入、付加の少なくとも１つがされたアミ
ノ酸配列で示され、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有す
るタンパク質に関する。また本発明の第２の発明は、上
記第１の発明のタンパク質をコードする遺伝子に関す
る。そして、本発明の第３の発明はＤＮＡポリメラーゼ
の製造方法に関し、本発明の第２の発明の好熱性ファー
ジ由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた組換えプ
ラスミドを導入させた形質転換体を培養し、該培養物か
らＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする。The present invention will be summarized. The first invention of the present invention is represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
An amino acid sequence, or one to several amino acids in the sequence
At least one of substitution, deletion, insertion and addition
No acid sequence and has DNA polymerase activity
Related proteins . The second aspect of the present invention, the upper
The present invention relates to a gene encoding the protein of the first invention . A third invention of the present invention relates to a method for producing a DNA polymerase, which comprises culturing a transformant introduced with a recombinant plasmid containing the thermophilic phage-derived DNA polymerase gene of the second invention, It is characterized in that DNA polymerase is collected from the culture.

【０００５】本発明に使用する好熱性ファージとは好熱
性細菌に感染して増殖するウイルスであり、ここで好熱
性細菌とは５５℃以上の温度で生育可能な細菌である。
好熱性ファージとしては、バチルス ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus)に感染するＴＰ
１、ＴＰ８〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（J.
Bacteriol)、第８９巻、第１７８〜１８４頁（１９６
５）〕、ＴＰ８４〔ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー、第９１巻、第３４０〜３４８頁（１９６６）〕、Ｇ
Ｈ５、ＧＨ８〔ジャーナル オブ ビロロジー（J.Vio
l.)、第９巻、第３９７〜３９８頁（１９７２）〕、バ
チルス アシドカルダリウス（Bacillus acidocaldariu
s)に感染するＮＳ１１〔ビロロジー（Virology) 、第７
５巻、第２５６〜２５９頁（１９７６）〕、そしてサー
マス サーモフィラス（Thermus thermophilus) に感染
するファージＹＳ４０〔ジャーナル オブ ビロロジ
ー、第１５巻、第１４４９〜１４５３頁（１９７５）〕
等が知られており、これらのファージより好熱性ファー
ジ由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を単離することができ
る。The thermophilic phage used in the present invention is a virus that propagates by infecting a thermophilic bacterium, and the thermophilic bacterium is a bacterium that can grow at a temperature of 55 ° C. or higher.
As a thermophilic phage, TP that infects Bacillus stearothermophilus
1, TP8 [Journal of Bacteriology (J.
Bacteriol), Vol. 89, pp. 178-184 (196).
5)], TP84 [Journal of Bacteriology, 91, 340-348 (1966)], G
H5, GH8 [Journal of Birology (J.Vio
l.), Vol. 9, 397-398 (1972)], Bacillus acidocaldariu
NS11 [Virology, 7th
5, 256-259 (1976)], and the phage YS40 infecting Thermus thermophilus (Journal of Virology, 15: 1449-1453 (1975)].
Etc. are known, and a thermophilic phage-derived DNA polymerase gene can be isolated from these phages.

【０００６】以下、サーマス サーモフィラスに感染す
る好熱性ファージＹＳ４０を例とし、本発明を詳細に説
明する。なお、ＹＳ４０はサーマス サーモフィラスＨ
Ｂ８（ＡＴＣＣ ２７６３４）に感染するファージとし
て伊豆、峰温泉の自噴泉中より採取、分離された好熱性
ファージである。The present invention will be described in detail below by taking the thermophilic phage YS40 which infects Thermus thermophilus as an example. The YS40 is Thermus Thermophilus H
As a phage that infects B8 (ATCC 27634), it is a thermophilic phage collected and isolated from a self-spraying spring in Mine Onsen, Izu.

【０００７】 好熱性ファージの好熱性細菌への感
染、ファージ粒子の精製、及び該粒子からのＤＮＡの抽
出は、公知の方法を用いることができ、例えばファージ
ＹＳ４０のサーマス サーモフィラスＨＢ８への感染、
ファージ粒子の精製、及び該粒子からのＤＮＡの抽出
は、前出のジャーナル オブ ビロロジー、第１５巻、
第１４４９〜１４５３頁（１９７５）に記載の方法で行
うことができる。Infection of a thermophilic phage with a thermophilic bacterium, purification of phage particles, and extraction of DNA from the particles can be carried out by known methods, for example, infection of phage YS40 with Thermus thermophilus HB8,
Purification of phage particles and extraction of DNA from the particles are described in Journal of Virology, Vol.
It can be performed by the method described on pages 1449 to 1453 (1975).

【０００８】 ファージＤＮＡより、目的のＤＮＡ断
片を選択する方法としては、プローブＤＮＡ、又はＲＮ
Ａを用いてハイブリダイゼーションを行う方法が最も確
実であるが、好熱性ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼ
のアミノ酸配列や遺伝子配列については何の情報もな
い。また感染菌から、ＤＮＡポリメラーゼを精製する方
法も確立されておらず、目的のＤＮＡポリメラーゼを得
ることは容易ではない。例えばファージＹＳ４０の場合
は溶菌性ファージのため、感染菌中にファージ由来タン
パク質の蓄積は無く、ＤＮＡポリメラーゼを精製し、そ
のＮ末端アミノ酸配列を決定し、その配列より、ＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子スクリーニング用のプローブＤＮＡ
を作成することは不可能である。As a method for selecting a target DNA fragment from phage DNA, probe DNA or RN is used.
The most reliable method is hybridization using A, but there is no information about the amino acid sequence and gene sequence of thermophilic phage-derived DNA polymerase. In addition, a method for purifying DNA polymerase from infectious bacteria has not been established, and it is not easy to obtain the desired DNA polymerase. For example, in the case of phage YS40, since it is a lytic phage, there is no accumulation of phage-derived protein in the infecting bacteria, DNA polymerase is purified, its N-terminal amino acid sequence is determined, and DNA from the sequence is determined.
Probe DNA for polymerase gene screening
Is impossible to create.

【０００９】ＤＮＡポリメラーゼは、そのアミノ酸配列
より大きく分けて、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを代表
とするポル（Pol)Ｉ型のものと、ヒト由来ＤＮＡポリメ
ラーゼαを代表とするα型のものがある。本発明者ら
は、それぞれのグループで保存されている領域を選び出
して、ＰＣＲ法用のオリゴヌクレオチドを合成した。Ｄ
ＮＡポリメラーゼの配列比較については、例えばポルＩ
型では、ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリ
ー（Journal of Biological Chemistry)、第２６４巻、
第４２５５〜４２６３頁（１９８９）、α型ではザ フ
ァーセブ ジャーナル（The FASEB Journal)、第３巻、
第１４〜２１頁（１９８９）を参考にすることができ
る。DNA polymerases are roughly classified into amino acid sequences, and are classified into Pol I type represented by Escherichia coli DNA polymerase I and α type represented by human-derived DNA polymerase α. The present inventors selected regions conserved in each group and synthesized oligonucleotides for the PCR method. D
For sequence comparison of NA polymerases, see eg Pol I.
By type, Journal of Biological Chemistry, Volume 264,
Pp 4255-4263 (1989), for the α type, The FASEB Journal, Volume 3,
Reference can be made to pages 14 to 21 (1989).

【００１０】本発明者らが作製したプライマー１〜８の
塩基配列を配列表の配列番号１〜８に示す。また、各プ
ライマー対がＰＣＲ法により増幅すると期待されるＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の型を表１に示す。The nucleotide sequences of the primers 1-8 prepared by the present inventors are shown in SEQ ID NOS: 1-8 of the sequence listing. In addition, each primer pair is expected to be amplified by the PCR method.
The type of A polymerase gene is shown in Table 1.

【００１１】[0011]

【表１】 表 １ ─────────────────────────────────── 増幅が期待されるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子 ─────────────────────────────────── プライマー１，２ ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子 プライマー３，４ 高ＧＣ型のα型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子 プライマー５，６ 中ＧＣ型のα型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子 プライマー７，８ 低ＧＣ型のα型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子 ───────────────────────────────────[Table 1]                             Table 1 ───────────────────────────────────                         DNA polymerase gene expected to be amplified ─────────────────────────────────── Primers 1 and 2 gene encoding a type I DNA polymerase Primers 3, 4 Genes encoding high GC α-type DNA polymerase Genes encoding GC type α-type DNA polymerase in primers 5 and 6 Primers 7 and 8 Genes encoding low GC α-type DNA polymerase ───────────────────────────────────

【００１２】 ＰＣＲはＰＣＲテクノロジー（ＰＣＲ
Technology) エルリッヒＨＡ（Erlich) 編集、ストッ
クトンプレス社（１９８９年発行）に記載の方法に準じ
行う。温度サイクルは９４℃ １分、５５℃ １分、７
２℃ ２分で３０サイクル行う。前記で記載のファー
ジＹＳ４０から調製したＤＮＡを鋳型として、表１の各
組合せのプライマー対を用いてＰＣＲを行っても、ＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子の特異的な増幅は認められず、フ
ァージＹＳ４０のＤＮＡポリメラーゼは公知のＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子配列を基に、通常の方法によってクロ
ーニングすることはできない。PCR is a PCR technology (PCR
Technology) Edited by Erlich HA (Erlich), according to the method described in Stockton Press (issued in 1989). Temperature cycle is 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 7
Perform 30 cycles at 2 ° C. for 2 minutes. Even when PCR was carried out using the DNA prepared from the phage YS40 described above as a template and using the primer pairs of each combination in Table 1, DN
No specific amplification of the A polymerase gene was observed, and the DNA polymerase of phage YS40 cannot be cloned by the usual method based on the known DNA polymerase gene sequence.

【００１３】 プライマーと鋳型の結合条件が緩和な
条件下でＰＣＲを行うと、目的のＰＣＲ産物以外のＤＮ
Ａも増幅される。このＤＮＡ産物中に目的ＤＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子のＰＣＲ産物が存在する可能性がある。そ
こでＰＣＲの温度サイクルを９４℃ １分、３７℃ １
分、７２℃ ２分の３０サイクルとし、プライマーと鋳
型の結合条件を緩和してＰＣＲを行う。前記で記載の
ファージＹＳ４０から調製したＤＮＡを鋳型として、表
１の組合せのプライマー対を用いてＰＣＲを行った場
合、プライマー１，２の組合せで約２．０ｋｂ、約１．
５ｋｂ、約０．３ｋｂの３種のＤＮＡの増幅が認めら
れ、このＰＣＲ産物のゲル電気泳動を行い、分離された
ＤＮＡを単離し、各分離ＤＮＡをベクターに組込み、ジ
デオキシ法により、塩基配列を決定する。分析したＤＮ
Ａ中で、約０．３ｋｂのＤＮＡ断片に、公知のポルＩ型
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と若干の相同性が認められ、
このＤＮＡ断片が目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一
部である可能性がある。約０．３ｋｂのＤＮＡ断片の配
列を配列表の配列番号９に示す。When PCR is carried out under conditions where the binding condition between the primer and the template is mild, DN other than the desired PCR product is
A is also amplified. The PCR product of the target DNA polymerase gene may be present in this DNA product. Therefore, the PCR temperature cycle was 94 ° C for 1 minute and 37 ° C for 1 minute.
PCR is performed for 30 minutes at 72 ° C. for 2 minutes and the binding conditions between the primer and the template are relaxed. When PCR was performed using the DNA pair prepared from the phage YS40 described above as a template and using the primer pairs in the combinations of Table 1, the combination of primers 1 and 2 was about 2.0 kb, and about 1.
Amplification of 3 kinds of DNA of 5 kb and about 0.3 kb was observed. The PCR products were subjected to gel electrophoresis, the separated DNAs were isolated, each separated DNA was incorporated into a vector, and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method. decide. DN analyzed
In A, the DNA fragment of about 0.3 kb showed some homology with the known Pol I type DNA polymerase gene,
This DNA fragment may be part of the DNA polymerase gene of interest. The sequence of a DNA fragment of about 0.3 kb is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.

【００１４】 前記で選抜された約０．３ｋｂのＤ
ＮＡをプローブ（プローブ１）とし、前記で得たＤＮ
Ａの制限酵素切断物をターゲットとし、ゲノミックサザ
ンハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のスクリーニングを行う。サザンハイブリダイゼ
ーションにより、プローブ１が結合するファージＹＳ４
０のＤＮＡの制限酵素切断断片としては、４．５ｋｂの
ＥｃｏＲＶ断片、３．０ｋｂのＥｃｏＴ１４Ｉ断片、
２．５ｋｂのＨｉｎｄ III断片、６．５ｋｂのＰｓｔＩ
断片、２．３ｋｂのＳｓｐＩ断片、そして４．５ｋｂの
ＸｂａＩ断片があり、これらのＤＮＡ断片が陽性シグナ
ルとして検出される。D of about 0.3 kb selected above
Using the NA as the probe (probe 1), the DN obtained above
A DNA polymerase gene is screened by genomic Southern hybridization using the restriction enzyme cleavage product of A as a target. Phage YS4 to which probe 1 binds by Southern hybridization
As a restriction enzyme digestion fragment of 0 DNA, a 4.5 kb EcoRV fragment, a 3.0 kb EcoT14I fragment,
2.5 kb Hind III fragment, 6.5 kb PstI
Fragment, 2.3 kb SspI fragment, and 4.5 kb XbaI fragment, and these DNA fragments are detected as a positive signal.

【００１５】 前記で選抜されたＤＮＡ断片中よ
り、目的のＤＮＡポリメラーゼ構造遺伝子全長をカバー
しているＤＮＡ断片の選抜を行う。前記で陽性シグナ
ルを示したファージＹＳ４０のＤＮＡの制限酵素切断断
片中より、目的のＤＮＡ断片の選抜は以下のように行う
ことができる。 ｉ）目的の大きさの各ＤＮＡ断片をそれぞれアガロース
ゲルから切り出し、ＥｃｏＴ１４Ｉ断片は平滑末端化
し、他のものはそのまま、それぞれ同じ酵素で開環した
ｐＵＣ１９ベクターに組込む。 ii）プローブ１の塩基配列より、プライマー９、１０
（配列番号１０、１１）を作成する。 iii)プライマー９とＭ１３プライマーＲＶ（宝酒造社
製）、プライマー１０とＭ１３プライマーＭ４（宝酒造
社製）のそれぞれの組合せで、上記ｉ）で得られた各Ｄ
ＮＡ断片が組込まれたベクターを鋳型としてＰＣＲを行
い、増幅ＤＮＡの大きさを電気泳動により決定する。陽
性シグナルを示したＤＮＡ断片が組込まれた各ベクター
を鋳型とした増幅ＤＮＡの大きさを表２に示す。なお、
４．５ｋｂのＥｃｏＲＶ断片と６．５ｋｂのＰｓｔＩ断
片は長鎖のためか１度の実験でクローンが得られなかっ
た。From the DNA fragments selected above, a DNA fragment covering the entire length of the target DNA polymerase structural gene is selected. The desired DNA fragment can be selected from the restriction enzyme digested fragments of the phage YS40 DNA which showed a positive signal as described above. i) Each DNA fragment of the desired size is cut out from an agarose gel, the EcoT14I fragment is blunt-ended, and the other fragments are directly incorporated into the pUC19 vector opened with the same enzyme. ii) From the nucleotide sequence of probe 1, primers 9, 10
(SEQ ID NOS: 10 and 11) are created. iii) Each D obtained in i) above in each combination of primer 9 and M13 primer RV (Takara Shuzo), primer 10 and M13 primer M4 (Takara Shuzo)
PCR is carried out using the vector incorporating the NA fragment as a template, and the size of the amplified DNA is determined by electrophoresis. Table 2 shows the size of amplified DNA using each vector as a template in which a DNA fragment showing a positive signal was incorporated. In addition,
The 4.5 kb EcoRV fragment and the 6.5 kb PstI fragment could not be cloned in one experiment, probably because of their long chains.

【００１６】[0016]

【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── 増幅ＤＮＡ（ｋｂ） ベクターに組込まれた ────────────────────── ＤＮＡ断片 プライマー９ プライマー１０ Ｍ１３プライマーＲＶ Ｍ１３プライマーＭ４ ─────────────────────────────────── 4.5kbのＥcoＲＶ 断片由来 ─── ─── 3.0kbのＥcoＴ14Ｉ 〃 １．０ ２．３ 2.5kbのＨind III 〃 １．５ １．０ 6.5kbのＰstＩ 〃 ─── ─── 2.3kbのＳspＩ 〃 ０．７ １．６ ───────────────────────────────────[Table 2]                             Table 2 ───────────────────────────────────                                         Amplified DNA (kb)   Incorporated into the vector ──────────────────────   DNA fragment Primer 9 Primer 10                             M13 primer RV M13 primer M4 ───────────────────────────────────  Derived from the 4.5 kb EcoRV fragment ───────  3.0 kb EcoT14I 〃 1.0 2.3  2.5kb Hind III 〃 1.5 1.0  6.5kb PstI 〃 ─── ───  2.3 kb SspI 〃 0.7 1.6 ───────────────────────────────────

【００１７】iv) 公知のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子の平均的鎖長は約３ｋｂであり、この遺伝子をｐＵ
Ｃ１９に組込み、プライマー９、Ｍ１３プライマーＲＶ
の組合せで増幅が予想されるＤＮＡの鎖長は約１．８〜
２．０ｋｂである。また、プライマー１０、Ｍ１３プラ
イマーＭ４の組合せで増幅が予想されるＤＮＡの鎖長は
約０．７〜０．８ｋｂである。よって、表２中、２．５
ｋｂのＨｉｎｄ III断片由来のＤＮＡ断片は、公知のポ
ルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と大きさが類似したＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子の全長が含有されている可能性
があり、該Ｈｉｎｄ III断片は目的のポリメラーゼ遺伝
子全長をカバーしているＤＮＡ断片として選抜する。Iv) The average chain length of the known Pol type I DNA polymerase gene is about 3 kb, and this gene is called pU
Incorporated into C19, primer 9, M13 primer RV
The length of DNA expected to be amplified by the combination of
It is 2.0 kb. The chain length of DNA expected to be amplified by the combination of primer 10 and M13 primer M4 is about 0.7 to 0.8 kb. Therefore, in Table 2, 2.5
The DNA fragment derived from the HindIII fragment of kb has a D size similar to that of the known Pol type I DNA polymerase gene.
There is a possibility that the full-length NA polymerase gene is contained, and the HindIII fragment is selected as a DNA fragment that covers the full-length polymerase gene of interest.

【００１８】 上記で選抜されたＤＮＡ断片をプラ
スミドベクターに組込む。プラスミドベクターとしては
公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。また組込ませる
手段についても公知の方法が利用でき、ＤＮＡリガーゼ
を用いた酵素反応で組込ませることができる。次いで組
換えプラスミドを宿主に導入し、宿主を形質転換する
が、宿主として大腸菌を使用する場合、宿主大腸菌とし
ては、形質転換能を有するものであれば野生株、変異株
のいずれも使用できるが、制限系変異株で修飾系野生株
（ｒ^- ，ｍ⁺ ）であることが望ましい。導入の手段自体
は公知の方法、例えばモレキュラー クローニング、ア
ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning,A La
boratory Manual)〔Ｔ．マニアティス（T.Maniatis) ほ
か著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー
1982年発行〕第２５０頁に記載の方法を用いることがで
きる。The DNA fragment selected above is incorporated into a plasmid vector. Known plasmid vectors can be used, for example pUC18 and pUC1.
9, pUC119, pTV118N and the like, but are not limited thereto. Also, as a means for incorporating, a known method can be used, and it can be incorporated by an enzymatic reaction using DNA ligase. Then, the recombinant plasmid is introduced into the host and the host is transformed. When E. coli is used as the host, either wild strain or mutant strain can be used as long as it has transformability. It is desirable that the restriction mutant strain is a modified wild strain (r ⁻ , m ⁺ ). The means of introduction itself is a known method, for example, molecular cloning or an laboratory manual (Molecular Cloning, A La.
boratory Manual) [T. Cold Spring Harbor Laboratory by T. Maniatis et al.
Issued in 1982] The method described on page 250 can be used.

【００１９】このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に
導入させ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１
１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、ある
いはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を有しかつ
白色を示すコロニーを選択することによりクローン化さ
れたＤＮＡの集団を調整することができる。次に上記集
団の中から目的の断片を有するクローンを選択する。選
択の方法はベクターの種類によってコロニーハイブリダ
イゼーション、プラークハイブリダイゼーションを用い
ればよく、また、プローブ作製に用いたプライマーによ
るＰＣＲ法を用いることもできる。In this way, the desired DNA fragment is introduced into the host, and the characteristics of the plasmid vector, for example pUC1
In the case of 19, ampicillin-resistant colonies, or ampicillin, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal) and isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPT
The population of cloned DNA can be prepared by selecting colonies that are ampicillin resistant and white on the plate containing G). Next, a clone having the desired fragment is selected from the above population. As a selection method, colony hybridization or plaque hybridization may be used depending on the type of vector, and a PCR method using the primer used for probe preparation may also be used.

【００２０】目的のＤＮＡ断片を含有するプラスミドベ
クターが選抜できれば、次に該ベクターで宿主の形質転
換を行い、次に該形質転換体の培養を行い、培養物中に
発現されているＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。こ
の時培養物の抽出液の熱処理物を検体として用いること
により、宿主由来のＤＮＡポリメラーゼ活性と区別する
ことができる。目的のＤＮＡポリメラーゼの発現が認め
られた場合は、その発現の最適条件を検討する。If a plasmid vector containing the desired DNA fragment can be selected, then the vector is transformed into a host, and then the transformant is cultured to obtain the DNA polymerase activity expressed in the culture. To measure. At this time, by using a heat-treated product of the extract of the culture as a sample, it can be distinguished from the DNA polymerase activity derived from the host. When expression of the target DNA polymerase is observed, the optimum conditions for the expression are examined.

【００２１】前記で選抜したファージＹＳ４０由来の
２．５ｋｂのＨｉｎｄIII 断片をクローニングするため
に、ファージＹＳ４０のＤＮＡをＨｉｎｄIII で分解
し、目的の大きさのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後
のアガロースゲルより回収する。ｐＵＣ１１９をＨｉｎ
ｄIII で開環し、回収したＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガ
ーゼで連結反応を行った後、大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、得られる形質転換体の中からコロニーハイブリダイ
ゼーションにより、目的のＤＮＡ断片が組込まれたクロ
ーンを選択し、本発明者らがプラスミドｐφＹＳ１０１
と命名したプラスミドを選抜する。プラスミドｐφＹＳ
１０１に挿入されている２．５ｋｂのＨｉｎｄIII 断片
の塩基配列はジデオキシチエーンターミネーター法で決
定することができる。決定された該塩基配列を配列表の
配列番号１２に示す。なお、決定された配列によれば、
前記で、プライマー１，２の使用下で増幅された約
０．３ｋｂの領域は、プライマー１のみで増幅されたも
のである。すなわちプライマー１が意外にも、鋳型ＤＮ
Ａの２カ所に貼りつき、約０．３ｋｂのＤＮＡを増幅し
たものである。In order to clone the 2.5 kb HindIII fragment derived from phage YS40 selected above, the DNA of phage YS40 was digested with HindIII, and the DNA of the desired size was recovered from the agarose gel after agarose gel electrophoresis. To do. Hinge pUC119
After circularization with dIII and mixing with the recovered DNA, ligation reaction was carried out with DNA ligase and introduction into E. coli JM109, the desired DNA fragment was incorporated by colony hybridization from the resulting transformants. A clone was selected, and the present inventors selected the plasmid pφYS101.
Select the plasmid named. Plasmid pφYS
The nucleotide sequence of the 2.5 kb HindIII fragment inserted in 101 can be determined by the dideoxy chain terminator method. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing. According to the determined sequence,
In the above, the region of about 0.3 kb amplified using the primers 1 and 2 is the one amplified only with the primer 1. That is, the primer 1 is unexpectedly used as the template DN.
It is attached to two places of A and amplified about 0.3 kb of DNA.

【００２２】プラスミドｐφＹＳ１０１で形質転換した
大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０１
の培養菌体を超音波処理により破砕した後、上清を６５
℃、２０分の熱処理を行い、大腸菌タンパク質を変性さ
せた後、遠心により上清を回収し、ＤＮＡポリメラーゼ
活性の測定を以下のように行う。Escherichia coli JM109 transformed with the plasmid pφYS101, E. coli JM109 / pφYS101
After crushing the cultured bacterial cells of No. 1 by ultrasonic treatment,
After heat treatment at 20 ° C. for 20 minutes to denature the E. coli protein, the supernatant is recovered by centrifugation and the DNA polymerase activity is measured as follows.

【００２３】反応溶液として６７ｍＭ リン酸カリウム
（ｐＨ７．４）、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭ ２
−メルカプトエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、各
３３μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、
１００μＭ 〔α³²Ｐ〕ｄＣＴＰを用意し、この溶液５
０μｌに対して５μｌの酵素液を加え、６５℃、１０分
間反応させた後４５μｌをＤＥ８１フィルターペーパー
にスポットして、５％Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 溶液で３回洗浄す
る。フィルター上に残った酸不溶性画分の放射活性を液
体シンチレーションカウンターで測定し、取り込み活性
を求める。上記溶液で３０分に１０ｎｍｏｌの全ヌクレ
オチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１ユニット
（Ｕ）とする。As a reaction solution, 67 mM potassium phosphate (pH 7.4), 6.7 mM MgCl ₂ , 1 mM 2
-Mercaptoethanol, 20 μM activated DNA, 33 μM each dATP, dGTP, dCTP, dTTP,
Prepare 100 μM [α ³² P] dCTP and prepare this solution 5
5 μl of enzyme solution was added to 0 μl, reacted at 65 ° C. for 10 minutes, and then 45 μl was spotted on DE81 filter paper and washed with 5% Na ₂ HPO ₄ solution three times. The radioactivity of the acid-insoluble fraction remaining on the filter is measured with a liquid scintillation counter to determine the uptake activity. The activity of incorporating 10 nmol of all nucleotides into the acid-insoluble precipitate in 30 minutes with the above solution is defined as 1 unit (U).

【００２４】大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０１由来の
粗抽出液中には６５℃、２０分の熱処理により変成しな
い、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性が認められ、本発
明の目的の遺伝子のクローニングが達成されている。し
かしながら、その発現は少なく、ＤＮＡポリメラーゼの
工業的生産にはプラスミドの改変が必要である。In the crude extract derived from Escherichia coli JM109 / pφYS101, the activity of thermostable DNA polymerase, which is not denatured by heat treatment at 65 ° C. for 20 minutes, was recognized, and cloning of the gene of the present invention has been achieved. However, its expression is low and industrial production of DNA polymerase requires modification of the plasmid.

【００２５】配列表の配列番号１２に示した２．５ｋｂ
のＨｉｎｄIII 断片の塩基配列を基にオープンリーディ
ングフレームの最長の領域を検索すれば配列番号１２の
塩基番号２２９〜２３１のＡＴＧが最長領域の翻訳開始
コドンとなる。よって配列番号１２の塩基番号１から該
コドン前の塩基配列を除去することにより、プロモータ
ー遺伝子と目的遺伝子が近接したプラスミドに改変でき
る。またタンパク質の高発現に適したプラスミドベクタ
ーに組込むことにより、ＤＮＡポリメラーゼの発現に適
したプラスミドベクターに改変することができる。2.5 kb shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing
When the longest region of the open reading frame is searched based on the nucleotide sequence of the HindIII fragment of SEQ ID NO: 12, ATG of nucleotide numbers 229 to 231 of SEQ ID NO: 12 becomes the translation initiation codon of the longest region. Therefore, by removing the base sequence before the codon from the base number 1 of SEQ ID NO: 12, it can be modified into a plasmid in which the promoter gene and the target gene are close to each other. Further, by incorporating into a plasmid vector suitable for high expression of protein, it can be modified into a plasmid vector suitable for expression of DNA polymerase.

【００２６】塩基配列２２９〜２３１の部位に部位特異
的変異法により、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を導入す
ることができる。該部位特異的導入は、公知の方法を用
いることができ、例えばプロシーディングズ オブ ザ
ナショナル アカデミーオブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ（Proc. Natl.Acad.Sci.USA)、第８２巻、
第４８８頁（１９８５）に記載の方法を用いることがで
きる。本発明者らがプラスミドｐφＹＳ１０２と命名し
た、ＮｃｏＩの認識部位が導入されたプラスミドより、
２．３ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片を、Ｎｃｏ
Ｉ、ＨｉｎｄIII で切り出し、タンパク質高発現性プラ
スミドベクターｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＥＴ８Ｃに組込むこ
とによって、本発明者らがそれぞれプラスミドｐφＹＳ
１０３、プラスミドｐφＹＳ２００と命名したプラスミ
ドを得ることができる。A recognition sequence for the restriction enzyme NcoI can be introduced into the sites of the base sequences 229 to 231 by the site-directed mutagenesis method. The site-specific introduction can be performed by using a known method, for example, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 82,
The method described on page 488 (1985) can be used. From the plasmid designated by the present inventors as the plasmid pφYS102, in which the recognition site of NcoI was introduced,
A 2.3 kb NcoI-HindIII fragment was added to NcoI
By excising with I and HindIII and incorporating into the high protein expression plasmid vectors pTV119N and pET8C, the present inventors have obtained the plasmid pφYS.
103, a plasmid designated as plasmid pφYS200 can be obtained.

【００２７】プラスミドｐφＹＳ１０３、及びプラスミ
ドｐφＹＳ２００はそれぞれのプラスミド系に適した高
発現系の宿主に組込み、形質転換体を得ることができ
る。プラスミドｐφＹＳ１０３が組込まれた大腸菌ＪＭ
１０９は大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０３、プラスミ
ドｐφＹＳ２００が組込まれた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００と命
名されている。大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０３及び
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００は前出の大
腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０１と同様に、培養、超音
波処理、熱処理を行い、それぞれの粗抽出液中の酵素活
性を測定した。結果を表３に示す。The plasmid pφYS103 and the plasmid pφYS200 can be integrated into a host of high expression system suitable for each plasmid system to obtain a transformant. Escherichia coli JM in which the plasmid pφYS103 is incorporated
109 is Escherichia coli JM109 / pφYS103, E. coli BL21 (DE
3) is designated as Escherichia coli BL21 (DE3) / pφYS200. Escherichia coli JM109 / pφYS103 and Escherichia coli BL21 (DE3) / pφYS200 were subjected to culture, sonication and heat treatment in the same manner as the above-mentioned Escherichia coli JM109 / pφYS101, and the enzyme activity in each crude extract was measured. The results are shown in Table 3.

【００２８】[0028]

【表３】 表 ３ ─────────────────────────────────── 形質転換体 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性 〔ｍＵ／μｌ〕 ─────────────────────────────────── 大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０１ ＜０．０１ 大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０３ ０．２ 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００ ５．６ ───────────────────────────────────[Table 3]                             Table 3 ───────────────────────────────────           Transformant Thermostable DNA polymerase activity                                               [MU / μl] ───────────────────────────────────   E. coli JM109 / pφYS101 <0.01   E. coli JM109 / pφYS103 0.2   E. coli BL21 (DE3) / pφYS200 5.6 ───────────────────────────────────

【００２９】プラスミドｐφＹＳ２００を有する大腸菌
ＢＬ（ＤＥ３）株を培養して得た粗抽出液からは、５．
６ｍＵ／μｌの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が得られ
る。このプラスミドｐφＹＳ２００で形質転換された大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）はEscherichia coli ＢＬ２１
（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００と命名、表示され、工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３６５
８として寄託されている。From the crude extract obtained by culturing the E. coli BL (DE3) strain containing the plasmid pφYS200, 5.
A thermostable DNA polymerase activity of 6 mU / μl is obtained. Escherichia coli BL21 (DE3) transformed with this plasmid pφYS200 is Escherichia coli BL21.
Named and displayed as (DE3) / pφYS200, FERM P-1365 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, AIST.
Deposited as 8.

【００３０】図１にプラスミドｐφＹＳ２００に組込ま
れている本発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する
２．３ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。また図
２に２．５ｋｂのＨｉｎｄIII 断片の制限酵素地図を示
す。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有す
る２．３ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列及び該断片がコー
ドし得るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に示
す。以上のようにして得られた組換え大腸菌〔Escheric
hia coli ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００〕を用
いることにより新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの工業的
製造が可能になる。FIG. 1 shows a restriction enzyme map of a 2.3 kb DNA fragment containing the DNA polymerase gene of the present invention incorporated in the plasmid pφYS200. Further, FIG. 2 shows a restriction enzyme map of the 2.5 kb HindIII fragment. The nucleotide sequence of a 2.3 kb DNA fragment containing the DNA polymerase gene of the present invention and the amino acid sequence of the protein that can be encoded by the fragment are shown in SEQ ID NO: 13. The recombinant Escherichia coli obtained as described above [Escheric
By using hia coli BL21 (DE3) / pφYS200], industrial production of a novel thermostable DNA polymerase becomes possible.

【００３１】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有さ
せた組換えプラスミドを導入した形質転換体、例えば大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００は通常の培養
条件、例えば１００μｇ／ｍｌのアンピリシンを含むＬ
Ｂ培地中、３７℃で培養することにより、培養物中に耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを発現させることができる。培
養終了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処
理後の遠心上清を６５℃、２０分間の熱処理による夾雑
タンパク質の変性処理、除核酸処理、硫安塩析処理、透
析処理、イオン交換クロマトグラフィー等を行うことに
より、精製酵素標品を得ることができる。Transformants introduced with a recombinant plasmid containing a thermostable DNA polymerase gene, such as Escherichia coli BL21 (DE3) / pφYS200, were cultured under normal culture conditions, for example, L containing 100 μg / ml ampicillin.
The thermostable DNA polymerase can be expressed in the culture by culturing in B medium at 37 ° C. After completion of the culturing, the cultured bacterial cells are collected, and the resulting centrifuged supernatant of the bacterial cells after sonication is subjected to heat treatment at 65 ° C. for 20 minutes for denaturation of contaminating proteins, nucleic acid removal treatment, ammonium sulfate precipitation treatment, A purified enzyme preparation can be obtained by performing dialysis treatment, ion exchange chromatography and the like.

【００３２】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を含有させた組換えプラスミドを導入した形質転換体、
例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００が生
産する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの酵素化学的、及び理
化学的性質は次のとおりである。A transformant introduced with a recombinant plasmid containing the thermostable DNA polymerase gene of the present invention,
For example, the enzymatic and physicochemical properties of thermostable DNA polymerase produced by E. coli BL21 (DE3) / pφYS200 are as follows.

【００３３】（１）作用及び基質特異性 鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチド又はポ
リヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基にジオキシリボ
ヌクレオシド ５′−３リン酸のα−ホスフェートを共
有結合させることにより、デオキシリボ核酸に相補的な
デオキシヌクレオシド ５′−１リン酸を導入する反応
を触媒する。本酵素は、４種類のデオキシリボヌクレオ
シド ５′−３リン酸を必要とする。(1) Action and Substrate Specificity By covalently bonding the α-phosphate of dioxyribonucleoside 5′-3 phosphate to the 3′-hydroxyl group of the oligonucleotide or polynucleotide annealed to the template DNA, It catalyzes the reaction of introducing deoxynucleoside 5'-1 phosphate complementary to deoxyribonucleic acid. This enzyme requires four types of deoxyribonucleoside 5'-3 phosphates.

【００３４】（２）酵素活性測定方法 反応溶液として２０ｍＭ トリス（Tris) ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．０１％ ＢＳＡ、
０．０１％ トリトンＸ−１００、０．２ｍｇ活性化Ｄ
ＮＡ、各３３μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、１００μＭ 〔メチル− ³Ｈ〕ＴＴＰを用意
し、この溶液１００μｌに対して５μｌの酵素液を加
え、６５℃、７．５分間反応させた後４５μｌをＤＥ８
１フィルターペーパーにスポットして、５％ Ｎａ₂ Ｈ
ＰＯ₄ 溶液で３回洗浄する。フィルター上に残った酸不
溶性画分の放射活性を液体シンチレーションカウンター
で測定し、取り込み活性を求める〔以下（３）〜（７）
については本方法で測定した〕。(2) Method for measuring enzyme activity As a reaction solution, 20 mM Tris HCl (pH
8.0), 2 mM MgCl ₂ , 0.01% BSA,
0.01% Triton X-100, 0.2 mg activated D
NA, 33 μM each dATP, dGTP, dCTP, d
TTP, 100 μM [methyl- ³ H] TTP was prepared, and 5 μl of enzyme solution was added to 100 μl of this solution, reacted at 65 ° C. for 7.5 minutes, and then 45 μl was added to DE8.
Spot on 1 filter paper, 5% Na ₂ H
Wash 3 times with PO ₄ solution. The radioactivity of the acid-insoluble fraction remaining on the filter is measured with a liquid scintillation counter to determine the uptake activity [the following (3) to (7)
Was measured by this method].

【００３５】（３）至適ｐＨ 本発明のＤＮＡポリメラーゼの反応へのｐＨの影響を求
めた。測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、
（２）に示す反応条件の内２０ｍＭ トリスＨＣｌをｐ
Ｈ７．０〜８．９に調製したものをそれぞれ用い反応さ
せた。本酵素は、図３に示すごとく、約ｐＨ８で最大活
性を示した。すなわち、図３は本発明により得られる酵
素の至適ｐＨを示す図であり縦軸は相対活性（％）、横
軸はｐＨを示す。(3) Optimum pH The influence of pH on the reaction of the DNA polymerase of the present invention was determined. For the measurement, 100 mU of this enzyme preparation was used.
Of the reaction conditions shown in (2), pour 20 mM Tris HCl
Reactions were carried out using those prepared for H 7.0 to 8.9. As shown in FIG. 3, this enzyme showed maximum activity at about pH 8. That is, FIG. 3 is a diagram showing the optimum pH of the enzyme obtained by the present invention, in which the vertical axis represents relative activity (%) and the horizontal axis represents pH.

【００３６】（４）至適温度 測定には、１００ｍＵの本酵素標品を用い、（２）に示
す反応条件下で種々の温度で７．５分間反応を行った。
本酵素は図４に示すように、ｐＨ８．０において３７℃
〜７０℃の範囲で活性があり、その至適温度は６５℃で
あった。すなわち図４は本発明により得られる酵素の至
適温度を示す図であり縦軸は相対活性（％）、横軸は温
度（℃）を示す。(4) For the optimum temperature measurement, 100 mU of this enzyme preparation was used, and the reaction was carried out at various temperatures for 7.5 minutes under the reaction conditions shown in (2).
As shown in FIG. 4, this enzyme was 37 ° C. at pH 8.0.
It was active in the range of ~ 70 ° C, and its optimum temperature was 65 ° C. That is, FIG. 4 is a diagram showing the optimum temperature of the enzyme obtained by the present invention, in which the vertical axis represents relative activity (%) and the horizontal axis represents temperature (° C.).

【００３７】（５）至適ＭｇＣｌ₂ 濃度 本酵素はＭｇ²⁺を要求する。本酵素１００ｍＵを用い
（２）に示す反応条件の内ＭｇＣｌ₂ 濃度を終濃度２〜
５０ｍＭで変化させそれぞれ６５℃で７．５分間反応を
行った。本酵素は図５に示すごとく、至適ＭｇＣｌ₂ 濃
度は約２ｍＭであった。すなわち、図５は本発明により
得られる酵素の活性とＭｇＣｌ₂ 濃度の関係を示し、縦
軸は相対活性（％）を、横軸はＭｇＣｌ₂ 濃度（ｍＭ）
を示す。(5) Optimal MgCl ₂ concentration This enzyme requires Mg ²⁺ . Using 100 mU of this enzyme, the MgCl ₂ concentration in the reaction conditions shown in (2) was adjusted to a final concentration of 2 to
The reaction was performed at 65 ° C. for 7.5 minutes while changing the amount at 50 mM. As shown in FIG. 5, this enzyme had an optimum MgCl ₂ concentration of about 2 mM. That is, FIG. 5 shows the relationship between the activity of the enzyme obtained according to the present invention and the MgCl ₂ concentration, where the vertical axis represents the relative activity (%) and the horizontal axis represents the MgCl ₂ concentration (mM).
Indicates.

【００３８】（６）至適ＫＣｌ濃度 本酵素１００ｍＵを用いて（２）に示す反応条件に終濃
度０〜１００ｍＭのＫＣｌを添加し、６５℃で７．５分
間反応を行った。本酵素は、図６で示す通り０〜１００
ｍＭ ＫＣｌで活性を有し、中でも０ｍＭ ＫＣｌ付近
が最も活性が高かった。すなわち、図６は本発明により
得られる酵素の活性とＫＣｌ濃度の関係を示す図であ
り、縦軸は相対活性（％）、横軸はＫＣｌ濃度（ｍＭ）
を示す。(6) Optimal KCl concentration Using 100 mU of this enzyme, KCl having a final concentration of 0 to 100 mM was added to the reaction conditions shown in (2), and the reaction was carried out at 65 ° C for 7.5 minutes. This enzyme is 0-100 as shown in FIG.
It had activity in mM KCl, and the activity was highest around 0 mM KCl. That is, FIG. 6 is a diagram showing the relationship between the activity of the enzyme obtained by the present invention and the KCl concentration, where the vertical axis represents relative activity (%) and the horizontal axis represents KCl concentration (mM).
Indicates.

【００３９】（７）Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）感
受性 本酵素１００ｍＵを用いて（２）に示す反応条件に終濃
度０〜１０ｍＭになるようにＮＥＭを加え、６５℃で
７．５分間反応させた。本酵素は図７で示す通り、ＳＨ
基修飾試薬であるＮＥＭに対して強い感受性を示した。
すなわち、図７は本発明により得られる酵素の活性とＮ
ＥＭ濃度の関係を示す図であり、縦軸は相対活性
（％）、横軸はＮＥＭ濃度（ｍＭ）を示す。本発明の酵
素は、ＮＥＭによって酵素活性が阻害される。(7) N-ethylmaleimide (NEM) sensitivity Using 100 mU of this enzyme, NEM was added to the reaction conditions shown in (2) so that the final concentration was 0 to 10 mM, and the reaction was carried out at 65 ° C. for 7.5 minutes. It was As shown in FIG. 7, this enzyme is SH
It showed strong sensitivity to NEM which is a group modifying reagent.
That is, FIG. 7 shows the activity of the enzyme and N
It is a figure which shows the relationship of EM density | concentration, a vertical axis | shaft shows relative activity (%) and a horizontal axis | shaft shows NEM density | concentration (mM). The enzyme activity of the enzyme of the present invention is inhibited by NEM.

【００４０】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り好熱性ファージ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子及び該遺伝子を用いた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの工
業的製造方法が提供される。本発明の耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼは公知のポルＩ型、α型ＤＮＡポリメラーゼと
は全く異なる新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、種
々の遺伝子操作実験、特に高温下における遺伝子操作に
おいて有用である。また本発明により単離されたＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子は、公知のポルＩ型、α型ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする塩基配列とは全く異なり、該遺
伝子を用いることにより、該遺伝子にハイブリダイズ可
能な好熱性ファージ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を簡便にクローニングすることができる。As described in detail above, the present invention provides a thermostable phage-derived thermostable DNA polymerase gene and a method for industrially producing a thermostable DNA polymerase using the gene. The thermostable DNA polymerase of the present invention is a novel thermostable DNA polymerase that is completely different from known Pol I type and α type DNA polymerases, and is useful in various genetic manipulation experiments, particularly in genetic manipulation under high temperature. DNA isolated by the present invention
The polymerase gene is completely different from the known nucleotide sequences encoding the type I and α type DNA polymerases, and by using the gene, a thermostable phage-derived thermostable DNA polymerase gene that can hybridize with the gene can be easily prepared. Can be cloned into.

【００４１】[0041]

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が本発明は以下の実施例に限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

【００４２】実施例１ （１）ファージＹＳ４０ＤＮＡの調製 サーマスサーモフィラスＨＢ８（ＡＴＣＣ ２７６３
４）を１０ｍｌの液体培地（ポリペプトン１０ｇ／リッ
トル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リ
ットル、０．０１％硫酸鉄）で７２℃、一夜培養し、新
しい同じ組成の培地１００ｍｌに移してＡ６００が約
０．１になるまで振とう培養した。この培養液に３×１
０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌのファージＹＳ４０保存溶液を７．５
ｍｌ加えて感染させ、更に４．５時間振とう培養した。
クロロホルムを加えて７０℃、５分で完全に溶菌させ、
１００００ｒｐｍで１５分遠心し、残渣を除いた。次
に、上清にＤＮａｓｅＩを１０ｍｇ、ＲＮａｓｅＡを５
００μｇ加え３７℃、１時間反応させ、溶出した宿主菌
由来のＤＮＡ、ＲＮＡを分解した後もう一度遠心（１０
０００ｒｐｍ １５分）した後、上清にＮａＣｌを１
３．５ｇ、ＰＥＧ６０００を５０ｇ加えて４℃で一晩放
置し、ファージ粒子を沈殿させた。更に、該溶液を１０
０００ｒｐｍ、１５分遠心した後、沈殿を回収し、１０
ｍｌの１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ に懸濁させた。更に、もう一度１０００
０ｒｐｍ、１５分の遠心の後、上清をショ糖密度勾配遠
心分離にかけ、ファージ粒子を精製した。４０％、５％
のショ糖液を、２．５ｍｌずつ遠心管に重層し、その上
からファージ粒子を５ｍｌずつ、２本に重層して、３５
０００ｒｐｍ、６０分遠心を行った後、沈殿を１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 溶
液２ｍｌに溶解して、もう一度ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓ
ｅＡ処理をし（それぞれ６μｇ、２０μｇ加え３７℃、
３０分）ＳＴＥＰバッファー（０．５％ＳＤＳ、５０ｍ
Ｍ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．４Ｍ ＥＤＴＡ、
プロティナーゼＫ１ｍｇ／ｍｌ）を５００μｌ加えて５
０℃、１５分反応させた。その後、同等のフェノールを
加え抽出を行い、フェノール／クロロホルム１：１溶液
で抽出した後、エタノール沈殿でファージＤＮＡを回収
した。次に該ＤＮＡを乾燥後ＴＥバッファー（１０ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）１ｍｌ
に溶かして定量した。ファージＤＮＡは約５００μｇ得
られた。Example 1 (1) Preparation of phage YS40 DNA Thermus thermophilus HB8 (ATCC 2763)
4) was cultured in 10 ml of a liquid medium (polypeptone 10 g / l, yeast extract 5 g / l, NaCl 5 g / l, 0.01% iron sulfate) at 72 ° C. overnight, transferred to 100 ml of a new medium having the same composition, and transferred to A600. The culture was carried out with shaking until it reached about 0.1. 3 x 1 in this culture
Phage YS40 stock solution at 0 ¹⁰ pfu / ml was added to 7.5
The cells were infected with the addition of ml, and the cells were further cultured by shaking for 4.5 hours.
Add chloroform and lyse completely at 70 ° C for 5 minutes,
The residue was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 15 minutes. Next, 10 mg of DNaseI and 5 mg of RNaseA were added to the supernatant.
After adding 00 μg and reacting at 37 ° C. for 1 hour, the eluted DNA and RNA derived from the host bacterium were decomposed and then centrifuged (10
000 rpm for 15 minutes), and add NaCl to the supernatant.
3.5 g and 50 g of PEG6000 were added and left at 4 ° C. overnight to precipitate phage particles. Further, the solution is added to 10
After centrifugation at 000 rpm for 15 minutes, the precipitate was collected and
ml 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 m
Suspended in M MgCl ₂ . Furthermore, once again 1000
After centrifugation at 0 rpm for 15 minutes, the supernatant was subjected to sucrose density gradient centrifugation to purify the phage particles. 40%, 5%
2.5 ml each of the sucrose solution of 3 was superposed on the centrifuge tube, and 5 ml of the phage particles were superposed on each tube in 5 ml.
After centrifuging at 000 rpm for 60 minutes, precipitate is 10 mM.
Dissolve in 2 ml of Tris HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl ₂ solution, and add DNaseI and RNas again.
eA treatment (6μg, 20μg added at 37 ° C,
30 minutes) STEP buffer (0.5% SDS, 50m
M Tris HCl, pH 7.5, 0.4M EDTA,
5 μl of proteinase K (1 mg / ml) was added.
The reaction was carried out at 0 ° C for 15 minutes. Then, an equivalent phenol was added for extraction, extraction was performed with a phenol / chloroform 1: 1 solution, and then phage DNA was recovered by ethanol precipitation. Next, after drying the DNA, TE buffer (10 mM
Tris HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) 1 ml
It was dissolved in and quantified. About 500 μg of phage DNA was obtained.

【００４３】（２）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅 配列表の配列番号１〜８でそれぞれ表されるミックスプ
ライマーのプライマー１〜８をＤＮＡ合成機で合成し、
精製した。次にプライマー１とプライマー２、プライマ
ー３とプライマー４、プライマー５とプライマー６、プ
ライマー７とプライマー８の組合せでプライマーを用い
てＰＣＲを行った。すなわちプライマーを各１００ｐｍ
ｏｌと（１）で得られたファージＹＳ４０のＤＮＡ１ｎ
ｇを用いて１０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０
ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、各２００μＭ
デオキシヌクレオチド３リン酸（４種）１ユニットタッ
ク（Ｔａｑ）ポリメラーゼを含む溶液１００μｌで９４
℃１分、５５℃１分、７２℃１分で３０サイクルのＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌをとりアガロ
ースゲル電気泳動で、ＤＮＡ増幅物を分析した。その結
果プライマー１と２の組合せで、ポルＩ型のＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の増幅は認められず、他の組合せから増
幅されたいくつかのバンドについて切り出し、Ｍ１３ｍ
ｐ１８のＳｍａＩ部位にブラント−エンドで結合させて
クローニングした後、その塩基配列を調べてコードし得
るアミノ酸配列を求めてみたがα型ＤＮＡポリメラーゼ
とホモロジーのある配列は得られなかった。そこで次
に、プライマーと鋳型ＤＮＡとのアニーリング条件を緩
和し、９４℃１分、３７℃１分、７２℃１分で３０サイ
クルのＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後同様に反応液５μ
ｌをとり、アガロースゲル電気泳動で分析した結果、プ
ライマー１と２の組合せではっきりと３種類のＤＮＡ断
片が増幅されることがわかった。それらは約２．０ｋ
ｂ、約１．５ｋｂそして約０．３ｋｂの長さであった。
このうち約１．５ｋｂと約０．３ｋｂの２種についてゲ
ルよりＤＮＡを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部
位にクローニングして塩基配列を求めた結果、約０．３
ｋｂの断片がコードし得るアミノ酸配列中にポルＩ型Ｄ
ＮＡポリメラーゼの配列との相同性を見出すことができ
た。(2) Amplification of specific DNA fragment using PCR Primers 1 to 8 of the mix primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 in the sequence listing were synthesized by a DNA synthesizer,
Purified. Next, PCR was carried out by using primers in combination of primer 1 and primer 2, primer 3 and primer 4, primer 5 and primer 6, and primer 7 and primer 8. That is, 100 pm for each primer
ol and DNA1n of phage YS40 obtained in (1)
g of 10 mM Tris HCl, pH 8.3, 50
mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 200 μM each
94 with 100 μl of a solution containing deoxynucleotide triphosphate (4 types) 1 unit Taq polymerase
30 cycles of PC at 1 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 minute at 72 ° C
R was done. After completion of PCR, 5 μl of the reaction solution was taken and analyzed by agarose gel electrophoresis for the amplified DNA product. As a result, amplification of the Pol I type DNA polymerase gene was not observed with the combination of primers 1 and 2, and some bands amplified from other combinations were excised, and M13m
After cloning by blunt-end ligation to the SmaI site of p18, the nucleotide sequence was examined to find a codeable amino acid sequence, but no sequence homologous to the α-type DNA polymerase was obtained. Then, next, the annealing conditions of the primer and the template DNA were relaxed, and 30 cycles of PCR were performed at 94 ° C. for 1 minute, 37 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute. After the PCR is completed, the reaction solution is 5μ
As a result of taking 1 and analyzing it by agarose gel electrophoresis, it was found that three kinds of DNA fragments were clearly amplified by the combination of the primers 1 and 2. They are about 2.0k
b, about 1.5 kb and about 0.3 kb in length.
Of these, about 1.5 kb and about 0.3 kb, two kinds of DNA were excised from the gel and cloned into the SmaI site of M13mp18 to obtain the nucleotide sequence.
Pol I type D in the amino acid sequence that can be encoded by the kb fragment.
Homology to the sequence of NA polymerase could be found.

【００４４】（３）ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 ファージＹＳ４０ＤＮＡを１つの制限酵素につき５μｇ
用いて、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｎｄ III、
ＰｓｔＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩでそれぞれ分解した。ア
ガロースゲル電気泳動で分離した後、ゲル中のＤＮＡを
ナイロン膜に移し、（２）のＰＣＲで得た約０．３ｋｂ
のＤＮＡ断片をプローブ１として用いてハイブリダイゼ
ーションを行った。なお、プローブ１はランダムプライ
ミング法により〔α³²ｐ〕ｄＣＴＰを基質に加えて、放
射性標識した。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１％ＳＤＳ、５×
デンハーツ溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、
牛血清アルブミン各１％）、１００μｇ／ｍｌ子牛胸線
ＤＮＡ中で６５℃、５時間行った。１×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後Ｘ線フィルムに感光
してオートラジオグラムをとった。その結果、ゲノミッ
クサザンハイブリダイゼーションにより、プローブ１が
結合するファージＹＳ４０のＤＮＡの制限酵素切断断片
としては、４．５ｋｂのＥｃｏＲＶ断片、３．０ｋｂの
ＥｃｏＴ１４Ｉ断片、２．５ｋｂのＨｉｎｄ III断片、
６．５ｋｂのＰｓｔＩ断片、２．３ｋｂのＳｓｐＩ断
片、そして４．５ｋｂのＸｂａＩ断片があり、これらの
ＤＮＡ断片が陽性シグナルとして検出された。(3) Search for target gene by genomic Southern method 5 μg of phage YS40 DNA per restriction enzyme
Using EcoT14I, EcoRV, HindIII,
It was digested with PstI, SspI and XbaI, respectively. After separation by agarose gel electrophoresis, the DNA in the gel was transferred to a nylon membrane, and the DNA obtained by PCR in (2) was about 0.3 kb.
Hybridization was carried out using the DNA fragment (1) as probe 1. The probe 1 was radiolabeled by adding [α ³² p] dCTP to the substrate by the random priming method. Hybridization is 6 x SSC
(1 × SSC: 0.15M NaCl, 0.015M
Sodium citrate, pH 7.0), 1% SDS, 5x
Den Hearts solution (Ficoll, polyvinylpyrrolidone,
Bovine serum albumin (1% each), 100 μg / ml calf thymus DNA at 65 ° C. for 5 hours. 1 x SSC, 0.1
After washing for 1 hour in a% SDS solution, it was exposed to an X-ray film and an autoradiogram was taken. As a result, by genomic Southern hybridization, as a restriction enzyme cleavage fragment of the DNA of phage YS40 to which probe 1 binds, a 4.5 kb EcoRV fragment, a 3.0 kb EcoT14I fragment, a 2.5 kb Hind III fragment,
There was a 6.5 kb PstI fragment, a 2.3 kb SspI fragment, and a 4.5 kb XbaI fragment, and these DNA fragments were detected as a positive signal.

【００４５】これらの陽性シグナルを示したファージＹ
Ｓ４０のＤＮＡの制限酵素切断断片より、目的のＤＮＡ
断片の選抜は以下のように行った。 ｉ）目的の大きさの各ＤＮＡ断片をそれぞれアガロース
ゲルから切り出した。そしてＥｃｏＴ１４Ｉ断片は平滑
末端化し、他のものはそのまま、それぞれ同じ酵素で開
環したｐＵＣ１９ベクターに組込んだ。 ii）プローブ１の塩基配列より、配列番号１０、１１で
それぞれ表されるＤＮＡ領域を選択し、配列番号１０、
１１でそれぞれ表されるプライマー９，１０をＤＮＡ合
成機で合成し、精製した。 iii)プライマー９とＭ１３プライマーＲＶ（宝酒造社
製）、プライマー１０とＭ１３プライマーＭ４（宝酒造
社製）のそれぞれの組合せで、上記ｉ）で得られた各Ｄ
ＮＡ断片が組込まれたベクターを鋳型としてＰＣＲを行
い、増幅ＤＮＡの大きさを電気泳動により決定した。 iv) 公知のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の平均的
鎖長は約３ｋｂであり、この遺伝子をｐＵＣ１９に組込
み、プライマー９、Ｍ１３プライマーＲＶの組合せで増
幅が予想されるＤＮＡの鎖長は約１．８〜２．０ｋｂで
ある。また、プライマー１０、Ｍ１３プライマーＭ４の
組合せで増幅が予想されるＤＮＡの鎖長は約０．７〜
０．８ｋｂである。前出の表２に示したように、２．５
ｋｂのＨｉｎｄ III断片由来のＤＮＡ断片は、プライマ
ー９、Ｍ１３プライマーＲＶの組合せで１．５ｋｂのＤ
ＮＡが増幅され、プライマー１０、Ｍ１３プライマーＭ
４の組合せで１．０ｋｂのＤＮＡが増幅され、該２．５
ｋｂのＨｉｎｄ III断片由来のＤＮＡ断片は、公知のポ
ルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と大きさが類似したＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子の全長が含有されている可能性
があり、該Ｈｉｎｄ III断片は目的のポリメラーゼ遺伝
子全長をカバーしているＤＮＡ断片として選抜した。Phage Y showing these positive signals
The target DNA was obtained from the restriction enzyme digestion fragment of S40 DNA.
Selection of fragments was performed as follows. i) Each DNA fragment of the desired size was cut out from each agarose gel. The EcoT14I fragment was blunt-ended, and the other fragments were incorporated as they were into the pUC19 vector opened with the same enzyme. ii) From the nucleotide sequence of probe 1, select the DNA regions represented by SEQ ID NOS: 10 and 11, respectively.
Primers 9 and 10 respectively represented by 11 were synthesized by a DNA synthesizer and purified. iii) Each D obtained in i) above in each combination of primer 9 and M13 primer RV (Takara Shuzo), primer 10 and M13 primer M4 (Takara Shuzo)
PCR was carried out using the vector incorporating the NA fragment as a template, and the size of the amplified DNA was determined by electrophoresis. iv) The average chain length of the known Pol type I DNA polymerase gene is about 3 kb, and the chain length of the DNA expected to be amplified by the combination of this gene into pUC19 and primer 9 and M13 primer RV is about 1. It is 8 to 2.0 kb. In addition, the chain length of DNA expected to be amplified by the combination of primer 10 and M13 primer M4 is about 0.7 to
It is 0.8 kb. As shown in Table 2 above, 2.5
The DNA fragment derived from the HindIII fragment of kb was a D of 1.5 kb with the combination of primer 9 and M13 primer RV.
NA is amplified and primer 10, M13 primer M
In the combination of 4, 1.0 kb of DNA was amplified,
The DNA fragment derived from the HindIII fragment of kb has a D size similar to that of the known Pol type I DNA polymerase gene.
It is possible that the full-length NA polymerase gene was contained, and the HindIII fragment was selected as a DNA fragment covering the full-length polymerase gene of interest.

【００４６】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したもののうち、２．
５ｋｂのＨｉｎｄ III断片をクローニングすべく、ファ
ージＹＳ４０ＤＮＡ５０μｇをＨｉｎｄ IIIで分解し、
アガロースゲル電気泳動後、目的の大きさの２．５ｋｂ
のＤＮＡをアガロースゲルより回収した。回収は、電気
的溶出法を用いた。ｐＵＣ１１９をＨｉｎｄ IIIで開環
し、アルカリ性ホスファターゼで末端のリン酸基を除去
したベクターを用意し、回収したＤＮＡと混合して、Ｄ
ＮＡリガーゼで連結反応を行った後、大腸菌ＪＭ１０９
に導入した。得られた組換体の集団の中から、コロニー
ハイブリダイゼーションによって目的のクローンを選択
した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロニー２１
６個を０．５Ｎ水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム溶液で変性させた後、１Ｍ トリスＨＣｌ、１．５
Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）溶液で中和し、紫外線照射
でＤＮＡを膜上に固定した。プローブ調製及びハイブリ
ダイゼーションの条件は上記（３）記載のゲノミックサ
ザン分析に準じた。オートラジオグラフィーの結果５個
のコロニーが陽性を示した。これらのコロニーよりプラ
スミドを回収し、その１つをｐφＹＳ１０１と命名し
た。(4) D containing a DNA polymerase gene
Of those that were positive in the cloned genomic Southern analysis of NA fragments, 2.
50 μg of phage YS40 DNA was digested with Hind III to clone a 5 kb Hind III fragment,
2.5 kb of desired size after agarose gel electrophoresis
Was recovered from the agarose gel. An electro-elution method was used for recovery. A vector prepared by opening pUC119 with Hind III and removing the terminal phosphate group with alkaline phosphatase was prepared and mixed with the recovered DNA to prepare D
After ligation reaction with NA ligase, E. coli JM109
Introduced. A target clone was selected by colony hybridization from the obtained recombinant population. Recombinant colony 21 grown on nylon membrane
After denaturing 6 with 0.5 N sodium hydroxide and 1.5 M sodium chloride solution, 1 M Tris HCl, 1.5
It was neutralized with M NaCl (pH 7.0) solution, and DNA was fixed on the membrane by UV irradiation. The conditions for probe preparation and hybridization were in accordance with the genomic Southern analysis described in (3) above. As a result of autoradiography, 5 colonies were positive. Plasmids were recovered from these colonies, and one of them was named pφYS101.

【００４７】（５）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むフ
ァージＹＳ４０染色体ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 （４）で得られたプラスミドｐφＹＳ１０１に挿入され
ている２．５ｋｂｐのファージＹＳ４０ＤＮＡの塩基配
列をジデオキシチエーンターミネーター法で決定した。
ｐφＹＳ１０１をＳｍａＩ、ＳａｃＩで二重切断し、ヘ
ニコフ（Henikoff) の方法〔ジーン（Gene) 、第２８
巻、第３５１〜３５９頁（１９８４）〕によりエキソヌ
クレアーゼIII とマングビーンヌクレアーゼを用いて種
々の大きさの欠失変異体のセットを調製して、それぞれ
の配列を解読し、得られた配列をつなぎ合せ最終的に配
列表の配列番号１２に示すＨｉｎｄ III断片の全領域に
ついて配列を決定した。(5) Determination of nucleotide sequence of phage YS40 chromosomal DNA fragment containing DNA polymerase gene The nucleotide sequence of 2.5 kbp phage YS40 DNA inserted in the plasmid pφYS101 obtained in (4) was determined by the dideoxy chain terminator method. Were determined.
pφYS101 was double cleaved with SmaI and SacI and the method of Henikoff [Gene, No. 28]
Vol. 351-359 (1984)] using exonuclease III and mung bean nuclease to prepare a set of deletion mutants of various sizes, and decoding the respective sequences. Finally, the entire region of the HindIII fragment shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing was sequenced.

【００４８】（６）プラスミドｐφＹＳ１０３、ｐφＹ
Ｓ２００の構築 配列表の配列番号１２に示した２．５ｋｂのＨｉｎｄ I
II断片の塩基配列を基にオープンリーディングフレーム
の最長の領域を検索すれば配列番号１２の塩基番号２２
９〜２３１のＡＴＧが最長領域の翻訳開始コドンとな
る。よって配列番号１２の塩基番号１から該コドン前の
塩基配列を除去することにより、プロモーター遺伝子と
目的遺伝子が近接したプラスミドに改変できる。またタ
ンパク質の高発現に適したプラスミドベクターに組込む
ことにより、ＤＮＡポリメラーゼの発現に適したプラス
ミドベクターに改変することができる。(6) Plasmid pφYS103, pφY
2.5 kb Hind I shown in SEQ ID NO: 12 of the construction sequence list of S200
If the longest region of the open reading frame is searched based on the nucleotide sequence of the II fragment, the nucleotide number 22 of SEQ ID NO: 12 will be searched.
ATGs 9 to 231 become the translation initiation codon of the longest region. Therefore, by removing the base sequence before the codon from the base number 1 of SEQ ID NO: 12, it can be modified into a plasmid in which the promoter gene and the target gene are close to each other. Further, by incorporating into a plasmid vector suitable for high expression of protein, it can be modified into a plasmid vector suitable for expression of DNA polymerase.

【００４９】塩基配列２２９〜２３１の部位に部位特異
的変異法により、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を導入す
ることができる。該部位特異的導入は、部位特異的変異
体作製システム、ミュータンＫ（宝酒造社製）を用いて
変換した。本発明者らがプラスミドｐφＹＳ１０２と命
名した、ＮｃｏＩの認識部位が導入されたプラスミドよ
り、２．３ｋｂのＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ III断片を、Ｎｃ
ｏＩ、Ｈｉｎｄ IIIで切り出し、タンパク質高発現性プ
ラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＥＴ８Ｃに組込む
ことによって、本発明者らがそれぞれプラスミドｐφＹ
Ｓ１０３、プラスミドｐφＹＳ２００と命名したプラス
ミドを得た。プラスミドｐφＹＳ１０３、及びプラスミ
ドｐφＹＳ２００はそれぞれのプラスミド系に適した高
発現系の宿主に組込み、形質転換体を得ることができ
る。プラスミドｐφＹＳ１０３が組込まれた大腸菌ＪＭ
１０９は大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０３、プラスミ
ドｐφＹＳ２００が組込まれた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００とそ
れぞれ命名した。なお、前出のプラスミドｐφＹＳ１０
１が組込まれた大腸菌ＪＭ１０９は大腸菌ＪＭ１０９／
ｐφＹＳ１０１と命名した。A recognition sequence for the restriction enzyme NcoI can be introduced into the sites of the base sequences 229 to 231 by the site-directed mutagenesis method. The site-specific introduction was converted using a site-specific mutant production system, Mutan K (Takara Shuzo). A 2.3 kb NcoI-HindIII fragment was designated as NcI-HindIII fragment from the plasmid designated by the present inventors as the plasmid pφYS102 and into which the NcoI recognition site was introduced.
By cutting out with oI and HindIII and incorporating into the high protein expression plasmid vectors pTV119N and pET8C, the present inventors have obtained plasmid pφY
A plasmid designated as S103 and plasmid pφYS200 was obtained. The plasmid pφYS103 and the plasmid pφYS200 can be integrated into a host of high expression system suitable for each plasmid system to obtain a transformant. Escherichia coli JM in which the plasmid pφYS103 is incorporated
109 is Escherichia coli JM109 / pφYS103, E. coli BL21 (DE
3) was named E. coli BL21 (DE3) / pφYS200. The plasmid pφYS10 described above is used.
E. coli JM109 containing 1 is E. coli JM109 /
It was named pφYS101.

【００５０】実施例２ 形質転換体による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＪＭ１０９／ｐφＹＳ１０１、大腸菌ＪＭ１０９
／ｐφＹＳ１０３、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹ
Ｓ２００をそれぞれ、アンピシリンが１００μｇ／ｍｌ
の濃度で存在するＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃で培
養した。培養液の濁度が０．５（Ａ６００）のとき、誘
導物質であるＩＰＴＧを添加し、更に１５時間培養を行
った。培養液１ｍｌから集菌し、５０ｍＭ トリスＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、２５％ショ糖溶液で洗浄した。同じ
溶液に再懸濁した後、超音波処理により破砕した後、上
清を６５℃、２０分の熱処理して大部分の大腸菌タンパ
ク質を変性させた。遠心により上清を回収しそれぞれ粗
抽出液１ｍｌを調製した。粗抽出液のＤＮＡポリメラー
ゼ活性を本発明の酵素活性測定法により測定した。結果
は表３に示した通りであるが、大腸菌ＪＭ１０９／ｐφ
ＹＳ１０１で活性の発現が認められ、大腸菌ＪＭ１０９
／ｐφＹＳ１０３由来の粗抽出液では０．２ｍＵ／μ
ｌ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ２００由来の
粗抽出液では５．６ｍＵ／μｌの酵素活性が認められ
た。Example 2 Production of thermostable DNA polymerase by transformant E. coli JM109 / pφYS101, E. coli JM109
/ PφYS103, E. coli BL21 (DE3) / pφY
Ampicillin is 100 μg / ml for each of S200
The cells were inoculated into 5 ml of LB medium existing at the concentration of and cultured at 37 ° C. When the turbidity of the culture solution was 0.5 (A600), IPTG as an inducer was added, and the culture was further performed for 15 hours. Bacteria were collected from 1 ml of culture solution and 50 mM Tris HC
1 (pH 8.0), washed with 25% sucrose solution. After resuspending in the same solution and disrupting by sonication, the supernatant was heat-treated at 65 ° C. for 20 minutes to denature most of the E. coli proteins. The supernatant was recovered by centrifugation and 1 ml of a crude extract was prepared. The DNA polymerase activity of the crude extract was measured by the enzyme activity measuring method of the present invention. The results are shown in Table 3, but E. coli JM109 / pφ
Expression of activity was observed in YS101, and E. coli JM109
/ Pφ YS103-derived crude extract 0.2 mU / μ
1, the crude extract derived from Escherichia coli BL21 (DE3) / pφYS200 had an enzyme activity of 5.6 mU / μl.

【００５１】次に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐφＹＳ
２００をアンピシリンが１０μｇ／ｍｌの濃度で存在す
るＬ培地２５０ｍｌに植菌し、３７℃で培養した。培養
液の濁度が０．５（Ａ６００）のときＩＰＴＧを加えて
更に１５時間培養した後、集菌して約２ｇの菌体を得
た。これより精製を開始し、上記の方法により上清２３
ｍｌを得た。更に、それを６５℃、２０分の熱処理によ
り２１ｍｌの粗抽出液を得た。次に硫安塩析により３０
％飽和の沈殿を遠心分離し、３０−８０％飽和で析出す
る沈殿画分を得た。この沈殿を５０ｍＭ トリスＨＣｌ
（ｐＨ７．０）、２ｍＭ メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）を含む溶液（以下、バッファーＡ
と略す）に溶かし、同じ溶液を外液として透析した後、
同じバッファーＡで平衡化したモノ（Mono) Ｑカラム
（ファルマシア バイオテク社製）に添加してＦＰＬＣ
システム（ファルマシア バイオテク社製）で０−３０
０ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配をかけ展開した。１００
ｍＭ ＮａＣｌ付近に溶出されてくる活性画分を集め
（３．２ｍｌ）、１ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ６．
８）、７ｍＭ メルカプトエタノール、１０％グリセロ
ールを含む溶液（以下、バッファーＢと略す）で透析し
た。次にバッファーＢで平衡化したヒドロキシルアパタ
イトカラム（ＫＢカラム、高研製）に添加した。０−４
００ｍＭのリン酸カリウムの直線濃度勾配を用いて展開
した。２００ｍＭ リン酸カリウム濃度付近に溶出され
てくる活性画分を集め（３．０ｍｌ）、バッファーＡで
透析した。更に、バッファーＡで平衡化したモノＳカラ
ム（ファルマシア バイオテク社製）に添加して０−２
００ｍＭＮａＣｌ直線濃度勾配を用いて展開した。７０
ｍＭ ＮａＣｌ濃度付近に溶出されてくる活性画分を集
め、アミコン（Amicon) ＣＦ２５（グレース社製）にて
濃縮し、最終標品とした。Next, E. coli BL21 (DE3) / pφYS
200 was inoculated into 250 ml of L medium containing ampicillin at a concentration of 10 μg / ml and cultured at 37 ° C. When the turbidity of the culture solution was 0.5 (A600), IPTG was added and the mixture was further cultured for 15 hours, and then the cells were collected to obtain about 2 g of bacterial cells. Purification is started from this, and the supernatant 23
ml was obtained. Further, it was heat-treated at 65 ° C. for 20 minutes to obtain 21 ml of a crude extract. Next, ammonium sulfate salting out
The% saturated precipitate was centrifuged to obtain a precipitate fraction that was precipitated at 30-80% saturation. This precipitate is added to 50 mM Tris HCl.
(PH 7.0), 2 mM mercaptoethanol, 10
% Glycerol, 4 μM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) in solution (hereinafter referred to as buffer A
Abbreviated) and dialyzing the same solution as the external solution,
Add to a Mono Q column (Pharmacia Biotech) equilibrated with the same buffer A and add FPLC.
System (Pharmacia Biotech) 0-30
A linear concentration gradient of 0 mM NaCl was applied for development. 100
Active fractions eluted near mM NaCl were collected (3.2 ml), 1 mM potassium phosphate (pH 6.
8), dialyzed against a solution containing 7 mM mercaptoethanol and 10% glycerol (hereinafter abbreviated as buffer B). Next, it was added to a hydroxylapatite column (KB column, Koken) equilibrated with buffer B. 0-4
Development was performed using a linear gradient of 00 mM potassium phosphate. Active fractions eluted near a concentration of 200 mM potassium phosphate were collected (3.0 ml) and dialyzed against buffer A. Further, it was added to a Mono S column (Pharmacia Biotech) equilibrated with buffer A to give 0-2.
Development was performed using a linear gradient of 00 mM NaCl. 70
The active fractions eluted near the concentration of mM NaCl were collected and concentrated with Amicon CF25 (manufactured by Grace) to obtain the final preparation.

【００５２】[0052]

【発明の効果】本発明により、好熱性ファージ由来の新
規ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が提供される。該遺伝子を
用いることにより、遺伝子工学の分野において有用な耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを工業的に得ることができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a novel DNA polymerase gene derived from thermophilic phage. By using the gene, a thermostable DNA polymerase useful in the field of genetic engineering can be industrially obtained.

【００５３】[0053]

【配列表】[Sequence list]

【００５４】配列番号：1 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23SEQ ID NO: 1 Array length: 23 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23

【００５５】配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21SEQ ID NO: 2 Array length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: YES Array: KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21

【００５６】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： WSSYTSTACC CSWSSATCAT 20SEQ ID NO: 3 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: WSSYTSTACC CSWSSATCAT 20

【００５７】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： TCSGTRTCSC CGTAGATVAC 20SEQ ID NO: 4 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: YES Array: TCSGTRTCSC CGTAGATVAC 20

【００５８】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： WSNYTNTAYC CNWSNATHAT 20SEQ ID NO: 5 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: WSNYTNTAYC CNWSNATHAT 20

【００５９】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： TCNGTRTCNC CRTARATNAC 20SEQ ID NO: 6 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: YES Array: TCNGTRTCNC CRTARATNAC 20

【００６０】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： WSHYTDTAYC CDWSDATHAT 20SEQ ID NO: 7 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: WSHYTDTAYC CDWSDATHAT 20

【００６１】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： TCDGTATCDC CRTARATNAC 20SEQ ID NO: 8 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: YES Array: TCDGTATCDC CRTARATNAC 20

【００６２】配列番号：9 配列の長さ：317 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： GACCCCAACC TCCAAAATAT TCCCTCTTGG TTTAAGAGAT ACATAACAGC AGAAGAAGGA 60 TATGTTCCTG TTTTTGCTGA TTATTCTCAA GTTGAGCTGA GAATCTTAGC TTATCTATCT 120 GGAGATGAGG CCATGATTGA CAGCTGTAAT TCTAAAGACA TGCACAGCGA AAATGCTAGA 180 AAGATTTACA AAATTCCCCC AGATCAACCT GTTCCACCAG AACTAAGGAA GAAAGCAAAA 240 ACAGTTTCAT TCGCCATTCC TTATGGTTCC TCAGCTTATG GGTTGGTTGT GCGTGGAATG 300 TTCTGGAGGT TGGGGTC 317SEQ ID NO: 9 Array length: 317 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: GACCCCAACC TCCAAAATAT TCCCTCTTGG TTTAAGAGAT ACATAACAGC AGAAGAAGGA 60 TATGTTCCTG TTTTTGCTGA TTATTCTCAA GTTGAGCTGA GAATCTTAGC TTATCTATCT 120 GGAGATGAGG CCATGATTGA CAGCTGTAAT TCTAAAGACA TGCACAGCGA AAATGCTAGA 180 AAGATTTACA AAATTCCCCC AGATCAACCT GTTCCACCAG AACTAAGGAA GAAAGCAAAA 240 ACAGTTTCAT TCGCCATTCC TTATGGTTCC TCAGCTTATG GGTTGGTTGT GCGTGGAATG 300 TTCTGGAGGT TGGGGTC 317

【００６３】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列： CAACCAACCC ATAAGCTGAG 20SEQ ID NO: 10 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: YES Array: CAACCAACCC ATAAGCTGAG 20

【００６４】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列： GAGATACATA ACAGCAGAAG 20SEQ ID NO: 11 Array length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Antisense: NO Array: GAGATACATA ACAGCAGAAG 20

【００６５】配列番号：12 配列の長さ：2537 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス：NO 配列： AAGCTTCGAT AACTAAATTT AAAACGCTGG AAGTTTGGTT TTTTATCTTT ACCGAAATAC 60 CCTTTTTGTT TTGTTCGAAG GTTACCTTAA ATAGTTCTGA TGAACAGGTG CAATTAGAAA 120 AGTCTATAGT AAATTGTGTC ATTGTGTTGG CAAGTGTTAC AGGCACGGTT TAATTGTATA 180 CAATGGAAAA GGCTTTTTCA CCTGACACGA AAGAGCTGAG GTGCTACCAT GAGTAGCATG 240 GACAAAGACC TTTTGGGATA CAAAAAAATT GTTGGAATTG ATATAGAAAC TTGGGATGGA 300 AAAAAAGGAG GTTCACTTGA TCCTTACTCA GGAAAAATAG CGTTAGTTCA GATTGCCTAT 360 GACAGAAATA ACATTGTTTT ATACAGACCT TGGGAAAAGA ATTTTGAGGA AGCATTGAAG 420 GTACTTAGCG ATAAAGATGT TTTAAAAGTT GGACACAACT TAAAATTTGA TTTAAAGTTT 480 TTCTACATGA ACAACATATA TCCAGAACCA ATATTTGATA CGATGATTGC ATCACAAATG 540 ATTTATGCTG GGTTAGATGA ACCAGATGAA ATTTCTGAAG TTTTAGAAGC ACTTAAAGAC 600 GATTTGACTA CAGAAGAAGT AGCTATATTT GATGTGTTTG GCAAGAAAAG AACAAAAGCT 660 ACCAAGTTTT CTCACAGTCT GCAGGCTGTC TTAAAGAGAG AACTAAACAT TTTCTTACCA 720 AAAGATGTTC AAAACAGCAA TTGGGGAGGT GAGCTTAGTG AAGCCCAAAA GGAATATGCA 780 ATTAACGATG TTAAATATCT TAAAGATTTG TCAATAGAGT TATGGAAAAA AATAAAGGCA 840 TTGAACATTG AAAATGTGTT TATGTTAGAA ATGAAGTTTT TGCCTGTGTT AGTAATGTTA 900 GAGTTAACAG GGGTGAAAAT TGATAAAGAA GGTTGGAAGA AAAAAATGGA AAAAGAAAAT 960 CAAGAGCTTT TAGAGCTAGA AAAAGAACTT AAAAAGGAAA TATATGAAAA ATTTGTTTCT 1020 AAACAAAGTG AAAAAATGAT GGTCGGATTG TTTGAAGATG CAGAATATGA AAAAATAAAT 1080 CTAAACTCAC CTTTACAAAT GGCAAAAATT TTTGGATTGC CAAATGTTTC TAAGCTAACC 1140 CTTGAGAAAA TTGAAGATCC GACAATAAAA AAGTATGTGG AATACAAAAA GAAAGCAAAG 1200 TTAGTAACAA CCTACTCAAA AGAATACTTA GAAAAACTAA CAGAAAACAA TAGGTTAATG 1260 TCCGATTACT CACAAACGAA GACTGCAACT GGAAGAATTA GTTCTAGTAA CCCCAACCTC 1320 CAAAATGTTC CCTCTTGGTT TAAGAGATAC ATAACAGCAG AAGAAGGATA TGTTCCTGTT 1380 TTTGCTGATT ATTCTCAAGT TGAGCTGAGA ATCTTAGCTT ATCTATCTGG AGATGAGGCC 1440 ATGATTGACA GCTGTAATTC TAAAGACATG CACAGCGAAA ATGCTAGAAA GATTTACAAA 1500 ATTCCCCCAG ATCAACCTGT TCCACCAGAA CTAAGGAAGA AAGCAAAAAC AGTTTCATTC 1560 GCCATTCCTT ATGGTTCCTC AGCTTATGGG TTGGTTGTGC GTGGCATGTT CTCTAGTTTG 1620 GCGGAAGCAG AGGAAGCTAT TGAAGGTTTT TTCAATAGCT TTCCTAAAGT TAAAGAGTTT 1680 CTAGAAAAAA GCGCAAAGAG TGCGCAAAAC GGCATTACTA GAGATGCGTT GGGTAGAGTA 1740 AGAAACTACA AGAAAATCTA TATTAGCGAA GATGAAAAAG GAGCTTTAAA GATACTTATG 1800 TTTAGATTAC CTTCTGGAAT TTCTAAAGAT GAGTTTATAA AGGAGGTTTT AGAGAAAAAT 1860 AGCTTTAAAG ACGCTGCAAA AATTTTTGGA ATGGATGAAC AAATGCTACA GCTAGCAATT 1920 TCTGCTTACG AAAAAACAAA GAAATTGGCT AAGATTGCGA GAGAAGGACA AAATCACCCG 1980 ATTCAAGCTA CTTCTGCATC AATTACAAAA ACAGCTATGG TTGATCTCTT AGAATACCTG 2040 TCAATGACAG GGTATGGATA TATGACTTTA ACAGTTCATG ACAGCATTTT CTTTGAAATC 2100 AAGAAAGAAT TTATTTTTGA TGCACTTCCA AAAATAAAAG AAATAATGGA ACAAGCTGGT 2160 CCAAAAGTTG TTCCCGGAAT TATAACTCCA GTTGATGTTG AGGTAGGAGA GAAAATATCG 2220 GTATATTGCA ATTCTTGCGG TAAAGAAAAC GAGATTAATA GATACATGGT AAATCTAAAT 2280 GAGAAGATAA TTGTTGATTT TACTAAGGAT CCTTATATTT GCGATGAATG CTTTAACAGG 2340 GTTATTTAAA ATAGTTTCTT AACCAAAAAT TCCAGAAGGG CATTAGGGAT ATTGCAAACG 2400 ATGCTACTAT AAAAACTTCT AACAAATCCA ATTTTCTGCC AATCAAGTCT TCAAATAGAT 2460 TAGATATAAT CCACAGAAAT CCAGCTACTC CCCAAGAAAT ATCACGAAAA CTCGGCTTTT 2520 GTTTAATTAT GAAGCTT 2537SEQ ID NO: 12 Array length: 2537 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: double-stranded Topology: linear Sequence Type: Genomic DNA Antisense: NO Array: AAGCTTCGAT AACTAAATTT AAAACGCTGG AAGTTTGGTT TTTTATCTTT ACCGAAATAC 60 CCTTTTTGTT TTGTTCGAAG GTTACCTTAA ATAGTTCTGA TGAACAGGTG CAATTAGAAA 120 AGTCTATAGT AAATTGTGTC ATTGTGTTGG CAAGTGTTAC AGGCACGGTT TAATTGTATA 180 CAATGGAAAA GGCTTTTTCA CCTGACACGA AAGAGCTGAG GTGCTACCAT GAGTAGCATG 240 GACAAAGACC TTTTGGGATA CAAAAAAATT GTTGGAATTG ATATAGAAAC TTGGGATGGA 300 AAAAAAGGAG GTTCACTTGA TCCTTACTCA GGAAAAATAG CGTTAGTTCA GATTGCCTAT 360 GACAGAAATA ACATTGTTTT ATACAGACCT TGGGAAAAGA ATTTTGAGGA AGCATTGAAG 420 GTACTTAGCG ATAAAGATGT TTTAAAAGTT GGACACAACT TAAAATTTGA TTTAAAGTTT 480 TTCTACATGA ACAACATATA TCCAGAACCA ATATTTGATA CGATGATTGC ATCACAAATG 540 ATTTATGCTG GGTTAGATGA ACCAGATGAA ATTTCTGAAG TTTTAGAAGC ACTTAAAGAC 600 GATTTGACTA CAGAAGAAGT AGCTATATTT GATGTGTTTG GCAAGAAAAG AACAAAAGCT 660 ACCAAGTTTT CTCACAGTCT GCAGGCTGTC TTAAAGAGAG AACTAAACAT TTTCTTACCA 720 AAAGATGTTC AAAACAGCAA TTGGGGAGGT GAGCTTAGTG AAGCCCAAAA GGAATATGCA 780 ATTAACGATG TTAAATATCT TAAAGATTTG TCAATAGAGT TATGGAAAAA AATAAAGGCA 840 TTGAACATTG AAAATGTGTT TATGTTAGAA ATGAAGTTTT TGCCTGTGTT AGTAATGTTA 900 GAGTTAACAG GGGTGAAAAT TGATAAAGAA GGTTGGAAGA AAAAAATGGA AAAAGAAAAT 960 CAAGAGCTTT TAGAGCTAGA AAAAGAACTT AAAAAGGAAA TATATGAAAA ATTTGTTTCT 1020 AAACAAAGTG AAAAAATGAT GGTCGGATTG TTTGAAGATG CAGAATATGA AAAAATAAAT 1080 CTAAACTCAC CTTTACAAAT GGCAAAAATT TTTGGATTGC CAAATGTTTC TAAGCTAACC 1140 CTTGAGAAAA TTGAAGATCC GACAATAAAA AAGTATGTGG AATACAAAAA GAAAGCAAAG 1200 TTAGTAACAA CCTACTCAAA AGAATACTTA GAAAAACTAA CAGAAAACAA TAGGTTAATG 1260 TCCGATTACT CACAAACGAA GACTGCAACT GGAAGAATTA GTTCTAGTAA CCCCAACCTC 1320 CAAAATGTTC CCTCTTGGTT TAAGAGATAC ATAACAGCAG AAGAAGGATA TGTTCCTGTT 1380 TTTGCTGATT ATTCTCAAGT TGAGCTGAGA ATCTTAGCTT ATCTATCTGG AGATGAGGCC 1440 ATGATTGACA GCTGTAATTC TAAAGACATG CACAGCGAAA ATGCTAGAAA GATTTACAAA 1500 ATTCCCCCAG ATCAACCTGT TCCACCAGAA CTAAGGAAGA AAGCAAAAAC AGTTTCATTC 1560 GCCATTCCTT ATGGTTCCTC AGCTTATGGG TTGGTTGTGC GTGGCATGTT CTCTAGTTTG 1620 GCGGAAGCAG AGGAAGCTAT TGAAGGTTTT TTCAATAGCT TTCCTAAAGT TAAAGAGTTT 1680 CTAGAAAAAA GCGCAAAGAG TGCGCAAAAC GGCATTACTA GAGATGCGTT GGGTAGAGTA 1740 AGAAACTACA AGAAAATCTA TATTAGCGAA GATGAAAAAG GAGCTTTAAA GATACTTATG 1800 TTTAGATTAC CTTCTGGAAT TTCTAAAGAT GAGTTTATAA AGGAGGTTTT AGAGAAAAAT 1860 AGCTTTAAAG ACGCTGCAAA AATTTTTGGA ATGGATGAAC AAATGCTACA GCTAGCAATT 1920 TCTGCTTACG AAAAAACAAA GAAATTGGCT AAGATTGCGA GAGAAGGACA AAATCACCCG 1980 ATTCAAGCTA CTTCTGCATC AATTACAAAA ACAGCTATGG TTGATCTCTT AGAATACCTG 2040 TCAATGACAG GGTATGGATA TATGACTTTA ACAGTTCATG ACAGCATTTT CTTTGAAATC 2100 AAGAAAGAAT TTATTTTTGA TGCACTTCCA AAAATAAAAG AAATAATGGA ACAAGCTGGT 2160 CCAAAAGTTG TTCCCGGAAT TATAACTCCA GTTGATGTTG AGGTAGGAGA GAAAATATCG 2220 GTATATTGCA ATTCTTGCGG TAAAGAAAAC GAGATTAATA GATACATGGT AAATCTAAAT 2280 GAGAAGATAA TTGTTGATTT TACTAAGGAT CCTTATATTT GCGATGAATG CTTTAACAGG 2340 GTTATTTAAA ATAGTTTCTT AACCAAAAAT TCCAGAAGGG CATTAGGGAT ATTGCAAACG 2400 ATGCTACTAT AAAAACTTCT AACAAATCCA ATTTTCTGCC AATCAAGTCT TCAAATAGAT 2460 TAGATATAAT CCACAGAAAT CCAGCTACTC CCCAAGAAAT ATCACGAAAA CTCGGCTTTT 2520 GTTTAATTAT GAAGCTT 2537

【００６６】配列番号：13 配列の長さ：2310 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA アンチセンス：NO 配列： C ATG GGT AGC ATG GAC AAA GAC CTT TTG GGA TAC AAA AAA ATT GTT 46 Met Gly Ser Met Asp Lys Asp Leu Leu Gly Tyr Lys Lys Ile Val 1 5 10 15 GGA ATT GAT ATA GAA ACT TGG GAT GGA AAA AAA GGA GGT TCA CTT 91 Gly Ile Asp Ile Glu Thr Trp Asp Gly Lys Lys Gly Gly Ser Leu 20 25 30 GAT CCT TAC TCA GGA AAA ATA GCG TTA GTT CAG ATT GCC TAT GAC 136 Asp Pro Tyr Ser Gly Lys Ile Ala Leu Val Gln Ile Ala Tyr Asp 35 40 45 AGA AAT AAC ATT GTT TTA TAC AGA CCT TGG GAA AAG AAT TTT GAG 181 Arg Asn Asn Ile Val Leu Tyr Arg Pro Trp Glu Lys Asn Phe Glu 50 55 60 GAA GCA TTG AAG GTA CTT AGC GAT AAA GAT GTT TTA AAA GTT GGA 226 Glu Ala Leu Lys Val Leu Ser Asp Lys Asp Val Leu Lys Val Gly 65 70 75 CAC AAC TTA AAA TTT GAT TTA AAG TTT TTC TAC ATG AAC AAC ATA 271 His Asn Leu Lys Phe Asp Leu Lys Phe Phe Tyr Met Asn Asn Ile 80 85 90 TAT CCA GAA CCA ATA TTT GAT ACG ATG ATT GCA TCA CAA ATG ATT 316 Tyr Pro Glu Pro Ile Phe Asp Thr Met Ile Ala Ser Gln Met Ile 95 100 105 TAT GCT GGG TTA GAT GAA CCA GAT GAA ATT TCT GAA GTT TTA GAA 361 Tyr Ala Gly Leu Asp Glu Pro Asp Glu Ile Ser Glu Val Leu Glu 110 115 120 GCA CTT AAA GAC GAT TTG ACT ACA GAA GAA GTA GCT ATA TTT GAT 406 Ala Leu Lys Asp Asp Leu Thr Thr Glu Glu Val Ala Ile Phe Asp 125 130 135 GTG TTT GGC AAG AAA AGA ACA AAA GCT ACC AAG TTT TCT CAC AGT 451 Val Phe Gly Lys Lys Arg Thr Lys Ala Thr Lys Phe Ser His Ser 140 145 150 CTG CAG GCT GTC TTA AAG AGA GAA CTA AAC ATT TTC TTA CCA AAA 496 Leu Gln Ala Val Leu Lys Arg Glu Leu Asn Ile Phe Leu Pro Lys 155 160 165 GAT GTT CAA AAC AGC AAT TGG GGA GGT GAG CTT AGT GAA GCC CAA 541 Asp Val Gln Asn Ser Asn Trp Gly Gly Glu Leu Ser Glu Ala Gln 170 175 180 AAG GAA TAT GCA ATT AAC GAT GTT AAA TAT CTT AAA GAT TTG TCA 586 Lys Glu Tyr Ala Ile Asn Asp Val Lys Tyr Leu Lys Asp Leu Ser 185 190 195 ATA GAG TTA TGG AAA AAA ATA AAG GCA TTG AAC ATT GAA AAT GTG 631 Ile Glu Leu Trp Lys Lys Ile Lys Ala Leu Asn Ile Glu Asn Val 200 205 210 TTT ATG TTA GAA ATG AAG TTT TTG CCT GTG TTA GTA ATG TTA GAG 676 Phe Met Leu Glu Met Lys Phe Leu Pro Val Leu Val Met Leu Glu 215 220 225 TTA ACA GGG GTG AAA ATT GAT AAA GAA GGT TGG AAG AAA AAA ATG 721 Leu Thr Gly Val Lys Ile Asp Lys Glu Gly Trp Lys Lys Lys Met 230 235 240 GAA AAA GAA AAT CAA GAG CTT TTA GAG CTA GAA AAA GAA CTT AAA 766 Glu Lys Glu Asn Gln Glu Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Lys 245 250 255 AAG GAA ATA TAT GAA AAA TTT GTT TCT AAA CAA AGT GAA AAA ATG 811 Lys Glu Ile Tyr Glu Lys Phe Val Ser Lys Gln Ser Glu Lys Met 260 265 270 ATG GTC GGA TTG TTT GAA GAT GCA GAA TAT GAA AAA ATA AAT CTA 856 Met Val Gly Leu Phe Glu Asp Ala Glu Tyr Glu Lys Ile Asn Leu 275 280 285 AAC TCA CCT TTA CAA ATG GCA AAA ATT TTT GGA TTG CCA AAT GTT 901 Asn Ser Pro Leu Gln Met Ala Lys Ile Phe Gly Leu Pro Asn Val 290 295 300 TCT AAG CTA ACC CTT GAG AAA ATT GAA GAT CCG ACA ATA AAA AAG 946 Ser Lys Leu Thr Leu Glu Lys Ile Glu Asp Pro Thr Ile Lys Lys 305 310 315 TAT GTG GAA TAC AAA AAG AAA GCA AAG TTA GTA ACA ACC TAC TCA 991 Tyr Val Glu Tyr Lys Lys Lys Ala Lys Leu Val Thr Thr Tyr Ser 320 325 330 AAA GAA TAC TTA GAA AAA CTA ACA GAA AAC AAT AGG TTA ATG TCC 1036 Lys Glu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Glu Asn Asn Arg Leu Met Ser 335 340 345 GAT TAC TCA CAA ACG AAG ACT GCA ACT GGA AGA ATT AGT TCT AGT 1081 Asp Tyr Ser Gln Thr Lys Thr Ala Thr Gly Arg Ile Ser Ser Ser 350 355 360 AAC CCC AAC CTC CAA AAT GTT CCC TCT TGG TTT AAG AGA TAC ATA 1126 Asn Pro Asn Leu Gln Asn Val Pro Ser Trp Phe Lys Arg Tyr Ile 365 370 375 ACA GCA GAA GAA GGA TAT GTT CCT GTT TTT GCT GAT TAT TCT CAA 1171 Thr Ala Glu Glu Gly Tyr Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln 380 385 390 GTT GAG CTG AGA ATC TTA GCT TAT CTA TCT GGA GAT GAG GCC ATG 1216 Val Glu Leu Arg Ile Leu Ala Tyr Leu Ser Gly Asp Glu Ala Met 395 400 405 ATT GAC AGC TGT AAT TCT AAA GAC ATG CAC AGC GAA AAT GCT AGA 1261 Ile Asp Ser Cys Asn Ser Lys Asp Met His Ser Glu Asn Ala Arg 410 415 420 AAG ATT TAC AAA ATT CCC CCA GAT CAA CCT GTT CCA CCA GAA CTA 1306 Lys Ile Tyr Lys Ile Pro Pro Asp Gln Pro Val Pro Pro Glu Leu 425 430 435 AGG AAG AAA GCA AAA ACA GTT TCA TTC GCC ATT CCT TAT GGT TCC 1351 Arg Lys Lys Ala Lys Thr Val Ser Phe Ala Ile Pro Tyr Gly Ser 440 445 450 TCA GCT TAT GGG TTG GTT GTG CGT GGC ATG TTC TCT AGT TTG GCG 1396 Ser Ala Tyr Gly Leu Val Val Arg Gly Met Phe Ser Ser Leu Ala 455 460 465 GAA GCA GAG GAA GCT ATT GAA GGT TTT TTC AAT AGC TTT CCT AAA 1441 Glu Ala Glu Glu Ala Ile Glu Gly Phe Phe Asn Ser Phe Pro Lys 470 475 480 GTT AAA GAG TTT CTA GAA AAA AGC GCA AAG AGT GCG CAA AAC GGC 1486 Val Lys Glu Phe Leu Glu Lys Ser Ala Lys Ser Ala Gln Asn Gly 485 490 495 ATT ACT AGA GAT GCG TTG GGT AGA GTA AGA AAC TAC AAG AAA ATC 1531 Ile Thr Arg Asp Ala Leu Gly Arg Val Arg Asn Tyr Lys Lys Ile 500 505 510 TAT ATT AGC GAA GAT GAA AAA GGA GCT TTA AAG ATA CTT ATG TTT 1576 Tyr Ile Ser Glu Asp Glu Lys Gly Ala Leu Lys Ile Leu Met Phe 515 520 525 AGA TTA CCT TCT GGA ATT TCT AAA GAT GAG TTT ATA AAG GAG GTT 1621 Arg Leu Pro Ser Gly Ile Ser Lys Asp Glu Phe Ile Lys Glu Val 530 535 540 TTA GAG AAA AAT AGC TTT AAA GAC GCT GCA AAA ATT TTT GGA ATG 1666 Leu Glu Lys Asn Ser Phe Lys Asp Ala Ala Lys Ile Phe Gly Met 545 550 555 GAT GAA CAA ATG CTA CAG CTA GCA ATT TCT GCT TAC GAA AAA ACA 1711 Asp Glu Gln Met Leu Gln Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Glu Lys Thr 560 565 570 AAG AAA TTG GCT AAG ATT GCG AGA GAA GGA CAA AAT CAC CCG ATT 1756 Lys Lys Leu Ala Lys Ile Ala Arg Glu Gly Gln Asn His Pro Ile 575 580 585 CAA GCT ACT TCT GCA TCA ATT ACA AAA ACA GCT ATG GTT GAT CTC 1801 Gln Ala Thr Ser Ala Ser Ile Thr Lys Thr Ala Met Val Asp Leu 590 595 600 TTA GAA TAC CTG TCA ATG ACA GGG TAT GGA TAT ATG ACT TTA ACA 1846 Leu Glu Tyr Leu Ser Met Thr Gly Tyr Gly Tyr Met Thr Leu Thr 605 610 615 GTT CAT GAC AGC ATT TTC TTT GAA ATC AAG AAA GAA TTT ATT TTT 1891 Val His Asp Ser Ile Phe Phe Glu Ile Lys Lys Glu Phe Ile Phe 620 625 630 GAT GCA CTT CCA AAA ATA AAA GAA ATA ATG GAA CAA GCT GGT CCA 1936 Asp Ala Leu Pro Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Gln Ala Gly Pro 635 640 645 AAA GTT GTT CCC GGA ATT ATA ACT CCA GTT GAT GTT GAG GTA GGA 1981 Lys Val Val Pro Gly Ile Ile Thr Pro Val Asp Val Glu Val Gly 650 655 660 GAG AAA ATA TCG GTA TAT TGC AAT TCT TGC GGT AAA GAA AAC GAG 2026 Glu Lys Ile Ser Val Tyr Cys Asn Ser Cys Gly Lys Glu Asn Glu 665 670 675 ATT AAT AGA TAC ATG GTA AAT CTA AAT GAG AAG ATA ATT GTT GAT 2071 Ile Asn Arg Tyr Met Val Asn Leu Asn Glu Lys Ile Ile Val Asp 680 685 690 TTT ACT AAG GAT CCT TAT ATT TGC GAT GAA TGC TTT AAC AGG GTT 2116 Phe Thr Lys Asp Pro Tyr Ile Cys Asp Glu Cys Phe Asn Arg Val ATT TAAAATAGTT TCTTAACCAA AAATTCCAGA AGGGCATTAG GGATATTGCA 2169 Ile AACGATGCTA CTATAAAAAC TTCTAACAAA TCCAATTTTC TGCCAATCAA GTCTTCAAAT 2229 AGATTAGATA TAATCCACAG AAATCCAGCT ACTCCCCAAG AAATATCACG AAAACTCGGC 2289 TTTTGTTTAA TTATGAAGCT T 2310SEQ ID NO: 13 Array length: 2310 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: double-stranded Topology: linear Sequence Type: Genomic DNA Antisense: NO Array: C ATG GGT AGC ATG GAC AAA GAC CTT TTG GGA TAC AAA AAA ATT GTT 46    Met Gly Ser Met Asp Lys Asp Leu Leu Gly Tyr Lys Lys Ile Val      1 5 10 15 GGA ATT GAT ATA GAA ACT TGG GAT GGA AAA AAA GGA GGT TCA CTT 91 Gly Ile Asp Ile Glu Thr Trp Asp Gly Lys Lys Gly Gly Ser Leu                  20 25 30 GAT CCT TAC TCA GGA AAA ATA GCG TTA GTT CAG ATT GCC TAT GAC 136 Asp Pro Tyr Ser Gly Lys Ile Ala Leu Val Gln Ile Ala Tyr Asp                  35 40 45 AGA AAT AAC ATT GTT TTA TAC AGA CCT TGG GAA AAG AAT TTT GAG 181 Arg Asn Asn Ile Val Leu Tyr Arg Pro Trp Glu Lys Asn Phe Glu                  50 55 60 GAA GCA TTG AAG GTA CTT AGC GAT AAA GAT GTT TTA AAA GTT GGA 226 Glu Ala Leu Lys Val Leu Ser Asp Lys Asp Val Leu Lys Val Gly                  65 70 75 CAC AAC TTA AAA TTT GAT TTA AAG TTT TTC TAC ATG AAC AAC ATA 271 His Asn Leu Lys Phe Asp Leu Lys Phe Phe Tyr Met Asn Asn Ile                  80 85 90 TAT CCA GAA CCA ATA TTT GAT ACG ATG ATT GCA TCA CAA ATG ATT 316 Tyr Pro Glu Pro Ile Phe Asp Thr Met Ile Ala Ser Gln Met Ile                  95 100 105 TAT GCT GGG TTA GAT GAA CCA GAT GAA ATT TCT GAA GTT TTA GAA 361 Tyr Ala Gly Leu Asp Glu Pro Asp Glu Ile Ser Glu Val Leu Glu                 110 115 120 GCA CTT AAA GAC GAT TTG ACT ACA GAA GAA GTA GCT ATA TTT GAT 406 Ala Leu Lys Asp Asp Leu Thr Thr Glu Glu Val Ala Ile Phe Asp                 125 130 135 GTG TTT GGC AAG AAA AGA ACA AAA GCT ACC AAG TTT TCT CAC AGT 451 Val Phe Gly Lys Lys Arg Thr Lys Ala Thr Lys Phe Ser His Ser                 140 145 150 CTG CAG GCT GTC TTA AAG AGA GAA CTA AAC ATT TTC TTA CCA AAA 496 Leu Gln Ala Val Leu Lys Arg Glu Leu Asn Ile Phe Leu Pro Lys                 155 160 165 GAT GTT CAA AAC AGC AAT TGG GGA GGT GAG CTT AGT GAA GCC CAA 541 Asp Val Gln Asn Ser Asn Trp Gly Gly Glu Leu Ser Glu Ala Gln                 170 175 180 AAG GAA TAT GCA ATT AAC GAT GTT AAA TAT CTT AAA GAT TTG TCA 586 Lys Glu Tyr Ala Ile Asn Asp Val Lys Tyr Leu Lys Asp Leu Ser                 185 190 195 ATA GAG TTA TGG AAA AAA ATA AAG GCA TTG AAC ATT GAA AAT GTG 631 Ile Glu Leu Trp Lys Lys Ile Lys Ala Leu Asn Ile Glu Asn Val                 200 205 210 TTT ATG TTA GAA ATG AAG TTT TTG CCT GTG TTA GTA ATG TTA GAG 676 Phe Met Leu Glu Met Lys Phe Leu Pro Val Leu Val Met Leu Glu                 215 220 225 TTA ACA GGG GTG AAA ATT GAT AAA GAA GGT TGG AAG AAA AAA ATG 721 Leu Thr Gly Val Lys Ile Asp Lys Glu Gly Trp Lys Lys Lys Met                 230 235 240 GAA AAA GAA AAT CAA GAG CTT TTA GAG CTA GAA AAA GAA CTT AAA 766 Glu Lys Glu Asn Gln Glu Leu Leu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Lys                 245 250 255 AAG GAA ATA TAT GAA AAA TTT GTT TCT AAA CAA AGT GAA AAA ATG 811 Lys Glu Ile Tyr Glu Lys Phe Val Ser Lys Gln Ser Glu Lys Met                 260 265 270 ATG GTC GGA TTG TTT GAA GAT GCA GAA TAT GAA AAA ATA AAT CTA 856 Met Val Gly Leu Phe Glu Asp Ala Glu Tyr Glu Lys Ile Asn Leu                 275 280 285 AAC TCA CCT TTA CAA ATG GCA AAA ATT TTT GGA TTG CCA AAT GTT 901 Asn Ser Pro Leu Gln Met Ala Lys Ile Phe Gly Leu Pro Asn Val                 290 295 300 TCT AAG CTA ACC CTT GAG AAA ATT GAA GAT CCG ACA ATA AAA AAG 946 Ser Lys Leu Thr Leu Glu Lys Ile Glu Asp Pro Thr Ile Lys Lys                 305 310 315 TAT GTG GAA TAC AAA AAG AAA GCA AAG TTA GTA ACA ACC TAC TCA 991 Tyr Val Glu Tyr Lys Lys Lys Ala Lys Leu Val Thr Thr Tyr Ser                 320 325 330 AAA GAA TAC TTA GAA AAA CTA ACA GAA AAC AAT AGG TTA ATG TCC 1036 Lys Glu Tyr Leu Glu Lys Leu Thr Glu Asn Asn Arg Leu Met Ser                 335 340 345 GAT TAC TCA CAA ACG AAG ACT GCA ACT GGA AGA ATT AGT TCT AGT 1081 Asp Tyr Ser Gln Thr Lys Thr Ala Thr Gly Arg Ile Ser Ser Ser                 350 355 360 AAC CCC AAC CTC CAA AAT GTT CCC TCT TGG TTT AAG AGA TAC ATA 1126 Asn Pro Asn Leu Gln Asn Val Pro Ser Trp Phe Lys Arg Tyr Ile                 365 370 375 ACA GCA GAA GAA GGA TAT GTT CCT GTT TTT GCT GAT TAT TCT CAA 1171 Thr Ala Glu Glu Gly Tyr Val Pro Val Phe Ala Asp Tyr Ser Gln                 380 385 390 GTT GAG CTG AGA ATC TTA GCT TAT CTA TCT GGA GAT GAG GCC ATG 1216 Val Glu Leu Arg Ile Leu Ala Tyr Leu Ser Gly Asp Glu Ala Met                 395 400 405 ATT GAC AGC TGT AAT TCT AAA GAC ATG CAC AGC GAA AAT GCT AGA 1261 Ile Asp Ser Cys Asn Ser Lys Asp Met His Ser Glu Asn Ala Arg                 410 415 420 AAG ATT TAC AAA ATT CCC CCA GAT CAA CCT GTT CCA CCA GAA CTA 1306 Lys Ile Tyr Lys Ile Pro Pro Asp Gln Pro Val Pro Pro Glu Leu                 425 430 435 AGG AAG AAA GCA AAA ACA GTT TCA TTC GCC ATT CCT TAT GGT TCC 1351 Arg Lys Lys Ala Lys Thr Val Ser Phe Ala Ile Pro Tyr Gly Ser                 440 445 450 TCA GCT TAT GGG TTG GTT GTG CGT GGC ATG TTC TCT AGT TTG GCG 1396 Ser Ala Tyr Gly Leu Val Val Arg Gly Met Phe Ser Ser Leu Ala                 455 460 465 GAA GCA GAG GAA GCT ATT GAA GGT TTT TTC AAT AGC TTT CCT AAA 1441 Glu Ala Glu Glu Ala Ile Glu Gly Phe Phe Asn Ser Phe Pro Lys                 470 475 480 GTT AAA GAG TTT CTA GAA AAA AGC GCA AAG AGT GCG CAA AAC GGC 1486 Val Lys Glu Phe Leu Glu Lys Ser Ala Lys Ser Ala Gln Asn Gly                 485 490 495 ATT ACT AGA GAT GCG TTG GGT AGA GTA AGA AAC TAC AAG AAA ATC 1531 Ile Thr Arg Asp Ala Leu Gly Arg Val Arg Asn Tyr Lys Lys Ile                 500 505 510 TAT ATT AGC GAA GAT GAA AAA GGA GCT TTA AAG ATA CTT ATG TTT 1576 Tyr Ile Ser Glu Asp Glu Lys Gly Ala Leu Lys Ile Leu Met Phe                 515 520 525 AGA TTA CCT TCT GGA ATT TCT AAA GAT GAG TTT ATA AAG GAG GTT 1621 Arg Leu Pro Ser Gly Ile Ser Lys Asp Glu Phe Ile Lys Glu Val                 530 535 540 TTA GAG AAA AAT AGC TTT AAA GAC GCT GCA AAA ATT TTT GGA ATG 1666 Leu Glu Lys Asn Ser Phe Lys Asp Ala Ala Lys Ile Phe Gly Met                 545 550 555 GAT GAA CAA ATG CTA CAG CTA GCA ATT TCT GCT TAC GAA AAA ACA 1711 Asp Glu Gln Met Leu Gln Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Glu Lys Thr                 560 565 570 AAG AAA TTG GCT AAG ATT GCG AGA GAA GGA CAA AAT CAC CCG ATT 1756 Lys Lys Leu Ala Lys Ile Ala Arg Glu Gly Gln Asn His Pro Ile                 575 580 585 CAA GCT ACT TCT GCA TCA ATT ACA AAA ACA GCT ATG GTT GAT CTC 1801 Gln Ala Thr Ser Ala Ser Ile Thr Lys Thr Ala Met Val Asp Leu                 590 595 600 TTA GAA TAC CTG TCA ATG ACA GGG TAT GGA TAT ATG ACT TTA ACA 1846 Leu Glu Tyr Leu Ser Met Thr Gly Tyr Gly Tyr Met Thr Leu Thr                 605 610 615 GTT CAT GAC AGC ATT TTC TTT GAA ATC AAG AAA GAA TTT ATT TTT 1891 Val His Asp Ser Ile Phe Phe Glu Ile Lys Lys Glu Phe Ile Phe                 620 625 630 GAT GCA CTT CCA AAA ATA AAA GAA ATA ATG GAA CAA GCT GGT CCA 1936 Asp Ala Leu Pro Lys Ile Lys Glu Ile Met Glu Gln Ala Gly Pro                 635 640 645 AAA GTT GTT CCC GGA ATT ATA ACT CCA GTT GAT GTT GAG GTA GGA 1981 Lys Val Val Pro Gly Ile Ile Thr Pro Val Asp Val Glu Val Gly                 650 655 660 GAG AAA ATA TCG GTA TAT TGC AAT TCT TGC GGT AAA GAA AAC GAG 2026 Glu Lys Ile Ser Val Tyr Cys Asn Ser Cys Gly Lys Glu Asn Glu                 665 670 675 ATT AAT AGA TAC ATG GTA AAT CTA AAT GAG AAG ATA ATT GTT GAT 2071 Ile Asn Arg Tyr Met Val Asn Leu Asn Glu Lys Ile Ile Val Asp                 680 685 690 TTT ACT AAG GAT CCT TAT ATT TGC GAT GAA TGC TTT AAC AGG GTT 2116 Phe Thr Lys Asp Pro Tyr Ile Cys Asp Glu Cys Phe Asn Arg Val ATT TAAAATAGTT TCTTAACCAA AAATTCCAGA AGGGCATTAG GGATATTGCA 2169 Ile AACGATGCTA CTATAAAAAC TTCTAACAAA TCCAATTTTC TGCCAATCAA GTCTTCAAAT 2229 AGATTAGATA TAATCCACAG AAATCCAGCT ACTCCCCAAG AAATATCACG AAAACTCGGC 2289 TTTTGTTTAA TTATGAAGCT T 2310

ＴT

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明により得られる酵素遺伝子を含有する
２．３ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図であ
る。FIG. 1 is a diagram showing a restriction enzyme map of a 2.3 kb DNA fragment containing an enzyme gene obtained by the present invention.

【図２】本発明により得られる酵素遺伝子を含有する
２．５ｋｂのHind III断片の制限酵素地図を示す図であ
る。FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of a 2.5 kb HindIII fragment containing the enzyme gene obtained by the present invention.

【図３】本発明により得られる酵素の至適ｐＨを示す図
である。FIG. 3 is a diagram showing the optimum pH of the enzyme obtained by the present invention.

【図４】本発明により得られる酵素の至適温度を示す図
である。FIG. 4 is a diagram showing the optimum temperature of the enzyme obtained by the present invention.

【図５】本発明により得られる酵素の至適MgCl₂ 濃度を
示す図である。FIG. 5 is a diagram showing the optimum MgCl ₂ concentration of the enzyme obtained by the present invention.

【図６】本発明により得られる酵素の至適KCl 濃度を示
す図である。FIG. 6 is a diagram showing the optimum KCl concentration of the enzyme obtained by the present invention.

【図７】本発明により得られる酵素のＮＥＭ感受性を示
す図である。FIG. 7 is a view showing NEM sensitivity of an enzyme obtained by the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 石野 良純 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI C12R 1:01) (72) Inventor Yoshizumi Ishino 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Pref. 72) Inventor Ikunobu Kato 3-4-1, Seta, Otsu City, Shiga Prefecture, Central Research Laboratory, Mina Shuzo Co., Ltd. (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/09 ZNA SwissProt / PIR / GeneS eq GenBank / EMBL / DDBJ / GeneSeq BIOSIS / MEDLINE / WPID S (STN)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号１３で表されるアミノ
酸配列、あるいは該配列に１〜数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加の少なくとも１つがされたアミノ酸配
列で示され、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタン
パク質。 1. An amino acid represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing.
Acid sequence, or substitution of one to several amino acids in the sequence,
Amino acid sequence with at least one of deletion, insertion, and addition
Tans shown in columns and having DNA polymerase activity
Pak quality. 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質をコードす
る遺伝子。2. A protein encoding the protein according to claim 1.
That gene. 【請求項３】 下記（１）に示す制限酵素地図を有し、
その長さが２．３ｋｂの遺伝子に含有される請求項２に
記載のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。（１） 3. A restriction enzyme map as shown in (1) below ,
The DNA polymerase gene according to claim 2 , which is contained in a gene having a length of 2.3 kb. (1) 【請求項４】 請求項２又は３に記載のＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子に６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハーツ
溶液、１００μｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ中、６５℃でハ
イブリダイズし、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子。4. The DNA polymerase gene according to claim 2 or 3, wherein 6 × SSC, 1% SDS and 5 × Denhart's are added.
A gene encoding a polypeptide which hybridizes at 65 ° C. in a solution, 100 μg / ml calf thymus DNA , and has DNA polymerase activity. 【請求項５】請求項２〜４のいずれか１項に記載の好熱
性ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた
組換えプラスミドを導入させた形質転換体を培養し、該
培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴と
するＤＮＡポリメラーゼの製造法。5. A transformant in which the recombinant plasmid containing the thermophilic phage-derived DNA polymerase gene according to any one of claims 2 to 4 is introduced, and the DNA polymerase is cultured from the culture. A method for producing a DNA polymerase, which comprises collecting the DNA polymerase.