JP3440097B2

JP3440097B2 - ヒト／ブタハイブリッド第ｖｉｉｉ因子

Info

Publication number: JP3440097B2
Application number: JP51778293A
Authority: JP
Inventors: エス．ローラー，ジョン; エス．ランジ，マーシャル
Original assignee: エモリーユニバーシテイ
Priority date: 1992-04-07
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 2003-08-25
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: DE69334003D1; PT1359222E; EP1359222A2; DE69334003T2; JP3495365B2; US5364771A; EP1359222A3; HK1058946A1; CA2133203A1; ATE284963T1; DK0638088T3; EP1359222B1; AU4279993A; JP2003174876A; ATE322544T1; WO1993020093A1; EP0638088A1; ES2235154T3; US5583209A; EP0638088A4

Description

【発明の詳細な説明】政府は、本発明にいたる研究を部分的に援助した国立
衛生研究所許可第HL40921号に基づき、この発明の権利
を有する。

発明の背景本発明は、一般的には、ヒト／ブタハイブリッド第VI
II因子、および、それらの調製方法および使用に関す
る。

外傷部位において外傷血管の切れた壁に血小板が付着
した時に、血液凝固が始まる。引き続いて、酵素的に制
御された反応のカスケードにおいて、可溶性フィブリノ
ーゲン分子が、酵素トロンビンによって、血栓中に血小
板をともに保持する不溶性フィブリンストランドに変換
される。カスケードの各ステップにおいて、タンパク質
前駆体は、連続して次のタンパク質前駆体を切断するプ
ロテアーゼに変換される。補因子が、多くのステップで
必要である。その活性形態において、タンパク質第VIII
因子は、プロテアーゼ活性化された第IX因子による第Ｘ
因子の活性化に必要な補因子である。

1930年代に、第VIII因子または抗血友病因子が血漿中
で注目され、命名された。1940年代に、第VIII因子中の
欠損が血液凝固疾病である血友病Ａに関連するとされ
た。第VIII因子はＸ染色体に連鎖していることが見いだ
され、そして、タンパク質であることが推定された。ウ
シ、ヒト、およびブタ血漿を包含する研究により、1980
年代に第VIII因子がタンパク質として同定されたが、そ
の決定的な細胞源はまだ不確かであった。

正確には、どのようにして第VIII因子が血液凝固に機
能するのか知られていない。第VIII因子が、トロンビン
または第Xa因子によって、タンパク質分解的に第VIIIa
因子に活性化されることが知られている。カルシウムと
リン脂質との組み合わせにより、第VIIIa因子は、未知
のメカニズムにより、第Ｘ因子のより有効な活性化因子
である第IXa因子を作る。

第VIII因子が欠損している、あるいは、第VIII因子で
処置されないのに第VIII因子に対する抗体を有している
ヒトは、関節内の炎症反応から早期死亡までの様々な範
囲の症状を起こし得、無制御の内部出血を起こしやす
い。アメリカ合衆国内に約10,000人いるひどい血友病患
者は、充分な回数および濃度で投与された場合、血液の
正常な凝固活性を回復し得る第VIII因子の輸液を用いて
治療され得る。事実、第VIII因子の古典的な定義は、血
友病Ａを有する個人由来の血漿中の血液凝固血管を矯正
する、正常な血漿に存在する物質である。

種々の純度の、ヒト血漿由来第VIII因子のいくつかの
調製物が、血友病Ａの治療のために市販されており入手
可能である。これらは、ウィルスに対する熱および界面
活性剤処理された多数人のドナーのプールされた血液由
来の部分精製された第VIII因子を含むが、抗原タンパク
質；抗原不純物とウィルス混入とが低レベルである、モ
ノクローナル抗体精製された第VIII因子；および、臨床
試験進捗中の組換えヒト第VIII因子を、顕著なレベルで
包含する。加えて、部分精製されたブタ第VIII因子の調
製物が、ヒト第VIII因子と結合および中和する循環する
抗体分子のような、ヒト第VIII因子に対するインヒビタ
ー、を有する患者を治療するために入手し得る。

血友病患者は、関節内への再発性出血の後に起こる不
具性血友病性関節炎を予防するために、第VIII因子を毎
日置換する必要がある。しかしながら、第VIII因子の濃
縮物の供給は、商業生産および治療上の使用の問題か
ら、血友病患者を適切に治療するためには充分豊富では
ない。例えば、通常用いられる血漿由来のものは、単離
および精製が困難で、免疫原性があり、そしてエイズお
よび肝炎ウィルスの感染の危険を除去する処理が必要で
ある。組換えヒト第VIII因子は後者の２つの問題を小さ
くし得る。ブタ第VIII因子もまた、代替物を提供し得
る。なぜなら、ヒト第VIII因子は、ブタ第VIII因子を比
較して、生理学的濃度およびpHで不安定であり、血液中
に極めて低濃度（0.2μg/ml血漿）で存在し、そして、
その比血液凝固活性が低いからである。

ヒト第VIII因子のインヒビターの多くは、ブタ第VIII
因子と強固に反応しないので、ブタ第VIII因子は、現
在、ヒト第VIII因子の輸液と反応しない条件下の患者の
第VIII因子欠損を矯正するのに使用されている。ブタ第
VIII因子の限界は、１またはそれより多い輸液後のそれ
に対する阻害抗体の発達である。

上記一般に使用されており、市販されており入手可能
な、そして血漿由来の第VIII因子にともなう問題は、よ
り良い第VIII因子生産の開発に関する関心を促進する。
より活発な第VIII因子分子に対する要求が存在し、それ
にはより多くのユニットの血液凝固活性を１分子あたり
送達し得、選択されたpHおよび生理学的濃度で安定な第
VIII因子分子；阻害抗体を産生しにくい第VIII因子分
子；および、ヒト第VIII因子に対する抗体を既に得てい
る患者において免疫系に検出されない第VIII因子分子が
ある。

それゆえ、本発明の目的は、第VIII因子が欠損してい
るあるいはヒト第VIII因子のインヒビターを有する患者
の血友病を矯正する第VIII因子を提供することである。

本発明のさらなる目的は、血友病患者の治療方法を提
供することである。

本発明の他の目的は、第VIII因子の血液凝固アッセイ
において、増強した効能を有する第VIII因子を提供する
ことである。

本発明のさらなる他の目的は、選択したpHおよび生理
学的濃度で安定な第VIII因子を提供することである。

発明の要旨ヒト／ブタハイブリッド血液凝固性第VIII因子は、ヒ
トおよびブタ第VIII因子サブユニットの単離および組換
えにより、あるいは、ヒトおよびブタ第VIII因子の遺伝
子工学により生産される。

好ましい実施態様としては、第VIII因子のサブユニッ
トは、ヒトまたはブタ血漿から単離および精製され、そ
して、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、ヒトＬ鎖
サブユニットとブタＨ鎖サブユニットとの混合、あるい
は、ブタＬ鎖サブユニットとヒトＨ鎖サブユニットとの
混合のいずれかにより、生産され、それにより、ヒトＬ
鎖／ブタＨ鎖、およびヒトＨ鎖／ブタＬ鎖ハイブリッド
分子を生産する。これらのハイブリッド分子は、イオン
交換クロマトグラフィーにより単離される。

あるいは、組換えDNA法が、ヒト第VIII因子に対応す
る要素とブタ第VIII因子の要素とを交換するのに使用さ
れ、その結果としてヒト／ブタハイブリッド第VIII因子
分子が得られる。

高純度に精製されたヒト／ブタハイブリッド第VIII因
子を調製する方法は、以下の工程：（ａ）血漿由来のヒ
ト第VIII因子のサブユニットおよび血漿由来のブタ第VI
II因子のサブユニットの単離、続いて、ヒトサブユニッ
トとブタサブユニットとの混合による血液凝固活性の再
構成、続いて、イオン交換クロマトグラフィーによるヒ
ト／ブタハイブリッド第VIII因子の単離；（ｂ）組換え
DNA法による、ブタ第VIII因子のドメインの構築、続い
て、ブタおよびヒト第VIII因子のドメインの交換；ある
いは、（ｃ）ヒト第VIII因子の特定のアミノ酸残基と相
同なブタ第VIII因子のアミノ酸残基との部位特異的変位
による置換による、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子
の創造、により得られる。

その結果として得られるヒト／ブタハイブリッド第VI
II因子は、ヒト第VIII因子より高い、そして、ブタ第VI
II因子に比べて等しいかまたはわずかに高い、比活性を
有する。

図面の簡単な説明図１（従来技術）は、サブユニット（Ｈ鎖およびＬ
鎖）ならびにそのドメインを示す第VIII因子の分子の概
略図面である。

発明の詳細な説明 −定義本明細書において用いる「ヒト／ブタハイブリッド第
VIII因子」とは、ヒトおよびブタ第VIII因子由来の配列
を有する、機能性第VIII因子タンパク質分子である。こ
のヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、ブタ第VIII因
子に比べて等しいかまたは高い比活性を有し、ヒト第VI
II因子アッセイにおける活性を有する。特定の実施態様
においては、このヒト／ブタハイブリッド第VIII因子
は、すべてのヒト第VIII因子抗体と交叉反応しない。

本明細書において用いる「比活性」とは、ヒト第VIII
因子欠損血漿の凝固血管を矯正し得る活性を言う。比活
性は、正常のヒト血漿の凝固時間とヒト第VIII因子欠損
血漿の凝固時間と比較する標準アッセイにおいて、第VI
II因子全タンパク質１ミリグラムあたりの凝固活性ユニ
ットで測定する。第VIII因子活性１ユニットは、正常ヒ
ト血漿１ミリリットルに存在する活性である。このアッ
セイにおいては、凝固形成時間が短いほど、第VIII因子
活性は高く測定される。

本明細書において用いられる「ハイブリッド第VIII因
子」または「ハイブリッドタンパク質」とは、部分的に
ヒト起源のおよび部分的にブタ起源に由来するアミノ酸
配列を有する第VIII因子タンパク質である。このハイブ
リッド第VIII因子は、（１）単離した血漿由来のブタま
たはヒトサブユニット（Ｈ鎖またはＬ鎖）と、対応する
ヒトまたはブタサブユニットとの置換；（２）ヒトまた
はブタサブドメイン（A1、A2、A3、A4、Ｂ、C1、および
C2）と、対応するヒトまたはブタドメインとの置換；
（３）ヒトまたはブタドメインの部分と、ブタまたはヒ
トドメインの部分の置換；または（４）ヒト第VIII因子
中の１またはそれより多いアミノ酸残基の、対応するブ
タ配列における前記残基への変換により生産し得る。融
合タンパク質とは、ハイブリッド遺伝子の産物であり、
この融合タンパク質においては、１つのタンパク質のコ
ード配列が、例えば、この融合タンパク質をコードする
ハイブリッド遺伝子を産生する異なる遺伝子由来の第２
のタンパク質をコードする配列と上記１つのコード配列
と融合することにより、広範囲にわたって改変されてい
る。本明細書においては、融合タンパク質は、本出願に
記載されたハイブリッドタンパク質のサブセットであ
る。

本明細書において用いられる「第VIII因子欠損」は、
欠陥第VIII因子の生産により、不完全な第VIII因子また
は生産されない第VIII因子により、あるいはインヒビタ
ーによる第VIII因子の部分的または全体的な阻害により
起こる血液凝固活性の欠損を含む。血友病Ａは、Ｘ染色
体に連鎖した遺伝子中の欠陥、および、それがコードす
る第VIII因子の不在あるいは欠損から起こる第VIII因子
欠失の１タイプである。

本明細書において用いられる、ヒトまたはブタ第VIII
因子の「サブユニット」とは、そのタンパク質のＨ鎖お
よびＬ鎖である。第VIII因子のＨ鎖には、３つの「ドメ
イン」A1、A2、およびＢが含まれる。第VIII因子のＬ鎖
にも、３つの「ドメイン」A3、C1、およびC2が含まれ
る。

−方法の一般的記載高純度に精製されたヒト第VIII因子と比較した時に、
標準血液凝固アッセイにおける活性がより高いヒト／ブ
タハイブリッド第VIII因子の分子は、以下のようにして
構築され得る。

本明細書で開示された、４つのタイプのヒト／ブタハ
イブリッド第VIII因子およびこれらの調製方法：これら
は、（１）（ａ）ブタサブユニット（例えばＨ鎖または
Ｌ鎖）と、対応するヒトサブユニットとの置換により；
（ｂ）ブタドメイン（例えば、A1、A2、A3、Ｂ、C1、お
よびC2）と、対応するヒトドメインとの置換により；
（ｃ）ブタドメインの部分と、対応するヒトドメインの
フラグメントとの置換により；および（２）ヒト第VIII
因子の１またはそれより多いアミノ酸残基の、対応する
ブタ配列における残基への変換により、得られる。この
ハイブリッド分子は、以下により詳細に記載した、多様
な領域の起源に依存してブタ配列より多くのパーセンテ
ージのヒト配列を含有し得、またはその逆であり得る。

以下に、ブタＨ鎖／ヒトＬ鎖からなり、上記で列記し
た第一のタイプのハイブリッドに対応する、ヒト／ブタ
ハイブリッド第VIII因子が、ヒト第VIII因子と比べて、
標準血液凝固アッセイにおいて、より高い血液凝固比活
性を有することを示す。このヒト／ブタハイブリッド第
VIII因子は、インヒビターを有する患者の治療に有用で
あり得る。なぜなら、これらのインヒビターは、ヒトま
たはブタ第VIII因子のいずれと比べても、ヒト／ブタハ
イブリッド第VIII因子との反応性のほうが低いからであ
る。

上記でグループ（１）として列記した、ヒト／ブタハ
イブリッド第VIII因子タンパク質は、血漿由来の第VIII
因子のサブユニットの単離、次いで再構築および精製に
より作られる。上記でグループ（２）として列記したヒ
ト／ブタハイブリッド第VIII因子タンパク質は、組換え
DNA法により作られる。

−単離したヒトおよびブタ第VIII因子サブユニットから
の再構築によるヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の分
子の調製：ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の分子は、調製さ
れ、単離され、そして、これらの血液凝固促進（Procoa
gulant）活性が特徴付けられる。１つの方法［この方法
は、Fay,P.J.らにより、265 J.Biol.Chem.6197（1990）
（本明細書に参照する）で報告された手順、および、Lo
llar,J.S.により、263 J.Biol.Chem.10451（1988）（本
明細書に参照する）で報告された手順を改変したもの］
においては、ヒトおよびブタ第VIII因子のサブユニット
（Ｈ鎖およびＬ鎖）の単離、それに続く、ヒトＨ鎖およ
びブタＬ鎖の組換え、または、ヒトＬ鎖およびブタＨ鎖
の組換えを含む。

それぞれの種由来の個々のサブユニットの単離は、エ
チレンジアミン四酢酸（EDTA）を用いたカルシウムのキ
レート化、そしてそれに続くMono S^TM HPLC（Pharmacia
−LKB、Piscataway、NJ）による、Ｌ鎖/H鎖ダイマーの
解離を含む。ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の分子
は、カルシウムの存在下で単離されたサブユニットから
再構築される。ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖ハイブリッド第VIII
因子またはブタＬ鎖／ヒトＨ鎖ハイブリッド第VIII因子
は、Mono S^TM HPLCを用いて、Lollar,J.S.らにより、71
Blood 137−143（1988）（本明細書に参照する）で報
告されたブタ第VIII因子の単離手順により、未反応性の
Ｈ鎖から単離される。

以下の実施例で詳細に記載するこれらの方法により、
ヒト第VIII因子の血液凝固促進活性の６倍より高い前記
活性を有するヒトＬ鎖／ブタＨ鎖ハイブリッド分子が得
られる。

−ヒトおよびブタ第VIII因子サブユニットをコードする
配列の組換え工学によるヒト／ブタハイブリッド第VIII
因子の分子の調製：ヒト第VIII因子遺伝子は、単離され、ほ乳類細胞にお
いて発現された。これは、Toole,J.J.ら、312 Nature 3
42−347（1984）（Genetics Institute）;Gitschier,J.
ら、312 Nature 326−330（1984）（Genentech）;Wood,
W.I.ら、312 Nature 330−337（1984）（Genentech）;V
ehar,G.A.ら、312 Nature 337−342（1984）（Genentec
h）（これらはそれぞれ本明細書に参照する）で報告さ
れた。そして、アミノ酸配列はcDNAから推定された。Ca
ponらによる米国特許第4,965,199号は、ほ乳類宿主細胞
において第VIII因子を産生する組換えDNA法およびヒト
第VIII因子の精製法を開示する。CHO（チャイニーズハ
ムスターの卵巣）細胞およびBHKC（ベビーハムスターの
腎細胞）における第VIII因子の発現が、既に報告されて
いる。

ヒト第VIII因子をコードするcDNA配列、および、推定
されるアミノ酸配列を、以下に示す。

組換えヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、ドメイ
ンA1−A2−A3−C1−C2に対応する第VIII因子配列をコー
ドするヒトcDNA（Biogen,Inc.）から出発して調製され
る。このcDNAは、Ｂドメインを全く欠いており、ヒト第
VIII因子の単鎖の１−740および1649−2332残基［Wood
ら、312 Nature 330−337（1984）（本明細書に参照す
る）のナンバリング系に基づく］に対応する。Ｂドメイ
ンは欠失しているが、生物学的機能に必要がないと思わ
れる。

ブタ第VIII因子は、血漿から単離され、そして、精製
されている（Fass,D.N.ら、59 Blood 594（1982））。
ブタ第VIII因子のＢドメインおよび一部分のA2ドメイン
のアミノ酸配列［Toole,J.J.ら、83 Proc.Nat'l.Acad.S
ci.U.S.A.5939−5942（1986）（本明細書に参照され
る）］および対応するゲノムDNA配列を以下に示す。ヌ
クレオチド配列におけるコード領域はNH2末端アミノ酸
であるアミノ酸（Gly−Leu−Tyr）に対応する、675位
（GGT CTC TGG ...）から始まる。

ブタとヒトの両方の第VIII因子は、２つのサブユニッ
トのタンパク質として血漿から単離される。図１（従来
技術）に、上記分子のサブユニット構造の概略図面を示
す。Ｈ鎖およびＬ鎖として公知の上記サブユニットは、
カルシウムまたは他の２価の金属イオンを必要とする非
共有結合により、互いに結合している。第VIII因子のＨ
鎖は、共有結合で結合した３つのドメインA1、A2、およ
びＢを含有する。第VIII因子のＬ鎖は、A3、C1、および
C2と名付けられた３つのドメインを含有する。Ｂドメイ
ンは、既知の機能を有さず、第VIII因子の測定可能な任
意のパラメーターにおける顕著な変化をさせずに、タン
パク質分解的にまたは組換えDNA法により、分子から除
去され得る。ヒト組換え第VIII因子は、ほ乳類中で発現
されないとグリコシル化されないが、血漿由来の第VIII
因子と同様の構造および機能を有する。

ヒトおよびブタの両方の活性化第VIII因子（第VIIIa
因子）は、A1ドメインとA2ドメインとの間のＨ鎖の切断
による３つのサブユニットを有する。この構造物はA1/A
2/A3−C1−C2と名付けられた。ヒト第VIIIa因子は、ブ
タ第VIIIa因子が安定な条件下では安定ではない。これ
は、ヒト第VIIIa因子のA2サブユニットの結合が弱いか
らである。ヒトおよびブタ第VIIIa因子のA2サブユニッ
トの解離は、活性の喪失を伴う。

ブタＢドメインのヌクレオチド配列は既知であるの
で、ハイブリッドの全長を構築し得る。ブタ第VIII因子
cDNAの個々のドメインは、クローン化され得、確立され
た変異法により対応するヒトドメインを置換し得る。こ
れらの第VIII因子cDNA分子は、活性なヒト／ブタハイブ
リッド第VIII因子のタンパク質分子の最終発現のために
発現ベクター中へクローン化され得る。

成熟ヒト第VIII因子の残基372−740位に相同である、
完全なブタ第VIII因子のA2ドメインが配列決定され、そ
してアミノ酸配列が推定された。これらの配列を以下に
示す。

−薬学的組成物ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子を含有する薬学的
組成物は、本明細書に参照される手法である、E.W.Mart
inによりRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載
されたような、既知の方法に基づいて調製される。上記
薬学的組成物は、単独、あるいは、適切な薬学的安定化
組成物、送達賦形剤、および／またはキャリア賦形剤と
の組合せである。

好適な一実施態様においては、静脈内輸液に対する好
適なキャリアまたは送達賦形剤は、生理食塩水またはリ
ン酸緩衝化生理食塩水である。

好適な他の実施態様においては、好適な安定化化合
物、送達賦形剤、およびキャリア賦形剤には、アルブミ
ンのような他のヒトまたはブタタンパク質を含有する
が、これに限定されない。

リン脂質賦形剤またはリポソーム懸濁液もまた、薬学
的に受容可能なキャリアまたは送達賦形剤として好適で
ある。これらは、当業者に公知の方法に基づいて調製さ
れ得、そして、例えば、ホスファチジルセリン／−ホス
ファチジルコリン、または表面に負電荷をともに与える
リン脂質または界面活性剤である他の組成物を含有し得
る。なぜなら、第VIII因子は負帯電したリン脂質膜と結
合するからである。リポソームは、適切な脂質（例え
ば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ス
テアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（arac
hadoyl）ホスファチジルコリン、およびコレステロー
ル）を、無機溶媒に溶解し、次いでエバポレートし、容
器の表面上に乾燥した脂質の薄膜として残すことにより
調製され得る。次いで、ヒト／ブタハイブリッド第VIII
因子の水溶液を、上記容器中に注ぐ。この容器を、さら
に手で渦を巻くように振り、容器の側面から脂質物質を
フリーにし、脂質凝集物を分散させ、それによりリポソ
ーム懸濁液を生成する。

ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、ビタミンＫ依
存症血液凝固因子、組織因子（tissue factor）、およ
びフォンビルブラント因子（vWf）または第VIII因子結
合性部位を含むvWfのフラグメント、ならびにショ糖な
どの多糖を含有する、他の適切な安定化化合物、送達賦
形剤、および／またはキャリア賦形剤と組合され得る。

ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、レトロウィル
スベクターのような送達手段を用いた、ヒト第VIII因子
が送達され得るのと同様の方法で、遺伝子治療により、
送達され得る。この方法は、第VIII因子欠陥患者中への
直接移植、または、第VIII因子の分子には透過性である
が細胞には不透過性である移植可能なデバイス中に置か
れる、次いで移植される、第VIII因子cDNAのヒト細胞中
への導入からなる。好適な方法は、レトロウィルスが介
在する遺伝子転移であり得る。この方法においては、外
因性遺伝子（例えば第VIII因子cDNA）は、改変レトロウ
ィルスのゲノム中にクローン化される。この遺伝子は、
宿主細胞のゲノム中に、細胞により発現され得るウィル
ス機構によって挿入される。このレトロウィルスベクタ
ーは、改変され、ウィルスを産生し得ずに、宿主のウィ
ルス感染を防止する。このタイプの治療の一般的原理
は、当業者には公知であり、文献（例えば、Kohn,D.B.
およびP.W.Kantoff、29 transfusion 812−820、1989）
に記載されている。

ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、ハイブリッド
分子の半減期および在庫保存期間を増加させるために、
vWfに結合して保存され得る。さらに、第VIII因子の凍
結乾燥は、vWfの存在下における活性化分子の収率を改
良し得る。商業供給者が現在用いているヒトおよびブタ
第VIII因子の保存方法は、ヒト／ブタハイブリッド第VI
II因子の保存のために用いられ得る。これらの方法は、
以下を含む：（１）部分生成された段階（例えば、さら
に精製することなく輸液とされた第VIII因子「濃縮物」
として）の第VIII因子の凍結乾燥；（２）Zimmerman法
による、第VIII因子の免疫アフィニティー精製および第
VIII因子を安定化するアルブミンの存在下での凍結乾
燥；（３）アルブミンの存在下での組換え第VIII因子の
凍結乾燥。

あるいは、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、0.
6M NaCl、20mM MES、および5mM CaCl₂,pH6.0中、４℃に
おいて、無期限に安定であり、これらの緩衝液中で凍結
して保存し得、そして活性の最低限の喪失で解凍し得
る。

−治療方法ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、阻害抗体を有
するおよび有さない血友病患者ならびに阻害抗体の発達
によりもたらされる第VIII因子欠損を有する患者におけ
る第VIII因子欠損による非制御出血（例えば、関節内
の、頭蓋内の、または胃腸管の出血）を治療するために
用いられる。この活性物質は、好ましくは静脈内に投与
される。

あるいは、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子は、上
記のように、ハイブリッドを産生するように遺伝的に改
変された細胞の移植、または、このような細胞を含有す
るデバイスの移植により、投与され得る。

好適な実施態様においては、ヒト／ブタハイブリッド
第VIII因子単独、あるいは、安定化剤、送達賦形剤、お
よび／またはキャリアとの組合せの薬学的組成物が、ヒ
トまたはブタ第VIII因子の注入に用いられるのと同様の
手順に基づいて、患者に静脈注入される。

上記治療を必要とする患者に投与され得るヒト／ブタ
ハイブリッド第VIII因子組成物の治療投与量は、第VIII
因子欠損の程度に依存する。

一般的には、投与量のレベルを、それぞれの患者の出血
現象の程度および持続時間に合わせて、投与回数（freq
uency）、持続時間、ユニットを調整する。従って、ヒ
ト／ブタハイブリッド第VIII因子は、薬学的に受容可能
なキャリア、送達賦形剤、または安定化剤中に、標準血
液凝固アッセイで測定した時に出血を止めるための治療
学的に有効な量のハイブリッドを患者に送達するのに充
分な量で含有される。

通常、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子投与により
患者において達成される、所望の血漿第VIII因子レベル
は正常の30％から100％までの範囲である。ヒト／ブタ
ハイブリッド第VIII因子の好適な投与の形態において
は、上記組成物は、体重1kgあたり約20ユニットから50
ユニットまでの範囲の好適な投与量で、静脈に注入さ
れ；投与の間隔は、約８時間から24時間の範囲であり
（重症の血友病患者において）；そして、治療持続日数
は、１日から10日の範囲であるか、または、出血がなく
なるまでである。Williams,W.J.ら編（1990）のHematol
ogyにおけるRoberts,H.R.およびM.R.Jonesの『Hemophil
ia and Related Conditions − Congenital Deficienci
es of Prothyombin（Factor II,Factor V,and Factors
VII to XII）』Ch.153、1453−1474,1460を参照のこ
と。インヒビターを有する患者は、ヒト／ブタハイブリ
ッド第VIII因子をより多く必要とするか、または、患者
は、ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子より少なく必要
とするかである。ヒト第VIII因子よりも高い比活性であ
るからである。ヒトまたはブタ第VIII因子を用いた治療
においては、注入される第VIII因子の量は、１工程の第
VIII因子血液凝固アッセイにより決定され、そして、選
択された例では、インビボでの回収は注入後の患者の血
漿中の第VIII因子を測定することにより決定される。任
意の特定の被験体（subject）に対する特定の投与摂生
法（resimens）は、個体の必要性、または組成物の投与
を指示または管理する専門医の判断により、常時調整さ
れ、しかも本明細書で提示される濃度範囲は例としての
みであり、そして、請求項に記載の組成物の範囲または
実際に限定されないことを意図する。

治療は、組成物の単回静脈内投与、あるいは、所望に
より、拡張された時間の期間にわたる定期的または連続
投与の形態を取り得る。あるいは、ヒト／ブタハイブリ
ッド第VIII因子は、多様な時間間隔で、単回または数回
の投与により、リポソームと共に、皮下あるいは経口投
与され得る。

上記に一般的に記載した、ヒト／ブタハイブリッド第
VIII因子の分子、ならびに、単離、特徴付け、産生、お
よび使用方法は、以下の限定されない実施例に関連して
さらに理解され得る。

実施例 1:ブタ第VIII因子およびヒト／ブタハイブリッ
ド第VIII因子のアッセイブタ第VIII因子は、分子の比活性に基づきヒト第VIII
因子より多い凝固活性を有する。これらの結果を実施例
４の表IIに示す。この結果は、ヒトおよびブタ第VIII因
子を公平に比較し得る適切な標準曲線の使用に基づく。
凝固アッセイは、血友病Ａの患者由来の血漿の血液凝固
時間を短縮する第VIII因子の能力に基づく。２種類のア
ッセイを行った：すなわち、１工程のアッセイおよび２
工程のアッセイである。

１工程のアッセイにおいては、0.1mlの血友病Ａ血漿
（George King Biomedical,Inc.）を、0.1mlの活性化さ
れた部分トロンボプラスチン試薬（APTT）（Organon Te
knika）、および0.01mlの試料または標準試薬と水浴中
で37℃で５分間インキュベートした。標準試薬は、希釈
クエン酸緩衝化正常ヒト血漿からなる。インキュベーシ
ョンの後、0.1mlの20mM CaCl₂を点火し、そしてフィブ
リン凝固が生じる時間を視覚による検査により測定し
た。

第VIII因子の１単位を、1mlのクエン酸緩衝化した正
常ヒト血漿中にある量と定義する。ヒト血漿を標準とし
て、ブタおよびヒト／ブタ第VIII因子活性を直接比較し
た。標準血漿または精製タンパク質の希釈を、0.15M Na
Cl、0.02M HEPES（pH7.4）中で行った。標準曲線を、血
漿の３または４の希釈液に基づいて作製し、最大希釈は
1/50であり、そしてlog₁₀血液凝固時間をlog₁₀血漿濃度
に対してプロットすると直線プロットとなる。未知試料
中の第VIII因子の単位数を、標準曲線から時間法により
決定した。

１工程アッセイは、血友病Ａ血漿中で形成された活性
化剤による第VIII因子の内因性活性化に依存するが、２
工程アッセイは予備活性化第VIII因子の血液凝固促進活
性（procoagulant）を測定する。２工程アッセイにおい
て、トロンビンと反応した第VIII因子含有試料を、37℃
で５分間プレインキュベートした活性化された部分トロ
ンボプラスチンおよびヒト血友病Ａ血漿の混合物に添加
した。次いで、得られた血液凝固時間を、上述した同じ
ヒト標準曲線に基づいて単位/mlに変換した。２工程ア
ッセイにおける相対活性は、第VIII因子を予備活性化し
たので、１工程アッセイにおけるより高かった。

実施例 2:ヒトとブタ第VIII因子との間の機能的な相違
の特徴付け。

ブタおよびヒト血漿由来第VIII因子およびヒト組換え
第VIII因子の単離は文献中に記載されている。Fulcher,
C.A.,およびT.S.Zimmerman,79 Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.
S.A.1648−1652（1982）;Toole.J.J.,ら、312 Nature 3
42−347（1984）（Genetics Institute）;Gitschier,
J.,ら、312 Nature 326−330（1984）（Genentech）;Wo
od,W.I.ら、312 Nature 330−337（1984）（Genentec
h）;Vehar,G.A.,ら、312 Nature 337−342（1984）（Ge
nentech）;Fass,D.N.,ら、59 Blood 594（1982）;Tool
e,J.J.,ら、83 Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.5939−5942
（1986）。この単離はいくつかの方法で成し遂げられ
る。上記の調製物の全てはサブユニット組成において類
似しているが、一つにはそれらを比較するのに共通の基
準を用いていないため、以前は注目されていなかった。
本明細書はヒト第VIII因子とブタ第VIII因子との間の機
能的相違の最初の記載である。

ヒト組換え第VIII因子とブタ第VIII因子を比較するた
めに、高度に精製されたヒト組換え第VIII因子（Cutter
Laboratories,Berkeley,CA）およびブタ第VIII因子（F
ass,D.N.,ら、59 Blood 594（1982）に記載のように免
疫精製した）調製物を、Mono Q^TM（Pharmacia−LKB,Pis
cataway,NJ）陰イオン交換カラム（Pharmacia,Inc.）上
の高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）にかけた。Mono
Q^TM HPLC工程の目的は、少量の不純物の除去と共通の
緩衝液への交換は、ヒトおよびブタ第VIII因子を比較す
るためである。1000〜2000単位の第VIII因子を含んでい
るバイアルを5mlのH₂Oで再構築した。次いで、Hepes（p
H7.4で2M）を添加し最終濃度を0.02Mにした。第VIII因
子を、0.15M NaCl、0.02M Hepes、5mM CaCl₂、pH7.4
（緩衝液Ａに0.15M NaClを添加）で平衡化したMono Q^TM
HR 5/5にかけた;10mlの緩衝液Ａ＋0.15M NaClで洗浄
し；そして緩衝液Ａ中の0.15M〜0.90MのNaCl 20mlの直
線濃度勾配を用い、流速1ml/分で溶出した。

ヒト第VIII因子（血漿由来およびMono Q^TM HPLCで精
製）おｙびブタ第VIII因子を比較するために、免疫アフ
ィニティー精製した血漿由来のブタ第VIII因子を、0.04
M Hepes、5mM CaCl₂、0.01％ Tween−80（pH7.4）で1:4
に希釈し、そしてヒト第VIII因子について前の文節に記
載した同じ条件下でMono Q^TM HPLCにかけた。ヒトおよ
びブタ第VIII因子を単離するためのこれらの手順は当業
者にとって標準的なものである。

カラム画分を、１工程凝固アッセイにより第VIII因子
活性についてアッセイし、アッセイ結果の平均を、物質
のA₂₈₀当たりの活性単位で表して表Ｉに示した。この結
果は、１工程アッセイを用いる場合、ブタ第VIII因子
が、ヒト第VIII因子よりも少なくとも６倍大きい活性を
有することを示す。

表Ｉヒトおよびブタ第VIII因子凝固活性の比較活性（U/A₂₈₀）ブタ 21,300 ヒト血漿由来 3,600 ヒト組換え 2,400 実施例 3:ヒトおよびブタ第VIIIa因子の安定性の比較第VIII因子に対する１工程アッセイの結果は、試料中
の第VIIIa因子に対する第VIII因子の活性化、およびお
そらくは形成された第VIIIa因子活性の損失を反映す
る。ヒト第VIII因子およびブタ第VIII因子の安定性の直
接比較を行った。Mono Q^TM HPLC由来の試料を同じ濃度
および同じ緩衝液組成に希釈し、そしてトロンビンと反
応させた。様々な時間で、試料を２工程凝固アッセイす
るために取り出した。代表的には、ピーク活性（２分
後）は、ブタ第VIIIa因子の方がヒト第VIIIa因子より10
倍高かった。そしてブタおよびヒト第VIIIa因子の両方
の活性は実質的に減少し、ヒト第VIIIa因子活性の方が
より急速に減少した。

一般的に、安定なヒト第VIIIa因子を単離する試み
は、安定なブタ第VIIIa因子を生成する条件を用いる場
合ですら成功しない。これを示すために、Mono Q^TM HPL
Cで生成したヒト第VIII因子をトロンビンで活性化し、
そして安定なブタ第VIIIa因子を生成する条件下で、Mon
o S^TM陽イオン交換（Pharmacia,Inc）HPLCにかけた（Lo
llar,J.S.およびParker,C.G.,28 Biochemistry 666,198
9、この教示は本明細書中に援用されている）。

全体積10mlの、0.2M NaCl、0.01M Hepes、2.5mM CaCl
₂、pH7.4中のヒト第VIII因子43μg/ml（0.2μＭ）を、
トロンビン（0.036μＭ）と10分間反応させ、反応後、F
PR−CH₂Cl D−フェニル−プロリル−アルギニル−塩化
メチルケトンを0.2μＭの濃度になるように添加しトロ
ンビンを不可逆的に不活性化した。次いで、混合液を、
40mM 2−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ME
S）、5mM CaCl₂、pH6.0で1:1に希釈し、そして5mM ME
S、5mM CaCl₂、pH6.0（緩衝液Ｂ）＋0.1M NaClで平衡化
したMono S^TM HR 5/5 HPLCカラムに2ml/分の流速でかけ
た。カラムを洗浄せずに、第VIIIa因子を、20mlの緩衝
液Ｂ中の0.1M NaCl〜0.9M NaClの濃度勾配で、1ml/分で
溶出した。

２工程アッセイにおける凝固活性の画分を、これらの
条件下で単一ピークとして溶出した。ピーク画分の比活
性は、約7,500U/A₂₈₀であった。Mono S^TM 第VIIIa因子
ピークのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS−PAGE）した後、タンパク質を銀染
色し、第VIII因子由来の異型二量誘導体（A3−C1−C2/A
1）に対応する２本のバンドを生じた。A2フラグメント
は濃度が低かったので、これらの条件下で銀染色では同
定されず、¹²⁵I標識により微量生成物として同定した。

ヒト第VIII因子を用いた結果に対して、同一の条件下
でMono S^TM HPLCにより単離したブタ第VIIIa因子は、1.
6×10⁶U/A₂₈₀の比活性を有した。ブタ第VIIIa因子の分
析をSDS−PAGEにより行うと、A1、A2、およびA3−C1−C
2サブユニットに対応する３つのフラグメントが示さ
れ、ブタ第VIIIa因子が３つのサブユニットを有するこ
とが証明された。

pH6.0におけるヒトトロンビン活性化第VIII因子調製
物のMono S^TM HPLCの結果は、安定なブタ第VIIIa因子を
生じる条件下で、ヒト第VIIIa因子が不安定であること
を示す。しかし、微量のA2フラグメントがピーク画分で
同定されたが、凝固活性が、少量の異型三量体第VIIIa
因子から生じるのかまたは低い比活性を有する異型二量
体から生じるか否かの決定は、この方法だけからは可能
ではなかった。

ヒト第VIIIa因子がA2サブユニットを失う前にヒト第V
IIIa因子を単離する方法がこの疑問を解決するのに好適
である。この目的に、Mono S^TM緩衝液のpHをpH5まで下
げること包含する手順で単離を行った。Mono Q^TMで精製
したヒト第VIII因子（0.5mg）を、H₂Oで希釈して、0.25
M NaCl、0.01M Hepes、2.5mM CaCl₂、0.05％ Tween−8
0、pH7.4（全体積7.0ml）中の0.25mg/ml（１μＭ）の第
VIII因子の最終組成物を調製した。トロンビンを最終濃
度0.072μＭになるように添加し、そして３分間反応さ
せた。次いで、トロンビンをFPR−CH₂Cl（0.2μＭ）で
不活性化した。次いで、混合液を、40mM 酢酸ナトリウ
ム、5mM CaCl₂、0.01％ Tween−80、pH5.0で1:1に希釈
し、そして0.01mM 酢酸ナトリウム、5mM CaCl₂、0.01％
Tween−80、pH5.0＋0.1M NaClで平衡化したMono S^TM H
R 5/5 HPLCカラムに2ml/分でかけた。カラムを洗浄せず
に、第VIIIa因子を20mlの同緩衝液中の0.1M NaCl〜1.0M
NaClの濃度勾配を用いて1ml/分で溶出した。この結
果、SDS−PAGEおよび銀染色により示されるA2フラグメ
ントの検出可能量を含有するピーク中に凝固活性を回収
した。ピーク画分の比活性は、pH6.0で回収した活性よ
り10倍高かった（75,000U/A₂₈₀対7,500U/A₂₈₀）。しか
し、４℃で長期間安定なpH6.0で単離したブタ第VIIIa因
子に対して、ヒト第VIIIa因子は、Mono S^TMから溶出後
数時間の期間にわたり絶え間なく減少した。さらに、pH
5.0で精製し、直ちにアッセイした第VIIIa因子の比活性
は、ブタ第VIIIa因子のほんの５％であり、アッセイ前
に実質的な解離が生じたことを示す。

これらの結果は、ヒトおよびブタ第VIIIa因子の両方
が、３つのサブユニット（A1、A2、およびA3−C1−C2）
で構成されることを示した。A2サブユニットの解離は、
生理学的イオン強度、pH、および濃度などの特定の条件
下で、ヒトおよびブタ第VIIIa因子の両方の活性の損失
に対応する。特定条件下でのブタ第VIIIa因子の相対的
安定性は、A2サブユニットのより強力な結合による。

実施例 4:ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の調製ブタ第VIII因子Ｌ鎖および第VIII因子Ｈ鎖を、以下の
ように単離した。0.5MのEDTA溶液（pH7.4）を、Mono Q
^TMで精製したブタ第VIII因子に添加して最終濃度を0.05
Mとし、そして室温で18〜24時間放置した。等量の、緩
衝液Ｂ（10mM ヒスチジン−HCl、10mM EDTA、0.02％v/v
Tween 80、pH6.0）を添加し、そしてこの溶液を1ml/分
で、緩衝液Ａ＋0.25M NaClで前もって平衡化したMono S
^TM HR 5/5カラムにのせた。第VIII因子Ｈ鎖は、SDS−PA
GEにより判断されたように、樹脂に結合しなかった。第
VIII因子Ｌ鎖を、20mlの緩衝液Ａ中の0.1〜0.7M NaCl直
線濃度勾配を用いて1ml/分で溶出した。そして第VIII因
子Ｌ鎖はSDS−PAGEで均一であった。第VIII因子Ｈ鎖
を、mono Q^TM HPLCにより以下の方法で単離した。第VII
I因子Ｈ鎖は、第VIII因子Ｌ鎖を精製している間、mono
S^TMに吸着しなかった。第VIII因子Ｈ鎖を含有する吸着
されなかった（full−through）溶出物質に0.5M Hepes
緩衝液（pH7.4）を添加してpH7.2に調節し、そして0.1M
NaCl、0.02M Hepes、0.01％ Tween−80（pH7.4）で平
衡化したmono Q^TM HR5/5 HPLCカラムにのせた。カラム
を10mLの同緩衝液で洗浄し、そして第VIII因子Ｈ鎖を、
20mLの同緩衝液中の0.1〜1.0M NaCl濃度勾配で溶出し
た。ヒトＬ鎖およびＨ鎖を、同じ方法で単離した。

ヒトおよびブタＬ鎖およびＨ鎖を、以下の工程に従っ
て再構築した。100μg/ml濃度のヒトまたはブタ第VIII
因子Ｌ鎖の10μｌを、1M NaCl、0.02M Hepes、5mM CaCl
₂、0.01％ Tween−80（pH7.4）中で、（１）同緩衝液中
の25μＬの異質のＨ鎖60μg/ml;（２）10μｌの0.02M H
epes、0.01％ Tween−80、pH7.4;（３）５μｌの0.6M C
aCl₂と、室温で14時間混合した。この混合液を、0.02M
MES、0.01％ Tween−80、5mM CaCl₂、pH6で1/4に希釈
し、0.1M NaCl、0.02M MES、0.01％ Tween−80、5mM Ca
Cl₂、pH6.0中で平衡化したMono S^TM Hr5/5にのせた。同
緩衝液中で、0.1〜1.0M NaCl 20mlの濃度勾配を1ml/分
で行い、そして0.5mlずつ画分を集めた。画分の280nmで
の吸収を測定し、そして１工程血液凝固アッセイにより
第VIII因子に対する吸収で画分をアッセイした。（Ｈ鎖
に結合していない）遊離Ｌ鎖もまたMono S^TMに結合する
のでＨ鎖が過剰に存在した；過剰のＨ鎖は遊離Ｌ鎖が調
製物の一部分でないことを確実にした。Mono S^TM HPLC
精製に続いて、鎖の４つの可能な組み合わせ全ての再構
築実験を行った：この４つの組合せは、ヒト／ヒトＨ
鎖、ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖、ブタＬ鎖／ブタＨ鎖、ブタＬ
鎖／ヒトＨ鎖である。表IIは、ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖第VI
II因子が天然のブタ第VIII因子（表Ｉ）に匹敵する活性
を有することを示し、ブタＨ鎖中の構成要素がヒト第VI
II因子と比較してブタ第VIII因子の増加した凝固活性対
応していることを示す。

表II: ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子比活性のヒ
トおよびブタ第VIII因子との比較活性（U/A₂₈₀）ブタＬ鎖／ブタＨ鎖 30,600 ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖 44,100 ブタＬ鎖／ヒトＨ鎖 1,100 ヒトＬ鎖／ヒトＨ鎖 1,000 実施例 5:ブタ第VIII因子のA2ドメインの単離および配
列決定ブタ第VIII因子のＢドメインおよびA2ドメインの一部
分だけが以前に配列決定されている（Toole,J.J.,ら、8
3 Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.5939−5942（1986））。
ブタ第VIII因子ＢドメインのゲノムDNA、およびブタ第V
III因子A2ドメイン全体のcDNA配列を本明細書に開示す
る。

ブタ第VIII因子A2ドメインを、ブタ脾臓の全RNAの逆
転写およびPCR増幅によりクローニングした；既知のヒ
ト第VIII因子cDNA配列に基づく縮重プライマー、および
ブタ第VIII因子配列に一部分に基づく正確なブタプライ
マーを用いた。1kbのPCR生成物を単離紙、そしてBluesc
ript^TM（Stratagene）ファージミド（phagemid）ベクタ
ーに挿入することにより増幅した。

ブタA2ドメインを、ジデオキシ配列決定法により完全
に配列決定した。配列は上述した通りである。

実施例 6:組換えヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の
調製ヒト第VIII因子は文献に記載されている。（Toole,J.
J.,ら、312 Nature 342−347（1984）（Genetics Insti
tute）;Gitschier,J.,ら、312 Nature 326−330（198
4）（Genentech）;Wood,W.I.,ら、312 Nature 330−337
（1984）（Genentech）;Vehar,G.A.,ら、312 Nature 33
7−342（1984）（Genentech））。配列は上述した通り
である。

組換えヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の作成に
は、ヒト第VIII因子cDNA領域（Biogen Corp.）を除去
し、そして相同のブタcDNA配列を挿入することが必要で
ある。引き続いて、このハイブリッドcDNAを適切な発現
システムで発現する。これらの実験では、例えば、ヒト
第VIII因子のA2ドメインに対応する全長cDNA配列を、当
業者一般に公知の方法であるオリゴヌクレオチド介在突
然変異により取り除いた（例えば、Sambrook.J.,E.F.Fr
itsch,およびT.Maniatis,Molecular Cloning: A Labora
tory Manual,第15章、Cold Spring Harbor Press,Cold
Spring Harbor,1989を参照）。

この工程は以下の通りである:E.coli CJ236細胞を、
ヒト第VIII因子cDNA挿入物を含むBluescript^TMファージ
で形質転換した。一本鎖のBluescript^TM/ヒト第VIII因
子環状DNAを、M13K07ヘルパーファージを用いて生成
し、続いて標準的な方法により精製した（Sambrook.J.,
E.F.Fritsch,およびT.Maniatis,Molecular Cloning: A
Laboratory Manual,第４章、Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,1989）。突然変異性オリゴヌク
レオチドを、A1ドメインの3'末端、およびA3ドメインの
5'末端に対応して合成した：付加的に、このオリゴヌクレオチドは、ブタA2ドメイ
ンを挿入するのに用いられ得るSnaB1制限部位を提供す
る。一本鎖Bluescript^TM/ヒト第VIII因子にこのオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーションすると、A1とA3
ドメインとの間の領域、すなわち、A2ドメインが「ルー
プアウト（looped out）する」。得られたヘテロ二本鎖
を、T7ポリメラーゼを用いて環状の２本鎖DNAに延ば
し、連結（ligate）し、そしてE.coli XL1−blue^TM（St
ratagene）細胞を形質転換するのに用いた。数種のコロ
ニーからファージミドDNAを単離紙、Xho1で切断し、そ
してファージミドDNAの大きさをアガロースゲル電気永
動により調べることにより形質転換体を、スクリーニン
グした。1kbのA2ドメインの欠失に対して予想されたよ
うに、ヒト第VIII因子/Bluescript^TMより1kb短い３つの
クローンを同定した。この結果は、A1およびA3ドメイン
の境界を横切って配列決定することにより確認した。

ブタA2ドメインを、以下の方法によりヒト第VIII因子
cDNAのA1とA2との間に挿入した。（１）ブタA2ドメイン
のPCR増幅；（２）PCR生成物のゲル精製（エチジウムブ
ロマイド染色により可視化されたハンドを生成するPCR
生成物のアガロースゲル電気永動、次いでバンドを切り
出しDNAを精製してアガロースおよび他の夾雑物を除
去）；および（３）T4 DNAリガーゼを用いるブタA2 cDN
Aの、SnaB1制限部位を用いることにより直鎖状にしたヒ
トA2ドメイン欠失cDNAへの結合。ブタA2をPCR増幅する
ために使用したプライマーは、以下のものであった： 3'プライマーは、ブタ第VIII因子タンパク質配列の736
〜740残基（A2ドメインのＣ末端で）、およびヒト第VII
I因子配列の1649〜1656残基（A3ドメインのＮ末端で）
に対応するヌクレオチドを含有する。ループアウト手順
はA3配列残基を除外したのでA3配列残基が含まれてい
た。結合生成物をXL1−Blue細胞を形質転換するのに用
い、PCRにより分析されたとき所望のブタA2挿入物を含
有する数個のコロニーを生成した。ブタA2ドメインのPC
R増幅した結果、生成物は、A1−A2結合部で不要のチミ
ンを含んでいた。突然変異性オリゴヌクレオチドを用いることにより、この単一塩基をループアウトし、
そして生成物を、ヒトA2欠失cDNAの生成について上述し
たように（実施例６の第３節に）、正確にクローニング
し得る。

ブタA1、A3、C1およびC2ドメインのクローニングは、
ブタA2ドメインのクローニングに用いたのと同じ戦略で
実行可能である。これらドメインのフラグメントを、ル
ープアウト突然変異技術よりクローニングし得る。ヒト
第VIII因子およびその任意のフラグメントにおける、対
応するドメインの切り出しは、単一アミノ酸の除去を含
み、上述したようにループアウト突然変異により実行可
能である。このアプローチにより、全ての可能なドメイ
ンの交換、ドメインのフラグメントの交換、または単一
アミノ酸残基の交換が可能である。

組換えヒト／ブタハイブリッド第VIII因子の生物学的
活性を、最初COS−細胞ほ乳類一次（transient）発現系
を用いることにより、評価し得る。ヒト／ブタハイブリ
ッドcDNAを、COS細胞にトランスフェクトし得、そして
上清を、実施例１で記載された１工程、および２工程凝
固アッセイを用いることにより、第VIII因子活性につい
て分析し得る。さらに、第VIII因子活性を、さらに高感
度で多量のの試料を分析し得る色素原基質アッセイを用
いることにより測定し得る。このアッセイは公知である
（Lollar,P.,G.J.Knutson、およびD.N.Fass,24 Biochem
istry 8056−8064,1985）。第VIII因子活性アッセイに
おいては、同様のアッセイが標準的である（Wood,W.I.,
ら、312 Nature 330−337,1984;Toole,J.J.,ら、312 Na
ture 342−347、1984）。COS細胞中での組換え第VIII因
子を発現は標準的な手法である（Toole,J.J.,ら、312 N
ature 342−347、1984;Pittman,D.D.,およびR.J.Kaufma
n,85 Proc.Nat'L.Acad.Sci.USA 2429−2433、1988）。
本明細書に記載された組換え分子の出発物質として使用
されるヒト第VIII因子cDNAをCOS細胞中で発現させて、
生物学的活性を有する生成物を産生した。この物質を、
ヒト／ブタハイブリッド第VIII因子分子と比較する標準
物として用い得る。ハイブリッド分子を適切に比較する
ために、アッセイにおける活性を比活性に変換した。こ
のために、細胞により産生された第VIII因子量の測定が
必要であり、そして標準物として精製されたヒトおよび
／またはブタ第VIII因子との免疫アッセイによって測定
され得る（例えば、Lollar,P.,ら、71 Blood 137−143,
1988を参照）。

ヒトおよびブタ第VIII因子の配列は、エピトープ（す
なわち、阻害抗体に対する認識部位として）に含まれて
いるようでありMacVector（IBI Corp.,New Haven,CT）
などの市販のを購入した予測コンピュータプログラムを
用いて決定し得る。ブタ第VIII因子の配列は、対応する
（相同な）抗原性ヒト配列に比べて抗原ではなく、そし
て置換体が作成され、標準的な組換えDNA方法に従っ
て、ブタ配列を挿入およびヒト配列を欠失する。ブタ第
VIII因子が、ヒト第VIII因子ほど特定の阻害抗体と反応
しないことはすでに公知である；このことは、阻害剤を
有する患者に対する本発明の治療の基礎を提供する。組
換えハイブリッドの作成後、それらをBethesda阻害剤ア
ッセイを用いて反応性をインビトロで試験する。天然の
ヒト第VIII因子および天然のブタ第VIII因子より反応性
が低いこれらの構築物は、代替の治療法の候補となる。

配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ローラー，ジョンエス．ランジ，マーシャルエス．（ii）発明の名称：ヒト／ブタハイブリッド第VIII因
子（iii）配列数:6 （iv）連絡住所（Ａ）住所人：キルパトリックアンドコーディ
ー（Ｂ）番地：スィート 2800, ピーチトゥリー
ストリート 1100 （Ｃ）市：アトランタ（Ｄ）州：ジョージア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号:30309−4530 （ｖ）コンピューター読み出し形態：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用（Ｃ）OS:PS−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃
1.0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）先願データ：（Ａ）出願番号:US 07/864004 （Ｂ）出願日:1992年４月７日（viii）代理人／事務所情報：（Ａ）氏名：パブスト，パトレアエル（Ｂ）登録情報:31,284 （Ｃ）照会／記録番号:EMU 106PCT （ix）電話回線情報：（Ａ）電話:404−815−6508 （Ｂ）テレファックス:404−815−6555 （２）配列番号:1の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:1130塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ｖ）フラグメント型:N−末端（vi）起源：（Ａ）生物名：ブタ（Ｆ）組織の種類：血液（xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:367アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ｖ）フラグメント型:N末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ブタ（Ｆ）組織の種類：脾臓（xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:9009塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA （iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ｖ）フラグメント型:N末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｆ）組織の種類：肝臓（ix）配列の特徴（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature （Ｂ）存在位置:5001..7053 （Ｄ）他の情報:/注＝"Domain構造:A3−C1−C2doma
inと等価” （ix）配列の特徴（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature （Ｂ）存在位置:1..2277 （Ｄ）他の情報:/注＝"Domain構造:A1−A2domainと
等価” （２）配列番号:4の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:2332アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ｖ）フラグメント型:N末端フラグメント（vi）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｆ）組織の種類：肝臓cDNA配列（xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:1260塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源：（Ａ）生物名：ブタ（xi）配列：配列番号:5 （２）配列番号:6の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:1090アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（iii）ハイポセティカル配列:NO （iv）アンチセンス:NO （ｖ）フラグメント型:N末端（vi）起源：（Ａ）生物名：ブタ（xi）配列：配列番号:6:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/465 ＡＣＡＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ランジ，マーシャルエス. アメリカ合衆国ジョージア 30345, アトランタ，エヌ．ディー．，シーダーキャニオンコート 2870 (56)参考文献特表平４−501508（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1991）, 米国，Ｖｏｌ．266，Ｎｏ．19，ｐ. 12481−12486 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（1986），Ｖｏｌ．83，ｐｐ．5939−5942 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/745 - 14/755 C12N 5/10 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ブタのアミノ酸配列とヒトのアミノ酸配列
を含んで成り、インビトロ凝固アッセイにおいてプロコ
アギュラント活性を有する精製されたハイブリド第VIII
因子の分子であって、（ａ）ヒト第VIII因子から成り、但し、ヒト第VIII因子
A2ドメインがブタのA2ドメインにより置換されている分
子；及び（ｂ）ヒトライト（Ｌ）鎖第VIII因子サブユニットとブ
タヘビー（Ｈ）鎖第VIII因子サブユニットとから成る分
子；から成る群から選択されるハイブリド第VIII因子の分
子。
【請求項２】ヒト第VIII因子から成り、但し、ヒト第VI
II因子のA2ドメインがブタのA2ドメインにより置換され
てる、請求項１に記載のハイブリド第VIII因子の分子。
【請求項３】ヒトＬ鎖第VIII因子サブユニットとブタＨ
鎖第VIII因子サブユニットとから成る、請求項１に記載
のハイブリド第VIII因子の分子。
【請求項４】前記ブタのA2ドメインが、配列番号:2に記
載のアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のハイ
ブリド第VIII因子の分子。
【請求項５】１段階凝固アッセイにおける標準としてヒ
ト血漿が使用される場合に、20,000U/A280タンパク質よ
り高い比活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に
記載の分子。
【請求項６】前記ハイブリドヒト／ブタ第VIII因子が医
薬として許容されるキャリヤーと組合わされる、請求項
１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】前記キャリヤーが安定剤及び供給ビヒクル
から成る群から選択される、請求項６に記載の分子。
【請求項８】前記安定剤がタンパク質及びポリサッカラ
イドから成る群から選択される、請求項７に記載の分
子。
【請求項９】フォンウイルブアンド（von Willebrand）
因子、ビタミンＫ依存性凝固因子及び凝固組織因子から
成る群から選択される凝固因子をさらに含んで成る、請
求項６〜８のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１０】供給ビヒクルがリポゾームである、請求
項７に記載の分子。
【請求項１１】精製されたハイブリド／ヒト／ブタ第VI
II因子の製造方法において、ヒトＬ鎖第VIII因子サブユ
ニットと、ブタＨ鎖第VIII因子サブユニットとを組合わ
せて、インビトロ凝固アッセイにおいてプロコアギュラ
ント活性を有するハイブリド第VIII因子を生成せいめる
ことを含んで成る方法。
【請求項１２】前記ハイブリド・ヒト／ブタ第VIII因子
の分子が、ヒト第VIII因子のＬ鎖サブユニット及びブタ
第VIII因子のＨ鎖サブユニットを単離し、そして精製
し、次に前記ヒトのＬ鎖サブユニットとブタのＨ鎖サブ
ユニットとを混合してハイブリド・ヒト／ブタ第VIII因
子を生成せしめることにより生成される、請求項11に記
載の方法。
【請求項１３】前記ヒト及びブタの第VIII因子サブユニ
ットが、それぞれヒト及びブタの血漿から単離される、
請求項12に記載の方法。
【請求項１４】ヒト第VIII因子のアミノ酸配列を含んで
成り、但し、ヒト第VIII因子A2ドメインがブタA2ドメイ
ンにより置換されているハイブリド第VIII因子をコード
するDNA。
【請求項１５】前記ブタのA2ドメインが、配列番号:2に
記載のアミノ酸配列を有する請求項14に記載のDNA。
【請求項１６】適当な宿主細胞において請求項14又は15
に記載のDNAを発現せしめ、そして前記宿主細胞の細胞
溶解物又は細胞上清からハイブリド第VIII因子を精製す
ることを特徴とする、ハイブリドヒト／ブタ第VIII因子
の製造方法。
【請求項１７】請求項１〜10のいずれか１項に記載のハ
イブリド第VIII因子を含んで成る、第VIII因子の欠損を
治療するための医薬組成物。
【請求項１８】請求項１〜４のいずれか１項に記載のハ
イブリド第VIII因子を医薬として許容されるキャリヤー
と組合わせることを特徴とする、第VIII因子の欠損を治
療するための医薬組成物の製造方法。