JP3435163B2

JP3435163B2 - 黒色腫阻害蛋白質

Info

Publication number: JP3435163B2
Application number: JP50493195A
Authority: JP
Inventors: ボクダーン，ウルリッヒ; ビュトナー，ラインハルト; カルザ，ブリギッテ
Original assignee: ロシュダイアグノスティクスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1993-07-20
Filing date: 1994-07-19
Publication date: 2003-08-11
Anticipated expiration: 2018-08-11
Also published as: ES2139751T3; ATE185152T1; CN1133049A; CA2167693C; AU7531294A; WO1995003328A2; WO1995003328A3; EP0947583A2; JPH09500531A; IL154248A; EP0710248B1; ZA945278B; GR3032212T3; CN1056617C; EP0947583A3; US5770366A; IL110385A; DK0710248T3; DE59408791D1; EP0710248A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、黒色腫阻害蛋白質（melanoma−inhibiting
protein;MIA）、それをコードする核酸、この蛋白質の
単離及び検出方法、並びに療法剤の製造のためのその使
用に関する。

細胞増殖の制御はポジティブに又はネガティブに作用
する因子により調節される。ポジティブな効果を有する
因子には既知の成長因子、例えば上皮成長因子（EG
F）、血小板由来成長因子（PDGF）、インシュリン及び
ソマトメジン類が含まれる。ネガティブな活性、すなわ
ち阻害活性を有する因子には成長促進物質及び成長阻害
物質として使用し得るTGF−β（Robertsら、Proc.Natl.
Acad.Sci.82（1985）,119−123）に加えて、直腸癌細胞
からの（Levineら、Cancer Research 45（1985）,2248
−2254）、メラノーマからの（Bogdahnら、Cancer Rese
arch 49（1989）,5358−5363）、及びラットの乳腺由来
の健康な上皮細胞からの（Ethierら、J.Cell.Phys.142
（1990）,15−20）、内因性腫瘍阻害因子が含まれる。

例えばポジティブな作用を有する成長因子の過剰生産
又はこれらの成長因子に対する変異した細胞の低下した
依存性（Rodeckら、International Journal of Cancer
40（1987）,687−690）による上記制御系の撹乱によ
り、腫瘍細胞が制御されることなく増殖することが可能
になる。種々の腫瘍組織からの前記の腫瘍阻害因子は、
この障害された制御系において療法的に介在し得る興味
ある化合物を提供する。このような療法的使用のために
は、これらの因子が多量に且つ再現性ある純度で提供可
能でなければならない。しかしながら、これらの因子の
ほとんどについて、それらの複雑な且つ時として未知の
組成のため、及び同時にそれらの製造の再現性の欠如の
ために、療法的適用のために適当ではない、細胞溶解物
から濃縮されたに過ぎない画分が今までに記載されてい
る。

本発明は、細胞系HTZ 19−dM及びATCC CRL 1424の増
殖を阻害し、そしてａ）成熟蛋白質もしくはｎ−末端プレ配列を有する蛋白
質のために配列番号:1に示すDNA配列、又は配列番号:3
に示すゲノム配列によりコードされており、あるいはｂ）配列番号:1もしくは３に示すDNA配列、又は成熟蛋
白質をコードするDNA領域中のこれらのDNA配列の断片と
ハイブリダイズするDNA配列によりコードされている、
新規な黒色腫阻害蛋白質（以下、MIA蛋白質又はMIAと称
する場合がある）に基礎を置いている。

増殖阻害は、抗増殖活性として理解すべきである。こ
の方法においては、細胞の増殖は、培地にMIA蛋白質を
添加することによりかなり妨害される。このための適切
な濃度は例えば0.1μg MIA蛋白質/ml培地である。しか
しながら、MIA蛋白質のより高い又はより低い濃度は、
濃度に対してより高く又はより低く依存することが観察
される増殖阻害のために適切である。

このような蛋白質の性質は本発明者らにより、Cancer
Research 49（1989）,5358−5363;Cancer Research 50
（1990）,6981−6986;Melanoma Research 2（1992）,32
7−336に記載されている。しかしながら、この蛋白質の
再現可能な製造方法はそれらの刊行物には記載されてい
ない。この蛋白質は、今まで公衆に入手可能でなかった
ヒト黒色腫細胞系HTZ 19−dMから得られる。この細胞系
は転移悪性黒色腫に由来し、そして0.8mmol/LのＬ−グ
ルタミン、非必須アミノ酸、10μg/mlのトランスフェリ
ン、30mmol/Lの亜セレン酸ナトリウム及び４μg/mlのゲ
ンタマイシンを含有する定義された血清不含有培地（50
％ Dulbecco最小必須培地、50％Ｆ−12）中で標準的
培養条件下で単層培養物として培養された。この細胞系
はBraunschweigのDeutsche Sammlung fur Mikroorganis
men und Zellkulturen GmbHに1993年６月22日に寄託さ
れた（DSM ACC 2133）。これもまた本発明の更なる対象
である。本発明の蛋白質はこの細胞系の培養上清から、
約11kDのサイズを有する蛋白質画分のクロマトグラフィ
ー分離、及びそれに続く、逆相HPLCによるこの画分の精
製により得ることができる。

この蛋白質は、そのDNA配列により及びそれに由来す
るアミノ酸配列により定義することができる。MIA蛋白
質は個体ごとに異る天然対立遺伝子（allel）変異とし
て存在し得る。しかしながらそれらは、全配列に対する
アミノ酸の除去、挿入及び付加であってもよい。本発明
のMIA蛋白質は、程度及び型に関して、それが発現され
る細胞及び細胞型に依存して、グリコシル化形でもよ
く、又は非−グリコシル化形であってもよい。

本発明の蛋白質はまた、組換え法によっても製造する
ことができる。非−グリコシル化MIAは、それが原核生
物において組換え生産される場合に得られる。本発明に
より提供される核酸配列により、任意の所望の細胞（例
えば、ヒトの細胞とは別に、さらに他の哺乳類におい
て）のゲノム中のMIA遺伝子又はその変異体を探し、そ
れらを同定し、そしてMIA蛋白質をコードする所望の遺
伝子を単離することができる。このような方法及び適当
なハイブリダイゼーション条件は当業者に知られてお
り、そして例えばJ.Sambrook,Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,1989;及びB.D.Hames,S.G.Hi
gins,Nacleic acid hybridization−a practical appro
ach（1985）IRL Press、オックスフォード、英国、に記
載されている。この場合、これらの刊行物に記載されて
いる標準的方法が実験において通常使用される。

組換えDNA技法の使用が、多くのMIA蛋白質誘導体の生
産を可能にする。このような誘導体は例えば個々の又は
幾つかのアミノ酸において、置換、除去又は付加により
修飾され得る。誘導体化は、例えば、部位特定変異誘発
により行うことができる。この変更は当業者により容易
に行うことができる（J.Sambrook,B.D.Hames,Loc.Li
t.）。MIA蛋白質の特徴的性質（前記の細胞系の阻害）
が保存されていることを確認しなければならないのみで
ある。

従って本発明はさらに、ａ）外来性DNAの原核性又は真核性発現の生成物であ
る、ｂ）成熟蛋白質のため又はＮ−末端プレ配列を有する蛋
白質のための配列番号:1に示すDNA配列により、あるい
は配列番号:3に示すゲノム配列によりコードされてい
る、ｃ）配列番号:1もしくは３に示すDNA配列又は成熟蛋白
質をコードするDNA領域中のDNA配列の部分とハイブリダ
イズするDNA配列によりコードされている、あるいはｄ）もし遺伝子コードの縮重がないと仮定すれば、前記
ｂ）〜ｃ）に定義する配列とハイブリダイズしそして同
一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDN
A配列によりコードされている、 MIA蛋白質に関する。

配列番号:1のヌクレオチド40−432又は112−432によ
り、又は遺伝子コドンの縮重により同じアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードするDNA配列によりコード
されている蛋白質が好ましい。

HTZ 19−dMからのMIA蛋白質は約11kDの分子量を有
し、熱安定性（100℃にて３分間）であり、そして例え
ばトリプシンのごときプロテアーゼに対して感受性であ
る。

本発明は、MIA蛋白質をコードしており、そしてａ）配列番号:1もしくは３に示すDNA配列又はその相補
的配列、ｂ）前記ａ）の配列のいずれかとハイブリダイズする核
酸配列、ｃ）もし遺伝子コードの縮重が存在しないと仮定すれ
ば、前記ａ）又はｂ）に記載した配列のいずれかとハイ
ブリダイズするであろう核酸配列、から成る群から選択される核酸に関する。

本発明はさらに、例えばマウス、ラット、ウシ又はヒ
ツジのごとき哺乳類細胞からの、細胞系HTZ 19−dM及び
ATCC CRL1424の増殖を同様の態様で阻害する黒色腫阻害
蛋白質、例えばヒトMIA蛋白質に関する。

ヒトMIAに類似するこれらの蛋白質は、当業者になじ
みの方法に従って、ヒトMIAをコードする配列を含有す
るハイブリダイゼーションサンプルにより対応する哺乳
類のcDNAライブラリーをスクリーニングし、ヒト及びネ
ズミMIAのDNA及び蛋白質配列（配列番号:1〜５）の配列
比較を行い、そしてコード断片を同定することにより得
ることができる。

本発明の好ましい態様は、ネズミMIA蛋白質及びそれ
をコードする核酸配列（配列番号:4）である。ネズミの
蛋白質は配列番号:4のヌクレオチド110−499又は179−4
99によりコードされている。

これらの核酸により、本発明の蛋白質は再現性ある態
様で多量に得ることができる。原核生物又は真核生物例
えば原核性宿主細胞又は真核性宿主細胞での発現のた
め、当業者になじみの方法に従って核酸配列が適当な発
現ベクターに組み込まれる。この様な発現ベクターは好
ましくは制御可能な／誘導性のプロモーターを含有す
る。次に、これらの組換えベクターは発現のために適当
な宿主細胞、例えば原核性宿主細胞として大腸菌、ある
いは真核性宿主細胞としてサッカロミセス・セレビシエ
−（Saccharomyces cerevisiae）、テラト（Terato）癌
細胞系PA−1 sc 9117（Buetterら、Mol.Cell.Biol.11
（1991）,3573−3583）、昆虫細胞、CHO又はCOS細胞に
導入し、そして形質転換又はトランスダクトされた宿主
細胞を外来遺伝子の発現を許容する条件下で培養する。
蛋白質の単離は既知の方法に従って、宿主細胞から又は
宿主細胞の培養上清から行うことができる。この様な方
法は、例えばAusebel I.,Frederick,M.,Current Protoc
ols in Mol.Biol.（1992）,John Wiley and Sons、ニュ
ーヨーク、により記載されている。さらに、蛋白質のイ
ンビトロ再活性化が必要な場合もある。

配列番号:1（cDNA）のヌクレオチド40−432もしくは1
12−432（コード配列）又は配列番号:3のゲノムDNA配列
は、本発明の蛋白質の組換え生産のために好適に使用さ
れる。

さらに、本発明は、ゲルクロマトグラフィー分離、及
び逆相HPLCによる約11kD（SDS−PAGE、非−還元）の分
子量に対応する画分の精製によって黒色腫細胞系HTZ 19
−dMの培養上清を単離することにより、MIA蛋白質を得
る方法に関する。この方法により、培養上清1L当り約0.
2μｇを得ることができる。

好ましい態様においては、天然MIA蛋白質を、単離及
び精製の間に酸処理にかける。これによりMIA活性を濃
縮することができる。有利には約２のpH値が適用され、
酸として例えば酢酸が適当である。

MIA蛋白質を組換え生産する、形質転換又はトランス
ダクトされた宿主細胞の検出及び蛋白質の精製は、好ま
しくは、この蛋白質に結合する抗体により行われる。こ
のような抗体は、既知の方法に従う簡単な態様で、抗原
又は免疫原として本発明の蛋白質を用いて得ることがで
きる。

従って本発明はさらに、本発明の黒色腫阻害活性蛋白
質に結合する抗体の製造のための、該蛋白質の使用に関
する。

このため、この目的に通常使用される動物、例えば特
にヒツジ、ラビット又はマウスが本発明の蛋白質により
免疫され、そして次に免疫された動物から既知の方法に
従って抗血清が単離され、又は免疫された動物の脾細胞
がKoehler及びMilistein（Nature 256（1975）,495−49
7）の方法に従って、不滅化細胞、例えば骨髄腫細胞と
融合される。MTAに対するモノクローナル抗体を生産す
る細胞は、こうして得られたハイブリドーマ細胞から選
択され、そしてクローニングされる。こうして得られた
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、支持体
材料、黒色腫阻害蛋白質の免疫吸着精製のために、例え
ばセルロースに結合させることができる。従って、この
種の抗体はサンプル、例えば切断した組織又は体液中の
MIA蛋白質の検出のために使用することができる。

従って本発明はさらに、MIA蛋白質により動物を免疫
しそして該免疫された動物の血清又は脾細胞から抗体を
単離することにより得られる、MIAに対する抗体に関す
る。

MIA蛋白質は、黒色腫細胞に対してのみならず、より
小さい程度に、例の腫瘍細胞、例えば膠芽細胞腫細胞、
神経芽細胞腫、小細胞肺癌及び神経外胚葉腫瘍に対して
も、DNA合成を阻害することにより（³H−チミジンの取
り込み（Coligan J.E.,Krusbeek A.M.,Margulies D.H.,
Shevach E.M.,Strober W.,Corrent Protocols Immunolo
gy,NIH Monograph,J.Wiley and Sons、ニューヨーク、1
992））、軟寒天中での腫瘍コロニーの形成の阻害によ
り、又は腫瘍幹細胞アッセイにおいて（Schlag P.,Flen
tje D.,Cancer Treatment Rev.11:Suppl.A:131−137,19
84）、阻害活性を示すことが示された。これに対して、
正常な非−変質（non−degenerate）細胞は阻害されな
い。この蛋白質は非常に低濃度（ナノグラムの範囲）で
すでに作用する。従ってこの蛋白質は腫瘍療法のための
療法剤の製造のために有用である。このような療法剤は
特に、悪性黒色腫、悪性膠細胞腫、気管支癌（特に、小
細胞気管支癌、CSLC）の療法のために適当である。

さらに、黒色腫阻害蛋白質は末梢血リンパ球のインタ
ーロイキン−２依存性でフィトヘマグルチニンに誘導さ
れる増殖を抑制することが見出された。Ｔリンパ球の細
胞毒性も低下する。従って黒色腫阻害蛋白質はまた、免
疫抑制剤として使用され得る療法剤の製造のためにも適
当である。

従ってさらに、本発明は腫瘍の治療において又は免疫
抑制剤として使用され得る療法剤の製造のための、本発
明の蛋白質の使用に関する。

本発明の蛋白質は、前記の療法的適用のための医薬製
剤において、所望により、通常使用される助剤、増量剤
及び／又は添加剤と共に加工される。

従ってさらに、本発明は、本発明の黒色腫阻害蛋白質
を、及び所望により通常使用される助剤、増量剤及び／
又は添付加剤と共に含む医薬組成物に関する。

本発明はさらに、遺伝子療法における、そして特に遺
伝子療法のための医薬の製造のための、MIA遺伝子の配
列、好ましくはMIA活性を有する蛋白質をコードする配
列、又は５′−非翻訳領域からの活性化配列、の使用に
関する。

体細胞の遺伝子療法は、例えばレトロウイルスベクタ
ー、他のウイルスベクターを使用することにより、又は
非−ウイルス遺伝子移行により達成することができる
（明確にするため、T.Friedmann,Science 244（1989）1
275;Morgan 1993,RAC DATA MANAGEMENT REPORT,1993年
６月、を参照のこと）。

遺伝子療法のために適当なベクター系は、例えば、レ
トロウイルス（Mulligan,R.C.（1991）,Nobel Symposiu
m 8:Ethiology of human disease at the DNA level（L
indsten,J.及びPattersun編集）、143−189頁、Raven P
ress）、アデノ関連ウイルス（McLughlin,J.Virol.62
（1988）,1963）、ワクシニアウイルス（Mossら、Ann.R
ev.Immunol.5（1987）,305）、ウシ・パピローマウイル
ス（Rasmussenら、Methods Enzymol.139（1987）,64
2）、又は肝炎ウイルス、例えばエプスタイン・バール
ウイルス（Margolskeeら、Mol.Cell.Biol.8（1988）,29
37）もしくはヘルペス単純ウイルスの群からのウイルス
である。

さらに、非−ウイルス供給系も知られている。このた
め、通常、「ヌード」核酸、好ましくはDNA、又は例え
ば移行剤のごとき助剤（リポゾーム、デンドロマー、ポ
リリジン−トランスフェリン−結合体（Wagner,1990;Fe
lgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84（1987）,741
3））と共に核酸が使用される。

遺伝子療法の他の好ましい方法は相同性組換えに基礎
を置いている。この場合、MIA蛋白質をコードする遺伝
子を１又は複数のコピーの形で体細胞のゲノムに挿入す
ることができ、そして／又は細胞内に本来存在するMIA
遺伝子を調節し（modulate）、好ましくは活性化するこ
とができる。

相同性組換えの方法は、例えば、Kucherlapati,Proc.
in Nucl.Acids.Res.and Mol.Biol.36（1989）,301;Thom
asら、Cell 44（1986）,419−428;Thomas及びCapecchi,
Cell 51（1987）,503−512;Doetschmanら、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 85（1988）,8583−8587;及びDoetschman
ら、Nature 330（1987）,576−578に記載されている。
これらの方法においては、ゲノムの特定の部位に組込ま
れるべきDNAの部分（MIAの遺伝子断片）が標的化（targ
eting）DNAに連結される。標的化DNAはゲノムDNAの領域
（好ましくは、MIA遺伝子内又はその近傍）に対して相
補的（相同な）DNAである。単鎖DNAの２つの相同な部分
（例えば、標的化DNA及びゲノムDNA）が相互に近付けば
それらはハイブリダイズし、そして２本鎖ヘリックスを
形成するであろう。次に、MIA遺伝子断片及び標的化DNA
が組換えの発生によりゲノム中に組込まれ得る。この相
同性組換えはイン−ビトロ及びイン−ビボ（患者中）の
両方で行われ得る。

好ましくは、MIA活性を有する蛋白質をコードするDN
A,MIAの発現を阻害する断片（ノックアウム配列）、又
は細胞のゲノムの組込み後にその細胞中でMIA活性を有
する蛋白質の活性化を行うことができる断片が使用され
る。このような断片は、例えば、対応するMIA領域に対
してヘテロロガスであるかあるいはMIA遺伝子への組込
みの後に、実際に静かな又はわずかに発現されるMIA遺
伝子を転写及び／又は翻訳の段階で活性化するプロモー
ター及び／又はエンハンサーである。

従って、このDNAにより、１又は複数のMIA遺伝子が標
的細胞に新たに導入され、又は哺乳類細胞のゲノム中で
本質的に転写されない遺伝子が活性化されて、該哺乳類
細胞が内因性MIAを生産できるようになる。この目的の
ため、DNA構成物が相同性組換えによりゲノムに挿入さ
れる。該DNA構成物は次のものを含んで成る：この遺伝
子に作用可能に連結されればその発現を調節し、好まし
くは刺激することができるDNA制御因子；及びこのゲノ
ム中の領域であってこの遺伝子内又はその近傍にある領
域に対して相同な１又は複数のDNA標的セグメント。こ
の構成物は哺乳類細胞のゲノムに挿入されて、MIA活性
を有する蛋白質をコードする遺伝子に前記制御セグメン
トが作用可能に連結される。好ましくは、MIA活性を有
する蛋白質をコードする遺伝子が細胞に挿入される場合
は特に、この構成物はさらに増幅配列をも含んで成る。

標的細胞へのMIA遺伝子の導入のため、この構成物は
制御因子、１又は複数のMIA遺伝子、及び１又は複数の
標的セグメントを含んで成る。標的配列は、それらがゲ
ノムの適切な領域とハイブリダイズし、それによって相
同性組換えの後、挿入された外来MIA遺伝子が発現され
るように選択される。

相同性組換えを開始することができる多数の方法が知
られている。好ましくは、相同性組換えはDNAの複製又
は細胞の有糸***の間に行われる。この種のDNAは腫瘍
の療法的処置剤の製造のため、又は宿主細胞中での同種
性又は異種性MIA蛋白質の生産のために使用され得る。

本発明により提供されるMIA蛋白質の核酸配列を基礎
にして、MIA蛋白質をコードする核酸を検出するための
試験を提供することができる。このような試験は、例え
ば細胞又は細胞溶解物中で行うことができる。この様な
試験は、核酸診断により行うことができる。この場合、
被験サンプルを、MIA蛋白質をコードする核酸配列とハ
イブリダイズするであろうプローブと接触せしめる。プ
ローブとサンプルからの核酸との間のハイブリダイゼー
ションが、発現されたMIA蛋白質の存在を示す。これら
の方法は当業者により知られており、そして例えばWO 8
9/06698,EP−A 0,200,362、米国特許2,915,082,EP−A
0,063,877,EP−A 0,173,251,EP−A 0,728,018に記載さ
れている。

本発明の好ましい態様においては、MIA蛋白質をコー
ドするサンプルの核酸は試験の前に、例えば周知のPCR
法により増幅される。核酸診断の分野においては通常、
誘導体化された（ラベルされた）核酸プローブが使用さ
れる。このプローブは、サンプルからの、キャリヤーに
結合した変性されたDNA又はRNAと接触され、そしてこの
工程において温度、イオン強度、pH値及び他の緩衝液が
次のように選択される。すなわち、核酸サンプルの長さ
及び予想されるハイブリドの溶融温度に依存して、ラベ
ルされたDNA又はRNAが相同なDNA又はRNAと結合すること
ができるように（ハイブリダイゼーション、さらにJ.Mo
l.Biol.98（1975）,503;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76（1
979）,3683を参照のこと）。適当なキャリヤーは、ニト
ロセルロース製膜もしくはキャリヤー材料（例えば、Sc
hleicher and Schuell,BA85,Amersham Hybond,C.）、粉
末状の補強されたもしくは結合したニトロセルロース、
又は種々の官能基（例えばニトロ基）により誘導体化さ
れたナイロン膜（例えば、Schleicher and Schuell,Nyt
ran;NEN,Gene Screen;Amersham Hybond M.;Pall Biodyr
e）である。

次に、ハイブリダイズしたDNA又はRNAは、十分な洗浄
及び非特異的結合を防止するための飽和の後、キャリヤ
ーを抗体又は抗体断片と共にインキュベートすることに
より検出される。この抗体又は抗体断片は、誘導体化の
間に核酸プローブに導入された物質に向けられる。代っ
て抗体がラベルされる。しかしながら、直接ラベルされ
たDNAを使用することも可能である。抗体とのインキュ
ベーションの後、特異的に結合した抗体結合体のみを検
出するため、それを再度洗浄する。次に、周知の方法に
従って抗体又は抗体断片のラベルを介して測定を行う。

MIAの発現の検出は例えば次のようにして行うことが
できる。

・固定化された組織スメアー及び単離された中期（meta
phase）染色体を用いての、固定化された全細胞とのイ
ンシチューハイブリダイゼーション、・コロニーハイブリダイゼーション（細胞）及びプラー
クハイブリダイゼーション（ファージ及びウイルス）、・ノーサンハイブリダイゼーション（RNA検出）・血清分析（例えば、スロット−ブロット分析による細
胞の細胞型分析）、・増幅後（例えばPCR技法）。

従って本発明は、MIA蛋白質をコードする核酸の検出
方法を包含し、この方法は、被験サンプルを、ａ）配列番号:1及び３に示すDNA配列又はこれらに対し
て相補的な配列、ｂ）前記ａ）の配列のいずれかとハイブリダイズする核
酸、から成る群から選択された核酸プローブと共にインキュ
ベートし、該核酸プローブをサンプルからの核酸とイン
キュベートし、そして所望により該核酸プローブを更な
る結合パートナーを介して検出することを特徴とする。

従って、MIAは腫瘍の診断（転移、発達）における価
値ある予知マーカーである。

本発明は、次の例及び図と共に配列より、さらに詳細
に説明される。この場合、配列番号:1は−プレ配列を有するヒトMIAのcDNAを示
し、配列番号:2は−蛋白質を示し、配列番号:3は−MIAのゲノムDNAを示し、配列番号:4は−プレ配列を有するネズミMIAのcDNAを
示し、配列番号:5は−蛋白質を示し、配列番号:6は−プライマーを示し、配列番号:7は−プライマーを示し、配列番号:8は−クローニング断片を示し、配列番号:9は−プライマーを示し、配列番号:10は−プライマーを示し、配列番号:11は−アダプターを示し、配列番号:12は−アダプターを示し、配列番号:13は−融合蛋白質を示し、配列番号:14は−融合蛋白質を示し、配列番号:15は−プライマーを示し、配列番号:16は−プライマーを示し、配列番号:17は−プライマーを示し、配列番号:18は−大腸菌での発現のための、融合して
いないMIAを示し、配列番号:19は−プライマーを示し、配列番号:20は−プライマーを示し、配列番号:21は−プライマーを示し、配列番号:22は−プライマーを示し、配列番号:23は−ポリリンカーを示し、配列番号:24は−MIAのゲノムDNA（対立遺伝子変形
体）を示す。

図１は、ヒトMIAの逆転阻害活性（invasion−inhibit
ory activity（MIAを用いての又は用いないでの細胞の
動きの阻害％）を示す。B16＋mMIA:ネズミMIAを使用す
る試験。

図２は、MIAによるＴ−細胞介在細胞毒性活性の阻害
を示し、CD4⁺T細胞の溶解（％）で表現する。

図３は、MIAによるLAK−細胞の細胞毒性活性の阻害を
示す。

図４は、MIAによるフィトヘマグルチニン−依存性リ
ンパ球の増殖阻害を示す（MIAの濃度はng/ml）により表
示される。

図５は、MIAによるIL−２刺激PBMC増殖の阻害を示す
（MIAの濃度はng/mlとして表現される）。

図６は、発現プラスミドpQE40−MIAのプラスミドチャ
ートを示す（例5a）。

図７は、ベクターpCMX−PL1のプラスミドチャートを
示す（例7a）。

実施例1.HTZ 19−dM細胞からの黒色腫阻害蛋白質の単離 HTZ 19−dM細胞を、0.8mmol/LのＬ−グルタミン（ギ
ブコ，英国）、非必須アミノ酸類（ギブコ，英国）、10
μg/mlのトランスフェリン（ベーリンガー・マンハイム
GmbH、カタログNo.1073974）、30mmol/Lの亜セレン酸ナ
トリウム（シグマ）及び４μg/mlのゲンタマイシン（メ
ルク）を含有する定義された血清不含有組織培養培地
（50％ Dulbecco最少必須培地、50％のＦ−12、ベーリ
ンガーマンハイムGmbH）中で単層に培養する。この培養
物の細胞培養上清を各場合に３〜４日の間隔で取り出
し、そして精製まで−70℃にて貯蔵する。

精製のため、前記の細胞培養上清を0.45μｍフィルタ
ー（ベクトン・ディキンソン、ハイデルベルグ）を通し
て濾過し、そしてアミコンYM2膜（排除限界2000D,アミ
コン，デンバー，マサツーセッツ，米国）を用いて膜限
外濾過により、最初の体積の１％の最終体積にまで濃縮
する。得られた材料を0.1mol/Lの酢酸に対して30時間透
析し（1000Dの排除限界を有する透析膜、ライヒエル
ト、ハイデルベルグ）、そして次に100,000gにて１時
間、４℃で超遠心分離する。ペレットを廃棄し、そして
上清をさらなる処理のために凍結乾燥する。

この凍結乾燥された透析物を1mol/Lの酢酸に入れ、そ
してさらに、バイオゲルｐ−10カラム（ファルマシア，
ウプサラ,2.6×100cm;バイオゲルｐ−100,200−400メッ
シュ，バイオラド・ラボラトリーズ，リッチモンド，カ
リホルニア，米国）上でのゲル浸透クロマトグラフィー
により精製する。ゲル材料を1mol/Lの酢酸により22℃に
て平衡化し、そして透析物を5mlの1mol/L酢酸中130〜14
5mgの濃度で適用する。これを1mol/Lの酢酸により12mol
/時の流速で溶出し、そして溶出液を4mlの画分に集め
る。３つの活性画分のプールを抗腫瘍活性の測定により
特定し（実施例５を参照のこと）、8000〜17000Dの分子
量に対応するその中間プールを逆相HPLCによりさらに精
製する。このため、これらの画分をまず一度凍結乾燥
し、そして次に0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）に入れ
る。得られた溶液の100μｌのアリコートを、各場合に
逆相HPLCに適用する（流速0.5ml/分）。各場合に750μ
ｌの画分を集める。HPLC分離に関するさらなるデータ：グラジエントプログラム：溶液A:水中0.06TFA 溶液B:0.056％ TFA 80％アセトニトリル２〜25％の溶液B,5分間 25〜50％の溶液B,120分間 50〜100％の溶液B,5分間２％にもどす、５分間。

カラム:mino RPC（ファルマシア） HPLCグラジエント混合物、ポンプ及び検出器：ファル
マシア。

溶出液を1.5mlの画分に集める。アリコートを凍結乾
燥し、そして例５に記載するようにして抗−腫瘍活性を
試験する。こうして、5Lの培養上清から約１μｇの黒色
腫阻害蛋白質を得ることができる。

実施例2. 実施例2a.ヒト黒色腫阻害蛋白質をコードするcDNAのク
ローニング精製された蛋白質のAsp−Ｎ及びトリプシン消化並び
にこうして得られたペプチド断片の再精製の後、MIAの
アミノ酸配列をシーケンサーにより決定する。Ｃ−末端
ペプチド配列及びＮ−末端近くに位置する１つを２個の
プライマーの合成のための基礎として選択した。プライ
マーは、制限酵素開裂部位を付加した縮重オリゴヌクレ
オチドである。

上流プライマー１（センス）（UP1）（配列番号:6）斜線（／）は、この位置の塩基が斜線の前又は後に位
置することを示す。このオリゴヌクレオチドは、ほとん
どすべての可能なコドンをカバーする32の異る分子の混
合物である。標的配列とのＧ−Ｔミスマッチは位置12及
び13においてのみ存在することができ、これはハイブリ
ドの安定性を増加せず、しかしそれを低下させない。PC
Rによる可能性ある生成物の再クローンを容易に行うこ
とができるように、EcoR Iリンカーがさらに５′−末端
に付加される。さらなる３個の不特定の塩基がこの５′
−末端の前に存在し、制限酵素開裂部位は末端ではな
い。なぜなら、制限酵素はこの位置を非常によく開裂し
ないからである。

下流プライマー１（アンチセンス）（DP1）（配列番
号:7） DP1はＣ−末端アミノ酸に対応し、８倍の縮重を有
し、そしてSal I開裂部位を含有する。

特定の第一鎖合成のため、プライマーDP1は下記の混
合物中で使用した。

５μｌ 10X PCR緩衝液３μｌ HTE−19全RNA を混合し、そして５℃にて65℃に加熱した。

ピペットにより次のものを加えた。

1 μｌ 100mM MgCl₂ 10 μｌ 2.5mM dNTP 0.5μｌ胎盤RNase 阻害物質 2 μｌ DP1（１μｇ） 1 μｌ逆転写酵素 37℃にて１時間のインキュベーションの後、下記のも
のを前記混合物に加えた。

１ μｌ UP1（１μｇ）５ μｌ 10X PCR緩衝液 70.5μｌ H₂O １ μｌ Taqポリメラーゼ増幅は次のプロフィールで30サイクル行った。

94℃ 30秒 55℃ 30秒 72℃ 60秒最終サイクルの後、すべての生成物の完全な伸長のた
め、さらに72℃にて７分間インキュベートした。

フェノール／クロロホルム抽出及びEtoH沈澱の後、PC
R混合物をEcoR I及びSal Iにより37℃にて２時間消化し
た。酵素の活性化の後、次にこれを５％ PAAゲル中で分
離し、そして320bpの断片を一夜溶出した。溶出物の半
分を、100ngのEcoR I/Sal I消化のpbluescriptと一夜連
結した。細菌（大腸菌DH5a）からの組換え白色コロニー
を拾い上げることができた。これを次の日に形質転換
し、そしてAmp及びＸ−Gal/IPTGを含有するSOB寒天プレ
ート上にプレートした。

プラスミドの単離の後、再クローン化された挿入部の
配列決定を、ファルマシアからのＴ−7 Deaza配列決定
キットを用いて行われた。Ｔ−３及びＴ−７プライマー
（ストラタゲン）はプライマーとして利用可能であっ
た。次の配列は、読み取られた配列のオーバーラップか
ら得られた（プライマーは下線で示されている）：（配列番号:8）定義された培地（dM）中に増殖するHTZ−19黒色腫細
胞のRNAから合成された完全なcDNAをクローニングする
ためにラムダgt11 cDNAライブラリーが利用可能であっ
た。

それぞれが8000pfuを含有する合計25プレートをプレ
ートアウトし、各プレート上で２枚のニトロセルロース
濾紙を置き、そしてそれらを、ニックトランスレーショ
ンによりラベルした精製されたMIR−PCR挿入部とハイブ
リダイズせしめた（ハイブリダイゼーション溶液50ml,2
×10⁶cpm/ml）。２日間のオートラジオグラフィーの
後、両フィルター上に対応するハイブリダイゼーション
シグナルを与える幾つかのシグナルを得た。対応するフ
ァージプラークを拾い上げ、そしてスクリーニングにか
けた。このために、各単離されたプラークの４段階希釈
物をプレートし、100〜300pfuを有するプレートを用い
てさらに２回スクリーニングした。

50mlの一夜培養の後、こうして単離したプラークから
ラムダDNAを単離することができ、その40μｇをEcoR I
により消化し、そして５％ PAAゲル中で分離した。挿入
部を溶出し、そして8ngを用いて、100ngのEcoR I−消化
脱リン酸化ベクター（pbluescript、ストラタゲン）と
連結した。連結混合物の半分を用いてコンピテント大腸
菌DH5aを形質転換し、この大腸菌を青／白選択のために
IPTG及びＸ−Galを含有するSOB/Ampプレート上にプレー
トした。組換えコロニーを拾い上げ、プラスミドを単離
し、そして挿入部の配列を決定した。完全なコード配列
を示す挿入部を配列番号:1に示す。

こうして得られたプラスミドがpbs L7MIAであり、こ
れはドイツ，ブラウンシマバイクの「Deutsche Sammlun
g fuer Microorganismen und Zell−kulturen GmbH」
（DSM）に、1993年７月14日に寄託された（DSM 842
0）。

クローニングのために使用したすべての方法はJ.Samb
rook E.F.Fritsch,T.Maniatis（1989）,Molecular Clon
ing:a laboratory manual,2nd edition,Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、米国、に
詳細に記載されている。

実施例2b.ヒト黒色腫阻害蛋白質をコードする遺伝子の
クローニングストラタゲン（ハイデルベルグ）から商業的に入手可
能なバクテリオファージλ FIX II（Elginら、Strategi
es 4（1991）８−９）中のヒトゲノムDNAライブラリー
を、確立された方法（Sambrookら、Molecular Cloning
（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従
って、ニトロセルロース上にプレートした。ハイブリダ
イゼーションサンプルとして使用するため、ヒトMIAを
コードする実施例2aからのcDNAを確立されている技法
（Sambrookら、Molecular Cloning（1989）,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）に従って放射能ラベルし
そして使用した。プレハイブリダイゼーション（２時
間）及びハイブリダイゼーション（16時間）を60℃にて
６×SSC,5×Denhardt溶液、100μg/mlサケ***DNA及び
0.1％ SDS中で行った。³²P−dCTP−ラベル化サンプル
を、ハイブリダイゼーション調製物に、１×10⁶cpm/ml
の濃度で加えた。次に、フィルターを60℃にて、20分
間、２×SSC,0.1％ SDS中で２回、そして次に１×SSC,
0.1％ SDS中で20分間２回、そして最後に0.25×SSC,0.1
％ SDS中で20分間２回、洗浄した。次に、濾紙を乾燥
し、そして次にＸ−線フィルムに24〜48時間暴露した。
この方法において正のハイブリダイゼーションシグナル
を与えたプラークを単離し、そしてハイブリダイゼーシ
ョンにより確認した。それらのプラーク中に挿入部とし
て含まれるヒトゲノムDNAを、MIA cDNAサンプルを用い
るサザンハイブリダイゼーションにより特徴付けた。こ
の目的のため、ファージDNAを制限エンドヌクレアーゼX
ba Iにより消化し、0.8％アガロースゲル上で分離し、
そして次にSouthern（J.Mol.Biol.98（1975）503）に従
ってニトロセルロースに移した。こうして得られたフィ
ルターを、サンプルとしての完全なMIA cDNAと、上記の
条件下でハイブリダイズせしめ、こうして約1.4kb及び
約2.2kbのサイズの２つのXba I断片が陽性のシグナルを
与えた。これら２つの断片のそれぞれを、配列決定のた
めに適当であり且つストラタゲン（ハイデルベルグ）か
ら商業的に入手可能なプラスミドpbluescript SK−（Sh
ortら、Nucl.Acids Res.16（1988）,7583−7600;Alting
−Meese及びShortら、Nucl.Acids Res.17（1989）,949
4）中にクローニングした。ヒトMIAをコードする完全な
配列は、配列番号:3にフランキング配列と共に示される
４個のエクソン中に位置する。MIA断片が位置する２個
のXba I断片間に１又は複数の追加のXba I断片が存在す
るか否かが検討されていないので、イントロン２が実際
に非常に長いことを排除することはできない。

実施例2c.ネズミ黒色腫阻害蛋白質をコードするcDNAの
クローニングベクターλEXlox（Palazzoloら、Gene 88（1990）,25
−26）中13.5年のマウスの胚からの商業的に入手可能な
（ノバジーン，ニューヨーク）cDNAライブラリーを、実
施例2aに記載したようにしてプレートした。ハイブリダ
イゼーションサンプルとして、ヒトMIAをコードする実
施例2aからのcDNAを放射能標識された形で用いた。ハイ
ブリダイゼーション及び洗浄の間に適用される温度がこ
こでは55℃であった点を除き、ハイブリダイゼーション
条件は実施例2aに記載したのと同一であった。こうして
得られそして再ハイブリダイゼーションにより確認され
たプラーク中に存在するcDNA挿入部の配列を決定した。
ネズミMIAの完全なコードDNAを含有する挿入部の配列を
配列番号:4に示す。

実施例2d.ネズミ黒色腫阻害蛋白質をコードする遺伝子
のスクリーニングこの場合、ネズミゲノムDNAライブラリー（ベクターE
MBL3（Frischaufら、J.Mol.Biol.170（1983）,827）中
の成BALB/Cマウスの肝臓から、クロンテック、パロアル
ト、カリホルニアから商業的に入手可能）を、サンプル
として実施例2cからのネズミMIA cDNAを用いて実施例2b
と同様にしてスクリーニングした。条件は実施例2bに記
載したのと同一であった。同様にしてさらなる処理を行
った。

実施例3. 実施例3a.腫瘍細胞に対する黒色腫阻害蛋白質の抗増殖
効果の測定実施例１に従って得られた黒色腫阻害蛋白質又は蛋白
質断片の黒色腫細胞に対する抗増殖効果を決定するた
め、対数増殖期のHTZ 19−dM細胞を、96・ウェルマイ
クロカルチュアープレート（コスター，チューリッヒ）
中、100μｌの血清不含有培地（実施例１を参照のこ
と）中で、ウェル当り３×10³細胞の密度において、24
時間接種した（Chambardら、J.Cell.Physiol.135（198
8）,101−107に従う）。次に、細胞を被験蛋白質画分と
共に、４〜５日間37℃/5％ CO₂にてインキュベートす
る。各々に１μCiの³H−チミジン（比活性23Ci/mmol,ア
マーシヤム・ブチラー，グラウンシュライク，ドイツ）
を添加した後、細胞をさらに８時間、同じ条件下でイン
キュベートし、そして次に細胞DNAへの³H−チミジンの
取込みを、通常の方法で酸沈澱した後に、液体シンチレ
ーションカウンターにより測定する。試験された蛋白質
画分の活性は、未処理の対照細胞への³H−チミジンの取
込みに対する処理された細胞の³H−チミジンの取込みの
パーセントとして表現する。異る濃度の単離された黒色
腫阻害蛋白質を用いることにより、未処理対照に比較し
て³H−チミジンの取込みが50％阻害される濃度を決定す
ることができる（次の表のIC₅₀値）。

実施例3b.腫瘍細胞に対する黒色腫阻害蛋白質の逆転阻
害効果 MIAの逆転阻害効果（invasion−inhibiting effect）
を測定するため、改変Boyden Chamber System（Albini
ら、Cancer Res.47（1987）,3239−3245）を使用する。
チャンバーはコスター社から得た（Blind Well Chamber
No.441200）。下チャンバー中の化学吸引物質（chemoa
tractant）と上チャンバー中の細胞との間の基礎膜様バ
リヤーの刺激のため、52μｌのマトリゲル（matrigel）
（ベクトン、ディッキンソン No.40234）をポリカーボ
ネートフィルター（孔サイズ８μm,Coster No.150446）
上に適用する。下チャンバーには化学吸引物質として21
0μｌの線維芽細胞コンディショニング培地を満たす。
この培地は次のようにして得る。正常ヒト皮膚からの線
維芽細胞を、ウシ胎児血清を添加することなく、24時間
DMEM培地（ギブコ）中第10及び第20継代の間維持する。
こうしてコンディショニングされた培地を化学吸引物質
として希釈しない形で適用する。Boyden装置の上チャン
バー中に800μｌのDMEM（ギブコ、ウシ胎児血清を含ま
ない）中２×10⁵の被験腫瘍細胞をMIA活性成分と共に又
はそれを伴わないで適用する。ヒト（実施例3a又は実施
例８を参照のこと）又は動物の腫瘍細胞、例えばB16（A
TCC CRL 6322）を実載された方法により、MIAを介して
のそれらの移動挙動の阻害に関して試験することができ
る。黒色腫阻害蛋白質を添加しない場合、約10％の腫瘍
細胞が約４時間のあいだに上チャンバーから下チャンバ
ーに移動し、そこでマトリゲル（Matrigel）膜の底側に
付着する。それらは固定され、染色されそして次に計数
される。ヒト又はネズミの黒色腫阻害蛋白質MIAが上チ
ャンバーに加えられれば、細胞の移動は強く阻害され
る。図１は得られた阻害値を示す（〔下チャンバー中の
細胞数、MIAを用いた実験〕／〔下チャンバー中の細胞
数、MIAを用いない実験〕×100％）。

実施例4.免疫活性の測定実施例4a.MIAによるＴ−細胞介在細胞毒性活性 MBPペプチド87−106に対して特異的なCD4⁺T細胞系D7.
1はMBP及びペプチド87−106を提示する標的を標的⁵¹Cr
放出測定法（ターゲット:Daudi cells,R.Martin,U.Utz,
J.E.Coligan,J.R.Richert,M.Fler lage,E.Robinson,R.S
tore,W.E.Biddison,D.E.MacFarlin,H.F.MacFarland、免
疫優性ミエリン塩基性蛋白質ペプチド87−106に対して
特異的なヒトCD4⁺細胞毒性Ｔ細胞応答のＴ細胞レセプタ
ーの使用及び正確な特異性の多様性、J.Immunol.（199
2）,148（５）,1359−1366）。MIAの添加（使用量は約5
0−100ng/ml精製MIAに対応する）の後、ペプチド−特異
的細胞毒性は約55％阻害され（図2a）、そしてMBP−特
異的細胞毒性は約50％（図2b）阻害される。予想通り、
阻害はエフェクター／標的比（E:T）にわずかに依存
し、これは本件の場合1:1又は1:5の非常に低いレベルで
設定され、そしてそれ故に高度に特異的である（図
２）。

実施例4b.MIAはリンホカインで活性化された末梢血リン
パ球（LAK細胞）の細胞毒性活性を阻害する LAK細胞はコロニーを介さないで拡大され、リンホカ
インで活性化された末梢血リンパ球、主としてＴリンパ
球である（A.A.Rayner,E.A.Grim,M.T.Lotze,E.W.Chu,S.
A.Rorenberg、リンホカイン活性化されたキラー（LAK）
細胞：ヒトの癌の免疫療法のために有意な因子の分析、
Cancer 55（1985）,1327−1333）。これらは、標準的方
法で、腫瘍療法のための多くの免疫療法アプローチにお
いて使用される。本件において示す実験において、微小
細胞毒性測定における標的としてのHTZ−19黒色腫細胞
に対するそれらの細胞毒性について試験される。1:1,5:
1及び10:1のエフェクター／標的比において、最大細胞
毒性（CTX）はほとんど40％に達する。これは、MIAの添
加後（濃度は実施例4aにおけるごとく）に、そして低エ
フェクター／標的比において最大80％で強く阻害され、
この比率は局所的に−すなち腫瘍自体の近傍で−より一
層予想されるものである。

実施例4c.MIAはIL−２依存性及びフィトヘマグルチニン
依存性リンパ球増殖を阻害する末梢血リンパ球（PBMC）は、フィトヘマグルチニン
（PHA）及びインターロイキン−２を用いて、標準化さ
れた古典的な方法で刺激され得る（J.E.Coligan,A.M.Kr
uisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevuch.W.Strober,Curren
t Protocols in Immunology,NIH Monograph,J.Wiley So
ns,ニューヨーク,1992）。この方法において、Ｔ細胞は
PHAによりほとんど排他的に刺激され、そしてIL−２は
Ｔリンパ球を優先的に刺激するが、しかしIL−２レセプ
ターを有する細胞をも刺激する。これらが記載された量
（蛋白質純度：第一精製段階（Biogel P10カラム）の
後、活性は完全な精製の後より約50−100倍低い）のMIA
と同時インキュベートされるとき、PHA応答の非常に強
い阻害を達成することができる（図４）。IL−２応答は
より多くの量において阻害される（図５）。

実施例5.大腸菌における融合蛋白質としてのMIAの組換
え発現実施例5a.発現ベクターの作製キャリヤーとして適当な蛋白質との融合蛋白質として
MIAを大腸菌において発現させるため、例えば市販のベ
クターpQE40（Cat.No.33403,DIAGEN GmbH,デュッセルド
ルフ）を用いることができる。このベクターに、成熟型
のMIAをコードするcDNA断片が、１個づつ存在する制限
部位Sph IとHind IIIとの間に挿入される。このタイプ
の断片は、マトリクスとしてのクローン化MIA cDNA並び
に２個の適当なプライマー（5'−GATGCATGCGGTCCTATGCC
CAAGCTG−３（配列番号:9）及び5'−GATAAGCTTTCACTGGC
AGTAGAAATC−3'（配列番号:10）を用いて、PCR増幅法に
より最も簡単に調製される。得られたPCR断片はSph I及
びHind IIIにより切断され、そして同様に処理されたベ
クターpQE40に連結される。生ずるプラスミドはDHFR
（キャリヤーとしてのジヒドロフォレート・ラダクター
ゼ）とMIAとの融合蛋白質を発現する。この融合蛋白質
から遊離のMIAが蛋白質分解的に切り出されることを可
能にするため、IgAプロテアーゼの認識配列（Ser Arg P
ro Pro/Ser）をコードするDNAセグメントをDHFRとMIAと
の間にクローニングする。これは、発現プラスミドをBg
III（部分分解、及びそれに続く線状化ベクターの単
離）及びSph Iにより開き、次にアダプター（ハイブリ
ダイズして２本鎖となる（5'−GATCTAGCCGGCCGCCCAGCCC
GGCATG−3'（配列番号:11）及び5'−CCGGGCTGGGCGGCCGG
CTA−3'（配列番号:12））の挿入により達成される。生
ずる発現プラスミドpQE40−MIAはDHFRとMIAとの融合蛋
白質をコードし、この融合蛋白質はDHFRとMIAとの間にI
gAプロテアーゼのための開裂部位を有する。この融合蛋
白質は、Ni−キレートゲル材料により該融合蛋白質を精
製するために使用され得る６個のヒスチジンをＮ−末端
に担持する。この種の方法はEP−A 0,282,042及びEP−A
0,253,303に記載されており、これらの記載を引用によ
りこの明細書に組み入れる。図６に発現プラスミドpQE4
0−MIAを示す。

キャリヤー蛋白質DHFRを除去し、そしてそれをできる
だけ小形で且つ同じ機能を満たすペプチドで置換えるこ
とによりMIAの含量を最適化することができる。このよ
うな適当なペプチドは、例えば、Met Arg Gly Ser His
His His His His His Gly Ser Ser Arg Pro Pro（配列
番号:13）（このペプチドは、成熟MIAのすべてに続くア
ミノ酸配列からIgAプロテアーゼにより開裂されること
ができる；この種の方法はWO 91/11520に記載されてお
り、引用によりこの記載をこの明細書に組み入れる）、
又はMet Arg Gly Ser His His His His His His Gly Se
r Val Asp Asp Asp Asp Lys−（配列番号:14）（このペ
プチドは、成熟MIAのすぐ続くアミノ酸配列からエンテ
ロキナーゼにより開裂され得る）である。このようなMI
Aペプチド融合体をコードする発現プラスミドは次の方
法により調製することができる：マトリクスとしてのMI
A cDNA（配列番号:1）並びにプライマー5'−AAAAAGGATC
CAGCCGGCCGCCCGGTCCTATGCCCAAGCTGGC−3'（配列番号:1
5）及び5'−GGCGAGCAGCCAGATCTCCATAG−3'（配列番号:1
6）を用いるPCR増幅が、BamH I及びBg IIIで再切断され
る断片をもたらす。発現ベクターpQE40−MIAもBamH I及
びBg IIIにより制限酵素処理し、生ずる断片の小さい方
を捨て、そして上記のPCR断片で置換える。これによ
り、誘導後に融合蛋白質Met Arg Gly Ser His His His
His His His Gly Ser Ser Arg Pro Pro−MIA（配列番
号:13）を発現する発現ベクターpQE40−MIAが得られ
る。全く同様にして、プライマー5'−AAAAAAGGATCCGTTG
ATGATGACGATAAAGGTCCTATGCCCAAGCTGGC−3'（配列番号:1
7）及び5'−GGCGAGCAGCCAGATCTCCATAG−3'（配列番号:1
6）を用いて融合蛋白質Met Arg Gly Ser His His His H
is His His Gly Ser Val Asp Asp Asp Asp Lys−MIA
（配列番号:14）が得られる。

同様にして、適切な（好ましくは強力で且つ誘導性
の）プロモーターの制御のもとに大腸菌について記載さ
れている多くのプラスミドの１つにクローニングし、そ
して発現させることにより、ペプチドとMIAとの他の類
似の融合蛋白質を調製することができる。大腸菌におい
てペリプラズムへの融合蛋白質の分泌を導き、次に開裂
されそしてMIAを放出するMIAとペプチドとの融合体は他
の例である。この方法はWO 88/09373に記載されてお
り、この記載を引用によりこの明細書に組み入れる。

実施例5b.融合蛋白質の発現及びMIAの回収発現プラスミドpQE40−MIA（あるいは、他の基本ベク
ター又は他のキャリヤー蛋白質もしくはキャリヤーペプ
チドを用いて得られる類似の発現プラスミド；このよう
な代替物もまた、実施例5aのほかに、Metuads of Enzym
ology 185（Gere Expression Technology）,David U.Go
edrlel編、Academic Press,1991）を、lacレプレサーの
十分な発現を有する適当な大腸菌株にトランスフェクト
し、MIA融合蛋白質の誘導的発現を達成することができ
る。この目的のため、pQE40と共に商業的に入手可能な
大腸菌株M15〔pEEP4〕（Diagon GmbH,デュッセルドル
フ）、あるいは他の大腸菌の株、例えばUT5600（Earhar
tら、FEMS Microbiology Letters 6（1976）277−28
0）、又は大腸菌BL21（Grodberg及びDunn,J.Bacteriol.
170（1988）,1245−1253）が適当であり、これらはlac
レプレッサー発現ヘルパープラスミド、例えば前記のpU
BS520（Brinckmannら、Gere 85（1989）,109−114、又
はEP−B 0,373,365に記載されている）によりトランス
フェクトされている。次に、次の手順によりMIAを得る
ことができる：大腸菌M55〔pREP4/pQE40−MIA〕を、0.6
の光学濃度（550nmにて測定）が達成されるまでLB培地
で培養し、次にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド、ベーリンガー・マンハイムGmbH）を1m
Mの最終濃度に加え、そして次にさらに４時間培養す
る。細胞を遠心分離し、300mM NaClを含む100mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.5）に入れ、そして凍結と解凍
を３回行うことにより溶菌し、そして次に超音波処理に
かける。遠心分離により透明となった溶菌物に、製造者
による最大結合容量を考慮してNi−NTA−アガロース（D
iagen GmbH）を加え、混合しながら周囲温度にて一夜イ
ンキュベートする。融合蛋白質が負荷されたゲル材料を
低速遠心分離により分離し、100mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.5）で２回、及びリン酸ナトリウム緩衝液（p
H6.1）で２回洗浄する。次に、100mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.5）中でゲル材料をIgAプロテアーゼ（ベー
リンガー・マンハイムGmbH）と共に37℃にて一夜インキ
ュベートすることにより、融合蛋白質からMIAを開裂せ
しめる。ゲル材料を一夜の遠心分離により分離し、そし
て無菌濾過の後、実施例３及び４に記載の活性試験にお
いてMIA含有上清を得る。

実施例6.大腸菌での非融合（fusion−free）MIAの組換
え発現 MIAをコードするDNA配列を、大腸菌での効率的な発現
が可能なように修飾する。この目的のため、マトリクス
としてのヒトMIA cDNA（配列番号:1））並びにプライマ
ー１（5'−AAAAACATATGGGACCAATGCCAAAATTAGCAGATCGTAA
ATTATGTGCAGATCAGGAG−3'（配列番号:19）及びプライマ
ー２（5'AAAAAAAGCTTTCACTGGCAGTAGAAATC−3'（配列番
号:20））を用いてPCR増幅を行う。プライマー１はＮ−
末端領域のMIA−コード配列を変更し、MIAアミノ酸配列
は変化しないがDNA配列及びそれ故にmRNA配列が大腸菌
のために最適される。開始コドンMetが付加され、そし
てこの部位に制限エンドヌクレアーゼNdelの認識配列が
挿入され、この配列が、（選択的に強力で且つ誘導性
の）プロモーター及び翻訳開配列（Shine Dalgarno配
列）をその結果置かれたNdel開始部位と共に含有するベ
クターへの、前記のように修飾されたMIAコード断片の
その後のクローニングを可能にする。プライマー２は3'
−カウンター−プライマーとして作用し、そしてHind I
II開裂部位を含有し、その結果、ベクターへの、Ndel−
Hind III断片としての修飾されたMIA−コード断片の挿
入が可能となる。このように修飾されたMIAコード配列
を配列番号:18に示す。こうして調製された発現プラス
ミドがp11379（DSM 9267）であり、これは「Deutsche S
ammluny von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmb
H」、ブラウンシュバイクＤ−38124に、1984年６月29日
に寄託された。

発現のため、非融合（fusion−free）MIAのための発
現プラスミドを適当な大腸菌株にトランスフェクトす
る。このような菌株は、発現プラスミドp11379のごとき
lacフプレッサーの制御のもとにある発現プラスミドを
使用する場合、十分に高い細胞内濃度のlacレプレッサ
ーを有する菌株である。このような菌株は、pREP4（Dia
gen GmbH）、pUBS500又はpUBS520（Brinckmannら、Gere
85（1989）,109−114）のごとき第二プラスミドのトラ
ンスフェクションにより調製することができる。適用さ
れる大腸菌株は好ましくは、例えば大腸菌UT5600（Earh
artら、FEMS Microbiology Letters 6（1979）,277−28
0）、大腸菌BL21（Grodberg及びDunn,J.Bacteriol.170
（1988）,1245−1253）、又は大腸菌Ｂのごとき、細胞
自体の低いプロテアーゼ活性を有すべきである。次に、
実施例5bに記載したのと同様にして発現培養を行う。MI
Aを回収するため、大腸菌から蛋白質凝集体として得ら
れたMIAを、EP 0,241,022,EP 0,364,926,EP 0,219,87
5、及びDE−A 40 37 196に記載されている手順に従って
処理する。

詳細には、例えば、この目的のために次の手順が適用
される：大腸菌の発酵からのMIA−含有凝集体（「封入
体」と称する）を6M塩基グアニジン、100mM Tris−HCl
（pH8）,1mM EDTA中で可溶化し、次にpH3〜４に調整
し、そして4M塩酸グアニジン（pH3.5）に対して透析す
る。次に、可溶化された蛋白質の再生（renaturation）
を1Mアルギニン（pH8）、1mM EPTA,5mM GSH（グルタチ
オン、還元型）及び0.5mM GSSG（グルタチオン、酸化
型）中で行う。再生調製物から、例えば1.4M硫酸アンモ
ニウムの添加後、Fractogel TSK Butyl（E.Merek、グル
ムスタット）のごとき疎水性マトリクスへの吸着及びそ
れに続く20mM Tris−HCl（pH7.0）への溶出によりMIAを
得ることができる。

実施例7.真核細胞中でのMIAの組換え発現実施例7a.哺乳類細胞中でのMIAの組換え発現このため、ヒト（配列番号:1）又はネズミ（配列番
号:4）のcDNA又は対応するゲノムDNAセグメントを、強
力なプロモーター・エンハンサー系に基いて、哺乳類細
胞中に転写されるベクターに連結されるゲノムDNA段階
の場合、この段階は、MIA自体のプロモーターのみが幾
つかの細胞タイプ、例えば黒髄種において活性であり、
そしてそれ故に一般的な組換え発現のためには適切でな
い；しかしながら、発現はまた実施例９に記載するよう
にイン−ビトロ相同性組換えによっても達成される）。
このようなプロモーター及びエンハンサーは、ほとんど
がウイルス、例えばSV40,hcMV、ポリオーマ又はレトロ
ウイルスからのものである。他の方法として、特定の細
胞型又は組織型に対して特異的なプロモーター・エンハ
ンサー系、例えばMAP−,MMTV−もしくは免疫グロブリン
プロモーター、又は誘導可能な系、例えばメタロチオネ
インプロモーターを用いることができる。この種のベク
ターはMTA cDNA（もし後者が使用されれば）を、RNAプ
ロセシングのためのドナー及びアクセプターシグナル並
びにポリ−Ａ−付加のシグナルに補充する。例えば、図
７に示すpCMX−pL1（Umesoneら、Cell 65（1991）,1255
−1266）はこのような適当なベクターである。このベク
ターの１つのそして唯一のEcoR I開裂部位に、EcoR Iリ
ンカーを備えたMIA cDNAを連結し、この場合、このベク
ターのポリリンカー（配列番号:23）中の他の開裂部位
による制限酵素分析により、MIA cDNAがCMVプロモータ
ーの読み方向に配向されていることが保証される。他の
ベクター、例えばpCDNA3（Introgen,サンジエゴ／米
国）又はpSG5（Stratagene,LaJolla/米国）へのクロー
ニングの際、全く類似の方法が適用される。こうして得
られた発現プラスミドのDNAは大腸菌から調製され、そ
して哺乳類細胞中にトランスフェクトされる。この場
合、特定のケースにおける細胞タイプに対して特異的な
技法が適用される（Methads of Enzymology 185（Gene
Expression Technology）,David V.Goeddel編、Academi
c Press 1991,セクションＶ）。発現プラスミドpCMX−p
L1−MIAは、すでに記載されている方法（Bue Hnerら、M
ol.Cell.Biol.13（1993）,4174−4185）に従ってヒト奇
形癌細胞系PA−lsc 9177（Buettnerら、Mo.Cell.Biol.1
1（1991）,3573−3583）にトランスフェクトされ、この
場合100mm培養皿当り200,000個の細胞が５μｇのDNAに
よりトランスフェクトされる。トランスフェクションの
後、ウシ胎児血清を添加しないMEM（ギブコ）中で細胞
を培養し、これにより48時間後に細胞培養上清中でMIA
が検出可能である。

実施例7b.昆虫細胞中でのMIAの組換発現昆虫細胞での発現のため、MIAをコードするDNAセグメ
ント、好ましくはヒトMIA cDNA（配列番号:1）を、AcMN
PV（オートグラファ・カリホルニカ（Autographa calif
ornica）多形核ウイルス）又はBm NPV（ボンビックス・
モリ（Bombyx mori）多形核ウイルス）由来のベクター
に挿入する。この目的のため、MIA cDNAをまず昆虫細胞
のために適当な強力なプロモーター（D.R.O'Reilly,L.
K.Miller及びV.A.Luckow,Baculovivus Expression vect
ors−A Laboratory Manual（1992）,W.H.Freeman ＆ C
o.,ニューヨーク）、例えばpoIHプロモーター又はp10プ
ロモーターの制御のもとに置く。poIHプロモーターの助
けでMIAを発現させるため次の方法を適用する:MIAをコ
ードし、そして制限エンドヌクレアーゼEcoR I（後期MI
A転写物の5'−末端に隣接する）及びBst I（後期MIA転
写物の3'−末端に隣接する）のための開裂部位を有する
DNA断片を、マトリクスとしてのMIA cDNA並びにプライ
マー5'−CGTGAATTCAACATGGCCCGGTCCCTGGTGTGC−3'（配
列番号:21）及び5'−TATCTGCAGTCACTGGCAGTAGAAATCCCA
−3'（配列番号:22）を用いて、既知の方法に従うPCR増
幅により得る。この断片をEcoR I及びPst Iにより再カ
ットし（対応する付着未満を生じさせるため）、そして
同じ制限酵素で処理した移行ベクターpVL 1393（D.R.O'
Reilly,L.K.Miller及びV.A.Luckow,Baculovirus Expres
sion Vectors−A Laboratory Mannual（1992）,W.H.Fre
eman ＆ Co.,ニューヨーク）（商業的に入手可能;Phar
Mingen,サンジエゴ，カリホルニア；又はInvitrogen Co
rporation,サンジエゴ，カリホルニア）に連結する。得
られた移行発現ベクターpVL 1393−MIAを、増加のため
に大腸菌K12にトランスフェクトし、そして確立された
方法に従ってプラスミドDNAを調製する。移行プラスミ
ドからバキャロウイルスベクターへの、poIHプロモータ
ーの制御下にあるMIA DNAの移行は、確立された方法
（O'Reillyら、（1992）前記参照）による相同性組換え
によって達成される。この目的のため、0.5μｇのBacul
o Glod DNA（Phar Minger Order No.21100Dから商業的
に入手可能な、致死的欠失及びpoIHプロモーターにより
制御されたlacZ発現を有する、線状化されたAcNPVウイ
ルスDNA）及び２μｇのpVLB−93−MIAを混合し、周囲温
度において５分間インキュベートし、そして1mlの125mM
Hepes（pH7.1）,125mM CaCl₂,140mM NaClと混合する。
この混合物を、10％ウシ胎児血清を含有するGrace培地1
mlによりあらかじめコートされた直径60mmの培養皿中の
２×10⁶個のSF9昆虫細胞（Invitrogen,Order No.B825−
01）に加える。４℃にて４時間のインキュベーションの
後、DNA含有培地を除去し、そして細胞を新たな培地中
で27℃にて４日間インキュベートする。次に、こうして
得られた組換えバキュロウイルスをプラーク形成により
２回精製し（O'Reillyら、（1992）前記を参照のこ
と）、この場合、β−ガラクトシダーゼ活性の不存在
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドの存在下で青色の不存在により光学
的に認識できる）により、相同性組換えで挿入されたMI
Aを有するウイルスが、用いられた野生型ウイルス（Pha
r Mingenから商業的に得られる、致死的欠失及びpoIHプ
ロモーターにより制御されるlacZ発現を有するAcNPV,Or
der No.21100D）から区別される。こうして得られたMIA
−発現組換えウイルスにより、確立された方法（O'Reil
lyら、（1992）前記参照）に従ってSF9細胞を感染さ
せ、そして血清不含有培地（Cell/Perfect Bac血清不含
有昆虫細胞培養培地、Stratagene,Order No.205120）中
で27℃にて少なくとも30時間さらにインキュベートす
る。次に、細胞培養上清を除去し、上清中に含まれるウ
イルスを超遠心分離（Beckmann Ti 60ローター、30,000
rpm）により分離し、そしてその後、上清をMicrocon 10
0フィルター（アミコン、排除限界100kD）を通して濾過
する。こうして得られたMIA−含有溶液を実施例３及び
４に記載した試験において使用なことができ、あるいは
実施例１に従ってさらに精製することができる。

実施例8.種々の細胞でのMIA mRNAの検出特定の細胞でのMIAの発現の、そしてそれ故にMIA mRN
Aの存在の検出は、一方において、核酸ハイブリダイゼ
ーションの確立された方法、例えばノーサンハイブリダ
イゼーション、イン−シチューハイブリダイゼーショ
ン、ドットもしくはスロットハイブリダイゼーション、
及びこれらに由来する診断的技法により達成することが
できる（Sambrookら、Molecular Cloning−A Laborator
y Manual（1989）,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss;Nacleic Acid Hybridisation−A Practical Approuc
h（1985）,B.D.Hames及びS.J.Higgins編、IRL Press:WO
89/06698;EP−A 0,200,262;米国特許No.2,915,082;EP
−A 0,063,879;EP−A 0,173,251;EP−A 0,128,018）。
他方、MIA特異的プライマーを用いての種々の増幅技法
からの方法を適用することができよう（PCR Protocols
−A Guide to Methods and Application（1990）,M.A.I
nnis,D.H.Gelfund,J.J.Sninsky,T.J.White,Academic Pr
ess Inc;PCR−A Proctical Approach（1991）,M.J.McPh
erson,P.Quirke,G.R.Taylor（1991）編、IRL Press）。
表2A及び2Bは種々のヒト腫瘍、腫瘍細胞系、及び正常細
胞でのMIAの発現を示し、この場合は放射能標識された
ヒトMIA cDNA（配列番号:1）を用いるノーサンハイブリ
ダイゼーションにより測定された。この目的のためRNA
を記載された細胞からChomczynski及びSacchi,Anal.Bio
chem.162（1987）,156−159の方法に従って単離した。2
0μｇの全RNAを１％アガロース・ホルムアルデヒドゲル
上で分離し、そしてナイロン膜（Amersham、ブラウンシ
ュバイク）に、標準的方法（Sambrookら、Molecular Cl
oning−A Laboratory Manual（1989）,Cold Spring Har
ber Laboratory Press）に従って移行させた。サンプル
として、完全なヒトMIA cDNA（配列番号:1）を放射能ラ
ベルした（Feinberg及びVogelstein,Anal,Biochem.137
（1984）,266−267）。ハイブリダイゼーションは68℃
にて、５×SSC,5×Denhardt,0.5％ SDS,10％硫酸デキス
トラン及び100μg/mlのサケ***DNA中で行った。次に、
膜を１時間に２回、１×SSC中で68℃にて洗浄し、そし
てＸ−線フィルムに暴露した。

実施例9.療法的目的のためのMIAコード核酸の使用 MIAは腫瘍細胞の増殖及び転移を阻害する。動物モデ
ル又は患者において、この効果はMIA蛋白質の外からの
導入のみならず、適当なプロモーターのもとにMIAをコ
ードしているか、又は相同性組換えによりゲノム中の細
胞自身のMIA遺伝子の前方に組み込むことができる適当
なプロモーターを含有するDNAセグメントの挿入により
生ずる。後者の場合、このプロモーターは、ヒトの（又
は、動物モデルの場合は動物の）MIA遺伝子の5'−非翻
訳領域中の配列に対して可能な限り高度に相同であるか
又は好ましくはそれと同一の配列部分により狭まれてい
なければならない（WO 91/09955を参照のこと）。この
方法により、もしDNAセグメントが腫瘍細胞自身に挿入
されれば、腫瘍細胞が増加した程度にMIAを発現し、そ
してそれ故にそれ自体の増殖及び転移を阻害すること
を、確立することができる。しかしながら多くの場合、
対応する遺伝子セグメントは特異的に及び排他的に腫瘍
細胞自身に挿入される必要はない。なぜなら、好ましく
は腫瘍に隣接する他の体細胞での発現も増加したMIA放
出を通じて腫瘍細胞の阻害を行うであろうからである。
次の例は、動物モデルでのMIA−コードDNAセグメントの
療法的効果を示している。

C57BLマウスの尾部静脈へのネズミB16黒色腫細胞（AT
CC CRL 6322）への注射、及びそれに続く、肺への転移
の定量は、転移癌形成の確立されたイン−ビボモデルで
ある。黒即腫細胞系B16の100,000個の細胞を、C57BLマ
ウスの眼球の後に注射した（１日:16動物）。48時間
後、８匹の動物に、100μｇのTE（10mM Tris−HCl,pH8.
0,1mM EDTA）中MIA発現プラスミドpCMX−LP1−MIA（実
施例7a）をDOTAPトランスフェクション試薬（Leventis
及びSilvius,Biochin,Biophys,Acta 1023（1990）,124
−132,ベーリンガー・マイハイムGmbHから商業的に入手
可能、Cat.No.1202375）と混合し、各場合に尾部静脈に
注射した。対照群（８動物）には同じプラスミドを与え
たがMIA配列は与えなかった。13日後、MIA配列を与えな
かった対照群の８動物中の６動物に局所腫瘍が生じ、
肺、脾臓、腎臓及び肝臓での転移癌の平均数は7.8であ
った。MIAコードプラスミドを与えられた８動物中４動
物のみに局所腫瘍が生じ、そして転移癌の平均数は2.7
であった。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願人（Ａ）名称：ベーリンガーコンハイムGMBH （Ｂ）ストリート：サンドホッフェルストラーセ11
6 （Ｃ）市：マンハイム（Ｄ）州:BV （Ｅ）国：ドイツ（Ｆ）郵便番号:D−68305 （Ｇ）電話番号:08856/60−3446 （Ｈ）ファクシミリ番号:08856/60−3451 （ii）発明の名称：黒色腫阻害蛋白質（iii）配列の数:24 （２）配列番号:1の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:459塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:40..432 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:sig_peptide （Ｂ）位置:40..111 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:mat_peptide （Ｂ）位置:112..432 （xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:131アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:3565塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:DNA（genomic）（ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:sig_peptide （Ｂ）位置:1378..1449 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:1378..1504 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:1586..1719 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:2804..2914 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:3232..3252 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:− （Ｂ）位置:one−of（2216）（Ｄ）他の情報:/注＝「2216位のＮはヌクレオチド
の不特定の数及び配列を示す」（xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:581塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:110..499 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:sig_peptide （Ｂ）位置:110..178 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:mat_peptide （Ｂ）位置:179..499 （xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:130アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:31塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:− （Ｂ）位置:one−of（14,17,20）（Ｄ）他の情報:/label＝Ｎ /注＝「ＮはＩ（イノシン）を示
す」（xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:33塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:305塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:misc_RNA （Ｂ）位置:join（1..29,277..305）（Ｄ）他の情報:/機能＝「プライマー」（xi）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:27塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:27塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:28塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:20塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:16アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:18アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の型：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:43塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:23塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号:17の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:50塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号:18の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:330塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:mat_peptide （Ｂ）位置:7..327 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:misc_RNA （Ｂ）位置:4..6 （Ｄ）他の情報:/機能＝「開始コドンMet」（xi）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号:19の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:59塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:19: （２）配列番号:20の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:29塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:20: （２）配列番号:21の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:33塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:21: （２）配列番号:22の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:30塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:22: （２）配列番号:23の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:260塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:cDNA （xi）配列の記載：配列番号:23: （２）配列番号:24の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:596塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型:DNA（genomic）（ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:CDS （Ｂ）位置:join（40..111,40..166,214..347,39
3..503,549..569）（ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:sig_peptide （Ｂ）位置:40..111 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:40..166 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:214..347 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:393..503 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:exon （Ｂ）位置:549..569 （ix）特徴：（Ａ）NAME/KEY:− （Ｂ）位置:one−of（194,369,527）（Ｄ）他の情報:/注＝「位置194,369及び527のＮは
ヌクレオチドの不確定の数及び配列を示す」（xi）配列の記載：配列番号:24:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/52 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＧ０１Ｎ 33/574 Ａ６１Ｐ 35/00 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:91 (Ｃ１２Ｐ 21/02 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ビュトナー，ラインハルトドイツ連邦共和国，デー―93090 バッハ，フィフテンベーク６ (72)発明者カルザ，ブリギッテドイツ連邦共和国，デー―83670 バットハイルブルン，ホッホフェルダンガー３ (56)参考文献ＭｅｌａｎｏｍａＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２（1992），ｐｐ．327− 336 ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．49（1989），ｐｐ．5358−5363 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 38/00 - 38/58 A61K 48/00 C07K 14/00 - 14/825 C07K 16/00 - 16/46 C07K 1/20 C07K 1/22 G01N 33/574 A61K 39/395 C12P 21/02

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】セルラインHTZ 19−dM（DSM ACC 2133）及
びATCC CRL 1424の増殖を阻害する黒色腫阻害活性を有
する蛋白質であって、ａ）成熟蛋白質もしくはＮ−末端プレ配列を有する蛋白
質について配列番号:1に示すDNA配列によりコードされ
ており；あるいはｂ）配列番号:1に示すDNA配列とハイブリダイズするDNA
配列によりコードされている、ここで、前記ハイブリダ
イゼーションの条件は、60℃にて６×SSC,5×Denhardt
溶液,100μg/mlサケ***DNA及び0.1％ SDS中でのハイブ
リダイゼーション、並びにこれに続く60℃にて２×SSC,
0.1％ SDS中20分間の洗浄２回、１×SSC,0.1％ SDS中20
分間の洗浄２回及び0.25×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗
浄２回である；ことを特徴とする前記蛋白質。
【請求項２】約11kD（SDS−PAGE、非還元）のサイズを
有し、そして黒色腫細胞系HTZ 19−dMの細胞上清からゲ
ルクロマトグラフィー及び逆相HPLCによる精製により得
ることができる、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】ａ）外来DNAの原核生物又は真核生物での
発現生成物であり；あるいはｂ）成熟蛋白質もしくはＮ−末端プレ配列を有する蛋白
質について配列番号:1に示すDNA配列によりコードされ
ており；あるいはｃ）配列番号:1に示すDNA配列とハイブリダイズするDNA
配列によりコードされており、ここで、前記ハイブリダ
イゼーションの条件は、60℃にて６×SSC,5×Denhardt
溶液,100μg/mlサケ***DNA及び0.1％ SDS中でのハイブ
リダイゼーション、並びにこれに続く60℃にて２×SSC,
0.1％ SDS中20分間の洗浄２回、１×SSC,0.1％ SDS中20
分間の洗浄２回及び0.25×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗
浄２回であり；あるいはｄ）もし遺伝子コードの縮重がないと仮定すれば、前記
ｂ）〜ｃ）に定義した配列とハイブリダイズし、そして
同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
DNA配列によりコードされている、ここで、前記ハイブ
リダイゼーションの条件は、60℃にて６×SSC,5×Denha
rdt溶液,100μg/mlサケ***DNA及び0.1％ SDS中でのハ
イブリダイゼーション、並びにこれに続く60℃にて２×
SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回、１×SSC,0.1％ SDS
中20分間の洗浄２回及び0.25×SSC,0.1％ SDS中20分間
の洗浄２回である；ことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛋白質。
【請求項４】配列番号:1のヌクレオチド40−432、又は1
12−432によりコードされている請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の蛋白質。
【請求項５】配列番号:4のヌクレオチド110−499、又は
179−497によりコードされている請求項１又は３に記載
の蛋白質。
【請求項６】配列番号:1に記載の塩基配列によりコード
される黒色腫阻害活性を有する蛋白質を発現するセルラ
インHTZ 19−dM（DSM ACC 2133）。
【請求項７】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋白
質をコードする核酸であって、ａ）配列番号:1もしくは３に示すDNA配列又はそれに対
して相補的なDNA配列；ｂ）前記ａ）の配列のいずれかとハイブリダイズする核
酸配列、ここで、前記ハイブリダイゼーションの条件
は、60℃にて６×SSC,5×Denhardt溶液,100μg/mlサケ
***DNA及び0.1％ SDS中でのハイブリダイゼーション、
並びにこれに続く60℃にて２×SSC,0.1％ SDS中20分間
の洗浄２回、１×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回及
び0.25×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回である；並
びにｃ）もし遺伝子コードの縮重がないと仮定すれば前記
ａ）〜ｂ）の配列のいずれかとハイブリダイズする核酸
配列、ここで、前記ハイブリダイゼーションの条件は、
60℃にて６×SSC,5×Denhardt溶液,100μg/mlサケ***D
NA及び0.1％ SDS中でのハイブリダイゼーション、並び
にこれに続く60℃にて２×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗
浄２回、１×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回及び0.2
5×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回である；から成る群から選択された核酸。
【請求項８】配列番号:1に示す配列を有するDNA。
【請求項９】配列番号:3に示す配列を有するDNA。
【請求項１０】配列番号:4に示す配列を有するDNA。
【請求項１１】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質をコードするDNAを含有し、そして形質転換された
微生物又は形質転換された真核細胞中で蛋白質コードDN
Aを発現する、組換え発現ベクター。
【請求項１２】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質をコードするDNAにより形質転換されており、そし
て該蛋白質を生産することができる原核性又は真核性宿
主細胞。
【請求項１３】大腸菌又は哺乳類細胞系である請求項12
に記載の宿主細胞。
【請求項１４】黒色腫細胞系HTZ 19−dMの培養上清から
のゲルクロマトグラフィー分離による単離及び約11kDの
分子量に相当する上清画分の精製による、黒色腫阻害活
性を有する蛋白質を得る方法。
【請求項１５】適当な宿主細胞での請求項７〜10のいず
れか１項に記載のDNAの発現、及び該宿主細胞からの又
は該宿主細胞の培養上清からの蛋白質の単離による、黒
色腫阻害活性を有する蛋白質の組換え生産方法。
【請求項１６】黒色腫阻害活性を有する蛋白質に対する
抗体の製造方法であって、請求項１〜５のいずれか１項
に記載の蛋白質によりヒト以外の動物を免疫し、該動物
の血清から抗血清を単離するか、あるいは該動物の脾細
胞と不滅化細胞との融合細胞の培養物からモノクローナ
ル抗体を採取することを特徴とする方法。
【請求項１７】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質によりヒト以外の動物を免疫し、そして該免疫され
た動物の血清から抗体を単離するかあるいは免疫された
動物の脾細胞と不滅化細胞との融合細胞の培養物からモ
ノクローナル抗体を得ることにより得られる、黒色腫阻
害蛋白質に対する抗体。
【請求項１８】所望により医薬助剤、増量剤及び／又は
添加剤と共に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の黒
色腫阻害性蛋白質を含んで成る医薬組成物。
【請求項１９】黒色腫阻害活性を有する蛋白質をコード
する核酸の検出方法であって、被験試料を、ａ）配列番号:1もしくは３に示すDNA配列又はそれに対
して相補的な配列、及びｂ）前記ａ）の配列のいずれかとハイブリダイズする核
酸、ここで、前記ハイブリダイゼーションの条件は、60
℃にて６×SSC,5×Denhardt溶液,100μg/mlサケ***DNA
及び0.1％ SDS中でのハイブリダイゼーション、並びに
これに続く60℃にて２×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄
２回、１×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回及び0.25
×SSC,0.1％ SDS中20分間の洗浄２回である、から成る
群から選択された核酸プローブと共にインキュベート
し；そして前記試料中の核酸と前記核酸プローブとのハイブリダイ
ゼーションを検出し、所望により更なる結合パートナー
を用いる；ことを特徴とする方法。
【請求項２０】検出すべき核酸を検出の前に増幅する、
請求項19に記載の方法。
【請求項２１】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質の製造方法であって、該蛋白質のための内因性遺伝
子を哺乳類宿主細胞の培養により発現せしめ、そして該
細胞から又は細胞培養上清から前記蛋白質を採取する段
階を含んで成り、作用可能に連結されていれば前記遺伝
子の発現を刺激することができるDNA制御因子、を含ん
で成りそしてさらにゲノム中のある領域に相同性の１又
は複数のDNA標的セグメントを含んで成るDNA構成物を前
記細胞のゲノム中に相同性組換えにより挿入することに
より前記の発現が行われ、前記領域は前記遺伝子内に又
はその近傍に存在する、ことを特徴とする方法。
【請求項２２】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質の製造方法であって、該蛋白質のための外因性遺伝
子を哺乳類宿主の培養により発現せしめ、そして該細胞
又は細胞培養上清から前記蛋白質を採取する段階を含ん
で成り、作用可能に連結されておれば前記遺伝子を発現
を刺激することができる、前記蛋白質をコードするDNA
制御因子を含んで成り、そしてさらにゲノム中のある領
域に相同性の１又は複数のDNAセグメントを含んで成りD
NA構成物を前記細胞のゲノム中に相同性組換えにより挿
入することにより前記発現が行われることを特徴とする
方法。