JP3403406B2 - カゼインマクロペプチドのペプチド類，これらペプチド類の抗体と用途 - Google Patents

カゼインマクロペプチドのペプチド類，これらペプチド類の抗体と用途

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、乳及び乳製品の蛋白質分解変性の程度を
評価することができる方法に関する。
蛋白質分解現象特に細菌性プロテアーゼによる分解現
象は、乳製品の品質の低下の原因となる。
これらの現象を起す細菌は、本質的にグラム陰性菌、
特にシュードモナス菌である。これらは低温で発育しう
る好冷性細菌（psychrotrophic bacteria）である。４
℃で乳の貯蔵は、他の種を犠牲にしてこれらの細菌の発
育に有利に働く。
好冷性細菌からのプロテアーゼの作用は本来カゼイン
に関して研究されている。最も急速に分解されるフラク
ションはＫ−カゼインで、β−カゼインも実質的にアタ
ックされ、αsl−カゼインも低程度であるが分解される
とみられる。好冷性細菌プロテアーゼによるＫ−カゼイ
ンの蛋白分解では、約60のアミノ酸ペプチド（例えば牛
乳では64アミノ酸）、グリコマクロペプチド（GMP）と
も称せられるカゼインマクロペプチド（CMP）で、Ｋ−
カゼインのＣ末端に対応するものを放出する。
好冷性細菌のプロテアーゼ活性は耐熱性で、かつUHT
滅菌処理に安定である。UHT製品にこの活性が残存する
ことは、これら製品の寿命及び感覚刺激性を減少させ
る。従って、乳及び乳製品中の好冷性細菌による蛋白質
分解（又は蛋白質分解力）を評価する試験を有すること
が望まれる。
牛乳工場に到着した牛乳にこのようなテストを行え
ば、受け取った牛乳の品質に最も適する処理と加工操作
を決めることが可能となる。それによりある種の製造過
失（UHT牛乳のジェリー化、苦味フレーバー、過酸、チ
ーズ収量の減少）を回避することができよう。
その上、このようなテストはチーズ製造上非常に有用
である。実際に、好冷性細菌の蛋白質分解酵素は、チー
ズの熟成にある役割を明白に奏する。製造前に潜在的な
蛋白質分解活性を測定することは、発育条件を変えるこ
とにより熟成をよりよくコントロールすることになろ
う。
結果として、牛乳中の蛋白質分解活性特に好冷性細菌
によるものを評価する目的でいくつかの方法が報告され
ている。
例えば、蛋白質分解の原因となる好冷性の生理的寄生
菌（flora）を直接評価することが提案されている。こ
の方法は、細菌を培養し計算することを含むか、それに
関連すあらゆる欠点がある。特殊な装置を比較的に多
く、かつ専門スタッフを必要とし、一方結果が細菌培養
の生育に必要とする期間後でのみ得られる。最近、迅速
な間接法（バイオ蛍光、インページメトリー等）が鉄案
されている。しかし、特殊な装置を必要とし、乳及び乳
製品のような異質培養物に多少適するもので、牛乳工場
では殆んど実際に使用されていない。
プロテアーゼを直接的にアッセイすることも提案され
ており、このアッセイは、酵素活性に基づくか、又はプ
ロテアーゼの免疫化学定量によって直接的に行われる。
酵素活性のアッセイは、例えば、標識物質（着色、蛍
光又は放射線）を放出する天然又は人工物質の加水分解
を測定することにより行われる。
例えば、HPA法〔CLIFFE、and LAW;J.Dairy Sci.,49,2
09〜219（1982）〕は、基体が、青色染料を共有結合さ
せて変性したコラーゲンであるものを挙げている。この
方法は、約２×106好冷菌/mで産生されたプロテアー
ゼを検出できる。
免疫化学法として、例えばシュードモナス フルオレ
ッセンスからのプロティナーゼP1が提案されている〔BR
IKELAND et al,Appl.Environ.Microbiol.,49,382〜38
7）〕。このプロティナーゼのELISA法によるアッセイで
は約107好冷菌/mの等価を検出できる。
他の方法として、蛋白質分解により放出されるアミノ
酸又は非蛋白窒素を測定するのがある。しかし、この方
法は、加水分解の前分離を必要とするので実行が難し
い。この方法は、約５×106好冷菌/mを検出できる。
最後に、カゼイン加水分解物の検出に基づく他の方法
がある。Ｋ−カゼインに対し、Ｋ−パラカゼインとカゼ
インマクロペプチド（CMP）の２つの分解物をアッセイ
する方法が鉄案されている。
現在では、Ｋ−パラカゼインが、電気泳動でのみ検出
できるが比較的つらい方法である。
グリコペプチドであるCMPの場合に、サアリン酸（Ｎ
−アセチルノイラミン酸）を測定するか又はDEAEセルロ
ースでのクロマトグラフィーによってアッセイすること
が提案されている。しかし、これは、つらい方法であ
り、得られる結果はあまり正確ではない。
この発明者らは、速度、使用容易性と信頼性をそなえ
る方法を見出すべく、CMPアッセイの免疫学的法の開発
をした。
そのため、抗CMP抗体を求めた（COLLIN et al.Commun
ication at the XXth International Dairy Congress,1
990年10月８〜12日、モントリオール）。
しかし、CMPのＫ−カゼインの加水分解による製造
は、非水分解のＫ−カゼインのコンタミを除去するため
長くて費用のかかる精製工程を必要とする。加えて、Ｋ
−カゼインでコンタミしていない完全に精製したCMPを
免疫源として使用しても、非加水分解Ｋ−カゼインと交
差反応をする抗体が得られ、この反応は、いくつかの親
和クロマトグラフィーでも減少しないことを観察した。
この発明の目的は、化学合成で容易に作られ、CMPの
抗原決定因子を保持し、抗CMP抗体の誘因に用いうる抗
原分子を作ることである。
発明者らは、CMPがグリコペプチドであるが、CMP配列
の断片を表わす、いくつかの非グリコシル化ペプチドが
所望の性質を有することを観察した。
この発明の主題は、アミノ酸配列がCMP配列の少なく
とも１つの断片からなり、そのペプチドがCMPの少なく
とも１つのエピトープを担持し、かつSEQ.ID No.1とし
て付表の配列リストで示される次の配列Met−Ala−Ile
−Pro−Proからなるペプチドおよび次の の（これらは付表の配列リストでSEQ.ID No.2,SEQ.ID N
o.3,SEQ.ID No.4,SEQ.ID No.5として表示）１つは、少
なくとも５つの連続アミノ酸からなるペプチドからなる
群より選択されることを特徴とする抗原ペプチドであ
る。
この発明の好ましい具体例によれば、前記ペプチドが
配列SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.4とSEQ.ID
No.5の１つの少なくとも８つの隣接アミノ酸からなる。
加えて、発明者は、得られたペプチド中、あるもの
は、Ｋ−カゼインとの交叉反応を全くか又は殆ど示さな
いことを認めた。これらのペプチドを免疫原として使用
すると、特異な抗CMP抗体を得ることができる。
“特異な抗CMP抗体”とは、CMPを認識し、交叉反応を
奏しない、又は親和クロマトグラフィーによって除去す
ることが容易であるＫ−カゼインとの反応のみの抗体を
意味すると理解すべきである。このような抗体のCMPの
断片を用いての産生は、CMPを免疫原として使用したと
きＫ−カゼインとの交叉反応を除去することは不可能と
されていたので意外である。
この発明の他の好ましい具体例によれば、前記ペプチ
ドは、次の配列SEQ.ID No.6 Met−Ala−Ile−Pro−Pro−Lys−Lys−Asn−Gln−Asp−
Lys, から本質的になるペプチド、 次の配列 の１つから本質的にペプチドからなる群より選択され
る。
この発明のなお他の好ましい具体例によれば、前記ペ
プチドは付加的にそのＣ末端にシステインからなる。
CMPの配列に関連して、配列SEQ.ID Nos.1,2,3,4,5,と
６のペプチドの位置は、MAPの構築に使用されるべきペ
プチドと同様に図１に示される。
この発明は、その構成が成分として上で定義した少な
くとも１つのペプチドから本質的になることを特徴とす
る抗原組成物を含む。
この発明による抗原組成物は、特に、上記したペプチ
ドのみならず、上記ペプチドから得られるMAPs（マルチ
抗原ペプチド）〔TAM,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,5409
〜5413,（1988年）〕ならびにそのペプチドをキャリヤ
ー蛋白にカップリングさせて得られたより複雑な抗原を
含む。
これらの組成物は、特に、抗CMP抗体誘因用の免疫原
及びCMPの検出とアッセイ用の試薬の両方に使用でき
る。
配列SEQ.ID No.1を含有するペプチドからなる組成物
（例えばペプチドSEQ.ID No.6又はその断片からなる組
成物）は、特異抗CMP抗体を得ることを可能とする。
配列SEQ.ID No.2のペプチド又はその断片からなる組
成物は、牛乳CMPのみを認識する種特異性抗体を得るこ
とを可能とし、これは、他の種（特に羊乳、ヤギ乳及び
野牛のようなウシからの乳でも）から得られた想定され
る乳又は他の乳製品の牛乳の存在の検出を可能とする。
この発明の主題は、また、動物が上記の抗原組成物で
免疫化される工程からなることを特徴とする抗CMP抗体
の製法である。
この発明は、また、抗原として、この発明の組成物を
用いて得られる抗CMP抗体を含む。
この発明の好ましい具体例によれば、その抗体はモノ
クロナール抗体である。
この発明の他の好ましい具体例によれば、その抗体の
ポリクローナル抗体である。
この発明の主題は、付加的に配列SEQ.ID No.1からな
るペプチドに対し指向する特異性抗CMP抗体を検査すべ
き乳または乳製品と接触させる工程、この工程中に生成
される抗原／抗体コンプレックスを適当な手段で検出お
よび／またはアッセイする工程からなることを特徴とす
る乳または乳製品の蛋白分解を評価しうる方法である。
この発明の方法の好ましい具体例では、使用される特
異抗CMP抗体が、配列SEQ.ID No.6のペプチド又はその断
片の１つに対して作られる。
Ｋ−カゼインとCMPの両方を認識する抗CMP抗体は、コ
ントロールとして、存在するＫ−カゼイン（加水分解又
は非加水分解）の全量を評価するのに使用できる。
この発明による方法は、ヨーグルト中のＫ−カゼイン
蛋白質分解の存在（その分解の程度はヨーグルトの製造
に用いた種により変化する）を検出できる。そのため、
この方法は、種のＫ−カゼイン加水分解によるCMPの生
産能に従って、種の選択に有利に応用できる。
付加的に、この発明の主題は、配列SEQ.ID No.2のペ
プチド又はそのペプチドの断片に対して産生された抗体
を検査すべき乳又は乳製品と接触させる工程、この工程
中に生成した抗原／抗体を適当な手段で検出および／ま
たはアッセイする工程からなることを特徴とする乳およ
び乳製品中の牛乳CMPの存在を検出する方法に関する。
抗原／抗体コンプレックスの検出、アッセイの手段
は、当業者に周知で、最も普通に用いられる手段として
ELISA、RIAなどの各種の方法が挙げられるが、これに限
定されない。
また、この発明の主題は、この発明による、少なくと
も１つのペプチド又は１つの抗原組成物又は別に少なく
とも１つの抗CMP抗体からなることを特徴とするCMPのア
ッセイ用の診断剤に関する。その抗体又はそのペプチド
は、反応物を可視化させる適当なマーカー（化学的、酵
素的又は放射線的）に任意に結合される。
この発明は、下記の付加的記載、すなわち抗CMP抗体
の産生用のこの発明の抗原組成物を用いる実施例及び乳
蛋白質分解の評価用の前記抗体の使用に関する記載の助
けでより明らかに理解されるであろう。
しかし、これらの実施例は発明の主題を例示するため
のもので、それによって限定されないことは勿論であ
る。
I.−抗CMP抗体の産生 ペプチドを、メリフィールドの方法、分冊“抗原とし
ての合成ポリペプチド類”〔VAN REGENMORTEL,BRIAND,M
ULLER,PLANE,Ed.Elsevier（1988）〕に記載の手順を用
いて合成し、クロマトグラフィーで精製する。精製後
に、ペプチドをキャリヤー蛋白に結合させる。
すなわち、カップリング剤MBS（Ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル）を用
いアミノ酸システイン−オバアルブミン又はカップリン
グ剤BDB（ビスジアゾベンジジン）を用いてアミノ酸チ
ロシン上牛の血清アルブミンの何れか。
実施例１−ポリクローナル血清の作成 ウサギを合成ペプチドで免疫化する。すなわち、第１
の注入は、生理食塩水と完全フロインドアジュバントの
等量混合物1mに200μｇのペプチドを溶解させたもの
で行う。ブースター注入は、200μｇのペプチドの不完
全フロインドアジュバント懸濁液で各３週ごとに行う。
血液サンプルを第１の注入後10日で採取し、血清を回
収する。
Ｋ−カゼインとの交叉反応を少なくするため、血清を
200mg牛血清アルブミンを補充した10mgのＫ−カゼイン
とカップリング剤（2.5％グルタルアルデヒド）からな
るＫ−カゼインゲルに吸着させた。重合したゲルは、0.
1Mリン酸塩緩衝液（pH7.2）中４℃で保存する。第１の
場合に、ゲルを４℃、18600gで15分間遠心分離して、緩
衝液を除去する。
リン酸塩緩衝液1m中凍結乾燥血清310mgの量で、抗C
MP血清をゲルに加える。この混合物を室温で２時間、次
いで４℃で一夜攪拌する。上澄液を回収し、ゲルをリン
酸塩緩衝液0.25mで洗浄する。次に、23600gで15分間
再び遠心分離して、全てのエントラップされた血清を回
収する。得られる上澄液を第１の上澄液に加える。
実施例２−抗CMPモノクロナール抗体の産生 Balb/c BYJICOマウスを完全フロインド アジュバン
ド中でエマルジョンにした卵白アルブミン連結ペプチド
100μｇを第１の腹腔内注射で免疫化する。17日目に、
卵白アルブミン連結ペプチド50μｇの腹腔内注射を不完
全なフロインド アジュバンド存在下で行い、卵白アル
ブミン連結ペプチド10μｇの静注をアジュバンドなしで
行った。20日目に、マウスを犠牲にし、脾臓を除去し、
脾細胞（splenocyles）をミルステインとコーラーの方
法〔Nature,256,495〜497（1975）〕により骨髄細胞と
融合する。得られるハイブリットのスクリーニングを牛
血清アルブミンに連結した免疫化用に供されたペプチド
で行う。
実施例３−CMPからの各種ペプチドの抗原性の比較 図１中、１〜９で表わされた牛乳CMPの配列の断片か
らなる合成ペプチド（ペプチド７はペプチドSEQ.ID No.
6に対応し、ペプチド８はその配列の最初の６つのアミ
ノ酸に相当し、Cys残基はこれら２つのペプチドのＣ末
端に添加された）を、実施例１に記載の方法による抗体
を作るのに用いた。
アッセイは、次の方法によるELISAで行い、CMPの２μ
g/m溶液100μｌ又はＫ−カゼインの６μg/m溶液100
μｌマイクロ適定プレートのくぼみに入れる。これらの
抗原の吸着は、プレートを４℃で一夜培養して行われ
る。次いで、くぼみをPBS−ツィーン350μｌで３回洗浄
し、PBS−ツィーン＋１％ゼラチンの250μｌで飽和す
る。プレートを37℃で１時間培養する。ペプチド１〜８
の１つに対して産生された抗体（1/1000希釈）の100μ
ｌを各プレートのくぼみに入れ、次いで37℃で１時間30
分インキュベートする。
350μｌのPBS−ツィーンで３回洗浄し、各くぼみにペ
ルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG抗体でPBS−ツィーンに
1/2000に希釈したもの100μｌを添加し、プレートを37
℃で45分培養する。
PBS−ツィーンで新たに３回洗浄し、反応を可視化す
る。使用した基質は、0.1Mクエン酸塩緩衝液pH5＋H2O2
は1/10希釈の3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン（TM
B）である。各くぼみに75μｌを加え、プレートを37℃
で15分培養する。
ペルオキシダーゼとTMBとの反応で青色を呈する。こ
の反応は、各くぼみに1N−塩酸25μｌを加え停止する。
次いで基質は黄色になる。結果は、450nmでのODを測定
して評価する。
結果は下記表１に示す。（＋）は陽性反応、（−）は
陰性反応、＋印の数は観察された着色反応の強度をそれ
ぞれ示す。
II.−乳及び乳製品中のCMPのアッセイへの抗CMP抗体の
使用 くぼみに吸着により、CMP吸着に干渉する乳蛋白の最
大量を除去しうるよう前もって限外濾過したテストサン
プルの溶液を用いて、アッセイを行う。このアッセイ
は、上記実施例３に記載のELISA法によって行う。
精製抗原の既知量（例えば、CMPの２μg/mの溶液10
0μｌ、この発明によるペプチド又はMAPはCMPの代りに
用いることができる）をプレートに吸着させる。
アッセイを限外濾過なしサンプルで行いたいときは、
競合ELISAアッセイで行うのが好ましい。
プレートの洗浄と飽和の後に、アッセイすべき抗原液
の連続希釈液の存在下で抗原−抗体反応を行う。
反応産物は上記実施例３に示すように可視化される。
検体サンプル中のCMPの量は、CMPの既知希釈液で得ら
れた連続目盛との比較で評価される。
実施例４−乳中のCMPのアッセイ このアッセイに使用された抗体はペプチド７（SEQ.ID
No.6＋Cys）に対して産生された。
４つのチーズ工場からの110の乳サンプルについての
研究で、これらのサンプルが研究室に到着した際、その
13％が平均２×105微生物/mを含み、CMPはｍ当たり
５μｇ以上含有した。
＋４℃で２日間保存後、平均微生物数は、４×106微
生物/mに増加し、このサンプルの26％がCMPをｍ当
たり５μｇ以上含有した。
加えて、9UHT乳サンプルを遠心分離前後に実験する。
そしてその脱安定化を評価する遠心分離後安定性が残っ
たサンプルは60〜100℃に加熱し、その非安定化温度を
記した。
非常に脱安定化した乳は高いCMP濃度（＞80μg/m）
で一方安定な乳なｍ当たりCMP10μｇ又はそれ以下を
含むことが観察される。遠心分離後に安定であるが加熱
後に脱安定化される乳は、ｍ当たりCMP43.4μｇを含
む。この結果は、CMPをアッセイして評価したＫ−カゼ
インの蛋白分解とUHT乳の脱安定化の間の関係を明らか
にする。
実施例５−この発明の抗体をチーズ中のCMPのアッセイ
とペプチドSEQ.ID No.2に指向した抗体の種特異性の例
証への使用 実施例１に記載の方法で作ったペプチドSEQ.ID No.2
に指向したウサギポリクロナール抗体を用いる。
チーズ5gを0.05Mリン酸塩緩衝液pH7.2 10mでの水性
抽出ビーターを用いて混合して行う。牛CMPの存在又は
非存在を、混合後に得た溶液を遠心分離し、その水層に
ついて上記の阻止ELISA法を用いて測定する。
結果は図２に示す。Ｘ軸は水性抽出物の希釈を示し、
〔■〕ウシ、〔□〕ヒツジ、（＊）ヤギ、Ｙ軸にOD 450
を示す。
配列のリスト SEQ.ID No.1ペプチド 牛乳のＫ−カゼインのアミノ酸106〜110 SEQ.ID No.2ペプチド 牛乳のアミノ酸155〜164 SEQ.ID No.3ペプチド 牛乳のアミノ酸116〜125 SEQ.ID No.4ペプチド 牛乳のアミノ酸124〜133 SEQ.ID No.5ペプチド 牛乳のアミノ酸148〜157 SEQ.ID No.6ペプチド 牛乳のアミノ酸106〜116
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ (72)発明者 コリン，ジャン−クロード フランス国、39800 ポリニー エコー ル マテルネル デュ サントル（番地 なし) (72)発明者 ペロー，ジャン−ルイ フランス国、01380 バージュ ル シ ャラル プレシャロン（番地なし) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/04 - 7/08 C07K 14/21 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】抗−CMP抗体を得るための、以下の配列： の１つに相当するペプチドからなる群より選択される抗
    原ペプチド。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のペプチドが、さらにＣ末
    端にシステインを有することを特徴とする、抗原ペプチ
    ド。
  3. 【請求項３】− 請求項２のペプチド、 − 請求項１又は２のいずれかに記載されたペプチドと
    キャリアープロテインのカップリングの産物、 − 請求項１又は２のいずれかに記載されたペプチドか
    ら誘導されるペプチド誘導体 からなる群から選択された少なくとも１つのペプチド又
    はペプチド誘導体を必須成分として含むことを特徴とす
    る抗原組成物。
  4. 【請求項４】請求項３の抗原組成物又は請求項１に定義
    されたペプチドで動物を免疫化する工程からなることを
    特徴とする抗CMP抗体の製造方法。
  5. 【請求項５】請求項４の方法を用いて得ることができる
    ことを特徴とする抗CMP抗体。
  6. 【請求項６】モノクローナル抗体であることを特徴とす
    る請求項５の抗体。
  7. 【請求項７】ポリクローナル抗体であることを特徴とす
    る請求項５の抗体。
  8. 【請求項８】以下の配列： の１つに相当するペプチドに対する請求項５の抗体を検
    査すべき乳又は乳製品と接触させる少なくとも１つの工
    程、及びこの工程中に生成される抗原／抗体コンプレッ
    クスを適当な手段で検出及び／又はアッセイする工程か
    らなることを特徴とする、乳及び乳製品のタンパク質分
    解を評価し得る方法。
  9. 【請求項９】配列:Ser−Pro−Pro−Glu−Ile−Asn−Thr
    −Val−Gln−Valのペプチドに対する請求項５の抗体を
    検査すべき乳又は乳製品と接触させる工程、及びこの工
    程中に生成した抗原／抗体コンプレックスを適当な手段
    で検出及び／又はアッセイする工程からなることを特徴
    とする、乳及び乳製品中の牛乳CMPの存在を検出する方
    法。
  10. 【請求項１０】請求項４〜６のいずれか１つによる少な
    くとも１つの抗CMP抗体からなることを特徴とするCMPの
    検出・アッセイ用の試薬。
JP51219093A 1992-01-10 1993-01-08 カゼインマクロペプチドのペプチド類，これらペプチド類の抗体と用途 Expired - Fee Related JP3403406B2 (ja)

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