JP3403205B2 - 糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法 - Google Patents

糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法

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JP3403205B2 JP51450098A JP51450098A JP3403205B2 JP 3403205 B2 JP3403205 B2 JP 3403205B2 JP 51450098 A JP51450098 A JP 51450098A JP 51450098 A JP51450098 A JP 51450098A JP 3403205 B2 JP3403205 B2 JP 3403205B2
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聡司 小泉
克敏 佐々木
徹夫 遠藤
和彦 田畑
明夫 尾崎
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協和醗酵工業株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、細菌・ウィルス等の感染防御、心血管障害
への適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製造方法
および該複合糖質の合成基質として重要である糖ヌクレ
オチドの製造方法に関する。
背景技術 糖ヌクレオチドの製造方法として、１）化学合成法
［Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,28,307（1973）、Bul
l.Chem.Soc.Japan,46,3275（1973）、J.Org.Chem.,57,1
46（1992）、Carbohydr.Res.,242,69（1993）］、２）
酵素を用いた製造方法［J.Org.Chem.,55,1834（199
0）、J.Org.Chem.,57,152（1992）、J.Am.Chem.Soc.,11
0,7159（1988）、特表平７−508413、特表平７−50024
8、WO96/27670］、３）酵母等の微生物菌体を用いる方
法（特公昭45−2073、特公昭46−40756、特公昭47−183
7、特公昭47−26703、特公昭49−8278、特開平２−2686
92）４）耐塩性酵母の微生物菌体からの抽出法（特開平
８−23993）等が知られている。
１）の方法においては、高価なヌクレオシド−5'−一
リン酸（以下、NMPと略す）のモルフォリデート誘導体
や糖リン酸等が必要であり、２）の方法においては、ヌ
クレオシド−5'−二リン酸（以下、NDPと略す）、ヌク
レオシド−5'−三リン酸（以下、NTPと略す）、ホスホ
エノールピルビン酸、糖リン酸等の高価な原料やピルビ
ン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であり、３）の方法に
おいては菌体の乾燥処理等が必要である。４）の方法を
含め、上記いずれの方法においても、原料として高価な
ヌクレオチドや糖リン酸等が用いられていたり、操作的
に大量生産が困難であるため、今日に至るまで、糖ヌク
レオチドの工業的規模での製造法は確立されていない。
複合糖質の製造法としては、１）化学合成法［Methods
in Enzymol.,247,193（1994）、Angew.Chem.Int.Ed.Eng
l.,21,155（1982）、Carbohydr.Res.,211,cl（199
1）］、２）加水分解酵素［Anal.Biochem.,202,215（19
92）、Trends Biotechnol.,６,256（1988）］を用いる
方法、および３）糖転移酵素（特開平７−79792、特表
平７−500248、特公平５−82200、WO94/25614、特表平
９−503905、USP5,583,042）を利用した方法が知られて
いる。
１）の方法では立体選択的合成のためには保護基の導
入が必須であり、２）の方法では収率・選択性が十分で
なく、３）の方法においてはNDP、NTP、ホスホエノール
ピルビン酸、糖リン酸、あるいは糖ヌクレオチド等の高
価な原料やピルビン酸キナーゼ等多数の酵素が必要であ
り、いずれの方法においても複合糖質の安価な工業的製
造方法は確立されていない。また、安価なヌクレオチド
の前駆物質および糖および複合糖質前駆物質のみを原料
として、直接複合糖質を工業的に製造する方法は知られ
ていない。
コリネバクテリウム属に属する微生物において、オロ
ット酸を添加することによりUMPが生産されるとの報告
がある［Amino Acid Nucleic Acid,23,107（1971）］。
また、オロット酸を原料にしてシチジン二リン酸コリン
を生成する方法も知られている（特開平５−276974）。
発明の開示 本発明の目的は、細菌・ウィルス等の感染防御、心血
管障害への適応および免疫治療等に有用な複合糖質の製
造方法および該複合糖質の合成基質として重要である糖
ヌクレオチドの安価で効率的な製造方法を提供すること
にある。
本発明者らは、微生物を用いて、ヌクレオチドの前駆
物質を原料とした複合糖質および糖ヌクレオチドの生産
について鋭意検討を行った結果、ヌクレオチドの前駆物
質および糖のみを原料として糖ヌクレオチドが効率的に
生産できること、糖ヌクレオチドの生成に関与する遺伝
子の発現を強化することにより、その生産性が向上する
ことを見いだし、さらに、該糖ヌクレオチドを生産可能
な微生物、および、糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質
から複合糖質を生産する能力を有する微生物あるいは動
物細胞あるいは昆虫細胞を利用し、ヌクレオチドの前駆
物質および糖および複合糖質前駆物質のみを原料として
効率的に複合糖質を生産できることを見いだし本発明を
完成するに至った。
本発明は、ａ）ヌクレオチドの前駆物質からNTPを生
産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の処
理物、ｂ）糖とNTPから糖ヌクレオチドを生産する能力
を有する微生物の培養液または該培養液の処理物、およ
びｃ）糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合糖質
を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは昆虫
細胞の培養液または該培養液の処理物、を酵素源として
用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質、糖およ
び複合糖質前駆物質を水性媒体中に存在せしめ、該水性
媒体中に複合糖質を生成蓄積させ、該水性媒体中から複
合糖質を採取することを特徴とする複合糖質の製造法、
ａ）ヌクレオチドの前駆物質からNTPを生産する能力を
有する微生物の培養液または該培養液の処理物、および
ｂ）糖とNTPから糖ヌクレオチドを生産する能力を有す
る微生物の培養液または該培養液の処理物、を酵素源と
して用い、これら酵素源、ヌクレオチドの前駆物質およ
び糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に糖ヌク
レオチドを生成蓄積させ、該水性媒体中から糖ヌクレオ
チドを採取することを特徴とする糖ヌクレオチドの製造
法、および糖ヌクレオチドと複合糖質前駆物質から複合
糖質を生産する能力を有する微生物、動物細胞あるいは
昆虫細胞の培養液または該培養液の処理物を酵素源とし
て用い、該酵素源、複合糖質前駆物質および上記に記載
の糖ヌクレオチドの製造法により得られた糖ヌクレオチ
ドを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に複合糖質
を生成蓄積させ、該水性媒体中から複合糖質を採取する
ことを特徴とする複合糖質の製造法を提供する。更に、
ガラクトキナーゼ活性の強い微生物の培養液または該培
養液の処理物を酵素源として用い、該酵素源およびＮ−
アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水
性媒体中にＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸を生
成蓄積させ、該水性媒体中からＮ−アセチルグルコサミ
ン−１−リン酸を採取することを特徴とするＮ−アセチ
ルグルコサミン−１−リン酸の製造法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は発現プラスミドpPA31およびpPAC31の造成工
程を示す。
第２図はgalU、ppa遺伝子発現プラスミドpNT12および
pNT32の造成工程を示す 第３図はgalT、galK遺伝子発現プラスミドpNT25の造
成工程を示す。
第４図はgalT、galK遺伝子をコリネバクテリウム・ア
ンモニアゲネスで発現するプラスミドpTK7の造成工程を
示す。
第５図はglmU、ppa遺伝子発現プラスミドpNT14の造成
工程を示す。
第６図はpgm遺伝子発現プラスミドpNT24の造成工程を
示す。
第７図はglmM遺伝子発現プラスミドpNT44の造成工程
を示す。
第８図はglk遺伝子発現プラスミドpNT46の造成工程を
示す。
第９図はpfkB遺伝子発現プラスミドpNT47の造成工程
を示す。
第10図はgalK遺伝子発現プラスミドpNT54の造成工程
を示す。
第11図はmanB、manC遺伝子発現プラスミドpNK7の造成
工程を示す。
第12図はpgm、pfkB遺伝子発現プラスミドpNT55の造成
工程を示す。
第13図はgmd、wcaG遺伝子発現プラスミドpNK8の造成
工程を示す。
第14図はneuA遺伝子発現プラスミドpTA14の造成工程
を示す。
第15図はlgtC遺伝子発現プラスミドpGT3の造成工程を
示す。
第16図はlgtB遺伝子発現プラスミドpNT60の造成工程
を示す。
第１−（１）表および第１−（２）表に本発明に用い
る略号および該略号の説明を記す。
本発明によれば、１）NTPや糖リン酸等の高価な原料
を必要とせず、オロット酸等の安価なヌクレオチドの前
駆物質および糖のみを原料とする、２）NMPあるいはNDP
からNTPへの転換において高価なホスホエノールピルビ
ン酸とピルビン酸キナーゼの添加を必要としない、さら
に、３）酵素の単離操作を必要としない等の特徴を有す
る糖ヌクレオチドの新規な製造法および該糖ヌクレオチ
ド製造法を利用した新規な複合糖質の製造法を提供でき
る。
本発明の製造法で製造される糖ヌクレオチドとして
は、ヌクレオシド−5'−二リン酸残基の末端リン酸基と
糖残基の還元基とがエステル結合をした一般構造を有す
る化合物をあげることができ、更に、ヌクレチド残基が
シチジン−5'−一リン酸のもの、糖残基がポリオールの
ものも本発明により製造される糖ヌクレオチドに含まれ
る。
本発明の製造法で製造される複合糖質としては、単
糖、オリゴサッカライド、担体等に結合した単糖または
オリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、脂質、糖蛋白
質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステロイド化合物
等に糖質が結合した化合物をあげることができる。
以下に本発明を詳細に説明する。
１） 本発明で用いられるヌクレオチドの前駆物質から
NTPを生産する能力を有する微生物としては、ヌクレオ
チドの前駆物質からNTPを生産する能力を有する微生物
であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリ
ヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物等を
あげることができる。
エシェリヒア属に属する微生物としてはエシェリヒア
・コリ等をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としてはコリネ
バクテリウム・アンモニアゲネス等をあげることができ
る。
２）本発明で用いられる糖とNTPから糖ヌクレオチドを
生産する能力を有する微生物としては、目的とする糖ヌ
クレオチドを生成する活性を有する生物であればいずれ
でも用いることができ、例えば、 ２）− UDP−Glcの生産に関しては、下記、式１に示
した（１）から（４）の酵素活性の強い微生物を用いる
ことが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属に属する微生物およびコ
リネバクテリウム属に属する微生物をあげることがで
き、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリまた
はコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげること
ができる。
また、（１）、（２）、（３）および（４）から選ば
れる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増
強した形質転換株を用いることもできる。該形質転換体
の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のgalUおよび
ppa遺伝子を含む組換え体DNA（pNT12）を保有するエシ
ェリヒア・コリKY8415（FERM BP−408）株等をあげるこ
とができる。
２）− UDP−Galの生産に関しては、下記、式２に示
した（５）および（６）の酵素活性の強い微生物を、ま
た、好ましくは、式１に示した（１）から（４）の酵素
活性の強い性質をもあわせ持つような微生物を用いるこ
とが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属に属する微生物およびコ
リネバクテリウム属に属する微生物をあげることがで
き、好ましい具体例としては、エシェリヒア・コリおよ
びコリネバクテリウム・アンモニアゲネスをあげること
ができる。
また、（５）および（６）から選ばれる一つ以上の酵
素の活性を、あるいは、（５）および（６）から選ばれ
る一つ以上の酵素と（１）から（４）から選ばれる一つ
以上の酵素の活性を、遺伝子組換え技術により増強した
形質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体
例として、エシェリヒア・コリ由来のgalTおよびgalK遺
伝子を含む組換え体DNA（pNT25）を保有するエシェリヒ
ア・コリNM522株およびエシェリヒア・コリ由来のgalT
およびgalK遺伝子を含む組換え体DNA（pTK7）を保有す
るコリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170を
あげることができる。
２）− UDP−GlcNAcの生産に関しては、下記、式３
に示した（７）から（12）および式１に示した（４）の
酵素活性の強い微生物、あるいは式３に示した（13）お
よび（10）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ま
しい。
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（４）、（７）、（８）、（９）、（10）、お
よび（13）から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子
組換え技術により増強した形質転換株を用いることもで
きる。該形質転換体の具体例として、エシェリヒア・コ
リ由来のglmM遺伝子を含む組換え体DNA（pNT44）を保有
するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ
由来のglmUおよびppa遺伝子を含む組換え体DNA（pNT1
4）を保有するエシェリヒア・コリKY8415株、エシェリ
ヒア・コリ由来のglk遺伝子を含む組換え体DNA（pNT4
6）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒ
ア・コリ由来のgalK遺伝子を含む組換え体DNA（pNT54）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげること
ができる。
遺伝子組換えによる（８）のホスホグルコサミンムタ
ーゼ活性の発現および増強には、Glc−1,6−P2の添加が
必要とされるが［J.Biol.Chem.,271,32（1996）］、（1
1）および（12）の酵素の活性を遺伝子組換え技術によ
り増強した形質転換株を用いることにより、Glc−1,6−
P2を添加することなく、Ｇ−６−ＰおよびＦ−６−Ｐか
らGlc−1,6−P2を供給することが可能である。
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア
・コリ由来のpgm遺伝子を含む組換え体DNA（pNT24）を
保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・
コリ由来のpfkB遺伝子を含む組換え体DNA（pNT47）を保
有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コ
リ由来のpgmおよびpfkB遺伝子を含む組換え体DNA（pNT5
5）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげるこ
とができる。
（11）および（12）の酵素活性を用いてＧ−６−Ｐお
よびＦ−６−ＰからGlc−1,6−P2を供給することによ
り、（８）のホスホグルコサミンムターゼ活性の発現を
増強する方法は本発明で初めて開示された方法である。
（13）のガラクトキナーゼ（EC2.7.1.6）を用いGlcNA
cからGlcNAc−１−Ｐを製造する方法は本発明で初めて
開示された製造法である。該製造法を用いてGlcNAc−１
−Ｐを製造することが可能である。即ち、ガラクトキナ
ーゼ活性の強い微生物、例えば、galKをコードする遺伝
子を含むDNA断片とベクターとの組換え体DNAを保有する
微生物の培養液または該培養液の処理物を酵素源として
用い、該酵素源およびGlcNAcを水性媒体中に存在せし
め、該水性媒体中にGlcNAc−１−Ｐを生成蓄積させ、該
水性媒体中からGlcNAc−１−Ｐを採取することによりGl
cNAc−１−Ｐを製造することができる。
水性媒体より、GlcNAc−１−Ｐの採取は、活性炭やイ
オン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことが
できる。
２）− UDP−GalNAcの生産に関しては、式３に示し
た（７）から（12）、式４に示した（14）および式１に
示した（４）の酵素活性の強い微生物、あるいは式３に
示した（10）、（13）および式４に示した（14）の酵素
活性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（７）から（14）および（４）から選ばれる一
つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した
形質転換株を用いることもできる。
２）− UDP−GlcUAの生産に関しては、式１に示した
（１）から（４）および式５に示した（15）の酵素活性
の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属およびコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリおよびコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（１）、（２）、（３）、（４）および（15）
から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術
により増強した形質転換株を用いることもできる。
２）− GDP−Manの生産に関しては、下記、式６に示
した（16）から（18）および式３に示した（11）および
（12）の酵素活性の強い微生物を用いることが好まし
い。
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（16）、（17）および（18）から選ばれる一つ
以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術により増強した形
質転換株を用いることもできる。該形質転換体の具体例
として、エシェリヒア・コリ由来のmanBおよびmanC遺伝
子を含む組換え体DNA（pNK7）を保有するエシェリヒア
・コリNM522株、エシェリヒア・コリ由来のglk遺伝子を
含む組換え体DNA（pNT46）を保有するエシェリヒア・コ
リNM522株等をあげることができる。
遺伝子組換え技術による（17）のホスホマンノムター
ゼ活性の発現および増強には、Glc−1,6−P2の添加が必
要とされるが、（11）および（12）の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることに
より、Glc−1,6−P2を添加することなく、Ｇ−６−Ｐお
よびＦ−６−ＰからGlc−1,6−P2を供給することが可能
である。このような形質転換体の具体例として、エシェ
リヒア・コリ由来のpgm遺伝子を含む組換え体DNA（pNT2
4）を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒ
ア・コリ由来のpfkB遺伝子を含む組換え体DNA（pNT47）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア
・コリ由来のpgmおよびpfkB遺伝子を含む組換え体DNA
（pNT55）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあ
げることができる。
（11）および（12）の酵素活性を用いてＧ−６−Ｐお
よびＦ−６−ＰからGlc−1,6−P2を供給することによ
り、（17）のホスホマンノムターゼ活性の発現を増強す
る方法は本発明で初めて開示された方法である。
２）− GDP−Fucの生産に関しては、下記、式７に示
した（19）および（20）および式６に示した（16）から
（18）および式３に示した（11）および（12）の酵素活
性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（16）、（17）、（18）、（19）および（20）
から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術
により増強した形質転換株を用いることもできる。該形
質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のma
nBおよびmanC遺伝子を含む組換え体DNA（pNK7）を保有
するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コリ
由来のgmdおよびwcaG遺伝子を含む組換え体DNA（pNK8）
を保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア
・コリ由来のglk遺伝子を含む組換え体DNA（pNT46）を
保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげることが
できる。
遺伝子組換え技術による（17）のホスホマンノムター
ゼ活性の発現および増強には、Glc−1,6−P2の添加が必
要とされるが、（11）および（12）の酵素の活性を遺伝
子組換え技術により増強した形質転換株を用いることに
より、Glc−1,6−P2を添加することなく、Ｇ−６−Ｐお
よびＦ−６−ＰからGlc−1,6−P2を供給することが可能
である。
このような形質転換体の具体例として、エシェリヒア
・コリ由来のpgm遺伝子を含む組換え体DNA（pNT24）を
保有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・
コリ由来のpfkB遺伝子を含む組換え体DNA（pNT47）を保
有するエシェリヒア・コリNM522株、エシェリヒア・コ
リ由来のpgmおよびpfkB遺伝子を含む組換え体DNA（pNT5
5）を保有するエシェリヒア・コリNM522株等をあげるこ
とができる。
２）− CMP−NeuAcの生産に関しては、下記、式８に
示した（21）、（22）または（23）、（24）および（2
5）の酵素活性の強い微生物を用いることが好ましい。
具体的には、エシェリヒア属またはコリネバクテリウ
ム属に属する微生物をあげることができ、好ましい具体
例としては、エシェリヒア・コリまたはコリネバクテリ
ウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、（21）、（22）、（23）、（24）および（25）
から選ばれる一つ以上の酵素の活性を遺伝子組換え技術
により増強した形質転換株を用いることもできる。該形
質転換体の具体例として、エシェリヒア・コリ由来のna
nA遺伝子を含む組換え体DNA（pNAL1）を保有するエシェ
リヒア・コリC600株［Appl.Environ.Microbiol.,51,562
（1986）］、エシェリヒア・コリ由来のneuA遺伝子を含
む組換え体DNA（pTA14）を保有するエシェリヒア・コリ
NM522株等をあげることができる。
微生物が１）に記載の微生物の性質および２）に記載
の微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を利
用し、ヌクレオチドの前駆物質と糖より糖ヌクレオチド
を生産することが可能である。
微生物が１）に記載の微生物の性質および２）−に
記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用
し、オロット酸等のUTP前駆物質とグルコースよりUDP−
Glcを、１）に記載の微生物の性質および２）−に記
載の微生物の性質を同時に有する場合には、該微生物を
利用し、オロット酸等のUTP前駆物質とガラクトースよ
りUDP−Galを、１）に記載の微生物の性質および２）−
に記載の性質を同時に有する場合には該微生物を利用
し、オロット酸等のUTP前駆物質とグルコサミンまたは
Ｎ−アセチルグルコサミンよりUDP−GlcNAcを、１）に
記載の微生物の性質および２）−に記載の性質を同時
に有する場合には該微生物を利用し、オロット酸等のUT
P前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサ
ミンよりUDP−GalNAcを、１）に記載の微生物の性質お
よび２）−に記載の性質を同時に有する場合には該微
生物を利用し、オロット酸等のUTP前駆物質とグルコー
スよりUDP−GlcUAを、１）に記載の微生物の性質および
２）−に記載の性質を同時に有する場合には、該微生
物を利用し、GMP等のGTP前駆物質とマンノースよりGDP
−Manを、１）に記載の微生物の性質および２）−に
記載の性質を同時に有する場合には、該微生物を利用
し、GMP等のGTP前駆物質とマンノースよりGDP−Fucを、
１）に記載の微生物の性質および２）−に記載の性質
を同時に有する場合には、該微生物を利用し、オロット
酸等のCTP前駆物質とＮ−アセチルグルコサミンまたは
Ｎ−アセチルマンノサミンよりCMP−NeuAcを生産するこ
とが可能である。
このような微生物の具体例としては、エシェリヒア・
コリ由来のgalTおよびgalK遺伝子を発現するコリネバク
テリウム・アンモニアゲネスをあげることができる。
また、上記の菌株とは異なり、１菌株中に糖ヌクレオ
チドの製造に必要な活性の一部しか有していない微生物
の場合、それぞれの活性を有する微生物を適宜組み合わ
せ、糖ヌクレオチドの製造を行うことができる。
１）に記載の性質を有する微生物も１種類である必要
はなく、２種類以上で１）に記載する性質を構成する場
合にも１）に記載の性質を有する微生物として利用でき
る。具体的には、エシェリヒア・コリ由来のpyrG遺伝子
を発現するエシェリヒア・コリとコリネバクテリウム・
アンモニアゲネスとの組み合わせを例示することができ
る（特開平５−276974）。
同様に２）に記載の性質を有する微生物も１種類であ
る必要はなく、２種類以上で構成することができる。該
微生物群を適宜組み合わせることにより、目的とする糖
ヌクレオチドを生産することができる。
例えば、１）に記載の性質を有する微生物および２）
−に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、
オロット酸等のUTP前駆物質とグルコースよりUDP−Glc
を、１）に記載の性質を有する微生物および２）−に
記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロッ
ト酸等のUTP前駆物質とガラクトースよりUDP−Galを、
１）に記載の性質を有する微生物および２）−に記載
の性質を有する一種類以上の微生物を用い、オロット酸
等のUTP前駆物質とグルコサミンまたはＮ−アセチルグ
ルコサミンよりUDP−GlcNAcを、１）に記載の性質を有
する微生物および２）−に記載の性質を有する一種類
以上の微生物を用い、オロット酸等のUTP前駆物質とグ
ルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンよりUDP−G
alNAcを、１）に記載の性質を有する微生物および２）
−に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、
オロット酸等のUTP前駆物質とグルコースよりUDP−GlcU
Aを、１）に記載の性質を有する微生物および２）−
に記載の性質を有する一種類以上の微生物を用い、GMP
等のGTP前駆物質とマンノースよりGDP−Manを、１）に
記載の性質を有する微生物および２）−に記載の性質
を有する一種類以上の微生物を用い、GMP等のGTP前駆物
質とマンノースよりGDP−Fucを、１）に記載の性質を有
する微生物および２）−に記載の性質を有する一種類
以上の微生物を用い、オロット酸等のCTP前駆物質とＮ
−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルマンノサミ
ンよりCMP−NeuAcを生産することが可能である。
上述のように、糖ヌクレオチドの製造において、遺伝
子組換え微生物を利用することが可能であるが、該製造
に関与する、第２表に記載した遺伝子は、エシェリヒア
・コリの染色体よりクローン化され、その全塩基配列が
決定されている。
該遺伝子を含有するプラスミドを保有するエシェリヒ
ア・コリからのプラスミドDNAの単離精製、プラスミドD
NAの制限酵素による切断、切断したDNA断片の単離精
製、DNA断片の酵素的結合、組換え体DNAを用いたエシェ
リヒア・コリの形質転換等、遺伝子組換えに関する種々
の操作は公知の方法［例えばJ.Sambrookらの成書;Molec
ular Cloning,A Laboratory Manual Second edition Co
ld Spring Harbor Laboratory（1989）］に準じて行う
ことができる。またポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
ョン（以下、PCRと略す）はパーキン・エルマー・シー
タス社製のサーマル・サイクラー等を用いて行うことが
できる。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子を宿主中で発
現させるためには、該遺伝子を含むDNA断片を、制限酵
素類あるいはPCRで、該遺伝子を含む適当な長さのDNA断
片とした後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿
入し、次いで上記DNAを挿入した発現ベクターを、発現
ベクターに適合した宿主中に導入することにより達成で
きる。
宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものは
全て用いることができる。例えば、エシェリヒア属、セ
ラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属、等に属する微生物
の他、サッカロマイセス属、キャンディダ属等に属する
酵母等をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主に於いて自立複製可
能ないしは染色体中への組込みが可能で、糖ヌクレオチ
ドの製造に関与する遺伝子を転写できる位置にプロモー
ターを含有しているものが用いられる。
上記の微生物を宿主として用いる場合は、糖ヌクレオ
チドの製造に関与する遺伝子の発現ベクターは微生物中
で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソ
ーム結合配列、糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝
子、転写終結配列より構成されていることが好ましい。
プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pB
Tac2（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、pKYP10
（特開昭58−110600）、pKYP200［Agric.Biol.Chem.,4
8,669（1984）］、pLSA1［Agric.Biol.Chem.,53,277（1
989）］、pGEL1［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,4306（1
985）］、pBluescript II SK+（STRATAGENE社製）、pTr
S30［エシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM BP−540
7）より調製］およびpTrS32［エシェリヒア・コリJM109
/pTrS32（FERM BP−5408）より調製］、pUC19［Gene,3
3,103（1985）］、pSTV28（宝酒造社製）、pPA1（特開
昭63−233798）、pCG11（特公平６−91827）等を例示す
ることができる。
プロモーターとしては、上記の宿主中で発現できるも
のであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモ
ーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモ
ーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来す
るプロモーターをあげることができる。またtrpプロモ
ーターを２つ直列させたプロモーター、tacプロモータ
ーのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用
いることができる。
リボソーム結合配列としては、上記の宿主中で発現で
きるものであればいかなるものでもよいが、リボソーム
結合配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜
18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好まし
い。
糖ヌクレオチドの製造に関与する遺伝子の発現には転
写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺
伝子の下流に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、組換え体DNAが発現でき、糖ヌクレオ
チドの生成反応に利用できるものならいかなる微生物も
使用でき、具体的には、Escherichia coli XL1−Blue、
Escherichia coli XL2−Blue、Escherichia coli DH1、
Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、
Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Es
cherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Esch
erichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escheri
chia coli KY8415、Escherichia coli NM522、Bacillus
subtilis、Bacillus brevis、Bacillus amyloliquefac
ines、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brev
ibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacteri
um flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869、Corynebacterium ammoniagenes ATCC2117
0、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebac
terium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium
ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida、Serra
tia marcescens等をあげることができる。
酵母菌株を宿主として用いる場合には、発現ベクター
として、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC370
51）、YCp50（ATCC37419）等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株の宿主中で発現でき
るものであればいかなるものでもよい。例えば、ヘキソ
キナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal １
プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショック
蛋白質プロモーター、MFα１プロモーター、CUP １プ
ロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主としては、組換え体DNAが発現でき、糖ヌクレオ
チドの生成反応に利用できるものならいかなる酵母も使
用でき、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Cand
ida utilis、Candida parapsilosis、Candida krusei、
Candida versatilis、Candida lipolytica、Candida ze
ylanoides、Candida guilliermondii、Candida albican
s、Candida humicola、Pichia farinosa、Pichia ohmer
i、Torulopsis candida、Torulopsis sphaerica、Torul
opsis xylinus、Torulopsis famata、Torulopsis versa
tilis、Debaryomyces subglobosus、Debaryomyces cant
arellii、Debaryomyces globosus、Debaryomyces hanse
nii、Debaryomyces japonicus、Zygosaccharomyces rou
xii、Zygosaccharomyces bailii、Kluyveromyces lacti
s、Kluyveromyces marxianus、Hansenula anomala、Han
senula jadinii、Brettanomyces lambicus、Brettanomy
ces anomalus、Schizosaccharomyces pombe、Trichospo
ron pullulansおよびSchwanniomyces alluvius等をあげ
ることができる。
本発明に用いる微生物の培養は、通常の培養方法に従
って行うことができる。該微生物を培養する培地は、該
微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有
し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然
培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るもの
であればよく、グルコース、フルクトース、シュークロ
ース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビ
トール、糖蜜、澱粉あるいは澱粉加水分解物等の炭水化
物、ピルビン酸、乳酸、クエン酸、フマル酸等の各種有
機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジン等の各種アミ
ノ酸、エタノール、プロパノール、グリセロール等のア
ルコール類が用いられる。また、白糖、キャッサバ、バ
ガス、コーン・スティープ・リカー等の天然有機栄養源
も用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の各種無機および有機アンモ
ニウム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニン等
のアミノ酸、ペプトン、NZアミン、コーン・スティープ
・リカー、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、カゼイ
ン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、フィッシュ
ミールあるいはその消化物等が用いられる。
無機物としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウ
ム、リン酸一ナトリウムリン酸二ナトリウム、リン酸マ
グネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩
化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マン
ガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等が用いられ
る。ビタミン、アミノ酸、核酸等を必要に応じて添加し
てもよい。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養等の好気的条件
下で行う。培養温度は15〜45℃がよく、培養時間は、通
常５〜96時間である。培養中pHは、3.0〜9.0に保持す
る。pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶
液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行
う。また培養中必要に応じてアンピシリン、カナマイシ
ンまたはクロラムフェニコール等の抗生物質を培地に添
加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発
現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、
必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質
転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモ
ーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培
養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地
に添加してもよい。
本発明の糖ヌクレオチドの製造において、２種以上の
微生物を用いる場合、該微生物それぞれを個別に培養
し、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いて
もよいし、一つの培養器に同時に植菌し、混合培養した
後、該培養液を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いて
もよい。また、いずれかの微生物の培養中もしくは培養
終了時に残りの微生物を植菌し、培養した後、該培養液
を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。更
に、上述１）に記載の性質を有する微生物と２）に記載
の性質を有する微生物とを別々に培養し、各々の培養液
を利用して糖ヌクレオチドの製造に用いてもよい。
該培養により得られた微生物の培養液および該培養液
を種々処理した培養液の処理物を酵素源として用い、水
性媒体中で糖ヌクレオチドの生成に用いることができ
る。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、培養液の
乾燥物、培養液を遠心分離して得られる培養上清、該培
養上清の濃縮物、培養上清から得られる酵素標品、培養
液を遠心分離して得られる細胞（菌体を含む）、該細胞
の乾燥物、該細胞の凍結乾燥物、該細胞の界面活性剤処
理物、該細胞の超音波処理物、該細胞の機械的摩砕処理
物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、該細胞
の蛋白質分画物、該細胞の固定化物あるいは該細胞より
抽出して得られる酵素標品等を挙げることができる。
糖ヌクレオチドの生成において用いられる酵素源の量
は、湿菌体として、１〜500g/lであり、好ましくは５〜
300g/lである。また、同時に２種以上の微生物を用いて
水性媒体中で反応を行う場合には、水性媒体中の該微生
物の全湿菌体量は２〜500g/lであり、好ましくは５〜40
0g/lである。
糖ヌクレオチドの生成において用いられる水性媒体と
しては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、ク
エン酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール
等のアルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセト
ン等のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげる
ことができる。また、酵素源として用いた微生物の培養
液を水性媒体として用いることができる。
糖ヌクレオチドの生成において用いられるヌクレオチ
ドの前駆物質としては、オロット酸、ウラシル、オロチ
ジン、ウリジン、シトシン、シチジン、アデニン、アデ
ノシン、グアニン、グアノシン、ヒポキサンチン、イノ
シン、キサンチン、キサントシン、イノシン−5'−一リ
ン酸、キサントシン−5'−一リン酸、グアノシン−5'−
一リン酸、ウリジン−5'−一リン酸およびシチジン−5'
−一リン酸等をあげることができ、好ましくはオロット
酸およびグアノシン−5'−一リン酸をあげることができ
る。該ヌクレオチドの前駆物質は、純品および該前駆物
質の塩並びに夾雑物が反応を阻害しない限り、微生物に
より発酵生産された該前駆物質含有培養液および該培養
液の該前駆物質粗精製物を用いることができる。ヌクレ
オチドの前駆物質は0.1mM〜1.0M、好ましくは0.01〜0.3
Mの濃度で用いられる。
糖ヌクレオチドの生成において用いられる糖として
は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、グルコ
サミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマン
ノサミン、アセチルノイラミン酸およびこれらの誘導体
等をあげることができる。該糖は、純品を用いてもよい
し、これらを含有するもので、夾雑物が反応を阻害しな
いものであればいずれも用いることができる。糖は、反
応開始時に一括して添加しても良いし、あるいは反応中
分割して、あるいは連続して添加することもでき、0.1m
M〜2.0Mの濃度で用いられる。
糖ヌクレオチドの生成において、必要に応じて、ATP
再生に必要なエネルギー供与体、補酵素、リン酸イオ
ン、マグネシウムイオン、フィチン酸等のキレート剤、
界面活性剤および有機溶剤を添加してもよい。
エネルギー供与体としては、グルコース、フルクトー
ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、マンニ
トール、ソルビトール等の炭水化物、ピルビン酸、乳
酸、酢酸等の有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、糖蜜、澱粉加水分解
物等をあげることができ、1.0mM〜2.0Mの濃度で用いら
れる。
リン酸イオンとしては、正リン酸、ピロリン酸、トリ
ポリリン酸、テトラポリリン酸、ポリリン酸、メタリン
酸、トリメタリン酸、リン酸一カリウム、リン酸二カリ
ウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等の無
機のリン酸塩等をあげることができ、1.0mM〜1.0Mの濃
度で用いることができる。
マグネシウムイオンとしては、硫酸マグネシウム、硝
酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機のマグネシ
ウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機のマグネシウム
塩等をあげることができ、通常１〜100mMの濃度で用い
られる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデ
シルアミン等の非イオン系界面活性剤（例えばナイミー
ンＳ−215、日本油脂社製）、セチルトリメチルアンモ
ニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアン
モニウムクロライド等のカチオン系界面活性剤（例えば
カチオンF2−40E、日本油脂社製）、ラウロイル・ザル
コシネート等のアニオン系界面活性剤、アルキルジメチ
ルアミン等の三級アミン類（例えば三級アミンFB、日本
油脂社製）等、各種糖ヌクレオチドの生成を促進するも
のであればいずれでも良く、１種または数種を混合して
使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1〜50g/l
の濃度で用いられる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アル
コール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、通常0.1
〜50ml/lの濃度で用いられる。
糖ヌクレオチドの生成反応は、水性媒体中、pH5〜10、
好ましくはpH6〜９、20〜50℃の条件で２〜96時間行
う。
該方法により糖ヌクレオチドを生成することができ、
例えば、ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二リン酸
化合物およびシチジン一リン酸化合物等をあげることが
でいる。具体的には、UDP−Glc、UDP−Gal、UDP−GlcNA
c、UDP−GalNAc、UDP−GlcUA、GDP−Man、GDP−Fuc、CM
P−NeuAcおよびこれらの誘導体から選ばれる糖ヌクレオ
チド等をあげることができる。
水性媒体中に生成した糖ヌクレオチドの定量は公知の
方法に準じて行うことができ、例えば、UDP−GlcとUDP
−Galの分離定量はAnal.Biochem.,216,188（1994）記載
の高速液体クロマトグラフィー（以下、HPLCと略す）に
よる方法で行うことができる。また、UDP−GlcNAc、GDP
−Man、GDP−Fuc、CMP−NeuAcの分離定量は以下の条件
のHPLCにより行うことができる。
溶出液:0.1M KH2PO4（H3PO4を用いてpH3.2に調整） 流速 :1ml/min カラム:Partisil−10SAX（ワットマン社製） 検出 :UV262nm 定量 ：スタンダードの吸光度値の比較により算出 反応液中に生成した糖ヌクレオチドの採取は、活性炭
やイオン交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うこ
とができ、例えば、UDP−GalおよびUDP−Glcにおいては
J.Org.Chem.,57,152（1992）、UDP−GlcNAcにおいては
J.Org.Chem.,57,146（1992）に記載の方法に準じて行う
ことができる。
本発明の複合糖質の製造に用いることのできる微生物
あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞としては、糖ヌクレ
オチドと複合糖質前駆物質から複合糖質を生産する能力
を有する微生物あるいは動物細胞あるいは昆虫細胞であ
ればいずれも用いることができる。例えば、グルコシル
トランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラー
ゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、グ
ルクロノシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランス
フェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼおよびフコシ
ルトランスフェラーゼ等の活性を有する微生物あるいは
動物細胞あるいは昆虫細胞をあげることができる。
また、前述の糖ヌクレオチドの製造の場合と同様に、
遺伝子組換え技術により造成された微生物あるいは動物
細胞あるいは昆虫細胞を利用することもできる。例え
ば、ヒト・メラノーマ細胞SK−Mel−28細胞由来のセラ
ミドグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するエ
シェリヒア・コリ［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,4638
（1996）］、β1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ
を産生するヒト・メラノーマ細胞WM266−４株（ATCC CR
L1676）、およびヒト・メラノーマ細胞WM266−４由来β
1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有す
るナマルバ細胞KJM−１株等の組換え株（特開平６−181
759）、ヒトHela細胞由来のβ1,4−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ［EM
BO J.,９,3171（1990）］あるいはSaccharomyces cerev
isiae［Biochem.Biophys.Res.Commun.,201,160（199
4）］、ラット由来のβ1,6−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を発現するCOS−７細胞（A
TCC CRL1651）［J.Biol.Chem.,268,15381（1993）］、
ヒト由来のＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を発現するSf9細胞［J.Biochem.,118,568
（1995）］、ヒト由来のグルクロノシルトランスフェラ
ーゼを発現するエシェリヒア・コリ［Biochem.Biophys.
Res.Commun.,196,473（1993）］、ヒト由来のα1,3−フ
コシルトランスフェラーゼを発現するナマルバ細胞［J.
Biol.Chem.,269,14730（1994）］、ヒト由来のα1,3/1,
4−フコシルトランスフェラーゼを発現するCOS−１細胞
［Genes Dev.,４,1288（1990）］、ヒト由来のα1,2−
フコシルトランスフェラーゼを発現するCOS−１細胞［P
roc.Natl.Acad.Sci.USA.,87,6674（1990）］、チキン由
来のα2,6−シアリルトランスフェラーゼを発現するCOS
−７細胞［Eur.J.Biochem.,219,375（1994）］、ヒト由
来のα2,8−シアリルトランスフェラーゼを発現するCHO
細胞［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91,7952（1994）］、
ナイセリア由来のβ1,3−Ｎ−アセチルグルコサミニル
トランスフェラーゼあるいはβ1,4−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼあるいはβ1,3−Ｎ−アセチルガラクト
サミニルトランスフェラーゼあるいはα1,4−ガラクト
シルトランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ
（WO96/10086）、ナイセリア由来のα2,3−シアリルト
ランスフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J.Bi
ol.Chem.,271,28271（1996）］、ヘリコバクター・ピロ
リ由来のα1,3−フコシルトランスフェラーゼを発現す
るエシェリヒア・コリ［J.Biol.Chem.,272,21349および
21357（1997）］、酵母由来のα1,2−マンノシルトラン
スフェラーゼを発現するエシェリヒア・コリ［J.Org.Ch
em.,58,3985（1993）］等の微生物あるいは動物細胞あ
るいは昆虫細胞をあげることができる。
本発明の複合糖質の製造に微生物を用いる場合には、
該微生物を、上記ヌクレオチドの前駆物質と糖から糖ヌ
クレオチドを生産する能力を有する微生物の培養と同様
の培地、培養条件により培養することができる。
本発明の複合糖質の製造に動物細胞を用いる場合に
は、該動物細胞を培養する培地として、一般に使用され
ているRPMI1640培地、EagleのMEM培地またはこれら培地
に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養
は、５％CO2存在下等の条件下で行う。培養温度は20〜4
0℃がよく、培養時間は、通常３〜14日間である。また
必要に応じて、抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明の複合糖質の製造に昆虫細胞を用いる場合に
は、該昆虫細胞の培養を公知の方法［J.Biol.Chem.,26
8,12609（1993）］に準じて行うことができる。
該培養により得られた微生物あるは動物細胞あるいは
昆虫細胞の培養液および該培養液を種々処理した培養液
の処理物を酵素源として用い、水性媒体中で複合糖質の
生成に用いることができる。培養液の処理物としては、
培養液の濃縮物、培養液の乾燥物、培養液を遠心分離し
て得られる培養上清、該培養上清の濃縮物、培養上清か
ら得られる酵素標品、培養液を遠心分離して得られる細
胞（菌体を含む）、該細胞の乾燥物、該細胞の凍結乾燥
物、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞の超音波処理
物、該細胞の機械的摩砕処理物、該細胞の溶媒処理物、
該細胞の酵素処理物、該細胞の蛋白質分画物、該細胞の
固定化物あるいは該細胞より抽出して得られる酵素標品
等を挙げることができる。
複合糖質の生成において用いられる酵素源の量は、酵
素の活性を、37℃で１分間に１μmoleの複合糖質を生成
することのできる活性を１単位（Ｕ）として、0.1mU/l
〜10000U/lであり、好ましくは1mU/l〜1000U/lの濃度で
用いることができる。
複合糖質の生成において用いられる水性媒体として
は、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、トリス等の緩衝液、メタノール、エタノール等の
アルコール類、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等
のケトン類、アセトアミド等のアミド類等をあげること
ができる。また、酵素源として用いた微生物、動物細胞
あるいは昆虫細胞の培養液を水性媒体として用いること
ができる。
複合糖質の生成において、必要に応じて、フィチン酸
等のキレート剤、MnCl2等の無機塩、β−メルカプトエ
タノール等を添加することができる。
複合糖質の生成において用いられる糖ヌクレオチドと
しては、上記糖ヌクレオチドの生成で得られた反応液あ
るいは該反応液から精製した糖ヌクレオチドを用いるこ
とができ、0.01mM〜2.0Mの濃度で用いることができる。
また、複合糖質の生成反応液中で、上述の方法により
糖ヌクレオチドを生成させることにより、糖ヌクレオチ
ドを供給することもできる。
複合糖質の生成において用いられる複合糖質前駆物質
としては、単糖、オリゴサッカライド、担体等に結合し
た単糖およびオリゴサッカライド、蛋白質、ペプチド、
脂質、糖蛋白質、糖脂質、グリコペプチドあるいはステ
ロイド化合物等糖転移酵素の基質となるものであればい
かなるものでも用いることができる。
具体的にはグルコース、ガラクトース、マンノース、
シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミ
ン、ラクト−Ｎ−ビオース、GlcNAcβ１−3Galβ１−4G
lc、GlcNAcβ１−4Galβ１−4Glc、グロボトリオース、
Galα１−4Galβ１−４−GlcNAc、2'−フコシルラクト
ース、３−フコシルラクトース、3'−シアリルラクトー
ス、6'−シアリルラクトース、3'−シアリル−Ｎ−アセ
チルラクトサミン、6'−シアリル−Ｎ−アセチルラクト
サミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオース、ルイスＸ、ル
イスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオ
テトラオース、ラクトジフコテトラオース、3'−シアリ
ル−３−フコシルラクトース、シアリルルイスＸ、シア
リルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラク
ト−Ｎ−フコペンタオースII、ラクト−Ｎ−フコペンタ
オースIII、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、LS−テ
トラサッカライドａ、LS−テトラサッカライドｂ、LS−
テトラサッカライドｃ、（α2,3）シアリルラクト−Ｎ
−ネオテトラオースおよびこれらの誘導体、セリン、ス
レオニン、アスパラギンおよび該アミノ酸を含有するペ
プチドおよびその誘導体、セラミドおよびその誘導体等
を例示することができる。該複合糖質前駆物質は0.01mM
〜2.0Mの濃度で用いることができる。
本発明の複合糖質としては、グルコース、ガラクトー
ス、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクト
サミン、グルクロン酸、マンノース、Ｎ−アセチルマン
ノサミン、フコース、シアル酸、ラクトース、Ｎ−アセ
チルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、GlcNAcβ１
−3Galβ１−4Glc、GlcNAcβ１−4Galβ１−4Glc、グロ
ボトリオース、Galα１−4Galβ１−4GlcNAc、2'−フコ
シルラクトース、３−フコシルラクトース、3'−シアリ
ルルラクトース、6'−シアリルルラクトース、3'−シア
リル−Ｎ−アセチルラクトサミン、6'−シアリル−Ｎ−
アセチルラクトサミン、シアリルラクト−Ｎ−ビオー
ス、ルイスＸ、ルイスａ、ラクト−Ｎ−テトラオース、
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクトジフコテトラオ
ース、3'−シアリル３−フコシルラクトース、シアリル
ルイスＸ、シアリルルイスａ、ラクト−Ｎ−フコペンタ
オースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースII、ラクト−
Ｎ−フコペンタオースIII、ラクト−Ｎ−フコペンタオ
ースＶ、LS−テトラサッカライドａ、LS−テトラサッカ
ライドｂ、LS−テトラサッカライドｃ、（α2,3）シア
リルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−ジフ
コヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースI
I、ラクト−Ｎ−ヘキサオース、ラクト−Ｎ−ネオヘキ
サオース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースおよび
これらの誘導体から選ばれる糖を１あるいはそれ以上含
有する複合糖質または該複合糖質を含む複合糖質をあげ
ることができ、例えば、Galβ１−3Glc、Galβ１−4Gl
c、Galβ１−3GlcNAc、Galβ１−4GlcNAc、Galβ１−3G
al、Galβ１−4Gal、Galβ１−3GalNAc、Galβ１−4Gal
NAc、Galα１−3Glc、Galα１−4Glc、Galα１−3GlcNA
c,Galα１−4GlcNAc、Galα１−3Gal、Galα１−4Gal、
Galα１−3GalNAc、Galα１−4GalNAc、GlcNAcβ１−3G
al、GlcNAcβ１−4Gal、GlcNAcβ１−6Gal、GlcNAcβ１
−3Glc、GlcNAcβ１−4Glc、GlcNAcβ１−3GlcNAc、Glc
NAcβ１−4GlcNAc、GlcNAcβ１−6GalNAc、GlcNAcβ１
−2Man、GlcNAcβ１−4Man、GlcNAcβ１−6Man、GalNAc
β１−3Gal、GalNAcβ１−4Gal、GalNAcβ１−4GlcNA
c、GalNAcα１−3GalNAc、Manβ１−4GlcNAc、Manα１
−6Man,Manα１−3Man,Manα１−2Man,GlcUAβ１−4Glc
N、GlcUAβ１−3Gal、GlcUAβ１−3GlcNAc、GlcUAβ１
−3GalNAc、NeuAcα２−3Gal、NeuAcα２−6Gal、NeuAc
α２−3GlcNAc、NeuAcα２−6GlcNAc、NeuAcα２−3Gal
NAc、NeuAcα２−6GalNAc、NeuAcα２−8NeuAc、Fucα
１−3Glc、Fucα１−4Glc、Fucα１−3GlcNAc、Fucα１
−4GlcNAc、Fucα１−2GalおよびFucα１−6GlcNAcから
選ばれる結合を有する糖を含む複合糖質または該複合糖
質を含む複合糖質をあげることができる。また、該糖を
有する複合糖質に含まれる糖の数としては、10個以下あ
るいは６個以下のものをあげることができる。
具体的な複合糖質製造法としては、 （１）ナイセリア由来のβ1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う
ことにより、オロット酸とガラクトースとグルコースか
らラクトースを生成させることができる。
（２）ナイセリア由来のβ1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う
ことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチル
グルコサミンからＮ−アセチルラクトサミンを生成させ
ることができる。
（３）ナイセリア由来のα2,3−シアリルトランスフェ
ラーゼ［J.Biol.Chem.,271,28271（1996）］を発現する
微生物、CTPの前駆物質からCTPを生産する能力を有する
微生物、糖とCTPからCMP−NeuAcを生産する能力を有す
る微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と
した酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセ
チルマンノサミンとピルビン酸とラクトースから3'−シ
アリルラクトースを生成させることができる。
（４）ナイセリア由来のα2,3−シアリルトランスフェ
ラーゼ［J.Biol.Chem.,271,28271（1996）］を発現する
微生物、CTPの前駆物質からCTPを生産する能力を有する
微生物、糖とCTPからCMP−NeuAcを生産する能力を有す
る微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と
した酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセ
チルマンノサミンとピルビン酸とＮ−アセチルラクトサ
ミンから3'−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを生
成させることができる。
（５）チキン由来のα2,6−シアリルトランスフェラー
ゼを発現するCOS−７細胞［Eur.J.Biochem.,219,375（1
994）］、CTPの前駆物質からCTPを生産する能力を有す
る微生物、糖とCTPからCMP−NeuAcを生産する能力を有
する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源
とした酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−ア
セチルマンノサミンとピルビン酸とＮ−アセチルラクト
サミンから6'−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを
生成させることができる。
（６）ナイセリア由来のβ1,3−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微
生物、UTPの前駆物質からUTPを生産する能力を有する微
生物、糖とUTPからUDP−GlcNAcを生産する能力を有する
微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とし
た酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセチ
ルグルコサミンとラクトースからGlcNAcβ１−3Galβ１
−4Glcを生成させることができる。
（７）β1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼを産生
するヒト・メラノーマ細胞WM266−４株（ATCC CRL167
6）、あるいはヒト・メラノーマ細胞WM266−４由来β1,
3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する
ナマルバ細胞KJM−１株等の組換え株（特開平６−18175
9）、UTPの前駆物質からUTPを生産する能力を有する微
生物、糖とUTPからUDP−Galを生産する能力を有する微
生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした
酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトース
とGlcNAcβ１−3Galβ１−4Glcからラクト−Ｎ−テトラ
オースを生成させることができる。
（８）ヒトHela細胞由来のβ1,4−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ［EM
BO J.,９,3171（1990）］あるいはSaccharomyces cerev
isiae［Biochem.Biophys.Res.Commun.,201,160（199
4）］、UTPの前駆物質からUTPを生産する能力を有する
微生物、糖とUTPからUDP−Galを生産する能力を有する
微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とし
た酵素反応を行うことにより、オロット酸とガラクトー
スとGlcNAcβ１−3Galβ１−4Glcからラクト−Ｎ−ネオ
テトラオースを生成させることができる。
（９）ナイセリア由来のβ1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う
ことにより、オロット酸とガラクトースとGlcNAcβ１−
3Galβ１−4Glcからラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生
成させることができる。
（10）ナイセリア由来のβ1,3−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニルトランスフェラーゼ（WO96/10086）を発現する微
生物、ナイセリア由来のβ1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−GlcNAcを生産する能力を有する微生物、糖とU
TPからUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液
または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行
うことにより、オロット酸とＮ−アセチルグルコサミン
とガラクトースとラクトースからラクト−Ｎ−ネオテト
ラオースを生成させることができる。
（11）ナイセリア由来のα2,3−シアリルトランスフェ
ラーゼ［J.Biol.Chem.,271,28271（1996）］を発現する
微生物、CTPの前駆物質からCTPを生産する能力を有する
微生物、糖とCTPからCMP−NeuAcを生産する能力を有す
る微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と
した酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセ
チルマンノサミンとピルビン酸とラクト−Ｎ−ネオテト
ラオースから（α2,3）シアリルラクト−Ｎ−ネオテト
ラオースを生成させることができる。
（12）ヒト由来のα1,3−フコシルトランスフェラーゼ
を発現するナマルバ細胞［J.Biol.Chem.,269,14730（19
94）］、GTPの前駆物質からGTPを生産する能力を有する
微生物、糖とGTPからGDP−Fucを生産する能力を有する
微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とし
た酵素反応を行うことにより、GMPとマンノースとラク
ト−Ｎ−ネオテトラオースからラクト−Ｎ−フコペンタ
オースIIIを生成させることができる。
（13）ヘリコバクター・ピロリ由来のα1,3−フコシル
トランスフェラーゼ［J.Biol.Chem.,272,21349および21
357（1997）］を発現する微生物、GTPの前駆物質からGT
Pを生産する能力を有する微生物、糖とGTPからGDP−Fuc
を生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液
の処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、
GMPとマンノースとラクト−Ｎ−ネオテトラオースから
ラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIを生成させることが
できる。
（14）ナイセリア由来のα1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う
ことにより、オロット酸とガラクトースとラクトースか
らグロボトリオースを生成させることができる。
（15）ナイセリア由来のβ1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、ナイセリ
ア由来のα1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ（WO9
6/10086）を発現する微生物、UTPの前駆物質からUTPを
生産する能力を有する微生物、糖とUTPからUDP−Galを
生産する能力を有する微生物の培養液または該培養液の
処理物とを酵素源とした酵素反応を行うことにより、オ
ロット酸とガラクトースとグルコースからグロボトリオ
ースを生成させることができる。
（16）ナイセリア由来のα1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ（WO96/10086）を発現する微生物、UTPの前
駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とUTP
からUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液ま
たは該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行う
ことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチル
ラクトサミンからGalα１−4Galβ１−4GlcNAcを生成さ
せることができる。
（17）ヒト由来のβ1,3−ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ（特開平６−181759）を発現する動物細胞、UTPの
前駆物質からUTPを生産する能力を有する微生物、糖とU
TPからUDP−Galを生産する能力を有する微生物の培養液
または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行
うことにより、オロット酸とガラクトースとＮ−アセチ
ルグルコサミンからラクト−Ｎ−ビオースを生成させる
ことができる。
（18）ナイセリア由来のα2,3−シアリルトランスフェ
ラーゼ［J.Biol.Chem.,271,28271（1996）］を発現する
微生物、CTPの前駆物質からCTPを生産する能力を有する
微生物、糖とCTPからCMP−NeuAcを生産する能力を有す
る微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源と
した酵素反応を行うことにより、オロット酸とＮ−アセ
チルマンノサミンとピルビン酸とラクト−Ｎ−ビオース
からシアリルラクト−Ｎ−ビオースを生成させることが
できる。
（19）ヒト由来のα1,3−フコシルトランスフェラーゼ
［J.Biol.Chem.,269,14730（1994）］を発現する動物細
胞、GTPの前駆物質からGTPを生産する能力を有する微生
物、糖とGTPからGDP−Fucを生産する能力を有する微生
物の培養液または該培養液の処理物とを酵素源とした酵
素反応を行うことにより、GMPとマンノースと3'−シア
リルＮ−アセチルラクトサミンからシアリルルイスＸを
生成させることができる。
（20）ヒト由来のα1,3/1,4−フコシルトランスフェラ
ーゼ［Carbohydrate Research,190,1（1989）］、GTPの
前駆物質からGTPを生産する能力を有する微生物、糖とG
TPからGDP−Fucを生産する能力を有する微生物の培養液
または該培養液の処理物とを酵素源とした酵素反応を行
うことにより、GMPとマンノースとシアリルラクト−Ｎ
−ビオースからシアリルルイスａを生成させることがで
きる。
（21）酵母由来のα1,2−マンノシルトランスフェラー
ゼを発現するエシェリヒア・コリ［J.Org.Chem.,58,398
5（1993）］、GTPの前駆物質からGTPを生産する能力を
有する微生物、糖とGTPからGDP−Manを生産する能力を
有する微生物の培養液または該培養液の処理物とを酵素
源とした酵素反応を行うことにより、GMPとマンノース
からManα１−2Manを生成させることができる。
等をあげることができる。
複合糖質の製造法は、上記に記載された例に限定され
るものではなく、本特許に記載された糖ヌクレオチド製
造法と組み合わせることができる糖転移酵素、および該
酵素が許容する基質特異性の範囲において、どのような
糖鎖でも、ヌクレオチドの前駆物質、糖、複合糖質前駆
物質のみを原料として工業的に製造することが可能であ
る。
本発明の製造方法により製造される複合糖質として、
例えば、 （１）病原性微生物やウィルスの感染に関与する複合糖
質類、例えば、病原性微生物やウィルスの受容体として
認識される複合糖質類、 （２）病原性微生物やウィルスが生産する毒素の受容体
として認識される複合糖質類、 （３）生体内で、細胞接着、異物の認識、各種リンフォ
カインの結合等に関与する複合糖質類、 等を、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコ
サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、
マンノース、Ｎ−アセチルマンノサミン、フコース、シ
アル酸等の糖を、単独あるいは複数、化学的に許容され
る結合形式で含有する複合糖質をあげることができ、よ
り具体的には、 （１）ヒトや動物のミルク中に含有される乳幼児の微生
物感染防御に関与する複合糖質類、例えば、ラクト−Ｎ
−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース等の複
合糖質、 （２）Escherichia coli、Propionibacterium granulos
ium、Mycobacterium tuberculosis、Moraxella catarah
lis、Candida albicans、Staphylococcus saprophyticu
s、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalact
iae、Pseudomonas aeruginosa、Actinomyces naeslundi
i、Neisseria gonorrhoeae、Helicobacter pylori、Hae
mophilus influenzae等の微生物を認識する受容体複合
糖質、 （３）インフルエンザウィルス、コロナウィルス、セン
ダイウィルス、ニューカッスル病ウィルス、レオウィル
ス、ロタウィルス、エイズウィルス、等のウィルスの受
容体複合糖質、 （４）クリプトスポリジウム、トリパノゾーマなどの原
虫の受容体複合糖質 （５）コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、ボツリヌス毒
素、クロストリジウムδ毒素、クロストリジウムＡ毒
素、志賀毒素、ベロ毒素、志賀毒素様毒素、腸炎ビブリ
オ耐熱性毒素、破傷風毒素、等の毒素が結合する受容体
複合糖質、 （６）GD3,GM3等のガングリオシドやグロボ系糖脂質等
の、ガン関連複合糖質、 （７）シアリルルイスｘ糖鎖等の、白血球の炎症部位へ
の接着や機能修飾に関与する複合糖質類、 （８）慢性関節リュウマチやIgA腎症等の自己免疫疾患
に関与する複合糖質類、 （９）異物認識やガン細胞の認識に関与する各種のレク
チン様物質が認識する複合糖質類等をあげることができ
る。
水性媒体中に生成した複合糖質の定量は公知の方法に準
じて行うことができる。［Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,8
5,3289（1988）、Anal.Biochem.,174,459（1988）］。
反応液中に生成した複合糖質の採取は、活性炭やイオン
交換樹脂等を用いる通常の方法によって行うことがで
き、例えば、Ｎ−アセチルラクトサミンにおいてはJ.Or
g.Chem.,47,5416（1982）記載の方法に準じて行うこと
ができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態 実施例1. galU、ppaを発現する組換え体プラスミドの
造成 galU、ppaを発現する組換え体プラスミドpNT12の造成
方法について以下に述べる（図１、図２）。
１）PLプロモーターを含む発現ベクターの造成 PLプロモーターを含む発現ベクターであるpPA31およ
びpPAC31は以下に示す方法で造成した（図１）。
トリプトファンプロモーターを含むプラスミドpTrS30
を保有するエシェリヒア・コリJM109/pTrS30（FERM BP
−5407）およびPLプロモーターを含むプラスミドpPA1
（特開昭63−233798）、PLプロモーターおよびcI857リ
プレッサーを含むプラスミドpPAC1（FERM BP−6054）を
保有するエシェリヒア・コリを、それぞれLB培地［バク
トトリプトン（ディフコ社製）10g/l、酵母エキス（デ
ィフコ社製）5g/l、NaCl5g/l、pHを7.2］に植菌し、30
℃で18時間培養した。
該培養により得られた菌体から前述の公知の方法によ
り、pTrS30、pPA1およびpPAC1プラスミドDNAを単離精製
した。
精製したpTrS30 DNA0.2μｇを制限酵素Pst IおよびCl
a Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を
分離し、ジーンクリーンIIキット（Bio101社製）により
3.4kbの断片を回収した。精製したpPA1 DNA0.5μｇを制
限酵素Pst IおよびCla Iで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりDNA断片を分離し、同様に1.0kbの断片を回収
した。
該3.4kbの断片および1.0kbの断片をライゲーションキ
ット（TAKARA ligation Kit、宝酒造社製）を用いて、1
6℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、37℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、PLプロモーターによ
る発現ベクターであるpPA31を得た。該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した（第１図）。
精製したpPA31 DNA0.2μｇを制限酵素Pst IおよびCla
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を
分離し、ジーンクリーンIIキットにより3.4kbの断片を
回収した。精製したpPAC1 DNA0.5μｇを制限酵素Pst I
およびCla Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりD
NA断片を分離し、同様に2.3kbの断片を回収した。
該3.4kbの断片および2.3kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて、16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、37℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、cI857リプレッサー
を含むPLプロモーターによる発現ベクターであるpPAC31
を取得した。該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した（第１図）。
２）galU発現プラスミドの造成 エシェリヒア・コリW3110株の染色体DNAを公知の方法
［例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,Joh
n Wiley and Sons Inc.（1994）］により単離精製し
た。
配列番号１記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号２記載のアンチセンス鎖DNAプライマーをアプライド
・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製380A・
DNA合成機を用いて合成した。
該合成DNAをプライマーとして、W3110株の染色体DNA
を鋳型としてPCRを行った。PCRはW3110染色体DNA0.04μ
ｇ、プライマー各0.5μＭ、TAKARA Ex Taq（宝酒造社
製）1.0unit、10×Ex Taq緩衝液（宝酒造社製）４μ
ｌ、deoxyNTP各200μＭを含む反応液40μｌを用い、94
℃−１分、42℃−２分、72℃−３分の工程を30回繰り返
すことにより行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動にかけ、
目的の断片が増幅されていることを確認後、残りの反応
液と等量のTE〔10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、1mM E
DTA〕飽和フェノール／クロロホルム（1vol/1vol）を添
加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層
に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30
分放置した。該放置液を遠心分離しDNAの沈殿を得た。
該沈殿を70％冷エタノールで洗浄し、真空乾燥して沈殿
を得た。以後、TE飽和フェノール／クロロホルムを添加
し、エタノールで洗浄したDNAの沈殿を得るまでの操作
をエタノール沈殿法と呼ぶ。
該DNAの沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μ
ｌを用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断
し、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した
後、ジーンクリーンIIキットにより0.9kbの断片を回収
した。実施例１−１）で取得したpPA31 DNA0.2μｇを制
限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.2kbの断片を
回収した。
該0.9kbの断片および4.2kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、galU発現プラスミド
であるpNT9を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第２図）。
３）galU,ppa同時発現プラスミドの造成 配列番号３記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号４記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成し、該
合成DNAをプライマーとして、W3110株の染色体DNAを鋳
型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法により、DNAの沈殿を取
得した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μ
ｌを用い、DNAを制限酵素BamH IおよびSal Iで切断し、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離した後、
ジーンクリーンIIキットにより1.0kbの断片を回収し
た。実施例１−２）で取得したpNT9 DNA0.2μｇを制限
酵素BamH IおよびSal Iで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.9kbの断片を回収
した。
該1.0kbの断片および4.9kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、galU,ppa同時発現プ
ラスミドであるpNT12を得た。該プラスミドの構造を制
限酵素消化により確認した（第２図）。
該pNT12 DNA0.5μｇを制限酵素EcoR IおよびSal Iで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離
しジーンクリーンIIキットにより2.2kbの断片を回収し
た。一方、pSTV28 DNA（宝酒造社製）0.2μｇを制限酵
素EcoR IおよびSal Iで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりDNA断片を分離し、同様に3.0kbの断片を回収し
た。
該2.2kbの断片および3.0kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。該連結反
応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従っ
て形質転換し、該形質転換体をクロラムフェニコール10
μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、galU,ppa遺伝子発現プラスミドで
あるpNT32を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（図２）。
実施例2.UDP−Glcの生産 実施例１で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT12株
を、アンピシリン50μg/mlを含むLB培地125mlの入った1
L容バッフル付き三角フラスコに接種し、30℃で220rpm
の条件で17時間培養した。該培養液125mlをグルコース1
0g/l、バクトトリプトン（ディフコ社製）12g/l、酵母
エキス（ディフコ社製）24g/l、KH2PO42.3g/l（別殺
菌）、K2HPO412.5g/l（別殺菌）、アンピシリン50μg/m
lの組成からなる液体培地（pH無調整）2.5Lの入った5L
容培養槽に接種し、30℃で４時間、更に、40℃で３時
間、600rpm、通気量2.5L/分の条件で培養を行った。
該培養中、28％アンモニア水を用いて、培養液のpHを
7.0に維持した。また、培養途中で必要に応じてグルコ
ースを添加した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得
した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株
を、グルコース50g/l、ポリペプトン（日本製薬社製）1
0g/l、酵母エキス（オリエンタル酵母社製）10g/l、尿
素5g/l、（NH4）2SO45g/l、KH2PO41g/l、K2HPO43g/l、M
gSO4・7H2O1g/l、CaCl2・2H2O0.1g/l、FeSO4・7H2O10mg
/l、ZnSO4・7H2O10mg/l、MnSO4・４〜6H2O20mg/l、Ｌ−
システイン20mg/l、Ｄ−パントテン酸カルシウム10mg/
l、ビタミンB1 5mg/l、ニコチン酸5mg/l、およびビオチ
ン30μg/l（10N NaOHでpH7.2に調整）の組成からなる液
体培地20mlの入った300ml容バッフル付き三角フラスコ
に接種し、28℃で220rpmの条件で、24時間培養した。
該培養液20mlを上記と同一組成の液体培地250mlの入
った2L容バッフル付き三角フラスコに接種し、28℃で22
0rpmの条件で、24時間培養した。得られた培養液を種培
養液として用いた。
該種培養液250mlを、グルコース150g/l、肉エキス
（極東製薬社製）5g/l、KH2PO410g/l、K2HPO410g/l、Mg
SO4・7H2O10g/l、CaCl2・2H2O0.1g/l、FeSO4・7H2O20mg
/l、ZnSO4・7H2O10mg/l、MnSO4・４〜6H2O20mg/l（別殺
菌）、β−アラニン15mg/l（別殺菌）、Ｌ−システイン
20mg/l、ビオチン100μg/l、尿素2g/l、およびビタミン
B1 5mg/l（別殺菌）（10N NaOHでpH7.2に調整）の組成
からなる液体培地2.25Lの入った5L容培養槽に接種し、3
2℃で600rpm、通気量2.5L/minの条件で24時間培養を行
った。培養中、28％アンモニア水を用いて、培養液のpH
を6.8に維持した。
該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体
は必要に応じて−20℃で保存することが可能で、使用前
に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリKY8415/pNT12株湿菌体40g/l、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌
体150g/l、グルコース100g/l、KH2PO420g/l、MgSO4・7H
2O5g/l、フィチン酸5g/l、オロット酸（カリウム塩）2
1.2g/l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組
成からなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、該反
応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）
し、32℃で21時間反応を行った。
反応中、4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてグルコース、KH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に43.9g/lのUDP−Glc（2Na
塩）が生成した。
実施例3.galT、galKを発現する組換え体プラスミドの造
成 galT、galKを発現する組換え体プラスミドpNT25の造
成方法について以下に述べる（第３図）。
配列番号５記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号６記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成し、該
合成DNAをプライマーとして、W3110株の染色体DNAを鋳
型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該DNA沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５
μｌを用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびHinc IIで切
断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し
た後、ジーンクリーンIIキットにより2.3kbの断片を回
収した。pBluescript II SK+DNA0.2μｇを制限酵素Hind
IIIおよびEcoR Vで切断し、アガロースゲル電気泳動に
よりDNA断片を分離し、同様に3.0kbの断片を回収した。
該2.3kbの断片および3.0kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、galT、galK遺伝子を
含むプラスミドであるpNT19を得た。該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した（第３図）。
該pNT19 DNA0.5μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離
し、同様に2.3kbの断片を回収した。実施例１−１）で
取得したpPAC31 DNA0.2μｇを制限酵素Cla IおよびBamH
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を
分離し、同様に5.5kbの断片を回収した。
該2.3kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM52株を前
述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体をア
ンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で
一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、galT、galK同時発現
プラスミドであるpNT25を得た。該プラスミドの構造を
制限酵素消化により確認した（第３図）。
実施例4.UDP−Galの生産 １）galT、galK、galU、ppa発現株の造成 実施例１−３）で得たpNT32 DNAを用いてエシェリヒ
ア・コリNM522/pNT25株を常法に従って形質転換し、該
形質転換体をアンピシリン50μg/mlおよびクロラムフェ
ニコール10μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一
晩培養した。生育してきた形質転換体を選択することに
より、galT、galK、galU、ppa発現株であるエシェリヒ
ア・コリNM522/pNT25/pNT32株を得た。
２）UDP−Galの生産 実施例４−１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT2
5/pNT32株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた
各々の培養物を遠心分離し、湿菌体を取得した。また、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−
20℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用いる
ことができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体50g/
l、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株
湿菌体150g/l、グルコース80g/l、ガラクトース20g/l、
KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/l、オロ
ット酸（カリウム塩）21.2g/l、ナイミーンＳ−215 4g/
l、キシレン10ml/lの組成からなる反応液2Lを5L容培養
槽に入れ、該反応液を600rpmにて攪拌し、1L/minにて通
気し、32℃で26時間反応を行った。
反応中、4N NaOHを用いて、該反応液のpH7.2に維持
し、必要に応じて、グルコース、ガラクトース、KH2PO4
を添加した。
該反応により、反応液中に47.4g/lのUDP−Gal（2Na
塩）が生成した。
実施例5.galT、galKをコリネバクテリウム・アンモニア
ゲネスで発現する組換え体プラスミドの造成 エシェリヒア・コリ由来のgalT、galKをコリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスで発現する組換え体プラスミ
ドpTK7の造成方法について以下に述べる（第４図）。
１）pCG116の造成 コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで複製できる
プラスミドpCG116の造成を以下のように行った。
プラスミドpCG11（特公平６−91827）DNA0.5μｇを制
限酵素Pst IおよびStu Iで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりDNA断片を分離し、ジーンクリーンIIキット
により6.5kbの断片を回収した。
一方、プラスミドpUC19 DNA1.0μｇを制限酵素EcoR I
で切断後、DNA Blunting Kit（宝酒造社製）により平滑
末端化した。平滑末端化した該DNAをPst Iで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、MERmaid
Kit（Bio101社製）により43bpの断片を回収した。
該6.5kbの断片および43bpの断片をライゲーションキ
ットを用いて、16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスATCC21170株をエレクトロポーレーション法［F
EMS Microbiol.Lett.,65,299（1989）］で形質転換し、
該形質転換体をスペクチノマイシン100μg/mlを含むLB
寒天培地に塗布後、30℃で２日間培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法
［J.Bacteriol.,159 306（1984）］に従ってプラスミド
を抽出し、プラスミドpCG116を得た。該プラスミドの構
造を制限酵素消化により確認した（第４図）。
２）galT、galKを発現するプラスミドpTK7の造成 実施例３で造成したgalT、galKを発現するプラスミド
pNT25 DNA1.0μｇを制限酵素Xho IおよびBamH Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
ジーンクリーンIIキットにより3.5kbの断片を回収し
た。
一方、実施例５−１）で造成したプラスミドpCG116 D
NA0.5μｇを制限酵素Sal IおよびBamH Iで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に6.5
kbの断片を回収した。
該3.5kbの断片および6.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてコリネバクテリウム・アンモニ
アゲネスATCC21170株をエレクトロポーレーション法で
形質転換し、該形質転換体をスペクチノマイシン100μg
/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で２日間培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に
従ってプラスミドを抽出し、galT、galK同時発現プラス
ミドであるpTK7を得た。該プラスミドの構造を制限酵素
消化により確認した（第４図）。
実施例6.UDP−Galの生産 実施例５で得たコリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スATCC21170/pTK7株を実施例２と同様の方法で32℃で20
時間培養した後、40℃で４時間培養し、得られた培養物
を遠心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応
じて−20℃で保存することが可能で、使用前に解凍して
用いることができる。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170/pT
K7株湿菌体150g/l、フルクトース40g/l、ガラクトース2
0g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/
l、オロット酸（カリウム塩）10.6g/l、ナイミーンＳ−
215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる反応液30mlを
200ml容ビーカーに入れ、該反応液をマグネティック・
スターラーにて攪拌（900rpm）し、32℃で22時間反応を
行った。
反応中、4N NaOHを用いて、該反応液のpH7.2に維持
し、必要に応じて、フルクトース、ガラクトース、KH2P
O4を添加した。
該反応により、反応液中に7.2g/lのUDP−Gal（2Na
塩）が生成した。
実施例7.glmU、ppa、pgm、glmM、glk、pfkB発現プラス
ミドの造成 １）glmU、ppa発現プラスミドの造成 配列番号７記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号８記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。
該合成DNAをプライマーとして、W3110株の染色体DNAを
鋳型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該DNA沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５
μｌを用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切
断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離
し、ジーンクリーンIIキットにより1.4kbの断片を回収
した。実施例１−１）で取得したpPA31 DNA0.5μｇを制
限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル
電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.2kbの断片を
回収した。
該1.4kbの断片および4.2kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、glmU発現プラスミド
であるpNT10を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消
化により確認した（第５図）。
実施例１−３）で取得したpNT12 DNA0.5μｇを制限酵
素BamH IおよびSal Iで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりDNA断片を分離し同様に1.0kbの断片を回収し
た。上記pNT10 DNA0.2μｇを制限酵素BamH IおよびSal
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分
離し、同様に5.3kbの断片を回収した。
該1.0kbの断片および5.3kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリKY8415株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、glmU、ppa同時発現
プラスミドであるpNT14を得た。該プラスミドの構造を
制限酵素消化により確認した（第５図）。
２）pgm発現プラスミドの造成 配列番号９記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号10記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。
該合成DNAをプライマーとして、W3110株の染色体DNAを
鋳型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法により、DNAの沈殿を取
得した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μ
ｌを用い、DNAを制限酵素Cla IおよびBamH Iで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、ジー
ンクリーンIIキットにより1.8kbの断片を回収した。実
施例１−１）で取得したpPAC31 DNA0.2μｇを制限酵素C
la IおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりDNA断片を分離し、同様に5.5kbの断片を回収した。
該1.8kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間、連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
前述の公知の方法に従って形質転換し、該形質転換体を
アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃
で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより前述の公知の
方法に従ってプラスミドを抽出し、pgm発現プラスミド
であるpNT24を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消
化により確認した（第６図）。
３）glmM発現プラスミドの造成 配列番号11記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号1
2記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株の
染色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でPCRを行っ
た。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Cla IおよびBamH Iで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、ジーン
クリーンIIキットにより1.6kbの断片を回収した。実施
例１−１）で取得したpPAC31 DNA0.2μｇを制限酵素Cla
IおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りDNA断片を分離し、同様に5.5kbの断片を回収した。
該1.6kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/lを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、glmM発現プラスミドであるpNT44
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（第７図）。
４）glk発現プラスミドの造成 配列番号13記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号1
4記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株の
染色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でPCRを行っ
た。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
し、該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌを
用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、ジー
ンクリーンIIキットにより0.5kbの断片を回収した。
実施例１−１）で取得したpPA31 DNA0.2μｇを制限酵
素Hind IIIおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.2kbの断片を回収
した。
該0.5kbの断片および4.2kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。該連結反
応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従っ
て形質転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/lを
含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、glkの一部を有するプラスミドで
あるpNT45を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第８図）。
上述と同一の条件でPCRを行い、得られたDNA溶解液５
μｌを用い、DNAを制限酵素Hind IIIで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に0.5kb
の断片を回収した。上に記した方法で取得したpNT45 DN
A0.2μｇを制限酵素Hind IIIで切断後アルカリホスファ
ターゼにより脱リン酸化処理を行い、アガロースゲル電
気泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.7kbの断片を回
収した。
該0.5kbの断片および4.7kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/lを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、glkを発現するプラスミドであるp
NT46を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により
確認した（第８図）。
５）pfkB発現プラスミドの造成 配列番号15記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号1
6記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、W3110株の染色体DNAを鋳型と
して前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびEcoR Vで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
ジーンクリーンIIキットにより1.3kbの断片を回収し
た。pBluescript II SK+DNA0.2μｇを制限酵素Hind III
およびEcoR Vで切断後、アガロースゲル電気泳動により
DNA断片を分離し、同様に3.0kbの断片を回収した。
該1.3kbの断片および3.0kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、pfkB遺伝子を保有するプラスミド
pNT43を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化によ
り確認した（第９図）。
pNT43 DNA0.5μｇを用い、DNAを制限酵素Cla Iおよび
Sac Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片
を分離し、同様に1.3kbの断片を回収した。
実施例１−１）で取得したpPAC31 DNA0.2μｇを制限
酵素Cla IおよびSac Iで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりDNA断片を分離し同様に5.7kbの断片を回収し
た。
該1.3kbの断片および5.7kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/lを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、pfkB発現プラスミドであるpNT47
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（第９図）。
実施例8.UDP−GlcNAcの生産 実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、
NM522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株を実施
例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠
心分離し、湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて
−20℃で保存することが可能で、使用前に解凍して用い
ることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT24株湿菌体6g/l、NM522
/pNT47株湿菌体6g/l、100mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）、6mM MgCl2・6H2O、10mMグルコース−６−リン酸、
2.5mMフルクトース６−リン酸、2.5mM ATP、ナイミーン
Ｓ−215 4g/lの組成からなる反応液0.1mlを1.5ml容チュ
ーブに入れ、37℃で１時間反応を行った。反応液を65℃
で５分間処理後、エシェリヒア・コリKY8415/pNT14株湿
菌体0.3g/l、NM522/pNT44株湿菌体6g/l、5mMグルコサミ
ン−６−リン酸、5mMアセチルCoA、5mM UTPとなるよう
に菌体および基質を添加し、さらに37℃で30分間反応さ
せたところ、反応液中に2.5mM（1.6g/l）のUDP−GlcNAc
（2Na塩）が生成した。この際、エシェリヒア・コリNM5
22/pNT24株湿菌体あるいはNM522/pNT47株湿菌体を添加
しなかった場合のUDP−GlcNAc生成量はそれぞれ0.08m
M、0.16mMであった。
このことは、pgm発現株とpfkB発現株の組み合わせに
より、glmMの活性発現に必要なGlc−1,6−P2が供給でき
ることを示している。
実施例9.UDP−GlcNAcの生産 実施例７で得たエシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、
NM522/pNT24株、NM522/pNT44株、NM522/pNT46株、NM522
/pNT47株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各
々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施
例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離
し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で
保存することが可能で、使用前に解凍して用いることが
できる。
エシェリヒア・コリKY8415/pNT14株、NM522/pNT24
株、NM522/pNT44株、NM522/pNT47株、NM522/pNT46株湿
菌体を各10g/l、コリネバクテリウム・アンモニアゲネ
スATCC21170株湿菌体150g/l、フルクトース50g/l、グル
コサミン塩酸塩80g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/
l、フィチン酸5g/l、オロット酸（カリウム塩）10g/l、
ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10mg/lの組成からな
る反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応液を
マグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）し、32
℃で10時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてフルクトース、KH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に6.2g/lのUDP−GlcNAc（2Na
塩）が生成した。
実施例10.galK発現プラスミドの造成 実施例３−１）で取得したpNT25 DNA0.5μｇを制限酵
素Cla IおよびEcoR Vで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりDNA断片を分離し、ジーンクリーンIIキットに
より6.7kbの断片を回収した。回収したDNAをDNA Blunti
ng Kitにより平滑末端化した後、ライゲーションキット
を用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、galK発現プラスミドであるpNT54
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（第10図）。
実施例11.UDP−GlcNAcの生産 実施例10で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT54株を
実施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心
分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方法
で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得し
た。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが可
能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT54株湿菌体50g/l、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体1
50g/l、フルクトース40g/l、Ｎ−アセチルグルコサミン
67g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/
l、オロット酸（カリウム塩）10g/l、ナイミーンＳ−21
5 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる反応液30mlを20
0ml容ビーカーに入れ、この反応液をマグネティック・
スターラーにて攪拌（900rpm）し、32℃で27時間反応を
行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてフルクトース、KH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に17.1g/lのUDP−GlcNAc（2N
a塩）が生成した。
実施例12.UDP−GlcNAcとUDP−Galの同時生産 実施例３で得たNM522/pNT25株を実施例２と同様の方
法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得
した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスAT
CC21170株を実施例２と同様の方法で培養し、得られた
培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要
に応じて−20℃で保存することが可能で、使用前に解凍
して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体25g/l、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体1
50g/l、フルクトース60g/l、Ｎ−アセチルグルコサミン
50g/l、ガラクトース40g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O
5g/l、フィチン酸5g/l、オロット酸（カリウム塩）10g/
l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成か
らなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応
液をマグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）
し、32℃で24時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に11.4g/lのUDP−GlcNAc（2N
a塩）および18g/lのUDP−Gal（2Na塩）が生成した。
実施例13.manB、manC、pgm、pfkB発現プラスミドの造成 １）manB、manC発現プラスミドの造成 配列番号17記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号1
8記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株染
色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
ジーンクリーンIIキットにより3.0kbの断片を回収し
た。pBluescript II SK+DNA0.2μｇを制限酵素Hind III
およびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳動により
DNA断片を分離し、同様に3.0kbの断片を回収した。
該3.0kbの両断片をライゲーションキットを用いて16
℃で16時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエ
シェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、
該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地
に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、manCおよびmanBを含むプラスミド
であるpNK6を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第11図）。
該pNK6 DNA0.5μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで切
断後アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し3.0
kbの断片を回収した実施例１−１）で取得したpPAC31 D
NA0.2μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで切断後、アガ
ロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し同様に5.5kb
の断片を回収した。
該3.0kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。該連結反
応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従っ
て形質転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを
含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、manCおよびmanB発現プラスミドで
あるpNK7を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化に
より確認した（第11図）。
２）pgm、pfkB同時発現プラスミドの造成 実施例７で取得したpNT24 DNA0.5μｇを制限酵素Xho
IおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によ
りDNA断片を分離しジーンクリーンIIキットにより3.0kb
の断片を回収した。一方、pSTV28 DNA（宝酒造社製）0.
2μｇを制限酵素Sal IおよびBamH Iで切断後、アガロー
スゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様に3.0kbの
断片を回収した。
該3.0kbの両断片をライゲーションキットを用いて16
℃で16時間連結反応を行った。該連結反応液を用いてエ
シェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質転換し、
該形質転換体をクロラムフェニコール10μg/mlを含むLB
寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、pgm遺伝子を有するプラスミドで
あるpNT53を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第12図）。
配列番号19記載のセンス鎖DNAプライマーを合成し、
該センス鎖DNAプライマーおよび配列番号16記載のアン
チセンス鎖DNAプライマーを用い、実施例７で取得した
プラスミドpNT47 DNAを鋳型として前述と同一の条件でP
CRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素EcoR VおよびBgl IIで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、同様
に1.3kbの断片を回収した。pNT53 DNA0.2μｇを制限酵
素Sma IおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳
動によりDNA断片を分離し、同様に6.0kbの断片を回収し
た。
該1.3kbの断片および6.0kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をクロラムフェ
ニコール10μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一
晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、pgmおよびpfkB発現プラスミドで
あるpNT55を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第12図）。
実施例14.GDP−Manの生産 １）manB、manC、pgm、pfkB発現株の造成 実施例13−２）で得たpNT55 DNAを用いてエシェリヒ
ア・コリNM522/pNK7株を常法に従って形質転換し、該形
質転換体をアンピシリン50μg/mlおよびクロラムフェニ
コール10μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩
培養した。生育してきた形質転換体を選択することによ
り、manB、manC、pgm、pfkB発現株であるエシェリヒア
・コリNM522/pNK7/pNT55株を得た。
２）GDP−Manの生産 上記１）で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55
株および実施例７で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT4
6を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培
養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と
同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌
体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存す
ることが可能で、使用前に解凍して用いることができ
る。
エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿菌体25g/
l、NM522/pNT46株湿菌体25g/l、コリネバクテリウム・
アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/l、フルクト
ース60g/l、マンノース50g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H
2O5g/l、フィチン酸5g/l、GMP（2Na,7H2O塩）60g/l、ナ
イミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる
反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応液をマ
グネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）し、24時
間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に14.6g/lのGDP−Man（2Na,1
H2O塩）が生成した。
実施例15.gmd、wcaG発現プラスミドの造成 配列番号20記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号2
1記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、エシェリヒア・コリW3110株染
色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびXho Iで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離しジーン
クリーンIIキットにより2.3kbの断片を回収した。
実施例１−１）で取得したpPA31 DNA0.2μｇを制限酵
素Hind IIIおよびSal Iで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりDNA断片を分離し、同様に3.9kbの断片を回収
した。
該2.3kbおよび3.9kbの断片をライゲーションキットを
用いて、16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、gmdおよびwcaGを含むプラスミド
であるpNK8を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化
により確認した（第13図）。
実施例16.GDP−Fucの生産 実施例14で得たエシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55
株、実施例15で得たNM522/pNK8株および実施例７で得た
NM522/pNT46を実施例２と同様の方法で培養し得られた
各々の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コ
リネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分
離し湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃
で保存することが可能で、使用前に解凍して用いること
ができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNK7/pNT55株湿菌体25g/
l、エシェリヒア・コリNM522/pNK8株湿菌体25g/l、エシ
ェリヒア・コリNM522/pNT46株湿菌体25g/l、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/
l、フルクトース40g/l、マンノース60g/l、KH2PO415g/
l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/l、GMP（2Na/7H2O
塩）60g/l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/l
の組成からなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、
この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（90
0rpm）し、32℃で24時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に1.0g/lのGDP−Fuc（2.5Na,
1H2O塩）が生成した。
実施例17.neuA発現プラスミドの造成 エシェリヒア・コリK235株（ATCC13027）染色体DNAを
実施例１と同様の方法で調製した。
配列番号22記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号2
3記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、エシェリヒア・コリK235株（A
TCC13027）染色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でP
CRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素EcoR IおよびBamH Iで切断後、
アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、ジー
ンクリーンIIキットにより1.3kbの断片を回収した。pBl
uescript II SK+DNA0.2μｇを制限酵素EcoR IおよびBam
H Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を
分離し、同様に3.0kbの断片を回収した。
該1.3kbおよび3.0kbの断片をライゲーションキットを
用いて16℃で16時間連結反応を行った。該連結反応液を
用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質
転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB
寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、neuA遺伝子を含むプラスミドであ
るpTA12を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化に
より確認した（第14図）。
該pTA12 DNA0.5μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離
し、同様に1.3kbの断片を回収した。実施例１−１）で
取得したpPAC31 DNA0.2μｇを制限酵素Cla IおよびBamH
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を
分離し、同様に5.5kbの断片を回収した。
該1.3kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。
該連結反応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を
常法に従って形質転換し、該形質転換体をアンピシリン
50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養し
た。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、neuA発現プラスミドであるpTA14
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（第14図）。
実施例18.CMP−NeuAcの生産 実施例17で得たエシェリヒア・コリNM522/pTA14株、C
600/pNAL1株［Appl.Environ.Micribiol.,51 562（198
6）］およびJF646/pMW5株［J.Biol.Chem.,261,5568（19
86）］を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々
の培養物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネ
バクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例
２と同様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し
湿菌体を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保
存することが可能で、使用前に解凍して用いることがで
きる。
エシェリヒア・コリNM522/pTA14株湿菌体50g/l、エシ
ェリヒア・コリC600/pNAL1株湿菌体15g/l、エシェリヒ
ア・コリJF646/pMW5株湿菌体25g/l、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/l、オロ
ット酸（カリウム塩）10g/l、ピルビン酸（Na塩）20g/
l、フルクトース40g/l、Ｎ−アセチルマンノサミン10g/
l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/l、
ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からな
る反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応液を
マグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）し、32
℃で24時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に2.7g/lのCMP−NeuAc（Na
塩）が生成した。
実施例19.ラクト−Ｎ−テトラオースの生産 １）β1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼの調製 プロテインＡのIgG結合領域とβ1,3−ガラクトシルト
ランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしている遺伝
子を含むプラスミドpAMoERSAW1（特開平６−181759）で
形質転換したナマルバKJM−１株をG418（ギブコ社製）
を0.5mg/ml含むRPMI640・ITPSGF培地30mlに5x104cells/
mlになるように懸濁し、CO2インキュベーター中で37℃
で８日間培養した。
該培養液から遠心分離により細胞を除き上清を回収し
た。該上清は、必要に応じて−80℃で保存可能であり、
使用前に解凍して使用することができる。
該プロテインＡのIgG結合領域とβ1,3−ガラクトシル
トランスフェラーゼとの融合蛋白質が生成された培養上
清にアジ化ナトリウムを最終濃度0.1％になるように添
加した後、製品説明書に従って前処理したIgGセファロ
ース（ファルマシア社製）を50μｌ添加し、４℃で一晩
緩やかに攪拌した。
攪拌後、遠心分離によりβ1,3−ガラクトシルトラン
スフェラーゼの結合したIgGセファロースを回収し、RPM
I640・ITPSGF培地1mlで３回洗浄後、該IgGセファロース
をβ1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素源と
して用いた。
２）ラクト−Ｎ−テトラオースの生産 ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・
グライコシステムズ社製）を公知の方法により［Agric.
Biol.Chem.,54,2169（1990）］に従って２−アミノピリ
ジンにより蛍光標識した後、0.1Uのβ−ガラクトシダー
ゼ（生化学工業社製）を加えて37℃で16時間反応させ、
非還元末端のガラクトースを除去した。
該反応液を、５分間、100℃で加熱し、β−ガラクト
シダーゼを失活させた。
該反応により得られたGlcNAcβ１−3Galβ１−4Glcを
複合糖質前駆体として用いた。
該複合糖質前駆物質0.5mM、上記１）で取得したIgGセ
ファロース結合β1,3−ガラクトシルトランスフェラー
ゼ0.5U、実施例４で取得したUDP−Galを含む反応液６μ
ｌ（5mM）、100mMトリス塩酸緩衝液（pH7.9）10mM MnCl
2、2mM β−メルカプトエタノールの組成からなる反応
液36μｌを、32℃で65時間放置し、反応を行った。
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物を下記条件
でHPLCを用いて定量した。
カラム:TSKgel ODS−80TMカラム（4.6mm x 30cm、TOSOH社製） 液相 :0.02M酢酸アンモニウム緩衝液（pH4.0） 温度 :50℃ 流速 :1ml/min 検出 :蛍光検出器（励起波長320nm、放射波長400nm） 生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−Ｎ
−テトラオースと標識された生成物の溶出時間を比較す
ることにより行った。
該反応により0.17mM（0.12g/l）のラクト−Ｎ−テトラ
オースが生成した。
実施例20.ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生産 実施例19と同様な方法で、ラクト−Ｎ−ネオテトラオ
ースからGlcNAcβ１−3Galβ１−4Glcを調製し、複合糖
質前駆体として用いた。
該複合糖質前駆体0.5mM、β1,4−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ（シグマ社製）0.5U、実施例４で取得した
UDP−Galを含む反応液６μｌ（5mM）、100mMトリス塩酸
緩衝液（pH7.9）、10mM MnCl2、2mM β−メルカプトエ
タノールの組成からなる反応液36μｌを、32℃で65時間
放置し、反応を行った。
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物を、実施例
19−２）と同様の条件で、HPLCを用いて定量した。な
お、生成物の同定はアミノピリジンで標識したラクト−
Ｎ−ネオテトラオースと生成物の溶出時間を比較するこ
とにより行った。
該反応により、0.15mM（0.11g/l）のラクト−Ｎ−ネ
オテトラオースが生成した。
実施例21.ラクト−Ｎ−フコペンタオースIIIの生産 α1,3−フコシルトランスフェラーゼの結合したIgGセ
ファロースはプロテインＡのIgG結合領域とα1,3−フコ
シルトランスフェラーゼとの融合蛋白質をコードしてい
る遺伝子を含むプラスミドpAMoA−FT6［J.Biol.Chem.,2
69,14730（1994）］で形質転換したナマルバKJM−１株
から実施例19−１）と同様な方法で調製し、α1,3−フ
コシルトランスフェラーゼの酵素源として用いた。
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（オックスフォード・
グライコシステムズ社製）0.25mM、IgGセファロース結
合α1,3−フコシルトランスフェラーゼ1.0U、実施例16
で取得したGDP−Fucを含む反応液６μｌ（0.25mM）、10
0mMトリス塩酸緩衝液（pH7.9）、10mM MnCl2の組成から
なる反応液50μｌを、37℃で24時間放置し、反応を行っ
た。
反応終了後、該反応液に蓄積された生成物をダイオネ
ックス社製の糖分析装置（DX−500）にて定量した。な
お、生成物の同定はラクト−Ｎ−フコペンタオースIII
（オックスフォード・グライコシステムズ社製）と生成
物の溶出時間を比較することにより行った。
該反応により、0.21mM（0.18g/l）のラクト−Ｎ−フ
コペンタオースIIIが生成した。
実施例22.α1,−４ガラクトシルトランスフェラーゼ（l
gtC）発現プラスミドの造成 Neisseria gonorrhoeae（ATCC33084株）染色体DNAを
実施例１と同一の方法で調製した。
配列番号24記載のセンス鎖DNAプライマーと、配列番
号25記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。
該合成DNAをプライマーとし、Neisseria gonorrhoeae
（ATCC33084株）染色体DNAを鋳型として前述と同一の条
件でPCRを行った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
ジーンクリーンIIキットにより1.0kbの断片を回収し
た。実施例１−１）で取得したpPA31 DNA0.2μｇを制限
酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりDNA断片を分離し、同様に4.2kbの断片を回
収した。
該1.0kbの断片および4.2kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃で16時間連結反応を行った。該連結反
応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従っ
て形質転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを
含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、lgtC発現プラスミドであるpGT3を
得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認し
た（第15図）。
実施例23.グロボトリオースの生産 実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT3
2株、実施例22で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体50g/
l、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体50g/l、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体1
50g/l、フルクトース100g/l、ガラクトース100g/l、ラ
クトース100g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィ
チン酸5g/l、オロット酸（カリウム塩）10g/l、ナイミ
ーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成からなる反応
液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応液をマグネ
ティック・スターラーにて攪拌（900rpm）し、32℃で36
時間反応を行った。
反応中は4N NaOHを用いて該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてガラクトース、ラクトース、フルクト
ース、KH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に188g/lのグロボトリオース
が生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、得られた
上清10mlから、活性炭を用いる方法により精製を行い、
グロボトリオースの白色粉末1.5gを得た。
実施例24.Galα１−4Galβ１−4GlcNAcの生産 実施例４で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT3
2株、実施例22で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3株
を実施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養
物を遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同
様の方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体
を取得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存する
ことが可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25/pNT32株湿菌体50g/
l、エシェリヒア・コリNM522/pGT3株湿菌体50g/l、コリ
ネバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体1
50g/l、フルクトース50g/l、ガラクトース50g/l、Ｎ−
アセチルラクトサミン96g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2
O5g/l、フィチン酸5g/l、オロット酸（カリウム塩）10g
/l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成か
らなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応
液をマグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）
し、32℃で23時間反応を行った。
反応中は4N NaOHを用いて該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、KH2PO4
を添加した。
該反応により、反応液中に10g/lのGalα１−4Galβ１
−4GlcNAcが生成した。
該反応液から遠心分離により菌体を除去し、得られた
上清30mlから、活性炭を用いる方法により生成物を精製
し、Galα１−4Galβ１−4GlcNAcの白色粉末0.2gを得
た。
実施例25.β1,4−ガラクトシルトランスフェラーゼ（lg
tB）発現プラスミドの造成 配列番号26記載のセンス鎖DNAプライマーと配列番号2
7記載のアンチセンス鎖DNAプライマーを合成した。該合
成DNAをプライマーとし、N.gonorrhoeae（ATCC33084
株）染色体DNAを鋳型として前述と同一の条件でPCRを行
った。
PCR終了後、エタノール沈殿法によりDNAの沈殿を取得
した。該沈殿を20μｌのTEに溶解した。該溶解液５μｌ
を用い、DNAを制限酵素Hind IIIおよびBamH Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
ジーンクリーンIIキットにより0.8kbの断片を回収し
た。pBluescript II SK+DNA0.2μｇを制限酵素Hind III
およびBamH Iで切断後、アガロースゲル電気泳動により
DNA断片を分離し、同様に3.0kbの断片を回収した。
該0.8kbおよび3.0kbの断片をライゲーションキットを
用いて16℃、16時間連結反応を行った。該連結反応液を
用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従って形質
転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを含むLB
寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、lgtB遺伝子を含むプラスミドであ
るpNT60Pを得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化に
より確認した（第16図）。
該pNT60P DNA0.5μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離
し0.8kbの断片を回収した。実施例１−１）で取得したp
PAC31 DNA0.2μｇを制限酵素Cla IおよびBamH Iで切断
後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片を分離し、
同様に5.5kbの断片を回収した。
該0.8kbの断片および5.5kbの断片をライゲーションキ
ットを用いて16℃、16時間連結反応を行った。該連結反
応液を用いてエシェリヒア・コリNM522株を常法に従っ
て形質転換し、該形質転換体をアンピシリン50μg/mlを
含むLB寒天培地に塗布後、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより常法に従って
プラスミドを抽出し、lgtB発現プラスミドであるpNT60
を得た。該プラスミドの構造を制限酵素消化により確認
した（第16図）。
実施例26.N−アセチルラクトサミンの生産 実施例25で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存すること
が可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体50g/l、エシ
ェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体50g/l、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/
l、オロット酸（カリウム塩）10g/l、フルクトース100g
/l、Ｎ−アセチルグルコサミン100g/l、ガラクトース10
0g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィチン酸5g/
l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/lの組成か
らなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、この反応
液をマグネティック・スターラーにて攪拌（900rpm）
し、32℃で34時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてガラクトース、フルクトース、KH2PO4
を添加した。
該反応により、反応液中に114g/lのＮ−アセチルラク
トサミンが生成した。
実施例27.ラクトースの生産 実施例25で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株を実
施例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を
遠心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の
方法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取
得した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存すること
が可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体50g/l、エシ
ェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体50g/l、コリネバク
テリウム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/
l、オロット酸（カリウム塩）10g/l、グルコース115g/
l、ガラクトース115g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/
l、フィチン酸5g/l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレ
ン10ml/lの組成からなる反応液30mlを200ml容ビーカー
に入れ、この反応液をマグネティック・スターラーにて
攪拌（900rpm）し、32℃で15時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に49g/lのラクトースが生成
した。
実施例28.グロボトリオースの生産 実施例25で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT60株、
実施例３で得たエシェリヒア・コリNM522/pNT25株およ
び実施例22で得たエシェリヒア・コリNM522/pGT3を実施
例２と同様の方法で培養し、得られた各々の培養物を遠
心分離し湿菌体を取得した。また、コリネバクテリウム
・アンモニアゲネスATCC21170株を実施例２と同様の方
法で培養し、得られた培養物を遠心分離し湿菌体を取得
した。該湿菌体は必要に応じて−20℃で保存することが
可能で、使用前に解凍して用いることができる。
エシェリヒア・コリNM522/pNT25株湿菌体50g/l、エシ
ェリヒア・コリNM522/pNT60株湿菌体50g/l、エシェリヒ
ア・コリNM522/pGT3株湿菌体50g/l、コリネバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21170株湿菌体150g/l、オロ
ット酸（カリウム塩）10g/l、グルコース115g/l、ガラ
クトース115g/l、KH2PO415g/l、MgSO4・7H2O5g/l、フィ
チン酸5g/l、ナイミーンＳ−215 4g/l、キシレン10ml/l
の組成からなる反応液30mlを200ml容ビーカーに入れ、
この反応液をマグネティック・スターラーにて攪拌（90
0rpm）し、32℃で13時間反応を行った。
反応中4N NaOHを用いて、該反応液のpHを7.2に維持
し、必要に応じてKH2PO4を添加した。
該反応により、反応液中に5g/lのグロボトリオースが
生成した。
産業上の利用可能性 本発明により、ヌクレオチドの前駆物質および糖のみ
を原料にして糖ヌクレオチドを、該糖ヌクレオチドおよ
び複合糖質前駆物質から複合糖質を工業的に効率よく製
造できる。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:31 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:2 配列の長さ:30 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:3 配列の長さ:28 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:4 配列の長さ:20 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:31 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:20 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:7 配列の長さ:31 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:27 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:28 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:10 配列の長さ:27 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:11 配列の長さ:20 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:12 配列の長さ:26 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:13 配列の長さ:29 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:14 配列の長さ:29 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:15 配列の長さ:25 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:16 配列の長さ:31 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:17 配列の長さ:31 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:18 配列の長さ:25 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:19 配列の長さ:33 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:20 配列の長さ:27 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:21 配列の長さ:25 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:22 配列の長さ:27 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:23 配列の長さ:25 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:24 配列の長さ:30 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:25 配列の長さ:28 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:26 配列の長さ:30 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列 配列番号:27 配列の長さ:29 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸、合成DNA 配列
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 1:15） (56)参考文献 特開 平７−233187（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−134096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−18993（ＪＰ，Ａ) 特公 昭47−1837（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭46−40756（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭47−46351（ＪＰ，Ｂ１) 特表 平１−500560（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/26 C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）ヌクレオチドの前駆物質からヌクレオ
    シド−5'−三リン酸（以下、NTPと略す）を生産する能
    力を有するエシェリヒア属およびコリネバクテリウム属
    に属する微生物から選ばれる微生物の培養液または該培
    養液の濃縮物、該培養上清の濃縮物、培養液を遠心分離
    して得られる細胞、該細胞の界面活性剤処理物、該細胞
    の溶媒処理物、該細胞の酵素処理物、および該細胞の固
    定化物からなる群より選ばれる該培養液の処理物、およ
    びｂ）グルコース、フルクトース、ガラクトース、グル
    コサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガ
    ラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルマ
    ンノサミンおよびアセチルノイラミン酸からなる群より
    選ばれる糖とNTPから糖ヌクレオチドを生産する能力を
    有するエシェリヒア属およびコリネバクテリウム属に属
    する微生物から選ばれる１種類ないしそれ以上の微生物
    の培養液または該培養液の濃縮物、該培養上清の濃縮
    物、培養液を遠心分離して得られる細胞、該細胞の界面
    活性剤処理物、該細胞の溶媒処理物、該細胞の酵素処理
    物、および該細胞の固定化物からなる群より選ばれる該
    培養液の処理物を酵素源として用い、これら酵素源、ヌ
    クレオチドの前駆物質およびグルコース、フルクトー
    ス、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコ
    サミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フ
    コース、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびアセチルノイ
    ラミン酸からなる群より選ばれる糖を水性媒体中に存在
    せしめ、該水性媒体中に糖ヌクレオチドを生成蓄積さ
    せ、該水性媒体中から糖ヌクレオチドを採取することを
    特徴とする糖ヌクレオチドの製造法。
  2. 【請求項２】ヌクレオチドの前駆物質が、オロット酸、
    ウラシル、オロチジン、ウリジン、シトシン、シチジ
    ン、アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、ヒ
    ポキサンチン、イノシン、キサンチン、キサントシン、
    イノシン−5'−一リン酸、キサントシン−5'−一リン
    酸、グアノシン−5'−一リン酸、ウリジン−5'−一リン
    酸またはシチジン−5'−一リン酸である請求項１記載の
    製造法。
  3. 【請求項３】糖ヌクレオチドが、ウリジン二リン酸化合
    物、グアノシン二リン酸化合物またはシチジン一リン酸
    化合物である、請求項１記載の製造法
  4. 【請求項４】ウリジン二リン酸化合物、グアノシン二リ
    ン酸化合物およびシチジン一リン酸化合物が、ウリジン
    二リン酸グルコース、ウリジン二リン酸ガラクトース、
    ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジ
    ン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジン二
    リン酸グルクロン酸、グアノシン二リン酸マンノース、
    グアノシン二リン酸フコース、シチジン一リン酸−Ｎ−
    アセチルノイラミン酸およびこれらの誘導体から選ばれ
    る化合物である、請求項３記載の製造法。
  5. 【請求項５】エシェリヒア属に属する微生物がエシェリ
    ヒア・コリである、請求項１記載の製造法。
  6. 【請求項６】コリネバクテリウム属に属する微生物が、
    コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項
    １記載の製造法。
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