JP3397737B2

JP3397737B2 - Nucleic acid extraction method

Info

Publication number: JP3397737B2
Application number: JP2000014391A
Authority: JP
Inventors: 聖子河村; 恒司北廣; 邦裕大島; 良平山本
Original assignee: Kurashiki Spinning Co Ltd
Current assignee: Kurashiki Spinning Co Ltd
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2003-04-21
Anticipated expiration: 2020-01-24
Also published as: JP2001204462A

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は核酸分析のため、出
発物質から核酸を抽出する方法を提供する。FIELD OF THE INVENTION The present invention provides a method for extracting nucleic acids from starting materials for nucleic acid analysis.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、核酸分析は医学分野において遺伝
疾患の検出や診断、病原因子の解析等に、また食品汚染
の検査産業における不純物や遺伝子操作産物の判別など
に、さらには遺伝子工学において、操作すべき遺伝子の
単離等、様々な場面で用いられる。核酸を分析するにあ
たり、まず血液、血清、糞便、尿、培養細胞、細菌等さ
まざまな試料より核酸の抽出、精製を行う必要がある。2. Description of the Related Art In recent years, nucleic acid analysis has been used in the medical field for detection and diagnosis of genetic diseases, analysis of pathogenic factors, etc., discrimination of impurities and genetically engineered products in the food contamination inspection industry, and further in genetic engineering. It is used in various situations such as isolation of genes to be manipulated. In analyzing nucleic acids, it is first necessary to extract and purify nucleic acids from various samples such as blood, serum, feces, urine, cultured cells and bacteria.

【０００３】生物由来の試料から核酸精製のための一般
的な方法としては例えば特公平７-１４３８７９号に記
載のごとき方法がある。この方法では、例えば培養細胞
からのＤＮＡを抽出するにあたって、界面活性剤や酵素
などにより細胞膜、核膜、タンパク質を分解し、次いで
多糖類を除去する。その後、フェノールクロロホルム処
理を行ってタンパク質分を沈殿させて除去し、水溶液相
の核酸をアルコールで沈殿させ、最後に得られた核酸を
洗浄する方法である。かかる方法は、少量の試料から比
較的多量のものまで試料の量に左右されずに行えるとい
う利点がある。しかしながら、非常に工程数が多く手間
が煩雑である点、タンパク質分解酵素反応を利用するた
め、反応時間がかかり、また酵素が高価な点、およびフ
ェノール−クロロホルム抽出工程から出るフェノールと
クロロホルムの廃液処理が必要となる点等の問題があ
る。As a general method for purifying nucleic acid from a biological sample, for example, there is a method described in Japanese Patent Publication No. 143879 / 7-143. In this method, for example, when extracting DNA from cultured cells, the cell membrane, nuclear membrane, and protein are decomposed by a surfactant or enzyme, and then the polysaccharide is removed. After that, a phenol-chloroform treatment is performed to precipitate and remove the protein component, the aqueous phase nucleic acid is precipitated with alcohol, and the finally obtained nucleic acid is washed. Such a method has an advantage that it can be performed from a small amount of sample to a relatively large amount of sample regardless of the amount of sample. However, the number of steps is extremely large and the labor is complicated, the reaction time is long because the protease reaction is used, and the enzyme is expensive, and the waste liquid treatment of phenol and chloroform from the phenol-chloroform extraction step is performed. There is a problem in that

【０００４】フェノールクロロホルムを使用しない方法
として、核酸のリン酸部分のマイナスイオンを利用し
て、低イオン濃度下で核酸をクロマト担体に吸着させ、
これを洗浄し、次いで高イオン濃度にて核酸を溶出させ
る方法が知られている。この方法においては、フェノー
ルクロロホルムを基本的には使用しないため、環境には
優しい方法であるといえる。しかしながら、高濃度の塩
と共に核酸を溶出させた後、脱塩処理が必要となり、ま
たタンパク質が核酸と共に吸着してしまうため、予め何
らかの方法によりタンパク質を除いておくか、あるいは
厳密に塩濃度を調節することが必要であり、あまり実用
的ではない。As a method that does not use phenol-chloroform, the nucleic acid is adsorbed on a chromatographic carrier at a low ion concentration by utilizing the negative ions of the phosphate moiety of the nucleic acid.
A method of washing this and then eluting the nucleic acid at a high ion concentration is known. Since this method basically does not use phenol chloroform, it can be said that it is an environmentally friendly method. However, after elution of nucleic acid with a high concentration of salt, desalting is required, and protein is adsorbed together with nucleic acid.Therefore, remove the protein by some method in advance, or adjust the salt concentration strictly. Is necessary and not very practical.

【０００５】別の方法では、カオトロピックイオンの存
在下でガラスやシリカゲルの固体に核酸が吸着するとい
う原理を利用した方法が知られている。この方法は、Pr
oc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 76 (1979) p615-619
および特許第２６８０４６２号に記載されている。こ
こでカオトロピックイオンとは、大きな半径を有する一
価の陰イオンの総称であり、疎水性物質と水が接触する
際に生じる水分子のエントロピーの減少を抑制する作用
を有するため、疎水性物質を溶解してしまう物質であ
る。かかる方法では、カオトロピックイオンが系へ残存
し、後の実験を阻害してしまう可能性が高いこと、およ
びカオトロピックイオン自身に腐食性及び毒性があるた
め、取り扱いに多大な注意が必要であるAnother method is known which utilizes the principle that nucleic acids are adsorbed on glass or silica gel solids in the presence of chaotropic ions. This method is Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA vol. 76 (1979) p615-619
And Japanese Patent No. 2680462. Here, chaotropic ion is a general term for monovalent anions having a large radius, and has a function of suppressing a decrease in entropy of water molecules generated when a hydrophobic substance and water come into contact with each other, It is a substance that dissolves. In such a method, it is highly likely that chaotropic ions remain in the system and interfere with subsequent experiments, and since chaotropic ions themselves are corrosive and toxic, great care is required in handling.

【０００６】さらに、カオトロピックイオンもフェノー
ルクロロホルムも使用しない方法として、特公平７-５
１０６５号に開示される、高濃度のエタノール、プロパ
ノール及びアセトニトリルと、核酸含有物質および固相
支持体とを用いて核酸を精製する方法である。この方法
は、有機溶媒を高濃度で用いるため、多量のタンパク質
を含む試料を処理する場合には、タンパク質が析出し
て、操作性が悪くなるという問題点がある。Further, as a method using neither chaotropic ion nor phenol / chloroform, Japanese Patent Publication No. 7-5
A method for purifying a nucleic acid using a high concentration of ethanol, propanol, and acetonitrile, a nucleic acid-containing substance, and a solid phase support disclosed in No. 1065. Since this method uses an organic solvent at a high concentration, when processing a sample containing a large amount of protein, there is a problem in that the protein precipitates and the operability deteriorates.

【０００７】さらに、特表平１１-５０１５０４ではか
かる毒性があったり処理が煩雑である溶媒を用いず、界
面活性剤で処理した試料を固相に接触させて核酸を抽出
する方法を提供する。ここで開示されている方法は、手
順が単純で、カオトロピック物質や有機溶媒等を用いる
必要がなく、非常に使いやすいものである。Further, Japanese Patent Publication No. 11-501504 provides a method for extracting a nucleic acid by bringing a sample treated with a surfactant into contact with a solid phase without using a solvent having such toxicity and complicated treatment. The method disclosed here is very easy to use because the procedure is simple and there is no need to use a chaotropic substance or an organic solvent.

【０００８】しかしながら、かかる方法では生体試料、
例えば血液や骨髄液等、大量の不純物が混入する試料を
大量に取り扱うことができないという弱点がある。However, in this method, a biological sample,
For example, there is a weak point that a large amount of a sample containing a large amount of impurities such as blood and bone marrow fluid cannot be handled.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、有機溶媒や
カオトロピック物質などの環境あるいは人体に有害な物
質を用いず、またタンパク質分解酵素を用いず、生体試
料等の不純物が多量に含有された試料でも容易に取り扱
える核酸抽出方法を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION According to the present invention, a large amount of impurities such as biological samples are contained without using substances harmful to the environment or human body such as organic solvents and chaotropic substances, and without using proteolytic enzymes. It is an object of the present invention to provide a nucleic acid extraction method that can easily handle even a sample.

【００１０】[0010]

【課題を解決する手段】核酸を含む試料を、界面活性
剤、塩、緩衝剤およびキレート剤を含む溶解液と混合す
る工程、得られる混合液を、構造単位の少なくとも一部
にリン酸エステル部分を有する重合体であって、親水性
の表面を有する固相支持体に接触させる工程、および固
相支持体を溶液から分離する工程を含む、核酸の抽出方
法を提供する。核酸の吸着した固相支持体は、目的に応
じてそのままＰＣＲ反応の鋳型等に用いても、固相支持
体からさらに核酸を溶出させてもよい。A step of mixing a sample containing a nucleic acid with a lysis solution containing a surfactant, a salt, a buffer and a chelating agent, and the resulting mixed solution is used for at least a part of a structural unit of a phosphate ester moiety. A method of extracting a nucleic acid, which comprises the step of contacting a solid phase support having a hydrophilic surface with a polymer having the following: and separating the solid phase support from a solution. The solid phase support on which the nucleic acid is adsorbed may be used as it is as a template for PCR reaction or the nucleic acid may be further eluted from the solid phase support depending on the purpose.

【００１１】本発明において、構造単位の少なくとも一
部にリン酸エステル部分を有する重合体であって、親水
性の表面を有する固相支持体としては、親水性の表面を
有する、多孔質微粒子であることが好ましい。特に好ま
しくは、下記のモノマーIn the present invention, a polymer having a phosphoric acid ester moiety in at least a part of its structural unit, and a solid phase support having a hydrophilic surface is a porous fine particle having a hydrophilic surface. Preferably there is. Particularly preferably, the following monomers

【化２】［式中、Ｒは水素原子またはメチル基、ｎは０〜３０の
数を示し、ｍは０〜３０の数を示す。但し、ｍ＋ｎ≧１
である。］を重合成分の少なくとも一部として含むモノ
マー成分を、該モノマーと重合可能な親水性モノマーと
共重合して得られる重合体である。[Chemical 2] [In the formula, R represents a hydrogen atom or a methyl group, n represents a number from 0 to 30, and m represents a number from 0 to 30. However, m + n ≧ 1
Is. ] Is a polymer obtained by copolymerizing a monomer component containing at least a part of the polymerization component with a hydrophilic monomer that is polymerizable with the monomer.

【００１２】固相支持体としては、板、シート、棒、
球、粒子等、どのような形状でもよいが、処理液と接触
する表面が最大となる、多孔質微粒子とすることが特に
好ましく、最も好ましくは平均孔径３０〜５０００Åの
多孔質重合体微粒子である。As the solid phase support, plates, sheets, rods,
Although it may have any shape such as spheres or particles, it is particularly preferable to use porous fine particles having the largest surface in contact with the treatment liquid, and most preferably porous polymer fine particles having an average pore diameter of 30 to 5,000Å. .

【００１３】かかる重合体については、本出願人による
特公平７−６２０５４号（特許第２０３２７７２号）公
報に開示されている。なお、該特許では、多孔質重合体
粒子をタンパク質のクロマトグラフィ用に使用すること
が開示されているが、上記微粒子が核酸を好適に吸着さ
せることを示唆する記載は無い。[0013] For such polymers are disclosed in KOKOKU 7-620 No. 54 (Japanese Patent No. 2032772) JP by the present applicant. It should be noted that the patent discloses that the porous polymer particles are used for protein chromatography, but there is no description suggesting that the fine particles adsorb nucleic acid suitably.

【００１４】本発明によって処理し得る試料は、哺乳類
由来の血液、骨髄液、糞便、尿、その他の体液、生体組
織などの生体試料、培養細胞、培養組織等の培養物、細
菌、ウイルス等の微生物、植物組織、食品等の天然物の
加工品等、核酸を含有しているものであれば特に限定さ
れない。Samples that can be treated by the present invention include mammalian-derived blood, bone marrow fluid, feces, urine, other body fluids, biological samples such as biological tissues, cultured cells, cultures of cultured tissues, bacteria, viruses and the like. It is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid, such as a processed product of a natural product such as a microorganism, plant tissue or food.

【００１５】本発明の方法によって処理する場合、血
液、体液、培養細胞等の場合には界面活性剤の作用によ
り細胞を溶解させ、含有される核酸を溶解液中に放出さ
せることが可能となるが、植物等の細胞壁を有する細胞
である場合や、組織片等の細胞同志が比較的強固に結合
している試料である場合には、細胞が溶解し易くなるよ
う、ホモジナイズ等の物理的な力により、予め細胞壁を
破壊する、結合細胞をバラバラにするなどの前処理を行
うことが必要である。これらの前処理については、当業
者に公知である。When treated by the method of the present invention, in the case of blood, body fluid, cultured cells, etc., it becomes possible to lyse the cells by the action of a surfactant and release the contained nucleic acid into the lysate. Is a cell having a cell wall of a plant or the like, or a sample in which the cells such as a piece of tissue are relatively tightly bound to each other, the cells are easily lysed so that the cells can be easily lysed by a physical method such as homogenization. It is necessary to perform a pretreatment such as breaking the cell wall by force, breaking the bonded cells apart, or the like. These pretreatments are known to those skilled in the art.

【００１６】本発明において用いる溶解液は、界面活性
剤、塩及びキレート剤を含有する。溶解液は界面活性剤
の作用により細胞膜や核膜を溶解させるものである。The solution used in the present invention contains a surfactant, a salt and a chelating agent. The lysis solution dissolves the cell membrane and nuclear membrane by the action of the surfactant.

【００１７】界面活性剤としては、陽イオン性、陰イオ
ン性、両イオン性及び非イオン性のいずれも好適に用い
られる。具体的には臭化セチルトリメチルアンモニウム
（ＣＴＡＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ
−ラウロイルサルコシンナトリウム、chaps(3-[(3-chol
amidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween
20)等が例示されるが、これらに限定されない。界面活
性剤は、溶解液中０.０１〜２％（ｗ/ｖ)、より好まし
くは０.０５〜５％添加する。As the surfactant, any of cationic, anionic, amphoteric and nonionic is preferably used. Specifically, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), N
-Sodium lauroyl sarcosine, chaps (3-[(3-chol
amidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate),
Polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween
20) and the like are exemplified, but the invention is not limited thereto. The surfactant is added in the solution in an amount of 0.01 to 2% (w / v), more preferably 0.05 to 5%.

【００１８】塩としては、一価陽イオンを与える塩、例
えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム、酢
酸ナトリウム、酢酸カリウムなどが例示され、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、塩化リチウムが特に好ましい。
塩は溶解液中好ましくは０.２〜０.５Ｍとなるよう添加
する。Examples of the salt include salts which give monovalent cations, such as sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, sodium acetate and potassium acetate, and sodium chloride, potassium chloride and lithium chloride are particularly preferable.
The salt is added so that the concentration of the salt in the solution is preferably 0.2 to 0.5M.

【００１９】緩衝剤としては、ｐＨが５〜９、より好ま
しくはｐＨ６〜７のトリス−ＨＣｌ、酢酸ナトリウム、
クエン酸，リン酸等が例示されるが、トリス-ＨＣｌ、
クエン酸緩衝液が特に有用である。As the buffering agent, Tris-HCl having a pH of 5 to 9, more preferably pH 6 to 7, sodium acetate,
Citric acid, phosphoric acid, etc. are exemplified, but Tris-HCl,
Citrate buffer is particularly useful.

【００２０】キレート剤は、ＤＮａｓｅ等の核酸分解酵
素がＭｇ²⁺の存在下で活性化されるため、これをキレー
トとして核酸分解酵素の活性を抑えるために添加される
ものであり、従来核酸の抽出時に用いられるキレート剤
のいずれを用いても良い。好ましくは、ＥＤＴＡ、ＥＧ
ＴＡである。キレート剤は溶解液中１〜１００ｍＭ、よ
り好ましくは１０〜５０ｍＭ添加する。The chelating agent is added in order to suppress the activity of the nucleic acid degrading enzyme as a chelate, since the nucleic acid degrading enzyme such as DNase is activated in the presence of Mg ²⁺ . Any chelating agent used during extraction may be used. Preferably, EDTA, EG
It is TA. The chelating agent is added to the solution in an amount of 1 to 100 mM, more preferably 10 to 50 mM.

【００２１】溶解処理は、試料と溶解液を混合して行え
ばよい。試料の種類にもよるが、典型的には体積比とし
て試料１に対して溶解液を２以上、好ましくは試料１に
対して溶解液を約４となるよう添加する。溶解処理の方
法については限定的ではないが、典型的には溶解液と試
料がまんべんなく混合されるように攪拌し、室温で５分
以上処理すればよい。溶解処理に際して固相支持体を同
時に添加しておいてもよく、また溶解処理終了後に固相
支持体を添加してもよく、あるいは固相支持体と試料を
直接接触させた後に溶解液を添加してもよい。ただし、
固相支持体と試料を先に接触させる場合には、すぐに溶
解液を添加しなくてはならない。The dissolution treatment may be carried out by mixing the sample and the dissolution liquid. Although it depends on the type of sample, typically, the volume ratio of the solution to be added is 2 or more to the sample 1, preferably about 4 to the sample 1. The method of lysis treatment is not limited, but typically, the lysis solution and the sample are stirred so that they are evenly mixed, and the treatment may be performed at room temperature for 5 minutes or more. The solid phase support may be added at the same time during the lysis process, or the solid phase support may be added after the lysis process is completed, or the lysis solution may be added after direct contact between the solid phase support and the sample. You may. However,
If the solid support and the sample are contacted first, the lysis solution must be added immediately.

【００２２】次いで溶液中へ構造単位の少なくとも一部
にリン酸エステル部分を有する重合体であって、親水性
の表面を有する固相支持体を添加する。本発明の方法に
おいて用いる、構造単位の少なくとも一部にリン酸エス
テル部分を有する重合体であって、親水性の表面を有す
る固相支持体とは、分子中にリン酸エステル部分を含有
するモノマーを、単独重合もしくは別のモノマーと共重
合して得られる親水性の重合体をいう。Next, a solid support having a hydrophilic surface, which is a polymer having a phosphate ester moiety in at least a part of its structural unit, is added to the solution. In the method of the present invention, a polymer having a phosphoric acid ester moiety in at least a part of its structural unit, and a solid phase support having a hydrophilic surface means a monomer having a phosphoric acid ester moiety in its molecule. Is a hydrophilic polymer obtained by homopolymerization or copolymerization with another monomer.

【００２３】固相支持体としては、粒子、シート、板、
フィルター、繊維状、管等どのような形状であってもよ
いが、核酸の吸着効率を高めるためには、液体と接触す
る面積が大きい、多孔質微粒子であることが好ましい。Solid phase supports include particles, sheets, plates,
Although it may have any shape such as a filter, a fibrous shape, a tube, etc., in order to enhance the adsorption efficiency of nucleic acid, it is preferable to use porous fine particles having a large contact area with a liquid.

【００２４】特に好ましい粒子は、下記の構造単位モノ
マー［Ｉ］Particularly preferred particles have the following structural unit monomer [I]

【化３】［式中、Ｒは水素原子またはメチル基、ｎは０〜３０の
数を示し、ｍは０〜３０の数を示す。但し、ｍ＋ｎ≧１
である。］と親水性担体とを重合して得られる重合体粒
子である。[Chemical 3] [In the formula, R represents a hydrogen atom or a methyl group, n represents a number from 0 to 30, and m represents a number from 0 to 30. However, m + n ≧ 1
Is. ] And a hydrophilic carrier are polymerized to obtain polymer particles.

【００２５】本発明の固相支持体に用いられるモノマー
［Ｉ］は重合性二重結合を有するカルボン酸とアルキレ
ングリコールまたはポリアルキレングリコールとのエス
テル３モルとのリン酸エステルである。代表的カルボン
酸はアクリル酸および／またはメタクリル酸（両者を合
わせて（メタ）アクリル酸と記す）である。The monomer [I] used in the solid support of the present invention is a phosphoric ester of a carboxylic acid having a polymerizable double bond and 3 mol of an ester of alkylene glycol or polyalkylene glycol. A typical carboxylic acid is acrylic acid and / or methacrylic acid (both are collectively referred to as (meth) acrylic acid).

【００２６】代表的（ポリ）アルキレングリコールは
（ポリ）エチレングリコール、（ポリ）プロピレングリ
コールまたは酸化エチレンと酸化プロピレンのブロック
またはランダム共重合体である。これらの（ポリ）アル
キレングリコール鎖は生成する重合体粒子に親水性を付
与するためであるが、分子量が大きくなりすぎると重合
体粒子の機械的強度が低下するため、ｎ＋ｍはせいぜい
３０程度までが適当である。ｎまたはｍはそれぞれ０〜
１０が好ましく、ｎ＋ｍは少なくとも１である。特に
（ポリ）エチレングリコールが好ましい。Typical (poly) alkylene glycols are (poly) ethylene glycol, (poly) propylene glycol or block or random copolymers of ethylene oxide and propylene oxide. These (poly) alkylene glycol chains impart hydrophilicity to the resulting polymer particles, but when the molecular weight becomes too large, the mechanical strength of the polymer particles decreases, so that n + m is at most about 30. Appropriate. n or m is 0 to
10 is preferred and n + m is at least 1. (Poly) ethylene glycol is particularly preferable.

【００２７】モノマー［Ｉ］はオキシ塩化リンと上記
（ポリ）アルキレングリコールの（メタ）アクリル酸エ
ステルとを常套の手段で反応させることにより得ること
ができる。モノマー［Ｉ］は同一分子内に異なった親水
基と重合性基を有していてもよい。例えばアクリル酸エ
ステルとメタクリル酸エステル、（ポリ）エチレングリ
コールエステルと（ポリ）プルピレングリコールエステ
ルあるいは異なった分子量のアルキレングリコール鎖を
有するものがモノマー［Ｉ］１分子中に混在していても
よい。The monomer [I] can be obtained by reacting phosphorus oxychloride with the (meth) acrylic acid ester of the above (poly) alkylene glycol by a conventional means. The monomer [I] may have different hydrophilic groups and polymerizable groups in the same molecule. For example, acrylic acid ester and methacrylic acid ester, (poly) ethylene glycol ester and (poly) propylene glycol ester, or those having alkylene glycol chains having different molecular weights may be mixed in one molecule of the monomer [I].

【００２８】本発明に有用な重合体粒子はモノマー
［Ｉ］の単独重合体（但し、この単独重合体とはモノマ
ー［Ｉ］自体が式［Ｉ］で表わされる複数種のモノマー
混合物である場合を含む）であってもよいが、親水性モ
ノマーとの共重合体であってもよい。The polymer particles useful in the present invention are homopolymers of the monomer [I] (provided that the monomer [I] itself is a mixture of plural kinds of monomers represented by the formula [I]. , And a copolymer with a hydrophilic monomer.

【００２９】使用し得る親水性モノマーはモノマー
［Ｉ］と重合し得る、好ましくは非イオン性のモノマー
であって分子内に親水性の基を有するものである。イオ
ン性モノマー（例えばアミノ基、カルボキシル基、スル
ホン酸基等を有するモノマー）はこれを液体クロマトグ
ラフィ用充填剤として用いると、これらの基にもとづく
非特異的吸着を生ずるため、その様な機能を利用する場
合（例えばイオン交換体）以外はむしろ好ましくない。
この様な親水性モノマーの好ましい具体例は、重合性二
重結合とヒドロキシル基またはオキシエーテル基を有す
るモノマー、例えばヒドロキシエチル（メタ）アクリレ
ート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリ
セリン（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトール
（メタ）アクリレート、オリゴエチレングリコール（メ
タ）アクリレートおよびオリゴプロピレングリコール
（メタ）アクリレート、（オリゴ）アルキレングリコー
ルイタコネート、ジ（オリゴ）アルキレングリコールマ
レエート等が例示される。上記のオリゴエチレングリコ
ールやオリゴプロピレングリコールで代表されるオリゴ
アルキレングリコール類は２〜１０個程度の酸化アルキ
レン重合体であって、モノマーに親水性を付与するため
に用いる、酸化アルキレンのモル数が多くなると機械的
強度が低下する。複数種の親水性モノマーを併用しても
よい。The hydrophilic monomer which can be used is a non-ionic monomer which can be polymerized with the monomer [I], and which has a hydrophilic group in the molecule. Ionic monomers (for example, monomers having amino groups, carboxyl groups, sulfonic acid groups, etc.), when used as packing materials for liquid chromatography, cause non-specific adsorption based on these groups, so such functions are utilized. It is rather unfavorable except when (for example, an ion exchanger).
Preferable specific examples of such a hydrophilic monomer include monomers having a polymerizable double bond and a hydroxyl group or an oxyether group, for example, hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, glycerin (meth) acrylate and penta. Examples thereof include erythritol (meth) acrylate, oligoethylene glycol (meth) acrylate and oligopropylene glycol (meth) acrylate, (oligo) alkylene glycol itaconate, and di (oligo) alkylene glycol maleate. The oligoalkylene glycols represented by the above oligoethylene glycol and oligopropylene glycol are about 2 to 10 alkylene oxide polymers, and the number of moles of alkylene oxide used for imparting hydrophilicity to the monomer is large. If so, the mechanical strength decreases. You may use together several types of hydrophilic monomers.

【００３０】モノマー［Ｉ］と親水性モノマーとの重量
比は１００:０〜１:９９、好ましくは９０:１０〜５:９
５、より好ましくは５０:５０〜１０:９０である。The weight ratio of the monomer [I] to the hydrophilic monomer is 100: 0 to 1:99, preferably 90:10 to 5: 9.
5, more preferably 50:50 to 10:90.

【００３１】モノマー［Ｉ］と親水性モノマーとは同時
に重合させてもよく（ランダム・ポリマー）、モノマー
［Ｉ］を重合させた後、これに親水性モノマーを反応さ
せてもよく（変性ポリマー）、あるいは、親水性モノマ
ーを重合させた後モノマー［Ｉ］を反応させてもよい
（架橋ポリマー）。さらに両者をオリゴメル化した後共
重合させてもよい（ブロック・ポリマー）。これらの共
重合の際、モノマー［Ｉ］あるいは親水性モノマーを滴
下して重合させてもよい。The monomer [I] and the hydrophilic monomer may be simultaneously polymerized (random polymer), or the monomer [I] may be polymerized and then reacted with the hydrophilic monomer (modified polymer). Alternatively, the monomer [I] may be reacted after polymerizing the hydrophilic monomer (crosslinked polymer). Further, both may be oligomerized and then copolymerized (block polymer). At the time of copolymerization of these, the monomer [I] or a hydrophilic monomer may be added dropwise for polymerization.

【００３２】上記モノマー類から重合体粒子を得るため
の特に好適な方法はモノマー［Ｉ］と所望により親水性
モノマーとを、水と混和しない非反応性有機溶剤と触媒
の存在下に水性懸濁重合させる方法である。A particularly preferred method for obtaining polymer particles from the above monomers is an aqueous suspension of monomer [I] and optionally a hydrophilic monomer in the presence of a water immiscible non-reactive organic solvent and a catalyst. It is a method of polymerizing.

【００３３】上述のごとくモノマー［Ｉ］と親水性モノ
マーの反応順序は限定的でなく、モノマー［Ｉ］を予め
重合させてこれに親水性モノマーを重合させてもよく、
両者を同時に重合させてもよく、あるいは親水性モノマ
ーを予め重合させ、次いでこれにモノマー［Ｉ］を反応
させてもよい。またモノマー滴下順序を交互に繰返して
重合させてもよい。As described above, the reaction order of the monomer [I] and the hydrophilic monomer is not limited, and the monomer [I] may be previously polymerized and then the hydrophilic monomer may be polymerized.
Both may be polymerized at the same time, or a hydrophilic monomer may be previously polymerized and then the monomer [I] may be reacted therewith. Further, the monomer dropping order may be alternately repeated for polymerization.

【００３４】モノマー成分はモノマー［Ｉ］に加えてさ
らに架橋剤を含んでいてもよい。架橋剤としては例えば
エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレ
ングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ
（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メ
タ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）
アクリレート、オリゴエチレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、オリゴプロピレングリコールジ（メタ）ア
クリレート等の親水性架橋剤が例示される。架橋剤の使
用量はモノマー［Ｉ］と架橋剤合計量の２０重量％以下
が適当である。The monomer component may further contain a crosslinking agent in addition to the monomer [I]. Examples of the cross-linking agent include ethylene glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, glycerin di (meth) acrylate, pentaerythritol di (meth) acrylate, pentaerythritol tri (meth) acrylate.
Examples of hydrophilic crosslinking agents include acrylates, oligoethylene glycol di (meth) acrylates, oligopropylene glycol di (meth) acrylates. The amount of the crosslinking agent used is appropriately 20% by weight or less based on the total amount of the monomer [I] and the crosslinking agent.

【００３５】モノマー［Ｉ］と架橋剤との反応は両者を
同時に反応させてもよく、予め、モノマー［Ｉ］を重合
させて、これに架橋剤を反応させてもよい。モノマー成
分はモノマー［Ｉ］に加えて更に親水性モノマーと架橋
剤を含んでいてもよい。この場合の架橋剤の量もモノマ
ー［Ｉ］と架橋剤合計量の２０重量％以下が適当であ
る。三者は同時に反応させてもよく、あるいは、モノマ
ー［Ｉ］と親水性モノマーとを重合させた後、架橋剤で
架橋してもよく、あるいは親水性モノマーの重合体に、
モノマー［Ｉ］と架橋剤を反応させてもよい。The reaction of the monomer [I] and the crosslinking agent may be carried out by reacting both at the same time, or the monomer [I] may be polymerized in advance and the crosslinking agent may be reacted therewith. The monomer component may further contain a hydrophilic monomer and a crosslinking agent in addition to the monomer [I]. In this case, the amount of the crosslinking agent is appropriately 20% by weight or less based on the total amount of the monomer [I] and the crosslinking agent. The three may be reacted at the same time, or after the monomer [I] and the hydrophilic monomer are polymerized, they may be crosslinked with a crosslinking agent, or a polymer of the hydrophilic monomer may be added.
You may make a monomer [I] and a crosslinking agent react.

【００３６】上記モノマー類の重合は非水系溶剤中で生
ずるが、重合がある程度進行すると、重合体は該溶剤に
溶解せず析出して微細な重合体粒子として水中に懸濁す
る。従って、粒径の整った均一な重合体粒子が得られ
る。有機溶剤を洗浄あるいは揮散により除去すると、粒
子中に微細な通気孔が形成されるため、吸着性に優れた
多孔質の重合体粒子が得られる。The above-mentioned monomers are polymerized in a non-aqueous solvent, but when the polymerization proceeds to some extent, the polymer does not dissolve in the solvent but precipitates and is suspended in water as fine polymer particles. Therefore, uniform polymer particles having a uniform particle size can be obtained. When the organic solvent is removed by washing or volatilization, fine air holes are formed in the particles, so that porous polymer particles having excellent adsorptivity can be obtained.

【００３７】上記重合体粒子の製造に用いられる非反応
性有機溶剤はモノマー成分を溶解し得るものであって水
と混和しないものであればよい。この様な有機溶剤とし
ては芳香族系炭化水素、例えば、ベンゼン、トルエン、
キシレン、テトラリン等、アルコール類、例えばブタノ
ール、アミルアルコール、シクロヘキサノール、２−エ
チルヘキサノール等、ケトン類、例えばメチルエチルケ
トン、メチルブチルケトン、エステル類、例えば酢酸エ
チル、酢酸ブチル等が例示される。２種以上の溶剤を混
合して、モノマー類の溶解性と生成ポリマーの溶解性、
親水性等を適当な範囲に調整してもよい。The non-reactive organic solvent used in the production of the polymer particles may be any one that can dissolve the monomer components and is immiscible with water. Such organic solvents include aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene,
Examples thereof include xylene, tetralin and the like, alcohols such as butanol, amyl alcohol, cyclohexanol, 2-ethylhexanol and the like, ketones such as methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone and esters such as ethyl acetate and butyl acetate. By mixing two or more solvents, the solubility of the monomers and the solubility of the produced polymer,
You may adjust hydrophilicity etc. to a suitable range.

【００３８】非反応性有機溶剤の使用量はモノマー成分
の重量の１〜５００重量％、好ましくは５０〜２００重
量％である。The amount of the non-reactive organic solvent used is 1 to 500% by weight, preferably 50 to 200% by weight, based on the weight of the monomer component.

【００３９】モノマー成分は全ての成分をあるいは成分
の一部（例えばモノマー［Ｉ］、親水性モノマーおよび
架橋剤を用いるときは、前二者）を予め上記有機溶剤類
に溶解し、これを水中で懸濁重合してもよく、あるいは
有機溶剤の水性懸濁液中にモノマー成分またはその一部
を滴下重合してもよい。成分の一部を予め重合させたと
きは、残りの成分を次いで重合反応に供してもよい。As the monomer component, all the components or a part of the components (for example, when the monomer [I], the hydrophilic monomer and the cross-linking agent are used, the former two) are dissolved in advance in the above organic solvents, and this is dissolved in water. Or the monomer component or a part thereof may be dropwise polymerized in an aqueous suspension of an organic solvent. When some of the components are prepolymerized, the remaining components may then be subjected to a polymerization reaction.

【００４０】触媒はラジカル重合開始剤、レドックス重
合開始剤、セリウム塩に代表される酸化剤等が用いられ
る。反応温度で分解が起るラジカル重合開始剤が好まし
く、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイルなど
の過酸化アシル類、アゾビスイソブチロニトリルなどの
アゾニトリル類がある。ラジカル重合開始剤の使用量は
モノマー[Ｉ]と親水性モノマー及び架橋剤の合計に対
し、０.３〜７重量％であり、好ましくは０.５〜５重量
％が望ましい。As the catalyst, a radical polymerization initiator, a redox polymerization initiator, an oxidizing agent represented by a cerium salt, or the like is used. A radical polymerization initiator that decomposes at the reaction temperature is preferable, and examples thereof include acyl peroxides such as benzoyl peroxide and lauroyl peroxide, and azonitriles such as azobisisobutyronitrile. The amount of the radical polymerization initiator used is 0.3 to 7% by weight, preferably 0.5 to 5% by weight, based on the total amount of the monomer [I], the hydrophilic monomer and the crosslinking agent.

【００４１】重合は水性媒体中で行なう。モノマー
［Ｉ］および親水性モノマーはいずれも水に溶解性であ
るため、これらの重合を有機溶剤層中で行なうには、上
記モノマー類の水層への分配率を抑制するため適当な塩
類を水に溶解させておくのが好ましい。親水性架橋剤を
モノマー［Ｉ］および／または親水性モノマーと混合し
て用いる場合も同様である。この様な塩類としては塩化
ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム等の中性
の無機塩であってよく、またこれらに限定されるもので
はない。塩類の使用量は１０〜３５重量％程度が適当で
ある。The polymerization is carried out in an aqueous medium. Since both the monomer [I] and the hydrophilic monomer are soluble in water, in order to carry out the polymerization of these in an organic solvent layer, appropriate salts should be added in order to suppress the distribution ratio of the above monomers to the aqueous layer. It is preferably dissolved in water. The same applies when the hydrophilic cross-linking agent is used as a mixture with the monomer [I] and / or the hydrophilic monomer. Such salts may be neutral inorganic salts such as sodium chloride, sodium sulfate and calcium chloride, and are not limited to these. An appropriate amount of salt used is about 10 to 35% by weight.

【００４２】有機溶剤およびモノマー成分を水に懸濁さ
せるためには超音波あるいはホモミキサー等の物理的手
段のみで行なってもよいが、分散剤を併用してもよい。
分散剤としては、澱粉、ゼラチンなどの天然高分子物
質、ＣＭＣ、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセル
ロースなどの加工天然高分子物質、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、カーボワックスなどの水溶
性高分子物質等が例示される。In order to suspend the organic solvent and the monomer component in water, ultrasonic waves or a physical means such as a homomixer may be used alone, but a dispersant may be used in combination.
Examples of the dispersant include natural polymer substances such as starch and gelatin, processed natural polymer substances such as CMC, hydroxyethyl cellulose and methyl cellulose, and water-soluble polymer substances such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and carbowax.

【００４３】添加量は水に対し０.３〜３重量％、好ま
しくは０.５〜１.５重量％が望ましい。反応温度は２０
〜１５０℃、好ましくは４０〜１００℃が適当である。The amount of addition is preferably 0.3 to 3% by weight, more preferably 0.5 to 1.5% by weight, based on water. Reaction temperature is 20
Appropriate temperature is ˜150 ° C., preferably 40˜100 ° C.

【００４４】得られる重合体粒子の細孔容量、孔径の制
御は、非反応性有機溶媒の使用量または非反応性有機溶
媒の組合せを変えることにより、また粒子の機械的強度
および親水性はモノマー［Ｉ］と親水性モノマーおよび
架橋剤の使用量により制御でき、これらによって本発明
の方法に特に好ましく用いられる、粒子径が１〜１００
０μ、平均孔径が３０〜５０００Åの重合体粒子を容易
に得ることができる。The pore volume and pore size of the obtained polymer particles can be controlled by changing the amount of the non-reactive organic solvent used or the combination of the non-reactive organic solvents, and the mechanical strength and hydrophilicity of the particles can be controlled by the monomer. It can be controlled by the amounts of [I], the hydrophilic monomer and the cross-linking agent used, whereby the particle size of 1 to 100 which is particularly preferably used in the method of the present invention.
Polymer particles having a particle size of 0 μ and an average pore diameter of 30 to 5000 Å can be easily obtained.

【００４５】本発明において、固相支持体の量は典型的
ではないが、固相支持体が粒子径１〜１０００μ、平均
孔径が３０〜５０００Åの重合体粒子である場合には溶
解液０.５ｍｌに対して〜５０ｍｇ、好ましくは１０〜
２０ｍｇ添加する。In the present invention, the amount of the solid phase support is not typical, but when the solid phase support is a polymer particle having a particle size of 1 to 1000 μ and an average pore size of 30 to 5000 Å, a solution of 0. ~ 50 mg, preferably 10 to 5 ml
Add 20 mg.

【００４６】固相支持体は、予め溶解液と混合しておい
て、ここへ試料を添加しても、あるいは溶解処理後に系
へ添加してもよい。固相支持体と試料の接触は、固相支
持体と試料および溶解液がまんべんなく混合されるよう
にすればよく、その方法としては特に限定されない。典
型的には、溶解処理と同時、あるいは溶解処理後、固相
支持体の存在下で１〜３０分間、より好ましくは５〜１
５分間室温で攪拌して、核酸を含む溶解液と固相支持体
表面とを接触させればよい。The solid phase support may be mixed with the solution in advance and the sample may be added thereto, or may be added to the system after the dissolution treatment. The solid phase support and the sample may be brought into contact with each other so that the solid phase support, the sample and the solution are evenly mixed, and the method is not particularly limited. Typically, at the same time as the dissolution treatment or after the dissolution treatment, it is carried out in the presence of a solid phase support for 1 to 30 minutes, more preferably 5 to 1
The solution containing nucleic acid may be contacted with the surface of the solid support by stirring for 5 minutes at room temperature.

【００４７】この操作により、溶解液にて細胞膜等が溶
解された後、溶解液中に放出された核酸が親水性表面を
有する固相支持体粒子へ結合する。一方、担体粒子の親
水性が高いため、タンパク質等の不純物は該粒子に吸着
されない。このため、核酸を効率良く、高い純度で分離
することが可能である。By this operation, after the cell membrane or the like is dissolved in the lysing solution, the nucleic acid released in the lysing solution binds to the solid phase support particles having a hydrophilic surface. On the other hand, since the carrier particles have high hydrophilicity, impurities such as proteins are not adsorbed on the particles. Therefore, nucleic acids can be efficiently separated with high purity.

【００４８】次いで、核酸が吸着された固相支持体を溶
解液と分離させる。固相支持体として粒子を用いる場合
には、これを溶解液から分離するには、遠心分離、デカ
ンテーション、濾過、などの様々な方法があり、いずれ
も好適に用いられる。Next, the solid phase support on which the nucleic acid is adsorbed is separated from the solution. When particles are used as the solid phase support, various methods such as centrifugation, decantation and filtration can be used to separate the particles from the solution, and any of them can be preferably used.

【００４９】次いで得られた固相支持体を洗浄する。洗
浄液としては、低級アルコール水溶液、アルコールと緩
衝液の混合物、アルコールと塩と緩衝液の混合物などが
例示される。特に好ましいのは、塩、緩衝液、および７
０％程度のエタノールからなる洗浄液である。洗浄方法
としては特に限定的ではないが、洗浄液が固相支持体に
まんべんなく行き渡るように攪拌し、次いで液と固相を
上記のごとき方法にて分離すればよい。Then, the obtained solid phase support is washed. Examples of the washing solution include a lower alcohol aqueous solution, a mixture of alcohol and a buffer solution, a mixture of alcohol, a salt and a buffer solution, and the like. Especially preferred are salts, buffers, and 7
It is a cleaning solution consisting of about 0% ethanol. The washing method is not particularly limited, but the washing solution may be stirred so that it is evenly distributed over the solid phase support, and then the solution and the solid phase may be separated by the method as described above.

【００５０】洗浄した固相支持体は、必要に応じて乾燥
させて次のステップに用いる。乾燥方法は限定的でない
が、例えば減圧乾燥１〜１０分、５０〜７０℃、１０分
以上の加熱乾燥、ドライヤー冷風などを１〜２分間あて
る通風乾燥、３０分以上放置する風乾などが挙げられ
る。こうして得られる核酸が吸着された固相支持体は使
用目的により、そのまま次の操作、例えばＰＣＲ法によ
る増幅や制限酵素処理などの各種分析に供してもよい
し、担体から核酸を溶出させてもよい。The washed solid phase support is dried if necessary and used in the next step. The drying method is not limited, and examples thereof include reduced pressure drying for 1 to 10 minutes, heating drying at 50 to 70 ° C. for 10 minutes or more, ventilation drying for applying a dryer cold air for 1 to 2 minutes, and air drying for standing for 30 minutes or more. . The nucleic acid-adsorbed solid phase support thus obtained may be subjected to the following operations as it is, for example, various analyzes such as amplification by PCR method and restriction enzyme treatment, or the nucleic acid may be eluted from the carrier depending on the purpose of use. Good.

【００５１】固相支持体から核酸を溶出するには、低イ
オン強度の溶媒を固相支持体に作用させ、加温する。溶
出のために用いる低イオン強度の溶液としては、水、Ｔ
Ｅバッファー（10ｍＭ Tris-HCl(pH 7.5) 1mM EDTA(pH
8.0））などが例示される。水を用いるのが便利であ
る。核酸を溶出させるためには、担体を水またはその他
の低イオン強度の溶媒と接触させ、加温する。核酸の溶
出のための温度は好ましくは５０〜９０℃、より好まし
くは７０〜８０℃である。In order to elute the nucleic acid from the solid support, a solvent having a low ionic strength is allowed to act on the solid support to heat it. As the low ionic strength solution used for elution, water, T
E buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) 1 mM EDTA (pH
8.0)) etc. are exemplified. It is convenient to use water. To elute the nucleic acids, the carrier is contacted with water or another low ionic strength solvent and warmed. The temperature for elution of nucleic acid is preferably 50 to 90 ° C, more preferably 70 to 80 ° C.

【００５２】溶出された核酸は、遠心分離、デカンテー
ション、濾過、などの方法にて担体を除き、回収すれば
よい。The eluted nucleic acid may be recovered by removing the carrier by a method such as centrifugation, decantation or filtration.

【００５３】本発明の方法により得られる核酸はさらな
る精製の必要なく、そのままＰＣＲ法や電気泳動方法等
の増幅若しくは各種分析に供することができる。本発明
の方法により、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれも抽出する
ことができる。The nucleic acid obtained by the method of the present invention can be directly subjected to amplification such as PCR method or electrophoresis method or various analyzes without further purification. Both DNA and RNA can be extracted by the method of the present invention.

【００５４】本発明はさらに、界面活性剤、塩、緩衝剤
およびキレート剤を含む溶解液、および構造単位の少な
くとも一部にリン酸エステル部分を有する重合体であっ
て、親水性の表面を有する固相支持体からなる、核酸抽
出のためのキットを提供する。本発明の溶解液、および
固相支持体としては、上に説明したものがいずれも好適
に用いられる。本発明のキットは、本発明の方法の実施
に好適に用いられる。The present invention further relates to a solution containing a surfactant, a salt, a buffer and a chelating agent, and a polymer having a phosphate ester moiety in at least a part of its structural unit, which has a hydrophilic surface. A kit for nucleic acid extraction comprising a solid support is provided. As the solution and the solid phase support of the present invention, those described above are preferably used. The kit of the present invention is suitably used for carrying out the method of the present invention.

【００５５】[0055]

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。固相支持体の調製還流冷却器、攪拌器、温度計を備えた３００ｍｌの四口
セパラブルフラスコに、トリ（メタクリロイルオキシエ
チル）リン酸を３ｇ、２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ートを３ｇ、１−ブタノール６ｇ、アゾビスイソブチロ
ニトリル０.１２ｇを投入した。さらにヒドロキシエチ
ルセルロース１ｇと塩化ナトリウム４０ｇを溶解させた
蒸留水１６０ｇを加え、３５０ｒｐｍの回転数で攪拌を
行ないながら７０℃で１時間、さらに８０℃、４時間加
熱した。生成した共重合体は真球で、粒径１００〜５０
０μｍの範囲にあった。生成した粒子を十分に水洗を繰
り返し、さらにメタノールで洗浄後、乾燥し、平均孔径
をポロシメーターで測定したところ、平均孔径１５００
Åであった。得られた粒子を固相支持体Ａとする。この
固相支持体Ａを用いて以下の実施例、比較例を行った。EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples. Preparation of solid-phase support In a 300 ml four-neck separable flask equipped with a reflux condenser, a stirrer, and a thermometer, 3 g of tri (methacryloyloxyethyl) phosphoric acid, 3 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, and 6 g of 1-butanol. Then, 0.12 g of azobisisobutyronitrile was added. Further, 160 g of distilled water in which 1 g of hydroxyethyl cellulose and 40 g of sodium chloride were dissolved was added, and the mixture was heated at 70 ° C. for 1 hour and further at 80 ° C. for 4 hours while stirring at a rotation speed of 350 rpm. The produced copolymer is spherical and has a particle size of 100 to 50.
It was in the range of 0 μm. The produced particles were sufficiently washed with water repeatedly, further washed with methanol, and then dried, and the average pore diameter was measured with a porosimeter.
It was Å. The obtained particles are designated as solid support A. Using the solid support A, the following examples and comparative examples were performed.

【００５６】[0056]

【実施例１】陰イオン界面活性剤を用いた血液からのＤ
ＮＡ抽出ＥＤＴＡを血液１ｍｌに対して１．５ｍｇ加えて非凝固
処理したヒト末梢血０.１ｍｇを、以下の処方からなる
溶解液０.４ｍｌと室温にて混合した。溶解液：Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム０.２％(ｖ/ｖ) 塩化ナトリウム０.４ＭＥＤＴＡ２０ｍＭ０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）Example 1 D from blood with an anionic surfactant
1.5 mg of NA-extracted EDTA was added to 1 ml of blood, and 0.1 mg of non-coagulated human peripheral blood was mixed with 0.4 ml of a lysis solution having the following formulation at room temperature. Lysate: N-lauroyl sarcosine sodium 0.2% (v / v) sodium chloride 0.4M EDTA 20 mM 0.1M Tris-HCl (pH 7.0)

【００５７】次いで、固相支持体Ａ２０ｍｇを室温で添
加し、１０分間攪拌した。フィルター濾過により溶解液
を除去し、固相支持体Ａを新たな溶解液０.５ｍｌにて
１回、次いで洗浄液（０.４Ｍ塩化ナトリウム、０.１Ｍ
トリス-ＨＣｌ（ｐＨ８.５）、７０％エタノール）０.
５ｍｌにて２回洗浄した。洗浄液を濾過して除き、アル
コール分を乾燥させた。Then, 20 mg of solid phase support A was added at room temperature and stirred for 10 minutes. The solution was removed by filtration through a filter, and the solid phase support A was washed once with 0.5 ml of a new solution, followed by a washing solution (0.4M sodium chloride, 0.1M).
Tris-HCl (pH 8.5), 70% ethanol)
It was washed twice with 5 ml. The washings were filtered off and the alcohol content was dried.

【００５８】得られた核酸吸着固相支持体Ａへ滅菌水
０.１ｍｌを添加、攪拌した。これを８０℃、１０分間
加熱し、固相支持体Ａ上に吸着された核酸を滅菌水へ溶
出させた。フィルター濾過して固相支持体Ａを除き、核
酸溶液を回収した。0.1 ml of sterilized water was added to the obtained nucleic acid-adsorbed solid phase support A and stirred. This was heated at 80 ° C. for 10 minutes to elute the nucleic acid adsorbed on the solid phase support A into sterilized water. The solid phase support A was removed by filtration with a filter, and the nucleic acid solution was recovered.

【００５９】得られた核酸（ＤＮＡ）を常套の方法によ
り電気泳動にかけた。得られた電気泳動写真を図１に示
す。エチジウムブロマイドによって染色されたＤＮＡの
バンドが示された。なお、図１の各レーンは以下の通り
である (左側より）。レーン１：分子量マーカーλ-Hind III digest（宝酒造
社製）レーン２、３および４：実施例１をｎ＝３で実施した各
結果。実施例１は、本発明の方法がＤＮＡを抽出するのに有用
であることを示す。The obtained nucleic acid (DNA) was electrophoresed by a conventional method. The obtained electrophoretic photograph is shown in FIG. A band of DNA stained with ethidium bromide was shown. The lanes in Figure 1 are as follows (from left). Lane 1: molecular weight marker λ- Hind III digest (manufactured by Takara Shuzo) Lanes 2, 3 and 4: each result of carrying out Example 1 at n = 3. Example 1 shows that the method of the present invention is useful for extracting DNA.

【００６０】[0060]

【実施例２】界面活性剤を変えた溶解液を調製して、本
発明の方法を実施した。用いた溶解液は以下の通りであ
る：０.４Ｍ塩化ナトリウム０.１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ (ｐＨ７.０) ０.４ｍｌおよび１）〜４）いずれかの界面活性剤０.２％（ｖ/
ｖ) １）セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡ
Ｂ）２）Ｓｐａｎ−２０３）Ｔｗｅｅｎ−２０４）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００Example 2 A solution having a different surfactant was prepared and the method of the present invention was carried out. The lysates used were as follows: 0.4M sodium chloride 0.1M Tris-HCl (pH 7.0) 0.4ml and 1) -4) 0.2% of any surfactant (v /
v) 1) Cetyltrimethylammonium bromide (CTA
B) 2) Span-20 3) Tween-20 4) Triton X-100

【００６１】ＥＤＴＡを血液１ｍｌに対して１．５ｍｇ
加えて非凝固処理したヒト末梢血各０.１ｍｌを、溶解
液のそれぞれ０.４ｍｌと室温にて混合した。続いて固
相支持体Ａ２０ｍｇを室温にて添加し、１０分間攪拌し
た。フィルター濾過により溶液を除去し、固相支持体Ａ
を新たな各溶解液０.５ｍｌにて１回、次いで洗浄液
（０.４Ｍ塩化ナトリウム、０.１Ｍトリス-ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８.５）、７０％エタノール）０.５ｍｌにて２回洗浄
した。洗浄液を濾過して除き、アルコール分を乾燥させ
た後、滅菌水０.１ｍｌを添加、攪拌し、８０℃、１０
分間加熱して、固相支持体Ａ上に吸着された核酸を滅菌
水へ溶出させた。フィルター濾過にて固相支持体を除
き、核酸溶液を回収した。1.5 mg of EDTA for 1 ml of blood
In addition, 0.1 ml each of non-coagulated human peripheral blood was mixed with 0.4 ml of each lysate at room temperature. Subsequently, 20 mg of solid phase support A was added at room temperature and stirred for 10 minutes. The solution is removed by filtration with a solid support A
Once with 0.5 ml of each fresh lysis solution, and then with the washing solution (0.4 M sodium chloride, 0.1 M Tris-HCl (p
It was washed twice with 0.5 ml of H8.5) and 70% ethanol). After removing the washing solution by filtration and drying the alcohol content, 0.1 ml of sterilized water was added and stirred, and the temperature was maintained at 80 ° C for 10 minutes.
After heating for minutes, the nucleic acid adsorbed on the solid support A was eluted into sterilized water. The solid phase support was removed by filtration with a filter, and the nucleic acid solution was recovered.

【００６２】得られたＤＮＡを常套の方法により電気泳
動にかけた。得られた電気泳動写真を図２に示す。な
お、図２の各レーンは以下の通りである。(左側より）レーン１：分子量マーカーλ-Hind III digest（宝酒造
社製）レーン２：セチルトリメチルアンモニウムブロマイド
（ＣＴＡＢ）レーン３：Ｓｐａｎ-２０レーン４：Ｔｗｅｅｎ-２０レーン５：ＴｒｉｔｏｎＸ-１００The obtained DNA was electrophoresed by a conventional method. The obtained electrophoretic photograph is shown in FIG. The lanes in FIG. 2 are as follows. (From the left side) Lane 1: Molecular weight marker λ- Hind III digest (Takara Shuzo) Lane 2: Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Lane 3: Span-20 Lane 4: Tween-20 Lane 5: Triton X-100

【００６３】[0063]

【実施例３】溶解液中の塩濃度の相違による、血液から
のＤＮＡ抽出溶解液中の塩化ナトリウム濃度を０Ｍ、０.２Ｍ、０.４
Ｍ、０.６Ｍ、および０.８Ｍとする以外は、実施例１と
同じ溶解液を調製した。各溶解液を用い、実施例１と同
様にして血液中のＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡの
電気泳動写真を図３に示す。塩化ナトリウム濃度０.４
Ｍにおいて、強いバンドが確認された。なお、図３の各
レーンは以下の通りである(左側より）。レーン１：分子量マーカーλ-Hind III digest(宝酒造
社製) レーン２：塩濃度０Ｍレーン３：塩濃度０.２Ｍレーン４：塩濃度０.４Ｍレーン５：塩濃度０.６Ｍレーン６：塩濃度０.８Ｍ[Example 3] Extraction of DNA from blood The concentration of sodium chloride in the lysate was adjusted to 0M, 0.2M and 0.4 depending on the difference in salt concentration in the lysate.
The same solution as in Example 1 was prepared except that M, 0.6M, and 0.8M were used. Using each lysate, DNA in blood was isolated in the same manner as in Example 1. The electrophoretic photograph of the obtained DNA is shown in FIG. Sodium chloride concentration 0.4
In M, a strong band was confirmed. The lanes in FIG. 3 are as follows (from the left side). Lane 1: Molecular weight marker λ- Hind III digest (Takara Shuzo) Lane 2: Salt concentration 0M Lane 3: Salt concentration 0.2M Lane 4: Salt concentration 0.4M Lane 5: Salt concentration 0.6M Lane 6: Salt Concentration 0.8M

【００６４】[0064]

【実施例４】ｐＨの相違による血液からのＤＮＡ抽出実施例１のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.０）緩衝液に代
えて以下の各ｐＨの緩衝液を用いる以外は実施例１と同
じ溶解液を調製した。各溶解液を用い、ＥＤＴＡを血液
１ｍｌに対して１．５ｍｇ加えて非凝固処理したヒト末
梢血０.１ｍｌからＤＮＡを抽出した。Example 4 Extraction of DNA from Blood by Difference in pH The same lysate as in Example 1 was used, except that the following Tris-HCl (pH 7.0) buffer solutions were used instead of the Tris-HCl (pH 7.0) buffer solutions. Prepared. Using each lysate, DNA was extracted from 0.1 ml of non-coagulated human peripheral blood by adding 1.5 mg of EDTA to 1 ml of blood.

【００６５】得られたＤＮＡの電気泳動写真を図４に示
す。中性ｐＨの溶解液を用いた場合に、最も強いＤＮＡ
のバンドが認められた。なお、図４の各レーンは以下の
通りである(左側より）。レーン１：分子量マーカーλ-Hind III digest レーン２：０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５.０レーン３：０.１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ５.０レーン４：０.１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６.０レーン５：０.１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６.０レーン６：０.１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ６.０レーン７：０.１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ７.０レーン８：０.１ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ８.０An electrophoretic photograph of the obtained DNA is shown in FIG. Strongest DNA when using a neutral pH lysate
Band was recognized. The lanes in FIG. 4 are as follows (from the left side). Lane 1: Molecular weight marker λ- Hind III digest Lane 2: 0.1M sodium acetate buffer pH 5.0 Lane 3: 0.1M citrate buffer pH 5.0 Lane 4: 0.1M sodium acetate buffer pH 6.0 Lane 5: 0.1M citrate buffer pH 6.0 Lane 6: 0.1M Tris-HCl pH 6.0 Lane 7: 0.1M Tris-HCl pH 7.0 Lane 8: 0.1M Tris-HCl pH 8.0

【００６６】[0066]

【実施例５】ポリヌクレアーゼ連鎖反応実施例１〜３で得た核酸を鋳型としてＰＣＲを行った。
用いたプライマーは 5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG である。プライマー各１μＭおよびＴＡＫＡＲＡＴａ
ｑキットのバッファー×１、ＴＡＫＡＲＡＴａｑ１.
２５Ｕ、ｄＮＴＰ（それぞれ最終濃度０.４ｍＭ）の混
合物へ各ＤＮＡ試料２５ｎｇを投入し、反応を行った。
ＰＣＲ反応は９４℃１分―［９４℃２０秒―５５℃４０
秒―７２℃１分３０秒］×３０―７２℃７分のスケジュ
ールで実施した。Example 5 Polynuclease Chain Reaction PCR was performed using the nucleic acid obtained in Examples 1 to 3 as a template.
The primer used was 5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG. 1 μM each of primer and TAKARA Ta
q Kit buffer x 1, TAKARA Taq 1.
25 ng of each DNA sample was added to a mixture of 25 U and dNTP (final concentration of 0.4 mM) to carry out the reaction.
PCR reaction is 94 ° C for 1 minute- [94 ° C for 20 seconds-55 ° C 40
Second-72 ° C 1 minute 30 seconds] x 30-72 ° C 7 minutes schedule.

【００６７】それぞれの増幅されたＤＮＡの電気泳動写
真を図５に示す。なお、図５の各レーンは以下の通りで
ある(左側より）。１：分子量マーカーφＸ１７４-HincII digest（宝酒造
社製）２：陰性コントロール３：実施例１４：実施例２-界面活性剤ＣＴＡＢ５：実施例２-界面活性剤Ｓｐａｎ-２０６：実施例２-界面活性剤Ｔｗｅｅｎ-２０７：実施例２-界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ-１００８〜１０無関係のデータ１１：実施例３-塩濃度０Ｍ１２：実施例３-塩濃度０.２Ｍ１３：実施例３-塩濃度０.４Ｍ１４：実施例３-塩濃度０.６Ｍ１５：実施例３-塩濃度０.８Ｍ１６〜無関係のデータAn electrophoretic photograph of each amplified DNA is shown in FIG. The lanes in FIG. 5 are as follows (from the left side). 1: Molecular weight marker φX174- Hin cII digest (manufactured by Takara Shuzo) 2: Negative control 3: Example 1 4: Example 2-surfactant CTAB 5: Example 2-surfactant Span-20 6: Example 2 -Surfactant Tween-20 7: Example 2-Surfactant Triton X-100 8-10 Irrelevant data 11: Example 3-Salt concentration 0M 12: Example 3-Salt concentration 0.2M 13: Example 3-Salt 0.4M 14: Example 3-Salt 0.6M 15: Example 3-Salt 0.8M 16-irrelevant data.

【００６８】[0068]

【実施例６】市販ＤＮＡ抽出系との比較 Dynabeads DNA DIRECT System II(Dynabeads社）を用
い、説明書に記載の通り１００μｌの血液からＤＮＡを
抽出した。こうして得られたＤＮＡ、実施例１で単離し
たＤＮＡおよび実施例１で得られた溶出を行わずＤＮＡ
が吸着された粒子をそれぞれ鋳型として、実施例５と同
一のプライマーおよび反応条件を用いてＰＣＲを行っ
た。Example 6 Comparison with Commercial DNA Extraction System DNA was extracted from 100 μl of blood as described in the instruction manual using Dynabeads DNA DIRECT System II (Dynabeads). The DNA thus obtained, the DNA isolated in Example 1 and the non-eluted DNA obtained in Example 1
PCR was carried out using the particles adsorbed with as a template and using the same primers and reaction conditions as in Example 5.

【００６９】増幅されたＤＮＡの電気泳動写真を図６に
示す。図６の各レーンは以下の通りである(左側よ
り）。１〜３：無関係４：Dynabeads DNA DIRECT System II ５：実施例１、溶出されたＤＮＡ６：Dynabeads DNA DIRECT System II ７：実施例１、核酸吸着固相支持体ＡAn electrophoretic photograph of the amplified DNA is shown in FIG. Each lane in FIG. 6 is as follows (from the left side). 1-3: Irrelevant 4: Dynabeads DNA DIRECT System II 5: Example 1, eluted DNA 6: Dynabeads DNA DIRECT System II 7: Example 1, nucleic acid adsorbing solid phase support A

【００７０】市販のDynabeads DNA DIRECT System IIで
は、目的物以外にも弱いバンドがいくつか認められた
が、実施例１で得たＤＮＡ試料からは、目的のＤＮＡの
みが増幅されたことがわかる。市販品では１００μｌと
いう比較的多量の血液をそのまま取り扱うのには無理が
あるようである。In the commercially available Dynabeads DNA DIRECT System II, some weak bands other than the target were observed, but it can be seen from the DNA sample obtained in Example 1 that only the target DNA was amplified. It seems that it is difficult for a commercial product to handle a relatively large amount of blood of 100 μl as it is.

【００７１】[0071]

【実施例７】少量の血液から抽出したＤＮＡの増幅ＥＤＴＡを血液１ｍｌに対して１．５ｍｇ加えて非凝固
処理したヒト末梢血１０μｌを実施例１と同じ溶解液
０.４ｍｌと混合、攪拌した。続いてすぐに固相支持体
Ａ５ｍｇを添加し、１０分間攪拌した。フィルターにて
溶解液を除去した後、固相支持体Ａを新たな溶解液で１
回、次いで実施例１と同じ洗浄液にて２回洗浄し、次い
でアルコール分を乾燥させた。次いで得られた核酸吸着
固相支持体Ａを５０μｌの滅菌水中へ懸濁させた。懸濁
液から１０μｌを分取してこれを鋳型とし、ＰＣＲ反応
に供した。または、同様にして得たＤＮＡ吸着固相支持
体粒子Ａへ滅菌水５０μｌを添加し、８０℃に１０分間
加熱してＤＮＡを水中に溶出させた。次いでフィルター
により濾過して担体粒子を除き、得られたＤＮＡ溶液１
０μｌをＰＣＲへ供した。Example 7 Amplification of DNA extracted from a small amount of blood 1.5 mg of EDTA was added to 1 ml of blood, and 10 μl of non-coagulated human peripheral blood was mixed with 0.4 ml of the same lysate as in Example 1 and stirred. . Immediately thereafter, 5 mg of solid phase support A was added and stirred for 10 minutes. After removing the dissolution liquid with a filter, the solid support A was replaced with a new dissolution liquid 1
It was washed twice, then twice with the same washing solution as in Example 1, and then the alcohol content was dried. Then, the obtained nucleic acid-adsorbed solid phase support A was suspended in 50 μl of sterile water. From the suspension, 10 μl was taken and used as a template for PCR reaction. Alternatively, 50 μl of sterilized water was added to the DNA-adsorbed solid phase support particles A obtained in the same manner, and heated at 80 ° C. for 10 minutes to elute the DNA in water. Then, the solution is filtered through a filter to remove the carrier particles, and the obtained DNA solution 1
0 μl was subjected to PCR.

【００７２】ＰＣＲ反応は、それぞれ実施例５と同じ条
件にて行った。増幅されたＤＮＡを実施例１と同様にし
て電気泳動にかけた。結果を図７に示す。図７中、右か
ら５列目が溶出したＤＮＡを、６列目がＤＮＡ吸着固相
支持体粒子をそれぞれ鋳型としてＰＣＲを実施した場合
の結果である。The PCR reaction was carried out under the same conditions as in Example 5. The amplified DNA was electrophoresed as in Example 1. The results are shown in Fig. 7. In FIG. 7, the fifth column from the right shows the results when PCR was carried out using the eluted DNA, and the sixth column shows the results when PCR was carried out using the DNA-adsorbed solid phase support particles as templates.

【００７３】[0073]

【実施例８】固相支持体粒子の相違血液１０μｌを、実施例１と同じ溶解液０.４ｍｌと混
合、攪拌した。固相支持体として以下のものを用いた：１）固相支持体Ａ２）２−ヒドロキシエチルメタクリレートとエチレング
リコールジメタクリレートの共重合体多孔質微粒子（Ｅ
Ｇ）粒径：１００μｍ（６０〜１４０μｍ）孔径：約２５００Å 重合比：２−ヒドロキシエチルメタクリレート：エチレ
ングリコールジメタクリレート：トリ（メタクリロイル
オキシエチル）リン酸＝５：４：１３）シリカゲルコスモシール７５Ｃ₁₈−ＯＰＮ(ナカ
ライテスク社製）平均粒径７５μｍ(分布４２〜１０５μｍ）平均細孔径１２０Å ４）架橋セルロースセルロファインＧＬ-２０００(チ
ッソ社製）膨潤時粒径４５〜１０５μｍ分画タンパク質分子量〜３００００００５）デキストラン粒子 Sephadex Ｇ-１５０ (ファル
マシア社製）膨潤時粒径１１５〜３５０μｍ分画タンパク質分子量５×１０³〜３×１０⁵ ６）アガロース粒子 Sepharose ４Ｂ（ファルマシア
社製）膨潤時粒径４５〜１６５μｍ分画タンパク質分子量６×１０⁴〜２×１０⁷ それぞれを、固相支持体Ａ２０ｍｇと同体積となるよう
添加し、室温で１０分間攪拌した。続いてフィルター濾
過にて溶解液を除き、粒子を新たな溶解液、次いで実施
例１と同じ洗浄液で洗浄した後、アルコール分を乾燥さ
せた。得られた粒子へ滅菌水１００μｌをそれぞれ添加
し、攪拌した後８０℃、１０分間加熱してＤＮＡを抽出
した。フィルター濾過により粒子を除き、ＤＮＡ溶液を
回収した。なお、Sepharose ４Ｂについては、８０℃で
溶解するため溶出作業を３７℃にて行った。また、比較
のため実施例１と同じ固相支持体についても３７℃の溶
出作業を行った。[Example 8] Difference in solid phase support particles 10 µl of blood was mixed with 0.4 ml of the same lysate as in Example 1 and stirred. The following were used as the solid support: 1) Solid support A 2) Copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate Porous fine particles (E
G) Particle size: 100 μm (60 to 140 μm) Pore size: Approximately 2500Å Polymerization ratio: 2-Hydroxyethyl methacrylate: Ethylene glycol dimethacrylate: Tri (methacryloyloxyethyl) phosphoric acid = 5: 4: 1 3) Silica gel Cosmo Seal 75C ₁₈ -OPN (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) Average particle size 75 μm (distribution 42 to 105 μm) Average pore size 120Å 4) Crosslinked cellulose Cellulofine GL-2000 (manufactured by Chisso) Particle size upon swelling 45 to 105 μm Fractionated protein molecular weight to 3000000 5 ) Dextran particles Sephadex G-150 (manufactured by Pharmacia) Particle size upon swelling 115-350 μm Fractionated protein molecular weight 5 × 10 ^{3 to} 3 × 10 ⁵ 6) Agarose particles Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) Particle size upon swelling 45-165 μm fractionated protein molecular weight 6 × 10 ⁴ ~ × 10 ^7, respectively, was added so that the same volume and the solid support A20mg, and stirred at room temperature for 10 min. Subsequently, the solution was removed by filtration with a filter, the particles were washed with a new solution, and then with the same washing solution as in Example 1, and then the alcohol content was dried. 100 μl of sterilized water was added to each of the obtained particles, stirred and heated at 80 ° C. for 10 minutes to extract DNA. The particles were removed by filtration with a filter, and the DNA solution was recovered. Note that Sepharose 4B was dissolved at 80 ° C., so that elution was performed at 37 ° C. For comparison, the same solid phase support as in Example 1 was subjected to the elution work at 37 ° C.

【００７４】得られたＤＮＡ溶液を実施例１と同様にし
て電気泳動にかけた。結果を図８に示す。なお図８のレ
ーンは以下の通りである(左側より）。レーン１：分子量マーカーλ-Hind III digest（宝酒造
社製）レーン２：実施例１の固相支持体Ａ（８０℃にて溶出）レーン３：ＥＧレーン４：コスモシール７５Ｃ１８レーン５：セルロファインＪＣＬ-２０００レーン６：Sephadex Ｇ-１５０レーン７：Sepharose ４Ｂレーン８：実施例１の固相支持体Ａ(３７℃にて溶出）The obtained DNA solution was subjected to electrophoresis in the same manner as in Example 1. The results are shown in Fig. 8. The lanes in FIG. 8 are as follows (from the left side). Lane 1: Molecular weight marker λ- Hind III digest (manufactured by Takara Shuzo) Lane 2: Solid phase support A of Example 1 (eluted at 80 ° C) Lane 3: EG Lane 4: Cosmo Seal 75C18 Lane 5: Cellulofine JCL-2000 Lane 6: Sephadex G-150 Lane 7: Sepharose 4B Lane 8: Solid support A of Example 1 (eluted at 37 ° C.)

【００７５】レーン６はバンドが太くＤＮＡ量が多い
が、ＤＮＡ溶出液が着色するほどの不純物を含有してい
る。レーン２、３および８のみにおいて、実質的な溶出
が認められた。Lane 6 has a thick band and a large amount of DNA, but contains impurities to the extent that the DNA eluate is colored. Substantial elution was observed only in lanes 2, 3 and 8.

【００７６】[0076]

【実施例９】実施例８で得られた各溶出液１０μｌを、
実施例５と同じ条件にてＰＣＲ反応に供した。増幅され
たＤＮＡを実施例１と同様にして電気泳動にかけた。結
果を図９に示す。なお、図９の各レーンは、以下の通り
である：レーン１：分子量マーカーφＸ１７４−Hinc II digest
（宝酒造社製）レーン２：陰性コントロールレーン３：実施例１の固相支持体Ａ(８０℃にて溶出）レーン４：ＥＧレーン５：コスモシール７５Ｃ１８レーン６：セルロファインＪＣＬ-２０００レーン７：Sephadex Ｇ-１５０レーン８：Sepharose ４Ｂレーン９：実施例１の固相支持体Ａ(３７℃にて溶出）レーン１０：無関係のデータExample 9 10 μl of each eluate obtained in Example 8
The PCR reaction was performed under the same conditions as in Example 5. The amplified DNA was electrophoresed as in Example 1. The results are shown in Fig. 9. The respective lanes in FIG. 9 are as follows: Lane 1: molecular weight marker φX174- Hin c II digest
(Manufactured by Takara Shuzo) Lane 2: Negative control Lane 3: Solid phase support A of Example 1 (eluted at 80 ° C) Lane 4: EG Lane 5: Cosmoseal 75C18 Lane 6: Cellulofine JCL-2000 Lane 7: Sephadex G-150 Lane 8: Sepharose 4B Lane 9: Solid support A of Example 1 (eluted at 37 ° C.) Lane 10: Irrelevant data.

【００７７】上記よりレーン３、４および９、即ち固相
支持体Ａおよびリン酸エステル部分を含有する固相支持
体であるＥＧを用いて抽出したＤＮＡのみが増幅され、
その他の担体で抽出されたＤＮＡは増幅されていなかっ
た。From the above, only DNA extracted using lanes 3, 4 and 9, ie, solid phase support A and EG which is a solid phase support containing a phosphate ester moiety, is amplified,
The DNA extracted with other carriers was not amplified.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１の電気泳動の結果を示す写真であ
る。FIG. 1 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 1.

【図２】実施例２の電気泳動の結果を示す写真であ
る。2 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 2. FIG.

【図３】実施例３の電気泳動の結果を示す写真であ
る。FIG. 3 is a photograph showing the result of electrophoresis in Example 3.

【図４】実施例４の電気泳動の結果を示す写真であ
る。FIG. 4 is a photograph showing the result of electrophoresis in Example 4.

【図５】実施例５の電気泳動の結果を示す写真であ
る。5 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 5. FIG.

【図６】実施例６の電気泳動の結果を示す写真であ
る。6 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 6. FIG.

【図７】実施例７の電気泳動の結果を示す写真であ
る。7 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 7. FIG.

【図８】実施例８の電気泳動の結果を示す写真であ
る。FIG. 8 is a photograph showing the results of electrophoresis in Example 8.

【図９】実施例９の電気泳動の結果を示す写真であ
る。9 is a photograph showing the result of electrophoresis in Example 9. FIG.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山本良平大阪府寝屋川市下木田町14番５号倉敷紡績株式会社技術研究所内 (56)参考文献特公平７−62054（ＪＰ，Ｂ２) 特表平４−501959（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07H 21/00 - 21/04 C12N 11/00 - 11/18 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Ryohei Yamamoto 14-5 Shimokita Town, Neyagawa City, Osaka Kurashiki Spinning Co., Ltd. Technical Research Institute (56) References Japanese Patent Publication 7-62054 (JP, B2) Flat 4-501959 (JP, A) (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/00-15/90 C07H 21/00-21/04 C12N 11/00-11/18 MEDLINE (STN) BIOSIS / WPI (DIALOG) PubMed

Claims

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims]

【請求項１】核酸を含む試料を界面活性剤、塩、緩衝
剤およびキレート剤を含む溶解液と混合する工程、得られる混合液を、構造単位の少なくとも一部にリン酸
エステル部分を有し、ヌクレオチド部分を含まない重合
体であって、親水性の表面を有する固相支持体に接触さ
せる工程、固相支持体を溶解液から分離する工程、を含む核酸の抽出方法。1. A sample surfactant comprising a nucleic acid, salts, mixing with solution containing a buffering agent and a chelating agent, the resulting mixture, have a phosphate moiety on at least a portion of the structural units A method of extracting a nucleic acid, which comprises a step of contacting a solid phase support having a hydrophilic surface with a polymer not containing a nucleotide portion, and a step of separating the solid phase support from a solution.

【請求項２】さらに固相支持体から核酸を分離する工
程を含む、請求項１記載の方法。2. The method according to claim 1, further comprising the step of separating the nucleic acid from the solid support.

【請求項３】固相支持体が以下のモノマー[I]：【化１】［式中、Ｒは水素原子またはメチル基、ｎは０〜３０の
数を示し、ｍは０〜３０の数を示す。但し、ｍ＋ｎ≧１
である。］を重合成分の少なくとも一部として含むモノ
マー成分を、該モノマーと重合可能な親水性モノマーと
共重合して得られる重合体である、請求項１記載の方
法。3. A solid support having the following monomer [I]: [In the formula, R represents a hydrogen atom or a methyl group, n represents a number from 0 to 30, and m represents a number from 0 to 30. However, m + n ≧ 1
Is. The method according to claim 1, which is a polymer obtained by copolymerizing a monomer component containing [] as at least a part of the polymerization component with a hydrophilic monomer polymerizable with the monomer.

【請求項４】核酸がＤＮＡである、請求項１記載の方
法。4. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is DNA.

【請求項５】核酸を含む試料が、血液である請求項１
記載の方法。5. The sample containing nucleic acid is blood.
The method described.

【請求項６】界面活性剤、塩、緩衝剤およびキレート
剤を含む溶解液、および構造単位の少なくとも一部にリ
ン酸エステル部分を有し、ヌクレオチド部分を含まない
重合体であって、親水性の表面を有する固相支持体を含
む、核酸抽出用キット。6. The surfactants possess salt, solution containing a buffering agent and a chelating agent, and at least a portion phosphate moiety to the structural unit, there in <br/> polymer containing no nucleotide portion And a kit for nucleic acid extraction, comprising a solid support having a hydrophilic surface.