JP3380133B2 - Novel nitrile hydratase - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、シュードノカルデ
ィア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ＪＣＭ３０９５、以下単にシ
ュードノカルディア・サーモフィラと呼ぶ）由来のニト
リルヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニット
をコードする新規なアミノ酸配列、該酵素のαサブユニ
ット及びβサブユニットをコードする新規な遺伝子配列
に関する。さらに、該遺伝子を含有する組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドにより形質転換された形質転換
菌株、該形質転菌株を用いてニトリルヒドラターゼを産
生する方法及び該形質転換菌株を培養して得られる培養
液・菌体・菌体処理物を用いてニトリル化合物から対応
するアミド化合物を製造する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to Pseudonocardia thermophila ( Pseudonocardia).
thermophila JCM3095, hereinafter simply referred to as Pseudonocardia thermophila ), a novel amino acid sequence encoding the α-subunit and β-subunit of nitrile hydratase, Regarding gene sequences. Furthermore, a recombinant plasmid containing the gene, a transformant strain transformed with the recombinant plasmid, a method for producing nitrile hydratase using the transformant strain, and a culture obtained by culturing the transformant strain The present invention relates to a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using a liquid, a bacterial cell, or a treated bacterial cell product.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ニトリル化合物のニトリル基を水和して
アミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術
は、酸またはアルカリの存在下や銅触媒の存在下で加熱
処理する化学的な方法が従来より知られていた。一方、
近年ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水
和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見
され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用
いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造す
る方法が既に開示されている（特公昭５６−１７９１
８、同６２−２１５１９、同６２−３１９１４、同５９
−３７９５１、特公平４−４８７３、同６−５５１４
８）。この製造方法は従来の化学的な方法と比べて、ニ
トリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び
選択率が高い等のメリットが知られている。2. Description of the Related Art A technique for producing a corresponding amide compound by hydrating a nitrile group of a nitrile compound to convert it to an amide group is a chemical method in which heat treatment is performed in the presence of an acid or an alkali or in the presence of a copper catalyst. Was previously known. on the other hand,
Recently, a nitrile hydratase, which is an enzyme having a nitrile hydration activity for hydrating a nitrile group and converting it to an amide group, has been discovered, and a corresponding amide compound is obtained from a nitrile compound by using the enzyme or a microbial cell containing the enzyme. Has already been disclosed (Japanese Patent Publication No. 56-1791).
8, 62-21519, 62-31914, 59.
-37951, Japanese Patent Publication No. 4-4873, 6-5514
8). This manufacturing method is known to have advantages such as high conversion and selectivity of a nitrile compound to a corresponding amide compound as compared with conventional chemical methods.

【０００３】ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化
合物よりアミド化合物を工業的に製造するためには、ア
ミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを
下げることが重要であり、より具体的には単位微生物重
量・単位時間あたりのアミド化合物の生成速度（以下、
菌体活性と呼ぶ）を高くする必要がある。そこで、該酵
素の遺伝子を用いて遺伝子工学の手法により該酵素を大
量に発現させることを目的として、該酵素の遺伝子をク
ローニングする試みが検討されている。例えば、コリネ
バクテリウム属（特開平２−１１９７７８）、シュード
モナス属（特開平３−２５１１８４）、ロドコッカス属
ロドクロウス種（特開平４−２１１３７９）、リゾビウ
ム属（特開平６−２５２９６）、クレビシエラ属（特開
平６−３０３９７１）を挙げることができる。但し、コ
リネバクテリウム属及びロドコッカス属ロドクロウス種
の場合は、大腸菌での形質転換菌株のニトリルヒドラタ
ーゼ活性は極微弱なものであったとの報告（ＴＩＢＴＥ
ＣＨ Ｖｏｌ．１０，ｐｐ４０２〜４０８，１９９２
年）があり、遺伝子工学の手法を用いれば高い菌体活性
を有する形質転換菌体が必ず得られる訳ではなかった。In order to industrially produce an amide compound from a nitrile compound using nitrile hydratase, it is important to reduce the production cost of the enzyme in the production cost of the amide compound. More specifically, the unit Microbial weight, production rate of amide compound per unit time (hereinafter,
It is necessary to increase the cell activity). Therefore, attempts are being made to clone the gene of the enzyme for the purpose of expressing the enzyme in a large amount by a genetic engineering method using the gene of the enzyme. For example, genus Corynebacterium (JP-A-2-119778), genus Pseudomonas (JP-A-3-251184), Rhodococcus sp. Kaihei 6-303971) can be mentioned. However, in the case of Rhodococcus spp. Of Corynebacterium spp. And Rhodococcus spp., It was reported that the nitrile hydratase activity of the transformant strain of E. coli was extremely weak (TIBTE
CH Vol. 10, pp402-408, 1992
However, it was not always possible to obtain transformed bacterial cells having high bacterial activity by using genetic engineering techniques.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ニトリ
ルヒドラターゼ活性を有する微生物として本発明者らに
より見い出されたシュードノカルディア・サーモフィラ
ＪＣＭ３０９５よりニトリルヒドラターゼ遺伝子を単離
し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らか
にすることに成功し、また該遺伝子を大量に発現する遺
伝子組換え菌株を作出することにも成功し、本願発明を
完成させるに至った。The present inventors isolated the nitrile hydratase gene from Pseudonocardia thermophila JCM3095, which was found by the present inventors as a microorganism having nitrile hydratase activity, and isolated its amino acid sequence. Moreover, the inventors have succeeded in clarifying the gene sequence for the first time, and have succeeded in producing a gene recombinant strain that expresses the gene in a large amount, thus completing the present invention.

【０００５】すなわち、本発明の目的は、シュードノカ
ルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの
アミノ酸配列および遺伝子配列を提供することである。
さらに該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラ
スミドを含む形質転換菌株、該形質転換菌株を用いた該
酵素の産生方法および該形質転換菌株を用いたニトリル
化合物からの対応するアミド化合物の製造方法を提供す
ることである。That is, an object of the present invention is to provide an amino acid sequence and a gene sequence of nitrile hydratase derived from Pseudonocardia thermophila.
Furthermore, a recombinant plasmid containing the gene, a transformant strain containing the recombinant plasmid, a method for producing the enzyme using the transformant strain, and a method for producing a corresponding amide compound from a nitrile compound using the transformant strain Is to provide.

【０００６】[0006]

【発明実施の形態】以下本発明を概説すると、本発明の
ニトリルヒドラターゼは配列表の配列番号１および２に
示すアミノ酸配列により基本的に構成されるが、同じ塩
基配列の遺伝子を鋳型として転写・翻訳された場合であ
っても、それを導入する宿主の種類、培養に使用する栄
養培地の成分や組成、培養時の温度やｐＨ等によって
は、遺伝子発現後の宿主内酵素による修飾などにより、
所期の酵素作用は保持しているものの配列表におけるＮ
末端付近のアミノ酸の１個または２個以上が欠失した
り、Ｎ末端に１個または２個以上のアミノ酸が新たに付
加した変異体を産生することがある。さらに、組換えＤ
ＮＡ技術の進歩により酵素の作用を実質的に変えること
なく比較的容易にその構成アミノ酸の１個または２個以
上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入でき
るようにもなった。また、その構成アミノ酸の１個また
は２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは
挿入することにより、有機溶媒耐性の向上や基質特異性
の変化等の産業上の利用価値の高い性質を付加した変異
酵素を作出する試みも行われている。かかる技術水準に
鑑み、この発明でいうニトリルヒドラターゼとは、配列
表における配列番号：１および２に示すアミノ酸配列を
そのまま具備するものは言うにおよばず、１個または２
個以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除も
しくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であって
も、それがニトリルヒドラターゼ活性を有している場合
は本発明に包含されるものとする。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be outlined below. The nitrile hydratase of the present invention is basically composed of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 of the Sequence Listing, but is transcribed using a gene having the same nucleotide sequence as a template. -Even when translated, depending on the type of host into which it is introduced, the components and composition of the nutrient medium used for culture, the temperature and pH during culture, etc., it may be modified by enzymes in the host after gene expression. ,
N in the sequence listing, although retaining the desired enzyme action
One or more amino acids near the terminal may be deleted, or a mutant in which one or more amino acids are newly added to the N-terminal may be produced. Furthermore, recombinant D
Advances in NA technology have made it possible to relatively easily substitute, delete, delete or insert one or more of the constituent amino acids with other amino acids without substantially changing the action of the enzyme. Further, by substituting, deleting, deleting or inserting one or more of the constituent amino acids with another amino acid, properties having high industrial utility value such as improvement in organic solvent resistance and change in substrate specificity Attempts have also been made to create a mutant enzyme with added. In view of such a state of the art, the nitrile hydratase referred to in the present invention is not limited to one having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing as they are, and one or two.
Even if it is a variant having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, deleted or inserted with other amino acids, it is included in the present invention when it has nitrile hydratase activity And

【０００７】すなわち、本発明は、配列表の配列番号：
１に示される２０５個のアミノ酸の配列により示される
αサブユニットおよび配列表の配列番号：２に示される
２３３個のアミノ酸の配列により示されるβサブユニッ
トにより構成されるニトリルヒドラターゼである。ま
た、本発明においては、配列表の配列番号：１または２
に示されるアミノ酸配列の一部が置換、欠失、削除また
は挿入して得られるαサブユニットとβサブユニットの
いずれか一方または双方を構成要素として含み、かつ、
ニトリル水和活性を保持している場合は、本発明のニト
リルヒドラターゼに含まれるものとする。That is, according to the present invention, SEQ ID NO: in the sequence listing:
It is a nitrile hydratase composed of an α subunit represented by the sequence of 205 amino acids shown in 1 and a β subunit represented by the sequence of 233 amino acids shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Further, in the present invention, SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing
Part of the amino acid sequence shown in, including, as a constituent, one or both of the α subunit and β subunit obtained by substitution, deletion, deletion or insertion, and,
When it retains nitrile hydration activity, it is included in the nitrile hydratase of the present invention.

【０００８】本発明においては、配列表の配列番号：１
に示される２０５個のアミノ酸の配列により示されるα
サブユニットをコードしている塩基配列は、本発明のニ
トリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝
子の範囲に含まれる。また、本発明においては、配列表
の配列番号：１に示されるアミノ酸配列の一部が置換、
欠失、削除または挿入して得られるαサブユニットを構
成要素に含むニトリルヒドラターゼがニトリル水和活性
を保持している場合には、該αサブユニットをコードす
る塩基配列も本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子の範
囲に含まれる。同様に、配列表の配列番号：２に示され
る２３３個のアミノ酸の配列により示されるβサブユニ
ットをコードしている塩基配列は、本発明のニトリルヒ
ドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子の範囲
に含まれる。また、本発明においては、配列表の配列番
号：２に示されるアミノ酸配列の一部が置換、欠失、削
除または挿入して得られるβサブユニットを構成要素に
含むニトリルヒドラターゼがニトリル水和活性を保持し
ている場合には、該βサブユニットをコードする塩基配
列も本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子の範囲に含ま
れる。In the present invention, SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
Α represented by the sequence of 205 amino acids shown in
The nucleotide sequence encoding the subunit is included in the range of the gene encoding the α subunit of nitrile hydratase of the present invention. Further, in the present invention, a part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is replaced,
When the nitrile hydratase containing the α subunit obtained by deletion, deletion or insertion as a component retains the nitrile hydration activity, the nucleotide sequence encoding the α subunit is also the nitrile hydrase of the present invention. Included within the scope of the Tase gene. Similarly, the base sequence encoding the β subunit represented by the sequence of 233 amino acids shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is the range of the gene encoding the β subunit of nitrile hydratase of the present invention. include. Further, in the present invention, a nitrile hydratase containing a β subunit as a constituent element obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a nitrile hydrate. When the activity is retained, the nucleotide sequence encoding the β subunit is also included in the scope of the nitrile hydratase gene of the present invention.

【０００９】本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、
配列表の配列番号３および４に示す塩基配列により基本
的に構成されるが、組換えＤＮＡ技術の進歩により酵素
のアミノ酸配列を実質的に変えることなく比較的容易に
翻訳の際の鋳型となるＤＮＡの塩基配列を他の塩基配列
で置換できるようになった。さらに、翻訳の際の鋳型と
なるＤＮＡの塩基配列を置換、欠失、削除もしくは挿入
することにより、酵素の作用を実質的に変えることなく
その構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸
で置換、欠失、削除または挿入させることもできるよう
になった。かかる技術水準に鑑み、この発明でいうニト
リルヒドラターゼ遺伝子とは、配列表における配列番
号：３および４に示すＤＮＡ塩基配列をそのまま具備す
るものは言うにおよばず、そのＤＮＡ塩基配列の１個ま
たは２個以上の塩基が他の塩基に置換、欠失、削除もし
くは挿入された変異体であっても、それがニトリルヒド
ラターゼ活性を有するタンパク質の鋳型として機能でき
る限りは本発明に包含されるものとする。すなわち、本
発明は、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子であ
って、αサブユニットが配列表の配列番号：３に示され
る６１８個の塩基配列により構成され、βサブユニット
が配列表の配列番号：４に示される７０２個の塩基配列
により構成されるものを含んでいる。また、本発明にお
いては、配列表の配列番号：３の塩基配列の一部を置
換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列により
コードされるアミノ酸配列により得られるαサブユニッ
トまたは配列表の配列番号：４の塩基配列の一部を置
換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列により
コードされるアミノ酸配列により得られるβサブユニッ
トのいずれか一方または双方を構成要素として含むタン
パク質がニトリル水和活性を有している場合には、本発
明のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれ
るものとする。The nitrile hydratase gene of the present invention is
It is basically composed of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 of the Sequence Listing, but it can be used as a template for translation relatively easily without substantially changing the amino acid sequence of the enzyme due to the progress of recombinant DNA technology. It has become possible to replace the base sequence of DNA with another base sequence. Furthermore, by substituting, deleting, deleting, or inserting a nucleotide sequence of a DNA serving as a template for translation, one or more of its constituent amino acids can be replaced with other amino acids without substantially changing the action of the enzyme. It has become possible to replace, delete, delete or insert with. In view of the state of the art, the nitrile hydratase gene referred to in the present invention is not limited to one having the DNA base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing as it is, and one of the DNA base sequences or Mutants in which two or more bases are substituted, deleted, deleted or inserted with other bases are included in the present invention as long as they can function as a template for a protein having nitrile hydratase activity. And That is, the present invention is a gene encoding nitrile hydratase, in which the α subunit is composed of 618 nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and the β subunit is SEQ ID NO: in the sequence listing: 4 includes a sequence composed of 702 bases shown in FIG. Further, in the present invention, an α subunit or a sequence listing obtained from an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing Of SEQ ID NO: 4 of SEQ ID NO: 4, a protein containing, as a constituent, either or both of the β subunits obtained by the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence obtained by substitution, deletion, deletion, or insertion Has nitrile hydration activity, it is included in the gene encoding the nitrile hydratase of the present invention.

【００１０】本発明は、本発明のニトリルヒドラターゼ
をコードする遺伝子が挿入された組換えプラスミドを構
築し、該組換えプラスミドを任意の微生物に導入して形
質転換体を得ることを含んでいる。さらに、得られた形
質転換体を一般的な栄養培地で培養して該酵素を産生さ
せ、該酵素を産生している該形質転換体を水性媒体中に
てニトリル化合物と接触させて対応するアミド化合物を
製造させることを含んでいる。The present invention comprises constructing a recombinant plasmid into which the gene encoding the nitrile hydratase of the present invention has been inserted, and introducing the recombinant plasmid into any microorganism to obtain a transformant. . Further, the obtained transformant is cultured in a general nutrient medium to produce the enzyme, and the transformant producing the enzyme is contacted with a nitrile compound in an aqueous medium to give a corresponding amide. Including producing a compound.

【００１１】本発明における組換えプラスミドとは、ニ
トリルヒドラターゼをコードする遺伝子が該遺伝子の発
現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域を含むプ
ラスミドベクターに挿入されたプラスミドであり、さら
に任意の宿主に導入されることで該酵素の産生が可能と
なるプラスミドのことである。ここでいう任意の宿主と
は、後述の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とく
に大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌等のバチル
ス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物も用いることがで
きる。発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列
（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾー
ム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示してい
る。具体的なプロモーター配列としては、大腸菌由来の
トリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクト
ースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由
来のＰLプロモーター及びＰRプロモーターや、枯草菌由
来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アル
カリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテ
アーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモ
ーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモ
ーターのように独自に改変・設計された配列も利用でき
る。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯
草菌由来の配列や本発明のようにシュードノカルディア
本来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の
宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものでは
ない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領
域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配
列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存
性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒ
ｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御
領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側
上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ニト
リルヒドラターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の
順に並ぶことが望ましい。また、その様な制御領域によ
りαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各
々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の
制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよ
い。The recombinant plasmid in the present invention is a plasmid in which a gene encoding nitrile hydratase is inserted into a plasmid vector containing a control region required for expression of the gene and a region required for autonomous replication, and further any It is a plasmid that enables the production of the enzyme when introduced into the host. Examples of the arbitrary host herein include Escherichia coli as in Examples described later, but are not particularly limited to Escherichia coli, and other microorganisms such as Bacillus subtilis Bacillus, yeast, actinomycetes, etc. Can be used. The control region required for expression indicates a promoter sequence (including an operator sequence that controls transcription), a ribosome binding sequence (SD sequence), a transcription termination sequence and the like. Specific promoter sequences include tryptophan operon-derived trp promoter, lactose operon-lac promoter, lambda phage-derived PL promoter and PR promoter, and Bacillus subtilis-derived gluconate synthase promoter (gnt) -alkaline protease promoter. (Apr) / neutral protease promoter (npr) / α-amylase promoter (amy). In addition, uniquely modified / designed sequences such as the tac promoter can also be used. Examples of the ribosome-binding sequence include sequences derived from Escherichia coli or Bacillus subtilis and sequences originally from Pseudonocardia as in the present invention, but are not particularly limited as long as they are sequences that function in a desired host such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. It is not something that will be done. For example, a consensus sequence having 4 or more consecutive bases complementary to the 3'terminal region of 16S ribosomal RNA may be prepared by DNA synthesis and used.
A transcription termination sequence is not always required, but is independent of ρ factor, such as lipoprotein terminator tr.
p operon terminator etc. can be used. Regarding the sequence order of these control regions on the recombinant plasmid, it is desirable that the promoter sequence, the ribosome binding sequence, the gene encoding nitrile hydratase, and the transcription termination sequence are arranged in this order from the 5'end upstream. The α subunit gene and the β subunit gene may be expressed as independent cistrons by such a control region, or may be expressed as a polycistron by a common control region.

【００１２】以上の要件を満たしているプラスミドベク
ターの例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を
有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１
０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有している
ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、
φ１０５等を挙げることができる。また、２種類以上の
宿主内での自律複製が可能なプラスミドベクターの例と
して、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７を
挙げることができる。Examples of the plasmid vector satisfying the above requirements are pBR322, pUC18 and Bluescr which have a region capable of autonomous replication in E. coli.
ipt II SK (+), pKK223-3, pSC1
01, pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, which has a region capable of autonomous replication in Bacillus subtilis.
φ105 and the like can be mentioned. Moreover, pHV14, TRp7, YEp7, and pBS7 can be mentioned as an example of the plasmid vector capable of autonomous replication in two or more types of hosts.

【００１３】該プラスミドベクターに本発明のニトリル
ヒドラターゼをコードする遺伝子を該遺伝子の発現に必
要な領域を有するプラスミドベクターに挿入して本発明
の組換えプラスミドを構築する方法、該組換えプラスミ
ドを所望の宿主に形質転換する方法及び該形質転換菌体
内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法としては、
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ
ｉｔｉｏｎ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら；Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されている分子生物学・
生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方
法と宿主を利用すればよい。尚、該形質転換菌株を培養
する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用い
られるが、より好ましくはそのような培地成分にＦｅイ
オン及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させる
とよい。A method for constructing the recombinant plasmid of the present invention by inserting the gene encoding the nitrile hydratase of the present invention into the plasmid vector into a plasmid vector having a region necessary for expression of the gene, The method for transforming into a desired host and the method for producing nitrile hydratase in the transformed cells include:
"Molecular Cloning 2nd Ed
edition ”(T. Maniatis et al .; Cold S
pring Harbor Laboratory P
molecular biology as described in Res., 1989).
General methods and hosts known in the field of biotechnology and genetic engineering may be used. In addition, LB medium, M9 medium and the like are generally used as a medium for culturing the transformant strain, but more preferably, Fe ions and Co ions are present in an amount of 0.1 μg / ml or more in such medium components. .

【００１４】また、本発明のニトリルヒドラターゼまた
は形質転換菌株を利用してニトリル化合物から対応する
アミド化合物を製造するには、所望のニトリル化合物を
該形質転換菌株の培養液、該形質転換菌株を培養して得
られる形質転換菌体、形質転換菌体の処理物または形質
転換菌体より分離・精製されたニトリルヒドラターゼと
水性媒体中で接触させればよい。接触させる温度は特に
限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが
失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜５
０℃である。ニトリル化合物としては、本発明のニトリ
ルヒドラターゼが基質として作用できる化合物であれば
特に限定されないが、好ましくはアセトニトリル、プロ
ピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロト
ノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等とい
った炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として
挙げられる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度
は、該ニトリル化合物の水性媒体中での最大溶解度を越
えない範囲内であれば特に限定されるものではないが、
好ましくは該ニトリル化合物による該酵素の失活を考慮
して５重量％以下、より好ましくは２重量％以下であ
る。Further, in order to produce a corresponding amide compound from a nitrile compound using the nitrile hydratase of the present invention or a transformant strain, the desired nitrile compound is added to a culture solution of the transformant strain, or the transformant strain. It may be brought into contact with a transformed bacterial cell obtained by culturing, a treated product of the transformed bacterial cell, or nitrile hydratase isolated and purified from the transformed bacterial cell in an aqueous medium. The contact temperature is not particularly limited, but is preferably within a temperature range in which the nitrile hydratase is not inactivated, and more preferably 0 ° C to 5 ° C.
It is 0 ° C. The nitrile compound is not particularly limited as long as it is a compound to which the nitrile hydratase of the present invention can act as a substrate, but preferably acetonitrile, propionitrile, acrylonitrile, methacrylonitrile, n-butyronitrile, isobutyronitrile, crotono. Typical examples thereof include nitrile compounds having 2 to 4 carbon atoms such as nitrile and α-hydroxyisobutyronitrile. The concentration of the nitrile compound in the aqueous medium is not particularly limited as long as it does not exceed the maximum solubility of the nitrile compound in the aqueous medium,
The amount is preferably 5% by weight or less, more preferably 2% by weight or less, in consideration of inactivation of the enzyme by the nitrile compound.

【００１５】本発明の配列表の配列番号１〜４に示すシ
ュードノカルシア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラ
ターゼのアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに至った
一連の工程を以下に要約した。尚、シュードノカルディ
ア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株であるが、本菌株は
理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２
−１）に番号ＪＣＭ３０９５として保管され、何人にも
請求により自由に分譲される。A series of steps leading to the elucidation of the amino acid sequence and the nucleotide sequence of Pseudonocarcia thermophila-derived nitrile hydratase shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 of the sequence listing of the present invention are summarized below. In addition, although it is Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain, this strain is a microbial strain preservation facility (2 Hirosawa, Wako City, Saitama Prefecture) of RIKEN.
It is stored under the number JCM3095 in -1) and is freely distributed to anyone by request.

【００１６】（１）該菌株を培養して得た菌体を破砕
後、硫安分画・陰イオン交換クロマトグラフィー・ゲル
ろ過クロマトグラフィー・疎水クロマトグラフィーによ
りニトリルヒドラターゼを精製し、αサブユニット及び
βサブユニットのＮ末端の７残基のアミノ酸配列を決定
した。(1) After crushing the cells obtained by culturing the strain, nitrile hydratase is purified by ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and hydrophobic chromatography to obtain α subunit and The amino acid sequence of the N-terminal 7 residues of the β subunit was determined.

【００１７】（２）決定されたＮ末端のアミノ酸配列に
基づいて遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを
作製し、該菌体から調製した染色体ＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行って増幅ＤＮＡ産物を得た。(2) An oligonucleotide primer for gene amplification was prepared based on the determined N-terminal amino acid sequence, and PCR was performed using the chromosomal DNA prepared from the cells as a template to obtain an amplified DNA product.

【００１８】（３）該染色体ＤＮＡを制限酵素により部
分的に切断して約１５００ｂｐ〜４０００ｂｐからなる
ＤＮＡ断片を採取した。このＤＮＡ断片をプラスミドベ
クターに連結し、大腸菌に形質転換してプラスミドライ
ブラリーを作製した。(3) The chromosomal DNA was partially cleaved with a restriction enzyme to obtain a DNA fragment of about 1500 bp to 4000 bp. This DNA fragment was ligated to a plasmid vector and transformed into Escherichia coli to prepare a plasmid library.

【００１９】（４）前記（２）の増幅ＤＮＡ産物をプロ
ーブとしたコロニーハイブリダイゼーションにより、ニ
トリルヒドラターゼをコードするＤＮＡ断片を含む陽性
クローンをプラスミドライブラリーから選択した。(4) A positive clone containing a DNA fragment encoding nitrile hydratase was selected from the plasmid library by colony hybridization using the amplified DNA product of (2) above as a probe.

【００２０】（５）該陽性クローンからプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、その挿入断片の全塩基配列を決定し、ニト
リルヒドラターゼのαサブユニット・βサブユニットを
コードする遺伝子の塩基配列を特定した。該塩基配列よ
り推定されるαサブユニット及びβサブユニットのアミ
ノ酸配列と前記（１）で得られた両サブユニットの７残
基のＮ末端のアミノ酸配列を比較し、該塩基配列がニト
リルヒドラターゼをコードしていることを確認した。(5) Plasmid DN from the positive clone
A was extracted, the entire base sequence of the inserted fragment was determined, and the base sequence of the gene encoding the α subunit / β subunit of nitrile hydratase was specified. The amino acid sequences of the α subunit and β subunit deduced from the nucleotide sequence were compared with the N-terminal amino acid sequences of 7 residues of both subunits obtained in (1) above, and the nucleotide sequence was determined to be nitrile hydratase. I confirmed that the code is

【００２１】（６）ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を前記（４）の陽性クローンのプラスミドよ
り再調製し、適当なプロモーターを含むプラスミドベク
ターに挿入した。(6) A DNA fragment containing the nitrile hydratase gene was re-prepared from the plasmid of the positive clone of (4) above and inserted into a plasmid vector containing an appropriate promoter.

【００２２】（７）前記（６）で得られたプラスミドを
適当な宿主菌に導入して形質転換体を得た。さらに、そ
の形質転換体を培養して得た菌体とアクリロニトリルを
水性媒体中で接触させることによりアクリルアミドが生
成することを確認した。(7) The plasmid obtained in (6) above was introduced into an appropriate host bacterium to obtain a transformant. Furthermore, it was confirmed that acrylamide was produced by contacting the cells obtained by culturing the transformant with acrylonitrile in an aqueous medium.

【００２３】[0023]

【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって何等限定される
ものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００２４】［実施例１］シュードノカルディア・サー
モフィラＪＣＭ３０９５株由来のニトリルヒドラターゼ
の精製 シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株
を０．２％のメタクリルアミドを含有する普通ブイヨン
培地（ｐＨ７．５）を用いて５０℃で３日間培養し、遠
心分離（８０００×Ｇ、３０分間）により湿菌体３ｇを
得た。これを７ｇのＫＰＢ（０．１Ｍリン酸カリウム水
溶液；ｐＨ７．０）に再懸濁し、超音波破砕機を用いて
菌体破砕液を調製した。菌体破砕液に２．７ｇの硫酸ア
ンモニウムを加えて４℃で１時間緩やかにかくはんした
後に、遠心分離（２５０００×Ｇ、３０分間）により不
溶物を除去した。遠心上清液９０ｇに１．２ｇの硫酸ア
ンモニウムを加えて４℃で１時間緩やかにかくはんした
後に、遠心分離（２５０００×Ｇ、３０分間）により沈
殿物を得た。該沈殿物を１ｍｌのＫＰＢに溶解し、２Ｌ
の同液に対して４℃で４８時間透析を行った。被透析液
を東ソー社のＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ
（カラムサイズ５×６φｃｍ）を用いた陰イオン交換ク
ロマトグラフィーに供した。展開液はＫＰＢを用い、塩
化カリウムによる０Ｍから０．５Ｍまでの濃度勾配溶出
を行ってニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。
次に該活性画分液をファルマシア社製のＳＵＰＥＲＤＥ
Ｘ２００−２６／６０を担体としたゲルろ過クロマトグ
ラフィーに供した。展開液は０．２Ｍ塩化カリウムを含
むＫＰＢを用い、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分
のみを回収した。続いて該活性画分液を東ソー社製のＴ
ＳＫｇｅｌ ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラム（ＨＰＬＣ
用）用いた疎水クロマトグラフィーに供した。２０％飽
和濃度の硫酸アンモニウムを含むＫＰＢにより平衡化さ
せたカラムに試料を吸着させ、硫酸アンモニム濃度を２
０％飽和から０％飽和まで一定の勾配で減少させて活性
画分を得た。Example 1 Purification of Nitrile Hydratase Derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 Strain Pseudonocardia thermophila JCM3095 was prepared from normal broth medium (pH 7.5) containing 0.2% methacrylamide. Was cultured at 50 ° C. for 3 days and centrifuged (8000 × G, 30 minutes) to obtain 3 g of wet cells. This was resuspended in 7 g of KPB (0.1 M potassium phosphate aqueous solution; pH 7.0), and a cell disruption solution was prepared using an ultrasonic disruptor. After 2.7 g of ammonium sulfate was added to the disrupted cell suspension and gently stirred at 4 ° C. for 1 hour, the insoluble matter was removed by centrifugation (25000 × G, 30 minutes). 1.2 g of ammonium sulfate was added to 90 g of the centrifugation supernatant and gently stirred at 4 ° C. for 1 hour, and then a precipitate was obtained by centrifugation (25,000 × G, 30 minutes). Dissolve the precipitate in 1 ml KPB,
This solution was dialyzed for 48 hours at 4 ° C. To-be-dialysed liquid is DEAE-TOYOPEARL650M of Tosoh Corporation.
It was subjected to anion exchange chromatography using (column size 5 × 6 φcm). Using KPB as a developing solution, elution with a concentration gradient from 0 M to 0.5 M with potassium chloride was performed to obtain a fraction containing nitrile hydratase activity.
Next, the active fraction liquid was added to SUPERDE manufactured by Pharmacia.
It was subjected to gel filtration chromatography using X200-26 / 60 as a carrier. As a developing solution, KPB containing 0.2 M potassium chloride was used, and only a fraction containing nitrile hydratase activity was collected. Subsequently, the active fraction liquid was treated with T
SKgel phenyl-5PW column (HPLC
It was subjected to the hydrophobic chromatography used. The sample was adsorbed on a column equilibrated with KPB containing 20% saturated ammonium sulfate, and the ammonium sulfate concentration was adjusted to 2
The active fraction was obtained by a constant gradient reduction from 0% saturation to 0% saturation.

【００２５】以上のクロマトグラフィーにおけるニトリ
ルヒドラターゼ活性の測定は、以下のように行った。各
画分液をＫＰＢにより適当に希釈し、これに１重量％の
アクリロニトリルを添加して１０℃で１０分間反応させ
た。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して
反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度をＨＰＬ
Ｃ分析により測定した。ＨＰＬＣカラムはＵＬＴＲＯＮ
８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸
水溶液を展開液として使用した。アクリルアミドは２２
０ｎｍの吸光度により検出した。The nitrile hydratase activity in the above chromatography was measured as follows. Each fraction solution was appropriately diluted with KPB, 1% by weight of acrylonitrile was added thereto, and the mixture was reacted at 10 ° C for 10 minutes. To the reaction solution, an equal amount of 1M phosphoric acid aqueous solution was added to stop the reaction, and the concentration of acrylamide produced was adjusted to HPL.
It was measured by C analysis. HPLC column is ULTRON
80 HG (50 × 8 φmm) was used, and a 10 mM phosphoric acid aqueous solution was used as a developing solution. 22 for acrylamide
Detection was by absorbance at 0 nm.

【００２６】疎水クロマトグラフィーでの活性画分液を
用いて還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、２９Ｋダルトン及び３２Ｋダルトンの２本の主要な
ポリペプチド鎖と４５Ｋダルトン以上の３本の薄いポリ
ペプチド鎖の存在が認められた。他のニトリルヒドラタ
ーゼの還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、一般的に
３０±３Ｋダルトンのポリペプチド鎖が２種類観察され
る。そこで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの２９Ｋダルトンと
３２Ｋダルトンの２本の主要なポリペプチド鎖をザナト
リウス社製のセミドライ型ブロッティング装置を用いて
バイオラッド社製のＰＶＤＦ膜に吸着させた。ＰＶＤＦ
膜から目的のポリペプチド鎖が吸着している部分のみを
切り出し、それぞれのＮ末端のアミノ酸配列を島津製作
所製のペプチドシークエンサーＰＳＱ−１を用いて解析
した。その結果、２９Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ
末端のアミノ酸配列は、配列表の配列番号：１記載のア
ミノ酸配列の２番目から８番目に相当するＴｈｒ−Ｇｌ
ｕ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓであり、
３２Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸配
列は、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列の１番
目から７番目に相当するＭｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌであった。When SDS-PAGE was carried out under reducing conditions using the active fractions obtained by the hydrophobic chromatography, two major polypeptide chains of 29K dalton and 32K dalton and three major chains of 45K dalton or more were detected. The presence of thin polypeptide chains was noted. In SDS-PAGE under the reducing conditions of other nitrile hydratase, generally, two types of polypeptide chains of 30 ± 3 KDa are observed. Therefore, two major polypeptide chains of 29 K dalton and 32 K dalton of SDS-PAGE gel were adsorbed on a PVDF membrane manufactured by Bio-Rad using a semi-dry type blotting apparatus manufactured by Zanatrius. PVDF
Only the portion where the desired polypeptide chain was adsorbed was cut out from the membrane, and the N-terminal amino acid sequence of each was analyzed using a peptide sequencer PSQ-1 manufactured by Shimadzu. As a result, the N of the 29 K dalton polypeptide chain was
The terminal amino acid sequence is Thr-Gl corresponding to the 2nd to 8th amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
u-Asn-Ile-Leu-Arg-Lys,
The N-terminal amino acid sequence of the 32 K dalton polypeptide chain corresponds to Met-Asn-Gly-Va corresponding to positions 1 to 7 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
It was 1-Tyr-Asp-Val.

【００２７】［実施例２］シュードノカルディア・サー
モフィラＪＣＭ３０９５株由来のニトリルヒドラターゼ
遺伝子の取得 シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株
を実施例１と同様の方法により培養し、遠心分離（８０
００×Ｇ、３０分間）により湿菌体２ｇを得た。これに
０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ水溶液（ｐＨ８．０）を４０ｍｌ加えて菌体を懸濁
し、９０℃で１０分間煮沸処理した。該処理液を３７℃
まで冷却した後に、卵白リゾチームを１００ｍｇ加えて
３７℃で１時間保温した。次に２００００Ｕ／ｍｇのザ
イモリレースを３０ｍｇ加えて３７℃で１時間保温し
た。続いて２０Ｕ／ｍｇのプロテイネースＫを５ｍｇ加
えて３７℃で１時間保温した。さらに、１０％ＳＤＳ溶
液を２ｍｌ添加して６５℃で１時間保温した後、直ちに
フェノール／クロロホルム抽出を行った。まず、ＴＥ
（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭのトリス塩
酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノール液４２
ｍｌを加え緩やかにかくはんした。遠心分離（３０００
ｒｐｍ、１０分）により水相と有機相を分離し、水相の
みを分取した。この水相に上記のＴＥ飽和フェノール液
２１ｍｌとクロロホルム２１ｍｌを加えて再び緩やかに
かくはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）
により水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取し
た。この水相にクロロホルム４２ｍｌを加えて再び緩や
かにかくはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０
分）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分取
した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液４
ｍｌとエタノール９２ｍｌを加えてしばらく室温で放置
した後、析出した糸状のＤＮＡをガラス棒を用いて巻取
った。７０％、８０％、９０％のエタノール水溶液で順
次脱水を行った後に風乾させた該ＤＮＡを４０ｍｌのＴ
Ｅ溶液に再溶解させた。ＲＮａｓｅＡを３０μｇ加えて
３７℃で１時間保温した後、制限酵素ＢａｍＨＩにより
部分切断した。フェノール抽出／クロロホルム抽出及び
エタノール沈殿によって部分切断された該ＤＮＡを再精
製し、最終的に１．０μｇ／μｌとなるようにＴＥ溶液
に溶解させた。[Example 2] Acquisition of nitrile hydratase gene derived from Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain Pseudonocardia thermophila JCM3095 strain was cultured by the same method as in Example 1 and centrifuged (80
2 × g of wet cells was obtained by (00 × G, 30 minutes). 50 mM EDTA · 2N containing 0.15M NaCl
40 ml of an aqueous solution (pH 8.0) was added to suspend the cells, and the cells were boiled at 90 ° C. for 10 minutes. The treatment liquid is 37 ° C.
After cooling to 100 ° C., 100 mg of egg white lysozyme was added and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. Next, 30 mg of 20,000 U / mg zymolase was added and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, 5 mg of 20 U / mg proteinase K was added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour. Further, 2 ml of a 10% SDS solution was added, and the mixture was kept at 65 ° C. for 1 hour and then immediately subjected to phenol / chloroform extraction. First, TE
Phenol solution 42 saturated with (10 mM Tris-HCl aqueous solution containing 1 mM EDTA / 2Na; pH 8.0)
ml was added and gently stirred. Centrifuge (3000
The aqueous phase and the organic phase were separated by (rpm, 10 minutes), and only the aqueous phase was separated. 21 ml of the above TE-saturated phenol solution and 21 ml of chloroform were added to this aqueous phase and gently stirred again, followed by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes).
The aqueous phase and the organic phase were separated again by, and only the aqueous phase was separated again. After adding 42 ml of chloroform to this aqueous phase and gently stirring again, centrifugation (3000 rpm, 10
The aqueous phase and the organic phase were separated again according to (min.), And only the aqueous phase was separated. TE solution containing 1.1 M NaCl in this aqueous phase 4
ml and ethanol (92 ml) were added and the mixture was allowed to stand at room temperature for a while, and then the precipitated filamentous DNA was wound with a glass rod. Sequential dehydration was performed with 70%, 80%, and 90% ethanol aqueous solutions, and then the air-dried DNA was added to 40 ml of T
Redissolved in solution E. After 30 μg of RNaseA was added and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, it was partially cleaved with the restriction enzyme BamHI. The DNA partially digested by phenol extraction / chloroform extraction and ethanol precipitation was repurified and dissolved in a TE solution to a final concentration of 1.0 μg / μl.

【００２８】実施例１で決定した２９Ｋダルトン及び３
２Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸配列
に基づいて、以下の４種類のＰＣＲ用プライマーを合成
した。 プライマー１：５’−ＡＣＮＧＡＲＡＡＹＡＴＮＹＴＮ
ＭＧＮＡＡ−３’ プライマー２：５’−ＴＴＮＣＫＮＡＲＮＡＴＲＴＴＹ
ＴＣＮＧＴ−３’ プライマー３：５’−ＡＴＧＡＡＹＧＧＮＧＴＮＴＡＹ
ＧＡＮＧＴ−３’ プライマー４：５’−ＡＣＮＴＣＲＴＡＮＡＣＮＣＣＲ
ＴＴＣＡＴ−３’ 配列表の配列番号：５記載のプライマー１及び配列表の
配列番号：６記載のプライマー２は、２９Ｋダルトンの
Ｎ末端アミノ酸配列に逆対応するＤＮＡ鎖の各相補鎖に
相当する。配列表の配列番号：７記載のプライマー３及
び配列表の配列番号：８記載のプライマー４は、３２Ｋ
ダルトンのＮ末端アミノ酸配列に逆対応するＤＮＡ鎖の
各相補鎖に相当する。尚、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを
表している。29K Daltons and 3 determined in Example 1
The following four PCR primers were synthesized based on the N-terminal amino acid sequence of the 2K dalton polypeptide chain. Primer 1: 5'-ACNGARAAYATNYTN
MGNAA-3 ′ Primer 2: 5′-TTNCKNARNATRTTTY
TCNGT-3 'Primer 3: 5'-ATGAAYGGNGNTTAY
GANGT-3 ′ primer 4: 5′-ACNTCRTANACNCCR
The primer 1 described in SEQ ID NO: 5 of the TTCAT-3 ′ sequence list and the primer 2 described in SEQ ID NO: 6 of the sequence list correspond to respective complementary strands of the DNA strands corresponding to the N-terminal amino acid sequence of 29 K daltons. The primer 3 described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing and the primer 4 described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing are 32K.
It corresponds to each complementary strand of the DNA strand that corresponds inversely to the N-terminal amino acid sequence of Dalton. In addition, N represents A, C, G or T.

【００２９】先に調製した部分切断された染色体ＤＮＡ
３μｇを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．
１では、プライマー１及び４を各々２００ｎｇとＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系
で、熱変性（９４℃）１分、アニーリング（３７℃）１
分、伸長反応（７２℃）１分の条件でＰＣＲを４０サイ
クル行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２では、プライマー２及
び３を各々２００ｎｇとＴａｑＤＮＡポリメラーゼを５
Ｕを含む全量１００μｌの系で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と
同様のサイクルで行った。各ＰＣＲ反応の終了液５μｌ
を用いてアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．２の場合のみ約７００ｂｐの増幅ＤＮＡ
産物の存在が確認できた。これより、シュードノカルデ
ィア・サーモフィラでは、５’末端側上流より３２Ｋダ
ルトンの遺伝子と２９Ｋダルトンの遺伝子がこの順番で
隣接して存在していることが判明した。Partially cut chromosomal DNA prepared above
PCR was performed using 3 μg as a template. PCR reaction No.
In No. 1, 200 ng of each of Primers 1 and 4 and Taq
Using a total volume of 100 μl containing 5 U of DNA polymerase, heat denaturation (94 ° C.) for 1 minute, annealing (37 ° C.) 1
40 cycles of PCR under conditions of 1 minute for extension reaction (72 ° C.). PCR reaction No. In Example 2, primers 2 and 3 were each added to 200 ng and Taq DNA polymerase was added to 5
PCR reaction No. 1 was performed in a total volume of 100 μl containing U. The same cycle as 1 was performed. 5 μl of the end solution of each PCR reaction
When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using
CR reaction No. Amplified DNA of about 700bp only in case of 2
The presence of the product was confirmed. From this, it was revealed that in the Pseudonocardia thermophila, the 32K dalton gene and the 29K dalton gene were adjacent to each other in this order from the 5'end upstream.

【００３０】先に調製したＢａｍＨＩにより部分切断さ
れた染色体ＤＮＡ溶液を用いて、アガロースゲル電気泳
動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；ア
ガロース濃度０．６重量％）を行い、アガロースゲルか
ら約１５００ｂｐから４０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む
アガロース片を切り出した。該アガロース片（約０．５
ｇ）を細かく粉砕し５ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃
で１時間保温してアガロースを完全に融解させ、この融
解液に対して前記と同様のフェノール／クロロホルム抽
出とエタノール沈澱を行ってＤＮＡ断片を精製した。こ
の様にして得られたＤＮＡ断片を少なくとも１０ｐｍｏ
ｌ用意し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）
を用いてｐＵＣ１８プラスミドベクター（宝酒造社製）
のマルチクローニングサイト内にあるＢａｍＨＩサイト
に挿入した。この時ライゲーションに用いたｐＵＣ１８
プラスミドベクターＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨＩで切
断した後にフェノール／クロロホルム処理及びエタノー
ル沈澱による精製を行い、続いてアルカリフォスファタ
ーゼ（宝酒造社製）を用いた５’末端の脱リン酸化処理
後にフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱
による再精製を行ったものを２０ｎｇ使用した。Agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration: 0.6% by weight) was performed using the chromosomal DNA solution partially digested with BamHI prepared above, and about agarose gel was used. An agarose piece containing a DNA fragment of 1500 bp to 4000 bp was cut out. The agarose piece (about 0.5
g) was finely crushed and suspended in 5 ml of TE solution, then at 55 ° C.
Agarose was completely thawed by incubating at 37 ° C. for 1 hour, and the resulting melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as described above to purify the DNA fragment. At least 10 pmo of the DNA fragment thus obtained
l Prepare a DNA ligation kit (Takara Shuzo)
Using pUC18 plasmid vector (Takara Shuzo)
Was inserted into the BamHI site within the multi-cloning site. PUC18 used for ligation at this time
The plasmid vector DNA was digested with the restriction enzyme BamHI, purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation, and subsequently dephosphorylated at the 5 ′ end using alkaline phosphatase (Takara Shuzo), followed by phenol / chloroform treatment and 20 ng was used after re-purification by ethanol precipitation.

【００３１】ライゲーション反応後のＤＮＡ溶液を用い
て、東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセ
ル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ＨＩＧＨ）への形質転換を行
い、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天
培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量
％バクトトリプトン、０．５重量％塩化ナトリウム、
１．５重量％寒天；ｐＨ７．５）上に形質転換処理後の
菌液を約１０ｕｌ塗布し、３７℃で一晩培養した。その
結果、１枚当たり１００個から１０００個のコロニーが
出現しているシャーレを複数枚得ることができた。The DNA solution after the ligation reaction was used to transform Escherichia coli HB101 manufactured by Toyobo Co., Ltd. into competent cells (COMPETENT HIGH), and LB agar medium containing 0.5 μg / ml of ampicillin (0.5 μg / ml) was used. % By weight Bacto yeast extract, 1% by weight Bacto tryptone, 0.5% by weight sodium chloride,
About 10 ul of the bacterial solution after the transformation treatment was applied on 1.5 wt% agar; pH 7.5) and cultured at 37 ° C. overnight. As a result, it was possible to obtain a plurality of petri dishes in which 100 to 1000 colonies appeared per sheet.

【００３２】これらの染色体ＤＮＡのプラスミドライブ
ラリーに対して、先に調製したＰＣＲによる増幅ＤＮＡ
産物をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーショ
ンを実施し、目的のニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む
クローンをスクリーニングした。Amplification DNA by PCR prepared previously for these chromosomal DNA plasmid libraries
Colony hybridization was performed using the product as a probe to screen for clones containing the nitrile hydratase gene of interest.

【００３３】まず、プラスミドライブラリーのシャーレ
上にアマシャム社製のナイロンメンブレムＨｙｂｏｎｄ
−Ｎを静かに置き、約１分後ゆっくりと取り除いた。は
がされたメンブレムを変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌを
含む０．５ＭのＮａＯＨ水溶液）に７分間浸した後、中
和溶液（１．５ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎ
ａを含む０．５Ｍトリス塩酸水溶液；ｐＨ７．２）で３
分間ずつ２回処理した。次に、２×ＳＳＣ溶液（１×Ｓ
ＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム
４．４１ｇを含む１リットルの水溶液）にて１回洗浄を
行った後、乾いた濾紙上で該メンブレンを風乾した。さ
らに１２０ｍＪ／ｃｍ²のＵＶ照射を行うことによりメ
ンブレン上のＤＮＡの固定を行った。こうして処理した
メンブレンを１枚に当たり３０ｍｌのハイブリダイゼー
ションバッファー（５×ＳＳＣに以下の成分を含む。１
重量％スキムミルク、０．１重量％Ｎ−ラウロイルザル
コシン、０．０２重量％ＳＤＳ、５０重量％ホルムアミ
ド）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行った。一方、先に調製したＰＣＲによる増幅ＤＮ
Ａ産物を鋳型に用いてベーリンガーマンハイム社製のＤ
ＩＧ−ＤＮＡラベリングキットを用いて蛍光標識プロー
ブの調製を行った。１００ｎｇの蛍光標識プローブと３
００ｎｇのｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡを９５℃で１０
分間の煮沸処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼー
ションを行ったメンブレンと共に１０ｍｌのハイブリダ
イゼーションバッファーに移した。４２℃で２４時間の
ハイブリダイゼーションを行った後に、メンブレンを１
５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣにて室
温で２回洗浄した。次に１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤ
Ｓを含む１×ＳＳＣ中で６８℃／５分間の洗浄を２回行
った。続いて１００ｍｌのバッファーＡ（０．３重量％
のツィーン２０及び０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．１
Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中で５分間洗浄
後、バッファーＢ（０．３重量％のツィーン２０、０．
１５ＭのＮａＣｌ及び１重量％のスキミムルクを含む
０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中にて室
温で３０分間のブロッキング処理を行った。さらに３０
０ｍｌのバッファーＡにて室温で１５分間の洗浄を２回
行った後、６０ｍｌのバッファーＣ（０．１ＭのＮａＣ
ｌ及び５０ｍＭの塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリ
ス塩酸塩水溶液；ｐＨ９．５）で５分間平衡化処理を行
った。発光基質であるベーリンガーマンハイム社製のＡ
ＭＰＰＤをバッファーＣにて１００倍に希釈した溶液３
０ｍｌ中に該メンブレンを室温で１０分間浸した後、乾
いた濾紙上に移して余分なＡＭＰＰＤを吸い取った。以
上の操作を経たメンブレンをポリエチレンフィルムに包
んだ後、Ｘ線フィルムを用いて蛍光シグナルの位置を確
認した。その結果、該メンブレン上にポジティブなシグ
ナルを１箇所を見いだし、その位置と重なるポジティブ
コロニーを元のシャーレ上で確認した。First, a nylon membrane, Hybond, manufactured by Amersham Co. is placed on a petri dish of the plasmid library.
-N was placed gently and slowly removed after about 1 minute. The stripped membrane is immersed in a denaturing solution (0.5 M NaOH aqueous solution containing 1.5 M NaCl) for 7 minutes, and then the neutralizing solution (1.5 M NaCl and 1 mM EDTA.2N) is added.
0.5M Tris-HCl aqueous solution containing a; pH 7.2) 3
It was treated twice for each minute. Next, 2 x SSC solution (1 x S
SC was washed once with 1 liter of an aqueous solution containing 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate), and then the membrane was air-dried on a dry filter paper. Further, UV irradiation of 120 mJ / cm ² was performed to fix the DNA on the membrane. 30 ml of hybridization buffer (5 × SSC contains the following components per membrane treated in this way: 1
Pre-hybridization was carried out at 42 ° C. for 2 hours by immersing it in 42% by weight skimmed milk, 0.1% by weight N-lauroylsarcosine, 0.02% by weight SDS, 50% by weight formamide. On the other hand, DN amplified by PCR prepared previously
Boehringer Mannheim D using product A as template
A fluorescent labeled probe was prepared using the IG-DNA labeling kit. 100 ng of fluorescent labeled probe and 3
00ng of pUC18 plasmid DNA at 95 ° C for 10
It was heat-denatured by boiling for 1 minute and transferred to 10 ml of hybridization buffer together with the prehybridized membrane. After hybridization at 42 ° C for 24 hours, the membrane was
It was washed twice with 50 ml of 2 × SSC containing 0.1 wt% SDS at room temperature. Then 150 ml of 0.1 wt% SD
Washing was carried out twice at 68 ° C. for 5 minutes in 1 × SSC containing S. Then 100 ml of buffer A (0.3 wt%
Tween 20 and 0.15M NaCl in 0.1
After washing for 5 minutes in M maleic acid buffer; pH 7.5, buffer B (0.3 wt% Tween 20, 0.
Blocking treatment was carried out for 30 minutes at room temperature in 0.1 M maleic acid buffer containing 15 M NaCl and 1 wt% skimimluc; pH 7.5). 30 more
After washing with 0 ml of buffer A at room temperature for 15 minutes twice, 60 ml of buffer C (0.1 M NaC was added).
Equilibration treatment was carried out for 5 minutes with 0.1 M tris hydrochloride aqueous solution containing 1 and 50 mM magnesium chloride; pH 9.5). Luminescent substrate A produced by Boehringer Mannheim
Solution 3 in which MPPD was diluted 100 times with buffer C
The membrane was soaked in 0 ml at room temperature for 10 minutes and then transferred onto a dry filter paper to absorb excess AMPPD. After wrapping the membrane subjected to the above operations in a polyethylene film, the position of the fluorescent signal was confirmed using an X-ray film. As a result, one positive signal was found on the membrane, and a positive colony overlapping the position was confirmed on the original petri dish.

【００３４】確認されたポジティブコロニーをシャーレ
上からアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ液体培地
に接種し、３７℃・２５０ｒｐｍで一晩培養を行った。
培養菌体より常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制
限酵素ＢａｍＨＩで処理を行った後に、アガロース電気
泳動（アガロース濃度０．７重量％）により挿入断片の
サイズの確認を行ったところ、約３．１Ｋｂｐの大きさ
であった。本プラスミドをｐＰＴ−Ｂ１［図−１（図
１）］と命名し、ＡＢＩ社製のシークエンシングキット
とオートシークエンサー３７３Ａを用いてプライマーエ
クステンション法により挿入断片の全塩基配列を決定し
た。その結果、挿入断片中に７０２ｂｐと６１８ｂｐの
塩基配列からなるオープンリディングフレーム（各々Ｏ
ＲＦ１とＯＲＦ２と呼ぶ）が５’末端側よりこの順番で
確認された。翻訳停止コドンを含めたＯＲＦ１の最も
３’末端側の４塩基とＯＲＦ２の最も５’末端側の４塩
基は重複しており、ＰＣＲでの結果と一致していた。さ
らに、ＯＲＦ１の塩基配列より推定されるＮ末端側７個
のアミノ酸配列と実施例１で示された３２Ｋダルトンの
ポリペプチド鎖のＮ末端側のアミノ酸配列は全く一致し
ていた。該配列領域は、配列表の配列番号：２記載のア
ミノ酸配列の１番目から７番目までの配列に相当する。
一方、ＯＲＦ２の塩基配列より推定される配列表のＮ末
端側２番目から８番目までの７個のアミノ酸配列と実施
例１で示された２９Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末
端側の７個のアミノ酸配列も全く一致していた。該配列
領域は、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列の２
番目から８番目までの配列に相当する。また、ＯＲＦ１
とＯＲＦ２のアミノ酸配列は、それぞれ他のニトリルヒ
ドラターゼのβサブユニット及びαサブユニットのアミ
ノ酸配列と高いホモロジーが認められた。以上より、Ｏ
ＲＦ１はニトリルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子
であり、ＯＲＦ２はαサブユニット遺伝子であることが
確認された。The confirmed positive colonies were inoculated on a petri dish into 10 ml of LB liquid medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37 ° C. and 250 rpm.
Plasmid DNA was extracted from the cultured cells by a conventional method, treated with the restriction enzyme BamHI, and then the size of the inserted fragment was confirmed by agarose electrophoresis (agarose concentration: 0.7% by weight). The size was 1 Kbp. This plasmid was named pPT-B1 [FIG. 1 (FIG. 1)], and the entire nucleotide sequence of the inserted fragment was determined by the primer extension method using a sequencing kit manufactured by ABI and auto sequencer 373A. As a result, an open reading frame consisting of nucleotide sequences of 702 bp and 618 bp (each O
RF1 and ORF2) were confirmed in this order from the 5'end side. The most 3'terminal 4 bases of ORF1 including the translation stop codon and the most 5'terminal 4 bases of ORF2 overlapped, which was consistent with the result of PCR. Furthermore, the 7 amino acid sequences on the N-terminal side deduced from the base sequence of ORF1 and the amino acid sequence on the N-terminal side of the 32 K dalton polypeptide chain shown in Example 1 were completely identical. The sequence region corresponds to the first to seventh sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
On the other hand, the 7 amino acid sequences from the 2nd to the 8th N-terminal side of the sequence listing deduced from the base sequence of ORF2 and the 7 amino acid sequences at the N-terminal side of the 29 K dalton polypeptide chain shown in Example 1 The amino acid sequences were also completely identical. The sequence region is 2 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Corresponds to the 8th to 8th arrays. Also, ORF1
The amino acid sequences of and ORF2 showed high homology with the amino acid sequences of the β subunit and α subunit of other nitrile hydratase, respectively. From the above, O
It was confirmed that RF1 is the β-subunit gene of nitrile hydratase and ORF2 is the α-subunit gene.

【００３５】［実施例３］形質転換菌株の造成 ｐＰＴ−Ｂ１上のｌａｃプロモーターの転写方向とＯＲ
Ｆ１及びＯＲＦ２の転写方向は完全に一致していた。そ
こで、ｐＰＴ−Ｂ１上のニトリルヒドラターゼ遺伝子の
５’末端側上流に位置し、かつ、ｐＰＴ−Ｂ１上の唯一
の制限酵素サイトであるＸｂａＩおよびＮｓｐＶにより
ｐＰＴ−Ｂ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグ
マ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース
濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約４．６Ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロ
ース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液
に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に
融解させ、この融解液に対して実施例２と同様のフェノ
ール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行ってＤＮ
Ａ断片を精製した。ＤＮＡブランティングキット（宝酒
造社製）により平滑末端化処理を行った後、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）により自己連結させて
プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１［図−２（図２）］を構築し
た。東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセ
ルを用いてｐＰＴ−ＤＢ１をＨＢ１０１株に導入し、形
質転換菌株ＭＴ−１０８２２株を得た。これにより、本
菌株においてニトリルヒドラターゼ遺伝子がｐＵＣ１８
上のｌａｃプロモーターにより転写・翻訳されるように
なった。ＭＴ−１０８２２株は受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−５７８５として茨城県つくば市東１丁目１番３号にあ
る工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。[Example 3] Construction of transformant strain OR direction and OR of transcription of lac promoter on pPT-B1
The transcription directions of F1 and ORF2 were completely in agreement. Therefore, pPT-B1 is located upstream of the nitrile hydratase gene on pPT-B1 on the 5′-end side and is the only restriction enzyme site on pPT-B1. (Using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 0.7%), and about 4.6K from agarose gel
Only the bp DNA fragment was excised. The cut agarose pieces (about 0.1 g) were finely pulverized and suspended in 1 ml of TE solution, and then the mixture was kept at 55 ° C. for 1 hour to completely melt the agarose. Phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation to obtain DN
The A fragment was purified. After blunting with a DNA blunting kit (Takara Shuzo), self-ligation was performed with a DNA ligation kit (Takara Shuzo) to construct plasmid pPT-DB1 [Fig. 2 (Fig. 2)]. PPT-DB1 was introduced into HB101 strain using a competent cell of Escherichia coli HB101 manufactured by Toyobo Co., Ltd. to obtain transformant strain MT-10822 strain. As a result, the nitrile hydratase gene was transformed into pUC18 in this strain.
It was transcribed and translated by the upper lac promoter. MT-10822 strain has accession number FERM BP
-5785 has been deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki.

【００３６】［実施例４］形質転換菌株によるニトリル
化合物のアミド化合物への変換例１ ５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍ
ｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コ
バルト・二水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調
製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌
した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよう
にアンピシリンを添加した後、実施例３で得られたＭＴ
−１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐ
ｍにて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１
５分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５
０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠
心分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２
００ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドのみが存在しており、アクリロニトリル
及びアクリル酸は認められなかった。すなわち、転化率
及び選択率は１００％であった。Example 4 Conversion of Nitrile Compound to Amide Compound by Transformation Strain Example 1 40 μg / m in a 500 ml Erlenmeyer flask with a baffle.
100 ml of LB liquid medium containing 1 L ferric sulfate heptahydrate and 10 μg / ml cobalt chloride dihydrate was prepared and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to give a final concentration of 100 μg / ml, and then MT obtained in Example 3 was used.
-10822 strain was inoculated with a single bacterium ear, and 37 ° C and 130 rp
The cells were cultured for about 20 hours. Centrifuge (5000G x 1
5 minutes) to separate only the bacterial cells from the culture solution, followed by 5
After resuspending the bacterial cells in 0 ml of physiological saline, centrifugation was carried out again to obtain wet bacterial cells. 100 mg of the wet cells are 2
00 ml of 50 mM potassium phosphate aqueous solution (pH 7.
0), and acrylonitrile was added to the suspension for 10 m.
1 was added and the reaction was carried out at 10 ° C. for 1 hour with gentle stirring. After completion of the reaction, the same HPLC as in Example 1
When the reaction solution was analyzed by analysis, only acrylamide was present in the reaction solution, and neither acrylonitrile nor acrylic acid was found. That is, the conversion rate and the selectivity were 100%.

【００３７】［実施例５］形質転換菌株によるニトリル
化合物のアミド化合物への変換例２ ５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに４０μｇ／ｍ
ｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コ
バルト・二水和物を含む１００ｍｌのＬＢ液体培地を調
製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌
した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよう
にアンピシリンを添加した後、実施例３で得られたＭＴ
−１０８２２株を一白菌植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。続いて遠心分離（５０００Ｇ
×１５分）により菌体のみを培養液より分離した。５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にメタクリロニトリルを５ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら２時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
メタクリルアミドのみが存在しており、メタクリロニト
リル及びメタクリル酸は認められなかった。すなわち、
転化率及び選択率は１００％であった。Example 5 Conversion of Nitrile Compound to Amide Compound by Transforming Strain Example 2 40 μg / m in 500 ml Erlenmeyer flask with baffle.
100 ml of LB liquid medium containing 1 L ferric sulfate heptahydrate and 10 μg / ml cobalt chloride dihydrate was prepared and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to give a final concentration of 100 μg / ml, and then MT obtained in Example 3 was used.
-10822 strain was inoculated with a simple white bacterium, 37 ° C, 130 rpm
The cells were cultured for about 20 hours. Then, centrifuge (5000G
For 15 minutes), only the bacterial cells were separated from the culture solution. Fifty
After resuspending the bacterial cells in ml of physiological saline, centrifugation was carried out again to obtain wet bacterial cells. 20 mg of the wet bacterial cells
0 ml of 50 mM potassium phosphate aqueous solution (pH 7.
0), and methacrylonitrile was added to the suspension for 5 m.
1 was added and the reaction was carried out at 10 ° C. for 2 hours with gentle stirring. After completion of the reaction, the same HPLC as in Example 1
When the reaction solution was analyzed by analysis, only methacrylamide was present in the reaction solution and neither methacrylonitrile nor methacrylic acid was found. That is,
The conversion and selectivity were 100%.

【００３８】［実施例６］ニトリルヒドラターゼ活性を
保持したアミノ酸置換体の取得（１） αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するた
めに、実施例３で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤ
ＮＡを鋳型として、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた
部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を
単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキット
の原理および操作方法を踏襲した。Example 6 Acquisition of Amino Acid Substitute Having Retention of Nitrile Hydratase Activity (1) The pPT-DB1 plasmid obtained in Example 3 for substituting Met for the 6th Leu of the α subunit. D
"LA PCR in" manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. using NA as a template
Site-directed mutagenesis using "vitro mutagenesis Kit" was performed. After that, "LA PCR
The "in vitro mutagenesis Kit" is simply called a kit. In the following examples, the principle and operating method of the kit were basically followed.

【００３９】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例３で得られ
たＭＴ−１０８２２株を一白菌耳植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適
当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００
ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカ
リＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium so that the final concentration was 100 μg / ml, and the MT-10822 strain obtained in Example 3 was inoculated with a single bacterium ear and incubated at 37 ° C./30.
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution was collected in an appropriate centrifuge tube and then centrifuged (15000).
The cells were separated by (rpm × 5 minutes). Then, a plasmid DNA of pPT-DB1 was prepared from the cells by the alkaline SDS extraction method.

【００４０】ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇ
を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．１は、配列表の配列番号９記載のプライマー及び
Ｍ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列を
記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成
はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１
５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２
℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー
（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３プラ
イマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）を各
々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに
記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操
作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の
反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガ
ロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析
を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞ
れのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮ
ＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μｌの溶液を
調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ含む全量４
７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキットに記載の
条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分
間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷
却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによっ
てアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴ
ＡＫＡＲＡＬＡ Ｔａｑを０．５μｌ加えて７２℃で３
分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これ
にＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５
０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリン
グ（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条
件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．
３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μｌを
用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低
融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２．０ｋ
ｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、ア
ガロースゲルから約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し
１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してア
ガロースを完全に融解させた。この融解液に対して実施
例２と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエタノー
ル沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μ
ｌのＴＥに溶解した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅Ｄ
ＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切
断した後、この制限酵素処理液に対して実施例２と同様
のフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行
って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに
溶解した。同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵素
サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ
−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社
製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度
０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース
片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸
濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解
させた。この融解液に対して実施例２と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮ
Ａ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−ＤＢ１
断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセ
ル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌バンクを調製
した。1 μg of plasmid DNA of pPT-DB1
Was used as a template to perform two types of PCR reactions. PCR reaction No. 1 is a system (50 μl in total) containing 50 pmol each of the primer described in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit), and heat denaturation (98 ° C) 1
5 seconds, annealing (55 ° C) 30 seconds, extension reaction (72
(° C) 120 seconds was repeated for 25 cycles. PCR reaction No. 2 is a system of 50 μl in total containing 50 pmol each of MUT4 primer (sequence described in SEQ ID NO: 11 of the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 12 of sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit) ), PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed.
Using Microcon 100 (Takara Shuzo Co., Ltd.), excess primer and dN from each PCR reaction termination solution
After removing TP, TE was added to each to prepare a 50 μl solution. A total volume of 4 containing 0.5 μl of each TE solution
7.5 μl of an annealing solution (composition is according to the conditions described in the kit) was prepared, subjected to heat denaturation treatment (98 ° C.) for 10 minutes, and then cooled to 37 ° C. at a constant rate for 60 minutes. Annealing treatment was performed by holding at 37 ° C. for 15 minutes. T for the annealing treatment liquid
Add 0.5 μl of AKALALA Taq and mix at 72 ° C for 3
Heat treatment was performed for a minute to complete the heteroduplex. To this, 50 pmol of M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) and M13 primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 12 of sequence listing) were added to give a total amount of 5
After 0 μl, PCR reaction No. was performed by repeating the conditions of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds for 25 cycles.
3 was done. PCR reaction No. Analysis of the DNA amplification product by agarose electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 0.8% by weight) using 5 μl of the reaction-completed solution of 3 showed about 2.0 k.
The presence of an amplified DNA product of bp could be confirmed. Subsequently, only a DNA fragment of about 2.0 Kbp was cut out from the agarose gel, the agarose piece (about 0.1 g) was finely crushed, suspended in 1 ml of TE solution, and then incubated at 55 ° C for 1 hour to complete the agarose. Thawed. The melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify the DNA fragment, and finally 10 μm.
It was dissolved in 1 of TE. Purified amplified D of about 2.0 kbp
After the NA fragment was cleaved with restriction enzymes EcoRI and HindIII, the restriction enzyme-treated solution was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify the DNA fragment, and finally 10 μl of TE was added. Dissolved in. Similarly, EcoRI and HindIII, which are the only restriction enzyme sites on pPT-DB1
-Cut DB1 and perform agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 0.7%) to obtain about 2.7 Kbp from the agarose gel.
Only the DNA fragment of was cut out. The cut agarose pieces (about 0.1 g) were finely pulverized, suspended in 1 ml of TE solution, and then kept at 55 ° C. for 1 hour to completely melt the agarose. This melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to give the DN.
The A fragment was purified and finally dissolved in 10 μl TE.
The amplified DNA product thus obtained and pPT-DB1
After ligating the fragments using a DNA ligation kit (Takara Shuzo), E. coli HB101 competent cells (Toyobo) were transformed to prepare E. coli banks.

【００４１】３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸
第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・
二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発
現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオート
クレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μ
ｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大
腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白菌耳
ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養
した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チュー
ブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）
により菌体を分離した。該菌体を２００μｌのリン酸カ
リウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１重
量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で２分間反応
させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加
して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実
施例１と同様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結
果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が
検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持しているこ
とが確認された。In a 30 ml test tube, 40 μg / ml ferric sulfate heptahydrate and 10 μg / ml cobalt chloride
10 ml of LB liquid medium containing dihydrate (hereinafter referred to as activity expression medium) was prepared and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. The final concentration of this medium is 100μ
After adding ampicillin to g / ml, 5 clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated with each one white ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube and then centrifuged (15000 rpm × 5 minutes).
The bacterial cells were separated by. The cells were suspended in 200 μl of potassium phosphate buffer (pH 7.0), 1% by weight of acrylonitrile was added thereto, and the mixture was reacted at 10 ° C. for 2 minutes. The same amount of 1 M aqueous solution of phosphoric acid as this was added to the reaction solution to stop the reaction, and the concentration of acrylamide produced was measured by the same HPLC analysis as in Example 1. As a result, production of acrylamide was detected in 4 out of 5 clones, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００４２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
のＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシーク
エンサー３７３Ａを用いたプライマーエクステンション
法により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子
の塩基配列を決定した。その結果、表１［表１］に示し
たクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニ
ットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the primer extension method using the same sequencing kit manufactured by ABI and auto sequencer 373A as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 1 [Table 1], the sixth Leu of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Met.

【００４３】[0043]

【表１】 [Table 1]

【００４４】［実施例７］ニトリルヒドラターゼ活性を
保持したアミノ酸置換体の取得（２） αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒに置換するた
めに、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、
実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入を行
った。[Example 7] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (2) Using pPT-DB1 plasmid DNA as a template to substitute Leu at position 6 of the α subunit with Thr.
Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in Example 6.

【００４５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１３
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 13 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００４６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００４７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２［表２］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに置換されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 2 [Table 2], the sixth Leu of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Thr.

【００４８】[0048]

【表２】 [Table 2]

【００４９】［実施例８］ニトリルヒドラターゼ活性を
保持したアミノ酸置換体の取得（３） αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａに置換するた
めに、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、
実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入を行
った。[Example 8] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (3) In order to substitute Lea at position 6 of the α subunit with Ala, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template.
Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in Example 6.

【００５０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１４
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 14 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００５１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００５２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３［表３］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの６番目のＬｅｕがＡｌａに置換されていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 3 [Table 3], the sixth Leu of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ala.

【００５３】[0053]

【表３】 [Table 3]

【００５４】［実施例９］ニトリルヒドラターゼ活性を
保持したアミノ酸置換体の取得（４） αサブユニットの６番目のＬｅｕをＶａｌに置換するた
めに、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、
実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入を行
った。[Example 9] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (4) In order to substitute Leu at position 6 of the α subunit with Val, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template.
Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in Example 6.

【００５５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１５
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 15 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００５６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００５７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表４［表４］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの６番目のＬｅｕがＶａｌに置換されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 4 [Table 4], the sixth Leu of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Val.

【００５８】[0058]

【表４】 [Table 4]

【００５９】［実施例１０］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（５） αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 10] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (5) In order to substitute 19th Ala of the α subunit with Val, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００６０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１６
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 16 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００６１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００６２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表５［表５］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに置換されてい
た。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 5 [Table 5], the 19th Ala of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Val.

【００６３】[0063]

【表５】 [Table 5]

【００６４】［実施例１１］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（６） αサブユニットの３８番目のＭｅｔをＬｅｕに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 11] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (6) In order to substitute Met at position 38 of the α subunit with Leu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００６５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１７
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 17 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００６６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００６７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表６［表６］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの３８番目のＭｅｔがＬｅｕに置換されてい
た。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 6 [Table 6], Met at position 38 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Leu.

【００６８】[0068]

【表６】 [Table 6]

【００６９】［実施例１２］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（７） αサブユニットの７７番目のＴｈｒをＳｅｒに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 12] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (7) In order to replace Thr at position 77 of the α subunit with Ser, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００７０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１８
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 18 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００７１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００７２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表７［表７］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの７７番目のＴｈｒがＳｅｒに置換されてい
た。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 7 [Table 7], Thr at the 77th position of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ser.

【００７３】[0073]

【表７】 [Table 7]

【００７４】［実施例１３］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（８） αサブユニットの９０番目のＧｌｙをＡｌａに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 13] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (8) In order to substitute Ala for the 90th Gly of the α subunit, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００７５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１９
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 19 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００７６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００７７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表８［表８］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの９０番目のＧｌｙがＡｌａに置換されてい
た。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, the 90th Gly of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ala in the clones shown in Table 8 [Table 8].

【００７８】[0078]

【表８】 [Table 8]

【００７９】［実施例１４］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（９） αサブユニットの１０２番目のＶａｌをＡｌａに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 14] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (9) In order to substitute the 102nd Val of the α subunit with Ala, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００８０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２０
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 20 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００８１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００８２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表９［表９］に
示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブ
ユニットの１０２番目のＶａｌがＡｌａに置換されてい
た。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, in the clones shown in Table 9 [Table 9], the 102nd Val of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ala.

【００８３】[0083]

【表９】 [Table 9]

【００８４】［実施例１５］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１０） αサブユニットの１０６番目のＶａｌをＩｌｅに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 15] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (10) In order to substitute the 106th Val of the α subunit with Ile, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００８５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２１
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 21 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００８６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００８７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１０［表１
０］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１０６番目のＶａｌがＩｌｅに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 10 [Table 1
[0], the 106th Val of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Ile.

【００８８】[0088]

【表１０】 [Table 10]

【００８９】［実施例１６］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１１） αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 16] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (11) In order to replace Phe at position 126 of the α subunit with Tyr, using pPT-DB1 plasmid DNA as a template Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００９０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２２
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 22 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００９１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００９２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１１［表１
１］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 11 [Table 1
In the clone shown in [1], Phe at position 126 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Tyr.

【００９３】[0093]

【表１１】 [Table 11]

【００９４】［実施例１７］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１２） αサブユニットの１３０番目のＧｌｎをＧｌｕに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 17] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (12) In order to replace Gln at position 130 of the α subunit with Glu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【００９５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２３
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 23 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【００９６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【００９７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１２［表１
２］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１３０番目のＧｌｎがＧｌｕに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 12 [Table 1
In the clone shown in [2], Gln at the 130th position of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Glu.

【００９８】[0098]

【表１２】 [Table 12]

【００９９】［実施例１８］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１３） αサブユニットの１４２番目のＬｅｕをＶａｌに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 18] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (13) In order to substitute Leu at position 142 of the α subunit with Val, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１００】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２４
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 24 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１０１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１０２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１３［表１
３］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１４２番目のＬｅｕがＶａｌに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 13 [Table 1
In the clone shown in [3], the 142nd Leu of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Val.

【０１０３】[0103]

【表１３】 [Table 13]

【０１０４】［実施例１９］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１４） αサブユニットの１４６番目のＧｌｕをＡｓｐに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 19] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (14) In order to replace Glu at position 146 of the α subunit with Asp, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１０５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２５
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 25 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１０６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１０７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１４［表１
４］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１４６番目のＧｌｕがＡｓｐに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 14 [Table 1
In the clone shown in [4], Glu at position 146 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Asp.

【０１０８】[0108]

【表１４】 [Table 14]

【０１０９】［実施例２０］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１５） αサブユニットの１８７番目のＡｌａをＴｈｒに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 20] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (15) In order to substitute Ala at the 187th position of the α subunit with Thr, using pPT-DB1 plasmid DNA as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１１０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２６
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 26 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１１１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１１２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１５［表１
５］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１８７番目のＡｌａがＴｈｒに置換さ
れていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 15 [Table 1
In the clone shown in 5], Ala at position 187 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Thr.

【０１１３】[0113]

【表１５】 [Table 15]

【０１１４】［実施例２１］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１６） αサブユニットの１９４番目のＳｅｒをＬｅｕに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 21] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (16) In order to substitute Ser at position 194 of the α subunit with Leu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１１５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２７
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 27 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１１６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１１７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１６［表１
６］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの１９４番目のＳｅｒがＬｅｕに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 16 [Table 1
In the clone shown in [6], Ser at position 194 of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Leu.

【０１１８】[0118]

【表１６】 [Table 16]

【０１１９】［実施例２２］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１７） αサブユニットの２０３番目のＡｌａをＧｌｕに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 22] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (17) In order to substitute Alu at position 203 of the α subunit with Glu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１２０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２８
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 28 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１２１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１２２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１７［表１
７］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
αサブユニットの２０３番目のＡｌａがＧｌｕに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 17 [Table 1
In the clone shown in [7], Ala at the 203rd position of the α subunit of nitrile hydratase was replaced with Glu.

【０１２３】[0123]

【表１７】 [Table 17]

【０１２４】［実施例２３］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１８） βサブユニットの２０番目のＡｌａをＶａｌに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 23] Obtainment of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (18) [0124] In order to substitute 20th Ala of β subunit with Val, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１２５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号２９
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 29 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１２６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１２７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１８［表１
８］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２０番目のＡｌａがＶａｌに変換され
ていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 18 [Table 1
In the clone shown in [8], the 20th Ala of the β subunit of nitrile hydratase was converted to Val.

【０１２８】[0128]

【表１８】 [Table 18]

【０１２９】［実施例２４］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（１９） βサブユニットの２１番目のＡｓｐをＡｓｎに置換する
ために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 24] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (19) [0129] In order to substitute Asn for Asp at position 21 of the β subunit, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１３０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３０
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 30 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１３１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１３２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１９［表１
９］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２１番目のＡｓｐがＡｓｎに置換され
ていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 19 [Table 1
In the clone shown in [9], the 21st Asp of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Asn.

【０１３３】[0133]

【表１９】 [Table 19]

【０１３４】［実施例２５］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２０） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 25] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (20) In order to replace Glu at position 108 of the β subunit with Asp, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１３５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３１
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 31 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１３６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１３７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２０［表２
０］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに置換さ
れていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 20 [Table 2
In the clone shown in [0], Glu at position 108 of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Asp.

【０１３８】[0138]

【表２０】 [Table 20]

【０１３９】［実施例２６］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２１） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＰｒｏに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 26] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (21) In order to substitute Glu at position 108 of β subunit with Pro, using pPT-DB1 plasmid DNA as a template Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１４０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３２
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two types of PCR reactions were carried out using 1 μg of the pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 32 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１４１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity-expressing medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１４２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２１［表２
１］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＰｒｏに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 21 [Table 2
In the clone shown in 1], Glu at the 108th position of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Pro.

【０１４３】[0143]

【表２１】 [Table 21]

【０１４４】［実施例２７］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２２） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＳｅｒに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 27] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (22) In order to substitute Glu at position 108 of β subunit with Ser, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１４５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３３
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 33 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１４６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１４７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２２［表２
２］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＳｅｒに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 22 [Table 2
In the clone shown in [2], Glu at the 108th position of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Ser.

【０１４８】[0148]

【表２２】 [Table 22]

【０１４９】［実施例２８］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２３） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 28] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (23) In order to replace Glu at position 108 of β subunit with Arg, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１５０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３４
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 34 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１５１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１５２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２３［表２
３］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 23 [Table 2
In the clone shown in [3], the 108th Glu of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Arg.

【０１５３】[0153]

【表２３】 [Table 23]

【０１５４】［実施例２９］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２４） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＣｙｓに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 29] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (24) [0154] In order to replace Glu at position 108 of the β subunit with Cys, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１５５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３５
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 35 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１５６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity-expressing medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１５７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２４［表２
４］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＣｙｓに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 24 [Table 2
In the clone shown in 4], Glu at the 108th position of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Cys.

【０１５８】[0158]

【表２４】 [Table 24]

【０１５９】［実施例３０］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２５） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＬｅｕに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 30] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (25) In order to replace Glu at position 108 of the β subunit with Leu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１６０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３６
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 36 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１６１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white ears and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１６２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２５［表２
５］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＬｅｕに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 25 [Table 2
In the clone shown in [5], Glu at the 108th position of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Leu.

【０１６３】[0163]

【表２５】 [Table 25]

【０１６４】［実施例３１］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２６） βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＴｈｒに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 31] Obtainment of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (26) [0164] In order to substitute Glu at position 108 of the β subunit with Thr, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１６５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３７
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 37 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１６６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１６７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２６［表２
６］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＴｈｒに置換さ
れていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 26 [Table 2
In the clone shown in [6], Glu at position 108 of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Thr.

【０１６８】[0168]

【表２６】 [Table 26]

【０１６９】［実施例３２］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２７） βサブユニットの２００番目のＡｌａをＡｓｐに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 32] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (27) In order to substitute Asp at position 200 of the β subunit with Asp, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１７０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３８
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 38 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１７１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity-expressing medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１７２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２７［表２
７］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２００番目のＡｌａがＡｓｐに置換さ
れていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 27 [Table 2
In the clone shown in [7], the 200th Ala of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Asp.

【０１７３】[0173]

【表２７】 [Table 27]

【０１７４】［実施例３３］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２８） βサブユニットの２００番目のＡｌａをＩｌｅに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 33] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (28) [0174] In order to substitute Ale at position 200 of β subunit with Ile, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１７５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３９
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 39 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１７６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１７７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２８［表２
８］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２００番目のＡｌａがＩｌｅに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 28 [Table 2
In the clone shown in [8], the 200th Ala of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Ile.

【０１７８】[0178]

【表２８】 [Table 28]

【０１７９】［実施例３４］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（２９） βサブユニットの２００番目のＡｌａをＶａｌに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。Example 34 Acquisition of Amino Acid Substitute Having Retention of Nitrile Hydratase Activity (29) In order to replace 200th Ala of β subunit with Val, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１８０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号４０
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 40 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１８１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１８２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２９［表２
９］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２００番目のＡｌａがＶａｌに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 29 [Table 2
In the clone shown in [9], the 200th Ala of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Val.

【０１８３】[0183]

【表２９】 [Table 29]

【０１８４】［実施例３５］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３０） βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。Example 35 Acquisition of Amino Acid Substitute Having Retention of Nitrile Hydratase Activity (30) In order to replace Ala at position 200 of β subunit with Glu, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１８５】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号４１
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the plasmid DNA of pPT-DB1 prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 41 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１８６】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１８７】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３０［表３
０］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕに置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 30 [Table 3
0], the 200th Ala of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Glu.

【０１８８】[0188]

【表３０】 [Table 30]

【０１８９】［実施例３６］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３１） βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒに置換す
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
て、実施例６と同様の操作により部位特異的な変異導入
を行った。[Example 36] Acquisition of amino acid substitutions retaining nitrile hydratase activity (31) [0189] In order to substitute Ser at position 212 of the β subunit with Tyr, pPT-DB1 plasmid DNA was used as a template. Site-specific mutagenesis was performed by the same operation as in 6.

【０１９０】実施例６で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラ
スミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を
行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号４２
記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の
配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）
３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイ
クル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２
は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配列
を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号
１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μ
ｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ
反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎ
ｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたア
ガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によ
りＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操作
により大腸菌バンクを調製した。Two kinds of PCR reactions were carried out using 1 μg of the pPT-DB1 plasmid DNA prepared in Example 6 as a template. PCR reaction No. 1 is SEQ ID NO: 42 in the sequence listing
A total volume of 50 μl containing 50 pmol each of the described primer and M13 primer M4 (sequence is described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit)
Heat denaturation (98 ° C) for 15 seconds, annealing (55 ° C)
It was carried out by repeating the condition of 30 seconds and extension reaction (72 ° C.) 120 seconds for 25 cycles. PCR reaction No. Two
Is a total amount of 50 μm including 50 pmol of MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of sequence listing).
1 system (the composition depends on the conditions described in the kit), PCR
Reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction N
o. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１９１】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１９２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３１［表３
１］に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼの
βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換さ
れていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 31 [Table 3
In the clone shown in [1], Ser at position 212 of the β subunit of nitrile hydratase was replaced with Tyr.

【０１９３】[0193]

【表３１】 [Table 31]

【０１９４】［実施例３７］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３２） クローンＮｏ．５株のアミノ酸変異（αサブユニットの
１９番目：ＡｌａがＶａｌ）とクローンＮｏ．１１株の
アミノ酸変異（αサブユニットの１２６番目：Ｐｈｅが
Ｔｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニ
トリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認し
た。[Example 37] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (32) Clone No. Amino acid mutation (19th α subunit: Ala is Val) of 5 strains and clone No. It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitution product having both the 11 amino acid mutations (126 of the α subunit: Phe is Tyr).

【０１９５】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例１６で得ら
れたクローンＮｏ．１１株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１１
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 16 was used. Eleven strains were inoculated with monospores at 37 ° C.
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 11
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０１９６】クローンＮｏ．１１株のプラスミドＤＮＡ
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１６記載のプライ
マー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０
に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの
系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プラ
イマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１
３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記
載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と
同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮ
ｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳
動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産
物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認
できた。以後、実施例６と全く同じ操作により大腸菌バ
ンクを調製した。Clone No. 11 strains of plasmid DNA
Two kinds of PCR reactions were performed using 1 μg as a template. PC
R reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing and M13 primer M4 (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
In a total amount of 50 μl each containing 50 pmol of each sequence (the composition depends on the conditions described in the kit), and heat denaturation (9
It was carried out by repeating 15 cycles of 15 seconds at 8 ° C., 30 seconds at annealing (55 ° C.) and 120 seconds at extension reaction (72 ° C.) for 25 cycles. PCR reaction No. 2 is MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of Sequence Listing) and M1
PCR reaction No. 3 was carried out in a total volume of 50 μl containing 50 pmol of each of 3 primer RVs (sequences are shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit). It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and N
o. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０１９７】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０１９８】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３２［表３
２］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのα
サブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユ
ニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換さ
れていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 32 [Table 3
As shown in [2], α of wild-type nitrile hydratase
The 19th Ala of the subunit was replaced with Val and the 126th Phe of the α subunit was replaced with Tyr.

【０１９９】[0199]

【表３２】 [Table 32]

【０２００】［実施例３８］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３３） クローンＮｏ．１株のアミノ酸変異（αサブユニットの
６番目：ＬｅｕがＭｅｔ）とクローンＮｏ．３２株のア
ミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａ
ｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を
共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒド
ラターゼ活性が保持されていることを確認した。[Example 38] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (33) Clone No. Amino acid mutation of strain 1 (6th α subunit: Leu is Met) and clone No. Amino acid mutation in 32 strains (19th Ala of α subunit is Va
1; It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in an amino acid substitution product in which Phe at position 126 of the α subunit has Tyr).

【０２０１】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例３７で得ら
れたクローンＮｏ．３２株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３２
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 37 was used. 32 strains were inoculated with monospores of ear strains at 37 ℃
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 32
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２０２】クローンＮｏ．３２株のプラスミドＤＮＡ
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号９記載のプライマ
ー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０に
配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系
（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８
℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応
（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライ
マー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１３
プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記載）
を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキッ
トに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様
の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．
２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動
（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物
の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認で
きた。以後、実施例６と全く同じ操作により大腸菌バン
クを調製した。Clone No. 32 strains of plasmid DNA
Two kinds of PCR reactions were performed using 1 μg as a template. PC
R reaction No. 1 is a system (50 μl in total) containing 50 pmol each of the primer described in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing and M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit) (98
C.) for 15 seconds, annealing (55.degree. C.) for 30 seconds, and extension reaction (72.degree. C.) for 120 seconds. PCR reaction No. 2 is MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of Sequence Listing) and M13
Primer RV (sequence described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing)
In a total amount of 50 μl containing 50 pmol of each (the composition depends on the conditions described in the kit), and the PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and No.
When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２０３】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２０４】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３３［表３
３］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのα
サブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニ
ットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの
１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されてい
た。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 33 [Table 3
[3], α of wild-type nitrile hydratase
The 6th Leu of the subunit was replaced with Met, the 19th Ala of the α subunit was replaced with Val, and the 126th Phe of the α subunit was replaced with Tyr.

【０２０５】[0205]

【表３３】 [Table 33]

【０２０６】［実施例３９］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３４） クローンＮｏ．２株のアミノ酸変異（αサブユニットの
６番目：ＬｅｕがＴｈｒ）とクローンＮｏ．３２株のア
ミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａ
ｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を
共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒド
ラターゼ活性が保持されていることを確認した。[Example 39] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (34) Clone No. Amino acid mutations in the 2 strains (6th α subunit: Leu is Thr) and clone No. Amino acid mutation in 32 strains (19th Ala of α subunit is Va
1; It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in an amino acid substitution product in which Phe at position 126 of the α subunit has Tyr).

【０２０７】実施例３８で調製したクローンＮｏ．３２
株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列
番号１３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４
（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍ
ｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件
による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング
（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件
を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１
１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の
配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌ
を用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増
幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例６と全
く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。Clone No. prepared in Example 38. 32
Two types of PC using 1 μg of plasmid DNA of the strain as a template
The R reaction was performed. PCR reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 13 of the sequence listing and M13 primer M4
50 pm each (listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing)
25 cycles of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds in a total volume of 50 μl (including composition) according to the conditions described in the kit. Went by. PCR reaction No. 2 is a MUT4 primer (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
1) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) in a total volume of 50 μl (the composition depends on the conditions described in the kit).
PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. P
CR reaction No. 1 and No. 5 μl for each reaction completion solution
The presence of the amplified DNA product was confirmed by analyzing the DNA amplification product by agarose gel electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight). Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２０８】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the active expression medium of Example 6 for each white bacterium ear, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２０９】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３４［表３
４］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのα
サブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニ
ットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの
１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されてい
た。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 34 [Table 3
[4], the wild type nitrile hydratase α
The 6th Leu of the subunit was replaced with Thr, the 19th Ala of the α subunit was replaced with Val, and the 126th Phe of the α subunit was replaced with Tyr.

【０２１０】[0210]

【表３４】 [Table 34]

【０２１１】［実施例４０］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３５） クローンＮｏ．３株のアミノ酸変異（αサブユニットの
６番目：ＬｅｕがＡｌａ）とクローンＮｏ．３２株のア
ミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａ
ｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を
共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒド
ラターゼ活性が保持されていることを確認した。[Example 40] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (35) Clone No. Amino acid mutations in the 3 strains (6th α subunit: Leu is Ala) and clone No. Amino acid mutation in 32 strains (19th Ala of α subunit is Va
1; It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in an amino acid substitution product in which Phe at position 126 of the α subunit has Tyr).

【０２１２】実施例３８で調製したクローンＮｏ．３２
株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列
番号１４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４
（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍ
ｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件
による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング
（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件
を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１
１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の
配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌ
を用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増
幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例６と全
く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。Clone No. prepared in Example 38. 32
Two types of PC using 1 μg of plasmid DNA of the strain as a template
The R reaction was performed. PCR reaction No. 1 is the primer of SEQ ID NO: 14 in the sequence listing and M13 primer M4
50 pm each (listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing)
25 cycles of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds in a total volume of 50 μl (including composition) according to the conditions described in the kit. Went by. PCR reaction No. 2 is a MUT4 primer (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
1) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) in a total volume of 50 μl (the composition depends on the conditions described in the kit).
PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. P
CR reaction No. 1 and No. 5 μl for each reaction completion solution
The presence of the amplified DNA product was confirmed by analyzing the DNA amplification product by agarose gel electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight). Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２１３】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２１４】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３５［表３
５］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのα
サブユニットの６番目のＬｅｕがＡｌａに、αサブユニ
ットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの
１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されてい
た。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 35 [Table 3
[5], α of wild-type nitrile hydratase
The 6th Leu of the subunit was replaced with Ala, the 19th Ala of the α subunit was replaced with Val, and the 126th Phe of the α subunit was replaced with Tyr.

【０２１５】[0215]

【表３５】 [Table 35]

【０２１６】［実施例４１］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３６） クローンＮｏ．２０株のアミノ酸変異（βサブユニット
の１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ）とクローンＮｏ．３１
株のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：Ｓｅ
ｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体において
もニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確
認した。[Example 41] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (36) Clone No. Amino acid mutations of strain 20 (β subunit 108: Glu is Asp) and clone No. 20. 31
Amino acid mutation in the strain (212nd β subunit: Se
It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in the amino acid substitution product in which r has both Tyr).

【０２１７】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例３６で得ら
れたクローンＮｏ．３１株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３１
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium so that the final concentration was 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 36 was used. 31 strains were inoculated with monospores at 37 ° C.
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 31
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２１８】クローンＮｏ．３１株のプラスミドＤＮＡ
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３１記載のプライ
マー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０
に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの
系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プラ
イマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１
３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記
載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と
同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮ
ｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳
動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産
物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認
できた。以後、実施例６と全く同じ操作により大腸菌バ
ンクを調製した。Clone No. 31 strains of plasmid DNA
Two kinds of PCR reactions were performed using 1 μg as a template. PC
R reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing and M13 primer M4 (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
In a total amount of 50 μl each containing 50 pmol of each sequence (the composition depends on the conditions described in the kit), and heat denaturation (9
It was carried out by repeating 15 cycles of 15 seconds at 8 ° C., 30 seconds at annealing (55 ° C.) and 120 seconds at extension reaction (72 ° C.) for 25 cycles. PCR reaction No. 2 is MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of Sequence Listing) and M1
PCR reaction No. 3 was carried out in a total volume of 50 μl containing 50 pmol of each of 3 primer RVs (sequences are shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit). It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and N
o. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２１９】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２２０】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３６［表３
６］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブ
ユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換
されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 36 [Table 3
[6], β of wild-type nitrile hydratase
Glu at the 108th subunit was replaced with Asp, and Ser at the 212th β subunit was replaced with Tyr.

【０２２１】[0221]

【表３６】 [Table 36]

【０２２２】［実施例４２］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３７） クローンＮｏ．２３株のアミノ酸変異（βサブユニット
の１０８番目：ＧｌｕがＡｒｇ）とクローンＮｏ．３１
株のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：Ｓｅ
ｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体において
もニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確
認した。[Example 42] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (37) Clone No. Amino acid mutation of the 23 strain (108 of β subunit: Glu is Arg) and clone No. 31
Amino acid mutation in the strain (212nd β subunit: Se
It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in the amino acid substitution product in which r has both Tyr).

【０２２３】実施例４１で調製したクローンＮｏ．３１
株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列
番号３４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４
（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍ
ｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件
による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング
（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件
を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１
１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の
配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌ
を用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増
幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例６と全
く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。Clone No. prepared in Example 41. 31
Two types of PC using 1 μg of plasmid DNA of the strain as a template
The R reaction was performed. PCR reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 34 of the sequence listing and M13 primer M4
50 pm each (listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing)
25 cycles of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds in a total volume of 50 μl (including composition) according to the conditions described in the kit. Went by. PCR reaction No. 2 is a MUT4 primer (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
1) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) in a total volume of 50 μl (the composition depends on the conditions described in the kit).
PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. P
CR reaction No. 1 and No. 5 μl for each reaction completion solution
The presence of the amplified DNA product was confirmed by analyzing the DNA amplification product by agarose gel electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight). Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２２４】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２２５】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３７［表３
７］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブ
ユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換
されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 37 [Table 3
[7], β of wild-type nitrile hydratase
The 108th Glu of the subunit was replaced with Arg, and the 212th Ser of the β subunit was replaced with Tyr.

【０２２６】[0226]

【表３７】 [Table 37]

【０２２７】［実施例４３］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３８） クローンＮｏ．２７株のアミノ酸変異（βサブユニット
の２００番目：ＡｌａがＡｓｐ）とクローンＮｏ．３１
株のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：Ｓｅ
ｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体において
もニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確
認した。[Example 43] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (38) Clone No. Amino acid mutation of the 27th strain (200th β subunit: Ala is Asp) and clone No. 31
Amino acid mutation in the strain (212nd β subunit: Se
It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in the amino acid substitution product in which r has both Tyr).

【０２２８】実施例４１で調製したクローンＮｏ．３１
株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列
番号３８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４
（配列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍ
ｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件
による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング
（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件
を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１
１に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の
配列番号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全
量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）
で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。Ｐ
ＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌ
を用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重
量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増
幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例６と全
く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。Clone No. prepared in Example 41. 31
Two types of PC using 1 μg of plasmid DNA of the strain as a template
The R reaction was performed. PCR reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 38 of the sequence listing and M13 primer M4
50 pm each (listed in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing)
25 cycles of heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55 ° C.) for 30 seconds, and extension reaction (72 ° C.) for 120 seconds in a total volume of 50 μl (including composition) according to the conditions described in the kit. Went by. PCR reaction No. 2 is a MUT4 primer (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
1) and M13 primer RV (sequence is shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) in a total volume of 50 μl (the composition depends on the conditions described in the kit).
PCR reaction No. It carried out by the same operation as 1. P
CR reaction No. 1 and No. 5 μl for each reaction completion solution
The presence of the amplified DNA product was confirmed by analyzing the DNA amplification product by agarose gel electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight). Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２２９】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white bacterium ear and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２３０】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３８［表３
８］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットの２００番目のＡｌａがＡｓｐに、βサブ
ユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換
されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 38 [Table 3
[8], β of wild-type nitrile hydratase
The 200th Ala of the subunit was replaced with Asp, and the 212th Ser of the β subunit was replaced with Tyr.

【０２３１】[0231]

【表３８】 [Table 38]

【０２３２】［実施例４４］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（３９） クローンＮｏ．３０株のアミノ酸変異（βサブユニット
の２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）とクローンＮｏ．３１
株のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：Ｓｅ
ｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体において
もニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確
認した。[Example 44] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (39) Clone No. Amino acid mutation of the 30 strain (200th β subunit: Ala is Glu) and clone No. 31
Amino acid mutation in the strain (212nd β subunit: Se
It was confirmed that the nitrile hydratase activity is retained even in the amino acid substitution product in which r has both Tyr).

【０２３３】実施例４１で調製したクローンＮｏ．３１
株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列
番４１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配
列表の配列番号１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ
含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件によ
る）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５
℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５
サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．
２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号１１に配
列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番
号１２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０
μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応
Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いた
アガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ
産物の存在が確認できた。以後、実施例６と全く同じ操
作により大腸菌バンクを調製した。Clone No. prepared in Example 41. 31
Two types of PC using 1 μg of plasmid DNA of the strain as a template
The R reaction was performed. PCR reaction No. 1 is 50 pmol each of the primer described in SEQ ID NO: 41 of the sequence listing and the M13 primer M4 (sequence described in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing)
In a total volume of 50 μl (including composition according to the conditions described in the kit), heat denaturation (98 ° C.) for 15 seconds, annealing (55
℃) 30 seconds, extension reaction (72 ℃) 120 seconds conditions of 25
This was done by repeating the cycle. PCR reaction No.
2 is a total amount of 50 pmol each containing 50 pmol of MUT4 primer (sequence is listed in SEQ ID NO: 11 of sequence listing) and M13 primer RV (sequence is listed in SEQ ID NO: 12 of sequence listing)
μl system (composition depends on the conditions stated in the kit), PC
R reaction No. It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and No. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl of each reaction-terminating solution of 2, the amplified DNA was obtained.
The presence of the product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２３４】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２３５】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３９［表３
９］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕに、βサブ
ユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換
されていた。The cells of the 4 clones were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 39 [Table 3
[9], β of wild-type nitrile hydratase
The 200th Ala of the subunit was replaced with Glu, and the 212th Ser of the β subunit was replaced with Tyr.

【０２３６】[0236]

【表３９】 [Table 39]

【０２３７】［実施例４５］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（４０） クローンＮｏ．２３株のアミノ酸変異（βサブユニット
の１０８番目：ＧｌｕがＡｒｇ）とクローンＮｏ．３９
株のアミノ酸変異（βサブユニットの２００番目のＡｌ
ａがＧｌｕ；βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴ
ｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニト
リルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認し
た。[Example 45] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (40) Clone No. Amino acid mutation of the 23 strain (108 of β subunit: Glu is Arg) and clone No. 39
Amino acid mutation of the strain (200th Al of β subunit
a is Glu; 212th Ser of β subunit is T
It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitution product having both yr).

【０２３８】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例４４で得ら
れたクローンＮｏ．３９株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３９
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 44 was used. 39 strains were inoculated with monospores at 37 ° C.
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 39
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２３９】クローンＮｏ．３９株のプラスミドＤＮＡ
１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣ
Ｒ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号３４記載のプライ
マー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号１０
に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの
系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プラ
イマー（配列表の配列番号１１に配列を記載）及びＭ１
３プライマーＲＶ（配列表の配列番号１２に配列を記
載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成は
キットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と
同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮ
ｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳
動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産
物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認
できた。以後、実施例６と全く同じ操作により大腸菌バ
ンクを調製した。Clone No. 39 strains of plasmid DNA
Two kinds of PCR reactions were performed using 1 μg as a template. PC
R reaction No. 1 is the primer described in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing and M13 primer M4 (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing).
In a total amount of 50 μl each containing 50 pmol of each sequence (the composition depends on the conditions described in the kit), and heat denaturation (9
It was carried out by repeating 15 cycles of 15 seconds at 8 ° C., 30 seconds at annealing (55 ° C.) and 120 seconds at extension reaction (72 ° C.) for 25 cycles. PCR reaction No. 2 is MUT4 primer (sequence is shown in SEQ ID NO: 11 of Sequence Listing) and M1
PCR reaction No. 3 was carried out in a total volume of 50 μl containing 50 pmol of each of 3 primer RVs (sequences are shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing) (composition depends on the conditions described in the kit). It carried out by the same operation as 1. PCR reaction No. 1 and N
o. When the DNA amplification product was analyzed by agarose electrophoresis (agarose concentration 1.0% by weight) using 5 μl each of the reaction-completed solution of 2, the presence of the amplified DNA product was confirmed. Thereafter, an E. coli bank was prepared by the same procedure as in Example 6.

【０２４０】該大腸菌バンクより任意に選別した５クロ
ーンを実施例６の活性発現培地１０ｍｌに各一白菌耳ず
つ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養し
た。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブ
に分取した後、実施例６と同様の操作によりニトリルヒ
ドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４
クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリル
ヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。Five clones arbitrarily selected from the Escherichia coli bank were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6 for each white ears, and cultured at 37 ° C. and 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture-finished solution was collected in an appropriate centrifuge tube, and the nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in Example 6. As a result, 4 out of 5 clones
Generation of acrylamide was detected in the clone, and it was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained.

【０２４１】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれ
ぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンの
プラスミドＤＮＡを調製した。続いて、実施例２と同様
の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺
伝子の塩基配列を決定した。その結果、表４０［表４
０］に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブ
ユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕに、βサブユニ
ットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換され
ていた。The cells of the four clones were separated from the remaining 1 ml of the culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and the plasmid DNA of each clone was prepared by the alkaline SDS extraction method. Then, the nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of each clone was determined by the same operation as in Example 2. As a result, Table 40 [Table 4
0], β of wild-type nitrile hydratase
The 108th Glu of the subunit was replaced with Arg, the 200th Ala of the β subunit was replaced with Glu, and the 212nd Ser of the β subunit was replaced with Tyr.

【０２４２】[0242]

【表４０】 [Table 40]

【０２４３】［実施例４６］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（４１） クローンＮｏ．３４株のアミノ酸変異とクローンＮｏ．
３６株のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体
においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されている
ことを確認した。[Example 46] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (41) Clone No. Amino acid mutation of strain 34 and clone No.
It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitutions having 36 amino acid mutations.

【０２４４】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例３９で得ら
れたクローンＮｏ．３４株および実施例４１で得られた
クローンＮｏ．３６株を一白菌耳植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適
当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００
ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続い
てアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮ
ｏ．３４株及びクローンＮｏ．３６株のプラスミドＤＮ
Ａをそれぞれ調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 39 was used. 34 strain and the clone No. obtained in Example 41. Thirty-six strains were inoculated with monospores of ear strains at 37 ℃
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution was collected in an appropriate centrifuge tube and then centrifuged (15000).
Each bacterial cell was separated by (rpm × 5 minutes). Subsequently, clone N was extracted from the cells by alkaline SDS extraction method.
o. 34 strain and clone no. 36 strains of plasmid DN
A was prepared respectively.

【０２４５】クローンＮｏ．３６株のプラスミドＤＮＡ
上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＮｏ
ｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した後、アガロー
スゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロ
ース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロー
スゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同
様に、クローンＮｏ．３４株のプラスミドＤＮＡ上の唯
一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによ
り該プラスミドＤＮＡを切断した後、アガロースゲル電
気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使
用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲル
から約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだ
した両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍ
ｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温し
てアガロースを完全に融解させた。この融解液に対して
実施例２と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエタ
ノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１
０μｌのＴＥに溶解した。Clone No. 36 strains of plasmid DNA
The only restriction enzyme sites above are EcoRI and No
After cleaving the plasmid DNA with tI, agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 1.0%) was performed to cut out a DNA fragment of about 770 bp from the agarose gel. Similarly, clone no. After cleaving the plasmid DNA with EcoRI and NotI, which are the only restriction enzyme sites on the plasmid DNA of 34 strains, agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 0.7%) was performed. A DNA fragment of about 3.8 kbp was cut out from an agarose gel. Cut both agarose pieces (about 0.1g) into 1m
After being suspended in each 1 l of TE solution, the agarose was completely melted by incubating at 55 ° C. for 1 hour. The melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify each DNA fragment, and finally 1
It was dissolved in 0 μl TE.

【０２４６】この様にして得られたクローンＮｏ．３６
株由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３
４株由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてｐＰ
Ｔ−ＤＢ４１を構築した。このｐＰＴ−ＤＢ４１プラス
ミドＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東
洋紡績社製）に導入し、大腸菌クローンＮｏ．４１株を
得た。[0246] The clone No. 36
About 770 bp DNA fragment derived from the strain and clone No. Three
About 3.8 Kbp DNA fragments derived from 4 strains were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo) to obtain pP.
T-DB41 was constructed. This pPT-DB41 plasmid DNA was introduced into a competent cell of Escherichia coli HB101 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and E. coli clone No. 41 strains were obtained.

【０２４７】クローンＮｏ．４１株を実施例６の活性発
現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌ
をそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、実施例６
と同様の操作によりニトリルヒドラターゼ活性を測定し
た。その結果、アクリルアミドの生成が検出され、クロ
ーンＮｏ．４１株は、ニトリルヒドラターゼ活性を保持
していることが確認された。Clone No. Forty-one strains were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, at 37 ° C.
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture completion liquid
Example 6 after separating each of them into an appropriate centrifuge tube
The nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in. As a result, the production of acrylamide was detected, and clone No. It was confirmed that 41 strains retain nitrile hydratase activity.

【０２４８】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより菌体を分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、実施例２と同様の操作によりクローンＮ
ｏ．４１株のニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配
列を決定した。その結果、表４１［表４１］に示したよ
うに野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの
６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目
のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰ
ｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕ
がＡｓｐに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴ
ｙｒにそれぞれ置換されていた。The cells were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and alkali S
The plasmid DNA of each clone was prepared by the DS extraction method. Then, by the same operation as in Example 2, clone N
o. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of strain 41 was determined. As a result, as shown in Table 41 [Table 41], Leu at position 6 of the α subunit of wild-type nitrile hydratase was in Thr, Ala at position 19 of the α subunit was in Val, and 126 of α subunit was 126. Th P
he is Tyr and the 108th Glu of β subunit
Is the Asp and the 212th Ser of the β subunit is T
were each replaced by yr.

【０２４９】[0249]

【表４１】 [Table 41]

【０２５０】［実施例４７］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（４２） クローンＮｏ．３４株のアミノ酸変異とクローンＮｏ．
３７株のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体
においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されている
ことを確認した。[Example 47] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (42) Clone No. Amino acid mutation of strain 34 and clone No.
It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitutions having the 37 amino acid mutations.

【０２５１】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例４２で得ら
れたクローンＮｏ．３７株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３７
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 42 was used. 37 strains were inoculated with 1 Saccharomyces cerevisiae at 37 ℃
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 37
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２５２】クローンＮｏ．３７株のプラスミドＤＮＡ
上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＮｏ
ｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した後、アガロー
スゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロ
ース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロー
スゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同
様に、実施例４６で調製したクローンＮｏ．３４株のプ
ラスミドＤＮＡ上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏ
ＲIおよびＮｏｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した
後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ
低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行
い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）
を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５
５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対して実施例２と同様のフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。Clone No. Plasmid DNA of 37 strains
The only restriction enzyme sites above are EcoRI and No
After cleaving the plasmid DNA with tI, agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 1.0%) was performed to cut out a DNA fragment of about 770 bp from the agarose gel. Similarly, the clone No. prepared in Example 46 was used. Eco which is the only restriction enzyme site on plasmid DNA of 34 strains
After cleaving the plasmid DNA with RI and NotI, agarose gel electrophoresis (Type VII manufactured by Sigma)
Low melting point agarose was used; agarose concentration was 0.7%), and a DNA fragment of about 3.8 kbp was cut out from the agarose gel. Both pieces of agarose cut out (about 0.1g)
Finely crushed and suspended in 1 ml of TE solution, then 5
The agarose was completely melted by incubating at 5 ° C for 1 hour.
The melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify each DNA fragment, and finally dissolved in 10 μl of TE.

【０２５３】この様にして得られたクローンＮｏ．３７
株由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３
４株由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてｐＰ
Ｔ−ＤＢ４２を構築した。このｐＰＴ−ＤＢ４２プラス
ミドＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東
洋紡績社製）に導入し、大腸菌クローンＮｏ．４２株を
得た。The clone No. thus obtained was 37
About 770 bp DNA fragment derived from the strain and clone No. Three
About 3.8 Kbp DNA fragments derived from 4 strains were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo) to obtain pP.
T-DB42 was constructed. This pPT-DB42 plasmid DNA was introduced into a competent cell of Escherichia coli HB101 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and E. coli clone No. 42 strains were obtained.

【０２５４】クローンＮｏ．４２株を実施例６の活性発
現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌ
をそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、実施例６
と同様の操作によりニトリルヒドラターゼ活性を測定し
た。その結果、アクリルアミドの生成が検出され、クロ
ーンＮｏ．４２株は、ニトリルヒドラターゼ活性を保持
していることが確認された。Clone No. Forty-two strains were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, at 37 ° C.
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture completion liquid
Example 6 after separating each of them into an appropriate centrifuge tube
The nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in. As a result, the production of acrylamide was detected, and clone No. It was confirmed that 42 strains retain the nitrile hydratase activity.

【０２５５】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより菌体を分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、実施例２と同様の操作によりクローンＮ
ｏ．４２株のニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配
列を決定した。その結果、表４２［表４２］に示したよ
うに野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの
６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目
のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰ
ｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕ
がＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴ
ｙｒにそれぞれ置換されていた。Cells were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and alkali S
The plasmid DNA of each clone was prepared by the DS extraction method. Then, by the same operation as in Example 2, clone N
o. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of 42 strains was determined. As a result, as shown in Table 42 [Table 42], the 6th Leu of the α subunit of wild-type nitrile hydratase was Thr, the 19th Ala of the α subunit was Val, and the α subunit of 126 was 126 Th P
he is Tyr and the 108th Glu of β subunit
Is Arg and the 212th Ser of the β subunit is T
were each replaced by yr.

【０２５６】[0256]

【表４２】 [Table 42]

【０２５７】［実施例４８］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（４３） クローンＮｏ．３４株のアミノ酸変異とクローンＮｏ．
３９株のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体
においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されている
ことを確認した。[Example 48] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (43) Clone No. Amino acid mutation of strain 34 and clone No.
It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitutions having the 39 amino acid mutations.

【０２５８】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例４４で得ら
れたクローンＮｏ．３９株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３９
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 44 was used. 39 strains were inoculated with monospores at 37 ° C.
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 39
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２５９】クローンＮｏ．３９株のプラスミドＤＮＡ
上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＮｏ
ｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した後、アガロー
スゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロ
ース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロー
スゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同
様に、実施例４６で調製したクローンＮｏ．３４株のプ
ラスミドＤＮＡ上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏ
ＲIおよびＮｏｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した
後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ
低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行
い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）
を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５
５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対して実施例２と同様のフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。Clone No. 39 strains of plasmid DNA
The only restriction enzyme sites above are EcoRI and No
After cleaving the plasmid DNA with tI, agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 1.0%) was performed to cut out a DNA fragment of about 770 bp from the agarose gel. Similarly, the clone No. prepared in Example 46 was used. Eco which is the only restriction enzyme site on plasmid DNA of 34 strains
After cleaving the plasmid DNA with RI and NotI, agarose gel electrophoresis (Type VII manufactured by Sigma)
Low melting point agarose was used; agarose concentration was 0.7%), and a DNA fragment of about 3.8 kbp was cut out from the agarose gel. Both pieces of agarose cut out (about 0.1g)
Finely crushed and suspended in 1 ml of TE solution, then 5
The agarose was completely melted by incubating at 5 ° C for 1 hour.
The melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify each DNA fragment, and finally dissolved in 10 μl of TE.

【０２６０】この様にして得られたクローンＮｏ．３９
株由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３
４株由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてｐＰ
Ｔ−ＤＢ４３を構築した。このｐＰＴ−ＤＢ４３プラス
ミドＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東
洋紡績社製）に導入し、大腸菌クローンＮｏ．４３株を
得た。[0260] Thus obtained clone No. 39
About 770 bp DNA fragment derived from the strain and clone No. Three
About 3.8 Kbp DNA fragments derived from 4 strains were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo) to obtain pP.
T-DB43 was constructed. This pPT-DB43 plasmid DNA was introduced into a competent cell of Escherichia coli HB101 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and E. coli clone No. 43 strains were obtained.

【０２６１】クローンＮｏ．４３株を実施例６の活性発
現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌ
をそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、実施例６
と同様の操作によりニトリルヒドラターゼ活性を測定し
た。その結果、アクリルアミドの生成が検出され、クロ
ーンＮｏ．４３株は、ニトリルヒドラターゼ活性を保持
していることが確認された。Clone No. Forty-three strains were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, at 37 ° C.
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture completion liquid
Example 6 after separating each of them into an appropriate centrifuge tube
The nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in. As a result, the production of acrylamide was detected, and clone No. It was confirmed that 43 strains retained nitrile hydratase activity.

【０２６２】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより菌体を分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、実施例２と同様の操作によりクローンＮ
ｏ．４３株のニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配
列を決定した。その結果、表４３［表４３］に示したよ
うに野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの
６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目
のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰ
ｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの２００番目のＡｌａ
がＧｌｕに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴ
ｙｒにそれぞれ置換されていた。The cells were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and alkali S
The plasmid DNA of each clone was prepared by the DS extraction method. Then, by the same operation as in Example 2, clone N
o. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of 43 strains was determined. As a result, as shown in Table 43 [Table 43], the sixth Leu of the α subunit of the wild-type nitrile hydratase was Thr, the 19th Ala of the α subunit was Val, and the α subunit 126 was 126. Th P
he is Tyr and 200th Ala of β subunit
Is Glu and the 212th Ser of the β subunit is T
were each replaced by yr.

【０２６３】[0263]

【表４３】 [Table 43]

【０２６４】［実施例４９］ニトリルヒドラターゼ活性
を保持したアミノ酸置換体の取得（４４） クローンＮｏ．３４株のアミノ酸変異とクローンＮｏ．
４０株のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体
においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されている
ことを確認した。[Example 49] Acquisition of amino acid substitution product retaining nitrile hydratase activity (44) Clone No. Amino acid mutation of strain 34 and clone No.
It was confirmed that the nitrile hydratase activity was retained even in the amino acid substitutions having the 40 amino acid mutations.

【０２６５】３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、実施例４５で得ら
れたクローンＮｏ．４０株を一白菌耳植菌し、３７℃・
３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌ
を適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０
００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアル
カリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．４０
株のプラスミドＤＮＡを調製した。10 ml of LB liquid medium was prepared in a 30 ml test tube and sterilized by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. Ampicillin was added to this medium to a final concentration of 100 μg / ml, and then clone No. 1 obtained in Example 45 was used. 40 strains were inoculated with monospores at 37 ° C.
The culture was performed at 300 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture solution
Into a suitable centrifuge tube and then centrifuge (150
The cells were separated by (00 rpm × 5 minutes). Subsequently, the clone No. was extracted from the cells by the alkaline SDS extraction method. 40
The strain's plasmid DNA was prepared.

【０２６６】クローンＮｏ．４０株のプラスミドＤＮＡ
上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＮｏ
ｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した後、アガロー
スゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロ
ース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロー
スゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同
様に、実施例４６で調製したクローンＮｏ．３４株のプ
ラスミドＤＮＡ上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏ
ＲIおよびＮｏｔIにより該プラスミドＤＮＡを切断した
後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ
低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行
い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）
を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５
５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対して実施例２と同様のフェノール／クロ
ロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。Clone No. 40 strains of plasmid DNA
The only restriction enzyme sites above are EcoRI and No
After cleaving the plasmid DNA with tI, agarose gel electrophoresis (using Sigma type VII low melting point agarose; agarose concentration 1.0%) was performed to cut out a DNA fragment of about 770 bp from the agarose gel. Similarly, the clone No. prepared in Example 46 was used. Eco which is the only restriction enzyme site on plasmid DNA of 34 strains
After cleaving the plasmid DNA with RI and NotI, agarose gel electrophoresis (Type VII manufactured by Sigma)
Low melting point agarose was used; agarose concentration was 0.7%), and a DNA fragment of about 3.8 kbp was cut out from the agarose gel. Both pieces of agarose cut out (about 0.1g)
Finely crushed and suspended in 1 ml of TE solution, then 5
The agarose was completely melted by incubating at 5 ° C for 1 hour.
The melt was subjected to the same phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation as in Example 2 to purify each DNA fragment, and finally dissolved in 10 μl of TE.

【０２６７】この様にして得られたクローンＮｏ．４０
株由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３
４株由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてｐＰ
Ｔ−ＤＢ４４を構築した。このｐＰＴ−ＤＢ４４プラス
ミドＤＮＡを大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東
洋紡績社製）に導入し、大腸菌クローンＮｏ．４４株を
得た。The clone No. thus obtained was 40
About 770 bp DNA fragment derived from the strain and clone No. Three
About 3.8 Kbp DNA fragments derived from 4 strains were ligated using a DNA ligation kit (Takara Shuzo) to obtain pP.
T-DB44 was constructed. This pPT-DB44 plasmid DNA was introduced into a competent cell of Escherichia coli HB101 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and E. coli clone No. 44 strains were obtained.

【０２６８】クローンＮｏ．４４株を実施例６の活性発
現培地１０ｍｌに各一白菌耳ずつ植菌し、３７℃・３０
０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌ
をそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、実施例６
と同様の操作によりニトリルヒドラターゼ活性を測定し
た。その結果、アクリルアミドの生成が検出され、クロ
ーンＮｏ．４４株は、ニトリルヒドラターゼ活性を保持
していることが確認された。Clone No. Forty-four strains were inoculated into 10 ml of the activity expression medium of Example 6, one ear of each white bacterium, at 37 ° C.
It was cultured at 0 rpm for about 20 hours. 1 ml of the culture completion liquid
Example 6 after separating each of them into an appropriate centrifuge tube
The nitrile hydratase activity was measured by the same procedure as in. As a result, the production of acrylamide was detected, and clone No. It was confirmed that 44 strains retain nitrile hydratase activity.

【０２６９】ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した
上記培養液の残部１ｍｌより菌体を分離し、アルカリＳ
ＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製
した。続いて、実施例２と同様の操作によりクローンＮ
ｏ．４４株のニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配
列を決定した。その結果、表４４［表４４］に示したよ
うに野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの
６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目
のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰ
ｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕ
がＡｒｇに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧ
ｌｕに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒ
にそれぞれ置換されていた。The cells were separated from the remaining 1 ml of the above culture solution used for the measurement of nitrile hydratase activity, and alkali S
The plasmid DNA of each clone was prepared by the DS extraction method. Then, by the same operation as in Example 2, clone N
o. The nucleotide sequence of the nitrile hydratase structural gene of 44 strains was determined. As a result, as shown in Table 44 [Table 44], the sixth Leu of the α subunit of wild-type nitrile hydratase was Thr, the 19th Ala of the α subunit was Val, and the α subunit 126 was 126. Th P
he is Tyr and the 108th Glu of β subunit
Is Arg and the 200th Ala of β subunit is G
The 212th Ser of β subunit is Tyr in lu
Have been replaced respectively.

【０２７０】[0270]

【表４４】 [Table 44]

【０２７１】[0271]

【発明の効果】本発明により、シュードノカルディア・
サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのアミノ酸配
列および遺伝子配列が提供される。また、該ニトリルヒ
ドラターゼの機能を実質的に変化させずに、その塩基配
列およびアミノ酸配列を変化させる方法、および、該方
法に基づいた塩基配列およびアミノ酸配列が変化したニ
トリルヒドラターゼが提供される。さらに、該遺伝子を
含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含む形質
転換菌株、該形質転換菌株を用いた該酵素の産生方法お
よび該形質転換菌株を用いたニトリル化合物からの対応
するアミド化合物の製造方法が提供される。According to the present invention, Pseudonocardia
The amino acid and gene sequences of nitrile hydratase from Thermophila are provided. Also provided are a method for changing the base sequence and the amino acid sequence of the nitrile hydratase without substantially changing the function of the nitrile hydratase, and a nitrile hydratase having the changed base sequence and the amino acid sequence based on the method. . Furthermore, a recombinant plasmid containing the gene, a transformant strain containing the recombinant plasmid, a method for producing the enzyme using the transformant strain, and production of a corresponding amide compound from a nitrile compound using the transformant strain A method is provided.

【０２７２】[0272]

【配列表】[Sequence list]

【０２７３】配列番号：１ 配列の長さ：２０５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ニトリルヒドラターゼαサブユニット 配列 Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 205 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Protein Origin Organism Name: Pseudonocardia thermo
phila Ltd. Name: JCM3095 Direct origin clone name: pPT-DB1 arrangement method to determine the characteristics features: E Other Information: nitrile hydratase α subunit sequence Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205

【０２７４】配列番号：２ 配列の長さ：２３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ニトリルヒドラターゼβサブユニット 配列 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 233SEQ ID NO: 2 Sequence Length: 233 Sequence Type: Amino Acid Topology: Linear Sequence Type: Protein Origin Organism Name: Pseudonocardia thermo
phila Ltd. Name: JCM3095 Direct origin clone name: pPT-DB1 arrangement method to determine the characteristics features: E Other Information: nitrile hydratase β subunit sequence Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 233

【０２７５】配列番号：３ 配列の長さ：６１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ニトリルヒドラターゼαサブユニット 配列 ATGACCGAGA ACATCCTGCG CAAGTCGGAC GAGGAGATCC AGAAGGAGAT CACGGCGCGG 60 GTCAAGGCCC TGGAGTCGAT GCTCATCGAA CAGGGCATCC TCACCACGTC GATGATCGAC 120 CGGATGGCCG AGATCTACGA GAACGAGGTC GGCCCGCACC TCGGCGCGAA GGTCGTCGTG 180 AAGGCCTGGA CCGACCCGGA GTTCAAGAAG CGTCTGCTCG CCGACGGCAC CGAGGCCTGC 240 AAGGAGCTCG GCATCGGCGG CCTGCAGGGC GAGGACATGA TGTGGGTGGA GAACACCGAC 300 GAGGTCCACC ACGTCGTCGT GTGCACGCTC TGCTCCTGCT ACCCGTGGCC GGTGCTGGGG 360 CTGCCGCCGA ACTGGTTCAA GGAGCCGCAG TACCGCTCCC GCGTGGTGCG TGAGCCCCGG 420 CAGCTGCTCA AGGAGGAGTT CGGCTTCGAG GTCCCGCCGA GCAAGGAGAT CAAGGTCTGG 480 GACTCCAGCT CCGAGATGCG CTTCGTCGTC CTCCCGCAGC GCCCCGCGGG CACCGACGGG 540 TGGAGCGAGG AGGAGCTCGC CACCCTCGTC ACCCGCGAGT CGATGATCGG CGTCGAACCG 600 GCGAAGGCGG TCGCGTGA 618SEQ ID NO: 3 Sequence length: 618 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-stranded topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin organism name: Pseudonocardia thermo
phila Ltd. Name: JCM3095 Direct origin clone name: pPT-DB1 method to determine the characteristics features of the sequence: E Other Information: nitrile hydratase α subunit sequence ATGACCGAGA ACATCCTGCG CAAGTCGGAC GAGGAGATCC AGAAGGAGAT CACGGCGCGG 60 GTCAAGGCCC TGGAGTCGAT GCTCATCGAA CAGGGCATCC TCACCACGTC GATGATCGAC 120 CGGATGGCCG AGATCTACGA GAACGAGGTC GGCCCGCACC TCGGCGCGAA GGTCGTCGTG 180 AAGGCCTGGA CCGACCCGGA GTTCAAGAAG CGTCTGCTCG CCGACGGCAC CGAGGCCTGC 240 AAGGAGCTCG GCATCGGCGG CCTGCAGGGC GAGGACATGA TGTGGGTGGA GAACACCGAC 300 GAGGTCCACC ACGTCGTCGT GTGCACGCTC TGCTCCTGCT ACCCGTGGCC GGTGCTGGGG 360 CTGCCGCCGA ACTGGTTCAA GGAGCCGCAG TACCGCTCCC GCGTGGTGCG TGAGCCCCGG 420 CAGCTGCTCA AGGAGGAGTT CGGCTTCGAG GTCCCGCCGA GCAAGGAGAT CAAGGTCTGG 480 GACTCCAGCT CCGAGATGCG CTTCGTCGTC CTCCCGCAGC GCCCCGCGGG CACCGACGGG 540 TGGAGCGAGG AGGAGCTCGC CACCCTCGTC ACCCGCGAGT CGATGATCGG CGTCGAACCG 600 GCGAAGGCGG TCGCGTGA 618

【０２７６】配列番号：４ 配列の長さ：７０２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ニトリルヒドラターゼβサブユニット 配列 ATGAACGGCG TGTACGACGT CGGCGGCACC GATGGGCTGG GCCCGATCAA CCGGCCCGCG 60 GACGAACCGG TCTTCCGCGC CGAGTGGGAG AAGGTCGCGT TCGCGATGTT CCCGGCGACG 120 TTCCGGGCCG GCTTCATGGG CCTGGACGAG TTCCGGTTCG GCATCGAGCA GATGAACCCG 180 GCCGAGTACC TCGAGTCGCC GTACTACTGG CACTGGATCC GCACCTACAT CCACCACGGC 240 GTCCGCACCG GCAAGATCGA TCTCGAGGAG CTGGAGCGCC GCACGCAGTA CTACCGGGAG 300 AACCCCGACG CCCCGCTGCC CGAGCACGAG CAGAAGCCGG AGTTGATCGA GTTCGTCAAC 360 CAGGCCGTCT ACGGCGGGCT GCCCGCAAGC CGGGAGGTCG ACCGACCGCC CAAGTTCAAG 420 GAGGGCGACG TGGTGCGGTT CTCCACCGCG AGCCCGAAGG GCCACGCCCG GCGCGCGCGG 480 TACGTGCGCG GCAAGACCGG GACGGTGGTC AAGCACCACG GCGCGTACAT CTACCCGGAC 540 ACCGCCGGCA ACGGCCTGGG CGAGTGCCCC GAGCACCTCT ACACCGTCCG CTTCACGGCC 600 CAGGAGCTGT GGGGGCCGGA AGGGGACCCG AACTCCAGCG TCTACTACGA CTGCTGGGAG 660 CCCTACATCG AGCTCGTCGA CACGAAGGCG GCCGCGGCAT GA 702SEQ ID NO: 4 Sequence length: 702 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-stranded topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin organism name: Pseudonocardia thermo
phila Ltd. Name: JCM3095 Direct origin clone name: pPT-DB1 method to determine the characteristics features of the sequence: E Other Information: nitrile hydratase β subunit sequence ATGAACGGCG TGTACGACGT CGGCGGCACC GATGGGCTGG GCCCGATCAA CCGGCCCGCG 60 GACGAACCGG TCTTCCGCGC CGAGTGGGAG AAGGTCGCGT TCGCGATGTT CCCGGCGACG 120 TTCCGGGCCG GCTTCATGGG CCTGGACGAG TTCCGGTTCG GCATCGAGCA GATGAACCCG 180 GCCGAGTACC TCGAGTCGCC GTACTACTGG CACTGGATCC GCACCTACAT CCACCACGGC 240 GTCCGCACCG GCAAGATCGA TCTCGAGGAG CTGGAGCGCC GCACGCAGTA CTACCGGGAG 300 AACCCCGACG CCCCGCTGCC CGAGCACGAG CAGAAGCCGG AGTTGATCGA GTTCGTCAAC 360 CAGGCCGTCT ACGGCGGGCT GCCCGCAAGC CGGGAGGTCG ACCGACCGCC CAAGTTCAAG 420 GAGGGCGACG TGGTGCGGTT CTCCACCGCG AGCCCGAAGG GCCACGCCCG GCGCGCGCGG 480 TACGTGCGCG GCAAGACCGG GACGGTGGTC AAGCACCACG GCGCGTACAT CTACCCGGAC 540 ACCGCCGGCA ACGGCCTGGG CGAGTGCCCC GAGCACCTCT ACACCGTCCG CTTCACGGCC 600 CAGGAGCTGT GGGGGCCGGA AGGGGACCCG AACTCCAGCG TCTACTACGA CTGCTGGGAG 660 CCCTACATCG AGCTCGTCGA CACGAAGGCG GCCGCGGCAT GA 702

【０２７７】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：Nは、AまたはCまたはGまたはT 配列 ACNGARAAYA TNYTNMGNAA 20SEQ ID NO: 5 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence features: N is A or C or G or T Array ACNGARAAYA TNYTNMGNAA 20

【０２７８】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：Nは、AまたはCまたはGまたはT 配列 TTNCKNARNA TRTTYTCNGT 20SEQ ID NO: 6 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence features: N is A or C or G or T Array TTNCKNARNA TRTTYTCNGT 20

【０２７９】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：Nは、AまたはCまたはGまたはT 配列 ATGAAYGGNG TNTAYGANGT 20SEQ ID NO: 7 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence features: N is A or C or G or T Array ATGAAYGGNG TNTAYGANGT 20

【０２８０】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：Nは、AまたはCまたはGまたはT 配列 ACNTCRTANA CNCCRTTCAT 20SEQ ID NO: 8 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence features: N is A or C or G or T Array ACNTCRTANA CNCCRTTCAT 20

【０２８１】配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACATCATGC GCAAGTCG 18SEQ ID NO: 9 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AACATCATGC GCAAGTCG 18

【０２８２】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17SEQ ID NO: 10 Sequence length: 17 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CAGGAAACAG CTATGAC 17

【０２８３】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCCAGTGCC TAGCTTACAT 18SEQ ID NO: 11 Sequence length: 20 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GGCCAGTGCC TAGCTTACAT 18

【０２８４】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTTTCCCAG TCACGAC 18SEQ ID NO: 12 Sequence length: 17 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GTTTTCCCAG TCACGAC 18

【０２８５】配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACATCACGC GCAAGTCG 18SEQ ID NO: 13 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AACATCACGC GCAAGTCG 18

【０２８６】配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACATCGCGC GCAAGTCG 18SEQ ID NO: 14 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AACATCGCGC GCAAGTCG 18

【０２８７】配列番号：１５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACATCGTGC GCAAGTCG 18SEQ ID NO: 15 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AACATCGTGC GCAAGTCG 18

【０２８８】配列番号：１６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATCACGGTGC GGGTCAAG 18SEQ ID NO: 16 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array ATCACGGTGC GGGTCAAG 18

【０２８９】配列番号：１７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACGTCGTTGA TCGACCGG 18SEQ ID NO: 17 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array ACGTCGTTGA TCGACCGG 18

【０２９０】配列番号：１８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACGGCTCCG AGGCCTGC 18SEQ ID NO: 18 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GACGGCTCCG AGGCCTGC 18

【０２９１】配列番号：１９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCAGGCCG AGGACATG 18SEQ ID NO: 19 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCAGGCCG AGGACATG 18

【０２９２】配列番号：２０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACGAGGCCC ACCACGTC 18SEQ ID NO: 20 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GACGAGGCCC ACCACGTC 18

【０２９３】配列番号：２１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACGTCATCG TGTGCACG 18SEQ ID NO: 21 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CACGTCATCG TGTGCACG 18

【０２９４】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACTGGTACA AGGAGCCG 18SEQ ID NO: 22 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AACTGGTACA AGGAGCCG 18

【０２９５】配列番号：２３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGCCGGAGT ACCGCTCC 18SEQ ID NO: 23 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GAGCCGGAGT ACCGCTCC 18

【０２９６】配列番号：２４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGCAGGTGC TCAAGGAG 18SEQ ID NO: 24 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CGGCAGGTGC TCAAGGAG 18

【０２９７】配列番号：２５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGGAGGACT TCGGCTTC 18SEQ ID NO: 25 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AAGGAGGACT TCGGCTTC 18

【０２９８】配列番号：２６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGCTCACCA CCCTCGTC 18SEQ ID NO: 26 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GAGCTCACCA CCCTCGTC 18

【０２９９】配列番号：２７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 18 CGCGAGTTGA TGATCGGCSEQ ID NO: 27 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array 18 CGCGAGTTGA TGATCGGC

【０３００】配列番号：２８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGAAGGAGG TCGCGTGA 18SEQ ID NO: 28 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GCGAAGGAGG TCGCGTGA 18

【０３０１】配列番号：２９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGCCCGTGG ACGAACCG 18SEQ ID NO: 29 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CGGCCCGTGG ACGAACCG 18

【０３０２】配列番号：３０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCGCGAACG AACCGGTC 18SEQ ID NO: 30 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CCCGCGAACG AACCGGTC 18

【０３０３】配列番号：３１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCGATC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 31 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCGATC ACGAGCAG 18

【０３０４】配列番号：３２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCCCGC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 32 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCCCGC ACGAGCAG 18

【０３０５】配列番号：３３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCTCGC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 33 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCTCGC ACGAGCAG 18

【０３０６】配列番号：３４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCCGGC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 34 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCCGGC ACGAGCAG 18

【０３０７】配列番号：３５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCTGCC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 35 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCTGCC ACGAGCAG 18

【０３０８】配列番号：３６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCCTGC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 36 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCCTGC ACGAGCAG 18

【０３０９】配列番号：３７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCCCACGC ACGAGCAG 18SEQ ID NO: 37 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CTGCCCACGC ACGAGCAG 18

【０３１０】配列番号：３８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACGGACC AGGAGCTG 18SEQ ID NO: 38 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array TTCACGGACC AGGAGCTG 18

【０３１１】配列番号：３９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACGATCC AGGAGCTG 18SEQ ID NO: 39 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array TTCACGATCC AGGAGCTG 18

【０３１２】配列番号：４０ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACGGTCC AGGAGCTG 18SEQ ID NO: 40 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array TTCACGGTCC AGGAGCTG 18

【０３１３】配列番号：４１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACGGAGC AGGAGCTG 18SEQ ID NO: 41 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array TTCACGGAGC AGGAGCTG 18

【０３１４】配列番号：４２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGAACTACA GCGTCTAC 18SEQ ID NO: 42 Sequence length: 18 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: Single chain Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array CCGAACTACA GCGTCTAC 18

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】プラスミドｐＰＴ−Ｂ１の制限酵素切断点地図
を示す。FIG. 1 shows a restriction enzyme cleavage point map of plasmid pPT-B1.

【図２】プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１の制限酵素切断点地
図を示す。FIG. 2 shows a restriction enzyme cleavage point map of plasmid pPT-DB1.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

Ａｍｐ：β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を示す。 ＯＲＩ：ＣｏｌＥ１系の複製開始部位を示す。 ｌａｃＰＯ：ｐＵＣ１８由来のラクトースオペロンのプ
ロモーターおよびオペレーター領域を示す。 ＮＨα：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 ＮＨβ：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 (XbaI/NspV)：ＸｂａＩおよびＮｓｐＶサイト間での平
滑末端化後の自己連結部位を示す。The gene encoding Amp: β-lactamase is shown. The replication origin of the ORI: ColE1 system is shown. lacPO: shows the promoter and operator regions of the lactose operon from pUC18. NHα: shows a gene encoding the α subunit of nitrile hydratase from Pseudonocardia thermophila. NHβ: shows a gene encoding the β subunit of nitrile hydratase from Pseudonocardia thermophila. (XbaI / NspV): shows a self-ligation site after blunting between the XbaI and NspV sites.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 中村 武史 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化 学株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/88 C12N 1/21 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI (C12N 9/88 C12R 1:19) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:01) (72) Inventor Takeshi Nakamura Mobara City, Chiba Prefecture 1144 Togo Mitsui Toatsu Kagaku Co., Ltd. (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 9/88 C12N 1/21 C12N 15/00-15/90 BIOSIS / WPI (DIALOG) SwissProt / PIR / GeneS eq GenBank / EMBL / DDBJ / Gene Seq

Claims (21)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配
列により示されるαサブユニットおよび配列表の配列番
号：２記載のアミノ酸配列により示されるβサブユニッ
トから構成されるニトリルヒドラターゼ。1. A nitrile hydratase composed of an α subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and a β subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 of the sequence listing. 【請求項２】 配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配
列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られるα
サブユニットと配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配
列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られるβ
サブユニットを構成要素として含んでいるニトリルヒド
ラターゼ。2. An α obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
Β obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a subunit and part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing
Nitrile hydratase containing a subunit as a constituent. 【請求項３】 シュードノカルディア・サーモフィラ（P
seudonocardia thermophila JCM3095）由来である請求
項１または２記載のニトリルヒドラターゼ。3. Pseudonocardia thermophila (P
The nitrile hydratase according to claim 1 or 2, which is derived from seudonocardia thermophila JCM3095). 【請求項４】 配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配
列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番
目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番
目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目
及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸
を他のアミノ酸に置換して得られるαサブユニットを構
成要素として含んでいるニトリルヒドラターゼ。4. The 6th, 19th, 38th, 77th, 90th, 102nd, 106th, 126th, 130th, 142nd, 146th, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A nitrile hydratase containing, as a constituent, an α subunit obtained by substituting one or more amino acids of the 187th, 194th and 203rd amino acids with another amino acid. 【請求項５】 配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配
列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目、２
１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他の
アミノ酸に置換して得られるβサブユニットを構成要素
として含んでいるニトリルヒドラターゼ。5. The 20th, 21st, 108th, 200th, 2nd amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
A nitrile hydratase containing as a constituent a β subunit obtained by substituting any one or more amino acids of the 12th amino acid with other amino acids. 【請求項６】 請求項１に記載のニトリルヒドラターゼ
のαサブユニットをコードする遺伝子。6. A gene encoding the α-subunit of the nitrile hydratase according to claim 1. 【請求項７】 請求項２に記載のニトリルヒドラターゼ
のαサブユニットをコードする遺伝子。7. A gene encoding the α subunit of the nitrile hydratase according to claim 2. 【請求項８】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
で表されるニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコ
ードする遺伝子。8. A gene encoding the α subunit of nitrile hydratase represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing. 【請求項９】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配列
の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩基
配列で表されるニトリルヒドラターゼのαサブユニット
をコードする遺伝子。9. A gene encoding an α subunit of nitrile hydratase represented by a nucleotide sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in Sequence Listing. . 【請求項１０】 配列表の配列番号：３に記載の塩基配
列の１６番目から１８番目、５５番目から５７番目、１
１２番目から１１４番目、２２９番目から２３１番目、
２６８番目から２７０番目、３０４番目から３０６番
目、３１６番目から３１８番目、３７６番目から３７８
番目、３８８番目から３９０番目、４２４番目から４２
６番目、４３６番目から４３８番目、５５９番目から５
６１番目、５８０番目から５８２番目、６０７番目から
６０９番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列
に置換して得られる塩基配列で表されるニトリルヒドラ
ターゼのαサブユニットをコードする遺伝子。10. The 16th to 18th, 55th to 57th, 1st of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing
12th to 114th, 229th to 231,
268th to 270th, 304th to 306th, 316th to 318th, 376th to 378th
Th, 388th to 390th, 424th to 42nd
6th, 436th to 438th, 559th to 5th
It encodes the α subunit of nitrile hydratase represented by a nucleotide sequence obtained by substituting one or more nucleotide sequences of 61st, 580th to 582th, and 607th to 609th with other nucleotide sequences. gene. 【請求項１１】 請求項１に記載のニトリルヒドラター
ゼのβサブユニットをコードする遺伝子。11. A gene encoding the β subunit of the nitrile hydratase according to claim 1. 【請求項１２】 請求項２に記載のニトリルヒドラター
ゼのβサブユニットをコードする遺伝子。12. A gene encoding the β subunit of the nitrile hydratase according to claim 2. 【請求項１３】 配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列で表されるニトリルヒドラターゼのβサブユニットを
コードする遺伝子。13. A gene encoding the β subunit of nitrile hydratase represented by the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing. 【請求項１４】 配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩
基配列で表されるニトリルヒドラターゼのβサブユニッ
トをコードする遺伝子。14. A gene encoding a β subunit of nitrile hydratase represented by a nucleotide sequence obtained by substituting, deleting, deleting or inserting a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing. . 【請求項１５】 配列表の配列番号：４に記載の塩基配
列の５８番目から６０番目、６１番目から６３番目、３
２２番目から３２４番目、５９８番目から６００番目、
６３４番目から６３６番目の何れか一つ以上の塩基配列
を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列で表される
ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺
伝子。15. The 58th position to the 60th position, the 61st position to the 63rd position, and the 3rd position of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing.
22nd to 324th, 598th to 600th,
A gene encoding the β subunit of nitrile hydratase represented by a nucleotide sequence obtained by substituting one or more nucleotide sequences from the 634th to 636th with another nucleotide sequence. 【請求項１６】 請求項６から１０に記載のニトリルヒ
ドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子または
請求項１１から１５に記載のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットをコードする遺伝子の何れかを含んでいる
組換えプラスミド。16. A gene encoding the α subunit of the nitrile hydratase according to any one of claims 6 to 10 or β of the nitrile hydratase according to any one of claims 11 to 15.
A recombinant plasmid containing any of the genes encoding the subunits. 【請求項１７】 請求項６から１０に記載のニトリルヒ
ドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子および
請求項１１から１５に記載のニトリルヒドラターゼのβ
サブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプ
ラスミド。17. A gene encoding the α-subunit of the nitrile hydratase according to claims 6 to 10 and β of the nitrile hydratase according to claims 11 to 15.
A recombinant plasmid containing a gene encoding a subunit. 【請求項１８】 請求項１６に記載の組換えプラスミド
を保持する形質転換株。18. A transformant carrying the recombinant plasmid according to claim 16. 【請求項１９】 請求項１７に記載の組換えプラスミド
を保持する形質転換株。19. A transformant carrying the recombinant plasmid according to claim 17. 【請求項２０】 請求項１８または１９に記載の形質転
換株を培養し、培養によって得られた形質転換株、培養
液、およびそれらの処理物からニトリルヒドラターゼを
回収することを特徴とするニトリルヒドラターゼの生産
方法。20. A nitrile characterized by culturing the transformant according to claim 18 or 19, and recovering nitrile hydratase from the transformant obtained by the culturing, the culture solution, and a treated product thereof. Method for producing hydratase. 【請求項２１】 請求項１８または１９に記載の形質転
換株を培養し、培養によって得られた形質転換株、培養
液、およびそれらの処理物、或いはそれらから得られる
ニトリルヒドラターゼとニトリル化合物とを水性媒体中
で接触させて該ニトリル化合物に対応するアミド化合物
を製造する方法。21. A transformant strain according to claim 18 or 19 is cultured, and a transformant strain, a culture solution obtained by the culture, a treated product thereof, or a nitrile hydratase and a nitrile compound obtained from them are obtained. Is contacted in an aqueous medium to produce an amide compound corresponding to the nitrile compound.