JP3375949B2 - 細胞障害性リンパ球成熟因子に対する抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はサイトカインの分野、特にインタ
ーロイキン−２（IL-２）と相乗的に作用して細胞障害
性リンパ球を活性化するサイトカイン、例えば細胞障害
性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）のようなサイトカイン
に対する抗体に関する。「サイトカイン」は一群のタン
パク質性細胞調節因子を表す術語である。これらの因子
は、リンフォカイン、モノカイン、インターロイキンお
よびインターフェロンという様々な名称で呼ばれ、体内
の広範な種類の細胞によって生産される。これらのサイ
トカインは多くの生理学的応答に重要な役割を演じ、あ
る範囲の疾病の病態生理学に関与し、そして治療への可
能性を有している。サイトカインは以下のように共通の
性質を有する異種タンパク質群である。すなわち、サイ
トカインは低分子量（≦８０ｋＤａ）の分泌タンパク質
で、グリコシル化されていることが多い；サイトカイン
は免疫および炎症反応に関わり、応答の強さおよび持続
時間を調節する；サイトカインは通常一過性、局所的に
生産され、エンドクリン様式によって作用するのではな
く、むしろパラクリン（傍分泌）様式またはオートクリ
ン様式で作用する。サイトカインは非常に強力であり、
一般にピコモル濃度で作用する；また各サイトカインま
たはサイトカイン群に特異的な細胞表面レセプターと高
い親和性を以って相互作用する。サイトカインの細胞表
面への結合によって、最終的に細胞のＲＮＡ合成および
タンパク質合成のパターンが変化され、そして細胞の挙
動が変化される。個々のサイトカインは複数の重複する
細胞調節作用を有する。

【０００２】あるサイトカインに対する細胞の応答は、
そのサイトカインの局所濃度、それが作用する細胞の種
類、および同時に露される他の細胞調節因子の如何によ
り決まる。異なる細胞表面レセプターに結合するこれら
構造的に無関係なタンパク質の調節作用の重複は、その
ＤＮＡ中に共通の応答要素を有しうる共通のタンパク質
を誘導することによって少くとも部分的に引き起こされ
る。サイトカインは、第一に互いに誘導しあい、第二に
サイトカイン細胞表面レセプターを別の状態に調節する
ことによって、そして第三に細胞機能への相乗的、相加
的、または拮抗的な相互作用によって、ネットワークの
中で相互に作用する。［Immunology Today 10:299（198
9）］。

【０００３】新生物の治療に於いて、および免疫増加剤
としてのサイトカインの利用可能性が近年ヒト組換えイ
ンターロイキン−２（rIL-２）を用いる研究で示されて
いる。天然のインターロイキン−２（IL-２）は、Ｔ−
リンパ球により生産され分泌されるリンフォカインであ
る。この糖タンパク質分子はＴ−細胞が役割を有する事
実上すべての免疫応答の誘導に密接に関与する。インビ
トロでのＢ細胞応答もIL-２の存在により増強される。
またIL-２は、分化誘導因子としてＢおよびＴリンパ球
応答の制御にも関係している。

【０００４】ヒトrIL-２の投与がいくつかの症例で示さ
れており、実験動物［J. Exp. Med.161:1169-1188（198
5）］およびヒト［N. Engl. J. Med. 313:1485-1492（1
985）およびN. Engl. J. Med. 316:889-897（1987）］
の両者で樹立腫瘍の退行性変化を生じた。rIL-２の抗腫
瘍効果は、インビボでrIL-２により活性化される宿主細
胞障害性エフェクターリンパ球によって媒介されると考
えられる［J. Immunol. 139:285-294（1987）］。さら
に、動物モデルから得られた結果は、rIL-２がある種の
感染性疾患の治療［J. Immunol. 135:4160-4163（198
5）およびJ. Virol. 61:2120-2127（1987）］、および
化学療法により引き起こされた免疫抑制の改善［Immuno
l. Lett. 10:307-314（1985）］にも有効でありうるこ
とを示唆する。

【０００５】しかしながら、rIL-２の臨床使用はそれが
惹起する可能性のある重大な副作用のために複雑な問題
となっている［N. Engl. J. Med. 313:1485-1492（198
5）およびN. Engl. J. Med. 316：889-897（1987）］。
毒性を低下させる一方でサイトカイン療法の有効性を向
上させる一つの方法は２またはそれ以上のサイトカイン
を組合せて使用することである。たとえば、rIL-２を組
換えインターフェロンアルファ（rIFNアルファ）と一緒
に［Cancer Res. 48:260-267（1988）およびCancer Re
s. 48:5810-5817（1988）］、または組換え腫瘍壊死因
子アルファ（rTFNアルファ）と一緒に［Cancer Res. 4
7:3948-3953（1987）］腫瘍担持マウスに投与した場合
に、相乗的な抗腫瘍活性が生ずることが示されている。
IL-２の抗腫瘍効果は宿主細胞障害性エフェクターリン
パ球により媒介されると考えられるので、rIL-２と相乗
作用してインビトロで細胞障害性リンパ球を活性化する
新規サイトカインを同定し単離することは興味深いであ
ろう。これら新規サイトカインはまた、インビボでrIL-
２と組み合わせて投与された場合、抗腫瘍剤としても有
用であろう。

【０００６】従って、本発明は細胞障害性リンパ球成熟
因子（ＣＬＭＦ）と呼ばれる新規サイトカインタンパク
質を提供するものである。このタンパク質はＣＬＭＦを
分泌しうる細胞によって生産および合成される。かかる
細胞の例は哺乳動物細胞、特にヒトリンパ芽球細胞であ
る。低濃度のIL-２の存在下ではＣＬＭＦはリンフォカ
イン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の細胞溶解活性を相乗
的に誘導する。ＣＬＭＦはまたＴ−細胞の増殖を刺激す
ることもできる。

【０００７】本発明は、ＣＬＭＦを実質的に純粋な形態
で単離するための方法において、以下の工程、すなわち ａ）ＮＣ−３７細胞のようなＢリンパ芽球細胞を刺激し
てサイトカインを生産させて上清液中に分泌させ、 ｂ）刺激を受けた細胞によって生産された上清液を集
め、 ｃ）この上清液をタンパク質フラクションに分離し、 ｄ）各タンパク質フラクションをＣＬＭＦの存在に関し
て検査し、 ｅ）Ｔ−細胞の増殖を刺激でき、タンパク質フラクショ
ンのＴ−細胞刺激活性の原因物質である活性タンパク質
を含有するタンパク質フラクションを保持し、 ｆ）細胞溶解性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）である該
活性タンパク質を実質的に純粋な形態で単離する、 ことを含んでなる方法に関する。

【０００８】このようにして得られたＣＬＭＦタンパク
質は他のサイトカインタンパク質を含有しない。天然型
ＣＬＭＦタンパク質は二つのポリペプチドサブユニット
４０ｋＤａサブユニットおよび３５ｋＤａサブユニット
からなる７５キロダルトン（ｋＤａ）のヘテロダイマー
であり、これらは一またはそれ以上のジスルフィド結合
を介して互いに結合している。本発明はまたＣＬＭＦ遺
伝子のヌクレオチド配列および該遺伝子によってコード
されるＣＬＭＦタンパク質のアミノ酸配列をも提供す
る。これらの配列情報に基づいてＣＬＭＦ活性を有す
る、天然型ＣＬＭＦタンパク質の誘導体を調製すること
ができる。それゆえ本発明は細胞障害性リンパ球成熟因
子（ＣＬＭＦ）を実質的に純粋な形態で含有するタンパ
ク質、またはＣＬＭＦ活性を示しＣＬＭＦのアミノ酸配
列の生物学的に活性な部分を含有するかあるいはＣＬＭ
Ｆのアミノ酸配列並びに他のアミノ酸を含有するタンパ
ク質、またはＣＬＭＦまたはその生物学的に活性なフラ
グメントに類似した配列を含有しＣＬＭＦ活性を有する
タンパク質に関する。

【０００９】上記工程ｃ）〜ｆ）は他のタンパク質とと
もにＣＬＭＦを含有する任意の液体または流体からＣＬ
ＭＦを精製するのに用いることができる。本発明はまた
ＣＬＭＦ活性を有しかつＴ細胞増殖を刺激しうるタンパ
ク質フラクション、上記方法によって得られた実質的に
精製された活性ＣＬＭＦタンパク質、４０ｋＤａサブユ
ニットおよび／または３５ｋＤａサブユニットをコード
し、単離されクローニングされた遺伝子、これらの遺伝
子を含有するベクター、該遺伝子を含有するベクターで
形質転換された宿主細胞、およびかかる形質転換宿主細
胞中に調製されたＣＬＭＦタンパク質および誘導体にも
関する。さらに本発明はＬＡＫ細胞およびＴ−細胞ＣＬ
ＭＦ単独でまたはIL-２とともに処理することを含んで
なるこれら細胞の刺激法にも関する。さらにまた本発明
はＣＬＭＦに結合しうる単離されたポリクローナルまた
はモノクローナル抗体にも関する。

【００１０】ＣＬＭＦの部分精製標品に対して調製され
たモノクローナル抗体は以下のように同定し特定決定さ
れている。すなわち、１： ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの免疫
沈降反応、２：ＣＬＭＦ生物活性の免疫低下、３：ＣＬ
ＭＦのウェスタンブロッティング、４： ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆのその細胞レセプターへの結合の阻害、および５：Ｃ
ＬＭＦ生物活性の中和。抗−ＣＬＭＦ抗体を分泌する２
０個のハイブリドーマを同定した。Ｔ−細胞増殖アッセ
イおよびＬＡＫ細胞誘導アッセイで評価してこれら抗体
は ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦを免疫沈降させそしてＣＬＭＦ
生物活性を免疫低下させることが判明した。ウェスタン
ブロットでは抗体が７０ｋＤａヘテロダイマーおよびサ
ブユニットの一方と結合することが示された。前記２０
個の抗−ＣＬＭＦモノクローナル抗体はいずれもＣＬＭ
Ｆに対して特異的であり、特にＣＬＭＦの４０ｋＤａサ
ブユニットに対しても特異的であった。個々の抗体がＣ
ＬＭＦのその細胞レセプターへの結合を阻害する能力を
評価するために、ＣＬＭＦレセプター結合アッセイが開
発されている。このアッセイは、 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦ
のＰＨＡ活性化ＰＢＬ芽球細胞に対する結合を各抗体の
存在下および非存在下で測定する。調べた２０抗体のう
ち、１２抗体が ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの芽球細胞への結
合を６０％以上阻害することが判明した。二つの阻害抗
体、すなわち７Ｂ２および４Ａ１はＣＬＭＦ生物活性を
中和するが、阻害作用のない一抗体すなわち８Ｅ３はＣ
ＬＭＦ生物活性を中和しない。これらのデータから、
¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦのその細胞レセプターへの結合を
阻止する抗体は、Ｔ−細胞増殖アッセイおよびＬＡＫ細
胞誘導アッセイにより評価してＣＬＭＦ生物活性を中和
するであろうことが確認される。ＣＬＭＦの４０ｋＤａ
サブユニットに特異的な抗体がＣＬＭＦ生物活性を中和
しうることは、４０ｋＤａサブユニット上の決定基がＣ
ＬＭＦ細胞レセプターへの結合に必要であることを示し
ている。

【００１１】本発明のモノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体
は、天然型および組換えヒトＣＬＭＦのイムノアフィニ
ティ精製、ヒトＣＬＭＦイムノアッセイの開発、ＣＬＭ
Ｆの４０ｋＤａサブユニットの活性部位の同定のための
強力な分析、診断および治療上の試薬を提供し、そして
移植におけるような細胞障害性Ｔ細胞の選択的な免疫抑
制を必要とする患者の治療的処置に使用できる。ヒトＣ
ＬＭＦ上の異なるエピトープを認識するモノクローナル
抗体を感度の高い二部位イムノアッセイに試薬として用
いて生物学的流体、細胞培養上清およびヒト細胞抽出物
中のＣＬＭＦレベルを測定できる。

【００１２】従って、本発明はまた多数の用途を有する
ＣＬＭＦに対するモノクローナル抗体にも関する。この
用途は以下を包含するがそれに限定されない： １．天然型および組換えヒトＣＬＭＦ精製のためのアフ
ィニティー試薬としてのモノクローナル抗体の利用； ２．生物学的流体、細胞培養上清、細胞抽出物中、およ
びヒト細胞の原形質膜上の天然型および組換えＣＬＭＦ
を測定するためのエンザイムイムノアッセイおよびラジ
オイムノアッセイを構成するための試薬として、および
ドラッグスクリーニングアッセイのための試薬として
の、モノクローナル抗体の利用； ３．生物学的な流体、細胞培養上清およびヒト細胞抽出
物中のＣＬＭＦ測定のための高感度の二部位イムノアッ
セイを構築するための試薬としてのモノクローナル抗体
の利用； ４．３５ｋＤａサブユニットとの結合に関与し、ＣＬＭ
Ｆ細胞レセプターとの結合に関与する４０ｋＤａサブユ
ニットの決定基を同定するための試薬としてのモノクロ
ーナル抗体の利用； ５．移植におけるような、細胞障害性Ｔ細胞の増殖およ
び活性化を選択的に阻止するための治療薬としての、阻
害性モノクローナル抗体の無傷のIgG分子、Fabフラグメ
ントまたは人体に適合させたIgG分子の利用。

【００１３】以下に図面について説明する。図１は培養
ＮＣ３７リンパ芽球細胞から得られた上清溶液をNu-Gel
P-SPカラムにかけ、ＴＧＦ活性を含有するタンパク質
フラクションが塩グラジエントで溶離されることを示す
プロットである。図２は、図１に示される分離により得
られたＴＧＦ活性含有物質がブルー−Ｂ−アガロース
（Blue-B-Agarose）カラムを通って塩グラジエント勾配
で溶離されるプロットである。

【００１４】図３は、図２に示される分離から得られた
ＴＧＦ活性含有物質がモノ（Mono）Ｑカラムを通ってＮ
ａＣｌグラジエントで溶離されるプロットである。図４
は、図３に図示した工程から得られたフラクション３０
から４５までと、４８および５０のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示
す。左側の数字、すなわち４４および６８は、レーンＳ
での標準タンパク質の見かけの分子量、４４および６８
ｋＤａを指す。

【００１５】図５は、図３で示されるMono Ｑクロマト
グラフィー分離（逆相ＨＰＬＣ）から得られたフラクシ
ョン３８をVydacジフェニル（Diphenyl）カラムに通し
た溶離プロフィールを示す。図６は、図５に示される分
離工程から回収されたタンパク質フラクション８５−９
０のタンパク質純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【００１６】図７は、逆相ＨＰＬＣ分離から得られたフ
ラクション８７および８８を非還元（レーンＡ；β−メ
ルカプトエタノールなし）および還元（レーンＢ；β−
メルカプトエタノール存在下）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析した結果を示し、75,000分子量のＣＬＭＦが４０
ｋＤａおよび３５ｋＤａの二つのサブユニットに分離さ
れることを示す。この図に示されるゲルの残りのレーン
は、４４および６８ｋＤａマーカータンパク質からなる
標準タンパク質を含有する。

【００１７】図８はＮＣ３７細胞からの上清溶液から得
られたタンパク質をNu-Gel P-SPカラムにかけ、塩グラ
ジエントで溶離した溶離パターンを示す。図９は、図８
に示されるNu-Gel P-SPカラム溶離により得られた活性
フラクションのブルー−Ｂ−アガロースカラム塩グラジ
エント溶離プロフィールである。図１０は、図９に示さ
れる溶離により得られた活性フラクションのモノＱカラ
ム塩グラジエント溶離プロフィールである。

【００１８】図１１は、図１０に示されるモノＱクロマ
トグラフィーから得られた活性フラクション３９および
４０の、Vydacジフェニルカラムを通した溶離パターン
である。図１２は、図１１に示される分離工程から得ら
れた活性フラクションの還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析を示す。

【００１９】図１３は、ＣＬＭＦサイトカインの３５ｋ
Ｄａサブユニットからの４０ｋＤａサブユニットの分離
を表す模式図である。図１４は、ＣＬＭＦサイトカイン
の４０ｋＤａサブユニットのアミノ酸組成の決定、Ｎ−
末端配列決定、タンパク分解的消化および完全な配列決
定を示す模式図である。

【００２０】図１５は、ＣＬＭＦサイトカインの消化さ
れた４０ｋＤａサブユニットのトリプシン処理ペプチド
の分離を示す。図１６は、スタフィロコッカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）Ｖ８プロテアーゼ消化
を受けた４０ｋＤａサブユニットＣＬＭＦのタンパク分
解ペプチドの分離を示す。

【００２１】図１７は、ＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニ
ットタンパク分解ペプチドの分析から得られたタンパク
質構造に関する情報を要約したチャートである。以下の
ような略号および記号が使用される： Ｎ−ｔ − 無傷のタンパク質のＮ−末端配列決定 Ｔｒ − フラクション番号を付したマップＨＰ２３８３からのトリプシン 処理ペプチド Ｖ８ − フラクション番号を付したマップＨＰ２４１２からのＶ８プロテ アーゼペプチド ∧ − ありそうなグリコシル化部位を示す；四角で囲った部分は可能性の ある部位を示す。

【００２２】図１８は、図３に示されるMono Q ＦＰＬ
Ｃ溶離プロフィールから得られたフラクション３９のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーンＡ：標準タンパク
質、β−メルカプトエタノールなし；レーンＢ：フラク
ション３９、β−メルカプトエタノールなし；レーン
Ｃ：フラクション３９、β−メルカプトエタノールあ
り；レーンＤ：標準タンパク質、β−メルカプトエタノ
ールあり。

【００２３】図１９は、逆相ＨＰＬＣによる３５ｋＤａ
サブユニットの精製に関するもので、５％β−メルカプ
トエタノール中で還元されたMono Ｑクロマトグラフィ
ーのフラクション３９をVydac C-18カラムに通して溶離
したパターンを示す。図２０は、図１９に示されるVyda
c C-18カラム溶離プロフィールから得られたフルオレサ
ミン陽性フラクションの、非還元条件下でのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル分析を示す。Ｓ：＝標準タンパク質；Ｆ：＝
フロースルー；番号はフラクション番号を指す。

【００２４】図２１は、Mono Ｑクロマトグラフィーの
フラクション３６および３７のトリプシン消化物をYMC
ODSカラムに通した溶離パターンを示す。図２２は、染
色したＰＶＤＦ膜を示し、不鮮明なバンドは、それぞれ
約２９，２５，１４，１２，および９ｋＤａの領域を切
り出す前（図２２Ｂ）および後（図２２Ａ）のCNBr分解
ＣＬＭＦである。これらの領域は以下の配列を有するCN
Brフラグメントを含有する： Ｉ (P?)-P-K-N-L-Q-L-K-P-L-K-N-?-V-(Q?)- （４０ｋＤａタンパク質由来の新配列） II ?-Q-K-A-(R?)-Q-T-L-E-F-Y-P-?-T- （３５ｋＤａタンパク質の残基番号３０から始まる新配列） III V-V-L-T-?-D-T-P-E-E-D-G-I-T- （４０ｋＤａタンパク質の残基番号２４から始まる） IV V-D-A-V-(H?)-K-L-K-Y-E-?-Y-T-?-?-F-F-I- （４０ｋＤａタンパク質の残基番号１９０から始まる） 注：上記配列にはメチオニン残基が先行することが想定
されるかまたは知られている。

【００２５】図２３は、ＣＬＭＦをCNBrで分解すること
により得られたペプチドフラグメントの逆相ＨＰＬＣ分
離を示す。図２４は、アガロース樹脂に共有結合された
モノクローナル抗体７Ｂ２を用いるアフィニティクロマ
トグラフィーによって精製された、純粋なＣＬＭＦおよ
び「遊離の」会合していない４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブ
ユニットのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンＡ：分子量
マーカータンパク質；レーンＢ：出発物質；レーンＣ；
フロースルー；レーンＤ：酸溶出物；レーンＥ：チオシ
アン酸カリウム溶出物。

【００２６】図２５ａ，ｂ，ｃ，およびｄは、ヒトＣＬ
ＭＦの４０ｋＤａサブユニットのＤＮＡ配列および推定
アミノ酸配列を示す。図２６ａ，ｂ，およびｃは、ＣＬ
ＭＦの３５ｋＤａサブユニットのｃＤＮＡ配列および推
定アミノ酸配列を示す。図２７は、ＣＬＭＦで免疫した
ラット由来の、および非免疫ラット（対照）由来の血清
によるＣＬＭＦ生物活性の阻害を示す。

【００２７】図２８は、 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、モノクロ
ーナル抗体４Ａ１（レーン１）、４Ｄ１（レーン２）、
８Ｅ３（レーン３）、および９Ｃ８（レーン４）による
免疫沈降反応、対照抗体（レーン５）による免疫沈降反
応、免疫ラット血清（レーン６および８）による免疫沈
降反応、および正常ラット血清（レーン７および９）に
よる免疫沈降反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。左側
にはｋＤａで表した分子量を示す。

【００２８】図２９は、ＣＬＭＦ生物活性（ＴＧＦ活
性）の、モノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体（ａ−ＣＬＭ
Ｆ）による免疫低下を示す。図３０は、ＣＬＭＦ生物活
性（ＬＡＫ誘導活性）の、モノクローナル抗−ＣＬＭＦ
抗体（ａ−ＣＬＭＦ）による免疫低下を示す。図３１
は、モノクローナル抗体（mAb）７Ｂ２，４Ａ１，８Ｅ
３，６Ａ３，９Ｆ５および２Ａ３とＣＬＭＦ７５ｋＤａ
ヘテロダイマーとの反応性、およびラットポリクローナ
ル抗−ＣＬＭＦ抗体（ＲＳ１）と同ヘテロダイマーとの
反応性に関するウェスタンブロット分析を示す。ＮＲ
Ｓ：＝正常ラット血清。

【００２９】図３２は、モノクローナルおよびラットポ
リクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体のＣＬＭＦ４０ｋＤａサ
ブユニットとの反応性に関するウェスタンブロット分析
を示す。レーン１から１８までは以下のmAbsが用いられ
た：それぞれ、４Ａ１，４Ｄ１，７Ｂ２，７Ａ１，２Ａ
３，１Ｃ１，８Ｅ４，８Ａ２，８Ｅ３，１Ｂ８，４Ａ
６，６Ａ２，８Ｃ４，９Ｆ５，６Ａ３，９Ｃ８，８Ａ
１，および２２Ｅ７。レーン１９には対照抗体を、レー
ン２０には融合ラット血清を、そしてレーン２１には正
常ラット血清が用いられた。

【００３０】図３３は、 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、ＰＨＡ−
活性化末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）リンパ芽球との結合
を示す。図３４は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対す
る ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、ラット抗−ＣＬＭＦ血清
による阻害を示す。データは、血清非存在下での全特異
的結合と比較した場合の、指示濃度の血清の存在下にお
けるその細胞に対する ^{1 25}Ｉ−ＣＬＭＦ結合の量（結合
％）で表わす。

【００３１】図３５は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽球細胞
に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、モノクローナル抗
体上清による阻害を示す。データは、抗体上清非存在下
での全特異的結合と比較した場合の、１：１希釈上清存
在下におけるその細胞に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の
％阻害で表わす。図３６は、ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽球
細胞に対する ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合の、様々な濃度の
精製モノクローナル抗体による阻害を示す。データは、
抗体非存在下での全特異的結合と比較した場合の、指示
濃度の抗体存在下におけるその細胞に対する ¹²⁵Ｉ−Ｃ
ＬＭＦ結合の量（ｃｐｍ結合％）で表わす。

【００３２】図３７は、ウサギポリクローナル抗−ＣＬ
ＭＦ抗体と７５ｋＤａ ＣＬＭＦ（非還元）との反応
性、および３５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニット（還元）
との反応性に関するウェスタンブロット分析を示す。３
５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットの合成ペプチドフラグ
メントに対する抗体を調製した。レーン１から５までは
β−メルカプトエタノールを用いなかった；レーン６か
ら１０まではβ−メルカプトエタノールを用いた。レーン １ １μｌ ＣＬＭＦ ２ ３μｌ ＣＬＭＦ ３ ６μｌ ＣＬＭＦ ４ ブランク ５ ブランク ６ ５μｌ予備染色分子量標準物 ７ １μｌ ＣＬＭＦ ８ ３μｌ ＣＬＭＦ ９ ６μｌ ＣＬＭＦ １０ １０μｌ予備染色分子量標準物 本文中で述べた上記および下記のすべての刊行物は、参
照としてここにとり込まれる。

【００３３】本発明のＣＬＭＦ活性タンパク質には、均
質な天然型ＣＬＭＦタンパク質、並びに天然型ＣＬＭＦ
の生物学的に活性なフラグメントを含有するＣＬＭＦ活
性タンパク質が包含される。さらに本発明には、組換え
ＣＬＭＦタンパク質並びに融合タンパク質、すなわち天
然型ＣＬＭＦのアミノ酸配列あるいはその部分配列を他
のタンパク質由来のアミノ酸配列とともに含有するＣＬ
ＭＦタンパク質誘導体が包含される。本発明のタンパク
質は以下の実施例で説明するＴ−細胞増殖因子アッセイ
のような標準的アッセイにより測定してＣＬＭＦの生物
学的活性を有する。

【００３４】本発明のＣＬＭＦタンパク質にはまた、Ｃ
ＬＭＦのアミノ酸配列またはそのＣＬＭＦ活性フラグメ
ントに類似したアミノ酸配列を有する、天然に存在しな
いＣＬＭＦ類似タンパク質も包含される。かかるＣＬＭ
Ｆ類似タンパク質は、天然型ＣＬＭＦまたはそのフラグ
メントの一またはそれ以上のアミノ酸が、ＣＬＭＦ活性
を失うことなく置換または欠失したタンパク質である。
かかる類似体はペプチド化学に知られた方法または組換
えＤＮＡ技術に知られた方法（例えば特定部位の突然変
位誘発）によって作成できる。フラグメントおよび類似
体を含む本発明のすべてのタンパク質のＣＬＭＦ生物活
性は標準的なＴ−細胞増殖因子アッセイを用いて測定で
きる。

【００３５】本発明によれば、天然型ＣＬＭＦが精製型
で得られる。ＣＬＭＦタンパク質の３５ｋＤａサブユニ
ットおよび４０ｋＤａサブユニットのアミノ酸配列を図
２５および図２６に示す。本発明に従って得られたこれ
らの配列に基づいて、ＣＬＭＦタンパク質の生物活性類
似体およびフラグメントを得ることができる。これらの
生物活性タンパク質は組換えＤＮＡ技術の標準的方法を
用いて生物学的に生成させることができるしあるいはア
ミノ酸シンセサイザーで、またはよく知られた液相また
は固相ペプチド合成法を用いたマニュアル合成によって
化学的に合成することができる。同様な方法で、類似
体、フラグメント、およびＣＬＭＦのアミノ酸配列を他
のアミノ酸とともに含有するタンパク質を生成すること
もできる。次に、これらタンパク質のすべてをＣＬＭＦ
活性について調べることができる。

【００３６】このように、本発明は、実質的に純粋な形
態の細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）活性を有
するタンパク質（例えばＣＬＭＦタンパク質それ自
体）、または天然型ＣＬＭＦのアミノ酸配列の少なくと
も一部を含有する、ＣＬＭＦ活性を有する前記タンパク
質誘導体に関する。本発明はまたＣＬＭＦをコードする
クローニングされた遺伝子、および上記で定義されたタ
ンパク質をコードし、ＣＬＭＦをコードするｃＤＮＡに
相当する配列を含有する、単離されたポリヌクレオチ
ド、ＣＬＭＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転
換された微生物、上記タンパク質に対する抗体、並びに
上記タンパク質、ベクターおよび抗体を調製する方法に
関する。さらに本発明は上記ＣＬＭＦタンパク質を用い
るＬＡＫ細胞、Ｔ−細胞またはナチュラルキラー細胞の
刺激方法にも関する。

【００３７】ここで用いられる「ＣＬＭＦをコードする
ｃＤＮＡに相当する配列を含有するポリヌクレオチド」
なる用語は、そのポリヌクレオチドがＣＬＭＦをコード
するｃＤＮＡ内の配列と相同のまたはそれと相補的な配
列を含有することを意味する。ｃＤＮＡに対する相同性
または相補性の度合は約５０％またはそれ以上で、好ま
しくは少なくとも約７０％そしてさらに好ましくは少な
くとも約９０％である。下記の方法を包含する当業上知
られた技法によって、すなわち例えば配列決定された試
料と記載されたｃＤＮＡとの直接比較によって、配列の
推定相同性に適する緊縮条件を用いたハイブリッド形成
実験後、一本鎖ヌクレアーゼを用いる消化によって、そ
して消化されたフラグメントの分子量決定によって、Ｃ
ＬＭＦ配列とｃＤＮＡ間の対応関係を決定できる。

【００３８】本発明の実施には、特に指示しない場合に
は、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学
の、当業者の技術範囲内にある慣用の技法が用いられよ
う。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば
Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLONING ; A
LABORATORY MANUAL（1982）；DNA CLONING, VOLUMESＩ
AND II（D. N.Glover編，1985）；OLIGONUCLEOTIDE SYN
THESIS（M. J. Gait編，1984）；NUCLEIC ACID HYBRIDI
ZATION（B. D. Hames & S. J. Higgins編，1984）；TRA
NSCRIPTION AND TRANSLATION（B. D. Harnes & S. J. H
iggins編，1984）；ANIMAL CELL CULTURE（R. I. Fresh
ney編，1986）；IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES（IRL
Press, 1986）；B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOL
ECULARCLONING（1984）；the series, METHODS IN ENZY
MOLOGY（Academic Press, Inc.）；GENE TRANSFER VECT
ORS FOR MAMMALIAN CELLS（J. H. MillerおよびM. P.Ca
los編，1987, Clod Spring Harbor Laboratory）,Metho
ds in Enzymology Vol.154およびVol.155（それぞれWu
およびGrossman, およびWu, 編，）；IMMUNO CHEMICAL
METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY（Mayerおよび
Walker, 編，1987, Academic Press, London）, Scope
s, PROTEIN PURIFICATION：PRINCIPLES AND PRACTICE,
第２版（1987, Springer-Verlag, N.Y.），およびHANDB
OOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, V OLUMES I-IV（D. M. MeirおよびC. C. Blackwell編，19
86）参照。

【００３９】非常に種々な宿主／ベクターの組合せを用
いて、本発明のＤＮＡ配列およびＤＮＡ分子を発現する
ことができる。たとえば、有用なベクターは、染色体
性、非染色体性および合成によるＤＮＡ配列のセグメン
トからなることができる。かかるベクターの例にはウイ
ルスベクター（例えばＳＶ４０の様々な知られた誘導
体）、細菌性ベクター（例えばpCR1,pBR322,pMB9および
RP４を含むイー・コリ（E.coli）由来のプラスミド）、
ファージＤＮＡ（例えばファージλ、Ｍ１３および他の
繊維状一本鎖ＤＮＡファージの種々の誘導体）、ならび
に酵母に於て有用なベクター（例えば２μプラスミ
ド）、真核細胞に於て有用なベクターがあり、より好ま
しくは動物細胞に於て有用なベクター（例えばＳＶ４
０、アデノウイルスおよび／またはレトロウイルス由来
のＤＮＡ配列を含有するベクター）がある。また有用ベ
クターは例えば修飾によりファージＤＮＡを含有するプ
ラスミドまたはそれらの他の誘導体のように、プラスミ
ドとファージＤＮＡとの組合せから誘導することもでき
る。

【００４０】組換えＣＬＭＦタンパク質の調製に使用で
きる発現ベクターは、クローン化ＣＬＭＦ ＤＮＡ配列
の発現を制御および調節するためにベクター内に挿入さ
れた、ＣＬＭＦ ＤＮＡ配列に機能的に連結し少なくと
も一種の発現制御配列を含有することを特徴とする。有
用な発現制御配列の例としては、lac系、trp系、tac
系、trc系、λファージの主要オペレーターおよびプロ
モーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、酵母の
解糖プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼのプロモーター）、酵母の酸ホスファターゼのプ
ロモーター（例えば、Pho５）、酵母α−接合因子プロ
モーター、およびポリオーマウイルス、アデノウイル
ス、レトロウイルスおよびシミアンウイルス由来のプロ
モーター（例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモー
ター）、および原核または真核細胞およびそれらのウイ
ルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他の
配列、ならびに上記プロモーター／オペレーター配列の
組合せ、がある。

【００４１】かかる有用な発現ベクターの中で、動物お
よびヒト細胞のような真核生物宿主内でクローン化ＣＬ
ＭＦ−関連ＤＮＡ配列の発現を可能にするベクターが知
られている［例えばP. J. SouthernおよびP. Berg, J.
Mol. Appl. Genet.１：327-41（1982）；S. Subramani
ら、Mol. Cell. Biol.１：854-64（1981）；R. J. Kauf
mannおよびP. A. Sharp. Mol. Cell. Biol. 159:601-64
（1982）；S. I. Scahillら、“Expression and Charac
terization of The Product of A Human ImmuneInterfe
ron DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells”, Pro
c. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 80:4654-59（1983）；G. U
rlaubおよびL. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A. 77:4216-20（1989）］。

【００４２】さらに、各々の特異的発現ベクターの内部
で、本発明のＣＬＭＦ−関連ＤＮＡ配列を挿入するため
に種々の部位を選ぶことができる。これらの部位は通常
それを切断する制限エンドヌクレアーゼによって示され
る。それらは当業者によってよく認識されている。本発
明で有用な発現ベクターは、選ばれたＤＮＡフラグメン
トを挿入するための制限エンドヌクレアーゼ部位を有す
る必要がないことは、当然理解されるべきである。その
代わりに、別の方法によってベクターをフラグメントに
結合させることができる。選択されたＤＮＡフラグメン
トを挿入するためおよびそのＤＮＡフラグメントを発現
制御配列に機能的に結合させるために発現ベクター内で
選ばれる部位は、特定の制限酵素の作用を受ける部位の
数、ベクター配列に関する開始および終止コドンの位
置、および組換えベクターで形質転換された宿主を選択
するための望ましい方法のような種々のファクターによ
って決定される。ベクターおよびＤＮＡ配列挿入部位の
選択は、これらのファクターのバランスによって決ま
り、すべての選択が特定の場合に同じように有効である
わけではない。

【００４３】ＣＬＭＦ関連ＤＮＡ配列の発現に用いられ
る宿主細胞は種々の知られた宿主から選択できる。かか
る宿主の例としては原核または真核細胞がある。かかる
宿主の多くが、the American Type Culture Collection
（ATCC）またはthe DeutscheSammlung fur Mikroorgani
smen（ＤＳＭ）のような種々の寄託機関から入手可能で
ある。原核細胞宿主の例には、E.コリ、バチルス・スブ
チリス（B.subtilis）およびその他のような細菌菌株が
ある。好ましい宿主はＳＶ４０で形質転換されたアフリ
カミドリザル腎細胞系統ＣＯＳような哺乳動物細胞であ
る。

【００４４】必ずしもすべての宿主／発現ベクターの組
合せ物が所定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効に機能す
るわけではない。しかしながら当業者は、本発明の範囲
から逸脱することなしに本文に記載の原則を十分考慮の
上で、宿主／発現ベクターの組合せについて個々に選択
できる。例えば、その選択は多数のファクターのバラン
スに基づいてなされねばならない。これらには例えば、
宿主とベクターの適合性、宿主細胞酵素によるタンパク
分解に対するタンパク質の感受性、精製過程で除去する
ことが困難な、宿主細胞により発現されるタンパク質の
混入可能性、ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク
質の宿主に対する毒性、所望のタンパク質の回収の容易
さ、ＤＮＡ配列およびそれに機能的に結合された発現制
御配列の発現特性、生物学的安全性、コスト、および所
望のタンパク質の折りたたみ構造、形態、またはその他
の任意の必要な発現後修飾が包含される。

【００４５】ＣＬＭＦ ＤＮＡを含有する発現ベクター
を有する宿主生物は通常宿主生物の増殖に最適の条件下
で増殖される。対数増殖期の終了に向かって単位時間当
たりの細胞数増加が低下したところで、ＣＬＭＦタンパ
ク質の発現が誘導される、すなわちそのタンパク質をコ
ードするＤＮＡが転写され、そして転写されたｍＲＮＡ
が翻訳される。増殖培地に誘導物質または抑制解除物質
を添加することによって、あるいは物理的パラメーター
を変化させること、例えば温度変化によって誘導を行う
ことができる。

【００４６】宿主生物内で生成されたＣＬＭＦタンパク
質は特別の輸送メカニズムによって細胞から分泌される
ことが可能であり、または細胞を破壊することによって
これを単離することができる。機械的手段［Charmら、M
eth. Enzymol. 22:476-556（1971）］、酵素処理（たと
えばリゾチーム処理）または化学的手段（たとえば界面
活性剤処理、尿素またはグアニジン・ＨＣｌ処理、な
ど）、またはそれらの組合せによって細胞を破壊でき
る。

【００４７】真核生物では、細胞から分泌されるポリペ
プチドは前駆体分子の形で合成される。成熟ポリペプチ
ドは、いわゆるシグナルペプチドを除去することにより
生じる。原核宿主生物は真核生物性のシグナルペプチド
を前駆体分子から切断できないので、真核生物性ポリペ
プチドは原核宿主生物では直接それらの成熟形として発
現される必要がある。翻訳開始シグナルＡＵＧは、ＤＮ
ＡレベルではＡＴＧコドンに対応するが、これによって
あらゆるポリペプチドが原核宿主生物においてＮ−末端
メチオニン残基をともない合成される。ある種の場合に
は、使用する発現系によって、そしておそらくは発現さ
れるポリペプチドによっては、このＮ−末端メチオニン
残基は切り離される。

【００４８】本発明のＤＮＡ配列で形質転換された原核
生物および真核生物宿主の発酵によって生産されるＣＬ
ＭＦを次に知られた方法によって実質的に均質となるま
で精製することができる。この方法には例えば、異なる
速度での遠心分離、硫酸アンモニウム沈澱、透析（常圧
または減圧下）、調製用等電点電気泳動、調製用ゲル電
気泳動、または種々のクロマトグラフィー法例えば、ゲ
ル濾過、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ーおよびアフィニティークロマトグラフィー（例えばSe
pharose Blue CL-6BまたはＣＬＭＦに対して生成された
キャリアー結合モノクローナル抗体）がある。

【００４９】本発明の精製ＣＬＭＦタンパク質はＬＡＫ
細胞およびＴ細胞アクチベーターおよび抗腫瘍組成物の
調製に、またＬＡＫ細胞、Ｔ−細胞またはナチュラルキ
ラー細胞を刺激する方法において使用できる。本発明の
ＣＬＭＦを分析し、ＣＬＭＦ活性に関する活性部位を決
定することもできる。この分析から得られた情報を用い
て、ＣＬＭＦ活性を有するフラグメントまたはペプチド
（合成ペプチドを含む）を予測し生成させることができ
る。かかる活性部位を決定するための既知の技法には、
Ｘ線結晶学、核磁気共鳴、円偏光二色性、ＵＶ分光法、
および特定部位の突然変異誘発がある。したがって、こ
のようにして得られたフラグメントはＴ細胞またはＬＡ
Ｋ細胞を刺激する方法において用いることができる。

【００５０】本発明により調製されたＣＬＭＦタンパク
質または誘導体、あるいはＣＬＭＦタンパク質または誘
導体を含有する医薬組成物は上記の臨床上の使用のため
に温血哺乳動物に投与することができる。投与は、抗腫
瘍活性を示す薬剤の任意の慣用の投与様式、例えば静脈
内、皮下または筋肉内のいずれかによる病変内または非
経口投与であることができる。明らかに、必要とされる
用量は処置される個々の状態、症状の重さ、治療の継続
期間および投与方法によって変化しよう。医薬用として
適した剤形は、慣用法での使用に先立って再構成される
滅菌濾過し凍結乾燥したタンパク質から得ることができ
る。また、本発明によるＣＬＭＦタンパク質を適合性の
ある製剤上許可できる担体物質（例えば緩衝剤、安定化
剤、制菌剤、および医薬品として非経口剤形に慣用に用
いられる他の賦形剤および添加物）と混合することによ
って、該ＣＬＭＦタンパク質を含有する医薬組成物を調
製することも当業者の技術範囲内にある。本発明はかか
る医薬組成物にも関する。

【００５１】好ましい投与形態は意図される投与様式お
よび治療上の適用の如何によって異なる。本発明のＣＬ
ＭＦタンパク質またはペプチド誘導体を含有する医薬組
成物にはまた好ましくは慣用の製剤上受容されうる担体
が包含されようしそして他の薬剤（例えば、インターロ
イキン−２）、担体、アジュバント、賦形剤など、例え
ばヒト血清アルブミンまたは血漿製剤が包含されうる。
本発明の組成物は単位量の形態でありそして通常一日に
一回ないしそれ以上これを投与するのが好ましい。単位
量は、ＣＬＭＦタンパク質または誘導体の有効量、およ
び所望の場合はインターロイキン−２の有効量を凍結乾
燥形態で含有する１ｍｌバイアル中に封入されるのが好
ましい。ＣＬＭＦタンパク質または誘導体および所望の
場合はインターロイキン−２を含有するバイアルは、そ
の医薬組成物の正しい使用法を記載した使用説明書とと
もに容器に包装するのが好ましい。また、本発明は好ま
しくは別の単位量のインターロイキン−２と一緒、最も
好ましくは適当な使用説明書と一緒に容器に包装された
かかる単位量にも関する。さらに、本発明はかかる単位
量の調製方法にも関する。

【００５２】ここに説明した本発明がよりよく理解され
るよう、以下に実施例を示す。これらの実施例は説明目
的のためのみであることが理解されるべきであり、そし
て本発明はそこに詳述される詳細な実施態様に限定され
るものとして解釈されるべきではない。以下に述べる特
定の製品名および供給者は、これを強制することを意味
するものではないことに注意されたい。当業者は他の供
給者から代替製品を選択しうる。

【００５３】

【実施例】細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）の
精製および特性決定 ＣＬＭＦを含有する上清液の生産 ヒトＮＣ−３７Ｂリンパ芽球細胞（ATCC CCL 214, Amer
ican Type Culture Collection, Rockville, MD）を、
ＣＬＭＦの生産に使用した。この細胞を、５％熱不活化
（５６℃、３０分）ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタ
ミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／
ｍｌストレプトマイシンを補添したRPMI１６４０培地中
で、連続継代によって維持した（細胞培養培地はすべ
て、GIBCOLaboratories, Grand Island, NYから入手し
た）。

【００５４】生産性のより高いＮＣ−３７細胞の亜系は
液体微量培養での限界希釈クローニングによって誘導し
た。３個のCostar3596マイクロプレート（Costar Co.,
Cambridge, MA）の各ウェルに、ＮＣ−３７細胞を５細
胞／ｍｌ含有する細胞懸濁液１００μｌを入れた。クロ
ーニングに用いた培地は新鮮な継代培地、および親ＮＣ
−３７細胞の貯蔵培養物由来の濾過した馴化培地の１：
１混合物である。培養開始の１週間および２週間後、微
量培養物の各々に新鮮培地および馴化培地の１：１混合
物５０μｌを供給した。培養開始後３週間および４週間
の間に、ＮＣ−３７細胞クローンを含有するウェルの内
容物を収集してもっと大量の培養に移した。

【００５５】所定の亜系の細胞数が１．４×１０⁶ を越
えたところで、百万個の細胞を刺激して、３ｎｇ／ｍｌ
ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭ
Ａ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）および１
００ｎｇ／ｍｌカルシウムイオノフォアＡ２３１８７
（Sigma）を含有する１ｍｌ培養物中にＣＬＭＦを生産
させた。二日後に培養物から上清を集め、例えばSPECTR
OP0R^R ＃１チューブ類（Fisher Scientific）を用いて
約５０容量のダルベッコリン酸緩衝食塩水（Gibco）に
対して一晩、緩衝液を一回交換して透析した後、５０μ
ｇ／ｍｌゲンタマイシンを有する５０容量のRPMI １６
４０培地（ともにGibco製）で４時間透析し、そしてＴ
細胞増殖因子アッセイ（下記参照）によってＣＬＭＦを
調べた。親ＮＣ−３７細胞系により生産される力価の４
倍以上の力価でＣＬＭＦを常に生産する三つの亜系、Ｎ
Ｃ−37.89、ＮＣ−37.98、およびＮＣ−37.102が同定さ
れた。これらの３亜系からの細胞はＣＬＭＦを同様の力
価（≧８００単位／ｍｌ）で生産するので、これら３亜
系から得られた培養上清をプールしてＣＬＭＦ精製のた
めの出発物質として用いた。

【００５６】ＣＬＭＦの大量生産は約３８ｒｐｍに設定
した回転装置（Wheaton Cell Production Roller Appar
atus Model II, Wheaton Instruments, Millville, N
J）上で回転瓶培養で行った。１％ヌトリドーマ（Nutri
doma）-SP（Boehringer Mannheim Biochemicals, India
napolis, IN）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／
ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ン、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡおよび２０−２５ｎｇ／ｍ
ｌカルシウムイオノフォアＡ２３１８７を添加したRPMI
１６４０培地中に１−１．５×１０⁶ ＮＣ−37.89、Ｎ
Ｃ−37.98またはＮＣ−37.102細胞／ｍｌを含有する細
胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液の２５０から３５
０ｍｌ部分を、すでに５％ＣＯ₂ 、９５％空気の混合物
で満たされたFalcon ３０２７組織培養回転瓶（Becton
Dickinson, Lincoln Park, NL）に加えた。次に、この
回転瓶にしっかりと蓋をしそして３日間連続回転させな
がら３７℃でインキュベートした。この期間の終了時に
培養上清を集めた。タンパク質の分解を遅らせるため
に、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド（ともにBoehringer Mannheim製）を最終濃度がそ
れぞれ１ｍＭおよび０．１ｍＭとなるようにこの培養上
清に加えた。この上清を４℃で保存した。

【００５７】リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細
胞誘導（ＬＣＩ）アッセイ 培養上清およびクロマトグラフィーフラクションをそれ
らがrIL-２と相乗的に作用して細胞溶解性ＬＡＫ細胞の
生成を誘導する能力に関し以下のように調べた。ヒト末
梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を下記方法で単離した。十
分に無菌の防腐剤の入っていないヘパリン（Sigma）を
最終濃度約５単位／ｍｌとなるように含有する注射器内
に正常な自発提供者から血液を採った。その血液を、カ
ルシウムもマグネシウムも含まないハンクス平衡塩類溶
液（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ）で１：１希釈した。次
に、この希釈した血液を５０ｍｌ Falcon ２０９８遠心
管内の１５ｍｌフィコール／ジアトリゾエート・ナトリ
ウム（Lymphocyte Separation Medium, Organon Teknik
a Corp., Durham, NC）上に積層させた。この遠心管を
５００×ｇで室温で３０分遠心した。遠心後、フィコー
ル／ジアトリゾエート・ナトリウム層上に浮遊する細胞
を集め、カルシウムもマグネシウムも含まない２倍容以
上のＨＢＳＳと混合することにより希釈した。次に、得
られた細胞懸濁液をFalcon ２０９８遠心管内の、１％
ヒトＡＢ血清（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）を
補添したRPMI １６４０培地中における２０％スクロー
ス（Fisher）の１５ｍｌ上に積層した。この遠心管を５
００×ｇで室温で１０分間遠心し、上清液を捨てた。細
胞ペレットを、５ｍｌのカルシウムおよびマグネシウム
を含まないＨＢＳＳ中に再懸濁し、遠心分離により再び
ペレットとし、そして最終的に適当な培地に再懸濁し
た。ロイシンエステルに代えてグルタミン酸エステルに
置き換える以外は、Ｌ−ロイシンメチルエステルによる
補助細胞除去に関するThieleら、J. Immunol. 131:2282
-2290（1983）の記載と同じ条件を用いて、５ｍＭ Ｌ−
グルタミン酸ジメチルエステル（Sigma）で処理するこ
とにより補助細胞をＰＢＭＣから除去した。

【００５８】補助細胞を欠失ＰＢＭＣをWongら、Cell I
mmunol. 111:39-54（1988）記載のようにして不連続パ
ーコール密度グラジエント（Pharmacia, Piscataway, N
J）での遠心によってさらに分画した。３８，４１，４
５および５８％パーコール層から回収された単核細胞を
プールし、アッセイに於けるＬＡＫ細胞前駆体の供給源
として用いた。パーコールグラジエントから回収された
細胞を洗浄し、そして０．１ｍＭ非必須アミノ酸、６０
μｇ／ｍｌアルギニンＨＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩
衝液、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニ
シリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべて
ＧＩＢＣＯから入手可能）、５×１０^-5Ｍ ２−メルカ
プトエタノール（Fisher Scientific, Fair Lawn, N
J）、１ｍｇ／ｍｌデキストロース（Fisher）、および
５％ヒトＡＢ血清（Irvine Scientific, Santa Ana, C
A）を添加した、RPMI １６４０およびダルベッコ改変イ
ーグル培地の１：１混合物からなる組織培養培地（ＴＣ
Ｍ）に懸濁した。これら細胞を２４−ウェル組織培養プ
レート（Costar, Cambridge, MA）中で、１ｍｌ培養物
（７．５×１０⁵ 細胞／培養）としてインキュベートし
た。この培養物には、内因性サイトカイン生産を最小限
にするために１０^-4Ｍコハク酸ヒドロコルチゾンナトリ
ウム（Sigma）を添加した。また一部の培養物には最終
濃度５単位／ｍｌでヒトrIL-２（Hoffmann-La Roche, I
nc., Nutley, NJ）、および／またはＣＬＭＦ活性につ
いてアッセイ予定の上清を加えた。すべての培養物を３
−４日間、３７℃で、５％ＣＯ₂ 、９５％空気の加湿で
インキュベートした。

【００５９】このインキュベーションの終了時に、各培
養物の内容物を集め、細胞を遠心によりペレットとし、
そして０．５ｍｌの新鮮なＴＣＭに再懸濁した。この細
胞懸濁液の１／１０ｍｌを、⁵¹Ｃｒ−標識Ｋ５６２また
はＲａｊｉ細胞（二つの細胞系ともにＡＴＣＣから入手
できる）の０．１ｍｌと混合しそして５時間の⁵¹Ｃｒ放
出アッセイで、その溶解活性を調べた。標的細胞を⁵¹Ｃ
ｒで標識し、細胞溶解アッセイを行うための方法は、Ga
telyら、［JNCI 69:1245-1254（1982）］に記載されて
いる。特異的⁵¹Ｃｒ放出パーセントは［（ｅ−ｃ）／
（１００−ｃ）］×１００として算出された。ここでｅ
はリンパ球とインキュベートした標的細胞からの⁵¹Ｃｒ
放出のパーセンテージでありそして、ｃは単独でインキ
ュベートされた標的細胞から自然発生的に放出された⁵¹
Ｃｒのパーセンテージである。放出可能な全⁵¹Ｃｒは、
２％ドデシル硫酸ナトリウムで標的細胞を溶解すること
により測定された。Gatelyら、JNCI 69:1245-1254（198
2）参照。すべてのリンパ球集団を４重で溶解活性につ
いてアッセイした。

【００６０】ＬＡＫ細胞誘導ミクロアッセイ：ヒトＬＡ
Ｋ細胞の誘導に於けるrIL-２およびＣＬＭＦ−含有溶液
の間の相乗作用を測定するためのミクロアッセイは、前
記のＬＡＫ細胞誘導アッセイと同様であるが、以下のよ
うな改変を加えた。前記のようにして予め補助細胞を除
去しパーコールグラジエント遠心によって分画されたヒ
ト末梢血液単核細胞をCostar ３５９６マイクロプレー
トのウェルに加えた（５×１０⁴ 細胞／ウェル）。一部
のウェルにはさらにrIL-２（最終濃度５単位／ｍｌ）お
よび／または精製ＣＬＭＦまたは免疫低下ＣＬＭＦ−含
有溶液を加えた。すべての培養物は１０^-4Ｍコハク酸ヒ
ドロコルチゾンナトリウム（Sigma）を含有しておりそ
して５％ヒトＡＢ血清を含有するＴＣＭの添加により全
量を０．１ｍｌとした。培養物を３日間３７℃でインキ
ュベートし、次に０．１ｍｌの⁵¹Ｃｒ−標識Ｋ５６２細
胞（５％ヒトＡＢ血清を添加したＴＣＭ中、５×１０⁴
細胞／ｍｌ）を各ウェルに加えた。次に培養物を３７℃
で一夜インキュベートした。これに続き培養物を５００
×ｇで５分間遠心し、Skatron上清収集システム（Skatr
on, Sterling, VA）を用いて上清溶液を集めた。各上清
溶液中に放出された ⁵¹Ｃｒの量をガンマカウンター（Pa
ckard, Downer’s Grove, IL）で計測し、そして特異的
⁵¹Ｃｒ放出％を前記のようにして算出した。すべての試
料を４連でアッセイした。

【００６１】細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成アッ
セイ ヒトＣＴＬの溶解活性を生じさせ、測定するために用い
られる方法は、GatelyらによりJ. Immunol. 136:1274-1
282（1986）に、およびWongらによりCell. Immunol. 11
1:39-54（1988）に詳細に記載されている。前記のよう
にしてヒト末梢血液単核細胞を正常な自発提供者の血液
から単離し、Ｌ−グルタミン酸ジメチルエステルで処理
することにより補助細胞を除去しそしてパーコールグラ
ジエント遠心によって分画した。４５％と５８％パーコ
ール層の間の界面から回収した高密度リンパ球を混合リ
ンパ球−腫瘍培養物（ＭＬＴＣ）に於ける応答リンパ球
として使用した。パーコールグラジエントで得られた高
密度リンパ球（７．５×１０⁵ ／培養物）を１×１０⁵
ＵＶ照射メラノーマ細胞例えばＨＴ１４４（ＡＴＣＣよ
り入手可）と一緒に、または５×１０⁴ ガンマ線照射メ
ラノーマ細胞例えばＨＴ１４４と一緒に５％ヒトＡＢ血
清（１．２ｍｌ／培養物）添加ＴＣＭ中でインキュベー
トすることにより２４ウェル組織培養プレート（Costar
＃３４２４）内のＭＬＴＣ中にＣＴＬを生成させた。Ｕ
Ｖ照射には、ＨＴ１４４細胞を１％ヒトＡＢ血清を含有
する、フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩類溶
液（ＧＩＢＣＯ）に１−１．５×１０⁶ 細胞／ｍｌの密
度で懸濁した。細胞懸濁液の１ｍｌを３５×１０ｍｍプ
ラスチック組織培養皿（Falcon＃３００１）に加え、次
に、細胞を２５４ｎｍ ＵＶ光（ＵＶＧ−５４型MINERAL
IGHT灯、Ultra-violet Products, Inc., San Gabriel,
CA）を用いて照射した（９６０μＷ／ｃｍ² 、５分
間）。ガンマ線照射には、ＨＴ１４４細胞を１−５×１
０⁶ 細胞／ｍｌの密度で、５％ヒトＡＢ血清添加ＴＣＭ
に懸濁し、そしてセシウム線源照射装置（１４３型、J.
L. Shepherd and Associates, San Fernando, CA）を
用いて照射した（10,000ラド）。ＵＶ−またはガンマ線
−照射ＨＴ１４４を遠心し、そして５％ヒトＡＢ血清を
含有するＴＣＭ中にＭＬＴＣへの添加に望ましい細胞密
度で再懸濁した。リンパ球およびメラノーマ細胞に加え
て、一部のＭＬＴＣにはヒトrIL-２および／または精製
ヒトＣＬＭＦを指示された濃度で加えた。内因性サイト
カイン生産を抑制し［S. Gillisら、J. Immunol. 123:1
624-1631（1979）］そして培養物の非特異的ＬＡＫ細胞
の生成を減少させるために［L. M. MuulおよびM. K. Ga
tely, J. Immunol. 132：1202-1207（1984）］、コハク
酸ヒドロコルチゾンナトリウム（Sigma）を最終濃度１
０^-4Ｍ（ＵＶ照射メラノーマ細胞を含有する培養物）ま
たは１０^-5Ｍ（ガンマ線照射メラノーマ細胞を含有する
培養物）となるようＭＬＴＣに添加した。培養物を３７
℃で、空気中５％ＣＯ₂ の加湿環境中６日間インキュベ
ートした。この期間の最後に、同型培養物から得られた
リンパ球をプールし、遠心し、５％ヒトＡＢ血清を含有
するＴＣＭ１、２ｍｌに再懸濁し、そして一夜の⁵¹Ｃｒ
放出アッセイでＨＴ１４４メラノーマ細胞を溶解させる
能力について調べた。特異性の対照としてＫ５６２赤白
血病細胞（ＡＴＣＣから入手しうる）を用いた。

【００６２】Gatelyら［JNCI 69:1245-1254（1982）］
記載のようにしてメラノーマ細胞およびＫ５６２細胞を
⁵¹Ｃｒ−クロム酸ナトリウムで標識した。同様に、神経
膠腫標的細胞の溶解を定量するための、Gatelyらの記載
（上記）と同じ方法で、⁵¹Ｃｒ標識メラノーマ細胞のリ
ンパ球を介した溶解を測定した。⁵¹Ｃｒ標識Ｋ５６２細
胞の溶解をアッセイするには、Costar ３６９６「ハー
フエリア」マイクロテストプレートのウェル内で、０．
１ｍｌのリンパ球懸濁液を２５μｌの⁵¹Ｃｒ標識Ｋ５６
２（５％ヒトＡＢ血清含有ＴＣＭ中、２×１０⁵ 細胞／
ｍｌ）と混合した。３７℃で一夜インキュベート後、プ
レートを１４００×ｇで５分間遠心し、培養培地の５０
μｌを各ウェルから吸引した。各試料中の⁵¹Ｃｒ量をガ
ンマカウンター（Packard）で測定し、そして特異的⁵¹
Ｃｒ放出％を前記のようにして算出した。すべてのアッ
セイを４連で行い、表（下記参照）中の値は同型試料の
平均値±１ S.E.M.を表す。

【００６３】Ｔ細胞増殖因子（ＴＧＦ）アッセイ 培養上清およびクロマトグラフィーフラクションがＰＨ
Ａ−活性化ヒトＴリンパ芽球の増強を刺激する能力を以
下のように測定した。ＬＣＩアッセイについて前記した
ようにして、不連続フィコールおよびスクロースグラジ
エントでの遠心によって、ヒトＰＢＭＣを単離した。Ｐ
ＢＭＣ（５×１０⁵ 細胞／ｍｌ）を０．１％フィトヘマ
グルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）（Difco Laboratories,
Detroit,MI）含有ＴＣＭ中３７℃で培養した。３日後、
その培養物を新鮮なＴＣＭで１：１に割り、ヒトrIL-２
を各培養物に最終濃度５０単位／ｍｌとなるよう加え
た。次にこの培養物をさらに１から２日間インキュベー
トした時点で、細胞を集め、洗浄しそして４×１０⁵ 細
胞／ｍｌでＴＣＭ中に再懸濁した。アッセイに於けるあ
らゆるありうるIL-２誘導細胞増殖を阻止するために、
この細胞懸濁液に熱不活化ヤギ抗−ヒトrIL-２抗血清
（最終希釈度：１／２００）を加えた。この抗血清は当
業者に周知の方法を用いて調製できるしあるいはGenzym
e Co., Boston,MAから入手することができる。用いた抗
血清は１／20,000の血清希釈度で２単位／ｍｌのrIL-２
の５０％中和を引き起こすことが示された。

【００６４】抗−IL-２抗血清を含有する細胞懸濁液の
５０μｌをCostar ３５９６マイクロプレートのウェル
内で、培養上清の連続希釈物またはクロマトグラフィー
フラクションの５０μｌと混合した。培養物空気中５％
ＣＯ₂ の加湿環境で１日間３７℃でインキュベートした
後、 ³Ｈ−チミジン（New England Nuclear, Boston, M
A）、ＴＣＭ中１０μＣｉ／ｍｌ、５０μｌを各ウェル
に添加した。この培養物をさらに一夜インキュベートし
た。続いて培養物の内容物をセルハーベスター（Cambri
dge Technology Inc., Cambridge, MA）を用いてグラス
ファイバーフィルター上に集め、細胞ＤＮＡへの ³Ｈ−
チミジンの取り込みを液体シンチレーション計数によっ
て測定した。すべての試料を３連でアッセイした。

【００６５】ＣＬＭＦ精製に際して、クロマトグラフィ
ー溶離プロフィールを作成しそして精製された試料の活
性回収パーセントおよび比活性を算出するためには活性
の単位を定義することが必要であった。このために、Ｐ
ＨＡ−活性化ヒト、ＰＢＭＣをＮＣ−３７細胞と同時培
養することにより生成されたヒトサイトカインの部分精
製標品を標準物として使用した。その標品に２０００単
位／ｍｌの自由裁量力価を割り当てた。それぞれのＴＧ
ＦまたはＬＡＫ誘導アッセイにはこの標品のいくつかの
希釈物を包含させた。標準標品について得られた結果を
用いて、用量−応答曲線を作成し、この曲線から検査し
た希釈度での各未知試料の活性単位／ｍｌを挿入でき
た。これらの値に希釈倍率を乗じることによって単位／
ｍｌで表されたもとの試料の活性が得られた。

【００６６】抗体中和実験には、ＴＧＦアッセイを以下
のように改変した。ＣＬＭＦ含有培地の２５μｌをCOST
AR ３５９６マイクロプレートのウェル内で抗血清の連
続希釈物または抗体溶液の５０μｌと混合した。この混
合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次にＰＨＡ
−活性化リンパ芽球（１：１００抗−rIL-２を加えたＴ
ＣＭ中、８×１０⁵ ／ｍｌ）の懸濁液２５μｌを各ウェ
ルに加えた。この培養物を前記のようにしてさらにイン
キュベートし、 ³Ｈ−チミジンでパルスし、細胞を集
め、そして ³Ｈ−チミジンの取り込みを分析した。

【００６７】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化アッ
セイ 単独添加時またはrIL-２と組み合わせて添加した場合の
精製ＣＬＭＦのＮＫ細胞活性化能を以下のようにして調
べた。ヒトＰＢＭＣを前記のようにして不連続フィコー
ルおよびスクロースグラジエント上の遠心によって単離
しそして１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００単位／ｍ
ｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、
および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したRPMI １６４０
培地に懸濁した。このＰＢＭＣを種々の濃度のrIL-２お
よび／または精製ＣＬＭＦと１ｍｌ培養液（５×１０⁶
細胞／培養物）中３７℃で一夜インキュベートした。１
８−２０時間後、培養液の内容物を集め、遠心し、細胞
を一夜培養に用いたと同じ培地に再懸濁した。次に、培
養されたＰＢＭＣの細胞溶解活性を前記⁵¹Ｃｒ放出アッ
セイで評価した。

【００６８】細胞上清溶液の濃度 誘導ＮＣ−３７細胞の数バッチから調製された全部で６
０リッターの凍結保存粗製ヒトＣＬＭＦ上清溶液をプー
ルし、そしてPellicon Cassette System（30,000 NMWL
PTTK00005；Millipore Corp., Bedford, MA）を用いて
３０倍に濃縮した。所望容量約１．９リッターまで濃縮
した後、１０Ｎ ＮａＯＨで、ｐＨ６．０に調製した１
０ｍＭ ＭＥＳと緩衝液交換した。この濃縮物を４℃で
１０分間10,000×ｇで遠心して沈澱を捨てた。

【００６９】NuGel P-SPカラムでのイオン交換クロマト
グラフィー 濃縮した上清溶液を１０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ６．０で平
衡化したNu-Gel P-SP（Separation Industries, Metuch
en, NJ）カラム（５×５ｃｍ）に毎時１２０ｍｌの流速
でかけた。２８０ｎｍで監視したベースライン吸光度が
得られるまでカラムを洗浄した。次に、吸着されたタン
パク質を０から０．５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＭＥＳ，
ｐＨ６．０の５００ｍｌ塩グラジエントを用い毎分２ｍ
ｌの流速で溶離した（図１）。フラクションの一部をと
ってＴ細胞増殖因子（ＴＧＦ）活性についてアッセイし
た。ＴＧＦ活性を有するフラクションをプールしそして
試料の塩濃度を５０分の１に低下させるために、５０容
量の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で透析した
（Spectra/Por ７，Fisher Scientific）。

【００７０】ブルーＢ−アガロースカラム上の色素アフ
ィニティークロマトグラフィー 透析した試料を４℃および10,000×ｇで１０分間遠心
し、沈降物を棄てた。上清溶液を２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５で平衡化したブルーＢ−アガロース（Am
icon, Danvers, MA）カラム（２．５×１０ｃｍ）に毎
時２０ｍｌの流速で注いだ。カラムを、２８０ｎｍで監
視したベースライン吸光度が得られるまで、この同じ緩
衝液で洗浄した。次に、吸収されたタンパク質を毎時１
５ｍｌの流速で０−０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５の塩グラジエント５００ｍｌで
溶離した（図２）。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ
活性についてアッセイした。ＴＧＦ活性を含有するフラ
クションをプールし、調製物の塩濃度を１００分の一に
減少させるために、１００容量の２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５で透析（Spectra/Por７，Fisher Scient
ific）した。

【００７１】モノＱクロマトグラフィー上でのイオン交
換クロマトグラフィー 透析した試料を０．４５μｍのセルロースアセテートフ
ィルター（Nalgene Co., Rochester, NY）で濾過し、そ
して濾液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５で平衡
化したモノＱ ＨＲ５／５（Pharmacia LKB Biotechnolo
gy, Inc., Piscataway, NJ）カラム（５×５０ｍｍ）に
毎時６０ｍｌの流速で注いだ。カラムを、２８０ｎｍで
監視したベースライン吸光度が得られるまでこの同じ緩
衝液で洗浄した。次に、吸収されたタンパク質を毎時６
０ｍｌの溶液で０−０．２５ＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５の１時間の直線状塩グラジエン
トを用いて溶離した。フラクションの一部分ずつをＴＧ
Ｆ活性についてアッセイしタンパク質純度を１２％スラ
ブゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Laemmli, Nature（L
ondon）227:680-685（1970）］により還元なしに評価し
た。ゲルはタンパク質を可視化するために銀染色［Morr
issey, Anal, Biochem. 117:307-310（1981）］した
（図４）。フラクション３６および３７は純度９５％以
上であり、分子量75,000で主要バンドを示した。ＴＧＦ
活性を含有するフラクション３８−４１はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによれば７５ｋＤａのタンパク質を示し、分子量5
5,000および40,000で大きな混入物がある。

【００７２】したがって、これら混入タンパク質を排除
するために前記モノＱクロマトグラフィーフラクション
３８を８Ｍ尿素で１：１ｖ／ｖに希釈し、そして逆相Ｈ
ＰＬＣ濃縮技術を用いてVydacジフェニルカラムにポン
プで注入した。カラムを続いて０．１％トリフルオロ酢
酸５ｍｌで洗浄した。タンパク質の溶離は０．１％トリ
フルオロ酢酸中の７時間以上にわたる０−７０％アセト
ニトリルのグラジエントで達成された（図５）。フラク
ションの一部分ずつをＴＧＦ活性についてアッセイし
た。ＴＧＦ活性を含有するフラクションのタンパク質純
度を１０％スラブゲルを用い非還元条件下でＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより評価した。このゲルを銀染色してタンパク
質を可視化した（図６）。フラクション８６−９０は９
５％以上の純度を有し、分子量75,000のタンパク質を示
した。フラクション８７および８８をプールして一部分
を還元条件下（β−メルカプトエタノールの存在下）お
よび非還元条件下（β−メルカプトエタノールの非存在
下）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。還元条件下に
おいては、分子量75,000のＣＬＭＦは40,000および35,0
00ダルトンの２個のサブユニットに分離された（図
７）。したがって、ＣＬＭＦはジスルフィドにより結合
した４０ｋＤａおよび３５ｋＤａサブユニットから成る
７５ｋＤａヘテロダイマーであることが結論づけられ
た。

【００７３】達成されたＣＬＭＦの全体としての精製を
第１表に示す。モノＱ精製された物質およびVydacジフ
ェニル精製物質のタンパク質含有量をアミノ酸分析に基
づいて計算した。

【００７４】

【表１】 モノＱ精製物質およびVydacジフェニル精製物質につい
てはそれぞれ８．５×１０⁷ 単位／ｍｇおよび５．２×
１０⁷ 単位／ｍｇの比活性が得られた。ジフェニル精製
タンパク質がモノＱ精製物質よりも比活性が少し低いと
いう事実はＣＬＭＦ分子の幾分かがＨＰＬＣ溶離溶媒
（すなわち０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリ
ル）中で不活性化するかまたは変性することによるので
あろう。

【００７５】化学的特性決定 均質なＣＬＭＦを調製できることにより、天然に存在す
るＣＬＭＦタンパク質のアミノ酸組成の決定および部分
的配列分析が初めて可能になった。モノＱ精製ＣＬＭＦ
の１０−２０ピコモルを加水分解にかけ、そのアミノ酸
組成を決定した（第２表）。プロリン、システインおよ
びトリプトファンは測定されなかった（ＮＤ）。ヒスチ
ジンの定量はトリスと関連した、His(*)と共に溶出され
る大きな人工産物のためできなかった。

【００７６】ジフェニル精製ＣＬＭＦの５−３０ピコモ
ルを過ギ酸での前処理を伴うかまたは伴わずして加水分
解にかけた。このようにしてトリプトファンを除く完全
なアミノ酸組成が得られた（第３表）。アミノ酸末端配
列決定をモノＱ精製ＣＬＭＦ １００ｐモルについての
自動エドマン分解により試みた。初めの２２サイクルの
データはＣＬＭＦのヘテロダイマー構造から予想される
ように二つの配列が存在することを示した。これらの結
果は下記のように要約されうる： サイクル １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ アミノ酸 1/? W/? E/L L/P K/V K/A D/T V/P サイクル 9 10 11 12 13 14 15 16 アミノ酸 Y-D V/P V/G E/M L/F D/P W/? Y/L サイクル 17 18 19 20 21 22 アミノ酸 P/H D/H A/S P/Q G/? E/? 第２表 アミノ酸 モル％ アスパラギン酸またはアスパラギン 11.8 トレオニン 7.8 セリン 8.4 グルタミン酸またはグルタミン 14.9 プロリン ND グリシン 6.2 アラニン 7.6 システイン ND バリン 6.9 メチオニン 2.0 イソロイシン 4.6 ロイシン 9.0 チロシン 3.7 フェニルアラニン 4.0 ヒスチジン * リジン 9.3 アルギニン 5.4 トリプトファン ND 第３表 アミノ酸 モル％ アスパラギン酸またはアスパラギン 10.8 トレオニン 7.2 セリン 8.9 グルタミン酸またはグルタミン 13.1 プロリン 3.8 グリシン 4.7 アラニン 5.9 システイン 2.9 バリン 6.2 メチオニン 1.9 イソロイシン 4.2 ロイシン 9.4 チロシン 3.6 フェニルアラニン 3.7 ヒスチジン 1.8 リジン 7.7 アルギニン 4.4 トリプトファン ND

【００７７】逆相ＨＰＬＣ クロマトグラフィー系は先にStern, A.S.およびLewis,
R.V.（1985）によりResearch Methods in Neurochemist
ry, Ens. Marks, N. and Rodnight, R.（Plenum, New Y
ork）Vol.6, 153-193に記載されている。フルオレサミ
ン（Polysciences, Inc., Warrington, PA）を用いた自
動蛍光検出系によりカラム流出物中のタンパク質を監視
した［Stein, S. およびMoschera, J.（1981）Methods
Enzymol.78：435-447］。逆相ＨＰＬＣはVydac C18また
はジフェニルカラム（４．６×２０ｍｍ，The Sep/a/ra
/tions Group, Hesperia, CA）を用いて行った。タンパ
ク質は０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルグラジエント
を用いて溶離した。

【００７８】タンパク質分析 アミノ酸分析は検出のためにフルオレサミンとのカラム
後反応を用いる器具で行った［Pan, Y. -C. E.,およびS
tein, S.（1986）、Methods of Protein Microcharacte
rization（Shively, J. E., Ed.），pp. 105-119, Huma
na Press, Clifton, NJ］。

【００７９】配列分析はApplied Biosystems Inc. Mode
l 470Aガス相シークエンサー（Foster City, CA）［Hew
ick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hood, L.E.,およびDre
yer,W.J., J. Biol. Chem. 256：7990-7997（1981）］
を用いて行った。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
アミノ酸誘導体はABI Model 120A PTHアナライザーを用
いて“オン−ライン”で同定した。

【００８０】ＣＬＭＦのサブユニットの部分的アミノ酸
配列の決定 ＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニットの精製 全部で３９．１リットルのＮＣ−３７細胞の保存された
上清溶液をプールして、Pellicon Cassette系を用いて
約２．４リットルまで濃縮し、−２０℃にて保存した。
解凍後、この濃縮物を清澄化するために、調製物を遠心
して沈降物を捨てた。

【００８１】上清溶液をNu-Gel P-SPカラムに注ぎ、タ
ンパク質を塩グラジエントを用いて溶離した（図８）。
ピークＴＧＦ活性を測定しそして活性フラクションをプ
ールして透析し、調製物の塩濃度を５０分の一に減少さ
せた。粒子を取り除くために遠心した後、この物質をブ
ルーＢアガロースカラムに注いだ。タンパク質を塩グラ
ジエントを用いて溶離した（図９）。ピークＴＧＦ活性
を測定しそして活性フラクションをプールして透析し、
調製物の塩濃度を１００分の一に減少させた。濾過後こ
の物質をモノＱカラムに注いだ。タンパク質を塩グラジ
エントを用いて溶離した（図１０）。フラクションの一
部分ずつをＴＧＦ活性に関してアッセイした。

【００８２】先のモノＱクロマトグラフィーのフラクシ
ョン３９および４０をプールし、８Ｍ尿素で１：１ｖ／
ｖに希釈しそして濃縮技術を用いてVydacジフェニルカ
ラムにポンプで注いだ。次にカラムを０．１％トリフル
オロ酢酸５ｍｌで洗浄した。タンパク質の溶離は、０．
１％トリフルオロ酢酸中の７時間にわたる０−７０％ア
セトニトリルのグラジエントを用いて達成された（図１
１）。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ活性に関して
アッセイした。ＴＧＦ活性を含有するフラクションのタ
ンパク質純度を還元条件下、すなわちβ−メルカプトエ
タノールの存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した
（図１２）。フラクション９４−９７は純度９０％以上
の40,000ダルトンサブユニットを含有していた。

【００８３】ＣＬＭＦのサブユニツトのアミノ末端配列
の決定 ＣＬＭＦの40,000ダルトンサブユニットの高度濃縮調製
物を調製できることにより、その部分的配列分析が可能
となった。

【００８４】アミノ末端配列決定はジフェニル精製40,0
00ダルトンサブユニット２０ｐモルを自動化エドマン分
解にかけることにより試みた。結果は下記のように要約
できる。 サイクル 1 2 3 4 5 6 7 アミノ酸 I W E L K K D サイクル 8 9 10 11 12 13 14 アミノ酸 V Y V V E L D サイクル 15 16 17 18 19 20 21 アミノ酸 W Y P D A P G サイクル 22 23 アミノ酸 E M 75,000ダルトンＣＬＭＦの配列分析およびＣＬＭＦの4
0,000ダルトンサブユニットの配列分析に関連して、Ｃ
ＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットのアミノ末端配列
を推定できる。35,000ダルトンサブユニットおよび40,0
00ダルトンサブユニットのアミノ末端配列は下記のよう
に要約できる：35,000ダルトンサブユニット：

【００８５】

【化５】 40,000ダルトンサブユニット：

【００８６】

【化６】 上記において？は未決定または“最前の当て推量”残基
を示す。

【００８７】ＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニット内部ア
ミノ酸配列セグメントの決定 ＣＬＭＦを前記のようにして精製した。40,000ダルトン
サブユニットをMatsudaira［J. Biol. Chem. 262：1003
5-10038（1987）］記載の方法により35,000ダルトンサ
ブユニットから分離精製した。ＣＬＭＦの５０μｇ（２
０ｍＭトリスｐＨ７．５：０．１５Ｍ ＮａＣｌ ５００
μｌ中）を２×濃縮の試料緩衝液２００μｌで希釈した
［Laemmli, Nature 227：680-685（1970）］。試料を４
００μｌに濃縮しそしてジスルフィド結合を１８μｌの
β−メルカプトエタノールの添加により切断し続いて１
０５℃に６分間さらした。

【００８８】試料を１２％ポリアクリルアミドを含有す
るミニゲル（１．０ｍｍ厚さ）に負荷し、Laemmli（上
記）に従い電気泳動した。電気泳動の後、ゲルをトラン
スファー緩衝液（１０ｍＭ ３−シクロヘキシルアミノ
−１−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ１
１．０）に５分間浸してトリスおよびグリシンの量を減
少させた。この間、ポリビニリデンジフルオライド（Ｐ
ＶＤＦ）膜（Immobilon；Millipore；Bedford, MA）を
１００％メタノールですすぎ、トランスファー緩衝液中
に保存した。ＰＶＤＦ膜２枚および数枚のブロット用紙
を重ねたゲルをブロット装置に組み立て、トランスファ
ー緩衝液中０．５Ａｍｐで３０分間電気泳動により溶離
した。ＰＶＤＦ膜を脱イオンＨ₂ Ｏ中で５分間洗浄し
た。ブロットしたもののへりをＰＶＤＦ膜から切り取
り、５０％メタノール中の０．１％クーマシーブルーＲ
−２５０で５分間染色し、続いて５０％メタノール、１
０％酢酸中で５−１０分間室温にて汚れを落とした。続
いて40,000ダルトンの染色バンドを未染色ブロットの相
当する領域と一致させ、40,000サブユニットを未染色Ｐ
ＶＤＦから切り取った。

【００８９】クーマシーブルー染色した40,000ダルトン
サブユニットのＮ−末端を配列決定し、Ｎ末端が先に決
定されたものと一致することを確認した（前記参照）。
この方法により、40,000ダルトンのタンパク質はＣＬＭ
Ｆの40,000サブユニットであることが同定された。ＰＶ
ＤＦ結合40,000ダルトンサブユニットの５％をそのアミ
ノ酸組成について分析した（第４表）。ブロットした4
0,000ダルトンサブユニットの残る９５％をBauw, ら、
［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：7701-7705（198
9）］の方法によりトリプシンでフラグメント化した。
タンパク質を担持する膜を約３×３ｍｍの断片に切り、
エッペンドルフチューブに集めた。続いてそれらをメタ
ノール中の２％ポリビニルピロリドン（40,000ダルト
ン）溶液３００μｌ中に浸した。３０分後、クエンチン
グ混合物を同量の蒸留水で希釈しそしてさらに５−１０
分間インキュベートした。次に上清溶液を捨て、膜片を
３００μｌの水で４回そして３００μｌの１００ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。２μｇのト
リプシンを含有するこの緩衝液２００μｌを添加した。
試料を振盪しそして３７℃で４時間インキュベートし
た。続いて上清溶液を第２のエッペンドルフチューブに
移し、膜片をさらに８８％（ｖ／ｖ）の蟻酸１００μｌ
で１回そして脱イオン水１００μｌで３回洗浄した。洗
浄液全てを第２のエッペンドルフチューブの消化混合物
に加えた。プールされた消化物中に含有される生じたペ
プチドをＹＭＣ Ｃ−１８カラム（２．６×５０ｍｍ；M
orris Plains, NJ）上の狭口径ＨＰＬＣ（HP1090A, Hew
lett Packard）により分離した。

【００９０】 第 ４ 表 アミノ酸 残基No. アスパラギン酸またはアスパラギン 27.9 (28) トレオニン 20.7 (23) セリン 24.6 (34) グルタミン酸またはグルタミン 44.6 (35) プロリン ND (14) グリシン 16.3 (15) アラニン 16.2 (14) システイン ND (10) バリン 20.9 (23) メチオニン 2.5 ( 2) イソロイシン 10.3 (12) ロイシン 22.9 (22) チロシン 12.9 (12) フェニルアラニン 9.9 ( 9) ヒスチジン 5.2 ( 5) リジン 24.5 (26) アルギニン 12.5 (12) トリプトファン ND (10) 注記：結果は２回の分析の平均を示す。プロリン、シス
テインおよびトリプトファンは測定されなかった（Ｎ
Ｄ）。カッコ内の値は、クローン化40,000ダルトンサブ
ユニットの配列分析から推定されたタンパク質の第１次
構造に基づいた40,000ダルトンサブユニットの理論上の
アミノ酸組成を示す。

【００９１】上記操作は図１３および図１４に概略的に
示される。消化された40,000ダルトンサブユニットのト
リプシン処理ペプチドマップを図１５に示す。ペプチド
を直線状グラジエントのアセトニトリルで溶離した。配
列決定されたピークを、そのフラクション番号に従い番
号をつける。これらのペプチドのアミノ酸配列を第５表
に示す。

【００９２】多くのトリプシン処理ペプチドを無傷の4
0,000ダルトンサブユニットの全領域から回収した（第
５表）。Ｎ末端ヘキサペプチド（フラクションno.60）
を高い収率で回収した。カルボキシ末端ペプチド（フラ
クションno.72）を回収しそして、最後の２個のアミノ
酸は配列決定により明確に確認されたわけではないが、
予測されたＣ末端ペプチドの完全長である。これは、恐
らくCysおよびSer残基が、特にそれらが、ペプチドの末
端に存在する場合充分に検出されないという事実による
のであろう。４個のありうるAsn結合炭水化物部位がｃ
ＤＮＡ配列から予測できる。これらの部位のうち２個を
含有する２本のペプチドを配列決定した。ペプチド１９
６−２０８（フラクションno.70）を配列決定した場
合、残基２００でピークが検出されなかった。このこと
はこのAsn（ｃＤＮＡにより予測）が確かにグリコシル
化されていることを示している。ペプチド１０３−１０
８（フラクションno.52）は残基１０３にてAsnを生じ
た。したがって、この部位はグリコシル化されていな
い。

【００９３】フラクションno.55のフェニルイソチオシ
アナート（ＰＴＨ）配列分析［Hewickら、J. Biol. Che
m. 256：7990（1981）］において見られた未知のピーク
は残基no.148に相当する位置で検出された。その部位は
もしそれが修飾されているのでなければ配列分析により
通常検出されないCys基であると予測される。上記ＰＶ
ＤＦトランスファー操作をＣＬＭＦの第２の５０μｇ分
量で反復した（操作概要については図１３および図１４
参照）。

【００９４】 第 ５ 表 ＰＶＤＦから離れたトリプシン処理４０ｋＤａ ＣＬＭＦペプチド フラクション 残 基 Ｎ−末端配列 no. no. 52 103-108 N-K-T-F-L-R 55 139-157 G-S-S-D-P-Q-G-V-T-*-G-A-A-T-L-S-A-E-R 55 & 57 267-279(?) V-F-T-D-K-T-S-A-T-V-I-?-R 57 52-58 T-L-T-I-Q-V-K 57 218-228 N-L-Q-L-K-P-L-K-N-S-R 60 1-6 I-W-E-L-K-K 67 288-? A-Q-D-R-Y-Y-S-S- 67 85-102(?) K-E-D-G-I-W-S-T-D-I-L-K-D-Q-K-E-P- 70 196-208 L-K-Y-E-?-Y-T-S-S-F-F-I-(R?) 71 85-96(?) K-E-D-G-I-?-S-T-D-I-L-K 72 288-306(?) A-Q-D-R-Y-Y-S-S-S-W-E-?-A-S-V-P-?-? 78 71-85 (G?)-G-E-V-L-S-H-S-L-L-L-(L?)-H-K-K しかしながら、ブロットされた40,000ダルトンサブユニ
ットをタンパク質分解酵素、スタフィロコッカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）Ｖ８プロテアーゼ
（エンドプロティナーゼ Endoproteinase Glu-C, Boehr
inger Mannheim,Indianapolis, IN）でフラグメント化
した。膜片を２０μｇのＶ８を用い３７℃で、６時間消
化した。ペプチドを８８％（ｖ／ｖ）ギ酸で抽出しそし
て相分離カラム（２×１５０ｍｍ，Ｃ８ Ｓ３，Queensf
erry, England, UK）で分離した（図１６）。アセトニ
トリルの直鎖状グラジエントでペプチドを溶離した。配
列決定されたピークをそれらのフラクション番号に従い
番号を付けた。これらのペプチドのアミノ酸配列を第６
表に示す。

【００９５】 第 ６ 表 ＰＶＤＦより離れたＶ８（Glu-C）４０ｋＤａペプチド フラクションno. 残 基no. Ｎ−末端配列 47 1-3 I-W-E 54 4-12 L-K-K-D-V-Y-V-V-E 57 13-22 L-D-W-Y-P-D-A-P-G-E 57 45-59 V-L-G-S-G-K-T-L-T-I-Q-V-K-(E?) ４本のペプチドを含有するペプチドの三大ピーク（フラ
クションno.４７，５４および５７）を配列決定した。
４本のペプチド全てが４０ｋＤａサブユニットのアミノ
末端領域からのものであった。このことはタンパク質の
Ｎ末端がＶ８消化を最も受けやすいことを示している。

【００９６】図１７はＣＬＭＦの40,000ダルトンサブユ
ニットのタンパク質構造決定を要約して示す。

【００９７】ＣＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットの
アミノ末端の直接配列決定 還元（β−メルカプトエタノールの存在下）および非還
元（β−メルカプトエタノールの非存在下）条件下（図
１８）でのモノＱフラクション３９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析（図３参照）では、40,000ダルトン分子量“混入
物”は“遊離”の40,000ダルトンＣＬＭＦサブユニット
（すなわち35,000ダルトンサブユニットと無関係）であ
ることが示される。この推測を指し示す証拠は、還元な
し（図１８、レーンＢ）では、主に75,000ダルトンＣＬ
ＭＦがいくらかの40,000ダルトンタンパク質と共に存在
する。還元後（図１８、レーンＣ）では、75,000ダルト
ンＣＬＭＦがなくなって35,000ダルトンサブユニットお
よび濃縮された40,000ダルトンバンドが生じる。

【００９８】先のモノＱクロマトグラフィーのフラクシ
ョン３９を４Ｍ尿素の存在下に５％β−メルカプトエタ
ノール中で還元しそして９５℃で５分間加熱した。試料
を濃縮法を用いVydac Ｃ−１８カラムにポンプで注ぎ、
続いてカラムを０．１％トリフルオロ酢酸５ｍｌで洗浄
した。タンパク質の溶離は０．１％トリフルオロ酢酸中
５時間にわたる０−７０％アセトニトリルのグラジエン
トを用いて達成した（図１９）。フルオレサミン陽性フ
ラクションのタンパク質純度を１０％スラブゲルを用い
非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ゲル
を銀染色してタンパク質を可視化した（図２０）。フラ
クション１１２−１１７は純度９５％以上である分子量
35,000での拡散バンドを示した。フラクション３９中に
存在する40,000ダルトンサブユニットおよび任意の他の
タンパク質はＣ−１８カラムに結合したままであった。
これらのタンパク質は（40,000ダルトンサブユニットを
含めて）４２％ギ酸／４０％１−プロパノールの溶液で
最終的に溶離された。

【００９９】均質な35,000サブユニットが調製できるこ
とでＣＬＭＦタンパク質のアミノ酸組成の決定および分
子量が低い方のサブユニット部分配列分析が可能になっ
た。３５ｋＤａサブユニットの約１μｇを加水分解にか
け、そしてそのアミノ酸組成を決定した（第７表）。プ
ロリン、システインおよびトリプトファンは測定されな
かった（ＮＤ）。

【０１００】 アミノ酸配列決定をＣ−１８精製３５ｋＤａサブユニッ
ト１００ｐモルについて自動エドマン分解により試み
た。はじめの２０サイクルからのデータにより、前記し
た推定により得られた配列が確認された。さらに、アミ
ノ酸２１−２６の他に第２のアミノ酸が得られた。これ
らの結果は下記のように要約できる： サイクル 1 2 3 4 5 6 7 アミノ酸 ? N L P V A T サイクル 8 9 10 11 12 13 14 アミノ酸 P D P G M F P サイクル 15 16 17 18 19 20 21 アミノ酸 ? L H H S Q N サイクル 22 23 24 25 26 アミノ酸 L L R A V したがって、35,000ダルトンサブユニットのアミノ末端
配列は下記のように要約できる：35,000ダルトンサブユ
ニット：

【０１０１】

【化７】 上記において？は未決定残基を示す。

【０１０２】ＣＬＭＦのトリプシン処理フラグメント配
列の決定 ＣＬＭＦの最初の精製からのモノＱフラクション３６お
よび３７をプールした（約１００ｐモル／１．７ｍ
ｌ）。３０μｌ試料を取り出し、残りの量をヘリウム気
流の下２００μｌまで減少させた。０．１Ｍ重炭酸アン
モニウムの１００μｌを加えた。トリプシン（Worthing
ton Biochemical Corp., Freehold, NJ）切断を３７℃
で２０時間、基質対酵素比率２：１で行った。生じたペ
プチドフラグメントを還元しそしてカルボキシメチル化
した。これは０．１Ｍトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５／６
Ｍグアニジン−ＨＣｌ １６０μｌを加えることにより
達成された。容量をヘリウム気流の下２００μｌまで減
少させそしてジチオトレイトール（５０ｍｇ／ｍｌ）４
μｌを加えた。混合物を３７℃で４時間インキュベート
した。ジスルフィド結合の還元的切断後、［¹⁴Ｃ]ヨー
ド酢酸（４μモル）を加え、生じた溶液を室温で暗中１
０分間インキュベートした。

【０１０３】生じたペプチドフラグメントＳ−５ １２
０オングストロームＯＤＳカラム（２．６×５０ｍｍ，
YMC, Inc., Morris Plains, NJ）での逆相ＨＰＬＣ（図
２１）により単離した。ペプチドはピリジンでｐＨ４．
０に調整した０．９Ｍ酢酸中の１−プロパノールグラジ
エントを用いて溶離した。フラクション４６中にみられ
るペプチドのアミノ酸配列はAsp-Ile-Ile-Lys-Pro-Asp-
Pro-Pro-Lysであることが判明した（自動エドマン分解
により決定）。

【０１０４】ＣＬＭＦの内部アミノ酸配列セグメントの
決定 ＣＬＭＦを先に記載したようにして精製した。タンパク
質約８０μｇを１０％トリクロロ酢酸を用いて沈降させ
た。沈降物を７０％（ｖ／ｖ）水性ギ酸中に室温で溶解
させた。少量の７０％ギ酸中の、メチオニン残基より約
５０倍モル過剰の臭化シアン（CNBr）を攪拌下に加え、
そしてこの混合物を酸素を含まないヘリウムの下室温で
４８時間、暗中でインキュベートした。この混合物を１
５容量の水で希釈し、２等分しそしてヘリウム気流の下
に乾燥した。酸および副生物を完全に除去するために、
さらに水を加えた後乾燥を繰り返した。

【０１０５】フラグメント化したＣＬＭＦの一部分（約
４０μｇ）を４％β−メルカプトエタノールを含有する
５０μｌのLaemmli試料緩衝液［Laemmli, Nature 227：
680-685（1970）］で溶解させ続いて１０５℃に６分間
さらした。試料を１７．５％ポリアクリルアミドを含有
するミニゲル（１．０ｍｍ厚）の３ウェルに負荷し、そ
してLaemmli（上記）に従い電気泳動した。

【０１０６】電気泳動の後、ゲルをトランスファー緩衝
液（１０ｍＭ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパン
スルホン酸、１０％メタノール、ｐＨ １１．０）中に
３０分間浸した。この間にポリビニリデンジフルオライ
ド（ＰＶＤＦ）膜（Immobilon；Millipore；Bedford, M
A）を１００％メタノールですすぎ、トランスファー緩
衝液中に保存した。ＰＶＤＦ膜２枚を重ね、ブロット用
紙でサンドイッチしたゲルをブロット用装置に組み立て
そしてトランスファー緩衝液中０．５Ampで３０分間電
気泳動した。ＰＶＤＦ膜を脱イオンＨ₂ Ｏ中で５分間洗
浄しそして５０％メタノール中の０．１％クーマシーブ
ルーＲ−２５０で５分間染色し、次に５０％メタノー
ル、１０％酢酸中で、室温で５−１０分間よごれを落と
した。数多くの不鮮明なバンドが観察された（図２２Ｂ
参照）。

【０１０７】膜の５領域を、ＣＬＭＦ CNBr消化物を含
有する最後の３レーンにまたがるように切り取った。こ
れらの領域を配列決定した。ＣＬＭＦのCNBrフラグメン
トから得た配列の要約を図２２Ａに示す。フラグメント
ＣＬＭＦの第２の部分（約４０μｇ）を６Ｍグアニジン
ＨＣｌ、０．１Ｍトリス／ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯ
Ｈ、ｐＨ８．０を含有する約４００−５００μｌの８８
％ギ酸中に溶解させた。試料をギ酸でｐＨ４．０に調整
した。ペプチドフラグメントをVydac Ｃ₄ カラム（４．
６×２０ｍｍ，The Sep/a/ra/tions Group, Hesperia,
CA）上の逆相ＨＰＬＣ（図２３）により単離した。ペプ
チドを４時間にわたる０．１％ＴＦＡ中の直線状グラジ
エントアセトニトリルを用いて溶離した。これらのピー
クのうちひとつを配列決定し、このペプチドのアミノ酸
配列は： フラクションNo. Ｎ−末端配列 47 V-D-A-V-H-K-L-K-Y-E-?-Y-T-S(S?) -F-F-I-R-D-I-I-K-P- （４０ｋＤａサブユニットの残基番号１９０から開始） であった。

【０１０８】上記配列にはMet基が前にあることが想定
されるかまたは知られている。“？”で印された残基は
“最善の当て推量”残基を示す。

【０１０９】アフィニティクロマトグラフィーを用いる
ＣＬＭＦの精製およびその40,000ダルトンサブユニット アフィニティクロマトグラフィー樹脂は、下記にその調
製が記載されているモノクローナル抗体７Ｂ２を活性化
アガロースに共有結合させることにより調製した。同様
に、下記に概略を示した精製は抗体をシリカまたは薄い
ミクロ細孔膜に共有結合させることによっても実施でき
よう。活性化アガロースは下記のようにして調製した。 １．１００ｍｌのセファロースＣＬ−６Ｂを１００ｍｌ
のＨ₂ Ｏで３回洗浄した。 ２．Ｈ₂ Ｏ中の１％メタ過ヨウ素酸ナトリウム１００ｍ
ｌを樹脂に加え、懸濁液を室温で６０分振盪した。 ３．樹脂を冷Ｈ₂ Ｏで充分に洗浄した。

【０１１０】７Ｂ２の活性アガロースへの共有結合は下
記のようにして行われた。 １．上記のようにして調製された活性化アガロース９ｍ
ｌをリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中の７Ｂ２（約３．
９ｍｇ／ｍｌ）７ｍｌに懸濁した。 ２．シアノボロハイドライド５０．２ｍｇをゲル懸濁液
に加えこれを４℃で一夜振盪した。 ３．ゲル懸濁液を濾過し、そしてシアノボロハイドライ
ド５０．２ｍｇを含有する７ｍｌの１．０Ｍエタノール
アミン、ｐＨ７．０に加えた。

【０１１１】上記樹脂（約２．６ｍｇ IgG/mlゲル）１
ｍｌをカラムに充填し、そしてリン酸緩衝食塩水で充分
に洗浄した。７５ｋＤａ ＣＬＭＦタンパク質および付
加的に主な混入タンパク質を含有するモノＱクロマトグ
ラフィーからのフラクションをプールして（約３．５×
１０⁶ Ｕ ＴＧＦ活性）、ＰＢＳで充分に透析した。こ
の調製物を７Ｂ２セファロースカラムに室温で毎時５ｍ
ｌの速度で注いだ。カラムを、２８０ｎｍで監視してベ
ースライン吸光度が得られるまでリン酸緩衝食塩水（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄した。続いて吸着されたタンパク質を
０．２Ｎ酢酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌを用いるｐＨ約３
で溶離した。フラクションの一部分ずつをＴＧＦ活性に
ついてアッセイした。出発活性の約７６％が酸溶出物中
に回収された。

【０１１２】タンパク質純度は１０％スラブゲルを用
い、還元なしにＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Laemmli, Nature 22
7：680-685（1970）］により評価した。ゲルを銀染色し
てタンパク質を可視化した［Morrissey, Anal. Bioche
m. 117：307-310（1981）］。酸溶出物は純粋ＣＬＭＦ
および「遊離の」連合していない４０ｋＤａ ＣＬＭＦ
サブユニットを含有する（図２４）。

【０１１３】ＣＬＭＦのｐＩの測定 プールしたモノＱフラクション３６および３７の３０μ
ｌ（図３参照）を、予め成形したアンフォリン（amphol
ine）ＰＡＧプレートゲル、ｐＨ３．５−９．５（Pharm
acia LKB Biotechnology）にスポットしてＣＬＭＦのｐ
Ｉを測定した。ｐＩ標準マーカーに基づけば、１本の大
きなバンドがｐＩ４．８に、そして１本の小さなバンド
がｐＨ５．２に観察された。ｐＨ測定に基づけばこれら
のバンドのｐＩは、それぞれ４．２および４．６であ
る。

【０１１４】精製ＣＬＭＦの生物学的活性 精製されたＣＬＭＦはＴ細胞増殖因子アッセイにおいて
ヒトＰＨＡ活性化リンパ芽球の増殖を刺激した（第８
表）。モノＱカラムから回収された精製ＣＬＭＦのＴ細
胞増殖因子活性を５つの別々の実験においてヒトリンフ
ォカインの標準調製物のそれと比較し、そして精製ＣＬ
ＭＦの比活性が８．５±０．９×１０⁷ 単位／ｍｇタン
パク質であることが判明した。ジフェニルＨＰＬＣから
得られた精製ＣＬＭＦをＴＧＦアッセイにおいて標準リ
ンフォカイン調製物と比較したひとつの実験において
は、５．２×１０⁷ 単位／ｍｇタンパク質の比活性が観
察された。精製ＣＬＭＦおよびヒトrIL-２の最適下限濃
度を、ＴＧＦアッセイにおいて組合せて検査した場合、
付加的増殖が観察され、rIL-２単独により生ずる最大増
殖まで達した。しかしながら、rIL-２により生じた増殖
は中和性ヤギ抗−ヒトIL-２抗血清の存在下で完全に阻
害されるがＣＬＭＦは影響されなかったという点で、Ｃ
ＬＭＦによる増殖と区別できた。

【０１１５】細胞障害エフェクター細胞を活性化する精
製ＣＬＭＦの能力を４日間ＬＡＫ細胞誘導アッセイおよ
び一夜ＮＫ細胞活性化アッセイの両方において調査し
た。ＬＣＩアッセイにおいては、８００単位／ｍｌの高
濃度の精製ＣＬＭＦはIL-２の非存在下ではほとんど活
性を有さなかった（第９表）。しかしながら、両サイト
カインの存在下に生成された溶解活性がどちらかのサイ
トカイン単独を含有する培養物中で観察された溶解活性
の合計より有意に大きかったので、ＣＬＭＦはＬＡＫ細
胞誘導を生じるのに低濃度のヒトrIL-２と相乗作用した
（第９表）。rIL-２の存在下において、精製ＣＬＭＦは
３単位／ｍｌの低濃度であった。

【０１１６】 第 ８ 表 精製ヒトＣＬＭＦはヒトＰＨＡ−活性化リンパ芽球の増殖を刺激する 添加サイトカイン ヒトCLMF^C ヒトrIL-２ PHA活性化リンパ芽球による³H-チミジン実 験 (u/ml) (u/ml) とり込み（平均cpm＋1 S.E.M.) １^ａ 0 0 10,607 ± 596 500 0 70,058 ± 1,630 100 0 60,377 ± 1,927 20 0 36,018 ± 321 4 0 24,996 ± 669 0.8 0 17,765 ± 790 ２^ｂ 0 0 9,976 ± 374 200 0 60,980 ± 1,713 50 0 38,817 ± 884 12.5 0 18,885 ± 2,132 3.1 0 13,648 ± 731 0 16 80,041 ± 5,835 0 4 21,282 ± 1,145 0 1 11,241 ± 896 50 4 62,050 ± 2,408 12.5 4 40,628 ± 2,196 3.1 4 31,144 ± 3,754 ａ 実験１の全ての培養物はヤギ抗−ヒトrIL-２を含有
した。

【０１１７】ｂ 実験２の培養物はどれでもヤギ抗ヒト
rIL-２を含有しなかった。 ｃ モノＱＦＰＬＣで精製されたヒトＣＬＭＦ。 第 ９ 表 精製ヒトＣＬＭＦは４日間培養物におけるリンフォカイン活性キラー（LAK） 細胞の生成においてヒトrIL-２と相乗作用する 添加サイトカイン： 下記からの特異的 ⁵¹ Cr放出 ^ａ ％ ヒトCLMF^b ヒトrIL-２ （u/ml) （u/ml) K562 Raji 0 0 3 ± 1.7 -1 ± 0.5 800 0 7 ± 0.3 1 ± 0.1 200 0 5 ± 1.1 1 ± 0.4 50 0 4 ± 3.0 0 ± 0.9 0 5 10 ± 2.4 2 ± 0.8 800 5 41 ± 4.0 11 ± 0.8 200 5 42 ± 1.9 11 ± 0.3 50 5 36 ± 2.7 9 ± 0.8 12.5 5 28 ± 2.1 7 ± 0.7 3.1 5 19 ± 0.8 5 ± 0.3 0.8 5 14 ± 1.2 3 ± 0.8 ａ 値は４組測定の平均±はS.E.M.を示す。Ｋ５６２お
よびRajiの自然発生的⁵¹Cr放出値は、それぞれ１６％お
よび１４％であった。

【０１１８】ｂ モノＱＦＰＬＣで精製されたヒトＣＬ
ＭＦ。４日間ＬＡＫ誘導アッセイにおける結果と対照的
に、精製ＣＬＭＦはそれ自体で一夜アッセイにおけるヒ
トＮＫ細胞の活性化に効果があった（第１０表）。この
アッセイにおいてＣＬＭＦは１．６単位／ｍｌの低濃度
で活性であった。ＣＬＭＦをヒトrIL-２と組合わせて検
査した場合、２つのサイトカインがいっしょで、やっと
ＮＫ活性の増強に付加的作用を有した（第１０表）。

【０１１９】 第 10 表 精製ヒトＣＬＭＦは一夜培養物のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を生じる 下記のエフェクター／標識比率での 添加サイトカイン： Raji細胞からの特異的 ⁵¹ Cr放出 ^a ％ ヒトCLMF^b ヒトrIL-２ （u/ml) （u/ml) 20/1 5/1 0 0 10 ± 0.6 5 ± 0.4 40 0 31 ± 0.4 14 ± 0.5 8 0 23 ± 2.1 12 ± 0.4 1.6 0 15 ± 0.3 10 ± 0.6 0.3 0 12 ± 1.2 9 ± 0.2 0 1 13 ± 0.4 6 ± 0.5 40 1 33 ± 2.0 17 ± 0.5 8 1 26 ± 0.8 13 ± 1.9 1.6 1 19 ± 1.1 11 ± 2.1 0.3 1 16 ± 1.0 10 ± 1.5 0 5 20 ± 1.3 13 ± 0.6 40 5 23 ± 2.0 12 ± 1.5 8 5 29 ± 1.1 16 ± 0.7 1.6 5 27 ± 1.2 13 ± 0.8 0.3 5 24 ± 1.8 13 ± 1.2 0 25 38 ± 1.4 19 ± 0.7 ａ 各値は４組測定の平均±１ S.E.M.を示す。自然発
生的⁵¹Cr放出は９％であった。

【０１２０】ｂ モノＱ ＦＰＬＣにより精製されたヒ
トＣＬＭＦ。非特異的なＮＫ／ＬＡＫ細胞の溶解活性を
増強するその能力に加えて、ＣＬＭＦはまだインビトロ
において特異的なヒト細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
応答を促進した。ＣＬＭＦは弱い免疫原性のガンマ照射
ＨＴ１４４メラノーマ細胞に対する特異的同種ＣＴＬ応
答を増大した（第１１表）。低濃度のrIL-２と組み合わ
せると、ＣＬＭＦまたはＵＶ照射されたＨＴ１４４メラ
ノーマ細胞に対する特異的同種ヒトＣＴＬ応答をも促進
（第１１表）したが添加サイトカイン非存在下では検出
可能なＣＴＬ応答を全く惹起しなかった。これらの研究
において生成された細胞溶解性エフェクター細胞の特異
性は、それらが⁵¹Cr標識ＨＴ１４４メラノーマ細胞を実
質的に溶解させるが、Ｋ５６２細胞はほとんどまたは全
然溶解させないその能力により示された。それとは対照
的に、ヒドロコルチゾンの非存在下で同じ実験で低密度
のリンパ球をrIL-２とインキュベートすることにより生
成したＬＡＫ細胞はＨＴ１４４メラノーマ細胞よりもず
っと大きな度合いでＫ５６２細胞を溶解させた。これら
アッセイにおいて生じた細胞溶解性エフェクター細胞の
特異性および同定をさらに考察するために、かかるもの
を第１１表に示す［Gatelyら、J. Immunol. 136：1274-
1282（1986）を参照］。

【０１２１】

【表２】 ａ 両方の実験において、二組の培養物の含有物をプー
ルし、洗浄し、１．２ｍｌ ＴＣＭ中に再懸濁し、そし
て希釈なしおよび１：５希釈で溶解活性をアッセイし
た。実験１においては、示されたデータは細胞溶解アッ
セイにおいて、約４：１のリンパ球：標的比率に相当す
るリンパ球の１：５希釈物を用いて得られた。実験２に
おいては、有意な溶解はリンパ球を希釈しないで溶解ア
ッセイに加えた場合にのみ見られ、これらのデータは表
に示されている。ＨＴ１４４細胞からの自然発生的⁵¹Cr
放出は実験１および２においてそれぞれ２５％および３
１％であり、そしてＫ５６２では実験１および２におい
てそれぞれ１８％および２７％であった。

【０１２２】ｂ パーコールフラクション４は４５％お
よび５８％パーコール層間の界面から回収された高密度
リンパ球を含有したが、パーコールフラクション１＋２
は３５％および３８％、および３８％および４１％パー
コール層間の界面から収集された低密度リンパ球を含有
した。パーコールフラクション４はＣＴＬ前駆体を含有
したがＬＡＫ前駆体をほとんど含有しなかった。一方フ
ラクション１＋２はＬＡＫ細胞前駆体に富んでいた。

【０１２３】ｃ ＨＴ_UVおよびＨＴγは、それぞれＵＶ
照射またはγ照射されたＨＴ１４４メラノーマ細胞を示
す。我々の結果は、精製ヒトＣＬＭＦがそれ自体で活性
化ヒトＴリンパ球を増殖させ、ヒトＮＫ細胞の細胞溶解
活性を増大させそしてヒトＣＴＬ応答を増大させたこと
を示す。ＣＬＭＦのこれらの活性はIL-２のそれらと類
似しており、このことはIL-２と同様にＣＬＭＦがイン
ビボで単一の治療剤として使用された場合に免疫増強お
よび抗腫瘍作用を有するにちがいないことを示唆してい
る。明らかに、ＣＬＭＦはまた腫瘍浸潤リンパ球から由
来しうるように、［Topalianら、J. Immunol. 142：371
4-3725（1989）］ＮＫ／ＬＡＫ細胞および活性化Ｔ細胞
のインビトロにおける増殖を刺激するのに利用できよ
う。さらに精製ＣＬＭＦは培養物中においてヒトＬＡＫ
細胞を生成させるのに低濃度のrIL-２と相乗作用しそし
てインビトロで特異的ＣＴＬ応答を促進するのにrIL-２
と付加的にかまたは相乗的に作用した。これらの結果
は、rIL-２と組合せてＣＬＭＦを使用することによりさ
らに最適の抗腫瘍療法を構成できようことを示唆してい
る。

【０１２４】ヒトＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニットを
コードするｃＤＮＡのクローニング１）細胞培養および
ポリＡ⁺ ＲＮＡの単離 ＮＣ−３７細胞（サブクローン９８）を前記のようにし
てローラーボトルで増殖させそしてＰＭＡおよびカルシ
ウムイオノフォアを用いて１５．５時間誘導した。細胞
を収穫し、約５．２５×１８⁸ 細胞を含有する１．１１
ｇの冷凍細胞ペレットにした。培養物の一部を３日間継
続し、その時点でのＣＬＭＦ活性のバイオアッセイ力価
は2,200単位／ｍｌであり、このことはＲＮＡを単離す
るために収穫した細胞がＣＬＭＦ活性を確かに産生して
いたことを示している。標準操作により凍結細胞から全
ＲＮＡを単離し、そしてポリＡ⁺ ＲＮＡをアフィニティ
クロマトグラフィーにより得た。ポリＡ⁺ ＲＮＡの収率
はＲＮＡ投入量の総量と比較して２．５％（ｗ／ｗ）で
あった。 ２）ｃＤＮＡライブラリーの確立 上記ポリＡ⁺ ＲＮＡの２μｇを、プライマーとして１５
０ｎｇのランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡに逆転写
した。ラムダgt１０にライブラリーを確立し、そして
１．５×１０⁵ クローンを増幅させてスクリーニングし
た。 ３）４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットｃＤＮＡに特異
的なＤＮＡプローブを生成させるためのＰＣＲの使用 精製４０ｋＤａタンパク質のＮ末端配列の一部はIWELKK
DVYVVELDWYPDAP... である。混合プライマーＰＣＲで使
用するための２本のプライマーを設計しそして標準操作
により合成した。正方向のプライマーは上記配列におけ
るアミノ酸ELKKDに相当するコード鎖として設計されこ
のものはその配列にありうる全てのコドンを含有し、そ
してEcoRI部位および安定性を付加する３個の付加的な
塩基を包含する5'末端伸張部分を有した。正方向のプラ
イマーの配列は従って、5' ctc gaattc gaa/g c/ttn aa
a/g aaa/g ga、すなわち６４の異なる配列を有する２３
マーである。逆方向のプライマーは４０ｋＤａ配列のＮ
末端の部分的アミノ酸配列YPDAPに相当するアンチセン
ス鎖を表すように同じ方法で設計された。逆方向のプラ
イマーは従って配列5'ctc gaa ttc ngg ngc a/gtc ngg
a/gtaを有し、２５６の異なる配列を含有する２４マー
であ。記号ｎは４種のありうる塩基a,g,cまたはｔの任
意のひとつを表わす。従ってこれらプライマーは７２塩
基対長さのアンプリコンを特定する。サブクローニング
するための付着末端を生成させるためにEcoRIで切断し
た後は、アンプリコンの寸法は６４塩基対まで低下す
る。誘導された細胞および対照として誘導されていない
細胞からのポリＡ⁺ ＲＮＡを用いて、上記２項記載のよ
うにしてＰＣＲに使用するための一本鎖ｃＤＮＡを生成
させた。これらｃＤＮＡのどちらかひとつの４０ｎｇを
１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．３／５０ｍＭ ＫＣｌ
／１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ／０．０１％ゼラチン／４種
のヌクレオチド２００μＭずつ／１０単位のTaqポリメ
ラーゼ／各プライマー２５０ｐモルずつ、の１００μｌ
中で正および逆方向プライマーを用いて増幅した。ＰＣ
Ｒのパラメーターは下記のとおりであった：最初の変性
は９５℃で７分間であった。低緊縮アニーリングは、２
分間以上３７℃にさまし、３７℃で２分間インキュベー
トし、２．５分以上７２℃に加熱し、７２℃で１．５分
間伸張させ、９５℃で１分間以上加熱し、そして９５℃
で１分間変性させることにより行った。この低緊縮アニ
ーリングサイクルをもう１回繰り返した。その後、３０
回の標準サイクルを下記のようにして実施した：９５℃
で１分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間。最後の伸
張は７２℃で１０分間行った。全試料の１０％を４％ア
ガロースゲルにかけ、染色しそして分析した。予想した
寸法を有するアンプリコンは誘導されたｃＤＮＡが増幅
されている試料においてのみ検出できた。試料の残りは
フェノールで抽出し、エタノールを用いる沈降により濃
縮しそして４２μｌの水に再溶解させた。この試料を５
０μｌ中の制限酵素EcoRI ６０単位を用い３７℃で２時
間消化した。続いて試料を６％ポリアクリルアミドゲル
にかけそして６４ｂｐアンプリコンをゲルから切り出し
て標準操作により溶離した。ＤＮＡアンプリコンを標準
操作によりブルースクリプトＳＫ＋プラスミドのEcoRI
部位にサブクローンした（Stratagene, La Jolla, C
A）。E.コリ株ＤＨ５（ＡＴＣＣより取得可能）の形質
転換により得られたコロニーを取りそして６４ｂｐ挿入
物の存在について分析した（ブルースクリプトＳＫ＋プ
ラスミドと適合しうる他のE.コリ株も使用できる）。２
個の陽性候補を配列決定してクローン化されたアンプリ
コンの配列を決定した。この分析により正しいフラグメ
ントが増幅されたことが明らかである。なぜなら推定ア
ミノ酸配列は、精製４０ｋＤａタンパク質の部分的アミ
ノ末端アミノ酸配列と正確に一致するからである。次に
この情報を用いてｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グに使用できる５４ｂｐ長オリゴヌクレオチドプローブ
を設計した。下記の配列を有する２本のオリゴを設計し
た。すなわち5'gag cta aag aaa gat gtt tat gtc gta
gaa ttc gatおよび5'aggggc atc cgg ata cca atc caa
ttc tac gac ata.これらの２本のオリゴは下記の構造を
形成するのに部分的に相補的である。

【０１２５】 5'gagctaaagaaagatgtttatgtcgtagaattggat 3' 3'atacagcatcttaacctaaccataggcctacgggga 5' かかる構造はクレノウフラグメントおよび標識されたヌ
クレオチドを用いて標識でき、従ってｃＤＮＡライブラ
リーのスクリーニングのための高い比活性を有するプロ
ーブが得られる。 ４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 増幅されたライブラリーからの全部で３×１０⁵ クロー
ンを下記条件下で６個の二組のフィルターでスクリーニ
ングした。５×ＳＳＣ／１０×デンハード／１００μｇ
／ｍｌの変性ウシ胸腺ＤＮＡ／２０％ホルムアミド／
０．１％／ＳＤＳ／１．５×１０⁶ ｃｐｍの標識５４マ
ー、の５０ｍｌを３７℃で１７時間。次にフィルターを
２×ＳＳＣ中で４２℃で３０分間洗浄し、乾燥しそして
Ｘ−線フィルムにさらした。増感スクリーンを用いて一
夜露出させた後、陽性の可能性のある１６検体を取り、
第２回のスクリーニングによりさらに分析した。１０個
の再度ハイブリダイズしたファージを単離し、それらの
ＤＮＡを調製した。これら１０単離体のうち８個はEcoR
I切断により０．８ｋｂおよび０．６ｋｂ長の２本のフ
ラグメントを遊離し、内部にEcoRI部がありうることを
示しており、同一のように見えた。ブロットし、スクリ
ーニングプローブとハイブリダイズすると０．６ｋｂフ
ラグメントだけがハイブリダイゼーションを示した。ふ
たつのフラグメントを前記したブルースプリプトＳＫ＋
プラスミドのEcoRI部位に別々にサブクローンしそして
完全に配列決定した。この分析により、両フラグメント
が一列に整列すると天然に存在する内部EcoRI部位を有
する約１．４ｋｂ長のひとつの連続したｃＤＮＡを形成
することが示された。なぜなら両フラグメントは翻訳さ
れると精製４０ｋＤａタンパク質から実際に単離されて
いるトリプシン消化ペプチドをコードする読み取り枠の
存在を示したからである。ｃＤＮＡから推定した４０ｋ
Ｄａサブユニットの完全な配列を図２５に示す。このｃ
ＤＮＡは３２８アミノ酸からなるひとつのオープンリー
ディングフレームをコードする。このタンパク質は開始
Metで始まり、古典的疎水性シグナルペプチドをつくる
別の２１アミノ酸が続く。成熟精製４０ｋＤａサブユニ
ットのＮ末端すなわちIWELKKD... がシグナル配列のす
ぐ後に続く。成熟タンパク質はしたがって３０６アミノ
酸から成る。推定タンパク質配列は４個のありうるＮ結
合グリコシル化部位を含有し、そのうち２個は単離され
配列決定されたトリプシン消化ペプチド中に存在する。
これらの２部位のうちの一方はインビボで炭水化物側鎖
結合に用いられる。成熟非グリコシル化タンパク質の計
算上の分子量は34,699であり、ｐＩは５．２４である。
相当するｍＲＮＡは２．４ｋｂ長であり、そして誘導さ
れた細胞のみから定常状態ＲＮＡでノーザンブロットで
検出できる。

【０１２６】ヒトＣＬＭＦの３５ｋＤａサブユニットを
コードするｃＤＮＡのクローニング 細胞培養、ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブラリー
の確立は４０ｋＤａサブユニットのクローニングに関し
て先に記載されたと同様にして行われた。

【０１２７】３５ｋＤａサブユニツトｃＤＮＡに特異的
なＤＮＡプローブの生成への混合プライマーＰＣＲの使
用 精製３５ｋＤａサブユニットのＮ末端部分配列は?NLPVA
TPDPGMFP?LHHSQNLLRAV... である。混合プライマーＰＣ
Ｒに用いるための２本のプライマーは標準操作により生
成された。正方向のプライマーは上記配列中のアミノ酸
DPGMFに相当するコード鎖として設計されれ、その配列
にありうる全てのコドンを含有しそしてEcoRI部位およ
び安定性を付加する３個の付加的塩基を含む5'末端伸張
部分を有した。この正方向プライマーの配列は従って5'
CTC GAA TTC GAT/C CCN GGN ATCTT-3'、すなわち３２の
異なる配列を有する２３マーであった。逆方向プライマ
ーは同じ方法で設計され、Ｎ末端部分配列のアミノ酸NL
LRAに相当するアンチセンス鎖を示すものであった。こ
の逆プライマーは配列5'CTC GAA TTC NGC NCG/TNAA/GNA
A/G A/GTTを有する、すなわち4,096の異なる配列を有す
る２４マーを有した。両プライマー配列において、Ｎは
４塩基の全てを表す。２本のプライマーは従ってアンプ
リコン塩基長を特定した。EcoRIで切断してサブクロー
ニングするための付着末端を生成させた後にはアンプリ
コン寸法は６１塩基に低下する。ヒトゲノムＤＮＡの約
３μｇを１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８．３／５０ｍＭ
ＫＣｌ／１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ／０．０１％ゼラチン
／４種のヌクレオチドをそれぞれ２００μＭ／２．５単
位のTaqポリメラーゼ／６４ｐモルの正方向および2,048
ｐモルの逆方向プライマー（２種のプライマーの非常に
異なる複雑さを補うために）の５０μｌ中で正および逆
方向プライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲサイクルパ
ラメーターは下記のとおりであった。最初の変性は９５
℃で７分間。低緊縮アニーリングは２分以上３７℃にさ
まし、３７℃で２分間インキュベートし、２．５分以上
７２℃に加熱し、１．５分間７２℃で伸張させ、１分以
上９５℃に加熱し、そして９５℃で１分間変性させるこ
とにより行った。この低緊縮アニーリングサイクルをも
う１回繰り返した。その後、４０回の標準サイクルを下
記のように行った。すなわち９５℃で１分間、５５℃で
２分間そして７２℃で３分間。最後の伸張を７２℃で１
０分間行った。試料の約２０％を６％ポリアクリルアミ
ドゲルにかけ、臭化エチジウムでゲルを染色した後に予
想された寸法のアンプリコンが検出された。試料の残り
をフェノールで抽出し、エタノール沈降により濃縮しそ
して水１７μｌ中に再溶解した。試料を２０μｌ中のEc
oRI酵素２０単位を用いて３７℃で６０分間消化した。
試料を続いて８％ポリアクリルアミドゲルで分画し、そ
して６１塩基対アンプリコンをゲルから切り出して標準
操作により溶離した。ＤＮＡアンプリコンを標準操作に
よりブルースクリプトプラスミドＳＫ＋（Stratagene,
La Jolla, CA）のEcoRI部位にサブクローンした。E.コ
リ株ＤＨ５の形質転換により得られたコロニーを６１塩
基対挿入物の存在に関して分析した。２候補を配列決定
してサブクローンされたアンプリコンの配列を決定し
た。２個のクローンのうち１個は正しい配列を含有して
いた。なぜならこの配列を翻訳すると精製タンパク質か
ら予想されるアミノ酸配列を生じたからである。この情
報に基づき、下記の配列を有する２本の合成オリゴヌク
レオチドを設計した。

【０１２８】 5'gatccgggaatgttcccatgccttcaccactccc3' 3'gtacggaagtggtgagggttttggaggatgcccga 5' かかる構造は放射性標識ヌクレオチドを用いることによ
りライブラリースクリーニング用に非常に高い比活性に
までクレノウフラグメントで標識できる。

【０１２９】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 増幅１６時間ライブラリーから計１０⁶ のクローンを４
０個の二通りのフィルター上で上記プローブを用いて下
記条件の下でスクリーニングした。５×ＳＳＣ４００ｍ
ｌ／２０％ホルムアミド／１０×デンハード／１００ｕ
ｇ／ｍｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ／０．１％ＳＤＳ／３．８
×１０⁷ ｃｐｍ標識プローブの存在下で一夜３７℃。次
にフィルターを４０℃で２×ＳＳＣ中で洗浄し、スクリ
ーンを用いて一夜Ｘ線フィルムに曝露した。陽性の可能
性のある６検体をこの第１段階のスクリーニングで拾い
上げ、前記した第２段階のプラークハイブリダイゼーシ
ョンにより分析した。１つのクローンを選択して最終的
に分析した。ファージＤＮＡを調製すると、このクロー
ンは約０．８ｋｂおよび０．３ｋｂの大きさの２つのEc
oRIフラグメントを含有することが解った。この２つの
フラグメントを別個に、ブルースクリプトＳＫ＋プラス
ミド中にサブクローンし、配列決定した。この分析によ
り、２つのフラグメントは一列に整列させると天然に存
在する内部EcoRI部位を有する総長約１．１ｋｂの連続
する一つの配列を形成していることが示された。３５ｋ
Ｄａ ＣＬＭＦサブユニットのｃＤＮＡの完全な配列お
よび推定アミノ酸配列を図２６に示す。このｃＤＮＡは
１番目の開始Metで始まる２１９アミノ酸オープンリー
ディングフレームをコードしている。続く２１アミノ酸
は標準的疎水性シグナル配列を構成する。シグナルペプ
チドのすぐ後には、成熟３５ｋＤａタンパク質のＮ末端
が配列RNLPVAT... で始まっている。精製した３５ｋＤ
ａタンパク質は配列 ?NLPVAT... を示した。即ち、成熟
３５ｋＤａタンパク質は３つのありうるＮ結合グリコシ
ル化部位および７つのCys残基を含有する１９７アミノ
酸からなる。成熟非グリコシル化タンパク質の分子量計
算値は、２２５１３であり、ｐＩは６．０９である。相
当するｍＲＮＡは長さ１．４ｋｂであり、少なくとも６
時間ＣＬＭＦに関して誘導された細胞からのＲＮＡにお
いてのみ検出可能である。

【０１３０】ＣＯＳ細胞内での生物学的に活性な組み換
えＣＬＭＦの発現 ＣＬＭＦの２つのサブユニットを以下の通り操作して哺
乳類細胞内で発現させた。

【０１３１】４９ｋＤａサブユニット ４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットの完全長ｃＤＮＡを
構成する２個のEcoRIフラグメントをｐＢＣ１２［B. Cu
llen, Meth. Enzymology 152：684-703（1987）参照］
と同様の発現ベクターに連結したが、今回はｃＤＮＡ発
現はＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いて
行なった。相互に正しい方向で２個の挿入物を有するク
ローンを、４０ｋＤａ ｃＤＮＡ中の内部EcoRI部位を包
含する合成オリゴヌクレオチドを用いるコロニーハイブ
リダイゼーションにより選択した。このオリゴヌクレオ
チドは以下の配列、即ち、5'CTG AAG CCA TTA AAG AAT
TCTCGG CAG GTG 3'を有していた。これを標準的な方法
を用いてキナーゼ処理することにより標識した。次に正
方向プライマーとしてＳＶ４０初期プロモータの配列に
特異的なプライマーを、そして逆方向プライマーとして
４０ｋＤａ ｃＤＮＡ配列位置851-868に相当するオリゴ
ヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応方法によ
り、ベクターに対する挿入部分の適正な方向についてク
ローンを分析した。正しい方向を有するクローンは８８
５ｂｐのＰＣＲアンプリコンを生じよう。試験した２０
クローン中の８つが予測したフラグメントを生じ、そし
て１つを選択してさらに調べた。

【０１３２】３５ｋＤａサブユニット ３５ｋＤａサブユニットの完全長ｃＤＮＡを、λgt１０
におけるEcoRI部位の左および右に位置するプライマー
を用いて、ＰＣＲによりもとのλファージの外で増幅さ
せた（プライマーはNew England Biolab Articles No.
1231および1232）。得られたＰＣＲアンプリコンはブル
ースクリプトプラスミドＳＫ＋のEcoRI部位に連結され
たブラント末端であり、そしてこのＤＮＡを増幅させ
た。ＤＮＡ配列決定では、プラスミド内のｃＤＮＡ挿入
物の方向は、ｍＲＮＡの5'末端に相当するｃＤＮＡの末
端がポリリンカー中のClaI部位に近接していることが示
された。従って挿入物はClaIで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼでこの末端を充填し、そして二次的にNotIで切
断することにより遊離された。生成するフラグメントを
ゲル精製し、そしてブルースクリプトベクターに基づき
かつＳＶ４０初期プロモーターを含有する発現プラスミ
ド中にサブクローンし、挿入されたｃＤＮＡを発現させ
た。使用した発現プラスミドの部位はｃＤＮＡの5'末端
のブラントエンドPstI部位および3'末端のNotI部位であ
った。１つのクローンを選択し、４０ｋＤａ構成物に関
して上記したようなＰＣＲ法によりその構造を確認した
後さらに調査を用いた。

【０１３３】ＣＯＳ細胞における２種類のｃＤＮＡ発現 ４０ｋＤａおよび３０ｋＤａサブユニットの発現構成物
に関するＤＮＡをCullen［Meth. Enzymology 152：684
（1987）］記載のＤＥＡＥデキストラントランスフェク
ション法（７×１０⁵ 細胞／塗布皿；１μｇ ＤＮＡ／
皿）により直径６ｃｍのプレート上でＣＯＳ細胞（ＡＴ
ＣＣより入手可能）に導入した。トランスフェクション
２４時間後、ウシ胎児血清のかわりに１％ヌトリドーマ
（Nutridoma）を含有する標準組織培養用培地を細胞に
与え、上清を４０時間後に回収し、０．４５μのフィル
ターで濾過した。

【０１３４】３５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットまたは
４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットをコードするｃＤＮ
Ａまたは両方のｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣ
ＯＳ細胞の培養物の上清をＣＬＭＦ活性についてＴ細胞
増殖因子アッセイにより検査した（第１３表）。表に示
されるとおり、サブユニットｃＤＮＡの１方のみでトラ
ンスフェクションされたＣＯＳ細胞は生物学的に活性な
ＣＬＭＦを培養液中に放出しなかった。しかしながら、
両方のサブユニットｃＤＮＡトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞は生物学的に活性なＣＬＭＦを産生した。
二重にトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の培養液
により誘導されたリンパ芽球増殖の量を、精製ＮＣ−３
７−由来ＣＬＭＦで誘導された増殖量と比較することに
より、培養液中のＣＬＭＦ濃度は３７４単位／ｍｌと推
定された。８×１０⁷ 単位／ｍｇＣＬＭＦタンパクなる
比活性推定に基づけばこの結果は二重にトランスフェク
ションされたＣＯＳ細胞の培養物から得られた液体は組
み換えＣＬＭＦを約４．７ｎｇ／ｍｌ含有していること
が示唆される。

【０１３５】

【表３】 抗ＣＬＭＦハイブリドーマおよび抗体 抗ＣＬＭＦハイブリドーマの調製、特性決定および精製 ルイスラット（Charles River Laboratories, Wilmingt
on, MA）を同量のフロインド完全アジュバント（Gibc
o）と混合した部分精製ＣＬＭＦで腹腔内経路（i.p.）
により初回免疫した。第１４表の計画に従って、フロイ
ンド不完全アジュバント（Gibco）と混合したＣＬＭＦ
のブースター免疫をラットに腹腔内注射した。活性化さ
れた脾臓細胞を調製する為に、ラット１匹に、細胞融合
４日前から開始して連続２日間、部分精製ＣＬＭＦを静
脈注射した（第１４表）。脾臓細胞をこのラットから単
離し、そしてＮＯＳ細胞［Galfre等、Meth. Enzymol. 7
3：3-46（1981）］と１：１の比（脾臓細胞：ＮＳＯ細
胞）で３５％ポリエチレングリコール（PEG 4000, E. M
erck）を用いて融合させた。ハイブリドーマ細胞融合に
おける融合相手として適するその他の細胞をＮＳＯ細胞
の代わりに使用することもできる。融合した細胞を１５
％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、グルタミン（２ｍＭ）、β
−メルカプトエタノール（０．１ｍｌ）、ゲルタマイシ
ン（５０μｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）および
１５％ Ｐ３８８Ｄｌ細胞上清（ｐ３８８Ｄｌ細胞はＡ
ＴＣＣより入手可能）を補添したＩＭＤＭ［Iscove等、
J. Exp.Med. 147：923-933（1978）］中、４８ウェルプ
レートに５×１０⁴ 細胞／ウェル／ｍｌの細胞密度で塗
布した。ハイブリドーマ上清を次の４アッセイ、即ち
１） ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦによる免疫沈降、２）ＣＬＭ
Ｆ生物活性の免疫低下、３）ＣＬＭＦを用いたウェスタ
ンブロット、および４）ＰＨＡ活性化ＰＢＬ芽細胞への
¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の阻害により、特異的ＣＬＭＦ抗
体に関してスクリーニングした。抗ＣＬＭＦ抗体を分泌
するハイブリドーマ細胞系を限界希釈法によりクローニ
ングした。抗体は大規模ハイブリドーマ培養物または腹
水液から、製造者の指示書に従い架橋アガロースに結合
されたプロテインＧ上のアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した（Gammabind G, Genex, Gaithersbu
rg, MD）。

【０１３６】 第 14 表 免 疫 化 計 画： 日 程 CLMF(10 ^-8 単位／mg) 総タンパク質 比活性 純 度 単位 μｇ （μｇ） （U/mg) （％） 3/28/89 1×10^４ 0.1μｇ 15 6.7×10⁵ 6.7 4/10/89 1.2×10^４ 0.1μｇ ? 6 ×10⁵ 0.6 5/3/89 第１回採血 5/18/89 2.2×10^５ 2μｇ 75 2.9×10⁶ 2.9 6/7/89 第２回採血 6/29/89 6.3×10^４ 0.63μｇ 83 7.5×10⁵ 0.75 7/21/89 1.2×10⁵ 1.2μｇ 24 5 ×10⁶ 5.0 8/2/89 第３回採血 10/19/89 2.1×10^６(i.v.) 10/20/89 2.1×10^６(i.v.) 10/23/89 融 合

【０１３７】ＣＬＭＦ特異的なモノクローナル抗体の単
離および同定 部分精製ＣＬＭＦで免疫したラットから第３回採血で単
離された血清（第１４表）はＴＧＦアッセイで測定して
ＣＬＭＦ生物活性（５単位／ｍｌ）を中和した（図２
７）。この中和は、過剰のＣＬＭＦ（２００単位／ｍ
ｌ）を添加することにより阻止でき、このことは抗血清
による中和がＣＬＭＦに対して特異的であることを示し
ている（図２７）。正常なラットの血清はＣＬＭＦ生物
活性を中和しなかった（図２７）。このラットから単離
した脾臓細胞をＮＳＯ細胞と融合させ、そして得られた
ハイブリドーマを、 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの免疫沈降に
よりＣＬＭＦ特異的抗体について最初にスクリーニング
した。

【０１３８】放射性ヨウ素化された部分精製ＣＬＭＦ標
品は主にＣＬＭＦ７５ｋＤａヘテロダイマーを含有し、
少量の遊離ＣＬＭＦ４９ｋＤａサブユニット、および約
９２ｋＤａおよび２５ｋＤａの２種類の別のタンパク質
を含有していた（図２８）。 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦ標品
はＴＧＦアッセイにおいてＣＬＭＦ生物活性を保持して
おり、このことは標識化操作がＣＬＭＦ分子の配置を有
意に変化させなかったことを示している。ＣＬＭＦ免疫
化ラット血清は、７５ｋＤａのヘテロダイマーおよび遊
離の４０ｋＤａサブユニット（レーン６および８、図２
８）を免疫沈降させたのに対し、正常ラット血清はこれ
らの放射性標識タンパク質を免疫沈降させなかった（レ
ーン７および９、図２８）。４種類の別々のモノクロー
ナル抗体もまた、７５ｋＤａヘテロダイマーおよび遊離
の４０ｋＤａサブユニットを免疫沈降させ（図２８）た
が、９２ｋＤａおよび２５ｋＤａの標識タンパク質は免
疫沈降させなかった。免疫沈降アッセイにより抗ＣＬＭ
Ｆ抗体を産生するハイブリドーマ２０個が同定された
（第１５表）。ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびオートラジオグ
ラフィーにより判定して全抗体が放射性標識７５ｋＤａ
ヘテロダイマーおよび遊離の４０ｋＤａサブユニットを
免疫沈降させた（図２８中において４種の代表的な抗体
についてのデータを示す）。

【０１３９】

【表４】 １．ウェスタンブロット：N.R.は非還元、Ｒｅｄは還元
ＳＤＳ／ＰＡＧＥ。ウェスタンブロットに関しては、５
％７５ｋＤａヘテロダイマーおよび９５％遊離４０ｋＤ
ａサブユニットを含有するＣＬＭＦ試料を１０％ＳＤＳ
／ＰＡＧＥ上で分離し、ウェスタンブロットは方法に記
載のとおり調製した。ブロットは、強陽性（++）、陽性
（＋）、弱陽性（+／-）および陰性（−）として採点し
た。

【０１４０】２．ＣＬＭＦレセプター結合アッセイ：Ｐ
ＨＡ活性化ＰＢＬ芽への放射性標識ＣＬＭＦの結合を６
０％以上阻止した場合にその抗体を阻害作用ありとみな
した。３．ＴＧＦアッセイにより査定したＣＬＭＦ生物
活性の中和：２００μｇ／ｍｌで５０％以上増殖を阻止
した場合にその抗体を中和作用ありとみなした。結果は
陽性（＋）または陰性（−）で示した。

【０１４１】４．ＮＤ：測定せず。免疫沈降アッセイで
特異的なＣＬＭＦ抗体を先ず同定した後に、ＴＧＦおよ
びＬＡＫ細胞誘導アッセイにより評価して抗体のＣＬＭ
Ｆ生物活性免疫低下能を試験した。漸増量のＣＬＭＦ
は、細胞***中の芽細胞への ³Ｈ−チミジンの取り込み
により測定してＴＧＦアッセイにおけるＰＢＬ芽の増殖
を用量依存的に増大させる（図２９）。固定化された抗
ＣＬＭＦ抗体によるＣＬＭＦ活性の免疫低下は、用量依
存的様式で起る（図２９）。ハイブリドーマ上清溶液の
一部分（０．４ｍｌおよび０．１ｍｌ）により、培地の
ＣＬＭＦ活性５０および２００単位／ｍｌが完全に失わ
れよう。上清溶液０．０２５ｍｌにより、５０単位／ｍ
ｌは完全に失われようが、２００単位／ｍｌは約５０％
しか失われないであろう。ハイブリドーマ上清の０．０
０６２ｍｌは５０および２００単位／ｍｌのＣＬＭＦに
対する低下作用が更に小さかった。抗−IL-１レセプタ
ー抗体上清溶液の一部分（０．４ｍｌ）はＣＬＭＦ生物
活性の免疫低下を全く示さなかった。

【０１４２】漸増量のＣＬＭＦはまた、ＬＡＫ細胞誘導
マイクロアッセイにおける⁵¹Crの放出により測定してＬ
ＡＫ細胞による標的細胞の溶解を用量依存的に増大させ
た（図３０）。固定化された抗ＣＬＭＦもまた、ＬＡＫ
細胞誘導アッセイにおいてＣＬＭＦ活性を用量依存的様
式で低下させる。これらのデータにより、放射性標識さ
れた部分精製ＣＬＭＦ標品からの７５ｋＤａ標識タンパ
ク質を免疫沈降させる抗体がＣＬＭＦに特異的であるこ
とが確認される。このデータはまた、放射性標識７５ｋ
Ｄａタンパク質がＣＬＭＦ生物活性の原因タンパク質で
あることを示している。

【０１４３】モノクローナル抗体アッセイ法 ＣＬＭＦの精製および ¹²⁵ ＩによるＣＬＭＦの標識化 ＣＬＭＦを前記したようにしてヒト末梢血液リンパ球
（ＰＢＬ）またはＮＣ−３７細胞から調製した細胞上清
から部分精製した。この部分精製ＣＬＭＦをヨードゲン
法の変化により、 ¹²⁵Ｉで標識した。ヨードゲン（Pier
ce Chemical Co.）を濃度０．５ｍｇ／ｍｌでクロロホ
ルムに溶解し、そのうち０．１ｍｌを１２×７５のホウ
ケイ酸塩ガラスチューブに入れた。クロロホルムを窒素
気流下に蒸発させヨードゲンをガラスチューブ底部の中
心で乾燥させた。この被覆されたチューブを真空下に室
温（ＲＴ）でデシケーター中に保存した。放射性標識す
るには、０．５〜１．０ｍＣｉの ¹²⁵Ｉ−Ｎａ（Amersh
am）を、トリス−ヨウ素化緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣ
ｌ ｐＨ７．５，０．４Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）５０ｍｌを含有するヨードゲン被覆チューブに加え
そして室温で４分間インキュベートした。活性化された
¹²⁵Ｉ溶液をＣＬＭＦ０．０５〜０．１ｍｌ（０．１２
５Ｍ ＮａＣｌ．２０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５中、
約５μｇ）を含有する１．５ｍｌチューブに移し、この
反応混合物を室温で更に８分間インキュベートした。イ
ンキュベーション終了時に、ヨードゲン停止緩衝液（ダ
ルベッコリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１０ｍｇ／ｍ
ｌチロシン１０％グルセロース．ｐＨ７．４）０．０５
ｍｌを添加し、３０秒間反応させた。次に混合物をトリ
ス−ヨウ素化緩衝液１．０ｍｌで希釈し、BioRad BioGe
l P1ODG（BioRad Laboratories）脱塩カラムに注いでク
ロマトグラフィーを行なった。カラムをトリス−ヨウ素
化緩衝液で溶離し、標識タンパク質のピーク量を含有す
るフラクション（１ｍｌ）を合わせてトリス−ヨウ素化
緩衝液中０．２５％ゼラチンで１×１０⁸ ｃｐｍ／ｍｌ
まで希釈した。ＴＣＡ沈殿可能な放射能（１０％トリク
ロロ酢酸最終濃度）は代表的には総放射能の９５％をこ
えていた。比放射能は６０００ｃｐｍ／ｆモル〜10,000
ｃｐｍ／ｆモルの範囲であった。

【０１４４】ＣＬＭＦの免疫低下：ハイブリドーマ培養
上清または精製されたモノクローナル抗体のＣＬＭＦ免
疫低下能を以下のとおり調べた。ヤギ抗−ラットIgG−
アガロースビーズ（Sigma Chemical Co. St. Louis. M
O）を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma）を添
加したＰＢＳ（Gibco）（ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液）１０ｍ
ｌで３回洗浄した。洗浄後、ビーズを最終濃度５０％vo
l／volでＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。ビーズ懸濁液
の一部分（０．２ｍｌ）を指示量のモノクローナル抗体
またはハイブリドーマ上清溶液とともに１．５ｍｌのエ
ッペンドルフチューブに加えた。ハイブリドーマ維持培
地［０．１％ウシ胎児血清（ＰＢＳ），１０％ Nutrido
ma-SP（Boehringer-Mannheim）および２ｍＭ Ｌ−グル
タミンを添加したlscove変性ダルベッコ培地（ＩＭＤ
Ｍ）］を添加することにより各混合物の溶量を１．４ｍ
ｌとし、次のこの混合物を血液学／化学ミキサー上室温
で２時間インキュベートした。このインキュベート後、
チューブをBeckman微量遠心器１２で遠心分離し（セッ
ティング５で１．５分）、上清を捨てた。ビーズを再
度、ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄し、次に５％ヒトＡＢ血
清および指示濃度の精製ヒトＣＬＭＦを含有する組織培
養培地（ＴＣＭ）１ｍｌ中に再懸濁した。次にチューブ
をミキサー上４℃で一夜インキュベートした。これに続
きビーズを微量遠心器で遠心することにより除去し、得
られた免疫低下上清溶液の残存ＣＬＭＦ活性を、ＴＧＦ
アッセイまたはＬＡＫ細胞誘導に関するマイクロアッセ
イにおいて測定した。

【０１４５】免疫沈降アッセイ：免疫沈降反応には、
０．０５〜０．５ｍｌのハイブリドーマ上清、希釈抗血
清または精製IgGを、アガロースに結合されたヤギ抗ラ
ットIgGの５０％懸濁液（Sigma Chemical Co.）０．１
ｍｌを含有する１．５ｍｌの微量遠心管に入れた。アッ
セイ容量をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ₄ ，ｐ
Ｈ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ．１％トリトン−Ｘ１
００，１％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ，１％Ｂ
ＳＡおよび５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて０．５ｍｌと
し、この混合物を室温で２時間、回転ミキサー上でイン
キュベートした。12,000×ｇで１分間遠心分離すること
によりビーズをペレット化し、次に ¹²⁵Ｉ ＣＬＭＦを
含有するＲＩＰＡ緩衝液１ｍｌ（１×１０⁵ ｃｐｍ）中
に再懸濁した。次にこの混合物を４℃で１６時間、回転
ミキサー上でインキュベートした。このインキュベーシ
ョンに続きビーズを遠心分離してペレットとなしそして
ＢＳＡを含有しないＲＩＰＡで２回洗浄した。次にビー
ズを０．１２５ＭトリスＨＣｌｐＨ６．８＋１０％グリ
セロースで１回洗浄した。５％β−メルカプトエタノー
ル添加および無添加の２×サンプル緩衝液（Leammli,
前記）１０μｌを添加し、９５℃で３分間加熱すること
により、固相抗体に結合された ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦを遊離
させた。免疫沈降 ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦを１０％または１２
％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。

【０１４６】ＣＬＭＦレセプター結合アッセイ：ハイブ
リドーマ上清溶液、精製IgGまたは抗血清の、 ¹²⁵Ｉ−
ＣＬＭＦがＰＨＡ−活性化ヒトＴリンパ芽球に結合する
のを阻害する能力を以下のとおり測定した。培養上清、
精製IgGまたは抗血清の連続希釈物０．１ｍｌづつを、
¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ（１×１０⁵ ｃｐｍ）を含有する結合
緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０、５％ＦＢＳ，２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）０．０２５ｍｌづつと混合し
た。この混合物を室温で１時間、軌道振盪器上でインキ
ュベートし、次に活性化芽細胞（５×１０⁷ 細胞／ｍ
ｌ）０．０２５ｍｌを各チューブに添加した。混合物を
室温で更に１時間インキュベートした。非特異的結合
は、アッセイ中に１０ｎＭ未満標識ＣＬＭＦを含めるこ
とにより測定した。インキュベーションは２通りまたは
３通りで行なった。細胞結合放射能はアッセイ内容物を
油状混合物（Thomasシリコーン液６４２８−Ｒ１５（A.
H. Thomas）とシリコーン油ＡＲ ２００（Gallard-Sch
lessinger）の１：２混合物）０．１ｍｌを通して４℃
で９０秒間10,000×ｇで遠心分離することにより、遊離
^{1 25}Ｉ−ＣＬＭＦから分離した。細胞ペレットを含有す
る先端部分を切り出し、ガンマカウンターで細胞結合放
射能を測定した。

【０１４７】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティン
グ：免疫沈降させた ¹²⁵Ｉ−標識タンパク質および部分
精製ＣＬＭＦを、５％β−メルカプトエタノール添加ま
たは無添加のLaemmli試料緩衝液（２％ＳＤＳ，１２５
ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ６．８，１０％グリセロール，
０．０２５％ブロモフェノールブルー）で処理し、３分
間９５℃で加熱しそして７．５％または１２％の成形済
みゲル（BioRad Laboratories）上のＳＤＳ／ＰＡＧＥ
により分離した。免疫沈降させた ¹²⁵Ｉ−標識タンパク
質については、ゲルを２５％イソプロピルアルコール＋
１０％酢酸中の０．２％クーマシーブリリアントブルー
で染色し、１０％メタノール＋１０％酢酸で汚れを落と
し、乾燥しそしてオートラジオグラフィーにより分析し
た。ウェスタンブロットするには、ＳＤＳ／ＰＡＧＥで
分離したタンパク質を、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ
８．３，７６．８ｍＭグリシン，２０％メタノールおよ
び０．０１％ＳＤＳ中、１００Ｖで１６時間、ニトロセ
ルロース膜（０．２μ）に移動させた。ニトロセルロー
ス膜を、３％ゼラチン、トリスＨＣｌ ｐＨ７．５，
０．１５Ｍ ＮａＣｌ中３７℃で１時間ブロックし、次
にＡＢ緩衝液（１％ウシ血清アルブミン，５０ｍＭリン
酸ナトリウムｐＨ６．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．０
５％ツイーン２０）で希釈したハイブリドーマ上清溶液
または精製抗体を用いて４℃で１６時間探索した。洗浄
緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％ツイーン２０）で洗浄した
後、ニトロセルロースストリップをＡＢ緩衝液で希釈し
た、ペルオキシダーゼに結合したヤギ抗−ラットIgG抗
体（Boehringer Mannheim Biochemicals）と室温で２時
間インキュベートした。ニトロセルロース膜を洗浄緩衝
液で洗浄し、４−クロロ−１−ナフトール（０．１５％
Ｈ₂ Ｏ₂ ，０．５Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭトリスＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５中０．５ｍｇ／ｍｌ）と室温で３０分間
インキュベートすることにより、結合された抗体を可視
化した。蒸留水で十分洗浄することにより、反応を停止
させた。

【０１４８】モノクローナル抗体による結合ＣＬＭＦサ
ブユニットの同定：ＣＬＭＦは４０ｋＤａおよび３５ｋ
Ｄａのサブユニットからなる７５ｋＤａヘテロダイマー
タンパク質である。ウェスタンブロット分析を用いて、
モノクローナル抗ＣＬＭＦ抗体が４０ｋＤａまたは３５
ｋＤａのサブユニットを認識するかどうか調べた。高度
精製７５ｋＤａ ＣＬＭＦヘテロダイマーを非還元型Ｓ
ＤＳ／ＰＡＧＥにより分離しそしてニトロセルロース膜
に移行させた（図３１）。更に、約９５％の遊離４０ｋ
Ｄａサブユニットおよび５％の７５ｋＤａヘテロダイマ
ーよりなる精製ＣＬＭＦを非還元型および還元型両方の
ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、そしてタンパク質をニ
トロセルロース膜に移行させた（図３２）。非還元７５
ｋＤａＣＬＭＦヘテロダイマー（図３１）、非還元４０
ｋＤａサブユニット（図３２、上部パネル）、および還
元４０ｋＤａサブユニット（図３２、下部パネル）を含
有する個々のニトロセルロースストリップを、モノクロ
ーナル抗−ＣＬＭＦ抗体、対照モノクローナル抗体、ラ
ット抗−ＣＬＭＦ血清および対照ラット血清を用いて探
索した。モノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体およびラット
ポリクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体は非還元７５ｋＤａ
ＣＬＭＦを含有するストリップ上の約７５ｋＤａヘテロ
ダイマーに特異的に結合するが、対照抗体標品はこの結
合活性を示さない（図３１）。全てのモノクローナルお
よびラットポリクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体は非還元４
０ｋＤａサブユニット（図３２、上部パネル）を認識す
る。しかしながら、ラットポリクローナル抗血清および
３種類のモノクローナル抗体、８Ｅ３，９Ｆ５および２
２Ｅ７のみが還元４０ｋＤａサブユニットタンパク質に
結合する（図３２、下部パネル）。これらのデータは、
全てのモノクローナル抗体がＣＬＭＦの４０ｋＤａサブ
ユニットに特異的であることを示している。

【０１４９】ＰＨＡ活性化リンパ芽球上のＣＬＭＦレセ
プターの同定：前出のデータはモノクローナル抗−ＣＬ
ＭＦ抗体が ¹²⁵Ｉ標識ＣＬＭＦを免疫沈降させ、ＣＬＭ
Ｆ生物活性を免疫低下させ、そしてＣＬＭＦの４０ｋＤ
ａサブユニットに結合することを示した。しかしなが
ら、ハイブリドーマ上清溶液中に存在する抗体がＴＧＦ
またはＬＡＫ細胞誘導アッセイにおいてＣＬＭＦ生物活
性を中和する能力については、対照抗体を含有する上清
溶液の非特異的阻害作用ゆえに直接試験できなかった。
IL-２モノクローナル抗体を用いる我々の先の研究で
は、IL-２レセプター担持細胞への ¹²⁵Ｉ−IL-２の結合
を阻止する抗体はIL-２の生物活性も中和することが示
されている。レセプター結合アッセイはハイブリドーマ
上清溶液または他の物質の添加によって通常影響を受け
ないため、抗ＣＬＭＦ抗体の阻害／中和活性を評価する
ためにＣＬＭＦレセプター結合アッセイが開発された。
ＣＬＭＦレセプター結合アッセイは ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭ
ＦおよびＰＨＡ−活性化末梢血液リンパ芽球により構成
した（図３３）。ＰＨＡ−活性化リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ
−ＣＬＭＦの結合は飽和可能かつ特異的であった（図３
３）。平衡結合データをスカッチャードブロット分析
（Scatchard；Ann. N. Y. Acad. Sci. 51：660-672（19
49）参照）したところ、レセプターへの ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭ
Ｆ結合の見かけの解離定数は約２００ｐＭであり、そし
て各リンパ芽球は約７００〜８００個のレセプターを有
することが示された。ＣＬＭＦで免疫化されたラットの
血清がＣＬＭＦ生物活性の中和を示したため、これをリ
ンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合を阻害する能力につ
いて試験した（図３４）。ラット免疫血清は約１／５０
０の希釈度で ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦ結合を５０％阻止し
たが、対照ラット血清はこの希釈度では何ら阻害作用を
示さなかった。確立されたレセプター結合アッセイの特
異性を用いて、ハイブリドーマ上清溶液をリンパ芽球へ
の ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合を阻害する抗体に関して調べ
た。

【０１５０】リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦ結合の阻
害度は、各ハイブリドーマ上清溶液の１／２希釈度で測
定した（図３５）。１２個のハイブリドーマ上清溶液は
リンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を６０％以上阻
害した。これらの上清溶液中に存在する抗体は阻害／中
和抗体として分類されている。６個のハイブリドーマ上
清溶液は、 ¹²⁵Ｉ−標識ＣＬＭＦの結合を４０％未満し
か阻害せず、これらは、非阻害／非中和抗体として分類
された。対照抗体はリンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの
結合を約１０％阻害した。

【０１５１】３種類の阻害抗体、７Ｂ２，２Ａ３および
４Ａ１および２種類の非阻害抗体、６Ａ３および８Ｅ３
をGammaBind G（Genex, Gaithersburg, MD）カラム上の
プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより
腹水液から精製した。抗体４Ａ１，２Ａ３および７Ｂ２
はそれぞれＩＣ₅₀濃度０．７μｇ／ｍｌおよび９．５μ
ｇ／ｍｌでリンパ芽球への ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を用
量依存的様式で阻害する（図３６）。抗体６Ａ３および
８Ｅ３は１００μｇ／ｍｌの濃度で ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの
結合を阻止しない（図３６）。これらのデータは、各抗
体が阻害または非阻害性としてはじめに分類されている
ことが正しかったことを示している。

【０１５２】抗体によるＣＬＭＦ生物活性の直接中和：
ＣＬＭＦレセプター結合アッセイにより「阻害性」と分
類された抗体がＣＬＭＦ生物活性を直接中和するかどう
かを調べるため、各阻害抗体の中和活性をＴＧＦアッセ
イにより調べた（第１６表）。２種類の阻害性抗体、４
Ａ１および７Ｂ２は、０．０３〜１００μｇ／ｍｌでＣ
ＬＭＦ生物活性（４０単位／ｍｌ）の用量依存性中和を
示し、ＩＣ₅₀濃度はそれぞれ約１μｇ／ｍｌおよび８０
μｇ／ｍｌであった。これらのデータにより、ＣＬＭＦ
レセプターへの ¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの結合を阻害する抗体
はＣＬＭＦ生物活性にも阻害することが確認された。

【０１５３】

【表５】 ＣＬＭＦの35,000ダルトンサブユニットの合成ペプチド
フラグメントに対する抗体の調製 ３５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットのＮＨ₂ −末端配列
のアミノ酸３−１３およびＣＯＯＨ−末端システインを
含有するペプチド（L-P-V-A-T-P-D-P-G-M-F-C）を固相
ペプチド法により合成し、ＨＰＬＣにより精製し、そし
てメチル化ウシ血清アルブミン法によりキーホールリン
ペットヘモシアニンに接合させた。ウサギ２匹をフロイ
ンド完全アジュバント中のこの接合タンパク（３００μ
ｇペプチド／ウサギ）で皮内免疫した。免疫化６週間
後、ウサギに遊離のペプチド（１００μｇ、静脈内）お
よびＫＬＨ接合ペプチド（１５０μｇ，皮下）をＰＢＳ
に溶解したものをブースターとして与えた。７日後、採
血して血清試料を調製した。ブースター投与および採血
の作業は４〜５週おきに反復した。各ウサギからの第１
回および第２回目の採血で得た血清試料を合成ペプチド
との反応に関して、直接ＥＬＩＳＡアッセイにより評価
した。合成の遊離ペプチドを４ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎ
ｇ／ｍｌでマイクロタイタープレート上に被覆し、プレ
ートを洗浄し、そしてウシ血清アルブミンでブロックし
た。種々の希釈度（第１７表）で血清試料を検査し、抗
体の反応性を基質としてｏ−フェニレンジアミンを用
い、第２抗体（ＨＲＰ−接合ヤギ抗ウサギIgG）を用い
て検出した。反応を停止させるために硫酸を添加した後
に、吸光度値を４９０ｎｍで読み取った。その結果によ
れば、35,000ダルトンＣＬＭＦペプチドに対する抗体は
両方のウサギで産出されていた（第１７表）。別の実験
において、我々は、（ａ）非免疫化ウサギから得た血清
はＥＬＩＳＡにおいてペプチドと反応せず、（ｂ）合成
ペプチドで免疫したウサギから得た血清は40,000ダルト
ンＣＬＭＦサブユニットからのペプチドフラグメントと
は反応せず、そして（ｃ）血清試料から精製したIgGは
合成ペプチドとも反応することから、この抗体はこのペ
プチドに対して特異的であることを証明した。

【０１５４】ウサギの１匹から得た血清試料（第１回採
血）を７５ｋＤａ ＣＬＭＦ及び３５ｋＤａ ＣＬＭＦサ
ブユニットとの反応性に関してウェスタンブロット分析
により検査した（図３７）。部分精製ＣＬＭＦ（約１２
０μｇ／ｍｌ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセ
ルロースに移行させ、そしてウサギ抗ＣＬＭＦペプチド
抗血清の１：５００希釈物で処理した。抗体反応性は、
ビオチニル化ヤギ抗−ウサギIgGおよびアルカリホスフ
ァターゼ接合ストレプトアビジンを用いることにより検
出した。抗ＣＬＭＦペプチド抗体は、非還元７５ｋＤａ
ＣＬＭＦタンパク質および還元３５ｋＤａ ＣＬＭＦサ
ブユニットの両方と反応することが判明した（図３
７）。

【０１５５】この実施例で生成された抗体はポリクロー
ナルであるが、同様の方法を用いてＣＬＭＦの３５ｋＤ
ａサブユニットに対するモノクローナル抗体を調製する
こともできた。この実施例で使用した合成ペプチドまた
は３５ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニットのアミノ酸配列に
基づく他の合成ペプチド（図２６）をラットの免疫化に
使用できた。上記したようにして融合を行ない、ハイブ
リドーマ培養物をモノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体の産
生に関してスクリーニングした。

【０１５６】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】上清溶液をNu-Gel P-SPカラムにかけ、ＴＧＦ
活性を含有するタンパク質フラクションが塩グラジエン
トで溶離されることを示すプロット図。

【図２】図１に示される分離により得られたＴＧＦ活性
含有物質がブルーＢ−アガロース（Blue-B-Agarose）カ
ラムを通って塩グラジエント勾配で溶離されるプロット
図。

【図３】図２に示される分離から得られたＴＧＦ活性含
有物質がモノ（Mono）Ｑカラムを通ってＮａＣｌグラジ
エントで溶離されるプロット図。

【図４】図３は図示した工程から得られたフラクション
３０から４５までと、４８および５０のＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を
示す。

【図５】図３で示されるMono Ｑクロマトグラフィー分
離（逆相ＨＰＬＣ）から得られたフラクション３８をVy
dacジフェニル（Diphenyl）カラムに通した溶離プロフ
ィールを示す図。

【図６】図５に示される分離工程から回収されたタンパ
ク質フラクション８５−９０のタンパク質純度のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析を示す図。

【図７】逆相ＨＰＬＣ分離から得られたフラクション８
７および８８を非還元および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析した結果を示す図。

【図８】ＮＣ−３７細胞からの上清溶液から得られたタ
ンパク質をNu-Gel P-SPカラムにかけ、塩グラジエント
で溶離した溶離パターンを示す図。

【図９】図８に示されるNu-Gel P-SPカラム溶離により
得られた活性フラクションのブルー−Ｂ−アガロースカ
ラム塩グラジエント溶離プロフィール図。

【図１０】図９に示される溶離により得られた活性フラ
クションのモノＱカラム塩グラジエント溶離プロフィー
ル図。

【図１１】図１０に示されるモノＱクロマトグラフィー
から得られた活性フラクション３９および４０の、Vyda
cジフェニルカラムを通した溶離パターン図。

【図１２】図１１に示される分離工程から得られた活性
フラクションの還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を
示す図。

【図１３】ＣＬＭＦサイトカインの３５ｋＤａサブユニ
ットからの４０ｋＤａサブユニットの分離を表す模式
図。

【図１４】ＣＬＭＦサイトカインの４０ｋＤａサブユニ
ットのアミノ酸組成の決定、Ｎ−末端配列決定、タンパ
ク分解的消化および完全な配列決定を示す模式図。

【図１５】ＣＬＭＦサイトカインの消化された４０ｋＤ
ａサブユニットのトリプシン処理ペプチドの分離を示す
図。

【図１６】スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）Ｖ８プロテアーゼ消化を受けた４０ｋ
ＤａサブユニットＣＬＭＦのタンパク分解ペプチドの分
離を示す図。

【図１７】ＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニットタンパク
分解ペプチドの分析から得られたタンパク質構造に関す
る情報を要約したチャート。

【図１８】図３に示されるMono Ｑ ＦＰＬＣ溶離プロフ
ィールから得られたフラクション３９のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析を示す図。

【図１９】逆相ＨＰＬＣによる３５ｋＤａサブユニット
の精製に関するもので、５％β−メルカプトエタノール
中で還元されたMono Ｑクロマトグラフィーのフラクシ
ョン３９をVydac C-18カラムに通して溶離したパターン
を示す図。

【図２０】図１９に示されるVydac C-18カラム溶離プロ
フィールから得られたフルオレサミン陽性フラクション
の、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す
図。

【図２１】Mono Ｑクロマトグラフィーのフラクション
３６および３７のトリプシン消化物をＹＭＣ ＯＤＳカ
ラムに通した溶離パターンを示す図。

【図２２】染色したＰＶＤＦ膜を示す図。

【図２３】ＣＬＭＦをＣＮＢｒで分解することにより得
られたペプチドフラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離を示す
図。

【図２４】アガロース樹脂に共有結合されたモノクロー
ナル抗体７Ｂ２を用いるアフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製された、純粋なＣＬＭＦおよび「遊
離」の会合していない４０ｋＤａ ＣＬＭＦサブユニッ
トのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。

【図２５】ヒトＣＬＭＦの４０ｋＤａサブユニットのＤ
ＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す図。

【図２６】ＣＬＭＦの３５ｋＤａサブユニットのｃＤＮ
Ａ配列および推定アミノ酸配列を示す図。

【図２７】ＣＬＭＦで免疫したラット由来の、および非
免疫ラット（対照）由来の血清によるＣＬＭＦ生物活性
の阻害を示す図。

【図２８】¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、モノクローナル抗体に
よる免疫沈降反応、対照抗体による免疫沈降反応、免疫
ラット血清による免疫沈降反応および正常ラット血清に
よる免疫沈降反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図。

【図２９】ＣＬＭＦ生物活性（ＴＧＦ活性）の、モノク
ローナル抗−ＣＬＭＦ抗体（ａ−ＣＬＭＦ）による免疫
低下を示す図。

【図３０】ＣＬＭＦ生物活性（ＬＡＫ誘導活性）の、モ
ノクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体（ａ−ＣＬＭＦ）による
免疫低下を示す図。

【図３１】モノクローナル抗体（ｍＡｂ）７Ｂ２，４Ａ
１，８Ｅ３，６Ａ３，９Ｆ５および２Ａ３とＣＬＭＦ７
５ｋＤａヘテロダイマーとの反応性およびラットポリク
ローナル抗−ＣＬＭＦ抗体（ＲＳ１）と同ヘテロダイマ
ーとの反応性に関するウェスタンブロット分析を示す
図。

【図３２】モノクローナルおよびラットポリクローナル
抗−ＣＬＭＦ抗体のＣＬＭＦ４０ｋＤａサブユニットと
の反応性に関するウェスタンブロット分析を示す図。

【図３３】¹²⁵Ｉ−ＣＬＭＦの、ＰＨＡ−活性化末梢血
液リンパ球（ＰＢＬ）リンパ芽球との結合を示す図。

【図３４】ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する¹²⁵Ｉ
−ＣＬＭＦの結合の、ラット抗−ＣＬＭＦ血清による阻
害を示す図。

【図３５】ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する¹²⁵Ｉ
−ＣＬＭＦの結合の、モノクローナル抗体上清による阻
害を示す図。

【図３６】ＰＨＡ−活性化ＰＢＬ芽細胞に対する¹²⁵Ｉ
−ＣＬＭＦの結合の、様々な濃度の精製モノクローナル
抗体による阻害を示す図。

【図３７】ウサギポリクローナル抗−ＣＬＭＦ抗体と７
５ｋＤａ ＣＬＭＦ（非還元）との反応性および３５ｋ
Ｄａ ＣＬＭＦサブユニット（還元）との反応性に関す
るウェスタンブロット分析を示す図。尚、図６、図７、
図１２、図１８、図２０、図２２、図２４、図２８、図
３１、図３２および図３７は電気泳動を表す写真であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲイトリー，モーリス，ケント アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07058 モントヴィル，コナー アヴェ ニュー 162 (72)発明者 ガブラー，ウルリッチ，アンドリアス アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07028 グレン リッジ，インズ プレ イス ４ (72)発明者 ハルムス，ジェフリー，ディヴィッド アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07456 リングウッド，ウェルチ ロー ド 23 (72)発明者 パン，ユーチング ユーゲン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07058 パイン ブルック，クレーン ドライヴ 10 (72)発明者 ポドラスキー，フランク，ジョン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 10956 ニュー シティー，ロムバーデ ィ ドライヴ 28 (72)発明者 スターン，アルヴィン，セッチ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07055 パセック パーク，ブルック アヴェニュー 295 (56)参考文献 Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ（1898）Ｖｏｌ. 170，Ｎｏ．３，ｐ．827−845 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C07K 16/24 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/08 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 および のアミノ酸配列からなり、少なくとも５.２×１０^７単
   位/ｍｇの比活性を有し、Ｔ細胞増殖因子アッセイで活
   性な細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）タンパク
   質に対する実質的に純粋なポリクローナル抗体またはモ
   ノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＣＬＭＦに対する抗体
   を製造するに当たり、（ａ）請求項１記載のタンパク質
   を該タンパク質に対する免疫応答を生じ得るヒト以外の
   温血動物に注射し、そして（ｂ）該動物から抗体を回収
   する、ことからなる方法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の方法により製造された請
   求項１記載のＣＬＭＦに対する抗体。