JP3374101B2

JP3374101B2 - Ｅｎｖ／ｇａｇポリペプチドマーカーを使用するネコ免疫不全ウイルス感染の診断

Info

Publication number: JP3374101B2
Application number: JP13582899A
Authority: JP
Inventors: ランドール・ジー・グロート; トーマス・ピー・オコンナー; ブライオン・マーマー
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-17
Publication date: 2003-02-04
Anticipated expiration: 2019-05-17
Also published as: ATE246359T1; EP0962774B1; JP2000002707A; AU754309B2; US6458528B1; AU2806799A; CA2271449A1; EP0962774A1; ES2200472T3; DE69909897D1; DE69909897T2; CA2271449C

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はネコ免疫不全ウイル
ス（ＦＩＶ）感染を診断する一般的な分野に関する。

【０００２】

【従来の技術】種々のレンチウイルスによる感染は免疫
不全症に関連がある。ＦＩＶに感染したネコ（Ｐｅｄｅ
ｒｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：７９０−７９
３，１９８７；米国特許第５，０３７，７５３号）は、
例えば、後天性免疫不全症状（ＡＩＤＳ）の多くの病原
性の回想症候群を示す（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ａｍ．
Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２４６−１２５８，１９
８８；Ａｃｋｌｅｙ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５６５
２−５６５５，１９９０；Ｓｉｅｂｅｌｉｎｋ等、ＡＩ
ＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
６：１３７３−１３７８，１９９０）。ＦＩＶ−関連ネ
コＡＩＤＳは、病的ネコ群のうち１５％程度の高率の発
症率を持つ重大なネコの病気である（Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ
等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：４７４
−４７９，１９８９）。細菌内プロウイルスの残存に関
連してしばしば見られる一過性、低レベルウイルス血症
は、感染に対して応答する抗体の検出を、ＦＩＶによる
感染の信頼性のある分析にする。

【０００３】ＦＩＶ抗体を検出するための酵素免疫吸着
法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）は、精製した不活性
化ＦＩＶビリオンおよび／または試料中のＦＩＶ抗体
に結合する固相試薬としての抗原を使用する。ｇａｇ−
コード化ｐ２４カプシド（ｐ２４）およびｐ１５ヌクレ
オチド蛋白質上ならびにｅｎｖ−コード化ｇｐ４０膜内
外（ｇｐ４０）およびｇｐ１００表面蛋白質上のエピト
ープを認識する抗体は放射性免疫沈降分析（ｒａｄｉｏ
ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｎａｌｙ
ｓｉｓ：ＲＩＰＡ）または免疫ブロット法により検出さ
れた（Ｈｏｓｉｅ等、ＡＩＤＳ４：２１５−２２０，
１９９０；Ｓｔｅｉｎｍａｎ等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．７１：７０１−７０６，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｅ
ｎ等、米国特許第５，６５６，７３２号明細書；Ｋｅｍ
ｐ等、米国特許第５，５９１，５７２号明細書；Ｍｅｒ
ｍｅｒ等、Ｓｉｍｉｌａｒｌｉｔｉｅｓｂｅｔｗｅｅ
ｎｔｈｅＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅ
ｉｎｓｏｆＦＩＶａｎｄＨＩＶ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，ＲＮ
ＡＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ，１９９１；Ｔｉｌｔｏ
ｎ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：８９
８−９０４，１９９０）。種々の抗−ＦＩＶ抗体も形成
された（Ｏ‘Ｃｏｎｎｏｒ等、米国特許第５，２１９，
７２５および同第５，１７７，０１４号各明細書）。

【０００４】アイデックス・ラボラトリーズ・インコー
ポレーテッドは商標ＳＮＡＰ（登録商標）ＣＯＭＢＯの
もとにＦＩＶ診断器具を市場化しており、この器具はネ
コ試料中のＦＩＶ抗体を検出する。この器具は固相捕獲
試薬として組換体ｐ２４を含む。固相試薬により捕獲さ
れるＦＩＶ抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ
に結合した破壊ＦＩＶにより検出される。米国特許第
５，７２６，０１０号および同第５，７２６，０１３号
各明細書を参照されたい。

【０００５】

【発明の概要】ＦＩＶｅｎｖポリペプチドおよびＦＩ
Ｖｇａｇポリペプチドの双方の存在について増大され
たポリペプチドマーカー組成物を使用することにより、
ＦＩＶ感染を表示するＦＩＶ抗体の検出が改良されるこ
とが見出された。「増大された」という用語は、ＦＩＶ
ｅｎｖおよびＦＩＶｇａｇポリペプチドがマーカー
組成物中に、破壊ウイルスから得られるＦＩＶ蛋白質の
単純混合物中よりもより高い重量百分率レベルで存在す
ることを意味する。増大は、例えば、ＦＩＶｅｎｖお
よびＦＩＶｇａｇポリペプチドの精製または部分精製
製剤をウイルス混合物に添加することにより、またはウ
イルス混合物を含まないマーカー組成物としてそのよう
な製剤を使用することにより達成できる。

【０００６】したがって、本発明は、ネコ試料（例え
ば、血清または血液試料）と、増大したＦＩＶｅｎｇ
およびｇａｇポリペプチドの双方を含む抗体結合性捕獲
組成物とを接触させることによるＦＩＶ感染の決定診断
法を特徴とする。増大化（例えば、精製）ポリペプチド
は組換もしくは合成ポリペプチド、またはＦＩＶウイル
スから単離されたポリペプチドであることができる。試
料中の抗体と捕獲組成物との反応は、試料の提供物がＦ
ＩＶに感染されていることを示す。

【０００７】ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、
ポリペプチドの自然構造状態のポリペプチドに特異的な
一種以上の抗体に結合できるポリペプチドフラグメント
である。ＦＩＶｇａｇ前駆体ｐ５５の免疫原性フラグ
メントには、ｐ５５自身、ｐ５５開裂生成物、例えば、
ｐ２４、ｐ１５およびｐ１０、ならびにモノクローナル
抗体（ｍＡｂ）２Ｄ４（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｈ
Ｂ９８９０）、３Ｈ８（ＡＴＣＣＨＢ１２５３１）、
４Ｆ２（ＡＴＣＣＨＢ９８８８）、２Ｈ４（ＡＴＣＣ
ＨＢ１２５３０）、または６Ｅ６（ＡＴＣＣＨＢ９
８９９）により認識されるいずれかのｐ５５フラグメン
トがあるが、これらに限定されない。ＦＩＶｅｎｖ前
駆体ｇｐ１３０の免疫原性フラグメントには、ｇｐ１３
０自身、ｇｐ１３０開裂生成物、例えば、ｇｐ４０およ
びｇｐ１１０があるが、これらに限定されない。さら
に、それらには、ｇｐ４０のシステインループを含有す
るいずれのｇｐ１３０フラグメントおよびｍＡｂ２Ｆ
１１（ＡＴＣＣＨＢ１０２９５）、１Ｃ９（ＡＴＣＣ
ＨＢ１２５２９）、または３Ｈ９（ＡＴＣＣＨＢ１
２５２８）に結合するいずれかのｇｐ１３０フラグメン
トも含まれる。ｇｐ１３０の免疫原性フラグメントの例
はＥＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：
１）である。第２捕獲ポリペプチドの例はＣＥＬＧＣＮ
ＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）である。

【０００８】上述の方法の一実施態様では、結合性組成
物は試料と不混和性の相（例えば、固相）に付着されて
いる。抗体−結合性検出組成物はネコ試料中の抗体と捕
獲組成物との反応を検出するために施用されることがで
きる。この検出組成物は、各々免疫原性フラグメントの
ｐ５５およびｇｐ１３０を含有する２種類の検出ポリペ
プチドを含んでもよい。例えば、検出組成物は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１または２の配列をもつペプチドを加え
た破壊ＦＩＶ（例えば、洗剤で天然ＦＩＶビリオンを破
壊することにより得られるウイルス性蛋白質の混合物）
を含有することができる。検出組成物中のポリペプチド
は、好ましくは、検出可能な成分、例えば、検出可能な
反応を触媒する酵素、コロイド状金、放射性核種および
蛍光体等で標識される。

【０００９】本発明により、ネコがＦＩＶに感染されて
いるか否かを決定する分析を行うための器具も包含され
る。この器具は上述の抗体−結合性捕獲組成物および抗
体−結合性検出組成物を含む。一実施態様では、検出組
成物は容器中に保持される。

【００１０】特に定義しない限り、本明細書中で使用す
る総ての技術専門用語および科学用語は本発明の属する
技術分野の通常の熟達者により一般的に理解されるのと
同じ意味を持つ。具体的な方法および物質を以下に述べ
るが、本明細書中で記載したのと類似または均等な方法
および物質も本発明の実際または試験にも使用できる。
本明細書中で述べる総ての刊行物およびその他の参照の
総てが全体として本明細書中に参照として含まれる。矛
盾する場合、定義を含めて本明細書のものを採用する。
物質、方法および実施例は単なる例証であり、制限され
ることを意図していない。

【００１１】本発明のその他の特徴および利点は以下に
述べる詳細な記述および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。

【００１２】

【発明の詳細な記述】本発明は試料中のＦＩＶ抗体を検
出するための免疫分析を特徴とする。図１は、一つのこ
のような分析の基本的な構成成分を示す。抗体は、捕獲
試薬（すなわち、抗体−結合性組成物）１０ａおよび１
０ｂにより捕獲され、これらの試薬は固体基体１２上に
多くの公知の方法のいずれかにより固定化されている。
具体的には、捕獲試薬は、（ａ）以下に詳細に記載する
とおりの組換ｐ２４、および（ｂ）同様に以下に述べる
合成ｅｎｖ（例えば、ｇｐ４０）免疫優性ペプチド（ｉ
ｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔｐｅｐｔｉｄｅ：ＩＤ
Ｐ）を含むことができるＦＩＶポリペプチドの混合物で
ある。試料中で捕獲試薬は抗体１１ａおよび１１ｂに結
合し、未結合物質はその他の公知の手段により洗い流さ
れるか除去される。捕獲されたＦＩＶ抗体の存在は、こ
の捕獲された抗体に特異的に結合する標識された検出試
薬１４の使用により検出される。この試薬は、目的抗体
に特異的に結合する天然、組換、および／または合成ポ
リペプチドの混合物である。これらのポリペプチド（例
えば、１８ａおよび１８ｂ）は、検出反応を触媒する酵
素１６に各々結合されている。抗体は二価であるので、
捕獲されたＦＩＶ抗体は捕獲試薬に使用されたと同じエ
ピトープを使用して検出されることができる。一つの具
体的な検出試薬には、上述したと同じであることができ
る合成ｇｐ４０ＩＤＰを加えた破壊天然ＦＩＶがあ
る。

【００１３】多くの公知の免疫分析フォーマットのいず
れかを上述の試薬を使用して試料中の抗−ＦＩＶ抗体の
存在を検出するのに使用できる。このようなフォーマッ
トの一つは、アイデックス・ラボラトリーズ・インコー
ポレーテッドのＳＮＡＰ（登録商標）器具で使用されて
いる逆流フォーマットであり、米国特許第５，７２６，
０１０号および同第５，７２６，０１３号各明細書に概
ね開示されている（これらを参照として本明細書に含め
る）。

【００１４】図２〜４はＦＩＶ分析を行うための単回使
用器具の例示を示す。図２では、この器具はベース２３
およびカバー２４の間に保持される吸水性フローマトリ
ックス２２を含む。アクチベーター２５ａおよび本体２
５ｂはフローマトリックス２２を取り囲む。２個の試薬
ウエル（酵素基質ウエル２７および洗浄ウエル２８）は
ベース中に配置され、ウエルシール２９により覆われて
いる。活性剤２５ａは、中心に吸収材３２を有する２個
の下方に面するランス（ｌａｎｃｅ）３０を含む。吸収
剤パッド３４はベース中の窪み３５中に配置されてい
る。

【００１５】図３では、使用前で、カバー２４とアクチ
ベーター２５ａをヒンジ３６から上向きに曲げられてい
る。ウエル２７および２８は満たされ、カバーがされて
いる。試料を試料カップ３８に導入し、試料はマトリッ
クス２２に沿って右から左に（図３では）流れる。試料
中のＦＩＶ抗体に結合し、ＦＩＶ抗体が検出できるよう
に設定された検出試薬を試料と混合してからフローマト
リックスに施用してもよく、あるいはこのマトリックス
（例えば、４２において）に検出試薬を予め施用して、
試料がマトリックスに沿って移動するときにＦＩＶ抗体
により捕捉されてもよい。被分析物捕獲帯４０は本出願
の別の箇所に記載した捕獲試薬を含む。捕獲試薬は、例
えば、米国特許第５，７２６，０１０号および同第５，
７２６，０１３号各明細書に記載されているような標準
的な技術にしたがって捕獲帯４０に固定化される。捕獲
試薬と反応するＦＩＶ抗体は捕獲試薬に結合し、それに
より、帯４０に保持される。帯４０より試料が移動でき
る時間を設定後、アクチベーター２５ａをヒンジ３６の
周りで旋回させることにより閉じる。ランス３０はウエ
ルシール２９を突き刺し、ウエル２７中の酵素基質の溶
液およびウエル２８中の洗浄溶液が吸収材３２を介して
マトリックス２２上に上昇できるようにする。同時に、
吸収剤パッド３４を、試料カップ３８の上流（図の右の
方）のマトリックス２２と接触させ、マトリックス中に
逆の流れ（左から右へ）を起こす。この流れは帯４０か
ら未結合物質を洗浄し、酵素基質を捕獲試薬の結合酵素
と接触させ、帯４０において試料中のＦＩＶ抗体の存在
を表示する検出可能（例えば、発色）反応をもたらす。

【００１６】その他のＥＬＩＳＡフォーマット（例え
ば、ミクロ平板ＥＬＩＳＡ）も使用できる。ＥＬＩＳＡ
実験から得られた結果をウエスタンブロット分析により
確認できる。

【００１７】捕獲試薬を試験試料に対して不混和性の相
に付着させる。例えば、固相上に捕獲試薬を固定化す
る。固相はどのような形態（例えば、微粒子状、ミクロ
平板ウエル状、またはストリップ状）でも良く、そし
て、例えば、単一表面（例えば、平面や曲面）または多
孔性構造であることができる。固体支持体として有用な
材料には、ガラス、ゲル類、紙、セルロース、ナイロ
ン、ポリスチレン、およびラテックス等があるが、これ
らに限定されない。捕獲試薬は、捕獲試薬と目的の抗体
との間で接触できるように試験試料とエマルションを形
成できる水不混和性溶媒に共有結合されていても良い。

【００１８】捕獲試薬として作用するポリペプチドは、
固体表面上に直接吸着するか当該表面上の反応性基に化
学結合することを含んで、多くの標準的な方法のいずれ
かにより固体表面に付着させることができる。例えば、
固体表面は活性アミン基を形成するように誘導化でき、
次いで、アミン−およびスルフヒドリル−反応性ヘテロ
二官能性架橋剤[例えば、スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ
レート（ＳＭＣＣ）またはＰｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ、ＩＬから入手できるその他のＤＯＵＢＬＥ−ＡＧ
ＥＮＴ（商標）架橋剤またはその他の販売者からの同等
の試薬]を使用してポリペプチド中の遊離システイン基
を固体表面上のアミン基に結合させる。あるいは、Ｐｉ
ｅｒｃｅまたはその他の販売者から入手できるホモ二官
能性架橋剤も使用できる。

【００１９】捕獲ポリペプチドはｐ５５またはｇｐ１３
０の免疫原性フラグメントを含有できる。このような免
疫原性フラグメントを同定するために、ｐ５５またはｇ
ｐ１３０（またはそれらの天然開裂産物、例えば、ｐ２
４またはｇｐ４０）をペプチターゼまたはＣＮＢＲで消
化させ、開裂した免疫原性ペプチドを抗−ｐ５５または
抗−ｇｐ１３０抗体を含有するアフィニィティーカラム
に結合するそれらの能力により精製できる。抗−ｐ５５
および抗−ｇｐ１３０抗体は周知の方法により形成でき
る。例えば、米国特許第５，１７７，０１４号および同
第５，２１９，７２５号各明細書；Ｌｏｍｂａｒｄｉ
等、ＡＩＤＳＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓ
ｅｓ９：１４１−１４６、１９９３および；Ｌｏｍｂ
ａｒｄｉ等、Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ７６（Ｐｔ
８）、１８９３−１８９９、１９９５を参照されたい。

【００２０】ｇｐ１３０の有用な免疫原性フラグメント
は、米国特許第５，５９１，５７２号明細書第３欄に示
されている４種のｇｐ４０ペプチドのいずれかを含む。
中心残基ＣＮＱＮＱＦＦＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）
を含むこれらの４種のｇｐ４０ヘプチド配列のいずれか
のセグメントであることもできる。このようなペプチド
は、天然ｇｐ４０中の対応する領域の免疫原構造を維持
する内部ジスルフィドループを含有する。ｇｐ４０捕獲
試薬の例は、アミノ酸残基ＣＥＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ
（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）から構成されるペプチド
（すなわち、ＩＲＧ２）である。このペプチドは、化学
合成中に残基５および１２により形成される内部ジスル
フィド結合をもつ。アミノ末端におけるシスティン残基
は対応する天然ＩＤＰの部分でないが、しかし結合でき
るように導入される。例えば、ペプチドは、このシステ
ィンを介して、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
に結合されることができ、順に固体表面に共有結合また
は吸着されることができる。ＩＲＧ２のカルボキシ末端
は場合によりアミド化され、ＩＲＧ２の天然状態のカル
ボキシ末端に擬態する。

【００２１】捕獲ポリペプチドは、ポリペプチドの精製
および同定を容易にするためにＦＬＡＧ（商標）のよう
な人工的なエピトープ標識をさらに含むことができる。
勿論、このエピトープ標識はネコにより通常は遭遇され
ないことが好ましく、その結果、免疫分析において交差
反応をもたらさない。β−ガラクトシダーゼのような蛋
白質標識も同様に使用できる（例えば、Ｍｅｒｍｅｒ
等、ＶｅｒｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ３５：１３３
−１４１，１９９２参照）。

【００２２】固体支持体上で捕獲試薬に結合されている
抗体は抗体結合性検出組成物により検出することができ
る。この検出組成物は、ｐ５５またはｇｐ１３０の免疫
原性配列を含有する検出ポリペプチドを含むことができ
る。例えば、ｇｐ１３０の免疫原性フラグメントを添加
した破壊ＦＩＶを検出組成物として使用できる。これら
の抗原は、放射性核種（例えば、¹²⁵Ｉおよび³⁵Ｓ）、
蛍光体（例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン、
テキサスレッド、もしくはアロフィコシアニン）、また
は測色反応または化学発光反応を触媒する酵素（例え
ば、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカ
リホスフチターゼ）のような検出可能な成分に結合され
る。一実施態様では、試験試料を、固相に施用している
間または施用する前に標識した抗原と接触させる。ある
いは、標識抗原を目標抗体が結合された後に固体表面に
施用される。いずれにしても、目標抗体、標識した抗原
および固定された抗原により、複合体が固体表面上に形
成され得る。未結合標識抗原を洗い流した後、固体表面
から形成される信号を結合抗体の存在の表示として決定
される。

【００２３】捕獲試薬または検出試薬として使用される
ポリペプチドは、天然ＦＩＶ由来、または、例えば、組
換技術もしくは化学合成により得られるものであること
ができる。前記のようなポリペプチドを表現するための
核酸構成は、同定されたＦＩＶ核酸配列、例えば、Ｔａ
ｌｂｏｔｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８６：５７４３−５７４７，１９８９に開
示されているＦＩＶゲノム配列のような同定されたＦＩ
Ｖ核酸配列を基準にしてポリメラーゼ鎖反応のような標
準的な技術により調製できる。

【００２４】

【実施例】下記の実施例は、本発明の方法と物質を例証
することを意味する。記載した条件やパラメーターの適
当な修正および適用は本発明の精神および範囲内にあ
る。実施例：ＦＩＶ抗体のスクリーニング材料および方法破壊ＦＩＶ抗原クランダルネコ腎臓（Ｃｒａｎｄａｌｌｆｅｌｉｎｅ
ｋｉｄｎｅｙ：ＣＲＦＫ）細胞系を使用してＦＩＶの
ペタルマ（Ｐｅｔａｌｕｍａ）株を増殖させた（Ｏ‘Ｃ
ｏｎｎｏｒ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２
７：４７４−４７９，１９８９）。精製したＦＩＶを洗
剤（例えば、ＳＤＳまたはＮＰ−４０）および熱を使用
して破壊した。残留した洗剤をＢＩＯ−ＢＥＡＤＳを使
用して除去した後、結合した（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ
ｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）。組換ｐ２４ｐ２４の遺伝子をＦＩＶペタルマ感染ＣＲＦＫ細胞の溶
解産物からポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増強し
た。プライマーは公開配列を基準にした（Ｔａｌｂｏｔ
ｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５７４３−５７４７，１９８９）。ＰＣＲ産物
をｐＵＣ１９にクローン化し、検証ＤＮＡ配列による挿
入物を適当なｐＥＸベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）
に転移させ、β−ガラクトシダーゼ−ｐ２４融合蛋白質
（すなわち、ＥＸＰ２４）をＥ．ｃｏｌｉＮ４８３
０−１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中
で合成した。４２℃２時間のインキュベートによりこの
蛋白質の発現を誘導した。

【００２５】β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を、前述
した超音波処理および遠心分離による不溶性封入体とし
ての細菌溶解産物から精製した（Ｈｏｐｐｅ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：２９５６−２９６０，１９
８９；Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６４：４３６７−４３７３，１９８９）。純度
を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのクマシンブルー染
色後、ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）電気泳動後の検査または
デンシトメトリーにより評価した。ＥＬＩＳＡＰＥＴＣＨＥＫおよびＳＮＡＰ分析（アイデックス・ラ
ボラトリーズ社；上掲のＭｅｒｍｅｒ等の論文も参照）
における固相全ウイルス抗原の代わりに組み換え抗原を
使用してＥＬＩＳＡ分析を行った。捕獲組成物ＥＬＩＳＡ分析における捕獲組成物はＩＲＧ２およびＥ
ＸＰ２４を含有した。ここで、ＩＲＧ２はＳＭＣＣを介
してＢＳＡに結合された。ＢＳＡ−ＩＲＧ２およびＥＸ
Ｐ２４は、受動吸着によりポリスチレン固体表面上に各
々２μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌ固定された。検出組成物ＩＲＧ２はＳＭＣＣを介してホースラディッシュペルオ
キシダーゼに結合された。破壊天然ＦＩＶは過ヨウ素酸
塩化学によりホースラディッシュペルオキシダーゼに結
合された。概ねのモル比が１：１のこれらの二種の結合
体の混合物を検出試薬として使用した。結果ＢＳＡ−ＩＲＧ２／ＥＸＰ２４捕獲組成物が特異的にｇ
ｐ４０に対する抗体を検出するかどうか試験をするため
に、ミクロ平板ＥＬＩＳＡを行った。簡単に言えば、ミ
クロ平板中のミクロウエルの内壁を捕獲組成物で被覆し
た。次いで、種々の濃度の抗−ｇｐ４０ｍＡｂ、すな
わち、ｍＡｂ２Ｆ１１またはｍＡｂ１Ｃ９を含有するウ
シ胎仔血清（ＦＢＳ）をウエルに加えた。ネコ白血病ウ
イルスのｐ２７に対するｍＡｂを含有するＦＢＳ（ｍＡ
ｂＡ２；Ｌｕｔｚ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｓ．５６：２０９−２２０，１９８３）を陰性対照とし
て使用した。ホースラディッシュペルオキシダーゼに結
合されたＩＲＧ２を使用して、ウエルに結合されていた
抗−ｇｐ４０抗体を検出した。表１に示されている結果
は、ｐ２１／ｇｐ４０ミクロ平板ＥＬＩＳＡが抗−ｇｐ
１０抗体を特異的に検出できることを示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】次いで、ＦＩＶ感染の危険のある５０９
Ｕ．Ｓ．ネコからの試料を、ｐ２４またはｇｐ４０に対
する抗体について調べた。ｐ２４に対する抗体を検出す
るために、ＰＥＴＣＨＥＫ（上掲のＭｅｒｍｅｒ等の論
文）およびＳＮＡＰを使用した[その双方共アイデック
ス・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｗｅｓｔ
ｂｒｏｏｋ、ＭＥ）から市販されているキットであ
る]。ｇｐ４０に対する抗体を検出するために、ＷＩＴ
ＮＥＳＳ（ＳｙｎｂｉｏｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている
キット）を使用した。双方の種類の試験から得られた結
果の組み合わせは有病率１３．８％（７０／５０９）Ｆ
ＩＶ−陽性試料を示した。

【００２８】これらの７０ＦＩＶ−陽性試料のうち、そ
れらのうち４試料（５．７％）のみがこれらの商業的試
験のｐ２４またはｇｐ４０抗原と反応した。１試料はｐ
２４系試験においてのみ陽性であったが、その他の３試
料はｇｐ４０系試験のみで陽性であった。これらの食い
違う試料は、ｐ２４およびｇｐ４０抗体の双方を検出す
るＥＬＩＳＡ、ＳＮＡＰ（商標）およびウエスタンブロ
ット分析において陽性の結果を与えた。この発見は、ｐ
２４−およびｇｐ−４０方向抗体双方の検出がＦＩＶ診
断試験において確実な結果にとって重要であることを示
す。

【００２９】特に、ＰＥＴＣＨＥＫ分析で陰性であった
４３９試料は、ｐ２４およびｇｐ４０抗体双方を検出す
るＳＮＡＰ分析においても陰性であった。したがって、
望むものではないが、特定の理論（発明の実施に必要で
ない）に結びつけると、２種類のマーカーの使用は次の
理由のため特に重要であることが提唱される。すなわ
ち、その理由は、一方のマーカーが検出できない試料を
他方のマーカーが、選択性の低下を招くことなく、すな
わち、疑陽性という判定を大幅な増大を生じることなく
検出できることである。寄託特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ
スト条約の規定の下で、ハイブリドーマ３Ｈ９，１Ｃ
９，２Ｈ４および３Ｈ８はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，
ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託され、それ
ぞれ、ＨＢ１２５２８，ＨＢ１２５２９，ＨＢ１２５３
０，およびＨＢ１２５３１の受託番号が与えられた。その他の実施態様本発明を詳細な説明と関連させて記載したが、前述の記
載は例証を目的とするものであり、特許請求の範囲で定
義した本発明の範囲を限定する目的ではないことを了解
すべきである。例えば、捕獲ｐ２４およびｇｐ４０に各
々使用されたポリペプチドは固体表面の別の領域に固定
化されることができ、各領域で結合された抗体の検出
は、試験試料のネコドナーがＦＩＶで感染されることを
示す。

【００３０】その他の態様、利点および修正は特許請求
の範囲内である。

【００３１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> IDEXX Laboratories, Inc. <120> DIAGNOSIS OF FELINE IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION USING ENV/GAG POLYPEPTIDE MARKERS <130> 00088/111JP1 <150> US 09/089,878 <151> 1998-06-03 <150> US 60/085,615 <151> 1998-05-15 <160> 3 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Feline immunodeficiency virus <400> 1 Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Feline immunodeficiency virus <400> 2 Cys Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Feline immunodeficiency virus <400> 3 Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＦＩＶ分析の構成成分を表す図であ
る

【図２】ＦＩＶを検出する単回使用分析器具の分解図
である。

【図３】使用前の、組み立てられた図２の器具の断面
図である。

【図４】使用後の図２の器具の断面図である。

【符号の説明】

１０ａ、１０ｂ捕獲試薬１２固体基体１１ａ、１１ｂＦＩＶ抗体１４標識検出試薬１６酵素１８ａ、１８ｂポリペプチド

フロントページの続き (72)発明者ブライオン・マーマーアメリカ合衆国メイン州04021，カンバーランド，トゥー・リンデン・コート (56)参考文献特表平６−510602（ＪＰ，Ａ) 特表平４−502856（ＪＰ，Ａ) 特表平４−507094（ＪＰ，Ａ) 特表平９−512177（ＪＰ，Ａ) 特表平11−506614（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/569

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ネコがネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）
に感染されているか否かの決定方法であって、ネコの生
体試料を与え、その試料と、（ｉ）ＦＩＶｇａｇ前駆体
ｐ５５の免疫原性フラグメントを含有する第１の増大さ
れた捕獲ポリペプチドおよび（ｉｉ）ＦＩＶｅｎｖ前駆
体ｇｐ１３０の免疫原性フラグメントを含有する第２の
増大された捕獲ポリペプチドを含む抗体−結合性捕獲組
成物とを接触させ、そして、その捕獲組成物と試料中の
抗体との反応を検出することを含み、ここで、反応の発
生が、ネコがＦＩＶに感染されていることを示す、上記
ネコがネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）で感染されてい
るか否かの決定方法。
【請求項２】前記結合性捕獲組成物が、試料に対して
不混和性である相に付着されている請求項１に記載の方
法。
【請求項３】前記相が固相である請求項２に記載の方
法。
【請求項４】第１捕獲ポリペプチドがｐ２４を含む請
求項１に記載の方法。
【請求項５】第１捕獲ポリペプチドがｐ１５を含む請
求項１に記載の方法。
【請求項６】第１捕獲ポリペプチドがｐ１０を含む請
求項１に記載の方法。
【請求項７】第２捕獲ポリペプチドがｇｐ４０のシス
テインループを含む請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】第２捕獲ポリペプチドが配列ＥＬＧＣＮ
ＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）またはＣＥＬ
ＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を有す
る請求項７に記載の方法。
【請求項９】第２捕獲ポリペプチドがｇｐ１１０を含
む請求項１または４に記載の方法。
【請求項１０】前記試料中の抗体と捕獲組成物との反
応を検出できるように抗体結合性検出組成物を固相に施
用することをさらに含む請求項３に記載の方法。
【請求項１１】前記検出組成物が、ＦＩＶｇａｇ前駆
体ｐ５５の免疫原性フラグメントを含有する第１検出ポ
リペプチド、およびＦＩＶｅｎｖ前駆体ｇｐ１３０の免
疫原性フラグメントを含有する第２検出ポリペプチドを
含み、第１および第２検出ポリペプチドが検出可能な成
分で標識されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】第２検出ポリペプチドが配列ＥＬＧＣ
ＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）またはＣＥ
ＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含
む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】検出組成物が、破壊ＦＩＶと、配列が
ＳＥＱＩＤＮＯ：１または２であるペプチドとを含
み、当該破壊ＦＩＶおよびペプチドの双方が検出可能な
成分で標識されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】検出可能な成分が検出可能な反応を触
媒する酵素である請求項１１または１３に記載の方法。
【請求項１５】検出可能な成分がコロイド状金、放射
性核種または蛍光体である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】ネコがネコ免疫不全ウイルス（ＦＩ
Ｖ）に感染されているか否かを決定する分析を行うため
の器具であって、（ｉ）ＦＩＶｇａｇ前駆体ｐ５５の免
疫原性フラグメントを含有する第１の増大された捕獲ポ
リペプチド、および（ｉｉ）ＦＩＶｅｎｖ前駆体ｇｐ１
３０の免疫原性フラグメントを含有する第２の増大され
た捕獲ポリペプチドを含む抗体−結合性捕獲組成物、な
らびに、その捕獲組成物に結合される抗体の存在を検出
するための抗体−結合性検出組成物を含む上記ネコがネ
コ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）で感染されているか否か
を決定する分析を行うための器具。
【請求項１７】結合性捕獲組成物が、試料に対して不
混和性である相に付着されている請求項１６に記載の器
具。
【請求項１８】前記相が固相である請求項１７に記載
の器具。
【請求項１９】第１捕獲ポリペプチドがｐ２４を含む
請求項１６に記載の器具。
【請求項２０】第１捕獲ポリペプチドがｐ１５を含む
請求項１６に記載の器具。
【請求項２１】第１捕獲ポリペプチドがｐ１０を含む
請求項１６に記載の器具。
【請求項２２】第２捕獲ポリペプチドがＦＩＶｇｐ４
０のシステインループを含む請求項１６または１９に記
載の器具。
【請求項２３】第２捕獲ポリペプチドが配列ＥＬＧＣ
ＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）またはＣＥ
ＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を有
する請求項２２に記載の器具。
【請求項２４】前記検出組成物が、ＦＩＶｇａｇ前駆
体ｐ５５の免疫原性フラグメントを含有する第１検出ポ
リペプチド、またはＦＩＶｅｎｖ前駆体ｇｐ１３０の免
疫原性フラグメントを含有する第２検出ポリペプチドを
含み、第１および第２検出ポリペプチドの双方が検出可
能な成分で標識されている請求項１６に記載の器具。
【請求項２５】第２検出ポリペプチドが配列ＥＬＧＣ
ＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）またはＣＥ
ＬＧＣＮＱＮＱＦＦＣＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）を含
む請求項２４に記載の器具。
【請求項２６】検出組成物が、破壊ＦＩＶおよび配列
がＳＥＱＩＤＮＯ：１または２であるペプチドを含
み、破壊ＦＩＶおよびペプチドの双方が検出可能な成分
で標識されている請求項２４に記載の器具。
【請求項２７】検出可能な成分が検出可能な反応を触
媒する酵素である請求項２４に記載の器具。
【請求項２８】検出可能な成分が検出可能な反応を触
媒する酵素である請求項２６に記載の器具。
【請求項２９】検出可能な成分がコロイド状金、放射
性核種または蛍光体である請求項２４に記載の器具。
【請求項３０】検出組成物が容器中に保持される請求
項１６に記載の器具。