JP3372087B2 - Novel promoter of Aspergillus fungi - Google Patents
Novel promoter of Aspergillus fungiInfo
- Publication number
- JP3372087B2 JP3372087B2 JP21265893A JP21265893A JP3372087B2 JP 3372087 B2 JP3372087 B2 JP 3372087B2 JP 21265893 A JP21265893 A JP 21265893A JP 21265893 A JP21265893 A JP 21265893A JP 3372087 B2 JP3372087 B2 JP 3372087B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- aspergillus
- aspergillus niger
- sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、アスペルギルス属糸状
菌の新規プロモーターに関する。さらに詳しくは、本発
明は、アスペルギルス・オリゼまたはニガーを宿主とし
て用いる遺伝子組換技術に関するものであり、アスペル
ギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列をクローニ
ングし、アスペルギルス・オリゼおよびアスペルギルス
・ニガーで異種タンパク質を高発現するプロモーターと
して発現系に使用するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel promoter of Aspergillus filamentous fungus. More specifically, the present invention relates to a gene recombination technique using Aspergillus oryzae or niger as a host, wherein a novel promoter sequence derived from Aspergillus niger is cloned, and a heterologous protein is enhanced in Aspergillus oryzae and Aspergillus niger. It is used as an expression promoter in an expression system.
【０００２】[0002]
【従来の技術】アスペルギルス・オリゼおよびアスペル
ギルス・ニガーは古くから有用酵素の生産源として用い
られており、さらに、アスペルギルス・オリゼは清酒醸
造の麹として用いられる微生物であり、歴史的に安全で
あることが証明されている。そこで最近、これらのアス
ペルギルス属糸状菌が異種タンパク質生産の宿主として
注目され、形質転換系の開発が活発に行われている。し
かし、アスペルギルス属の遺伝子の解析例は少ない。こ
れまで、アスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーターを利用したタンパク質生産法の報告
(特開昭６２−２７２９８８号)、そのプロモーターを人
為的に変化させた報告(特開平４−１２１１９４号)、ア
スペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーのグリ
セルアルデヒド−３−ホスフェイト デヒドロゲナーゼ
(ＧＡＰ−ＤＨ)のプロモーターを利用しての異種タンパ
ク質の製造方法の報告がある(特開平３−１８７３９２
号)等があるにすぎず、いずれも、発現効率が低く、よ
り強力なプロモーターの開発が望まれている。2. Description of the Related Art Aspergillus oryzae and Aspergillus niger have long been used as a source of useful enzymes, and aspergillus oryzae is a microorganism used as a koji for sake brewing and is historically safe. Has been proven. Therefore, recently, filamentous fungi of the genus Aspergillus have attracted attention as hosts for the production of heterologous proteins, and the development of transformation systems has been actively carried out. However, there are few examples of analysis of Aspergillus gene. So far, a report on a protein production method using the promoter of the α-amylase gene of Aspergillus oryzae
(JP-A-62-272988), a report in which the promoter is artificially changed (JP-A-4-121194), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase of Aspergillus oryzae and Aspergillus niger.
There is a report on a method for producing a heterologous protein using a (GAP-DH) promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 3-187392).
No.) and the like, and in both cases, the expression efficiency is low and the development of a stronger promoter is desired.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明はアスペルギル
ス属糸状菌から、発現効率のよい、より強力なプロモー
ター配列をクローニングし、これをアスペルギルス属に
おける異種タンパク質の生産に利用することを目的とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION It is an object of the present invention to clone a stronger promoter sequence with high expression efficiency from Aspergillus filamentous fungus and utilize it for the production of a heterologous protein in Aspergillus.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは鋭意研究を行い、アスペルギルス・ニ
ガーから新規な、強力なプロモーター配列をクローニン
グすることに成功し、本発明を完成するに至った。[Means for Solving the Problems] In order to achieve the above object, the present inventors have conducted diligent research, succeeded in cloning a novel and strong promoter sequence from Aspergillus niger, and completed the present invention. Came to do.
【０００５】すなわち、本発明は、（１）以下の配列表
に示した塩基配列で表されるＤＮＡ、（２）該ＤＮＡか
らなるプロモーター、（３）該プロモーターを挿入した
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ、
（４）該プロモーターを挿入したベクターにより形質転
換したアスペルギルス・ニガー、（５）上記（３）項の
アスペルギルス・オリゼを培養し、生成、蓄積された有
用タンパク質を採取することを特徴とする有用タンパク
質の製造法、および（６）上記（４）項のアスペルギル
ス・ニガーを培養し、生成、蓄積された有用タンパク質
を採取することを特徴とする有用タンパク質の製造法、
を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明す
る。That is, the present invention provides (1) a DNA represented by the nucleotide sequence shown in the following sequence listing, (2) a promoter comprising the DNA, (3) an Aspergillus transformed with a vector having the promoter inserted therein.・ Orize,
(4) Aspergillus niger transformed with a vector into which the promoter is inserted, (5) Aspergillus oryzae of (3) above is cultured, and a useful protein produced and accumulated is collected. And (6) a method for producing a useful protein, which comprises culturing Aspergillus niger of (4) above and collecting the produced and accumulated useful protein,
Is provided. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【０００６】すなわち、本発明は、
（１）以下の配列表（配列番号１、以下、単に配列表と
いう）に示した塩基配列で表されるＤＮＡ、
（２）該ＤＮＡからなるプロモーター、
（３）アスペルギルス・ニガー由来である上記（２）記
載のプロモーター、
（４）アスペルギルス・ニガーにおいて高発現する上記
（２）記載のプロモーター、
（５）アスペルギルス・オリゼにおいて高発現する上記
（２）記載のプロモーター、
（６）上記（２）記載のプロモーターを挿入したベクタ
ーにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ、
（７）上記（２）記載のプロモーターを挿入したベクタ
ーにより形質転換したアスペルギルス・ニガー、
（８）上記（６）記載のアスペルギルス・オリゼを培養
し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取することを
特徴とする有用タンパク質の製造法、および
（９）上記（７）記載のアスペルギルス・ニガーを培養
し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取することを
特徴とする有用タンパク質の製造法、を提供するもので
ある。以下、本発明を詳細に説明する。That is, the present invention comprises: (1) a DNA represented by the nucleotide sequence shown in the following sequence listing (SEQ ID NO: 1, hereinafter simply referred to as sequence listing), (2) a promoter comprising the DNA, (3) ) The promoter according to (2) above, which is derived from Aspergillus niger, (4) the promoter according to (2) above, which is highly expressed in Aspergillus niger, and (5) the promoter according to (2), which is highly expressed in Aspergillus oryzae. (6) Aspergillus oryzae transformed with the vector having the promoter described in (2) above, (7) Aspergillus niger transformed with the vector having the promoter described in (2) above, (8) above ( 6) Culturing the Aspergillus oryzae described above, and collecting the produced and accumulated useful protein And (9) a method for producing a useful protein, which comprises culturing the Aspergillus niger according to (7) above and collecting the produced and accumulated useful protein. It is provided. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
【０００７】該プラスミドを用い、アスペルギルス・ニ
ガー由来の種々のプロモーター配列を自体公知の方法に
よりクローニングし、最少培地で高発現する新規なプロ
モーターを得る。プロモーター配列を得るアスペルギル
ス・ニガー株としては、特に限定するものではないが、
例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ア
ワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソ
ーヤ、アスペルギルス・オリゼなどが挙げられる。ま
た、最少培地としては、例えば、０．２％ＮａＮＯ3、
０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4、０．０５
％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ4、３％グルコースま
たは３％澱粉、ｐＨ５．５のツァペック−ドックス（Cz
apek-Dox）培地が用いられる。なお、本発明における
「高発現」とは、従来までに報告されている中では（タ
ダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第
５５巻、１９３９頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuch
iya）ら、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・ア
ンド・バイオケミストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂioc
hem．）第５６巻、１８４９頁(１９９２年)）、アスペ
ルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ーにレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子を発現する誘
導条件以上のＧＵＳ活性の発現量を意味し、一方、これ
に及ばない発現は低発現である。Using this plasmid, various promoter sequences derived from Aspergillus niger are cloned by a method known per se to obtain a novel promoter highly expressed in a minimal medium. The Aspergillus niger strain for obtaining the promoter sequence is not particularly limited,
For example, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachi, Aspergillus soja, Aspergillus oryzae and the like can be mentioned. The minimum medium is, for example, 0.2% NaNO 3 ,
0.1% K 2 HPO 4 , 0.05% MgSO 4 , 0.05
% KCl, 0.001% FeSO 4 , 3% glucose or 3% starch, Czapek-Dox pH 5.5 (Cz
apek-Dox) medium is used. The term "high expression" in the present invention means that among the previously reported (Tada et al., Agricultural and Biological Chemistry) No.
55 , 1939 (1991) and Tsuchiya (Tsuch
iya) et al., Bioscience, Biotechnology and Biochemistry (Biosci. Biotech. Bioc)
hem. ) Vol. 56 , p. 1849 (1992)), which means the expression level of GUS activity above the inducing condition for expressing the GUS gene as a reporter gene in the promoter of the α-amylase gene of Aspergillus oryzae. No expression is low expression.
【０００８】本発明のプロモーターは、特に、アスペル
ギルス・オリゼまたはアスペルギルス・ニガーに導入し
た場合に高発現するものであり、該プロモーターの下流
に、所望の有用タンパク質遺伝子を連結してベクターを
構築し、該ベクターでこれらの宿主アスペルギルス属糸
状菌を形質転換し、それを培養することにより、有用タ
ンパク質を著量生産させることができる。[0008] The promoter of the present invention is particularly highly expressed when introduced into Aspergillus oryzae or Aspergillus niger, and a desired useful protein gene is ligated downstream of the promoter to construct a vector, By transforming these host filamentous fungi of the genus Aspergillus with the vector and culturing them, a useful protein can be produced in a significant amount.
【０００９】得られたプロモーターへの有用タンパク質
遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、自体公知の方法で
行うことができる。有用タンパク質遺伝子としては、特
に限定するものではないが、例えば、仔牛キモシン、ヒ
トＥＧＦ、各種成長ホルモン、各種インターフェロンな
どが挙げられる。また、ベクターとしては、アルギニン
要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化
などの炭素・窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性な
どの薬剤耐性遺伝子などを用いることができる。The useful protein gene can be linked to the obtained promoter and inserted into a vector by a method known per se. The useful protein gene is not particularly limited, and examples thereof include calf chymosin, human EGF, various growth hormones, various interferons, and the like. As the vector, an auxotrophic complementary gene such as arginine auxotrophy, a carbon / nitrogen source assimilation gene such as acetamide assimilation, and a drug resistance gene such as oligomycin resistance can be used.
【００１０】宿主は、アスペルギルス属糸状菌に限定す
るものではなく、ノイロスポラ属（Neurospora）、ペニ
シリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichod
erma）なども使用できるが、発現効率の点から、上記の
ごとく、アスペルギルス属糸状菌を用いることが好まし
く、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス
・ソーヤ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス
・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・
ニドランスなどが挙げられる。The host is not limited to the filamentous fungus of the genus Aspergillus, but includes the genera Neurospora, Penicillium and Trichodrum.
erma) or the like, but from the viewpoint of expression efficiency, as described above, it is preferable to use Aspergillus filamentous fungus, for example, Aspergillus oryzae, Aspergillus soya, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachi, Aspergillus niger, Aspergillus
Nidrance etc. are mentioned.
【００１１】これらの宿主アスペルギルス属糸状菌の形
質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該
形質転換体の培養も常法に従って、所望のタンパク質に
適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うこ
とができ、得られたタンパク質の採取も公知の方法で行
うことができる。Transformation of these host filamentous fungi of the genus Aspergillus can also be performed by a method known per se. Cultivation of the transformant can be performed according to a conventional method by appropriately selecting a medium and culture conditions suitable for the desired protein, and the obtained protein can also be collected by a known method.
【００１２】[0012]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、これに限定されるものではない。
実施例１
アスペルギルス・ニガー由来の新規プロモーター配列の
クローニング
選択マーカーとして、アスペルギルス・ニドランス由来
のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(a
rgＢ)(バクストン（Ｂuxton）ら、ジーン（Ｇene）第３
７巻、２０７頁(１９８５年))およびＡＭＡ１配列を組
み込み、さらにレポーター遺伝子としてβ−グルクロニ
ダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を組み込んだ、ＢamＨＩサイト
をユニークサイトとするブルースクリプト（Ｂluescrip
t）ＩＩ誘導体のプロモーター検索用プラスミドを２種
類構築した(pＢＸＧＡlおよびpＢＧＡＲ)。それぞれの
ＢamＨＩサイトに、アスペルギルス・オリゼＩＦＯ４２
９０とアスペルギルス・ニガーＩＦＯ４６３４の染色体
ＤＮＡを制限酵素Ｓau３ＡＩで部分分解したＤＮＡ断片
(０．５〜２ Ｋbp)を挿入したプラスミドライブラリー
を４種類作成した。それぞれのプラスミドＤＮＡを調製
後、argＢ-株のアスペルギルス・オリゼ(ＩＦＯ５２４
０から変異処理により取得)とアスペルギルス・ニガー
(ＡＴＣＣ２０７３９)をヤタラーゼ[Ｙatalase(宝酒造
製)]を用いてプロトプラスト化し、ＰＥＧ−ＣaＣl2存
在下で上記プラスミドＤＮＡと混合した。スクリーニン
グ用培地として、炭素源としてグルコース、マルトー
ス、スターチと変化させた最少培地(Ｃzapek−Ｄox)
に、スタビライザーとして０．８ＭのＮaＣlとβ−グル
クロニダーゼが発現するとき青色の色素を生産するＸ−
グルクロナイドを含むプレートに重層後、３０℃の恒温
槽で数日間培養後、青色に発色するコロニーを選択し
た。このうち２４株の青色を示す形質転換株をスクリー
ニングし、炭素源をグルコースとスターチの２種類の最
少培地で２４株を培養後、菌体内のβ−グルクロニダー
ゼの酵素活性を最も強く発現している形質転換株を選択
し、Ｎｏ．８株と命名した。Ｎｏ．８株は、アスペルギ
ルス・ニガー由来のプロモーター領域を含む配列を上記
ｐＢＸＧＡ１のＢａｍＨＩサイトに組み込んだベクター
により形質転換したアスペルギルス・オリゼであり、ア
スペルギリス オリゼＮＰ−８と命名し、平成５年８月
５日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所の受
託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３７８５の下、寄託してある。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the invention is not limited thereto. Example 1 As a cloning selection marker for a novel promoter sequence derived from Aspergillus niger, an ornithine carbamoyltransferase gene (a derived from Aspergillus nidulans) (a
rgB) (Buxton et al., Gene 3rd )
7 , p. 207 (1985)) and AMA1 sequence, and a β-glucuronidase (GUS) gene as a reporter gene, BamHI site as a unique bluescript (Bluescrip).
t) Two types of promoter search plasmids for II derivatives were constructed (pBXGAl and pBGAR). Aspergillus oryzae IFO42 on each BamHI site
90 and Aspergillus niger IFO 4634 chromosomal DNA partially digested with restriction enzyme Sau3AI
Four kinds of plasmid libraries having (0.5 to 2 Kbp) inserted were prepared. After preparation of each plasmid DNA, argB - strain Aspergillus oryzae (IFO524
(Obtained by mutation processing from 0) and Aspergillus niger
(ATCC 20739) was protoplastized using Yatalase [Yatalase (Takara Shuzo)] and mixed with the above plasmid DNA in the presence of PEG-CaCl 2 . Minimal medium (Czapek-Dox) with glucose, maltose, and starch as carbon sources changed as a screening medium
X-, which produces a blue pigment when 0.8M NaCl and β-glucuronidase are expressed as a stabilizer.
After overlaying on a plate containing glucuronide and culturing for several days in a thermostat at 30 ° C., colonies that develop blue color were selected. Of these 24 strains, 24 strains showing blue color were screened, and after culturing 24 strains in two types of minimal mediums of glucose and starch as the carbon source, the enzyme activity of β-glucuronidase in the cells was most strongly expressed. Select a transformant strain and select No. It was named 8 strains. No. Eight strains were Aspergillus oryzae transformed with the vector in which a sequence containing a promoter region derived from Aspergillus niger was inserted into the BamHI site of pBXGA1 and named Aspergillus oryzae NP-8. It has been deposited under the deposit number FERM P-13785 of the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
【００１３】Ｎo．８株よりＤＮＡ画分を調製し、イー
・コリＨＢ１０１を形質転換して得られるプラスミドＤ
ＮＡよりＮo．８のプロモーター領域の入ったＸbaＩ−
ＳmaＩ断片をＢluescriptＩＩのＸbaＩ−ＳmaＩ領域に
挿入し、シークエンスを行った。その配列を配列表に示
す。この配列は、最新のデーターベースとのホモロジー
検索の結果、全く新規なＤＮＡ配列であることが判明し
た。No. Plasmid D prepared from 8 strains and transformed into E. coli HB101
From NA, No. XbaI-containing 8 promoter regions
The SmaI fragment was inserted into the XbaI-SmaI region of BluescriptII and sequenced. The sequence is shown in the sequence listing. As a result of homology search with the latest database, this sequence was found to be a completely novel DNA sequence.
【００１４】実施例２
Ｎｏ．８株によるβ−グルクロニダーゼ活性発現に及ぼ
す培地の炭素源および窒素源の影響
上記方法により取得したＮo．８のアスペルギルス・オ
リゼの形質転換株を表１に示す炭素源と窒素源で培養
後、菌体内に生産するβ−グルクロニダーゼの活性を比
較した。その結果を表１に示す。Example 2 No. Effect of carbon source and nitrogen source of medium on β-glucuronidase activity expression by 8 strains No. After culturing 8 Aspergillus oryzae transformants with carbon and nitrogen sources shown in Table 1, the activities of β-glucuronidase produced in the cells were compared. The results are shown in Table 1.
【００１５】[0015]
【表１】 [Table 1]
【００１６】β−グルクロニダーゼ活性の発現誘導は、
炭素源の違いによる誘導は見られず、今までに報告され
ているα−アミラーゼ、グルコアミラーゼのアミラーゼ
系のプロモーター[タダ（Ｔada）ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａgric．
Ｂiol．Ｃhem．）第５３巻、５９３頁(１９８９年)およ
びハタ（Ｈata）ら、カレント・ジェネティクス（Ｃur
r．Ｇenet．）第２２巻、８５頁(１９９２年)]とは異な
ることは、配列表のシークエンス結果からも明らかであ
る。また、窒素源による違いを調べたところ、アスパラ
ギンやカザミノ酸などの有機態のものよりも硝酸ソーダ
や硫安などの無機態の窒素源の方が高いβ−グルクロニ
ダーゼ比活性を示した。The induction of β-glucuronidase activity is as follows.
No induction was observed due to the difference in carbon source, and the amylase promoters of α-amylase and glucoamylase reported so far [Tada et al., Agricultural and Biological Chemistry (Agric.
Biol. Chem. 53 , p. 593 (1989) and Hata et al., Current Genetics (Cur).
r. Genet. ) Vol. 22 , p. 85 (1992)], it is clear from the sequence results of the sequence listing. In addition, when the differences depending on the nitrogen source were investigated, the β-glucuronidase specific activity was higher in the inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate and ammonium sulfate than in the organic states such as asparagine and casamino acid.
【００１７】実施例３
既知のプロモーターとの比較
本発明のアスペルギルス・ニガー由来の新規プロモータ
ー活性と、これまでに報告されている強力なプロモータ
ーであるアスペルギルス・オリゼのα−アミラーゼ遺伝
子のプロモーター活性を、β−グルクロニダーゼ遺伝子
をレポーター遺伝子として比較した。双方ともインテグ
レート型のベクターとして比較するために、Ｎo．８の
プロモーターが入ったプラスミッド検索用ベクターから
自己複製配列であるＡＭＡ１を除き、インテグレート型
のベクターに変換してアスペルギルス・オリゼとアスペ
ルギルス・ニガーを再度形質転換した。糸状菌の形質転
換の特徴として、導入された遺伝子は、相同的な部位に
インテグレートされるだけでなく、非相同的な部位にも
何コピーもタンデムに連なってインテグレートされる。
したがって、コピー数の制御は難しいので、何個かの形
質転換株のβ−グルクロニダーゼ活性の比活性の平均を
比較した。その結果を表２に示す。Example 3 Comparison with known promoters The novel promoter activity of Aspergillus niger of the present invention and the promoter activity of the α-amylase gene of Aspergillus oryzae, which is a strong promoter reported so far, are The β-glucuronidase gene was compared as a reporter gene. In order to compare both as integrated vectors, No. The plasmid-searching vector containing 8 promoters was removed from the self-replicating sequence AMA1 and converted into an integrated type vector to transform Aspergillus oryzae and Aspergillus niger again. As a characteristic of transformation of filamentous fungi, the introduced gene is not only integrated into a homologous site, but also integrated into a non-homologous site in multiple copies in tandem.
Therefore, since it is difficult to control the copy number, the average of the specific activities of β-glucuronidase activities of several transformants was compared. The results are shown in Table 2.
【００１８】[0018]
【表２】 [Table 2]
【００１９】Ｎo．８のアスペルギルス・オリゼの再形
質転換株におけるβ−グルクロニダーゼ活性の発現は、
α−アミラーゼのプロモーターとターミネーターの間に
β−グルクロニダーゼ遺伝子の構造遺伝子をそれぞれＰ
ＣＲ(サイキ（Ｓaiki）ら、サイエンス（Ｓcience）第
２３９巻、４８７頁(１９８８年))により構築し、argＢ
遺伝子のマーカーの入ったインテグレート型のベクター
に挿入したＴaka−ＧＵＳの形質転換株により、デキス
トリンあるいはデンプンを炭素源とする培地で誘導生産
される活性よりも非常に高く、１回目の形質転換では、
８株の平均で２．８倍、２回目の形質転換では、６株の
平均で４．３倍のβ−グルクロニダーゼ活性を発現して
いた。このＴaka−ＧＵＳの形質転換株における誘導、
非誘導(炭素源がグルコースの場合)のβ−グルクロニダ
ーゼ活性は、従来報告されている値[タダ（Ｔada）ら、
アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ａgric．Ｂiol．Ｃhem．）第５５巻、１９３９
頁(１９９１年)およびツチヤ（Ｔsuchiya）ら、バイオ
サイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミ
ストリー（Ｂiosci．Ｂiotech．Ｂiochem．）第５６
巻、１８４９頁(１９９２年)]と同程度であった。No. Reform of 8 Aspergillus oryzae
Expression of β-glucuronidase activity in the transformant was
between the α-amylase promoter and terminator
The structural genes of β-glucuronidase gene are
CR (Saiki et al., Science No. 1)
239Vol., Page 487 (1988)), argB
Integrated vector containing gene markers
The transformant strain of Taka-GUS inserted in
Induction production in medium containing trin or starch as carbon source
Much higher than the activity achieved, and in the first transformation,
2.8 times the average of 8 strains, 6 strains in the second transformation
Expressing 4.3 times more β-glucuronidase activity on average
I was there. Induction of this Taka-GUS transformant,
Non-induced (when glucose is the carbon source) β-glucuronida
The activity of the enzyme was previously reported [Tada et al.,
Agricultural and Biological Chemistry
Tree (Agric. Biol. Chem.) No.55Volume, 1939
Page (1991) and Tsuchiya et al., Bio
Science, biotechnology and biochemistry
Streamy (Biosci. Biotech. Biochem.) No.56
Vol. 1849 (1992)].
【００２０】アスペルギルス・ニガーの形質転換株を用
いて同様の実験を行った。宿主のタンパクの生産能力の
差により、アスペルギルス・オリゼの宿主よりも１／１
０程度のβ−グルクロニダーゼ活性の発現量であった
が、Ｎo．８のアスペルギルス・ニガー由来の該新規プ
ロモーターが入ったものは、アスペルギルス オリゼの
α−アミラーゼのプロモーターが入ったものよりも、６
株の平均で、β−グルクロニダーゼ活性はやはり３．２
倍高くなった。このことにより、アスペルギルスの既知
のプロモーターよりも、格段に強いプロモーター配列あ
るいはＵＡＳ(Ｕpstream Ａctivation Ｓequence)配
列がアスペルギルス・オリゼ以外の菌種にも存在するこ
とが明らかとなった。上記の結果は、本発明のプロモー
ターが炭素源がグルコースでも非常に強い発現量を示す
プロモーターであることを示唆しており、ノーザンハン
ブリダイゼーションの結果においても、アスペルギルス
・ニガー由来の該新規プロモーターが挿入されたβ−グ
ルクロニダーゼ遺伝子の転写産物の量がアスペルギルス
・オリゼのα−アミラーゼのプロモーターの同転写産物
の量よりもはるかに多いことからも結論付けられる。The same experiment was carried out using a transformant of Aspergillus niger. Due to the difference in protein production capacity of the host, it is 1/1 compared to the host of Aspergillus oryzae
Although the expression level of β-glucuronidase activity was about 0, No. 8 containing the novel promoter derived from Aspergillus niger is 6% more than that containing the Aspergillus oryzae α-amylase promoter.
The average β-glucuronidase activity of the strains was 3.2.
It was twice as expensive. From this, it was revealed that a promoter sequence or UAS (Upstream Activation Sequence) sequence which is significantly stronger than the known promoter of Aspergillus exists also in bacterial species other than Aspergillus oryzae. The above results suggest that the promoter of the present invention is a promoter that exhibits a very strong expression level even when the carbon source is glucose, and even in the results of Northern hybridization, the novel promoter derived from Aspergillus niger was inserted. It is also concluded that the amount of the transcript of the β-glucuronidase gene was much higher than that of the promoter of Aspergillus oryzae α-amylase.
【００２１】[0021]
【発明の効果】本発明により、アスペルギルス・ニガー
由来の新規強力プロモーターが提供され、該プロモータ
ー配列を含むベクターにより形質転換されたアスペルギ
ルスオリゼおよびニガーにおける外来性タンパク質の著
量生産が可能となる。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a novel strong promoter derived from Aspergillus niger is provided, and it becomes possible to produce a large amount of a foreign protein in Aspergillus oryzae and niger transformed with a vector containing the promoter sequence.
【００２２】[0022]
【配列表】配列の長さ：７８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アスペルギルス・ニガー 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 配列番号１ 10 20 30 40 50 60 5' GATCGGCTGC GACTGCGAGG ATTTTACTCT GAAGACGTAC GGGATTGCCA TTGGTGTTTT 3' CTAGCCGACG CTGACGCTCC TAAAATGAGA CTTCTGCATG CCCTAACGGT AACCACAAAA 70 80 90 100 110 120 GGGACTTCAC ATCCTTTCGC TTCTGCTCAT CAAGGGCGGC TCTGGGAGGC GTGGGGCATC CCCTGAAGTG TAGGAAAGCG AAGACGAGTA GTTCCCGCCG AGACCCTCCG CACCCCGTAG 130 140 150 160 170 180 AGCGACTAGC TTGCGGATAG GAGGAGCTGG GCGGTAGAAG ATGGAGTGAC GAACGTGGTT TCGCTGATCG AACGCCTATC CTCCTCGACC CGCCATCTTC TACCTCACTG CTTGCACCAA 190 200 210 220 230 240 TGGAAGAAAT CATCCCGGTG GGAGGATTGG GCCATATTGG TAGGAGGGGA TTTTTAGTTG ACCTTCTTTA GTAGGGCCAC CCTCCTAACC CGGTATAACC ATCCTCCCCT AAAAATCAAC 250 260 270 280 290 300 ATGGAACTAT TATTATGACC AAGAATAAGG AGCAGTAACC AGGAAATGGG GCAATGTAAT TACCTTGATA ATAATACTGG TTCTTATTCC TCGTCATTGG TCCTTTACCC CGTTACATTA 310 320 330 340 350 360 AGTCAGATTA GACCCAGACA ATGCCTAGGA TGCTATCCAC AAAACCAGCT TTTGGTGAAT TCAGTCTAAT CTGGGTCTGT TACGGATCCT ACGATAGGTG TTTTGGTCGA AAACCACTTA 370 380 390 400 410 420 AATGAATACT ACTAGCATTC CCCGCTGACG GAGCTCACGT GGTCCGTTCG GGCAAAACTA TTACTTATGA TGATCGTAAG GGGCGACTGC CTCGAGTGCA CCAGGCAAGC CCGTTTTGAT 430 440 450 460 470 480 ACGAAGGAAC TGCATGTTGA GCTTCTCCCG TCCACCGGAG CCCCAGCCTT TCCCACCACA TGCTTCCTTG ACGTACAACT CGAAGAGGGC AGGTGGCCTC GGGGTCGGAA AGGGTGGTGT 490 500 510 520 530 540 AAACCTCCGT CGTTCCTTTT TAAACCTTTT CTCTTCCTCA TCTTCCCTTC TTCTCTCTTC TTTGGAGGCA GCAAGGAAAA ATTTGGAAAA GAGAAGGAGT AGAAGGGAAG AAGAGAGAAG 550 560 570 580 590 600 CTCCCACTTC CTTGCCCTTC CCCCCCCTCC CACCTCCCTA CCCATTGAGC AGATTTTTCC GAGGGTGAAG GAACGGGAAG GGGGGGGAGG GTGGAGGGAT GGGTAACTCG TCTAAAAAGG 610 620 630 640 650 660 CTCCTCCTTC CCTCTCTCCC CCCTGTACCT TTCTTTTCTA TCTTGCGCGT CAATCGCGCA GAGGAGGAAG GGAGAGAGGG GGGACATGGA AAGAAAAGAT AGAACGCGCA GTTAGCGCGT 670 680 690 700 710 720 CACTCCCCTG TCAGCATGGA TATGAACCAT TTAATAGGGT CAGTGTTCTA TGCCACTACT GTGAGGGGAC AGTCGTACCT ATACTTGGTA AATTATCCCA GTCACAAGAT ACGGTGATGA 730 740 750 760 770 780 GGTCTGAACC AGGGTTTGTG CGGCTAGGCG GGAGTTAACA CCTGGCAGTC AGCGTTTCAA CCAGACTTGG TCCCAAACAC GCCGATCCGC CCTCAATTGT GGACCGTCAG TCGCAAAGTT CCTGATC 3' GGACTAG 5'[Sequence listing] Sequence length: 787 Sequence type: Nucleic acid Number of chains: double-stranded Topology: linear Sequence Type: Genomic DNA origin Organism name: Aspergillus niger Sequence features Characteristic symbol: promoter Sequence number 1 10 20 30 40 50 60 5'GATCGGCTGC GACTGCGAGG ATTTTACTCT GAAGACGTAC GGGATTGCCA TTGGTGTTTT 3'CTAGCCGACG CTGACGCTCC TAAAATGAGA CTTCTGCATG CCCTAACGGT AACCACAAAA 70 80 90 100 110 120 GGGACTTCAC ATCCTTTCGC TTCTGCTCAT CAAGGGCGGC TCTGGGAGGC GTGGGGCATC CCCTGAAGTG TAGGAAAGCG AAGACGAGTA GTTCCCGCGC AG AGACCCTCCG CACCCCGTAG 130 140 150 160 170 180 AGCGACTAGC TTGCGGATAG GAGGAGCTGG GCGGTAGAAG ATGGAGTGAC GAACGTGGTT TCGCTGATCG AACGCCTATC CTCCTCGACC CGCCATCTTC TACCTCACTG CTTGCACCAA 190 200 210 220 230 240 TGGAAGAAAT CATCCCGGTG GGAGGATTGG GCCATATTGG TAGGAGGGGA TTTTTAGTTG ACCTTCTTTA GTAGGGCCAC CCTCCTAACC CGGTATAACC ATCCTCCCCT AAAAATCAAC 250 260 270 280 290 300 ATGGAACTAT TATTATGACC AAGAATAAGG AGCAGTAACC AGGAAATGGG GCAATGTAAT TACCTTGATA ATAATACTGG TTCTTATTCC TCGTCATTGG TCCTTTACCC CGTTACATTA 310 320 330 340 350 360 AGTCAGATTA GACCCAGACA ATGCCTAGGA TGCTATCCAC AAAACCAGCT TTTGGTGAAT TCAGTCTAAT CTGGGTCTGT TACGGATCCT ACGATAGGTG TTTTGGTCGA AAACCACTTA 370 380 390 400 410 420 AATGAATACT ACTAGCATTC CCCGCTGACG GAGCTCACGT GGTCCGTTCG GGCAAAACTA TTACTTATGA TGATCGTAAG GGGCGACTGC CTCGAGTGCA CCAGGCAAGC CCGTTTTGAT 430 440 450 460 470 480 ACGAAGGAAC TGCATGTTGA GCTTCTCCCG TCCACCGGAG CCCCAGCCTT TCCCACCACA TGCTTCCTTG ACGTACAACT CGAAGAGGGC AGGTGGCCTC GGGGTCGGAA AGGGTGGTGT 490 500 510 520 530 540 AAACCTCCGT CGTTCCTTTT TAAACCTTTT CTCTTCCTCA TCTTCCCTTC TTCTCTCTTC TTTGGAGGCA GCAAGGAAAA ATTTGGAAAA GAGAAGGAGT AGAAGGGAAG AAGAGAGAAG 550 560 570 580 590 600 CTCCCACTTC CTTGCCCTTC CCCCCCCTCC CACCTCCCTA CCCATTGAGC AGATTTTTCC GAGGGTGAAG GAACGGGAAG GGGGGGGAGG GTGGAGGGAT GGGTAACTCG TCTAAAAAGG 610 620 630 640 650 660 CTCCTCCTTC CCTCTCTCCC CCCTGTACCT TTCTTTTCTA TCTTGCGCGT CAATCGCGCA GAGGAGGAAG GGAGAGAGGG GGGACATGGA AAGAAAAGAT AGAACGCGCA GTTAGCGCGT 670 680 690 700 710 720 CACTCCCCTG TCAGCATGGA TATGAACCAT TTAATAGGGT CAGTGTTCTA TGCCACTACT GTGAGGGGAC AGTCGTACCT ATACTTGGTA AATTATCCCA GTCACAAGAT ACGGTGATGA 730 740 750 760 770 780 GGTCTGAACC AGGGTTTGTG CGGCTAGGCG GGAGTTAACA CCTGGCAGTC AGCGTTTCAA CCAGACTTGG TCCCAAACAC GCCGATCCGC CCTCAATTGT GGACCGTCAG TCGCAAAGTT CCTGATC 3 ' GGACTAG 5 '
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 布川 彌太郎 兵庫県西宮市今津出在家町４番９号 大 関株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特表 平４−503150（ＪＰ，Ａ) Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．22 （４），ｐ．313−316（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/15 C12P 21/02 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)Front page continuation (51) Int.Cl. 7 Identification code FI (C12N 1/15 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:69) (C12N 15/09 ZNA C12R 1: 685) (C12P 21/02 C12R 1: 685) ) (C12P 21/02 C12R 1:69) (72) Inventor Yataro Nunokawa 4-9 Imazu Izukaecho, Nishinomiya City, Hyogo Prefecture Ozeki Co., Ltd. (56) References Japanese Patent Publication No. 4-503150 (JP) , A) Curr. Genet. , Vol. 22 (4), p. 313-316 (1992) (58) Fields surveyed (Int.Cl. 7 , DB name) C12N 15/09 C12N 1/15 C12P 21/02 GenBank / EMBL / DDBJ / GeneSeq CA / BIOSIS / MEDLINE / W PIDS (STN)
Claims (9)
ＤＮＡ。1. A DNA represented by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
ター。2. A promoter comprising the DNA according to claim 1.
niger）由来である請求項２記載のプロモーター。3. An Aspergillus niger.
niger) -derived promoter.
する請求項２記載のプロモーター。4. The promoter according to claim 2, which is highly expressed in Aspergillus niger.
oryzae）において高発現する請求項２記載のプロモータ
ー。5. Aspergillus oryzae
The promoter according to claim 2, which is highly expressed in oryzae).
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・オリゼ。6. An Aspergillus oryzae transformed with the vector into which the promoter according to claim 2 is inserted.
ベクターにより形質転換したアスペルギルス・ニガー。7. An Aspergillus niger transformed with the vector into which the promoter according to claim 2 is inserted.
を培養し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取する
ことを特徴とする有用タンパク質の製造法。8. A method for producing a useful protein, which comprises culturing the Aspergillus oryzae according to claim 6 and collecting the produced and accumulated useful protein.
を培養し、生成、蓄積された有用タンパク質を採取する
ことを特徴とする有用タンパク質の製造法。9. A method for producing a useful protein, which comprises culturing the Aspergillus niger according to claim 7 and collecting the produced and accumulated useful protein.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21265893A JP3372087B2 (en) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | Novel promoter of Aspergillus fungi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21265893A JP3372087B2 (en) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | Novel promoter of Aspergillus fungi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0759571A JPH0759571A (en) | 1995-03-07 |
| JP3372087B2 true JP3372087B2 (en) | 2003-01-27 |
Family
ID=16626268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21265893A Expired - Lifetime JP3372087B2 (en) | 1993-08-27 | 1993-08-27 | Novel promoter of Aspergillus fungi |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3372087B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100676183B1 (en) * | 2004-05-14 | 2007-01-30 | 채건상 | Aspergillus oryzae derived mheA gene as promoter |
| US7378256B2 (en) | 2004-11-18 | 2008-05-27 | Genencor International, Inc. | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
| CN101061224B (en) * | 2004-11-18 | 2011-11-02 | 金克克国际有限公司 | Aspergillus niger promoter for expressing genes in host cells |
-
1993
- 1993-08-27 JP JP21265893A patent/JP3372087B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２２（４），ｐ．３１３−３１６（１９９２） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0759571A (en) | 1995-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2410048B1 (en) | Method for producing a compound of interest in a filamentous fungal cell | |
| JP3005618B2 (en) | Aspergillus yeast promoter | |
| EP0635574B1 (en) | Selection marker gene free recombinant strains, a method for obtaining them and the use of these strains | |
| EP0758020B1 (en) | amdS gene from Aspergillus niger coding for an acetamidase | |
| NZ207000A (en) | Dna coding for fungal glucoamylase | |
| EP0770139A1 (en) | A FUNGUS WHEREIN THE areA GENE HAS BEEN MODIFIED AND AN areA GENE FROM ASPERGILLUS ORYZAE | |
| HU214005B (en) | Process for producing transformed hostcells and polipeptides by use of novel fun gal expression system | |
| JP3372087B2 (en) | Novel promoter of Aspergillus fungi | |
| US5543322A (en) | DNA coding for alkaline protease | |
| JP6599583B1 (en) | Multigene disrupted Aspergillus microorganism and method for producing the same | |
| JP3343567B2 (en) | Filamentous fungal enhancer DNA base sequence and its use | |
| CN113699176A (en) | Construction and application of aspergillus niger recombinant expression strain for high-yield lysophospholipase | |
| JP4495904B2 (en) | Modified promoter | |
| CN113755509A (en) | Lysophospholipase variant, construction method thereof and expression in aspergillus niger strain | |
| Santhanam et al. | A reassessment of flocculosin-mediated biocontrol activity of Pseudozyma flocculosa through CRISPR/Cas9 gene editing | |
| CA2485119A1 (en) | Promoters with modified transcription efficiency | |
| JP5105691B2 (en) | Cyclic nucleotide derived from Aspergillus filamentous fungi, method for producing Aspergillus filamentous fungus self-cloning strain, and self-cloning strain | |
| JPH07115976A (en) | New promoter for mold belonging to genus aspergillus | |
| DE60209467T2 (en) | NEW AMINO PEPTIDASE AND ITS GENE | |
| JP2005052116A (en) | High activity promoter and use thereof | |
| JPH11155568A (en) | Transformation of lentinus edodes | |
| CN111647572A (en) | Reductase derived from trichoderma reesei and coding gene and application thereof | |
| JPH07203975A (en) | Gene encoding antimicrobial peptide and production thereof | |
| JPH11313683A (en) | New xylosidase gene, vector, transformant using the same and its use | |
| JP2901387B2 (en) | Protein production method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071122 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 6 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081122 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081122 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091122 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101122 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 9 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111122 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111122 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121122 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121122 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 11 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131122 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |