JP3369166B2

JP3369166B2 - 細胞間粘着分子―２およびその結合リガンド

Info

Publication number: JP3369166B2
Application number: JP05786990A
Authority: JP
Inventors: アレンスプリンガーティモシー; ローランダスティンマイケル; イースターントンドナルド
Original assignee: センターフォアブラッドリサーチインコーポレイテッド
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 2003-01-20
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: EP0387668B1; JPH0361486A; CA2011633C; AU5117290A; KR900013978A; DE69029336T2; NO901093D0; FI901170A0; ATE146222T1; ES2097747T3; KR0169728B1; NO178862C; AU647017B2; HU901367D0; NO901093L; NO178862B; CA2011633A1; IL93680A0; IL93680A; NZ232833A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、リンパ球の群が細胞基質を認識しそれに付
着して炎症部位に移動し炎症反応中細胞と相互作用する
過程に関与する細胞間粘着分子−２（“ICAM−2"）に関
する。本発明はさらにICAM−２細胞間粘着分子に結合し
得るリガンド分子、該細胞間粘着分子の利用および該リ
ガンド分子に関する。

従来技術白血球はホストをバクテリアまたはウイルスのような
外敵に対して適切に防御するために細胞基質に付着し得
なければならない。防御システムの優れた見解はEisen,
H.W.により“Microbiology,第３版、ペンシルバニア州
フィラデルフィア、Harper ＆ Row社刊、（1980）、290
−295および381−418"に与えられている。白血球は内皮
細胞に結合できて循環系から進行中の炎症部位に移動で
きなければならない。さらに、白血球は抗原提供細胞に
付着して正常な特異的免疫応答を起こし得るものでなけ
ればならず、さらに、リンパ球は、適当なターゲット細
胞に付着してウイルス感染または腫瘍細胞の分解を起こ
し得るものでなければならない。

最近、そのような付着の媒介に関与する白血球表面分
子がハイブリドーマ技術を用いて同定された。要する
に、ヒトＴ−細胞〔Davignon,D.等、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,78:4535−4539（1981）〕とマウスひ臓細胞〔Spr
inger,T.等、Eur.J.Immunol.,９:301−306（1979）〕に
対して向けられた各モノクローナル抗体は白血球表面に
結合し、上述の付着関連機能を抑制しているものと同定
された〔Springer,T.等、Fed.Proc.,44:2660−2663（19
85）〕。これらの抗体により同定された分子はMac−１
およびリンパ球機能会合抗原１（LFA−１）と称され
る。Mac−１はマクロファージ、顆粒球および顆粒状大
リンパ球上に見い出されるヘテロダイマーである。LFA
−１は大部分のリンパ球に見い出されるヘテロダイマー
である〔Springer,T.A.等、Immunol.Rev.,68:111−135
（1982）〕。これらの２つの分子、および第３分子p15
0、95（これはMac−１と同様な組織分布を有する）は細
胞粘着においてある役割を発揮する〔Keizer,G.等、Eu
r.J.Immunol.,15:1142−1147（1985）〕。

上記の白血球分子は“CD−18族”糖たん白質と呼ばれ
る、糖たん白質の関連群の構成員であることが見い出さ
れた〔Sanchez−Madrid,F.等、J.Exper.Med.,158:1785
−1803（1983）;Keizer,G.D.等、Eur.J.Immunol.,15:11
42−1147（1985）〕。この糖たん白質群は１つのアルフ
ァー鎖と１つのベータ鎖を有するヘテロダイマーからな
っている。抗原の各々のアルファー鎖は互いに異なるけ
れども、ベータ鎖はかなり一定に保たれていることが判
明している〔Sanchez−Madrid,F.等、J.Exper.Med.,15
8:1785−1803（1983）〕；糖たん白質群のベータ鎖（し
ばしば“CD18"と称される）は95KDの分子量を有するこ
とが見い出され、一方アルファー鎖は150KD−180KDで変
化することが見い出された〔Springer,T.等、Fed.Pro
c.,44:2660−2663（1985）〕。膜たん白質のアルファサ
ブユニットはベータサブユニットの有する広い相同性を
共有していないけれども、糖たん白質のアルファーサブ
ユニットの近似分析は両者の間に実質的に類似性がある
ことを示している。LFA−１関連糖たん白質のアルファ
ーおよびベータサブユニット間の類似性の検討はSanche
z Madrid,F.等によりなされている〔J.Exper.Med.,158:
586−602（1983）;J.Exper.Med.,185:1785−1803（198
3）〕。

白血球表面上の上記粘着たん白質群のいずれの１員の
正常量をも表現できない１群の人々の存在が確認されて
いる〔Anderson,D.C.等、Fed.Proc.,44:2671−2677（19
85）;Anderson,D.C.等、J.Infect.Dis.,152:668 689
（1985）〕。これらの患者からのリンパ球は、分子のCD
−18族が抗体により中和されている健常者に類似するイ
ンビトロ欠陥を示していた。さらにまた、上記の患者
は、その細胞の細胞基質への粘着能力がないことによ
り、正常な免疫応答を備えることができない〔Anderso
n,D.C.等、Fed.Proc.,44:2671−2677（1985）;Anderso
n,D.C.等、J.Infect.Dis.,152:668−689（1985）〕。こ
れらのデータは、リンパ球がCD−18族の機能的粘着分子
の欠如により正常な形で付着できない場合には、免疫反
応が緩和されることを示している。

即ち、要約すれば、動物の健康および生命力を維持す
るリンパ球の能力は、リンパ球が他の細胞（内皮細胞の
ような）に粘着できることを必要とする。この粘着はリ
ンパ球の細胞表面上に存在する特異的レセプター分子を
含む細胞−細胞接触を必要とすることが判明している。
これらのレセプターはリンパ球が他のリンパ球または内
皮および他の非血管細胞に粘着することを可能する。細
胞表面レセプター分子は相互に密接に関連することが判
明している。リンパ球が上記の細胞表面レセプター分子
を欠損しているヒトは慢性で再発生の感染症、および不
完全抗体応答を含む他の臨床的症状を示す。

リンパ球粘着は、外来組織が認識され拒絶される過程
に関与しているので、この過程の理解は臓器移植、組織
移植、アレルギーおよび腫瘍学の分野において著しく価
値がある。

発明の内容本発明は細胞間粘着分子−２（ICAM−２）およびその
機能性誘導体に関する。本発明はさらにICAM−２の機能
を抑制し得る抗体および抗体フラグメント、および他の
ICAM−２機能の阻害剤に関する。本発明はさらに上記分
子すべての診断および治療上の利用にも関する。

さらに詳細には、本発明は実質的に天然の異物を含ま
ない細胞間粘着分子ICAM−２またはその機能性誘導体を
包含する。

本発明は、更に以下に挙げるものからなる群から選ば
れる少なくとも一つのポリペプチドを含むICAM−２にも
係る。

（ａ）−Ｓ−Ｓ−Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ａ
−Ｌ−；（ｂ）−Ｄ−Ｅ−Ｋ−Ｖ−Ｆ−Ｅ−Ｖ−Ｈ−Ｖ−Ｒ−Ｐ
−Ｋ−；（ｃ）−Ｇ−Ｓ−Ｌ−Ｅ−Ｖ−Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｎ−；（ｄ）−Ｈ−Ｙ−Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｉ−Ｓ−Ｈ−Ｔ−Ｄ
−Ｖ−；（ｅ）−Ｓ−Ｍ−Ｎ−Ｓ−Ｎ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｙ−Ｑ−Ｐ
−Ｐ−；（ｆ）−Ｆ−Ｔ−Ｉ−Ｅ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ｐ−Ｔ−Ｖ−Ｅ
−Ｐ−；（ｇ）−Ｇ−Ｎ−Ｅ−Ｔ−Ｌ−Ｈ−Ｙ−Ｅ−Ｔ−Ｆ−Ｇ
−Ｋ−；（ｈ）−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｒ−Ｅ
−Ｄ−；（ｉ）−Ｈ−Ｒ−Ｎ−Ｆ−Ｓ−Ｃ−Ｌ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｄ
−Ｌ−；（ｊ）−Ｍ−Ｖ−Ｉ−Ｉ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ
−Ｌ−；（ｋ）−Ｓ−Ｌ−Ｆ−Ｖ−Ｔ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｃ−Ｆ
−Ｉ−；および（ｌ）−Ｍ−Ｇ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｒ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｒ
−Ｒ−．本発明は、またICAM−２またはその機能性誘導体をコ
ードもしくは表現し得る組換えまたは合成DNAをも提供
する。

本発明は更に、ICAM−２およびその機能性誘導体から
なる群から選ばれる分子に結合し得る抗体、特にモノク
ローナル抗体をも提供する。

本発明は、また上記モノクローナル抗体を産生し得る
ハイブリドーマ細胞を提供する。

本発明はICAM−２またはその機能性誘導体と結合し得
る抗体を産生する所定のハイブリドーマ細胞の樹立法を
も包含し、該方法は以下の工程を含む。

（ａ）ICAM−２表現細胞、ICAM−２表現細胞の膜、ICAM
−２、担体に結合したICAM−２、ICAM−２のペプチドフ
ラグメント、および担体に結合したICAM−２のペプチド
フラグメントからなる群から選ばれる免疫原で動物を免
疫し、（ｂ）該動物の脾細胞とミエローマ細胞系とを融合し、（ｃ）該融合した脾細胞およびミエローマ細胞に抗体分
泌ハイブリドーマ細胞を形成せしめ、および（ｄ）該ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、IC
AM−２と結合し得る抗体を産生できる所定のハイブリド
ーマ細胞を得る。

本発明は、また哺乳類罹患体における特異的防御シス
テムの応答に起因する炎症の治療法をも提供する。この
方法は、かかる治療を要する罹患体に、該炎症を抑制す
るに十分な量の抗炎症剤を投与することを含み、該抗炎
症剤がICAM−２に結合し得る抗体、ICAM−２に結合し得
る抗体フラグメント、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導
体、ICAM−１以外のICAM−２の非−Igアンタゴニストま
たはCD−18族分子の構成員からなる群から選ばれること
を特徴とする。

また、本発明は移動のためにCD−18（特にLFA−１）
の一員をもつ造血性腫瘍細胞の転移を抑制する方法をも
含み、該方法はこのような治療を必要とする患者に該転
移を抑制するのに十分な量の薬剤を投与することを含
み、該薬剤がICAM−２と結合し得る抗体、ICAM−２と結
合し得る毒素−誘発性（toxin−derivatized）抗体、IC
AM−２と結合し得る抗体フラグメント、ICAM−２と結合
し得る毒素−誘発性抗体フラグメント、ICAM−２、ICAM
−２の機能性誘導体、毒素−誘発性ICAM−２、および毒
素−誘発性ICAM−２の機能性誘導体、およびICAM−１以
外のICAM−２の非−IgアンタゴニストまたはCD−18族分
子の構成員からなる群から選ばれることを特徴とする。

また、本発明はICAM−２表現腫瘍細胞の成長を抑制す
る方法をも含み、該方法はこのような治療を要する患者
に、該抑制に十分な量の薬剤を投与することを含み、該
薬剤がICAM−２と結合し得る抗体、ICAM−２と結合し得
る毒素−誘発性抗体、ICAM−２と結合し得る抗体フラグ
メント、ICAM−２と結合し得る毒素−誘発性抗体フラグ
メント、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導体、ICAM−１
以外の、ICAM−２の非−IgアンタゴニストまたはCD−18
族分子の構成員、毒素−誘発性のCD−18族分子の構成
員、および毒素−誘発性の、CD−18族分子の構成員の機
能性誘導体からなる群から選ばれることを特徴とする。

本発明は、また以下の工程を含む、ICAM−２表現細胞
の存在を検出する方法をも提供する。

（ａ）ICAM−2mRNAにハイブリッド化し得る核酸分子の
存在下で該細胞またはその抽出物をインキュベートする
工程、および（ｂ）該核酸分子が、該細胞またはその抽出物中に存在
する相補的核酸分子にハイブリッドされたか否かを決定
する工程。

本発明は、更に以下の成分を含む薬理組成物をも提供
する。

（ａ）ICAM−２と結合し得る抗体、ICAM−２と結合し得
る抗体フラグメント、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導
体、およびICAM−１以外のICAM−２の非−Igアンタゴニ
ストまたはCD−18族分子の構成員からなる群から選ばれ
る抗−炎症剤単独、または（ｂ）免疫抑制剤との組合せ。

本発明の第１の局面はLFA−１に対する天然結合リガ
ンドの発見に関連する。細胞粘着の過程に関与するCD−
18族分子などの分子は“粘着分子（adhesion molecule
s）”と呼ぶ。

Ｉ LFA−１およびICAM−１白血球粘着分子LFA−１は広範囲のリンパ球、単球、N
K細胞および顆粒球の免疫および炎症における他の細胞
との相互作用を媒介する。（Springer T.A.等、Ann.Re
v.Immunol.,1987,５,pp.223−252〕。

LFA−１は細胞間粘着分子１（ICAM−１）に対するレ
セプタであり、表面分子は本質的にいくつかの組織上で
表現され、かつ他の炎症のある組織に誘起される（Marl
in,S.D.等、Cell,1987,51,pp.813−819;Dustin,M.L.
等、J.Immunol.,1986,137,pp.245−254;Dustin,M.L.
等、Immunol.Today,1988,９,pp.213−215;米国特許出願
第07/019,440（1987年２月26日付出願）および同第07/2
50,446（1988年９月28日付出願）；これら特許出願を本
発明の参考文献とする）。

LFA−１は他の細胞と、抗原特異的および抗原独立細
胞毒素性Ｔ細胞、ヘルパＴ細胞、NK細胞、顆粒球および
単球との相互作用において機能する（Springer,T.A.等,
Ann.Rev.Immunol.,1987,５,pp.223−252;Kishimoto,T.
K.等、Adv.Immunol.,（1988,投稿中））。LFA−１は非
共有結合的に結合した180および95KDのαおよびβ糖タ
ンパク質サブユニットをもつ白血球インテグリン（Ieuk
ocyte integrin）である。

ICAM−１は細胞の型の違いによって76〜114KDで質量
が変動する一本鎖糖タンパクであり、かつ５個のＣ−状
ドメインをもつIgスーパーファミリーの一員である〔Du
stin,M.L.等、Immunol.Today,1988,９,pp.213−215;Sta
unton,D.E.等、Cell,1988,52,pp.925−933;Simmons,D.
等、Nature,1988,331,pp.624−627〕。ICAM−１はIFN−
γ、TNFおよびIL−１を含むサイトカインにより様々な
型の細胞上で高い誘発性を示す〔Dustin,M.L.等、Immun
ol.Today,1988,９,pp.213−215）。上皮細胞、内皮細胞
および繊維芽細胞上でのICAM−１の誘発はリンパ球のLF
A−１依存性粘着を媒介する〔Dustin,M.L.等、J.Immuno
l.,1986,137,pp245−254;Dustin,M.L.等、J.Exp.Med.,1
988,167,pp.1323−1340）。付着はLFA−1MAbでリンパ球
を前処理もしくはICAM−1MAbで他の細胞を前処理するこ
とにより阻止される（Dustin,M.L.等、J.Immunol.,198
6,137,pp.245−254;Dustin,M.L.等、J.Cell Biol.,198
8,107,pp.321−331;Dustin,M.L.等、J.Exp.Med.,1988,1
67,pp.1323−1340）。人工膜またはペトリ皿上での精製
ICAM−１による等価な結果はLFA−１およびICAM−１が
相互にレセプタであることを証明している（Marlin,S.
D.等、Cell,1987,51,pp.813−819;Makgoba,M.W.等、Nat
ure,1988,331,pp,86−88）。明確化のために、これらを
ここでは夫々“レセプタ”および“リガンド”と呼ぶこ
とにする。ICAM−１については更に米国特許出願第07/0
45,963;07/115,798;07/155,943;07/189,815または07/25
0,446に与えられており、これらを本発明の参考文献と
する。

II ICAM−２ ICAM−１とは異る第２のLFA−１リガンドが提示され
ている（Rothlein,R.等、J.Immunol.,1986,137,pp.1270
−1274;Makgoba,M.W.等Eur.J.Immunol.,1988,18,pp.637
−640;Dustin,M.L.等、J.Cell Biol.,1988,107,pp.321
−331）。本発明はこの第２のリガンド（“ICAM−2"と
命名された“細胞間粘着分子−2"）に関する。

ICAM−２は細胞内分布およびサイトカイニン誘発性に
乏しい点でICAM−１と異っている。ICAM−２は２つのIg
−様ドメインをもつ接合膜タンパクであり、一方ICAM−
１は５つのIg−様ドメインをもつ（Staunton,D.E.等、C
ell,1988,52,pp.925−933;Simmons,D.等、Nature,1988,
331,pp.624−627）。注目すべきことに、ICAM−２は、I
CAM−１またはICAM−２のいずれかがIgスーパーファミ
リーの他の構成員と関連している以上にずっとICAM−１
の２つの最もＮ−末端側のドメインに密接に関係してお
り（34％の同一性）、このことは同一のインテグリン族
レセプタに結合するIg−様リガンドのサブファミリであ
ることを証拠付けている。

III ICAM−２のcDNAクローニング種々の手順のいずれもICAM−２遺伝子のクローニング
に用いることができる。このような方法の一つは、ICAM
−２遺伝子を含むインサートの存在に対して、ICAM−２
表現細胞由来のcDNAインサートのシャトルベクターライ
ブラリーの解析を必要とする。このような解析は、細胞
を該ベクタで移入し、次いでICAM−２の表現について検
定することにより行うことができる。

ICAM−2cDNAは好ましくはアルフォ＆シード（Aruffo
and Seed）の方法（Seed,B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,1987,84,pp.3365−3369）の新規な改良法を付着分子
のリガンド同定に用いる際に同定される。この方法にお
いて、cDNAライブラリーは、ICAM−２を表現する細胞
（例えば内皮細胞またはRamos.BBN Ｂリンパ芽球様、U
937単球またはSKW3リンパ芽球様細胞系）から調製され
る。好ましくは、cDNAライブラリーは内皮細胞から調製
される。このライブラリーは正常にICAM−２を表現しな
い細胞（COS細胞など）をトランスフェクションするの
に用いられる。この移入細胞は予めLFA−１で被覆され
たペトリ皿に導入される。ICAM−１またはICAM−２のい
ずれかをコードする配列でトランスフェクションされか
つ細胞表面でこれらリガンドのいずれかを表現するCOS
細胞は該ペトリ皿上のLFA−１に付着する。非付着細胞
を洗い流し、次に付着細胞をペトリ皿から取出し、培養
する。次に、これら細胞中の組換えICAM−１またはICAM
−２表現配列を取出し、かつ配列決定してICAM−１また
はICAM−２をコードするか否かを決定する。

上記方法の好ましい態様において、抗−ICAM−１抗体
を該ペトリ皿に加えて、ICAM−１表現細胞の付着を防止
する。ICAM−２移入COS細胞のLFA−１への結合はEDTAお
よび抗−LFA−１モノクローナル抗体（“MAb"）によっ
て阻害されるが抗−ICAM−1MAbによっては阻害されな
い。かくして、この態様においてはICAM−１表現細胞は
ICAM−１を介してペトリ皿に付着することができず、従
って他の非付着細胞のすべてと共に殆ど洗い流されてし
まう。結局、ICAM−２表現細胞のみが該ペトリ皿に付着
できる。

かくして、cDNAクローンは、COS細胞中での表現によ
って、かつ予めプラスチック製ペトリ皿に結合されてい
た機能的に活性な精製LFA−１を用いた、リガンド担持C
OS細胞のパンニングによってスクリーニングされる。パ
ンニングの後、非付着細胞はICAM−2⁺細胞を含まず、一
方EDTAによってLFA−１被覆プラスチックから遊離する
付着細胞は殆ど完全にICAM−2⁺である。ICAM−1⁺細胞の
LFA−１被覆プラスチックへの付着はRR1/1抗−ICAM−1M
Abにより阻害できる。

こうして、このICAM−２のcDNAクローニング法によれ
ば、cDNAライブラリーが内皮細胞から調製され、このこ
とは適当なプラスミド、例えばプラスミドベクタCDM8を
用いるLFA−１依存付着のICAM−１依存およびICAM−１
独立成分両者の存在を明らかにする（Dustin,M.L.等、
J.Cell Biol.,1988,107,pp.321−331）。移入COS細胞
は、ICAM−1cDNAの単離の可能性を減じる目的で存在す
る抗−ICAM−1MAbと共にLFA−１被覆ペトリ皿中でイン
キュベートされる。付着細胞をEDTAで溶出し、プラスミ
ドを単離し、E.コリ中で増殖する。トランスフェクショ
ン、付着およびプラスミド単離の約３回の繰返し並びに
一回のサイズ分画の後、プラスミドは制限エンドヌクレ
アーゼ消化により解析できる。トランスフェクションに
よりCOS細胞中に導入した場合、1.0kbより大きなインサ
ートをもつプラスミドの約1/3がLFA−１への付着を生じ
た。

また、ICAM−２のcDNAクローンは遺伝子コード（Wats
on,J.D.,Menlo Park,CA,1977,pp.356−357）を用いて得
ることができ、ICAM−２タンパクをコードし得るポリヌ
クレオチドの配列決定が可能である。

ICAM−2cDNAのクローンは、また該ICAM−２タンパク
のペプチドフラグメントのアミノ酸配列を同定し、次い
で、該遺伝子コードを用いて該ICAM−２ペプチドをコー
ドし得るオリゴヌクレオチドプローブ分子を構築するこ
とによっても得ることができる。次に、このプローブを
用いて、ICAM−２タンパクをコードするcDNAライブラリ
ー（ICAM−２表現細胞のcDNAから調製）のこれら構成員
を（ハイブリダイゼーションを介して）検出する。

上記の技術あるいはこれらに準じた技術は、ヒトアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（Hsu,L.C.等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,1985,82,pp.3771−3775）、フィブロネクチ
ン（Suzuki,S.等、Eur.Mol.Biol.Organ.J.,1985,４,pp.
2519−2524）、ヒトエストロゲンレセプタ遺伝子（Walt
er,P.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1985,82,pp.7889−7
893）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（Pennica,
D.等、Nature,1983,301,pp.214−221）およびヒト胎盤
アルカリホスファターゼcDNA（Kam,W.等、Proc.Natl.Ac
ed.Sci.USA,1985,82,pp.8715−8719）の遺伝子を首尾よ
くクローニングできる。

更に別のICAM−２遺伝子のクローニング法では、表現
ベクタのライブラリーは、ICAM−２を表現できる細胞か
らのDNA、より好ましくはcDNAを表現ベクタ中にクロー
ニングすることにより調製される。次いで、このライブ
ラリーを抗−ICAM−２抗体に結合し、かつICAM−２また
はそのフラグメントと同一の酸配列をもつペプチドをコ
ードできるヌクレオチド配列をもつタンパクを表現でき
るものについてスクリーニングする。

上記方法のいずれかを用いて得られたクローン化ICAM
−２遺伝子は表現ベクタに機能発現できるように結合で
き、かつバクテリアまたは真核細胞に導入してICAM−２
タンパクを得ることができる。このような処理法はMani
atis,T.等（上記文献）により記載され、当分野で周知
である。

IV.本発明の薬品:ICAM−２およびその機能性誘導体、ア
ゴニストおよびアンタゴニスト本発明はICMA−２、その“機能性誘導体”、並びにそ
の“アゴニスト”および“アンタゴニスト”を目的とす
る。

A.ICAM−２の機能性誘導体 ICAM−２の“機能性誘導体”はICAM−２の生物活性に
実質的に類似する生物活性（機能並びに構造のいずれか
もしくは両者）を有する化合物である。用語“機能性誘
導体”とは分子の“フラグメント”、“変異体”、“類
似体”または“化学的誘導体”を含むものとする。

分子、例えばICAM−２の“フラグメント”は該分子の
任意のポリペプチドサブセットを言うものとする。ICAM
−２活性のあるしかも可溶性（即ち膜結合性のない）で
あるICAM−２のフラグメントは特に好ましい。

ICAM−２などの分子の“変異体”とは完全な該分子ま
たはそのフラグメントのいずれかと構造並びに機能の点
で実質的に類似する分子をいうものとする。

ICAM−２などの分子の“類似体”とは完全な該分子ま
たはそのフラグメントのいずれかと機能の点で実質的に
類似する分子をいうものとする。

両分子が実質的に類似する構造をもつ場合あるいは両
者が同様な生物活性をもつ場合に、一方の分子が他方の
分子に“実質的に類似”するという。かくして、２つの
分子が同様な活性をもっていれば、これらは変異体であ
ると考える。この用語は、ここでは、一方の分子の構造
が他方中に見出されなくとも、あるいはアミノ酸残基配
列が同等でなくとも使用する。

ここでは、ある分子が通常他の分子の一部をなさない
付随的な化学的部分を含む場合に、該分子を該他の分子
の“化学的誘導体”という。かかる部分は該分子の溶解
性、吸収性、生物学的半減期などを改善できる。これら
部分は、また該分子の毒性を減じ、該分子の望ましから
ぬあらゆる副作用などを排除もしくは減衰できる。この
ような作用をになうことのできる部分はRemington's Ph
armaceutical Sciences,1980に開示されている。

“毒素−誘発性”分子は“化学的誘導体”の特定の組
を構成する。“毒素−誘発性”分子は毒素部分を含む分
子（例えばICAM−２または抗体）である。このような分
子の細胞への結合は該毒素部分が該細胞近傍にもたらさ
れることになり、そのため細胞の死を早める。任意の適
当な毒素部分を用いることができるが、例えばリシン毒
素、コレラ毒素、ジフテリア毒素、放射性毒素、膜−チ
ャンネル−形成毒素などの毒素を用いることが好まし
い。このような毒素成分と分子とのカップリング手順は
当分野で周知である。

約100残基までをもつICAM−２の機能性誘導体がイン
ビトロ合成で有利に調製できる。必要ならば、かかるフ
ラグメントは、精製または粗製タンパクのターゲットア
ミノ酸残基を選ばれた側鎖または末端残基と反応性の有
機誘導体形成剤と反応させることにより変性できる。得
られる共有結合性誘導体は生物活性に重要な残基の同定
のために用いることができる。

最も一般的に、システィニル残基をα−ハロアセテー
ト（および対応するアミン）、例えばクロル酢酸または
クロロアセタミドと反応させて、カルボキシメチルまた
はカルボキシアミドメチル誘導体とすることができる。
システィニル残基も、ブロモトリフルオロアセトン、α
−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、ク
ロロアセチル燐酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニト
ロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジ
スルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロ
メルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニ
トロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応に
より誘導体化される。

ヒスチジル残基からは、pH5.5〜7.0にてジエチルプロ
カーボネートとの反応により誘導体が得られる。という
のは、この試薬はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的
であるからである。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも使
用でき、この反応は、好ましくはpH6.0にて0.1Mナトリ
ウムカコジレート中で行う。

リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他の
無水カルボン酸と反応される。これら試薬での誘導体形
成はリジニル残基の電荷を反転する効果をもつ。α−ア
ミノ−含有残基を誘導するのに適した他の反応体はイミ
ドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリド
キサル燐酸エステル、ピリドキサル、クロロボロハイド
ライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、ｏ−メチル−
イスレア、2,4−ペンタンジオン、およびグリオキシレ
ートとのトランスアミナーゼ触媒反応を包含する。

アルギニル残基は一または数種の公知の反応体、特に
フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シ
クロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によ
り変性できる。アルギニン残基の誘導体形成は、この反
応をアルカリ条件下で行うことを必要とする。というの
はグアニジン官能基が高いpKa値をもつからである。更
に、これらの試薬はリジン並びにアルギニンε−アミノ
基と反応できる。

チロシル残基自体の特異的な修飾が広範に研究され、
特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタ
ンとの反応によるチロシル基へのスペクトル標識の導入
に興味がもたれている。最も一般的に、Ｎ−アセチルイ
ミジゾールおよびテトラニトロメタンが夫々ｏ−アセチ
ルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成するのに用
いられる。チロシル基は¹²⁵Iまたは¹³¹Iでヨウ素化され
て、ラジオイムノアッセイで用いる標識タンパク（クロ
ラミンＴ法が適している）が調製される。

カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）
はカルボジイミド（R¹−Ｎ−Ｃ−Ｎ−R¹）、例えば１−
シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチ
ル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾ
ニア−4,4−ジメチルペンチル）−カルボジイミドなど
によって選択的に修飾される。更に、アスパルチルおよ
びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によっ
てアスバラギニルおよびグルタミニル残基に転化され
る。

二官能性試薬による誘導体形成は、ICAM−２機能性誘
導体化合物を、水不溶性支持マトリクス、またはICAM−
２機能性誘導体融合ポリペプチドを開裂して該開裂ポリ
ペプチドを遊離し回収する方法で用いる表面に架橋する
のに利用される。一般に使われる架橋剤は、例えば1,1
−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グル
タルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二
官能性イミドエステル（3,3′−ジチオビス（サクシン
イミジルプロピオネート）などのジサクシンイミジルエ
ステルを包含する）、および二官能性マレイミド、例え
ばビス−Ｎ−マレイミド−1,8−オクタンなどを含む。
メチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピ
オンイミデートなどの誘導体形成剤は光の存在下で架橋
形成し得る光活性化性の中間体を与える。また、反応性
水−不溶性マトリックス、例えばシアノゲンブロミド−
活性化炭水化物および米国特許第3,969,287号、同第3,6
91,016号、同第4,195,128号、同4,247,642号、同第4,22
9,537号および同第4,330,440号に記載されている反応性
基質がタンパクの固定化に用いられる。

グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱
アミド化されて、対応するグルタミルおよびアスパルチ
ル残基とされる。また、これらの残基は緩めな酸性条件
下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形状も本
発明の範囲内にはいる。

その他の修飾はプロリンおよびリジンのヒドロキシル
化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のホ
スホリル化、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの側
鎖にα−アミノ基のメチル化（T.E.Creighton,Protein
s:Structure and Molecule Properties,W.H.Freeman ＆
Co.,San Francisco,1983,pp.79−86）,N−末端アミン
のアセチル化、およびいくつかの例におけるＣ−末端カ
ルボキシル基のアミド化を包含する。

変更されたアミノ酸配列をもつICAM−２の機能性誘導
体もDNAの変異によって調製できる。ICAM−２遺伝子を
コードするヌクレオチド配列は第２図に示されている。
このような変異は、例えば第２図に示されたアミノ酸配
列内の残基の除去、挿入または置換を含む。最終的な構
築に到達するべく除去、挿入および置換の任意の組合を
行うことができる。但し、最終的な構築体が所定の活性
をもたなければならない。明らかに、この変異体をコー
ドするDNAにおいてなすことのできる変異は読取り枠以
外にシーケンスを配置してはならず、かつ好ましくは二
次的なmRNA構造を生成し得る相補的領域を形成してはな
らない（欧州特許出願公開第75,444号参照）。

遺伝子レベルで、通常これらの機能性誘導体は、ICAM
−２分子をコードするDNA中のヌクレオチドのサイト−
特異的変異誘発によって調製され、それによって該機能
性誘導体をコードするDNAを得、次いで組換え細胞培養
で該DNAを表現する。これら機能性誘導体は、典型的に
は天然産の類似体と同じ定性的生物活性を示す。しか
し、これら正常に作られたICAM−２分子に関するこのよ
うな特性とは全く異っている。

アミノ酸配列変異を導入するためのサイトは予め決め
られているが、変異自体は予め決める必要はない。例え
ば、所定サイトの変異の性能を最適化するためには、無
秩序な変異誘発をターゲットコドンまたは領域にて行っ
て、表現されたICAM−２の機能性誘導体を所定の活性の
最適の組合せについてスクリーニングできる。既知配列
をもつDNA中の所定サイトで置換変異を行う技術は周知
であり、例えば部位特異的変異誘発法である。

本発明に従うICAM−２機能性誘導体分子の調製は、初
期に調製された機能性誘導体またはタンパクの非変異バ
ージョン（version）をコードするDNAの部位特異的変異
誘発により達成することが好ましい。部位特異的変異誘
発は、所定の変異体のDNA配列をコードする特定のオリ
ゴヌクレオチド配列並びに十分な数の隣接ヌクレオチド
を用いてICAM−２機能性誘導体を調節することを可能と
し、十分なサイズのプライマー配列および配列の複雑性
を与え、ふさがれている除去接合の両側に安定な二重螺
線を形成できる。典型的には、長さ約20〜25ヌクレオチ
ドのプライマーは好ましくは、変更された配列の接合部
の両側に約５〜10残基をもつ。一般に、例えばAdelman
等の、DNA、1983、２、p.183（これを本発明の参考文献
とする）などの刊行物に例示されているように、部位特
異的変異誘発技術は当分野で周知である。

理解されるように、部位特異的変異誘発法は典型的に
一本鎖または二本鎖形で存在するファージベクタを用い
る。部位特異的変異誘発で有用な典型的なベクタは、NB
ファージ、例えばMessing等、Third Cleveland Symposi
um on Macromolecules and Recombinant DNA,A.Walton
編、エルセビア刊、アムステルダム、（1981）（これを
本発明の参考文献とする）に記載されているようなベク
タを包含する。これらファージは市販品として容易に入
手でき、その使用は当業者には一般に周知である。ま
た、複製の一本鎖ファージ開始点を含むプラスミドベク
タ（Veira,等、Meth.Enzymol.1987,153,p.3）を一本鎖D
NAを得るのに用いることができる。

一般に、本発明による部位特異的変異誘発は、まず配
列内に関連タンパクをコードするDNA配列を含む一本鎖
ベクタを得ることで行われる。所定の変位配列をもつオ
リゴヌクレオチドプライマーを、一般には例えばCrea等
のProc.Natl.Acad.Sci.USA,1978,75,p.5765に記載の方
法によって合成により調製される。次に、このプライマ
ーを一本鎖タンパク−配列−含有ベクタと共にアニール
し、DNA重合酵素、例えばE.コリポリメラーゼクレノウ
フラグメントの作用に付して変異をもつストランドの合
成を完了する。かくして、変異配列および第２ストラン
ドは所定の変異をもつ。次に、このヘテロ二重鎖ベクタ
を用いて適当な細胞を形質転換する。細胞としては、例
えばJM101細胞が用いられ、変異配列配置をもつ組換え
ベクタを含むクローンが選別される。

このクローンの選別後、変異を受けたタンパク領域を
取出し、タンパク生産のために適当なベクタ、一般には
適当なホストの形質転換に用いることのできる型の表現
ベクタに入れることができる。

アミノ酸配列の除去は、一般に約１〜30、より好まし
くは１〜10残基でありおよび典型的には連続するもので
ある。除去部はIgドメイン、例えばICAM−２のドメイン
１または２を含んでいてもよい。アミノ酸配列挿入は１
残基から本質的には無限の長さのポリペプチドのアミノ
および／またはカルボキシル−末端融合体、並びに単一
のまたは複数のアミノ酸残基からなる配列内挿入を包含
する。配列内挿入（即ち、完全なICAM−２分子配列内の
挿入）は、一般には約１〜10、より好ましくは１〜５残
基の範囲であり得る。末端挿入の例は、ホスト細胞に対
し異種であろうが同種であろうが、シグナル配列の該分
子のＮ−末端に融合して、組換えホストからのICAM−２
機能性誘導体の分泌を容易にすることを含む。

機能性誘導体の第３の群は、少なくとも一つのICAM−
２分子中のアミノ酸残基、好ましくはその一つが除か
れ、かつ異る残基がその位置に挿入されたものである。
好ましくは、このような置換は、ICAM−２分子の特性を
精巧に変調しようとする場合には、以下の表に従って行
われる。

第１表元の残基置換の例 Ala gly;ser Arg lys Asn gln;his Asp glu Cys ser Gln asn Glu asp Gly ala;pro His asn;gln Ile leu;val Leu ile;val Lys arg;gln;glu Met leu;tyr;ile Phe met;leu;tyr Ser thr Thr ser Trp tyr Tyr trp;phe Val ile;leu 機能または免疫学的同等性における大きな変化は、第
１表に与えられたものよりも保存性の低い置換を選択す
ることにより、即ち（ａ）置換領域におけるポリペプチ
ド骨格の構造、例えばシートまたはヘリックス構造、
（ｂ）ターゲットサイトの分子の電荷または疎水性、ま
たは（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に及ぼす残基の効果の点
でより大幅に異っている残基を選択することにより行わ
れる。一般に、期待される置換は（ａ）グリシンおよび
／またはプロリンが他のアミノ酸で置換されるか、ある
いは除去または挿入され、（ｂ）親水性残基、例えばセ
リルまたはスレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、
イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニ
ルで置換され、（ｃ）システイン残基が任意の他の残基
で置換され、（ｄ）電気的に正の側鎖をもつ残基、例え
ばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが負電荷をも
つ残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルで置換さ
れ、あるいは（ｅ）嵩高な側鎖、例えばフェニルアラニ
ンを有する残基が、このような側鎖のないもの、例えば
グリシンで置換されているものである。

多くの除去および挿入、特に置換はICAM−２分子の特
性の激しい変更を生じないものと期待される。しかし、
置換、除去または挿入の正確な効果を、これらの実施前
に予測することが困難である場合には、当業者は、この
効果が日常のスクリーニングアッセイにより評価される
ことを理解するであろう。例えば、機能性誘導体は典型
的に元のICAM−２分子−コード核酸の部位特異的変異誘
発、組換え細胞培養での変異核酸の表現および場合によ
っては細胞培養物からの精製、例えば抗−ICAM−２分子
抗体カラム（少なくとも一つの残留エピトープへの結合
により機能性誘導体を吸収するためのもの）上での免疫
親和性吸着による精製によって行われる。

ICAM−２のアフィニティーを増すように工夫された変
異は、ICAM−１における相同位置に存在するアミノ酸残
基の導入により導くことができる。同様に、このような
変異ICAM−２分子は、ICAM−１との相同位置においてＮ
−結合CHOが欠除するように調製することもできる。

次いで、細胞溶解液または精製したICAM−１分子の機
能性誘導体の活性を、所定の特性に関する適当なスクリ
ーニングアッセイでスクリーニングする。例えば、機能
性誘導体の免疫学的特徴、例えば所定の抗体に対する親
和性における変化を拮抗型のイムノアッセイで測定す
る。免疫修飾活性の変化は適当なアッセイで測定され
る。このようなタンパク特性、例えば酸化還元または熱
安定性、生物学的半減期、疎水性、タンパク分解酵素に
よる分解に対する感受性またはキャリヤとの凝集傾向も
しくはマルチマーへの凝集傾向などの変更は当業者には
周知の方法で検定される。

B.ICAM−２のアゴニストおよびアンタゴニスト ICAM−２の“アゴニスト”はICAM−２の生物的機能の
いずれかを発揮する能力を高める化合物である。このよ
うなアゴニストの一例は、ICAM−２が細胞レセプタまた
はウイルスタンパクに結合する能力を増大するものであ
る。

ICAM−２の“アンタゴニスト”は、ICAM−２がその生
物的機能のいずれかを発揮する能力を減衰もしくは阻害
する化合物である。このようなアンタゴニストの例はIC
AM−１、ICAM−１の機能性誘導体、抗−ICAM−２抗体、
抗−LFA−１抗体などを包含する。

米国特許出願第07/045,963号、同第07/115,798号、同
第07/155,943号、同第07/189,815号または同第07/250,4
46（これらすべてを本発明の参考文献とする）に記載さ
れている細胞凝集アッセイは、LFA−１依存性凝集の測
定を可能とし、かつICAM−2/LFA−１凝集の程度に影響
を与える試薬を同定するのに用いることができる。即
ち、このようなアッセイはICAM−２のアゴニストおよび
アンタゴニストの同定に利用できる。アンタゴニストは
LFA−１またはICAM−２の凝集媒介能を劣化するよう機
能し得る。また、上記アッセイを用いて、非Ig（即ち、
化学的）試薬を調べて、これらがICAM−2/LFA−１凝集
のアゴニストであるか、あるいはアンタゴニストである
かを調べることができる。

C.抗−ICAM−２抗体本発明の好ましいIgアンタゴニストはICAM−２に対す
る抗体である。適当な抗体は様々な方法のいずれによっ
ても得ることができる。

抗原分子、例えばICAM−２は当然リンパ球の表面上に
表現される。従って、例えば腹腔内注射などにより適当
な動物にこのような細胞を導入することにより、ICAM−
２またはCD−18族分子の構成員に結合し得る抗体が産生
される。必要ならば、このような動物の血清を取出し
て、これら分子に結合し得るポリクローナル抗体の源と
して用いることが可能である。

更に、抗−ICAM−２抗体はSelden,R.F.の方法（欧州
特許出願公開第289,034）またはSelden,R.F.等の方法
（Science,1987、236、pp.714−718）の準用により生成
できる。この方法の準用により、適当な動物（例えばマ
ウスなど）の細胞を、完全なICAM−２分子またはそのフ
ラグメントのいずれかを表現し得るベクタでトランスフ
ェクションする。該動物の移入細胞におけるICAM−２産
生は該動物中の免疫応答を誘起し、かつ該動物による抗
−ICAM−２抗体産生へと導く。

また、抗−ICAM2抗体は、ICAM−２またはそのペプチ
ドフラグメントを適当な動物に導入することによっても
作ることができる。この免疫動物はこのような曝露に応
答してポリクローナル抗体を産生する。ICAM−２のペプ
チドフラグメントを使用することは、動物を免疫するの
に用いたペプチドフラグメントに含まれるエピトープの
みと反応する領域特異的抗体を得ることを可能とする。

しかし、（上記のいずれかの方法で免疫された）動物
から脾細胞を取り出して、これをミエローマ細胞系と融
合し、かかる融合細胞にハイブリドーマ細胞（ICAM−２
と結合し得るモノクローナル抗体を分泌する）を形成す
ることが好ましい。

上記方法で得られるハイブリドーマ細胞を様々な方法
でスクリーニングして、ICAM−２と結合し得る抗体を分
泌する所定のハイブリドーマ細胞を同定できる。好まし
いスクリーニングアッセイにおいて、このような分子は
ICAM−２−表現、ICAM−１−非表現細胞の凝集を阻害す
る能力によって同定される。次いで、このような凝集を
阻止し得る抗体を更にスクリーニングして、これらがIC
AM−２に、あるいはCD−18族分子の構成員と結合してか
かる凝集を阻害するか否かを決定する。ICAM−２をCD−
18族分子の構成員から識別できる任意の手段がこのスク
リーニングで利用できる。即ち、例えばこの抗体により
結合した抗原は免疫沈殿法およびアクリルアミドゲル電
気泳動法などにより解析できる。CD−18族分子の構成員
に結合する抗体と、ICAM−２に結合するものとの間の識
別は、LFA−１を表現するがICAM−２を表現しない（逆
も同様）細胞に対する結合能のある抗体につきスクリー
ニングすることにより可能となる。LFA−１を表現する
が、ICAM−２を表現しない細胞に対する抗体の結合能は
当業者により一般に用いられている手段によって検出で
きる。このような手段はイムノアッセイ（特に免疫螢光
法を用いるもの）、細胞凝集、フィルタ結合法、抗体沈
殿法などを含む。

上記ICAM−２の機能性誘導体に加えて、ウイルス感染
または炎症の治療のために本発明に従って使用できる他
の薬剤はICAM−２に対する抗体、抗−ICAM−２抗体に対
する抗イディオタイプ抗体、およびICAM−２に結合し得
るレセプタ分子、またはこのような分子のフラグメント
を包含する。

使用できるICAM−２（またはその機能性誘導体）に対
する抗体はポリクローナル、モノクローナルのいずれで
あってもよい。

本発明で興味ある抗−イディオタイプ抗体はICAM−２
と拮抗的に（あるいは排他的に）結合し得る。このよう
な抗体は、例えば抗−ICAM−２抗体に対する抗体を生成
せしめ、次いでICAM−２の天然結合リガンドに対する結
合能につき該抗体をスクリーニングすることにより得る
ことができる。

CD−18族の分子はICAM−２に結合できるので、かかる
分子の投与（例えば、αおよびβサブユニット両者をも
つヘテロダイマーとして、あるいはαまたはβサブユニ
ットのみからなる分子として、あるいはこれらサブユニ
ットのいずれかまたは両者のフラグメントをもつ分子と
して）は細胞上にあるICAM−２に結合するHRVと拮抗し
（あるいはこれを排除）することができる。

本発明の抗−凝集抗体は様々な方法で同定しかつ力価
の決定を行うことができる。例えば、ICAM−２表現細胞
（例えば活性化内皮細胞）に特異的に結合する抗体の能
力、およびICAM−２を表現しない細胞に対する非結合能
を測定することができる。細胞凝集の適当なアッセイは
米国特許出願第07/045,963号、同第07/115,798号、同第
07/155,943号、同第07/189,815号または同第07/250,446
（これを本発明の参考文献とする）に記載されている。
また、該抗体のICAM−２に対する結合容量あるいはICAM
−２のペプチドフラグメントに対する結合容量を測定す
ることMOできる。当業者には容易に理解されるように、
上記アッセイは変更でき、あるいは異る順序で行って様
々な可能なスクリーニングを得ることができ、その各々
はICAM−１に結合し得る抗体と、CD−18族分子の構成員
に対する結合抗体とを同定し、かつ識別することができ
る。

より好ましい方法において、ICAM−２を表現するCOS
細胞に対する結合能をもつが、ICAM−２を表現しないCO
S細胞には結合しないことについて、抗体を選別するこ
とができる。

D.本発明の薬剤の調製本発明の薬剤は自然法（例えば、動物、植物、真菌、
菌などにICAM−２の非−Igアンタゴニスト産生を誘発す
ることにより、あるいは動物にICAM−２に結合し得るポ
リクローナル抗体産生を誘起することにより）、合成法
（例えば、ペプチド合成のメリフィールド法を用いてIC
AM−２、その機能性誘導体あるいは（Igまたは非−Ig型
の）ICAM−２のタンパクアンタゴニストを合成）、ハイ
ブリドーマ法（例えば、ICAM−２に結合し得るモノクロ
ーナル抗体産生用の）、あるいは組換え技術（例えば、
様々なホスト（即ち、酵母、菌、真菌、培養哺乳動物細
胞など）に本発明の薬剤を産生させるか、あるいは組換
えプラスミドもしくはウイルスベクタからの産生）など
によって得ることができる。いずれの方法を用いるかの
選択は便利さ、所定の収率などといったファクタに依存
する。上記方法、工程あるいは技術の一つだけを用いて
特定の抗−炎症剤を生成する必要はなく、特定の薬剤を
得るべくこれらを任意に組合せることが可能である。

V.ICAM−２、その機能性誘導体、アゴニストおよびアン
タゴニストの使用 A.炎症の抑制本発明の一局面はICAM−２およびその機能性誘導体が
CD−18族分子特にLFA−１のレセプタあるいはウイルス
タンパク（例えば、ライノウイルスなどのタンパク）と
相互作用する能力をもつことに由来する。ICAM−２の、
糖タンパクのCD−18族の構成員との相互作用能のため
に、炎症を抑制（即ち、阻止もしくは減衰）するのにこ
れを用いることができる。

ここで使う“炎症（inflammation）”なる用語は特異
的防御系の反応および非特異的防御系の反応両者を含む
ものとする。

ここで用いる“特異的防御系”とは、特異的抗原の存
在に対して反応する免疫系のそのような成分をいうもの
とする。炎症は、これが該特異的防御系によって、これ
を媒介としてあるいはこれに関連して引起こされる場合
には、該特異的防御系の応答の結果であるといわれる。
特異的防御系の応答の結果生ずる炎症の例は風疹ウイル
スなどの抗原に対する応答、自己免疫患者、遅延型のＴ
−細胞によって媒介される過敏性応答（例えばマント
（Mantaux）テストで“正”とみなされた患者にみられ
る）などを含む。慢性炎症性疾患および移植臓器および
組織の拒絶も特異的防御系の炎症性反応の例である。

本明細書で用いるような“非特異的防御系”の反応
は、免疫記憶の不可能な白血球により媒介される反応を
いうものとする。このような細胞は顆粒球およびマクロ
ファージを含む。ここでいう炎症は、これが非特異的防
御系によって生じ、これによって媒介されもしくはこれ
に関連して発生する場合、非特異的防御系の応答の結果
として生ずるといわれる。少なくとも部分的にこの非特
異的防御系の反応に起因する炎症の例は、成人呼吸困難
症候群（ARDS）、敗血症または外傷にとって二次的な多
発性臓器傷害症候群、心筋または他の組織の再かん流傷
害、急性系球体腎炎、反応性関節炎、急性炎症性成分を
有する皮膚疾患、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経
系炎症性疾患、熱傷害、血液透析、白血球除去血輸血、
潰瘍性大腸炎、クローン疾患、壊死性全腸炎、顆粒球輸
液関連症候群およびサイトカイニン誘発毒性などの状態
に関連した炎症を包含する。

上記のように、ICAM−２分子のCD−18族分子の構成員
に対する結合は細胞付着にとって最も重要である。付着
過程を通して、リンパ球は外因性抗原の存在に対して、
常に動物を監視できる。これらの過程は通常は望ましい
が、これらは同様に臓器移植拒絶、組織移植拒絶並びに
多くの自己免疫疾患の原因となっている。従って、細胞
付着を減衰もしくは阻害できる何等かの手段が、臓器移
植（特に腎移植）、組織移植の受容者または自己免疫疾
患々者において切望されている。

CD−18族の構成員に対するモノクローナル抗体は、内
皮への結合を含む白血球の多くの付着依存性機能（Hask
ard,D.等、J.Immunol.,1986、137、pp.2901−2906）、
ホモタイプ付着（Rothlein,R.等、J.Exp.Med.,1986、16
3、pp.1132−1149）、リンパ球の抗原およびマイトジェ
ン誘起性増殖（Davignon,D.等、Proc.Natl.Acad.Sci.,U
SA,1981,78,pp.4535−4539）、抗体形成（Fischer,A.
等、J.Immunol.,1986、136、pp.3198−3203）および細
胞毒性Ｔ−細胞の溶解活性などのすべての白血球のエフ
ェクタ機能（Krensky,A.M.等、J.Immunol.,1984、132、
pp.2180−2182）、マクロファージ（Strassman,G.等、
J.Immunol.,1986、136、pp.4328−4333）並びに抗体−
依存性細胞毒性反応に関与するすべての細胞（Kohl,S.
等、J.Immunol.,1984、133、pp.2972−2978）を阻害す
る。上記機能のすべてにおいて、抗体は白血球の適当な
細胞基質に対する結合能を阻害し、これは順次最終的な
結果を阻害する。これらがICAM−2/LFA−１相互作用を
含む限りにおいて、かかる機能は抗−ICAM−２抗体によ
り抑制できる。

かくして、ICAM−２に結合し得るモノクローナル抗体
は哺乳類罹患体における抗−炎症剤として用いることが
できる。このような薬剤は、一般的な抗−炎症剤と、該
薬剤が選択的に付着を阻害し、かつ従来の薬剤でみられ
た腎毒性などの他の副作用をもたらさないという点にお
いて著しく異る。

ICAM−２は、特に溶解型で、CD−18族の構成員に対し
て抗体と同様に作用できるので、炎症を抑制できる。そ
の上、ICAM−２の機能性誘導体およびアンタゴニストも
炎症の抑制に使用できる。

1.遅延型過敏性反応のサプレッサー ICAM−２分子は、部分的に、遅延型過敏性反応などの
炎症反応の開始に必要な付着事象を媒介する。従って、
ICAM−２分子に結合し得る抗体（特にモノクローナル抗
体）はこのような反応の減衰または排除における治療上
の可能性をもつ。

また、ICAM−２はICAM/LFA−１相互作用のアンタゴニ
ストであるから、ICAM−２（特に可溶化型のもの）また
はその機能性誘導体は遅延型過敏症反応を抑制し得る。

これらの有力な治療上の用途は２つの方法のいずれか
で実現できる。その第１は、ICAM−２に対するモノクロ
ーナル抗体含有組成物を遅延型過敏症反応に罹っている
患者に投与することである。例えば、このような組成物
を抗原、例えばキズタ毒、オーク毒などに接触している
ヒトに与える。第２の態様では、ICAM−２に結合し得る
モノクローナル抗体を抗原と共に患者に投与して、後の
炎症反応を防止する。かくして、ICAM−２結合モノクロ
ーナル抗体と共に付随的に抗原を投与することにより、
一時的に該抗原の後の発現に対し患者を寛容化できる。

2.慢性炎症性疾患の治療 LAD患者はLFA−１に乏しく炎症反応を開始しないの
で、LFA−１の天然リガンドのアンタゴニスト、ICAM−
２も炎症応答を阻害するものと考えられる。ICAM−２に
対する抗体の炎症阻害能は、慢性炎症性疾患および自己
免疫疾患、例えば紅班性狼瘡、自己免疫性甲状腺炎、実
験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、多発性硬化症、糖
尿病のいくつかの形態、レイノード症候群、リウマチ性
関節炎などの治療における基礎を与える。このような抗
体は幹癬の治療においても使用できる。一般に、ICAM−
２に結合し得るモノクローナル抗体はステロイド療法を
介して従来治療し得た疾患の治療にも使用できる。

本発明によれば、このような炎症および免疫拒絶応答
を、このような治療を要する患者に、炎症を抑制するの
に十分な量の抗−炎症剤を投与することにより抑制（即
ち阻止または減衰）できる。適当な抗−炎症剤は、ICAM
−２に結合し得る抗体、ICAM−２に結合し得る抗体フラ
グメント、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導体、ICAM−
１以外のICAM−２の非−IgアンタゴニストまたはLFA−
１以外のICAM−２の非−Igアンタゴニストを包含する。
特に好ましいのは、可溶性ICAM−２機能性誘導体を含む
抗−炎症剤である。このような抗−炎症治療は、LFA−
１に結合できる抗体、LFA−１に結合し得る抗体の機能
性誘導体およびLFA−１の非−Igアンタゴニストからな
る群から選ばれる薬剤をも付随的に投与することをも含
む。

本発明は、更に該特異的防御系の炎症性応答を抑制す
る上記方法をも含み、そこでは患者に免疫抑制剤が更に
投与される。このような薬剤は通常必要とされるよりも
低い（即ち“準−最適（suboptimal）”投与量）で与え
ることが好ましい。この準−最適投与量の使用は、本発
明の薬剤の相乗効果のために可能となる。適当な免疫抑
制剤はデキサメテゾン（dexamethesone）、アザチオプ
リン（azathioprine）、ICAM−１、サイクロスポリン
（cyclosporin）Ａなどを含む。

3.非−特異的炎症の治療本発明は、一部には、顆粒球−内皮細胞粘着が内皮と
CD−18族の糖タンパクとの相互作用に起因するという発
見によるものである。細胞接着は白血球が炎症サイトに
移動できおよび／または炎症に寄与する様々なエフェク
タ機能を行うために必要とされるので、細胞接着を阻害
する薬剤はこの炎症を減衰もしくは阻止する。このよう
な炎症反応は、免疫記憶できない白血球により媒介され
る非−特異的防御系の反応によるものである。このよう
な細胞は顆粒球およびマクロファージを含む。ここで使
用するような炎症は、該炎症が非−特異的防御系により
生じ、これによって媒介されもしくはこれに関連する場
合に、該非−特異的防御系の応答に起因するものといわ
れる。少なくとも部分的に非−特異的防御系の反応に起
因する炎症の例は成人呼吸困難症候群（ARDS）、敗血症
または外傷に二次的な多発性臓器傷害症候群、心筋また
は他の組織の再かん流傷害、急性糸球体腎炎、反応性関
節炎、急性炎症性成分を有する皮膚疾患、急性化膿性髄
膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、熱傷害、血液透
析、白血球除去血輸血、潰瘍性大腸炎、クローン疾患、
壊死性全腸炎、顆粒球輸液関連症候群およびサイトカイ
ニン誘発毒性からなる群から選ばれる状態に関連する炎
症を含む。

本発明の抗−炎症剤は顆粒球上のCD−18複合体と内皮
細胞との相互作用と特異的に拮抗できる化合物である。
このようなアンタゴニストはICAM−１、ICAM−２の機能
性誘導体およびICAM−１以外のICAM−２の非−Igアンタ
ゴニストまたはCD−18族分子の構成員を含む。

B.臓器および組織拒絶のサプレッサー特に可溶性型のICAM−２はCD−18族の構成員に対して
抗体と同様に作用することができるので、任意の細胞接
着−依存性機能によって生ずる臓器または組織拒絶を抑
制するのに用いることができる。更に、抗−ICAM−２抗
体およびその機能性誘導体およびアンタゴニストもかか
る拒絶を抑制できる。

ICAM−２およびICAM−２に結合し得る抗体は臓器また
は組織拒絶を防止し、あるいは自己免疫応答の改善に、
哺乳動物罹患体において副作用の恐れなしに使用するこ
とができる。

ICAM−２を認識し得るモノクローナル抗体の使用はHL
A不適合の対象間での臓器移植の実施を可能とするので
重要である。

C.治療または診断の目的で投与された抗原物質の導入に
対する付加剤例えば牛インシュリン、インターフェロン、組織型プ
ラスミノーゲン活性化剤または二十日ネズミのモノクロ
ーナル抗体などの治療または診断剤に対する免疫応答
は、このような薬剤の治療または診断の価値を実質的に
害し、しかも実際上血清病などの疾病を起こす恐れがあ
る。このような状況は本発明の抗体の使用により改善で
きる。この態様において、該抗体は該治療または診断薬
と組合せて投与される。この抗体の添加は受容者が該薬
剤を認識するのを防止し、かつその結果受容者がこれに
対する免疫応答を開始することを阻止する。このような
免疫応答がないことは、患者が更に治療もしくは診断薬
の投与を受け付けることを可能とする。

ICAM−２（特にその可溶型のもの）またはその機能性
誘導体は、疾病の治療においてICAM−１またはLFA−１
に結合し得る抗体と互換性をもって用いることができ
る。かくして、可溶型のかかる分子は臓器または組織移
植における拒絶反応を阻止するのに使用できる。ICAM−
２またはその機能性誘導体は、治療または診断薬の免疫
原性を減じるために、抗−ICAM−２抗体と同様に使用で
きる。

D.腫瘍転移のサプレッサー本発明の薬剤は、また移動のためにCD−18族の機能性
構成員を必要とする造血器官の腫瘍細胞の転移を阻止す
るのに用いることもできる。本発明のこの態様によれ
ば、このような治療を要する患者に、該転移を阻止する
のに十分な量の薬剤（例えば、ICAM−２に結合する抗
体、ICAM−２に結合し得る毒素−誘発性の抗体、ICAM−
２に結合し得る抗体フラグメント、ICAM−２に結合し得
る、毒素−誘発性の抗体フラグメント、ICAM−２、ICAM
−２の機能性誘導体、およびICAM−１以外のICAM−２の
非−Igアンタゴニスト）を投与する。

本発明は、またICAM−２表現腫瘍細胞の成長抑制方法
をも提供し、該方法はそのような治療を要する患者に該
成長を抑制するのに十分な量の薬剤を投与することを含
む。適当な薬剤はICAM−２に結合し得る抗体、ICAM−２
に結合し得る毒素−誘発性抗体、ICAM−２に結合し得る
抗体フラグメント、ICAM−２に結合し得る毒素−誘発性
抗体フラグメント、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導
体、ICAM−１以外のICAM−２の非−Igアンタゴニスト、
毒素−誘発性のCD−18族分子の構成員およびCD−18族分
子の構成員の毒素−誘発性機能性誘導体を包含する。

本発明は、またLFA−１表現腫瘍細胞の成長抑制法を
も提供し、該方法はこのような治療を要する患者に、該
成長を抑制するのに十分な量の毒素を投与することを含
む。適当な毒素は、毒素−誘発性ICAM−２または毒素−
誘発性のICAM−２機能性誘導体を含む。

E.ウイルス感染のサプレッサー ICAM−１は、最近ライノウイルスの大部分の群により
レセプタとして滅されることが示された（Greve,J.M.
等、Cell,1989、56、pp.839−847;Staunton,D.E.等、Ce
ll,1989、56、pp.849−853;Tomassini,J.E.等、Proc.Na
tl.Aced.Sci.USA、1989、86、pp.4907−4911;これらを
本発明の参考文献とする）。ライノウイルス、即ち小さ
な、RNA−含有タンパク−包封（Preteinencapsidated）
ピコルナウイルス科の一員は感冒の40〜50％の原因とな
る（Rueckert,R.R.,Fields Virology,Fields,B.N.等
編、Ravon社刊、ニューヨーク（1985）、pp.705−738;S
perber S.J.等、Antimicr.Agents Chemo.,1988、32、p
p.409−419:これらを本発明の参考文献とする）。100以
上の免疫学的に非交叉反応性のライノウイルスが明らか
にされ、その90％がICAM−１に結合する。

ICAM−１以外に、細胞接着分子CD4および補体レセプ
タCR2は、最近夫々HIVおよびEBVウイルスによってウイ
ルスレセプタとして滅されることがわかった（Maddon,
P.J.,Cell,1986、47、pp.333−348;Fingeroth,J.D.等、
Proc.Natl.Aced.Sci.USA、1984、81、pp.4510−4514:こ
れらを本発明の参考文献とする）。また、ICAM−１と類
似のIgドメイン構造を有し、かつ細胞接着において機能
する分子がポリオウイルスレセプタであることがわかっ
た（Mendelsohn,C.L.等、Cell,1989、56、pp.855−86
5）。

ICAM−２およびその機能性誘導体はウイルス（特にラ
イノウイルス、とりわけ小数の血清型ライノウイルス）
の付着または感染に対するレセプタとして作用し得る。
従って、ICAM−２（またはそのフラグメント）に対する
抗体、ICAM−２、あるいはICAM−２の機能性誘導体はこ
のような付着または感染を阻止するのに使用でき、これ
によってウイルス感染を抑制できる。

F.診断および予後的用途 ICAM−２に結合し得るモノクローナル抗体は患者中の
ICAM−２表現および炎症サイトの造影または可視化手段
として使用できる。このような場合、モノクローナル抗
体は放射性同位体、アフィニティ標識（例えばビオチ
ン、アビジンなど）、螢光標識、常磁性原子、標識抗−
ICAM−２抗体などの使用により検出できるように標識さ
れる。このような標識を行う方法は当分野で周知であ
る。診断的造影での抗体の臨床的利用は、Grossman,H.
B.,Urol.Clin.North.Amer.,1986、13、pp.465−474;Ung
er,E.C.等、Invest.Radiol.,1985、20、pp.693−700お
よびKhaw,B.A.等、Science、1980、209、pp.295−297に
概説されている。

ICAM−２表現の存在は、結合性リガンド、例えばICAM
−２を表現する細胞のICAM−２遺伝子配列またはICAM−
2mRNA配列に結合し得るmRNA、cDNAまたはDNAの使用によ
っても検出できる。このようなハイブリダイゼーション
アッセイを実施する技術はManiatis,T.等のMolecular C
loning,a Laboratory Manual,コールドスプリングハー
バー社刊、NY（1982）およびHaymes,B.D.等のNucleio A
cid Hybridization,a Practical Approach,IRL社刊、ワ
シントンDC（1985）（これらを本発明の参考文献とす
る）に記載されている。

このように検知できるように標識した抗体の集中部位
の検出は、ICAM−２表現または腫瘍発現サイトの指標と
なる。一態様では、この表現の検査は、組織または血液
サンプルを採り、検出し得るように標識されたまたは標
識できる抗体の存在下で該サンプルをインキュベートす
ることにより実施される。好ましい態様では、この方法
は磁気的結像、螢光々度法などを用いることによる非侵
攻性の様式で行われる。このような診断テストは起こり
得る組織拒絶の初期シグナルにつき臓器移植受容者を監
視する際に使用できる。このようなアッセイは対象がリ
ウマチ性関節炎または他の慢性炎症性疾患に罹っている
か否かを調べるために行うこともできる。

例えば、放射能標識した抗体または抗体フラグメント
を用いて、ラジオイムノアッセイを利用して抗原を検出
できる。ラジオイムノアッセイ（RIA）の優れた説明
は、Work,T.S.等のLaboratory Techniqus and Biochemi
stry in Molecular Biology,ノースホランド出版、NY
（1978）（特に“An Introduction to Radioiummno Ass
ay and Related Technique"（Chard,T.）と題する章：
これを本発明の参考文献とする）に見出すことができ
る。また、螢光、酵素またはその他の適当な標識を用い
ることもできる。

本発明で使用できるラベルの型の例は、酵素ラベル、
放射性同位体ラベル、非放射性同位体ラベル、螢光ラベ
ル、毒素ラベルおよび化学発光ラベルを含むが、これら
に制限されない。

適当な酵素ラベルの例はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、
スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイド
アイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロゲナーゼ、
α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリ
オースホスフェートアイソメラーゼ、パーオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌク
レアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコースアミラー
ゼ、アセチルコリンエステラーゼなどを包含する。

適当な放射性同位体ラベルの例は、³H、¹¹¹In、
¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹F
e、⁷⁵Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷
Sc、¹⁰⁹Pdなどを含む。適当な非放射性同位体ラベルの
例は¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr、⁵⁶Feなどを包含する。

適当な螢光ラベルは¹⁵²Euラベル、フルオレセインラ
ベル、ローダミンラベル、フィコエリトリンラベル、フ
ィコシアニンラベル、アロフィコシアニンラベル、Ｏ−
フタルアルデヒドラベル、フルオレサミンラベルなどを
含む。

化学発光ラベルの例はルミナールラベル、イソルミナ
ールラベル、芳香族アクリジニウムエステルラベル、イ
ミダゾールラベル、アクリジニウム塩ラベル、オキサレ
ートエステルラベル、ルシフェリンラベル、ルシフェラ
ーゼラベル、アエコリン（aequorin）ラベルなどを含
む。

VI.本発明の組成物の投与 ICAM−２の治療効果は、患者に完全なICAM−２分子ま
たはその任意の治療上有効なペプチドフラグメントを投
与することにより得ることができる。特に興味のあるの
は可溶性の治療活性をもつICAM−２のペプチドフラグメ
ントである。

ICAM−２およびその機能性誘導体は、合成、組換えDN
A技術、またはタンパク分解もしくはこれら方法の任意
の組合せによって得ることができる。ICAM−２の治療上
の利点は、キャリヤへの結合性を高めるため、もしくは
ICAM−２への活性を高めるために付加された付随的なア
ミノ酸残基をもつICAM−２の機能性誘導体の使用によっ
て高めることができる。本発明の範囲は、いくつかのア
ミノ酸残基の欠除した、あるいはアミノ酸残基が変えら
れたICAM−２の機能性誘導体をも含むが、これらはICAM
−２の生物的または薬理的活性をもたなければならな
い。

ここに記載した本発明の抗体およびICAM−２分子両者
は、これらを含有する処方物が通常かつ天然に見出され
る物質を実質的に含まない場合に、“天然の異物を実質
的に含まない”といわれる。

本発明はICAM−２に結合し得る抗体およびその生物活
性フラグメント（これらはモノクローナルでもポリクロ
ーナルでもよい）にも及ぶ。このような抗体は動物によ
り、組織培養によりあるいは組換えDNA手段により作る
ことができる。

患者にICAM−２結合性の抗体またはそのフラグメント
を投与する場合、あるいはICAM−２（またはそのフラグ
メント、変異体もしくは誘導体）を受容者（組織、臓器
の）としての患者に投与する場合、該投与薬剤の投与量
は、患者の年令、体重、身長、性別、一般的医学的状
態、病歴などのファクタに依存して変化する。一般に、
抗体は受容者に約1pg/kg〜10mg/kg（患者の体重）の投
与量で投与することが望ましいが、これ以下もしくはこ
れ以上の投与量でも勿論投与できる。ICAM−２分子また
はその機能性誘導体を患者に投与する場合、このような
分子を同じく約1pg/kg〜10mg/kg（患者の体重）の範囲
の投与量で投与することが好ましいが、これ以下もしく
はこれ以上で投与してもよい。以下で論議するように、
この治療上有効な投与量は、抗−ICAM−２抗体を抗−LF
A−１抗体と共に投与する場合には減らすことができ
る。ここでは、一つの化合物は、２種の化合物が、これ
らを患者の血清中に同時に検出し得る程に時間的に接近
して投与された場合に、第２の化合物と共に付随的に投
与されるという。

ICAM−２に結合できる抗体およびICAM−２自体のいず
れも静脈内、筋肉内、皮下、腸管もしくは非経口経路で
患者に投与できる。注射によって抗体またはICAM−２を
投与する場合、連続注入または単一のもしくは複数のボ
ルス（boluses）で投与できる。

本発明の薬剤は炎症を抑制するのに十分な量で受容者
としての対象に投与することが意図されている。この量
は、この薬剤の投与量、投与経路などが炎症を減衰しも
しくは阻止するのに十分である場合に、“抑制する”の
に十分であるといわれる。

抗−ICAM−２抗体またはそのフラグメントは単独で、
もしくは１または２以上の追加の免疫抑制剤（特に臓器
または組織移植した受容体に対して）と組合せて投与す
ることができる。このような化合物の投与は“予防”ま
たは“治療”いずれの目的であってもよい。予防の目的
で投与する場合、該免疫抑制剤化合物は何等かの炎症性
応答または症状の前（例えば、臓器または組織移植時点
の前、その時点あるいはその短時間後で、かつ臓器拒絶
反応の任意の症状のでる前）に投与される。これら化合
物の予防上の投与は任意の後にみられる炎症性応答（例
えば、移植臓器または組織の拒絶など）を阻止もしくは
減じるように作用する。治療の目的で投与する場合、該
免疫抑制化合物は実際の炎症の症状（例えば、臓器また
は組織の拒絶）が始った時点（もしくはその短時間経過
後）に投与される。これら化合物の治療を目的とする投
与は任意の実際の炎症（例えば、移植臓器もしくは組織
の拒絶）を減じるように作用する。

かくして、本発明の抗−炎症剤は（関連する炎症を抑
制するために）炎症の開始前に、あるいは炎症の開始後
に投与できる。

組成物は、その投与が受容体としての患者に許容され
得る場合に、“薬理的に許容”されるといわれる。投与
量が生理的に十分である場合に、かかる薬剤は“治療上
有効量”で投与されたといわれる。ある薬剤の存在が患
者の生理において検出可能な変化をもたらす場合には、
該薬剤は生理的に十分である。

本発明の抗体およびICAM−２分子は公知の方法に従っ
て処方して製薬上有用な組成物とすることができ、それ
によってこれらの物質またはその機能性誘導体は製薬上
許容されるキャリヤビヒクルとの混合物として組合せら
れる。適当なビヒクルおよびその処方は他のヒトタンパ
ク、例えばヒト血清アルブミンを含めて、例えばReming
ton'sPharmaceutical Sciences、1980、第16版、Osol,
A.鑑集、Mack,Enston PAに記載されている。有効な投与
に適した製薬上許容される組成物を得るために、かかる
組成物は有効量の抗−ICAM−２抗体、ICAM−２分子、ま
たはその機能性誘導体を、適当量のキャリヤビヒクルと
共に含有する。

更に、製薬法を用いて作用期間を調節できる。制御放
出処方物は、ポリマーを用いて抗−ICAM−２抗体または
ICAM−２またはこれらの機能性誘導体と複合化またはこ
れらを吸収することにより得られる。制御放出性（徐放
性など）は適当な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポ
リアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルア
セテートコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースまたはプロタミンサルフェート）を、お
よびその濃度並びに配合法を適当に選択して制御放出と
することができる。もう一つの可能な、制御放出処方物
による作用期間の調節法は抗−ICAM−２抗体、ICAM−２
分子またはこれらの機能性誘導体を、ポリエステル、ポ
リアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン
−ビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材料の粒
子中に配合することである。また、これら薬剤をポリマ
ー粒子に配合する代りに、例えばコアセルベーション法
あるいは界面重合法で調製されるマイクロカプセル、例
えばメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル
およびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル
中に、もしくはコロイド状薬剤放出系、例えばリポゾー
ム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルシ
ョン、ナノ粒子およびナノカプセルあるいはマクロエマ
ルション中に封入することもできる。このような技術は
Remington's Pharmaceutical Sciences（1980）に開示
されている。

本発明は更に（ａ）抗−炎症剤（例えば、ICAM−２に
結合し得る抗体、ICAM−２に結合し得る抗体フラグメン
ト、ICAM−２、ICAM−２の機能性誘導体、およびICAM−
１以外のICAM−２の非−Igアンタゴニスト）および
（ｂ）少なくとも一種の免疫抑制剤を含む薬理組成物を
も包含する。適当な免疫抑制剤の例はデクサメテゾン、
アザチオプリンおよびサイクロスポリンＡを含む。

（実施例）これまで、本発明を一般的に記載してきたが、本発明
は以下の実施例を参照することにより、より一層容易に
理解されよう。但し、以下の実施例は本発明を例示する
ものであって、特に述べない限り何等これを制限するも
のではない。

実施例1;ICAM−2cDNAのクローニング ICAM−２をコードし得るcDNAをクローニングするため
に、COS細胞中での表現によりcDNAを選別するためのAru
ffo ＆ Seedの方法（Seed,B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,1987,84,pp.3365〜3369）の改良法を用いて、ペトリ
皿に結合した機能的に活性な精製LFA−１上で、リガン
ド担持COS細胞をパンニングした。

詳しくいえば、LFA−１をTS2/4LFA−1MAbセファロー
スイムノアフィニティークロマトグラフィーによってSK
W−３溶解液から精製し、2mM MgCl₂および１％オクチル
グルコシドの存在下でpH11.5にて溶出した。LFA−１（1
0μg/200μ/6cmプレート）を、オクチルグルコシドを
2mM MgCl₂含有PBS中にて0.1％まで希釈し、４℃にて一
夜インキュベートすることにより、微生物用ペトリ皿に
結合した。プレートを１％BSAで遮断し、PBS/2mM MgCl₂
/0.2％BSA/0.025％アジド/50μg/mゲンタマイシン中
で保存した。

Gubler ＆ Hoffmanの方法による、LPS−刺激臍静脈内
皮細胞からのcDNAライブラリの合成を、Staunton等の方
法（Cell,1988,52,pp.925/933）に従って行った。第２
のストランド合成に引続いて、このcDNAをBst×１アダ
プターに結合（Seed,B.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,19
87,84,pp.3365−3369）し、＞600bpのcDNAを、低融点
（LMP）アガロースゲル電気泳動法で選別した。次に、
このcDNAをCDM8（Seed,B.Nature,1987,329,pp.840〜84
2）に接合し、E.コリホストMC1061/P3に導入し、培地に
塗布して５×10⁵コロニーを得た。このコロニーをLB培
地に懸濁し、プールし、標準的アルカリ溶解法（Maniat
is,T.等、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー（1982））によ
りプラスミドを調製した。50％密集性において、COS細
胞の10cmプレートを、DEAE−デキストランを用いてプラ
スミドcDNAライブラリー10μg/プレートに移入した（Ki
ngston,R.E.,Current Protocols in Molecular Biolog
y,1987,9.0.1.〜9.9.6,グリーンパブリッシングアソシ
エーツ）。ICAM−２は内皮およびSKW−３細胞上でトリ
プシン耐性である。トランスフェクションの３日後のCO
S細胞を0.025％トリプシン/1mM EDTA/HBSS（Gibco）で
処理して懸濁させ、⁵¹Cr−標識COS細胞について以下に
述べるように、LFA−１被覆プレート上でハプニングし
た（Seed,B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84,pp.33
65〜3369）。接着細胞を10mMまでEDTAを加えて遊離させ
た。

プラスミドを、Hirt上澄中のCOS細胞の接着集団から
回収した（Hirt,B.J.,J,Mol.Biol.,1967,26,pp.365〜36
9）。次いで、E.コリ菌株MC1061/P3をこのプラスミドで
形質転換し、プレート上のコロニーをLB培地中に懸濁
し、プールし、プラスミドをアルカリ−溶解法で調製し
た。LFA−１−接着移入COS細胞の選別およびプラスミド
の回収を更に２サイクル繰返した。第３回目のサイクル
後に得られたプールしたコロニーを、18μg/mのテト
ラサイクリンと20μg/mのアンピシリンとを含む100m
のLB培地中で飽和に至るまで成長させた。プラスミド
を調製し、１％LMP−アガロースゲル電気泳動法で分画
し、MC1061/P₃を別途９種のサイズの違う画分からのプ
ラスミドで形質転換した。COS細胞のLFA−１に対する接
着の促進において最大の活性をもつ画分からの各プラス
ミドを、Xbalによる消化によりインサートのサイズにつ
き調べ、COS細胞接着アッセイでテストした。これは、
1.1kbのICAM−2cDNAインサートをもつプラスミド、pCDI
C2.27を与えた。

接着テストのために、CDM8（２μg/10cmプレート）中
のICAM−２プラスミドpCDIC2.27または1.8kb Sal Iを含
むICAM−１構築体、Kpn Iフラグメント（Staunton,D.E.
等,Cell,1988,52,pp.925〜933）を、DEAE−デキストラ
ンを用いてCOS細胞中に導入した。トランスフェクショ
ンの３日後に、COS細胞を0.025％トリプシン/1mM EDTA/
HBSSで懸濁し、⁵¹Crで標識した。５μg/mのMAb（表示
通り）を含む2mのPBS/5％FCS/2mM MgCl₂/0.025％アシ
ド（バッファー）中の約２×10⁵ ⁵¹Cr−標識COS細胞
を、LFA−１被覆6cmプレート中で25℃にて１時間インキ
ュベートした。非−接着細胞を緩かに揺することにより
除き、バッファーで３回洗浄した。接着細胞を10mMまで
EDTA添加して溶出し、γ−計数に付した。

この方法の可能性は、予めクローニングしたICAM−1c
DNA（Fig.1A）でトランスフェクションしたCOS細胞を用
いて立証された。ICAM−１を25％の移入COS細胞上に表
現させた。パンニングの後、非−接着細胞はICAM−1⁺細
胞を含まず、一方EDTAによりLFA−１被覆プラスチック
から遊離した接着細胞は殆ど完全にICAM−1⁺であった。
ICAM−1⁺細胞のLFA−１被覆プラスチックへの付着はRR1
/1 ICAM−１ MAbで阻止された。ペトリ皿上へのLFA−
１の被覆はCOS細胞接着およびEDTAでの溶出のサイクル
５回以上に亘り安定であった。プレートは使用と使用と
の間の期間はMg²⁺と共に４℃で保存した。

ICAM−２をクローニングするために、プラスミドベク
タCDM8中のcDNAライブラリを、IFA−１依存性接着のICA
M−１−依存性およびICAM−１−独立性成分両者を含む
ことが明らかにされている内皮細胞から調製した（Dust
in,M.L.等、J.Cell Biol.,1988,107,pp.321〜331）。移
入COS細胞を、ICAM−1cDNAの単離を防止するために加え
たICAM−１ MAbと共にLFA−１被覆ペトリ皿中でインキ
ュベートした。接着細胞をEDTAで溶出し、プラスミドを
単離し、E.コリ中で増殖させた。

移入、接着およびプラスミド単離からなるサイクルを
３回行った後、かつ一回のサイズ分画後、30プラスミド
を制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析した。1.0k
bを越えるインサートをもつ３種のうちの一つのプラス
ミドを移入によりCOS細胞に導入したが、これはLFA−１
に対する接着を起こした。

この単離プラスミドは、ICAM−１移入についてみられ
た比率と同様に、移入細胞の高い割合がLFA−１に接着
性が示した（第1B図）。接着はLFA−1MAbで阻止された
が、ICAM−１移入体とは対照的に、ICAM−1MAbでは阻止
されなかった（第1B図）。更に、このプラスミドで移入
された細胞は４種のICAM−1MAbパネルとは反応しなかっ
た。かくして、第２のLFA−１リガンドをコードするcDN
Aに対するすべての機能上の基準が満たされ、かつこの
リガンドは“ICAM−2"と命名された。

実施例2:ICAM−2cDNA配列のキャラクタリゼーション 1052bpをもつICAM−2cDNA配列（第２図）は62bpの
５′および167bpの３′未翻訳領域を含む。位置1019のA
ATACAポリアデニル化シグナルは、AATAAAとは対照的
に、脊椎動物のmRNAの約２％でみられ（Wickens,M.等、
Science,1984,226,pp.1045〜1051）、その後に1058の位
置におけるpoly（Ａ）尾部をもつ。最長の読取り枠は63
の位置の第１のATGで始まり、位置885におけるTAG終止
コドンで終端している。疎水性分析（Kyte,J.等,J.Mol.
Biol.,1982,157,pp.105〜132）および開裂部位近傍のア
ミノ酸の利用（von Heijme,G.,Nucleic Acids Researc
h,1986,14,pp.4683〜4690）は21残基のシグナルペプチ
ドの存在を予想している（第２図）。

この予想された成熟配列はアミノ酸１から201までの
推定細胞外ドメインを含み、その後には26残基の疎水性
推定膜貫通ドメインおよび26残基の細胞質ドメインがあ
る。多分α−ヘリックス状膜貫通セグメントの４つのタ
ーン（turns）は一方の側にあるスレオニンおよびセリ
ン残基をもつ両親媒性のものであり、このことは膜の面
内での自己会合または他の膜タンパクとの会合の可能性
を示唆している。この細胞質ドメインは異常な塩基性
で、疎水性の多くの細胞質ドメインと対照的に平均して
疎水性のものである。成熟ポリペプチドの予想された質
量は28,175ダルトンであり、６つの予想されたＮ−結合
グリコシル化サイトを用いた場合には、これは約46kdの
ICAM−２糖タンパクを与えるであろう。

実施例3:DNAおよびRNAハイブリダイゼーション分析単離したICAM−2cDNAクローンをノーザンおよびサザ
ンハイブリダイゼーション両者を用いて分析した。ノー
ザンブロットでは変性され、１％アガロースホルムアル
デヒドゲルで電気泳動し（Maniatis,T.等、Molecular C
loning:A Laboratory Manual,1982,コールドスリングハ
ーバーラボラトリ）、かつナイロン膜に電気泳動転移
（Zeta Probe,BioRad;electrotransferred）した６μｇ
のpoly（Ａ）⁺RNAを用いた。転移の完了は、ゲルのUVト
ランス−イルミネーション（trans−illumination）に
よりまた該ブロットの蛍光光度法により確認した。

ゲノムDNAを業者の推奨する量の５倍のEcoR IおよびH
ind IIIエンドヌクレアーゼ（New England Biolabs）で
消化した。0.8％アガロースゲルでの電気泳動の後、DNA
をZeta Probeに移した。RNAおよびDNAブロットを、ICAM
−２またはICAM−1cDNA（ランダムプライミングでα〔
³²P〕_dXTPで標識されている;Boehringer Mannheim）を
用いて、標準的方法に従って（Maniatis,T.等、Molecul
ar Cloning:A Laboratory Manual,1982,コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー）、予備ハイブリダイゼーシ
ョンおよびハイブリダイゼーションした。

1.1kbICAM−2cDNAを1.4kb poly（Ａ）⁺mRNAにおよび
弱く3kb mRNA（第3A図）にハイブリッド化し、3.3kbお
よび2.4kbのICAM−1mRNA（第3B図）から識別する。mRNA
を、機能的にICAM−１−依存性および第２リガンド−依
存性のLFA−１への結合につき、キャラクタリゼーシン
されている細胞中で調べた。ICAM−1 mRNAはLPSによっ
て内皮細胞中で強く誘起された（第3B図、レーン２およ
び３）。一方、ICAM−2 mRNAは基本的に内皮細胞中で強
く表現され、かつLPSにより更に誘発されることはなか
った（第3A図、レーン２および３）。このことは、内皮
細胞におけるLFA−１−依存、ICAM−１−独立パスウェ
イ（path way）の強力な基本的かつ非−誘発性表現およ
びICAM−１−依存パスウェイの誘発性と相関関係にある
（Dustin,M.L.等,J.Cell Biol.,1988,107,pp.321〜33
1）。

緩和なまたは長期のオートラジオグラム曝露によって
示されるように、ICAM−2mRNAは、RamosおよびBBNBリン
パ芽球、U937単球およびSKW3リンパ芽球細胞系を含む広
範な様々な型の細胞中に存在する（第3A、レーン1,4,6
および８）。勿論、SKW3、U937およびBBNはLFA−1⁺細胞
に対するLFA−１依存、ICAM−１−独立接着性を示すこ
とがわかっている（Rothlein,R.等、J.Immunol.,1986,1
37,pp.1270−1274;Makgoba,M.W.等、Eur.J.Immunol.,19
88,18,pp.637−640）。また、LFA−１−被覆プラスチッ
クに対する接着性も示すことがわかっている。LFA−１
−依存性接着のICAM−１−依存成分のみ示す（Makgoba,
M.W.等、Eur.J.Immunol.,1988,18,pp.637−640）HeLa上
皮細胞系は、長いオートラジオグラム曝露後でさえもIC
AM−2mRNAを示さない（第3A図、レーン５）。従って、I
CAM−２の細胞分布はLFA−１−依存接着のICAM−１独立
成分と一致する。

ICAM−2cDNAでハイブリッド化したゲノムDNAのサザン
ブロット（第3D図）は単一の支配的な8.2kbのEcoR Iフ
ラグメントと14kbのHind IIIフラグメントとを示した。
このことはコード情報の殆どをもつ単一の遺伝子が8kb
中にあることを示唆している。

実施例4:ICAM−１とICAM−２のアミノ酸配列の比較 LFA−１リガンドに関する機能上の類似がみられたの
で、ICAM−１とICAM−２のアミノ酸配列を比較した。IC
AM−１はIgスーパーファミリの一員であり、その細胞外
ドメインは完全に５つのＣ−状ドメインからなってい
る。ICAM−２の201アミノ酸細胞外ドメインは２つのIgC
−状ドメインからなり、推定ドメイン間ジスルフィド−
結合したシステインは43〜56残基離れ、かつ予想された
β−ストランド構造をもつ（第４図）。注目すべきこと
に、ICAM−２の２つのIg−様ドメインはICAM−１の最も
Ｎ−末端側の２つのIg−様ドメインに対し（第４図）ア
ミノ酸配列の点で34％の相同（平均よりもALIGNスコア
が15s.d.高い）であり、またICAM−１のドメイン３およ
び４との相同27％（平均よりもALIGNスコア3s.d.高い）
を示す。

NBRFおよびSWISS−PROTタンパクデータベースの探索
によれば、わずかにIgスーパーファミリの他の構成員、
主としてHLAクラスII抗原との部分的ドメイン相同性が
みられたにすぎなかった。ICAM−２は、ICAM−１よりも
幾分低いIgドメインの保存された残基特性を示す。ICAM
−２は夫々接着分子NCAM（Cunningham,B.A.等,Science,
1987,236,799−806）およびMAG（Salzer.,J.L.等、J.Ce
ll Biol.,1987,104,957−965）の２つのＮ−末端ドメイ
ンに対して17％および19％の類似性をもち、一方ICAM−
１は夫々19％および20％の類似性をもつ。

リンパ球機能関連抗原−１（LFA−１）および細胞間
粘着分子−１（ICAM−１）はMAb選択により同定され、
夫々Ｔリンパ球−媒介殺害およびホモ型接着で阻害され
る（Rothlein,R.等,J.Immunol.,1986,137,pp.1270−127
4;Davignon,D.等,Proc,Natl.Acad.Sci.USA,1981,78,pp.
4535−4539）。逆に、ICAM−２は、前もっての生化学的
または免疫学的方法によるタンパクの同定を必要としな
い、機能性cDNA選択法を用いて規定された。

ICAM−２に対するcDNAの単離は想定したもう一つのLF
A−１リガンドの存在を確証している。LFA−１に対する
ICAM−１−依存かつICAM−１−独立接着について特徴付
けされた限られた数の細胞上でのICAM−２に対するmRNA
の分布は、ICAM−２が観察されたICAM−１単独LFA−１
−依存接着のすべてを説明できることを示唆している。

ICAM−２およびICAM−１の２つのＮ−末端ドメイン
は、Igスーパーファミリーの他の構成員とよりも一層相
互に類似している。このことは、LFA−１に結合するIg
−様分子のサブファミリーの存在を立証している。ICAM
−１のLFA−１結合領域は、ドメイン除去および系統的
アミノ酸置換によってドメイン１および２にマッピング
されている。従って、構造上および機能上両方に相同性
が存在する。ICAM−２はインテグリンに結合するIg−族
構成員の第２の例である。細胞接着レセプタ中に、かつ
インテグリン中には殆ど序列はないが、細胞外マトリッ
クス成分に対するレセプタの数は多数のリガンドを認識
することが示された（Hynes,R.O.,Cell,1987,48,pp.549
−554;Ruoslahti,E.等,Science,1987,238,pp.491−49
7）。

ICAM−１もICAM−２もRGD配列を含まず、従ってLFA−
１による認識の態様は、細胞外マトリックス成分を結合
するインテグリンとは異っている可能性がある（Hynes,
上記文献;Ruoslahti,上記文献）。Mac−１およびp150,9
5（LFA−１に密接に関連した白血球インテグリン）によ
り認識される細胞リガンドは同一のIgサブファミリーに
属し得る。ICAM−１は、最近感冒の50％の原因となって
いるライノウイルスの大きな群に対するレセプタである
ことが明らかにされた。ICAM−２もライノウイルスまた
は他のピコルナウイルスに対するレセプタとして機能し
得る。かくして、ICAM−２はこのようなウイルスによる
感染を抑制（即ち阻止または低減）する治療において用
いることができる。

LFA−１に対する一群のリガンドはこの認識法の重要
性を強調し、かつ精密な特異性および機能の多様化を付
与する機序となり得る。ICAM−１とICAM−２との間のい
くつかの相違点は特に重要である。ICAM−１は殆どの細
胞上で誘起し得るが、ICAM−２表現はテストした限りに
おいて細胞上のサイトカイニンにより影響されない。IC
AM−１上の更なる３つのドメインは細胞表面から、ICAM
−２のものよりも遠方のLFA−１結合サイトの存在を反
映するものと期待される。このことは、より密接な細胞
−細胞接触がLFA−1:ICAM−１相互作用よりもLFA−1:IC
AM−２相互作用に対して必要とされるであろうことを示
唆している。ICAM−２を移入したCOS細胞は、洗浄の剪
断力を増すにつれて、LFA−１被覆プラスチックから、I
CAM−１を移入したCOS細胞よりも一層容易に脱離する。
これは、ICAM−２がより小さな寸法をもつことに起因す
ると思われ、そのために人工的基質上のLFA−１に受け
入れられ難くしている。あるいはアフィニティの差異を
与える配列の差異に起因するのかも知れない。

ICAM−１および−２の明確な細胞質ドメインは異るシ
グナルを付与でき、もしくは細胞表面での異った局在化
を生じる可能性がある。同様に、LFA−１によるシグナ
ル発生および細胞骨格との相互作用はICAM−１またはIC
AM−２のいずれが結合しているかに応じて異る可能性が
ある。

ICAM−１および第2LFA−１の対−レセプタ、即ちICAM
−２は、従ってIgスーパーファミリーの−サブファミリ
ーをなす（Staunton,D.E.等,Cell,1988,52,pp.925−93
3:これを本発明の参考文献とする）。ICAM−１は５つの
Ig−様Ｃドメインを有し、一方ICAM−２はこのようなド
メインを２つもち、これらはICAM−１のアミノ末端ドメ
インに最も相同である。様々な型の細胞上に表現された
ICAM−１および−２は、免疫応答における誘発並びにエ
フェクタ機能を包含する様々な白血球接着依存機能をも
つ。ICAM−１の表現はサイトカイニンにより強く誘発し
得、従ってLFA−1/ICAM−１接着系は炎症中に白血球の
移動および局在化を誘導できる（Rothlein,R.,J.Immuno
l.,1986,137,pp.1270−1274;Marlin,S.D.等,Cell,1987,
51,pp.813−819;Kishimoto,T.K.等,Adv.Immunol.,1989,
46,pp.149−182;Dustin,M.L.等,Immunol.Today,1988,
９,pp.213−215:これらを本発明の参考文献とする）。

LFA−１結合にとって重要なものとして上で定義したI
CAM−１残基は他のICAMに保存されている（Staunton,D.
E.等,Nature,1989,339,pp.61−64:これを本発明の参考
文献とする）。ヒトICAM−１は二十日ネズミのICAM−１
と50％類似であり、かつヒトICAM−２とは35％類似であ
る（Staunton,D.E.等，上記文献）。LFA−１結合にとっ
て最も決定的な残基、E34およびQ73はマウスICAM−１お
よびヒトICAM−２に保存されている。この点は、マウス
ICAM−１およびヒトICAM−２のいずれもがヒトLFA−１
結合能をもつことと一致している（Staunton,D.E.,上記
文献）。LFA−１の結合に影響するN156における一つのD
2N−結合グリコシル化サイトもICAM−２に維持されてい
る。ライノウイルス−14結合にとって重要な数種の残
基、Q58、G46、D71、K77およびR166はマウスICAM−１ま
たはヒトICAM−２に保存されていない（Staunton,D.E.
等,Cell,1989,56,pp.849−853:これを本発明の参考文献
とする）。このことは、マウス細胞（Colonno,R.J.等,
J.Virol.,1986,57,pp.7−12）およびICAM−２のライノ
ウイルス−14に対する見掛け上の非結合性と一致してい
る。

以上、本発明をその特定の態様に関連して記載してき
たが、これは更に変更することが可能であり、かつ本願
は、一般に本発明の原理に従う本発明のあらゆる変更、
利用もしくは改作を含み、かつ本発明の関与する当技術
の範囲内で公知もしくは通常実施されるような本発明の
開示から逸脱したものをも、上記の特許請求の範囲に示
した基本的特徴に適用できる限り包含するものと理解す
べきである。

【図面の簡単な説明】

第１図はLFA−１で被覆したプラスチックに対する、ICA
M−１およびICAM−２を表現する移入COS細胞の結合を示
す。Ａ）ICAM−1cDNAを移入したCOS細胞をLFA−１−被
覆プレート上にてパニングし（panned）、ICAM−１の表
現を、一次MAbとして抗−ICAM−１モノクローナル抗体R
R1/1を用いた間接免疫螢光フローサイトメトリーによっ
て分析した。点線、破線および実線は夫々パニングしな
かった細胞、付着しなかった細胞および付着細胞に対応
する。Ｂ）⁵¹Cr−標識移入COS細胞（ICAM−１またはICA
M−２を表現）はMAbの存在下でLFA−１−被覆プラスチ
ックに結合した。第２図はICAM−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
示す。このアミノ酸配列は、シグナルペプチドの予想開
裂サイトに続く第１の残基から番号付けされている。該
疎水性の推定シグナルペプチドおよびトランスメンブラ
ン配列（TM）には下線が施されている。可能なＮ−結合
グリコシル化サイトを四角で囲んである。推定ポリアデ
ニル化シグナルAATACAには上に線を施した。ICAM−2cDN
Aの両ストランドは、製造業者の推奨に従って（Sequena
se,U.S.Biochemical）相補的オリゴヌクレオチドプライ
マーの逐次合成およびジデオキシヌクレオチド鎖終止シ
ーケンシングによりCDM8内で配列決定されている〔Sang
er,F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1977,74,pp.5463−5
467〕。第３図はRNAおよびDNAハイブリダイゼーション分析の結
果を示す。ノーザン（ＡおよびＢ）およびサザン（Ｃ）
ブロットを1.1kb³²P−標識ICAM−2cDNA（ＡおよびＣ）
に対しハイブリッド化し、かつ3kb³²P−標識ICAM−1cDN
A（Ｂ）に対し再ハイブリッド化した。（Ａおよび
Ｂ）：レーン１＝バーキット（Burkitt）リンパ腫細胞
系、ラモス（Ramos）からのポリ（Ａ）⁺RNA;レーン２＝
内皮細胞；レーン３＝LPSで３時間刺激された内皮細
胞；レーン４＝EBV不死化Ｂ−リンパ芽球細胞系、BBN;
レーン５＝上皮癌細胞系、HeLa;レーン６およびレーン
７＝Ｔリンパ腫細胞系、JurkatおよびSKW−3;およびレ
ーン８＝前単球細胞系、U937（いずれも６μｇ）。
（Ｃ）６μｇのＢ細胞系、BL−２からのゲノムDNA（レ
ーン１および４）;ER−LCL（レーン２および５）および
Raji（レーン３および６）。レーン１〜３はEcoR Iでま
たレーン４〜６はHind IIIで夫々消化した。ICAM−２お
よびICAM−１のmRNAは矢印で示してある。第４図はICAM−１に対するICAM−２の相同を示す。ICAM
−２の全体で201の残基の細胞外配列は、ALIGNプログラ
ム〔Dayhoff,M.O.等、Methods Enzymol.,1983,91,pp.52
4−545〕を利用し、かつ検査によりICAM−１の残基１〜
185とを一列に並べた。ICAM−２残基に番号を付した。
同等部は四角で囲んだ。D₁およびD₂はICAM−２およびIC
AM−１のIg状ドメインの環境を示す。ICAM−２のβ−ス
トランド予想部〔Chou,P.Y.等,Biochemistry,1974,13,p
p.211−245〕は上部に線を施し、かつICAM−１のそれに
は下線を施した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者マイケルローランダスティンアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02215 ボストン 23 パークドライヴ 231 (72)発明者ドナルドイースターントンアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02167 チェスナットヒルチェスナットヒルロード 124 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00,5/00 C07K 14/704,16/28 C12Q 1/68 ＷＰＩＢＩＯＳＩＳｐｒｅｖｉｅｗｓＣＡＳｏｎｌｉｎｅＧｅｎＢａｎｋ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞又はウイルスの表面上に存在する分子
に結合でき、かつ以下の第１番目〜第253番目のアミノ
酸配列を含む細胞間接着分子−２（ICAM−２）。
【請求項２】請求項１記載のICAM−２をコードすること
ができる組換えDNA分子。
【請求項３】前記分子が、ICAM−２を発現することがで
きる請求項２記載の組換えDNA分子。
【請求項４】請求項１記載のICAM−２に結合できる抗
体。
【請求項５】請求項４記載のモノクローナル抗体を生産
できるハイブリドーマ細胞。
【請求項６】請求項１記載のICAM−２を発現する細胞の
存在を検出する方法であって、（ａ）ICAM−2mRNAにストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズすることができる核酸分子のプローブであっ
て、以下の第63番目〜第884番目の塩基配列又はその一
部を含むプローブの存在下で、該細胞又はその細胞の抽
出物をインキュベートする工程、（ｂ）前記核酸分子のプローブが、該細胞又はその細胞
の抽出物中に存在する相補的核酸分子にハイブリダイズ
されたか否かを決定する工程を含む前記方法。