JP3365517B2 - Method for detecting an analyte by chemiluminescence and composition therefor - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は化学発光による試料中の
被分析物、例えば核酸または蛋白質の検出方法およびそ
のための組成物に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for detecting an analyte such as a nucleic acid or protein in a sample by chemiluminescence, and a composition therefor.

【０００２】[0002]

【従来技術】近年、特定の配列を持つ核酸断片をプロー
ブを用いて検出する技術、たとえば、サザンブロット
法、ノーザンブロット法、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン、プラークハイブリダイゼーション等による核酸配
列の検出は、遺伝病、癌、感染症等の診断のために有効
な手段として汎用されるようになってきた。また、抗体
を用いたウエスターンブロット法、ＥＬＩＳＡ、イムノ
アッセイ等も同様に抗原（蛋白質）を検出することがで
きる。これらの検出方法においては、従来、³²Ｐ、³⁵Ｓ
または ¹²⁵Ｉなどの放射性物質が標識として用いられて
いる。これらの放射性物質は長時間積算できるため、極
めて高感度の検出が可能であるが、人体や環境へ及ぼす
危険性を考えると、放射性同位元素を用いない標識方法
が望ましい。現在では、ペルオキシダ−ゼやアルカリフ
ォスファタ−ゼ等の酵素を標識した方法が、non-isotop
icであることに加え、各種分析機の開発にともない、多
くの検査室で使用されるようになってきた。これらの酵
素活性の測定は一般に比色測定法が主流であったが、放
射性同位元素を用いる従来の方法と比べて感度が低いと
いう問題点があった。そこでここ数年、検査の高感度
化、さらに短時間化のため比色測定法から蛍光測定法、
あるいは発光測定法が一般化されつつある。その中で最
も感度の優れた簡便な方法の一つとして、安定な１，２
−ジオキセタン化合物を用い、その分解によって起こる
発光を測定する方法が挙げられる（特開昭６３−９３７
７７号公報等）。この方法は、１，２−ジオキセタンが
非常に安定、検出感度が高い、反応時間が短い、発光時
間が長い、などから非常に優れた方法であると考えられ
る。2. Description of the Related Art In recent years, a technique for detecting a nucleic acid fragment having a specific sequence using a probe, for example, Southern blotting, Northern blotting, colony hybridization, plaque hybridization, etc. It has come to be widely used as an effective means for diagnosing cancer, infectious diseases and the like. Further, the Western blotting method using an antibody, ELISA, immunoassay and the like can similarly detect the antigen (protein). In these detection methods, ³² P and ³⁵ S are conventionally used.
^{Alternatively} , radioactive substances such as ¹²⁵ I have been used as labels. Since these radioactive substances can be integrated over a long period of time, detection with extremely high sensitivity is possible. However, considering the danger to the human body and environment, a labeling method that does not use radioactive isotopes is desirable. Currently, the method of labeling enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase is non-isotop
In addition to being ic, it has come to be used in many laboratories with the development of various analyzers. The colorimetric measurement method is generally the mainstream for measuring these enzyme activities, but there is a problem that the sensitivity is lower than that of the conventional method using a radioisotope. So, in recent years, from the colorimetric measurement method to the fluorescence measurement method
Alternatively, luminescence measurement methods are becoming popular. As one of the most sensitive and convenient methods, stable 1,2
-A method of using a dioxetane compound and measuring the luminescence caused by its decomposition (Japanese Patent Laid-Open No. 63-937).
77 publication). This method is considered to be a very excellent method because 1,2-dioxetane is very stable, the detection sensitivity is high, the reaction time is short, and the emission time is long.

【０００３】一方、固相を用いて、標識プロ−ブまたは
標識抗体により目的とする核酸や蛋白質を検出する場
合、固相への目的とする核酸や蛋白質以外の物質の非特
異的反応はノイズを上昇させ、測定感度を低下させる由
々しき問題である。これを避けるために反応系に界面活
性剤を添加することは必須であった。界面活性剤として
は、核酸プロ−ブを用いる方法においては、ＳＤＳ（ラ
ウリル硫酸ナトリウム）（ＷＯ９０／１０７１８等）、
ＳＬＳ（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）（Clin
ical Chemistry,35,6,1989等）等が一般的であり、免疫
反応ではＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００等
が一般的である。しかし本発明者等が１，２−ジオキセ
タンを用いた高感度検出の検討を進めていたところ、こ
れらの界面活性剤の一部は、１，２−ジオキセタンの分
解による発光を阻害することが明らかになった。ＳＤＳ
がその代表的な例である。ＳＤＳは本来酵素阻害剤とし
て知られており標識として酵素を用いた場合、発光量の
低下は酵素活性の低下によると思われたが、同時に基質
を用いた発色法により酵素活性を測定したところ活性の
低下が認められなかったことから、ＳＤＳは化学発光阻
害しているとが明らかであった。非特異的反応を防ぐ界
面活性剤は、試料を固相に固定する段階、またはその前
段階の固相の前処理、あるいは標識プロ−ブまたは標識
抗体を試料と反応させる段階で反応液に添加することが
効果的である。しかし、その際界面活性剤が固相に吸着
し、発光反応を阻害、結果的に検出感度の低下が起こっ
ていたと考えられる。On the other hand, when the target nucleic acid or protein is detected by the labeled probe or the labeled antibody using the solid phase, the non-specific reaction of the substance other than the target nucleic acid or protein with the solid phase is noisy. Is a serious problem that increases measurement sensitivity and decreases measurement sensitivity. In order to avoid this, it was essential to add a surfactant to the reaction system. In the method using a nucleic acid probe as the surfactant, SDS (sodium lauryl sulfate) (WO90 / 10718, etc.),
SLS (N-lauroyl sarcosine sodium) (Clin
ical Chemistry, 35, 6, 1989) and the like are common, and Tween-20, Triton-X100 and the like are common in the immunoreaction. However, when the present inventors have proceeded with the study of high-sensitivity detection using 1,2-dioxetane, it was revealed that some of these surfactants inhibit luminescence due to the decomposition of 1,2-dioxetane. Became. SDS
Is a typical example. SDS was originally known as an enzyme inhibitor, and when an enzyme was used as a label, the decrease in luminescence was thought to be due to a decrease in enzyme activity. At the same time, when the enzyme activity was measured by a coloring method using a substrate, the activity was It was clear that SDS inhibited chemiluminescence because no decrease was observed. A surfactant that prevents non-specific reactions is added to the reaction solution during the step of fixing the sample to the solid phase, the pretreatment of the solid phase in the previous step, or the step of reacting the labeled probe or labeled antibody with the sample. It is effective to do. However, at that time, it is considered that the surfactant was adsorbed on the solid phase and inhibited the luminescence reaction, resulting in a decrease in detection sensitivity.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標識
リガンドを用いて試料中の被分析物を高感度検出するた
めに、化学発光阻害の要因となる界面活性剤に代り、非
特異的反応を防ぐ組成物を用いて高感度検出を可能とす
るものである。SUMMARY OF THE INVENTION The object of the present invention is to use a labeled ligand to detect an analyte in a sample with high sensitivity, instead of a surfactant that causes chemiluminescence inhibition, instead of a non-specific It enables highly sensitive detection using a composition that prevents a reaction.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、一般的な界面活
性剤と同等に非特異的反応を防ぎ、かつ発光反応を阻害
しない物質として、ジヨードサリチル酸またはその塩が
有用であることを見出した。[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies to solve these problems, the inventors of the present invention prevent nonspecific reactions as well as general surfactants and do not inhibit luminescence reactions. It was found that diiodosalicylic acid or a salt thereof is useful as the substance.

【０００６】すなわち本発明は固相に固定化した試料中
の被分析物を、それと特異的に結合する標識されたリガ
ンドと反応させ、反応したリガンドの標識を化学発光で
測定することにより試料中に含まれる被分析物を検出す
る方法において、ジヨードサリチル酸またはその塩を含
む試薬を用いることを特徴とする化学発光による被分析
物の検出法である。That is, according to the present invention, an analyte in a sample immobilized on a solid phase is reacted with a labeled ligand that specifically binds to the analyte, and the label of the reacted ligand is measured by chemiluminescence. In the method for detecting an analyte contained in 1., a reagent containing diiodosalicylic acid or a salt thereof is used, which is a method for detecting an analyte by chemiluminescence.

【０００７】また本発明は、標識されたリガンドの希釈
液および／またはリガンドと分析物との反応液、および
／または非特異的反応を防ぐため固相を処理する反応液
がジヨードサリチル酸またはその塩を含む試薬であるこ
とを特徴とする化学発光による被分析物の検出用組成物
である。In the present invention, the diluted solution of the labeled ligand and / or the reaction solution of the ligand and the analyte, and / or the reaction solution for treating the solid phase to prevent nonspecific reaction are diiodosalicylic acid or its A composition for detecting an analyte by chemiluminescence, which is a reagent containing a salt.

【０００８】本発明において 被分析物とは抗原−抗体
反応を利用するイムノアッセイでは、抗原または抗体で
あり、核酸の相補性を利用する核酸プローブ測定では、
ＤＮＡあるいはＲＮＡなどである。固相とは、被分析物
を結合する物質を言い、マイクロタイタープレート、ラ
テックス粒子、磁性微粒子、ナイロン膜、ニトロセルロ
ース膜などから選択される。その結合方法は、物理的な
吸着、アミノ基やカルボキシル基等を介した共有結合、
架橋による結合等、被分析物を直接固相に固定化する方
法、あるいは被分析物と特異的に結合するリガンドを固
相に結合させ、そのリガンドを介して固定化する方法等
が考えられる。そして試料の固定化は、物理的吸着、官
能基を介した結合、架橋による結合等による固相への直
接結合であるか、または固相に固定化された被分析物と
特異的に結合するリガンドを介して行なわれる結合であ
る。In the present invention, the analyte is an antigen or an antibody in the immunoassay utilizing the antigen-antibody reaction, and in the nucleic acid probe measurement utilizing the complementarity of nucleic acids,
It is DNA or RNA. The solid phase refers to a substance that binds an analyte, and is selected from microtiter plates, latex particles, magnetic particles, nylon membranes, nitrocellulose membranes and the like. The bonding method is physical adsorption, covalent bonding via an amino group or a carboxyl group,
A method of immobilizing the analyte directly on the solid phase such as binding by cross-linking, or a method of immobilizing a ligand that specifically binds to the analyte on the solid phase and immobilizing the ligand via the ligand can be considered. Then, the immobilization of the sample is direct binding to the solid phase by physical adsorption, binding through a functional group, binding by cross-linking or the like, or specifically binds to the analyte immobilized on the solid phase. It is the binding that takes place via the ligand.

【０００９】標識としては１，２ージオキセタン化合物
を基質とし、その分解物が発光することが可能となるよ
うな反応を触媒する酵素、たとえばアルカリフォスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アリルエステラーゼ(T
etrahedron Letters;28,935,1987）などがある。また
１，２−ジオキセタン化合物を直接標識することも可能
である。As the label, an enzyme that catalyzes a reaction such that a decomposition product of the 1,2-dioxetane compound can be used as a substrate, such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, and allyl esterase (T
etrahedron Letters; 28,935,1987). It is also possible to directly label the 1,2-dioxetane compound.

【００１０】本発明の１，２−ジオキセタンは、下記式
で示される化合物である。The 1,2-dioxetane of the present invention is a compound represented by the following formula.

【００１１】[0011]

【化１】 〔式中、Ｒ₂ はＯＸ基で置換されたアリール基、Ｘは酵
素と易反応性の基であり、またＲ_1,Ｒ_3,Ｒ₄ はそれぞ
れ、光の発生を許容する受動性の有機性基である。また
式中、基Ｒ₁ と基Ｒ₂ はスピロ結合によって互いに結合
していてもよく、基Ｒ₃ と基Ｒ₄ は互いに結合して環式
の基を形成していてもよい。〕[Chemical 1] [In the formula, R ₂ is an aryl group substituted with an OX group, X is a group that easily reacts with an enzyme, and R _1, R _{3 and} R ₄ are each a passive organic group that allows the generation of light. It is a sexual group. Further, in the formula, the groups R ₁ and R ₂ may be bonded to each other by a spiro bond, and the groups R ₃ and R ₄ may be bonded to each other to form a cyclic group. ]

【００１２】具体的な化合物として、下記式で示される
化合物がある。A specific compound is a compound represented by the following formula.

【化２】 〔式中、Ｒは炭素数１−８を有する低級アルキル基であ
り、Ｘは酵素と易反応性の基である。〕 さらに具体的な化合物として、例えばLumiphos 480（和
光純薬製）(4-Methoxy-4(3-phosphate phenyl)spiro[1,
2-dioxetane-3,2'-adamantane] disodium saltなどが挙
げられる。[Chemical 2] [In the formula, R is a lower alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and X is a group easily reactive with an enzyme. ] As a more specific compound, for example, Lumiphos 480 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (4-Methoxy-4 (3-phosphate phenyl) spiro [1,
2-dioxetane-3,2'-adamantane] disodium salt and the like.

【００１３】これらの化合物は特開昭６３−９３７７７
号公報、特開平２−７２４号公報等に記載の方法により
製造される。化学発光の測定は、一般のルミノメーター
（ダイナテック社、マイクロライト1000等）を用いて測
定できる。またポラロイドフィルム、Ｘ線フィルムなど
に焼きつけることも可能である。These compounds are disclosed in JP-A-63-93777.
It is manufactured by the method described in JP-A No. 2-72424. The chemiluminescence can be measured using a general luminometer (Dynatech, Microlite 1000, etc.). It is also possible to print on a polaroid film, an X-ray film or the like.

【００１４】本発明の被分析物の検出法は、以下のいず
れかの方法で行なわれる。 ａ）被分析物を固相へ直接結合させ、被分析物と標識リ
ガンドとを反応させ、反応してない標識リガンド、また
は非特異的に反応している標識リガンドを洗浄により除
去し、固相に結合する標識を発光させ、その発光量を測
定する。 ｂ）被分析物と特異的に結合するリガンドを固相に結合
させ、標識した被分析物を捕捉させ、リガンドと反応し
ていない標識被分析物、あるいは非特異的に反応してい
る標識被分析物を洗浄により除去し、固相に結合する標
識を発光させ、その発光量を測定する。 ｃ）被分析物と特異的に結合するリガンドを固相に結合
させ、被分析物をリガンドと反応させ、さらに標識した
リガンドを被分析物と反応させ、反応していない標識リ
ガンド、あるいは非特異的に反応している標識リガンド
を洗浄により除去し、固相に結合する標識を発光させ、
その発光量を測定する。The method for detecting an analyte of the present invention is performed by any of the following methods. a) The analyte is directly bound to the solid phase, the analyte and the labeled ligand are reacted, and the unreacted labeled ligand or the nonspecifically reacted labeled ligand is removed by washing, and the solid phase The label that binds to is emitted and the amount of emitted light is measured. b) A ligand that specifically binds to the analyte is bound to the solid phase to capture the labeled analyte, and the labeled analyte that has not reacted with the ligand or the labeled analyte that has reacted nonspecifically. The analyte is removed by washing, the label bound to the solid phase is allowed to emit light, and the amount of emitted light is measured. c) A ligand that specifically binds to the analyte is bound to the solid phase, the analyte reacts with the ligand, and the labeled ligand reacts with the analyte, and the unreacted labeled ligand or non-specific The labeled ligand that has been chemically reacted is removed by washing, and the label bound to the solid phase is made to emit light,
The amount of light emission is measured.

【００１５】また被分析物と標識リガンドを反応させた
後に固相に結合したリガンドと反応させてもよい。さら
には固相に結合したリガンドと被分析物、被分析物と酵
素標識リガンドの反応は、同時に行うことも可能であ
る。固相に結合させるリガンドは、被分析物と特異的に
結合する部位、標識リガンドと特異的に結合する部位と
は異なる部位と特異的に結合する。Alternatively, the analyte may be reacted with the labeled ligand and then with the ligand bound to the solid phase. Furthermore, the reaction between the ligand bound to the solid phase and the analyte, and the analyte and the enzyme-labeled ligand can be performed simultaneously. The ligand bound to the solid phase specifically binds to a site that specifically binds to the analyte and a site different from the site that specifically binds to the labeled ligand.

【００１６】本発明では、標識リガンドならびに被分析
物の非特異的な結合を防ぐために、ａ）では被分析物を
固相へ結合させた後に不活性化剤で処理する。ｂ）、
ｃ）ではリガンドを固相に結合させた後に固相を不活性
化剤で処理する。またａ）に於いては、標識リガンドを
反応させる際に用いる反応液中に、ｂ）、ｃ）では被分
析物を反応させる際、および／または標識リガンドを反
応させる際、および／または標識リガンドを反応させる
際に、使用する反応液中に非特異的反応を防ぐための不
活性化剤を添加することもできる。ここで不活性化剤と
は、ジヨードサリチル酸またはその塩であり、塩として
はナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩などがあり、その濃度は０．１〜１０％、好まし
くは１〜２％である。In the present invention, in order to prevent non-specific binding of the labeled ligand and the analyte, in a), the analyte is bound to the solid phase and then treated with an inactivating agent. b),
In c), the ligand is bound to the solid phase and then the solid phase is treated with an inactivating agent. Further, in a), in the reaction solution used when reacting the labeled ligand, in b) and c) when the analyte is reacted and / or when the labeled ligand is reacted, and / or the labeled ligand At the time of reacting with, a deactivator for preventing non-specific reaction can be added to the reaction solution used. Here, the inactivating agent is diiodosalicylic acid or a salt thereof, and examples of the salt include sodium salt, potassium salt, magnesium salt, calcium salt and the like, and the concentration thereof is 0.1 to 10%, preferably 1 to 10. 2%.

【００１７】ジヨードサリチル酸またはその塩を含む試
薬は標識化されたリガンドの希釈液および／またはリガ
ンドと固相との反応液および／または非特異的反応を防
ぐため固相を処理する反応液として使用する。The reagent containing diiodosalicylic acid or a salt thereof is used as a diluent for the labeled ligand and / or a reaction solution between the ligand and the solid phase and / or a reaction solution for treating the solid phase to prevent nonspecific reaction. use.

【００１８】[0018]

【発明の効果】本発明により、１，２−ジオキセタンの
分解による発光を阻害することなく非特異的吸着を防ぐ
ことが可能となり、試料中の被分析物、核酸または蛋白
質を精度よく検出することができる。Industrial Applicability According to the present invention, non-specific adsorption can be prevented without inhibiting luminescence due to the decomposition of 1,2-dioxetane, and an analyte, nucleic acid or protein in a sample can be accurately detected. You can

【００１９】[0019]

【実施例】以下に本発明の実施例及び比較例を例示する
ことによって本発明をより一層明確なものとする。尚、
実施例中 “n ×SSC ”は 0.3M クエン酸ナトリウムお
よび 3.0M NaCl混合液の（20/n) 倍希釈液を表す。EXAMPLES The present invention will be further clarified by exemplifying Examples of the present invention and Comparative Examples below. still,
In the examples, “n × SSC” represents a (20 / n) -fold diluted solution of a 0.3M sodium citrate and 3.0M NaCl mixture.

【００２０】参考例１ 〔腸炎ビブリオ検出用プロ−ブの調製〕標識プロ−ブは
ＤＮＡ合成機３９１（アプライドバイオシステムズ社）
を用いてホスホアミダイド法により合成した。塩基配列
は 5-CCCCGGTTCTGAXAGATATTGTT-3 である。配列中、Ｘ
は５位にリンカ−ア−ムを有するウリジンを示す。この
プロ−ブは特開平４−２０２９９号公報に記載されたも
のである。Reference Example 1 [Preparation of probe for detecting Vibrio parahaemolyticus] A labeled probe was a DNA synthesizer 391 (Applied Biosystems).
Was synthesized by the phosphoamidide method. The base sequence is 5-CCCCGGTTCTGAXAGATATTGTT-3. X in the array
Represents a uridine having a linker arm at the 5-position. This probe is described in JP-A-4-20299.

【００２１】参考例２ 〔プロ−ブの酵素標識〕参考例１で得られたプロ−ブと
そのリンカ−ア−ムを介してのアルカリホスファタ−ゼ
との結合を、文献（Nucleic Acids Research,14,6155,1
968 ）に従って行った。リンカーオリゴヌクレオチド
（標識プロ−ブ）1.0 A₂₆₀を0.2M H₃BO₃ 60 μlに溶解
し、ここへスベリン酸ジスクシニミジル（ＤＤＳ）1.25
mgを加えて室温で２分間反応させた。反応液を1mM CH₃C
OONa（pH5.0 ）で平衡化したSephadex G-25 （ファルマ
シア社）カラム（1cm φ×30cm）でゲル濾過して過剰の
ＤＳＳを除去した。末端のアミノ基が活性化されたリン
カーオリゴヌクレオチドを、更にモル比で２倍等量のア
ルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）と
室温、１６時間反応させることでアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識核酸プローブを得た。Reference Example 2 [Enzyme Labeling of Probe] The binding of the probe obtained in Reference Example 1 and its alkaline phosphatase via the linker arm was analyzed by literature (Nucleic Acids Research). , 14,6155,1
968). Linker oligonucleotide (labeled probe) 1.0 A ₂₆₀ was dissolved in 60 μl of 0.2 MH ₃ BO ₃ and then disuccinimidyl suberate (DDS) 1.25 was added.
After adding mg, the mixture was reacted at room temperature for 2 minutes. Add 1 mM CH ₃ C to the reaction mixture.
The excess DSS was removed by gel filtration through a Sephadex G-25 (Pharmacia) column (1 cm φ × 30 cm) equilibrated with OONa (pH 5.0). An alkaline phosphatase-labeled nucleic acid probe was obtained by further reacting the linker oligonucleotide in which the terminal amino group was activated with a two-fold equimolar amount of alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) at room temperature for 16 hours.

【００２２】参考例３ 〔プロ−ブのビオチン化〕参考例１で得られたプロ−ブ
を以下の方法でビオチン化した。プロ−ブ（500 μg/m
l）112.5 μl 、１M トリスー塩酸バッファー（pH7.6
）37.5 μl 、15mM NHS−ビオチン（ピアス社）150 μ
l をエッペンドルフチューブに入れ、室温で一夜反応さ
せた後Sephadex G-25 （ファルマシア社）でゲル濾過し
精製した。Reference Example 3 [Biotinylation of probe] The probe obtained in Reference Example 1 was biotinylated by the following method. Probe (500 μg / m
l) 112.5 μl, 1M Tris-HCl buffer (pH 7.6
) 37.5 μl, 15 mM NHS-biotin (Pierce) 150 μm
l was put in an Eppendorf tube, reacted overnight at room temperature, and then purified by gel filtration with Sephadex G-25 (Pharmacia).

【００２３】参考例４ 〔腸炎ビブリオ遺伝子の調製〕ＴＤＨ産生腸炎ビブリオ
菌株を３％NaClを含むブレインハートインヒュージョン
培地（Brain Heart Infusion Agar ）に接種し、37℃で
一晩培養した。生育したコロニーをそれぞれ1.5ml のエ
ッペンドルフチューブにかきとり、希釈緩衝液（0.1M N
aH₂PO₄,pH7.0）300 μl に懸濁した。さらにここへプロ
テイナーゼＫ（ナカライテスク社）0.6mg 、溶菌液（8M
尿素、0.25％ドデシル硫酸ナトリウム、0.25％ラウリル
サルコシンナトリウム、50mM EDTA 、pH7.6 ）600 μl
を加えて撹拌し、60℃で30分間インキュベートした。得
られた溶菌液をフェノ−ルで２回、クロロホルムで１回
抽出後、エタノ−ル沈殿し、核酸を得た。Reference Example 4 [Preparation of Vibrio parahaemolyticus gene] A TDH-producing Vibrio parahaemolyticus strain was inoculated into Brain Heart Infusion Agar containing 3% NaCl and cultured at 37 ° C overnight. Each grown colony is scraped into a 1.5 ml Eppendorf tube and diluted with a dilution buffer (0.1 MN).
aH ₂ PO ₄ , pH 7.0) was suspended in 300 μl. Further to this, Proteinase K (Nacalai Tesque) 0.6 mg, lysate (8M
Urea, 0.25% sodium dodecyl sulfate, 0.25% sodium lauryl sarcosine, 50 mM EDTA, pH 7.6) 600 μl
Was added, stirred, and incubated at 60 ° C. for 30 minutes. The lysate thus obtained was extracted twice with phenol and once with chloroform, followed by ethanol precipitation to obtain a nucleic acid.

【００２４】実施例１ （腸炎ビブリオ遺伝子の固相への結合）固相はナイロン
膜（ハイボンドＮ＋；アマシャム社）を用いた。参考例
２で得られた核酸を滅菌水で希釈し、等容量の0.3N NaO
H を加えて室温で15分間処理し変性した。陰性検体とし
て、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（ファルマシア社）1 μg/1μl
を同様の方法で変性した。変性後ドットブロッター
（ＢＲＬ社）を用いて膜上に各試料を100 μl ずつ添加
しゆっくり吸引した。溶液がすべて吸引された後5×SSC
を100 μl ずつ添加吸引し、膜をドットブロッターか
らはずして 5×SSC で軽くすすいだ後、乾燥させた。Example 1 (Binding of Vibrio parahaemolyticus Gene to Solid Phase) A nylon membrane (High Bond N +; Amersham) was used as the solid phase. The nucleic acid obtained in Reference Example 2 was diluted with sterilized water to obtain an equal volume of 0.3N NaO.
H 2 was added and the mixture was treated at room temperature for 15 minutes to denature it. As a negative sample, human placenta-derived DNA (Pharmacia) 1 μg / 1 μl
Was denatured in a similar manner. After denaturation, 100 μl of each sample was added on the membrane using a dot blotter (BRL) and slowly sucked. 5 x SSC after all solution is aspirated
100 μl of each of the above was suctioned, the membrane was removed from the dot blotter, rinsed lightly with 5 × SSC, and then dried.

【００２５】（ハイブリダイゼ−ション）腸炎ビブリオ
遺伝子を固定したナイロン膜をハイブリバッグ（ＢＲＬ
社）に入れ、ハイブリバッファー［５×SSC 、1.0 ％ジ
ヨードサリチル酸リチウム（ナカライテスク社）、0.5
％牛血清アルブミン］を入れシールし、振盪させながら
15分間プレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリ
バッグからバッファーを除き、アルカリホスファターゼ
標識プロ−ブ溶液を加え、振盪させながら50℃で15分間
ハイブリダイゼ−ションを行った。膜をハイブリバッグ
から出し、洗浄液−１（２×SSC,1 ％ＳＤＳ）を入れた
バットに移して振盪させながら50℃で15分間洗浄した。
次に洗浄液−２（１×SSC,0.5 ％トリトン X-100）のバ
ットに移し振盪させながら室温で10分間洗浄した。(Hybridization) A nylon membrane on which the Vibrio parahaemolyticus gene has been immobilized is used as a hybrid bag (BRL).
Hybrid buffer [5 × SSC, 1.0% lithium diiodosalicylate (Nacalai Tesque), 0.5)
% Bovine serum albumin] and seal while shaking
Prehybridization was performed for 15 minutes. The buffer was removed from the hybrid bag, an alkaline phosphatase-labeled probe solution was added, and hybridization was carried out at 50 ° C. for 15 minutes while shaking. The membrane was taken out from the hybrid bag, transferred to a vat containing Wash Solution-1 (2 × SSC, 1% SDS), and washed at 50 ° C. for 15 minutes while shaking.
Next, the solution was transferred to a vat of Wash Solution-2 (1 × SSC, 0.5% Triton X-100) and washed at room temperature for 10 minutes while shaking.

【００２６】（標識プロ−ブの検出）ハイブリダイゼ−
ション後、洗浄の終った膜をキュベットに入れ、化学発
光基質、Lumiphos 480（和光純薬製）(4-Methoxy-4(3-p
hosphatephenyl)spiro[1,2-dioxentane-3,2'-adamantan
e] disodium salt (Lumigen PPD)) を100 μl 添加し、
37℃15分間酵素反応させた後、ＴＤ４０００ルミフォト
メ−タ−で発光量を測定した。その結果を表１に示し
た。陰性検体の発光量は低く非特異的吸着が抑えられて
いた。発光に対する阻害はおきていないと思われる。(Detection of labeled probe) Hybridase-
After the treatment, the washed membrane was put in a cuvette and the chemiluminescent substrate, Lumiphos 480 (Wako Pure Chemical Industries) (4-Methoxy-4 (3-p
hosphatephenyl) spiro [1,2-dioxentane-3,2'-adamantan
e] disodium salt (Lumigen PPD)) in 100 μl,
After enzymatic reaction at 37 ° C. for 15 minutes, the amount of luminescence was measured with a TD4000 Lumiphotometer. The results are shown in Table 1. The amount of luminescence of the negative sample was low and non-specific adsorption was suppressed. It seems that there is no inhibition on luminescence.

【００２７】比較例１ 実施例１と同じ腸炎ビブリオ固定膜を、界面活性剤であ
るＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）（ＷＯ９０／１０
７１８等）、ＳＬＳ（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリ
ウム）、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むハイブリダイゼーショ
ンバッファーでハイブリダイゼーションし、実施例１と
同様の方法で発光させ、発光量を測定した。その結果を
表１に示す。いずれの試薬でも実施例１の結果に比べ陽
性検体の発光量は低く、発光阻害がおきていることが分
る。Comparative Example 1 The same Vibrio parahaemolyticus fixed membrane as in Example 1 was prepared by using the surfactant SDS (sodium lauryl sulfate) (WO90 / 10).
718), SLS (N-lauroyl sarcosine sodium), and Tween-20 were used for hybridization, light was emitted in the same manner as in Example 1, and the amount of light emission was measured. The results are shown in Table 1. It can be seen that, with any of the reagents, the amount of luminescence of the positive sample was lower than that of the result of Example 1, and luminescence was inhibited.

【００２８】[0028]

【表１】 [Table 1]

【００２９】実施例２ 実施例１で得られた核酸固定化膜を実施例１のハイブリ
ダイゼーションバッファーでプレハイブリダイゼーショ
ンした。ハイブリバッグからバッファーを除き、参考例
３の方法で得られたビオチンプローブ溶液を加え、振盪
させながら50℃で15分間ハイブリダイゼーションを行っ
た。膜をハイブリバッグから出し、洗浄液−１（２×SS
C,1 ％ＳＤＳ）を入れたバットに移して振盪させながら
50℃で15分間洗浄した。次に洗浄液−２（１×SSC,0.5
％トリトン X-100）のバットに移し振盪させながら室温
で10分間洗浄した。次に膜をハイブリバッグに入れアル
カリ性ホスファターゼ・ストレプトアビジン・コンジュ
ゲート（クローンテック社）溶液を加え室温で１時間反
応させた。その後膜を蒸留水で室温で10分間洗浄した。Example 2 The nucleic acid-immobilized membrane obtained in Example 1 was prehybridized with the hybridization buffer of Example 1. The buffer was removed from the hybrid bag, the biotin probe solution obtained by the method of Reference Example 3 was added, and hybridization was carried out at 50 ° C. for 15 minutes while shaking. Remove the membrane from the hybrid bag and wash solution-1 (2 x SS
C, 1% SDS) while transferring to a vat with shaking
It was washed at 50 ° C for 15 minutes. Next, wash solution-2 (1 x SSC, 0.5
% Triton X-100), and washed at room temperature for 10 minutes while shaking. Next, the membrane was placed in a hybrid bag, an alkaline phosphatase-streptavidin-conjugate (Clontech) solution was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. The membrane was then washed with distilled water at room temperature for 10 minutes.

【００３０】（標識プロ−ブの検出）ハイブリダイゼ−
ション後、洗浄の終った膜をキュベットに入れ、化学発
光基質、Lumiphos 480（和光純薬製）を100 μl 添加
し、37℃15分間酵素反応させた後ＴＤ４０００ルミフォ
トメーターで発光量を測定した。その結果を表２に示し
た。(Detection of labeled probe) Hybridase-
After the reaction, the washed membrane was put in a cuvette, 100 μl of chemiluminescent substrate, Lumiphos 480 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the enzyme reaction was carried out at 37 ° C for 15 minutes, and then the luminescence amount was measured by TD4000 Lumiphotometer . The results are shown in Table 2.

【００３１】比較例２ 実施例２と同じ腸炎ビブリオ固定膜を、界面活性剤であ
るＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）（ＷＯ９０／１０
７１８等）、ＳＬＳ（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリ
ウム）、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むハイブリダイゼーショ
ンバッファーを用いてプレハイブリダイゼーションし、
実施例２の方法でハイブリダイゼーション、発光させ、
発光量を測定した。その結果を表２に示す。いずれの試
薬でもジヨードサリチル酸でプレハイブリダイゼーショ
ンを行った場合と比較して陽性検体の発光量は低く、発
光阻害がおきていることが分る。COMPARATIVE EXAMPLE 2 The same Vibrio parahaemolyticus membrane as in Example 2 was prepared by using the surfactant SDS (sodium lauryl sulfate) (WO90 / 10).
718), SLS (N-lauroyl sarcosine sodium), Tween-20, and pre-hybridization using a hybridization buffer,
Hybridization and luminescence were carried out by the method of Example 2,
The amount of luminescence was measured. The results are shown in Table 2. It can be seen that the amount of luminescence of the positive sample is lower than that in the case of performing prehybridization with diiodosalicylic acid in any of the reagents, indicating that luminescence inhibition occurs.

【００３２】[0032]

【表２】 [Table 2]

【００３３】参考例５ 〔ジヨードサリチル酸塩共存下での化学発光阻害〕アル
カリホスファターゼにジヨードサリチル酸塩、ＳＤＳ、
ＳＬＳをそれぞれ共存させ、１，２−ジオキセタンを用
いて発光量を測定した。アルカリホスファターゼ（ベー
リンガーマンハイム社）は、0.1％ジヨードサリチル酸
リチウム、または0.1 ％ＳＤＳ、または0.1 ％ＳＬＳを
含む50mMトリス−塩酸バッファーで希釈した。希釈した
アルカリホスファターゼをキュベットに10μl 分注し、
次に化学発光基質、Lumiphos 480を100 μl 加え、37℃
で15分間酵素反応させた後、発光量をＴＤ４０００ルミ
フォトメ−タ−で測定した。対照としてアルカリホスフ
ァターゼを50mMトリス−塩酸バッファーで希釈したもの
を同様の方法で測定した。その結果を図１に示した。ジ
ヨードサリチル酸リチウム共存下に比べ、ＳＤＳおよび
ＳＬＳ共存下では発光量の大幅な減少が認められ、発光
阻害がおきていることが示唆された。Reference Example 5 [Inhibition of chemiluminescence in the presence of diiodosalicylate] In addition to alkaline phosphatase, diiodosalicylate, SDS,
The SLS was made to coexist and the amount of luminescence was measured using 1,2-dioxetane. Alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim) was diluted with 50 mM Tris-HCl buffer containing 0.1% lithium diiodosalicylate, or 0.1% SDS, or 0.1% SLS. Dispense 10 μl of diluted alkaline phosphatase into a cuvette,
Next, add 100 μl of chemiluminescent substrate, Lumiphos 480, and incubate at 37 ℃.
After 15 minutes of enzymatic reaction, the amount of luminescence was measured with a TD4000 lumiphotometer. As a control, alkaline phosphatase diluted with 50 mM Tris-HCl buffer was measured by the same method. The results are shown in Fig. 1. A large decrease in the amount of luminescence was observed in the presence of SDS and SLS, compared with the presence of lithium diiodosalicylate, suggesting that luminescence inhibition occurred.

【００３４】[0034]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジ−：一本鎖 配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Thermostable Direct
Haemolysin）遺伝子の102 番目から125 番目のヌクレオ
チド配列と相同的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GAATAGATAT TGTT 24SEQ ID NO: 1 Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid topology-: Single-stranded sequence type: Other nucleic acid synthetic DNA Sequence features Location: 1..24 Method of determining features: S Other features : Vibrio parahaemolyticus TDH (Thermostable Direct
Haemolysin) has a sequence homologous to the 102nd to 125th nucleotide sequences. Array CCCCGGTTCT GAATAGATAT TGTT 24

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】不活性化剤共存下での化学発光阻害を示す。FIG. 1 shows chemiluminescence inhibition in the presence of an inactivating agent.

【符号の説明】 図中、●はジヨードサリチル酸リチウム共存、○はＳＤ
Ｓ共存、△はＳＬＳ共存、□は対照を示す。[Explanation of symbols] In the figure, ● indicates coexistence of lithium diiodosalicylate and ○ indicates SD.
S coexistence, Δ indicates SLS coexistence, and □ indicates control.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−311272（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−273200（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−53897（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−139298（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−103696（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−501203（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/78 G01N 33/543 ４Ｂ０６３ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) Reference JP-A-1-311272 (JP, A) JP-A-2-273200 (JP, A) JP-A-3-53897 (JP, A) JP-A-3- 139298 (JP, A) JP-A-5-103696 (JP, A) Special table 5-501203 (JP, A) (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) G01N 21/78 G01N 33 / 543 4B063 BIOSIS / WPI (DIALOG)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 固相に固定化した試料中の被分析物を、
それと特異的に結合する標識されたリガンドと反応さ
せ、反応したリガンドの標識を化学発光で測定すること
により試料中に含まれる被分析物を検出する方法におい
て、ジヨードサリチル酸またはその塩を含む試薬を用い
ることを特徴とする化学発光による被分析物の検出法。1. An analyte in a sample immobilized on a solid phase,
A reagent containing diiodosalicylic acid or a salt thereof, which comprises reacting with a labeled ligand that specifically binds to it, and detecting the analyte contained in the sample by measuring the label of the reacted ligand by chemiluminescence. A method for detecting an analyte by chemiluminescence, characterized by using. 【請求項２】 標識が酵素であり、酵素により特異的に
分解される基質が１，２−ジキセタン化合物である請求
項１に記載する化学発光による被分析物の検出法。2. The method for detecting an analyte by chemiluminescence according to claim 1, wherein the label is an enzyme, and the substrate specifically decomposed by the enzyme is a 1,2-dixetane compound. 【請求項３】 ジヨードサリチル酸またはその塩を含む
試薬が標識化されたリガンドの希釈液および／またはリ
ガンドと固相との反応液および／または非特異的反応を
防ぐために固相を処理する反応液である請求項１に記載
する化学発光による被分析物の検出法。3. A reaction in which a reagent containing diiodosalicylic acid or a salt thereof is diluted with a labeled ligand and / or a reaction liquid between a ligand and a solid phase and / or a solid phase is treated to prevent a nonspecific reaction. The method for detecting an analyte by chemiluminescence according to claim 1, which is a liquid. 【請求項４】 標識化されたリガンドの希釈液および／
またはリガンドと固相との反応液および／または非特異
的反応を防ぐために固相を処理する反応液がジヨードサ
リチル酸またはその塩を含む試薬であることを特徴とす
る化学発光による被分析物の検出用組成物。4. A diluted solution of a labeled ligand and / or
Alternatively, the reaction solution of the ligand and the solid phase and / or the reaction solution for treating the solid phase for preventing nonspecific reaction is a reagent containing diiodosalicylic acid or a salt thereof, and the analyte by chemiluminescence is characterized. A composition for detection.