JP3359822B2 - 高感度な物質の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の分析対象
物質を、化学反応に基づいて色素等の検出可能な物質を
生成する反応系を用い、前記検出可能な物質を測定する
ことにより定量する方法において、前記検出可能な物質
を層状無機化合物に吸着させて測定する、高感度な測定
方法に関するものである。本発明の方法は、生体成分や
環境試料の分析等に用いられる。

【０００２】

【従来の技術】試料中の分析対象物質、例えば体液中の
尿や血液等の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在す
る微量物質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等を検
出・定量する方法として、分析対象物質が関与する反応
系を用い、それによって定量的に生成する色素等の検出
可能な物質の量を測定する方法がある。

【０００３】このような方法としては、例えば分析対象
物の化学反応によって生成される過酸化水素を、ペルオ
キシダーゼの共存下にある被酸化性発色剤（色素前駆
体）と酸化還元反応を行わせ、生成する色素化合物を比
色定量する方法などがある。

【０００４】臨床検査においては、このような分析対象
物質から過酸化水素を生成させた後、この過酸化水素の
量を生成する色素化合物の定量によって測定し、これに
より分析対象物質の量を求める方法が、その簡便性から
多く用いられている。しかしながら、従来の方法では、
分析対象物質が微量であるとき、測定の感度が十分に得
られず、精度の高い測定結果が得られなかった。

【０００５】また電子伝達物質（メディエーター）と分
析対象物質の間に酵素などによって酸化／還元反応を起
こさせ、生じた電子伝達物質の酸化体／還元体を電極で
還元／酸化するときの電気化学応答から分析対象物質の
量を求める方法がある。しかしながら従来の方法では、
分析対象物質が微量であるときは、測定の感度が十分に
得られなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、分析対象物
質の化学反応に基づいて量的相関関係を伴って生成す
る、色素等の検出可能な物質を定量することによって、
分析対象物質を測定する高感度な測定方法を提供するこ
とを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、検出可能
な物質の生成反応を含む反応系に層状無機化合物を存在
させることにより、上記課題を解決できることを見出
し、本発明を完成したものである。

【０００８】すなわち、本発明は、試料中の分析対象物
質の化学反応に基づいて検出可能な物質を生成する反応
を含む反応系を用いて前記検出可能な物質の量を測定す
ることにより前記分析対象物質を測定する方法におい
て、前記反応系に層状無機化合物を加え、前記層状無機
化合物に前記検出可能な物質を吸着させる工程を含むこ
とを特徴とする物質の測定方法に関する。

【０００９】本発明においては、生成する検出可能な物
質を層状無機化合物に吸着させることにより、高感度な
測定が可能となる。すなわち、例えば検出可能な物質が
層状無機化合物に吸着して沈降する結果、光学的又は電
気化学的な検出における測定感度が高められる。この場
合、検出可能な物質が層状無機化合物に吸着してコロイ
ド状の凝集となって沈降する場合もあるが、必ずしも凝
集させる必要はない。

【００１０】本発明が適用される測定方法は、試料中の
分析対象物質の化学反応に基づいて前記分析対象物質と
量的相関関係を伴って検出可能な物質を生成する反応を
含む反応系を利用して、前記検出可能な物質を定量する
ことによって前記分析対象物質を定量測定する方法であ
れば、特に限定されるものではない。もちろん、検出可
能な物質が分析対象物質自身であってもよい。また、例
えば、前記分析対象物質の化学反応によって検出可能な
物質が直接生成される反応系を利用する場合に限らず、
前記分析対象物質の化学反応と検出可能な物質の生成反
応とが別の化学反応を介して間接的に結びついている場
合も含まれる。そのうち、本発明の方法は、検出可能な
物質が酸化還元反応によって生成する色素や電子伝達物
質である反応系を用いる測定方法、生成する検出可能な
物質がアゾ色素などの色素やイオノフォアと分析対象物
質との錯体などである反応系を用いる測定方法等に好ま
しく適用される。

【００１１】本発明の測定方法は、好ましくは体液中の
尿や血液等の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在す
る微量物質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等を検
出・定量する方法に利用される。

【００１２】特に、生体成分から酸化酵素反応によって
生成する過酸化水素と被酸化性発色剤との酸化還元反応
により定量的に生成する色素を光学的に測定する方法
が、臨床検査における体液中の各種成分の定量や環境分
析等に利用されているが、本発明の方法をこのような分
析・検出方法に用いることによって、高感度な測定が可
能となる。勿論、本発明の方法はこの例に限定されるも
のではない。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態を詳細
に説明する。本発明の測定方法は、具体的には以下に述
べるような検出可能な物質を生成する反応系を利用した
測定方法に適用するのが好ましい。

【００１４】検出可能な物質としては、本発明の層状無
機化合物に吸着可能なものであれば特に限定されない。
層状無機化合物に吸着可能なものとしては、具体的に
は、アミン、ポリアミン等のアミン類；イミン、ポリイ
ミン等のイミン類；ポリエン類；アニリン誘導体、ベン
ゾキノン誘導体、芳香族縮合環化合物等の芳香族化合
物；キサンテン、アジン、チアジン等の複素環化合物；
イオンとクラウンエーテルやバリノマイシンなどの環状
配位子との錯体；などであって、分子内に４級窒素原
子、フェノール性水酸基、スルホン酸基、カルボキシル
基を含んでいてもよい。

【００１５】層状無機化合物に吸着可能な物質は、例え
ば、H.Van Olphen著の成書「An Introduction to Clay
Colloid Chemistry, Second Edition」（Krieger Publi
shment, Malabar）の１１章「Interaction of Clays an
d Organic Compounds」などに詳述されている。また、
加藤忠義、特公昭50-8462（USP3,950,180）などには、
多数の吸着可能な化合物が紹介されている。このうち、
光学的方法、電気化学的方法によって検出できる物質が
挙げられる。

【００１６】光学的方法によって検出できる物質として
は、色素が挙げられる。ここで、色素には蛍光色素、発
光物質等も含まれ、また、色素を生成する反応とは、光
学的に検知しうるものが生成する反応であればよく、例
えば発色のみならず、変色、蛍光、発光等をもたらすも
のでもよい。

【００１７】色素としては、好ましくは、色素前駆体か
ら酸化還元反応、酸塩基反応、縮合反応などにより生成
される色素化合物が挙げられる。酸化還元反応に関連し
て生成する色素としては、４−アミノ−１，２−ジヒド
ロ−１，５−ジメチル−２−フェニル−３Ｈ−ピラゾー
ル−３−オン（４−アミノアンチピリン：以下、４−Ａ
Ａと略す。）に代表されるカプラーと、水素供与体（Ｎ
−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメ
チルアニリンなどのトリンダー試薬類等）が酸化縮合す
ることによって生成する色素；オルトトリジン、ベンジ
ジン類（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
など）の酸化発色体色素；２，６−ジクロロ−４−
［（４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シク
ロヘキサジエン−１−オンなどロイコ体が酸化されて生
成する色素；４−ヒドロキシフェニル酢酸などが酸化さ
れて生成する蛍光物質；化学発光物質など発光物質およ
びその励起体；テトラゾリウム塩の還元色素であるホル
マザン；１，１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウ
ム塩などが還元されて生成する色素；などが挙げられ
る。

【００１８】酸塩基反応で生成する色素としては、ブロ
モクレゾールグリーンなどｐＨの変化によって発色また
は変色する化合物が挙げられる。その他に、呈色反応等
として公知である種々の反応で生成する色素として、２
−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩な
どジアゾニウム塩のカップリングによって生成するアゾ
系色素；アルデヒドと２，３−ジメチル−２，３−ビス
（ヒドロキシアミノ）ブタンの反応など種々の公知の呈
色反応によって生成する色素；ヒスタミンとオルトフタ
ルアルデヒドとの反応など種々の公知の反応によって生
成する蛍光物質；４−メチルウンベリフェリルリン酸塩
などの酵素基質が酵素によって反応し生成する色素や蛍
光物質が挙げられる。

【００１９】また、配位結合、イオン結合で生成する色
素として、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５
−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミ
ノ］アニリン塩と金属イオンから生成した錯体である色
素が挙げられる。

【００２０】ここで、水素供与体とは、過酸化水素の共
存下、ペルオキシダーゼ作用で、４−アミノ−１，２−
ジヒドロ−１，５−ジメチル−２−フェニル−３Ｈ−ピ
ラゾール−３−オン（４−ＡＡ）や３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾンと縮合してキノン系色素を
生成するフェノール等の化合物であり、具体的にはジク
ロロフェノール、オルトメトキシフェノール、１，２，
３−トリヒドロキシベンゼン、ジメチルアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピルメタアニシジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５
−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
メタトルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）メタアニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）メタトル
イジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン等が挙げ
られる。

【００２１】例えば前記４−ＡＡと水素供与体とが過酸
化水素の存在下で反応してキノン系色素を生成する反応
系を利用する方法では、生成するキノン系色素を吸光光
度計などで測定して間接的に過酸化水素を定量すること
によって分析対象物質を定量するのである。

【００２２】またオルトトリジン、ベンジジン類として
は、オルトトリジン、ジアニシジン、３，３’−ジアミ
ノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，３’，５，
５’−テトラメチルベンジジン等が挙げられる。

【００２３】ロイコ体は酸化されて色素となり発色する
無色の色素前駆体である。ロイコ体が酸化された色素と
しては、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシフ
ェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエン−１−
オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ−４−ヒ
ドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジ
エン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３−イミノ
−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３−（ジエチ
ルアミノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム
塩、３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−
５−イウム塩、１−ヒドロキシ−５−メチルフェナジニ
ウム塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−
オン−１０−オキシドが挙げられ、ロイコ体としては、
４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリ
ン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホ
プロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタ
ン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，
５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−
ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、
４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−
（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス
（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。

【００２４】酸化されて発色する色素前駆体としては、
そのほかに、４−メトキシフェノール、４−エトキシフ
ェノール、２−エトキシフェノール、１−（２−ヒドロ
キシ−５−メトキシフェニル）エタノン、２−ヒドロキ
シ−５−メトキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−メト
キシベンズアルデヒド、２−ヒドロキシ−５−メトキシ
安息香酸メチル、４−メトキシ−２−ニトロフェノー
ル、２−クロロ−４−メトキシフェノール、４−ヒドロ
キシ−３−メトキシベンズアルデヒド、４−ヒドロキシ
−３−メトキシ安息香酸などが挙げられる。

【００２５】また、３−（４−ヒドロキシフェニル）−
２−プロペン酸、２−ヒドロキシフェニル酢酸、３−ヒ
ドロキシフェニル酢酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
３−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、２
−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸、４−アミノ安
息香酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ
安息香酸、４−アミノ−２−クロロ安息香酸、４−アミ
ノ−３−メチル安息香酸、４−アミノ−３−メトキシ安
息香酸、４−アミノフタル酸などが挙げられる。

【００２６】また、２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシ
ピリミジン、４，５−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミ
ジン、４−アミノ−２，６−ジヒドロキシピリミジン、
６−ヒドロキシ−２，４，５−トリアミノピリミジン、
４，５−ジアミノ−２，６−ジヒドロキシピリミジン、
４−アミノ−６−ヒドロキシ−２−メチルピリミジン、
４−アミノ−６−ヒドロキシピリミジン、４−アミノ−
６−ヒドロキシ−２−メトキシピリミジンなどが挙げら
れる。

【００２７】また、４−ヒドロキシフェニル酢酸などが
酸化されて蛍光物質を生成するが、蛍光物質としては、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、（４−ヒドロキシ−３−
メトキシフェニル）酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸、４−ヒドロキシ−（２−アミノエチ
ル）フェノール、４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルベンゼンメタミニウム、アルファアミノパラヒドロ
キシヒドロケイ皮酸、４−ヒドロキシフェネチルアミ
ン、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアニリド、
２，７−ジクロロフルオレッセインジアセテート等が、
酸化されて生成した蛍光物質が挙げられる。

【００２８】化学発光物質など発光物質としては、ホタ
ルルシフェリン、ウミホタルルシフェリン、エクオリ
ン、ルシゲニン誘導体、ルミノール誘導体、アクリジニ
ウムエステル、過シュウ酸エステル等が挙げられる。

【００２９】例えば前記ベンジジン類やロイコ体が過酸
化水素の存在下で酸化反応して発色する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計などで測定して
間接的に過酸化水素を定量することによって分析対象物
質を定量するのである。

【００３０】前記蛍光物質や発光物質が生成する反応系
を利用する方法では、蛍光光度計や発光光度計などで測
定して間接的に過酸化水素を定量することによって分析
対象物質を定量するのである。

【００３１】このような色素を生成する酸化反応におい
て、酸化反応に与る酸化剤は過酸化水素に限定されるも
のではなく、種々の公知の酸化剤を利用してもよい。ペ
ルオキシダーゼなどの酸化酵素を添加してもよい。また
色素が生成する酸化反応に先立って、前記酸化剤が生成
する反応が生じていてもよい。

【００３２】テトラゾリウム塩としては、２，３，５−
トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−
３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，
３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレ
ン）−ビス［２−（パラニトロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−（３，３’
−ジメトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４，４’−
ジイル）−ビス［２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウム］塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−
ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウ
ム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロ
フェニル）−５−［２，４−ジスルホフェニル］−２Ｈ
−テトラゾリウム塩、２−（４−ヨードフェニル）−３
−（２，４−ジニトロフェニル）−５−［２，４−ジス
ルホフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−
［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイル）−ビス
［２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３
−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジ
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。

【００３３】還元されて生成する色素としては、１，
１’−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，
１’−ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩等の還
元体が挙げられる。また７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノ
キサジン−３−オン−１０−オキシドなどが還元されて
蛍光物質を生成するが、蛍光物質としては、７−ヒドロ
キシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン−１０−オキシ
ド、５−シアノ−２，３−ビス（４−メチルフェニル）
−２Ｈ−テトラゾリウム塩、２，３−ビス（４−シアノ
フェニル）−５−シアノ−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が
還元されて生成する蛍光物質等が挙げられる。

【００３４】例えば前記テトラゾリウム塩やロイコ体が
還元剤の存在下で還元反応して発色する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計又は蛍光光度計
などで測定して間接的に還元剤を定量することによって
分析対象物質を定量するのである。また色素が生成する
還元反応に先立って還元剤が生成する反応が生じていて
もよい。

【００３５】このような色素を生成する還元反応におい
て、還元反応に与る還元剤としてニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートが好ましく用いられる。しかし
もちろんこれに限定されるものではなく、種々の公知の
還元剤を利用していてもよい。

【００３６】またｐＨの変化によって発色または変色す
る化合物としては、ブロモクレゾールグリーン、ブロモ
フェノールブルー、フェノールレッド、ブロモピロガロ
ールレッド、ピロガロールレッドなどのスルホンフタレ
イン系色素、マラカイトグリーン、ロゾリックアシドな
どのトリフェニルメタン系色素、キナルジンレッド、Ｎ
−（パラヒドロキシフェニル）−２，６−ジクロロパラ
ベンゾキノンイミンなどのキノリン系色素、７−ヒドロ
キシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン １０−オキシ
ドなどのオキサゾン系色素、６，７−ジヒドロキシ−４
−メチルクマリンなどのクマリン系色素、アニリンオリ
ゴマーなどの導電性高分子化合物が挙げられる。

【００３７】例えばｐＨの変化によって発色または変色
する化合物が酸または塩基によって発色または変色する
反応系を利用する方法では、生成する色素を吸光光度計
などで測定して間接的に酸または塩基を定量することに
よって分析対象物質を定量するのである。

【００３８】また例えばｐＨの変化によって発色または
変色する化合物が水素イオンによって発色または変色す
る反応系を利用する方法では、生成する色素を吸光光度
計などで測定して水素イオン濃度を定量することによっ
て分析対象物質を定量する。

【００３９】またジアゾニウム塩のカップリングによっ
て生成するアゾ系色素としては、インドキシルと２−メ
トキシ−４−モルホリノベンゼンジアゾニウム塩のカッ
プリングによって生成するアゾ系色素、ウロビリノーゲ
ンと３，３’−ジメトキシビフェニル−４，４’−ジア
ゾニウム塩のカップリングによって生成するアゾ系色
素、亜硝酸塩の存在下に４−アミノベンゼンアルソン酸
とＮ−１−ナフチルエチレンジアミンが反応して生成す
るアゾ系色素、同じく亜硝酸塩の存在下に２，４−ジク
ロロアニリンとＮ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’−１−ナフチル
ナフチルエチレンジアミンシュウ酸塩（津田試薬）とが
反応して生成するアゾ系色素などが挙げられる。

【００４０】前記アゾ系色素が生成する反応系を利用す
る方法では、生成する色素を吸光光度計などで測定して
反応の出発物質である分析対象物質（前記の例ではイン
ドキシル、ウロビリノーゲン、亜硝酸塩である）を定量
するのである。アゾ系色素が生成する反応は前記の例に
限定されるものではなく、種々の公知のアゾ系色素が生
成する反応に好ましく適用される。

【００４１】また種々の公知の呈色反応によって生成す
る色素としては、次に述べる公知の呈色反応において生
成する色素が挙げられるが、もちろんこれに限定される
ものではない。呈色反応としては、アルデヒドを検出す
るときの過酸化水素と１，４−ジアミノベンゼンの反
応、アルデヒドを検出するときの２，３−ジメチル−
２，３−ビス（ヒドロキシアミノ）ブタンの反応、アル
デヒドを検出するときの３−メチル−２−ベンゾチアゾ
リノンヒドラゾンと酸化剤の反応、二級アミンを検出す
るときの１０Ｈ−フェノチアジンと臭素の反応、チオー
ルを検出するときの２，２’−ジチオジピリジンの反応
などが挙げられる。

【００４２】前記公知の呈色反応を利用する方法では、
生成する色素を吸光光度計などで測定して反応の出発物
質である分析対象物質（前記の例ではアルデヒド、二級
アミン、チオールである）を定量するのである。利用で
きる公知の呈色反応は、もちろん前記の例に限定される
ものではない。

【００４３】また種々の公知の反応によって生成する蛍
光物質としては、次に述べる試薬を用いて実施される公
知の検出反応において生成する蛍光物質が挙げられる
が、もちろんこれに限定されるものではない。蛍光物質
を生成する検出反応に用いられる試薬としては、グアニ
ジノ化合物を検出するときの２−ヒドロキシ−１，２−
ジフェニルエタノン、ヒスタミンを検出するときのオル
トフタルアルデヒド、スペルミジンを検出するときのオ
ルトフタルアルデヒド、アルファケト酸を検出するとき
の１，２−ジアミノ−４，５−ジメトキシベンゼンなど
が挙げられる。

【００４４】前記公知の検出反応を利用する方法では、
生成する蛍光物質を蛍光光度計などで測定して反応の出
発物質である分析対象物質（前記の例ではグアニジノ化
合物、ヒスタミン、スペルミジン、アルファケト酸であ
る）を定量するのである。利用できる公知の検出反応
は、もちろん前記の例に限定されるものではない。

【００４５】また酵素によって反応し色素や蛍光物質を
生成する酵素基質としては、キモトリプシンの基質であ
るＮ−トシル−Ｌ−フェニルアラニン−２−アミドアク
リドン、アミノペプチターゼの基質であるＬ−アラニン
−２−アミドアクリドン、エステラーゼを測定するとき
の７−アセトキシ−Ｎ−メチルキノリニウム塩、エステ
ラーゼの基質である７−アセトキシ−３Ｈ−フェノキサ
ジン−３−オン、ホスファターゼの基質である４−メチ
ルウンベリフェリルリン酸塩などが挙げられるが、もち
ろんこれに限定されるものではない。

【００４６】例えば前記酵素基質が酵素によって分解さ
れる反応を利用する方法では、生成する色素や蛍光物質
を吸光光度計や蛍光光度計などで測定して間接的に酵素
を定量することによって分析対象物質を定量するのであ
る。酵素や酵素基質は例えば抗体やその断片に化学的に
結合していてもよい。

【００４７】また錯体である色素とは、金属イオンやア
ニオンと、配位子などの化合物とが、配位結合やイオン
結合で錯体を形成して生成した色素あるいは蛍光物質で
ある。金属イオンと錯体を形成し発色・変色する化合物
としては、金属指示薬やクロモイオノフォアとして知ら
れている化合物のほか、有色の遷移金属イオンと錯体を
形成して着色する化合物が含まれるが、具体的にはエチ
レンジアミン四酢酸、２，２−ビピリジン、１−ヒドロ
キシ−２−（２−ヒドロキシフェニルアゾ）ベンゼン、
ジベンゾ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキシル−１
８−クラウン−６、環状ポリアミン類、カリックス
［４］アレーン、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチ
ル）アミノメチル］−１，２−ジヒドロキシアンスラキ
ノン、５’，５”−ジブロモピロガロールスルホンフタ
レイン、２−ヒドロキシ−１−（１−ヒドロキシ−２−
ナフチルアゾ）−６−ニトロ−４−ナフタレンスルホン
酸塩、２，６−ジクロロ−４’−ヒドロキシ−３’，
３”−ジメチルフクソン−５’，５”−二カルボン酸
塩、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチ
ル）アミノメチル］フルオレッセイン、８−［Ｎ，Ｎ−
ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−４−メチル
ウンベリフェロン、２，７−ビス（２−アルソノフェニ
ルアゾ）−１，８−ジヒドロキシ−３，６−ナフタレン
ジスルホン酸、５−クロロ−２−ヒドロキシ−３−
（２，４−ジヒドロキシフェニルアゾ）ベンゼンスルホ
ン酸、５−［（ヘキサヒドロ−２，４，６−トリオキソ
−５−ピリミジニル）イミノ］−２，４，６（１Ｈ，３
Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン塩、２−（５−ブロモ
−２−ピリジルアゾ）−５−［Ｎ−プロピル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）アミノ］アニリン塩、１，８−ジヒ
ドロキシ−２−（２−ピリジルアゾ）−３，６−ナフタ
レンジスルホン酸塩、２−ニトロソ−５−［Ｎ−プロピ
ル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アミノ］フェノール等
が挙げられる。

【００４８】また特に一価のカチオンと有色錯体を生成
する化合物としては、テトラキス［３，５−ビス（トリ
フルオロメチル）フェニル］ボレート塩、テトラフェニ
ルホスホニウム塩等が挙げられる。

【００４９】また特にカルシウムイオンなどと蛍光錯体
を生成する化合物としては、１−［２−アミノ−５−
（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９
−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５
−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四
酢酸塩、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−
６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−キサンテニル）フェ
ノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）
エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−ペンタアセトキ
シメチルエステル、１−［６−アミノ−２−（５−カル
ボキシ−２−オギザゾイル）−５−ベンゾフラニロキ
シ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタ
ン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、１−［６−アミノ
−２−（５−カルボキシ−２−オギザゾイル）−５−ベ
ンゾフラニロキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフ
ェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸 ペン
タアセトキシメチルエステル、１−［２−アミノ−５−
（６−カルボキシ−２−インドリル）フェノキシ］−２
−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、１−［２−アミノ−５−
（６−カルボキシ−２−インドリル）フェノキシ］−２
−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸 ペンタアセトキシメチルエス
テル、８−アミノ−２−［（２−アミノ−５−メチルフ
ェノキシ）メチル］−６−メトキシキノリン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−四酢酸塩、８−アミノ−２−［（２−アミ
ノ−５−メチルフェノキシ）メチル］−６−メトキシキ
ノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシ
メチルエステル、３，３’−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カル
ボキシメチル）アミノメチル］フルオレッセイン、８−
［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］−
４−メチルウンベリフェロンなどが挙げられる。

【００５０】またアニオンと有色錯体を形成するテトラ
フェニルアルソニウム塩、塩化物イオンと錯体を形成す
ると蛍光強度が減少する臭化Ｎ−エトキシカルボニルメ
チル−６−メトキシキノリニウム、ホウ素と錯体を形成
する８−ヒドロキシ−１−（サリシリデンアミノ）−
３，６−ナフタレンジスルホン酸塩などが挙げられる。

【００５１】前記錯体が形成される反応を利用する方法
では、イオンと配位子などが生成する色素や蛍光物質を
吸光光度計や蛍光光度計などで測定して色素や蛍光物質
の量を定量することによって分析対象物質（多くの場
合、イオンである）を定量するのである。

【００５２】今まで光学的に検出可能な物質について述
べてきたが、次に電気化学的に検出可能な物質について
説明する。電気化学的方法によって検出できる物質とし
ては、電子伝達物質（メディエーター）やイオノフォア
とイオンとの錯体などが挙げられる。

【００５３】電子伝達物質とは、分析対象物質を酵素な
どによって酸化／還元し、その際分析対象物質から／に
直接的に電子を受容／供与する化学物質であって、電子
伝達物質の還元体／酸化体を電極で酸化／還元するとき
の電気化学応答から分析対象物質を定量するのである。
また電子伝達物質と分析対象物質が直接的に電子を授受
していなくても良く、電子伝達物質は、分析対象物質を
酵素などによって酸化／還元し、その際分析対象物質か
らまたは分析対象物質に、間接的に電子を受容／供与す
る化学物質であっても良い。分析対象物質と定量的関係
にある電子伝達物質の酸化体／還元体を電極で還元／酸
化するときの電気化学応答から分析対象物質を定量する
のである。

【００５４】具体的には電子伝達物質として、１，１’
−ジメチル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，１’−
ジベンジル−４，４’−ビピリジリウム塩、１，４−ジ
アミノベンゼン、２−メチル−１，４−ナフトキノン、
Ｎ−メチルフェナジニウム塩、１−ヒドロキシ−５−メ
チルフェナジニウム塩、１−メトキシ−５−メチルフェ
ナジニウム塩、９−ジメチルアミノベンゾアルファフェ
ノキサジン−７−イウム塩、フェロセン誘導体、ヘキサ
シアノ鉄（ＩＩ）塩、７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキ
サジン−３−オン １０−オキシド、３，７−ジアミノ
−５−フェニルフェナジニウム塩、３−（ジエチルアミ
ノ）−７−アミノ−５−フェニルフェナジニウム塩、
１，４-ベンゼンジオール、１，４−ジヒドロキシ−
２，３，５−トリメチルベンゼン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチル−１，４−ベンゼンジアミン、Δ２，
２’−ビ−１，３−ジチオール、２，６−ジメチルベン
ゾキノン、２，５−ジメチルベンゾキノン、２，３，
５，６−テトラメチル−２，５−シクロヘキサジエン−
１，４−ジオン、２，６−ジクロロ−４−［（４−ヒド
ロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロヘキサジエ
ン−１−オン、２，６−ジクロロ−４−［（３−クロロ
−４−ヒドロキシフェニル）イミノ］−２，５−シクロ
ヘキサジエン−１−オン、７−（ジエチルアミノ）−３
−イミノ−８−メチル−３Ｈ−フェノキサジン塩、３，
７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン−５−イウ
ム塩等が挙げられる。

【００５５】この例において検出可能な物質とは電子伝
達物質の酸化体／還元体であり、検出可能な物質を生成
する反応とは電子伝達物質の酸化／還元反応である。前
述のように分析対象物質と定量的関係をもって存在する
電子伝達物質の酸化体／還元体を電極で還元／酸化する
ときの酸化還元電流などの電気化学応答を測定し、分析
対象物質を定量するのである。例えば、アスコルビン酸
や過酸化水素のように、電子供与／受容物質として電極
上で酸化／還元されるときの電気化学的応答を測定し、
その応答結果から分析対象物質を間接的に定量すること
ができる。

【００５６】イオノフォアとは、分析対象物質である特
定のイオンと選択的に配位結合またはイオン結合を生
じ、錯体となる配位子などの化合物であって、液膜電極
で用いられていることは特に良く知られている。

【００５７】具体的には、カチオンと錯体をつくるイオ
ノフォアとして、テトラキス［３，５−ビス（トリフル
オロメチル）フェニル］ボレート塩、テトラフェニルホ
スホニウム塩、バリノマイシン、シクロ（Ｎ’，Ｎ’−
ジオクチル−Ｄ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−
アラニル）₂、ビス（ベンゾ−１５−クラウン−５）、
ビス［（ベンゾ−１５−クラウン−５）−４−メチル］
ピメレート、ビス（１２−クラウン−４）、ビス［（１
２−クラウン−４）メチル］−２−ドデシル−２−メチ
ルマロネート、１４−クラウン−４、ドデシル−メチル
−１４−クラウン−４、６，６−ジベンジル−１，４，
８，１１−テトラオキサシクロテトラデカン、ジベンゾ
−１８−クラウン−６、ジシクロヘキシル−１８−クラ
ウン−６、４，１６−ジ−Ｎ−オクタデシルカルバモイ
ル−３−オキサブチリル−１，７，１０，１３，１９−
ペンタオキサ−４，１６−ジアザシクロヘンイコサン等
が挙げられる。

【００５８】またアニオンと錯体をつくるイオノフォア
として、テトラフェニルアルソニウム塩、６−メトキシ
−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム塩などが挙
げられる。

【００５９】液膜電極とは、電極の表面に多孔質の高分
子層などを設け、高分子層にイオノフォアを染み込ま
せ、試料液中の特定のイオンのみと結合させて高分子層
内を移動させることによって、ある特定のイオンのみを
選択分離させ、その際に生じる膜電位を測定し分析対象
物質である特定のイオンを定量する方法である。もちろ
ん電気化学的検出方法にイオノフォアが用いられるの
は、この液膜電極の例に限られるわけではない。

【００６０】バルク液中でイオノフォアとある特定のイ
オンを結合させ、結合していないイオンが移動できず、
結合して生成した錯体のみが移動できる高分子層を設け
た電極において該イオンの選択分離を行い、その際に生
じる膜電位を測定し分析対象物質である該イオンを定量
することができる。

【００６１】この例において検出可能な物質とはイオノ
フォアと特定のイオンとの錯体であり、検出可能な物質
を生成する反応とは配位結合またはイオン結合によるイ
オノフォアと特定のイオンとの錯体形成反応である。前
述のように分析対象物質である特定のイオンの濃度に応
じて発生する膜電位を電気化学的に測定することによ
り、分析対象物質を定量するのである。

【００６２】本発明の測定方法は、このような検出可能
な物質を生成する反応系を利用する方法に好ましく適用
されるが、好ましくは以下のような方法が挙げられる。

【００６３】(a)過酸化水素の生成反応または過酸化水
素を酸化剤とする酸化反応を含む反応系を利用する方法
であり、具体的には、例えば分析対象物質から酸化酵素
反応系を介して過酸化水素を生成させ、これをペルオキ
シダーゼの共存下、被酸化性発色体（色素前駆体）と酸
化還元反応を行わせて、この反応により生成する色素化
合物の量を測定する方法。

【００６４】(b)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤＨ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）を生成する反応、
または、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを還元剤として使
用する反応を含む反応系を利用する方法であって、具体
的には、例えば、分析対象物質から、脱水素酵素反応系
を介してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成させ、これを
電子伝達系存在下に色素前駆体に作用させて還元し、こ
れにより生成する色素化合物の量を測定する方法。

【００６５】(c)酸性下で芳香性第１アミンに亜硝酸を
反応させてジアゾニウム塩を生成させ、生成したジアゾ
ニウム塩と被カップリング試薬とを反応させ、次いで生
成したアゾ色素を定量する亜硝酸塩、ジアゾニウム塩、
カップリング化合物の量を測定する方法。

【００６６】(d)リン酸エステルを有する４−メチルウ
ンベリフェロンなどの蛍光酵素基質が、アルカリホスフ
ァターゼの作用によってリン酸塩を遊離して蛍光物質を
生成し、生成した蛍光物質に励起光を照射し発する蛍光
を測定する、蛍光酵素基質で標識された物質やアルカリ
ホスファターゼの量を測定する方法。

【００６７】(e)酸化還元酵素などによって１，４−ジ
アミノベンゼンなどのメディエーターを酸化／還元し、
生成したメディエーターの酸化体／還元体が電極反応で
還元／酸化されるときの電流応答を測定する、酸化還元
酵素や酸化還元酵素で標識された物質の量の測定方法。

【００６８】もちろん、検出可能な物質とは分析対象物
質自身であってもよく、その例としては、水に溶解した
グルコースが電極表面で酸化される際の電気化学的応答
を測定し、分析対象物質を定量するものがある。

【００６９】このような反応系で測定可能な分析対象物
質としては、体液中の尿や血液等の生体成分、食品、医
薬、自然環境に存在する微量物質、産業化学物質、廃棄
物中の微量物質等を挙げることができる。

【００７０】次に、本発明の層状無機化合物について説
明する。本発明の層状無機化合物は、Ｓｉ四面体、Ａｌ
八面体等の多面体が平面状に連なったシート構造が層状
に重なった結晶構造を有する無機化合物であり、層状粘
土鉱物及びハイドロタルサイトが含まれる。

【００７１】粘土鉱物とは、粘土（細かい土状の無機粒
状物で、水で湿った状態で可塑性のあるもの）の大半を
占めるアルミニウムケイ酸塩鉱物をいい、通常は、Ｓｉ
が４つのＯ（酸素原子）に囲まれたＳｉ四面体とＡｌ又
はＭｇが６つのＯＨ基あるいはＯに囲まれたＡｌ（又は
Ｍｇ）八面体を最小構成単位としている。

【００７２】層状粘土鉱物の構造は、Ｓｉ四面体が１つ
の面を共有し、残る頂点のＯを同方向に向けて六角網状
のシートを形成し（四面体シート）、一方Ａｌ（又はＭ
ｇ）八面体が稜角を共有してシートを形成し（八面体シ
ート）、これらが層状に重なったものである。四面体シ
ートと八面体シートが一枚づつ重なってできた１：１層
が何枚も積み重なってできた鉱物を１：１型鉱物、一枚
の八面体シートを２枚の四面体シートで挟んだ２：１層
が何枚も積み重なってできた鉱物を２：１型鉱物、２：
１型の層間にもう一枚八面体シートが挟まったものを
２：１：１型鉱物という。また、八面体シートがＭｇ
（ＯＨ）₂ですべての八面***置に金属イオンが存在す
るものを３八面体型（Trioctahedral）、八面体シート
がＡｌ（ＯＨ）₃で１／３が空孔になっているものを２
八面体型（Dioctahedral）という。本発明で用いる層状
無機化合物としては、２：１型鉱物が好ましい。

【００７３】本発明の層状無機化合物を構成する元素
は、好ましくは、リチウム、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、アルミニウム、ケイ素、酸素、水素、フッ
素、及び炭素から選ばれる少なくとも一つ以上から構成
され、具体的には以下に示す式１〜９のいずれか一つで
表される化合物が挙げられる。尚、これらの式に結晶水
が含まれたものでもよい。もちろん、これらの式は鉱物
学的又は化学的に純粋な化合物としての式であって、現
実の層状無機化合物では、ケイ酸ナトリウムなどの不純
物を含む場合があるため、元素分析などによって化学式
を定めたものとしても、これらの式と必ずしも一致しな
い場合があることは、例えば、文献（D. W, Thompson,
J. T. Butterworth, J. Colloid Interf. Sci., 151, 2
36-243(1992)）においても記述されていることである。

【００７４】

【化１】 Ｍ_xＳｉ₄（Ａｌ_2-xＭｇ_x）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（１） （式１においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は２未満の正数である。）

【００７５】

【化２】 Ｍ_x（Ｓｉ_4-xＡｌ_x）Ａｌ₂Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（２） （式２においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は４未満の正数である。）

【００７６】

【化３】 Ｍ_xＳｉ₄（Ｍｇ_3-xＬｉ_x）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（３） （式３においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は３未満の正数である。）

【００７７】

【化４】 Ｍ_x（Ｓｉ_4-xＡｌ_x）Ｍｇ₃Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（４） （式４においてＭはＨ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのうちいずれか
ひとつであって、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、x
は４未満の正数である。）

【００７８】

【化５】ＭＳｉ₄Ｍｇ_2.5Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（５） （式５においてＭはＬｉ、Ｎａのうちいずれかであっ
て、好ましくはＮａである。ＸはＯＨ、Ｆのいずれかで
あって、好ましくはＦである。）

【００７９】

【化６】Ｍ₂Ｓｉ₄Ｍｇ₂Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（６） （式６においてＭはＬｉ、Ｎａのうちいずれかであっ
て、好ましくはＬｉである。ＸはＯＨ、Ｆのいずれかで
あって、好ましくはＦである。）

【００８０】

【化７】Ｍｇ₆Ａｌ₂（ＯＨ）₁₆Ｘ_x ・・・（７） （式７においてＸはハロゲン、Ｎ０₃、ＳＯ₄、ＣＯ₃、
ＯＨのいずれかもしくは有機酸のアニオン形であって、
好ましくはＣＯ₃である。xはＸがハロゲン、ＯＨ、ＮＯ
₃、一価の有機酸のとき２であって、ＸがＳＯ₄、Ｃ
Ｏ₃、二価の有機酸のとき１である。）

【００８１】

【化８】 Ｎａ_0.33Ｓｉ₄（Ｍｇ_2.67Ｌｉ_0.33）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（８） （式８において、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、好
ましくはＯＨである。）

【００８２】

【化９】 Ｎａ_a-b（Ｓｉ_4-aＡｌ_a）（Ｍｇ_3-bＡｌ_b）Ｏ₁₀Ｘ₂ ・・・（９） （式９において、ＸはＯＨ、Ｆのいずれかであって、好
ましくはＯＨである。ａは４未満の正数であって、ｂは
３未満の正数であって、ａ−ｂ＞０である。）

【００８３】本発明の層状無機化合物の具体例として
は、カオリナイト、ハロイサイト、蛇紋石等の１：１型
粘土鉱物；タルク、パイロフィライト、スメクタイト、
バーミキュライト（上記式中、式２で表されるもの、以
下同様）、フッ素四ケイ素雲母（式５）やテニオナイト
（式６）を含む雲母等の２：１型粘土鉱物；クロライト
等の２：１：１型粘土鉱物；２：１〜２：１：１型の中
間鉱物；イモゴライト等の準晶質粘土鉱物；アロフェン
等の非晶質粘土鉱物；ハイドロタルサイト（式７）；等
が挙げられる。

【００８４】また、スメクタイトには、同型置換された
四面体、八面体格子中のイオン種によってモンモリロナ
イト（式１）、モンモリロナイトが４０〜８０％含まれ
る天然物であるベントナイト、バイデライト（式２）等
の２八面体型；ヘクトライト（式３、好ましくは式
８）、サポナイト（式４、好ましくは式９）、ノントロ
ナイト等の３八面体型；等が含まれる。

【００８５】尚、ハイドロタルサイトは、上記式中の式
７、具体的にはＭｇ₆Ａｌ₂（ＯＨ） ₁₆ＣＯ₃・４Ｈ₂Ｏで
表される層状鉱物であり、Ｍｇ（ＯＨ）₂（ブルーサイ
ト：中心にＭｇ²⁺を持つ酸素八面体の層が積み重なった
構造を持つ）のＭｇ²⁺の一部がＡｌ³⁺に同型置換したも
のであって正電荷を有するが、層間のＣＯ₃ ^2-によって
電気的中性を保っており、陰イオン交換能をもつもので
ある。ケイ酸塩鉱物ではないが、しばしば粘土鉱物とし
て取り扱われる。

【００８６】上述した本発明の層状無機化合物のうちい
くつかの組成を下記表１に示す。

【００８７】

【表１】 ＜表１＞ ──────────────────────────────────── 鉱物名 組成^* ──────────────────────────────────── カオリナイト（Kaolinite） Si₂Al₂O₅(OH)₄ ハロイサイト Si₂Al₂O₅(OH)₄・2H₂O 蛇紋石 Si₂(Mg²⁺,Fe²⁺)₃O₅(OH)₄ タルク（Talc） Si₄Mg₃(OH)₂O₁₀ パイロフィライト（Pyrophyllite） Si₄Al₂(OH)₂O₁₀ モンモリロナイト（Montmorillonite） MI_xSi₄(Al_2-xMg_x)O₁₀(OH)₂・nH₂O バイデライト（Beidellite） MI_x(Si_4-xAl_x)Al₂O₁₀(OH)₂・nH₂O ヘクトライト（Hectorite） MI_xSi₄(Mg_3-xLi_x)O₁₀(OH,F)₂・nH₂O サポナイト（Saponite） MI_x(Si_4-xAl_x)Mg₃O₁₀(0H)₂・nH₂O ノントロナイト（Nontronite） MI_x(Si_4-xAl_x)Fe₂O₁₀(OH)₂・nH₂O バーミキュライト（Vermiculite） MI_x(Si_4-xAl_x)Al₂O₁₀(OH)₂・nH₂O ハイドロタルサイト（Hydrotalcite） Mg₆Al₂(OH)₁₆CO₃・4H₂O ──────────────────────────────────── * : MI は１価陽イオンで代表させた交換性陽イオン

【００８８】本発明の層状無機化合物の平均粒径は、均
一な分散が行える程度に小さな粒径であれば特に限定は
されない。また、層状無機化合物は一般に板状の粒子で
あり且つ複数個の粒子が凝集と劈開を繰り返す動的平衡
にあるので、平均粒径の定義を行うこと自体が困難であ
るから、好ましい平均粒径の範囲を明示することは容易
ではないが、強いて言及すれば、光散乱法や電子顕微鏡
での観察などの手段によって測定された値が、水中に分
散させた状態で、１ｎｍ以上２０μｍ以下のものが好ま
しい。さらには１０ｎｍ以上２μｍ以下のものが好まし
い。又、これらはイオン交換能を有することによって、
色素等の電荷や極性に応じて吸着を行うものと考えら
れ、イオン交換能は、層を構成する金属イオンの置換に
よって生じた層電荷に由来する。そこで、層電荷の絶対
値は、表１に示した式の組成の原子団について０．２〜
１程度の値を有することが好ましい。

【００８９】また、鉄等の遷移金属イオンを置換イオン
として構造中に、又は不純物として含むものは、それに
よって着色を生じ、また酸化還元特性等を示して副反応
を生じる結果、透明性等に劣ることとなるため、遷移金
属イオンによる置換がない方が好ましいが、これに限定
されるものではない。

【００９０】これら粘土鉱物等の層状無機化合物には４
級アンモニウム塩などのピラーを立てて層間距離や層間
の電荷や極性をあらかじめ調整することもできる。本発
明の上述した層状無機化合物のうち、より好ましいもの
は２：１型粘土鉱物であり、特に好ましいものはイオン
交換能を有する膨潤性粘土鉱物である。

【００９１】膨潤性粘土鉱物のうち、更に好ましいもの
はベントナイト、スメクタイト、バーミキュライトまた
は合成フッ素雲母であり、特に好ましくは合成ヘクトラ
イトもしくは合成サポナイト等の合成スメクタイト、ま
たは合成フッ素雲母で代表される膨潤性合成雲母（又は
Ｎａ型雲母）等の合成雲母（天然の雲母は通常非膨潤性
の粘土鉱物である）である。尚、膨潤作用は交換性のカ
チオンまたはアニオンを持つことに由来し、層間あるい
はカードハウス構造と呼ばれる粘土鉱物等の表面に検出
可能な物質を迅速に吸着するため、膨潤性の層状無機化
合物を用いるのが好ましい。粘土鉱物はアニオン性物
質、カチオン性物質、非イオン性の極性有機化合物を、
ハイドロタルサイトはアニオン性化合物を吸着する。層
状無機化合物に吸着可能な化合物は、例えば、H.Van Ol
phen著の成書「An Introduction toClay Colloid Chemi
stry, Second Edition」（Krieger Publishment, Malab
ar）の１１章「Interaction of Clays and Organic Com
pounds」などに詳述されている。本発明においてはこれ
らを単独で、または２種以上を併用してもよい。

【００９２】本発明の上述した層状無機化合物は、合成
物、天然物に限らず使用できるが、好ましくは合成物が
用いられる。合成物は、天然物とは異なり、化学的に均
一で吸着した検出可能な物質を定量的に取り扱うことが
可能であり、更に層間に鉄等の有色の金属を含まず透明
度が高いため、定量的、光学的取り扱いが可能だからで
ある。尚、ここで、「合成」とは、少なくともスメクタ
イトの場合は、主に水熱合成法又は溶融法によって製造
されたものをいう。天然物を精製して得られる膨潤性粘
土鉱物も好ましく用いられる。

【００９３】このような層状無機化合物はいくつか市販
されており、たとえばコープケミカル（株）製の商品名
ルーセンタイトＳＷＮもしくはルーセンタイトＳＷＦ
（合成ヘクトライト）またはＭＥ（フッ素雲母）、クニ
ミネ工業（株）製の商品名スメクトンＳＡ（合成サポナ
イト）、協和化学工業（株）製の商品名チキソピーＷ
（合成ヘクトライト）または商品名キョーワード５００
（合成ハイドロタルサイト）、ラポー社製の商品名ラポ
ナイト（合成ヘクトライト）、（株）ナカライテスク社
販売の天然ベントナイト、（株）豊順鉱業社製の商品名
マルチゲル（ベントナイト）等が挙げられる。

【００９４】上述した層状無機化合物は、アミン、ポリ
エン、各種色素など有機化合物を吸着することが知られ
ており、従来、油、色素などを吸着する水処理剤、ワイ
ンやみりん等の製造時の蛋白除去剤、不純物吸着除去に
よる脱色精製剤等として用いられてきた。また、これら
層状無機化合物は、メタクロマジーと呼ばれる現象を生
じるなど、特定の反応場を与える素材として知られてお
り、更に、最近では天然色素の光安定性を向上させるこ
とも知られているが、本発明においては、この層状無機
化合物に検出可能な物質を吸着させることにより、測定
の高感度化が可能となることを見出したものである。か
かる粘土鉱物等の層状無機化合物を物質の測定に使用し
て高感度化を図った例は未だ見い出されていない。

【００９５】更に驚くべきことに、反応系にあらかじめ
前記層状無機化合物を添加しても、検出反応は妨害され
なかった。よって、この層状無機化合物の添加によっ
て、例えば前記４−ＡＡと水素供与体を用いる反応系で
の過酸化水素測定を、より定量的に行うことができるの
である。

【００９６】本発明の方法において層状無機化合物を添
加する方法は、利用する反応系にもよるが、溶媒に分散
させて分散液の形で反応系中に添加するのが好ましい。
溶媒としては特に限定されず、従来公知のものを任意に
使用することができるが、例えば蒸留水などの水、エタ
ノールなどのアルコール、アセトンなどのケトン類、ジ
エチルエーテルなどのエーテル類、酢酸エチルなどのエ
ステル類、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、
ベンゼンやトルエンなどの芳香族炭化水素類などから、
分析対象物質やその検出反応系に適したものを選ぶこと
ができる。好ましくは後述する緩衝剤を用い、緩衝剤に
分散させた緩衝溶液として添加するのがよい。また、分
析対象物質を含む血液、唾液、尿などの試料液体を反応
溶媒として使用することができるのは、ドライケミスト
リーとして知られている通りである。

【００９７】層状無機化合物の添加量は、利用する反応
系に応じて決定され、用いる層状無機化合物にもよる
が、検出可能な物質に対して吸着サイトが少な過ぎて検
出可能な物質が吸着されずに溶液中等に残ったり、吸着
サイトが多すぎて検出可能な物質の吸着に濃度の偏りが
生じたりすることのない量が望ましい。

【００９８】尚、反応系に添加する層状無機化合物の好
ましい量は以下のように決定する。即ち、層状無機化合
物は、主として上述の層電荷の程度に応じた量の色素等
を吸着するので、各種の層状無機化合物について色素等
に対する全吸着サイト数を求めることができる。検出反
応系において試薬の濃度が定まれば、生成する色素等の
おおよその最大量が算出でき、層状無機化合物の全吸着
サイト量を生成しうる色素等の最大量が越えないように
層状無機化合物を添加することができる。

【００９９】層状無機化合物の添加時期については特に
限定はなく、検出可能な物質の生成反応の前であっても
生成反応後であってもよいが、検出可能な物質の生成反
応前に反応系にあらかじめ添加し、反応系中に分散させ
ておくのが好ましい。

【０１００】ここで、反応系中に分散させておくのは、
層状無機化合物と、検出可能な物質の生成反応に与る反
応出発物質、反応中間体、又は反応生成物との吸着など
の相互作用が生じやすくなるようにするためである。ま
た、均一に分散した濃度のバラツキのない状態は検出に
適しているためでもある。したがって、ここでいう分散
とは、液体中へ層状無機化合物が分散した状態でもよ
く、ゾル、ゲルなどの状態であってもよく、前述の相互
作用が生じやすくまた検出に適した状態であればよい。

【０１０１】層状無機化合物が分散する分散媒は、反応
が行われる反応溶媒と必ずしも同じでなくてもよい。層
状無機化合物は、反応溶媒を分散媒とする分散液に分散
している状態でもよく、また反応溶媒が浸透しうるゾ
ル、ゲル、凝集体、凝結体又は焼結した多孔体の状態で
あってもよく、層状無機化合物が均一に分散しうる形態
で存在していれば特に限定されない。

【０１０２】交換性のカチオン、あるいは交換性のアニ
オンを持つ層状無機化合物は、撹拌又は超音波の照射な
どによって水中に分散させると、適当な濃度であればほ
とんど均一な分散液となる。しかし、電解質の添加や有
機化合物の添加や長時間の静置や温度変化などによっ
て、層状無機化合物の粒子同士が凝集あるいは凝結し、
時としてゲル化や沈殿を生じるに至る。これらの凝集は
一般に穏やかに粒子同士が相互作用をしたもので、撹拌
によって容易に再分散しうる。

【０１０３】このような層状無機化合物の分散と凝集と
再分散については、例えば、、H.Van Olphen著の成書
「An Introduction to Clay Colloid Chemistry, Secon
d Edition」（Krieger Publishment, Malabar）の３章
「The Theory of Stability ofHydrophobic Sols.」、
４章「Successes of the Theory of Stability - Furth
er Theories and Refinement」、７章「Electric Doubl
e-Layer Structure and Stability of Clay Suspension
s」、８章「Peptization of Clay Suspensions」などに
詳述されている。

【０１０４】吸着の度合いは緩衝剤の組成（ｐＨ、イオ
ン強度、錯体を形成する成分等）に影響される。例え
ば、純水に分散させたスメクタイトは食用色素青色一号
（ブリリアントブルー ＦＣＦ）を吸着しにくいが、ｐ
Ｈ６．５のビス−トリス緩衝液［ビス（２−ヒドロキシ
エチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタンと塩
酸から調製されたもの］中に分散させたスメクタイトは
この色素を迅速に吸着する。

【０１０５】本発明の方法に用いる緩衝剤、緩衝溶液の
種類は、例えば上述したビス−トリス緩衝液の他、リン
酸緩衝溶液、クエン酸緩衝溶液、Ｎ−（２−アセトアミ
ド）イミノ二酢酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限
定されるものではなく、用いる反応系に応じて適宜選択
するのが好ましい。また、緩衝剤のｐＨ、濃度等につい
ては、用いる反応系に適した条件を選択することが好ま
しい。

【０１０６】緩衝剤の添加時期は特に限定されず、層状
無機化合物の添加前であっても添加後であっても差し支
えないが、層状無機化合物を分散させた緩衝溶液とし
て、層状無機化合物と共に反応系に添加するのが好まし
い。

【０１０７】また、測定にあたっては、反応系に種々の
界面活性剤を添加することもできる。界面活性剤の添加
により、難溶性物質を含む検体の均一な分散、検体の濡
れ性の向上による浸透の均一化と迅速化が可能となる。
ただし、界面活性剤は、界面に吸着する、物質を分散・
溶解する等の作用があるため、生成した検出可能な物質
の層状無機化合物への吸着と競合し、あるいは生成した
検出可能な物質の溶解をもたらすことによって、測定の
精度を損なわしめるおそれがある。したがって、本発明
において層状無機化合物と組み合わせて用いる界面活性
剤としては、生成した検出可能な物質と層状無機化合物
との吸着を妨害しないものを選択するのが好ましい。ま
た、界面活性剤の使用量についても、このような妨害が
生じない程度の少量を用いるのが好ましい。

【０１０８】吸着を妨害しない界面活性剤の種類として
は、界面活性剤の分子量が生成する色素に比べて極端に
大きくないものであり、且つ界面活性剤の有機性値と無
機性値が下記式を満足するものが好ましい。

【０１０９】

【数１】（無機性値）＝（2.37±0.23）×（有機性値）
−186.2±117.1

【０１１０】上記式は、既知の構造の種々の界面活性剤
について吸着阻害効果と無機性値及び有機性値との関係
を検討して得られたものである。すなわち、炭素一個の
有機性値を２０、水酸基の無機性値を１００、ポリエチ
レンオキシドの有機性値を３０、その無機性値を６０、
ニトロ基の有機性値を７０、その無機性値を７０、など
のように官能基や原子ごとにポイントを割り振り、化合
物を構成する官能基、原子についてこれらのポイントを
合計して無機性値の総和及び有機性値の総和をとり、こ
の無機性値と有機性値とを直交座標にプロットすると、
似た性質の化合物は直交座標の同じ領域に位置づけられ
るので、化合物の構造によらない共通の性質が現れるこ
とが有機概念図として知られている（甲田善生、「有機
概念図−基礎と応用−」第１１頁、三共出版(1984)）。
本発明者らは、既知の構造を有する多くの界面活性剤に
ついて吸着阻害効果と無機性値及び有機性値との関係を
検討し、吸着を阻害しない界面活性剤の種類が有機概念
図において上記式を満足することを見出したものであ
る。なお、無機性値、有機性値の算出には、前述の有機
概念図に関する成書中の換算データを用いることができ
るが、前述の数式（数１）は、本間善夫作製のプログラ
ム「パソコン有機概念図」（化学ソフトウェア学会等）
中の換算データを用いて得たものである。

【０１１１】吸着を妨害しない界面活性剤の種類と添加
量の選択は、例えば次の（イ）〜（ニ）のように実施す
ることができる。

【０１１２】（イ）所定量のスメクタイト、４−ＡＡ、
及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３，５−ジメトキシアニリンを含む反応液に
過酸化水素を加え発色させる。 （ロ）（イ）と同じ組成の反応液に更に所定の濃度とな
るように界面活性剤を加え、同様に過酸化水素を加え発
色させる。 （ハ）スメクタイトを自然沈降、遠心分離、ろ別などの
適当な手段で分離し、上澄み液またはろ液の色調を分光
光度計等で測定して、（イ）、（ロ）のそれぞれにおけ
るスメクタイトへの生成色素の吸着量を比較する。ある
いは、吸着による凝集が観察される場合には、凝集沈殿
の程度をもって評価する。 （ニ）界面活性剤を添加しないときと添加したときでほ
とんど差が見られない界面活性剤の種類と添加量を選択
する。

【０１１３】このような方法で選択された好ましい界面
活性剤の種類としては、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシドなどの糖アルキルエーテル類、ｎ−オクチル
−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−
Ｄ−チオグルコピラノシドなどの糖アルキルチオエーテ
ル類、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−
ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドなどの糖アミド類、
β−Ｄ−フラクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ドモノデカノエート、β−Ｄ−フラクトピラノシル−α
−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエートなどの糖エス
テル、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナミドプロピル）
デオキシコラミドなどが挙げられる。

【０１１４】また、添加量としては特に限定されず、層
状無機化合物全量に対する添加の割合も特に限定される
わけではなく、界面活性剤の種類と層状無機化合物の種
類と反応系に適した量を選べばよいが、界面活性剤とし
ての効果を発揮するに充分な量、例えば水系溶液におい
て用いる界面活性剤の臨界ミセル濃度を大きく越えない
程度が好ましい。例えば、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオ
グルコピラノシドの０．３％水溶液、β−Ｄ−フラクト
ピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノデカノエー
トの０．３％水溶液、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコナ
ミドプロピル）デオキシコラミドの０．３％水溶液を好
ましく用いることができる。

【０１１５】本発明の好ましい態様においては、反応系
にあらかじめ層状無機化合物を添加して分散させてお
く。このとき半透明のコロイド状の凝集を生じる場合が
あるが、本発明においては必ずしも凝集を生じる必要は
ない。なお、この凝集は、層状無機化合物と検出可能な
物質とが吸着した複合体と考えることができる。この凝
集は液を撹拌することによって均一に再分散する。ま
た、特に凝集が不都合であるときには、リン酸塩系の緩
衝溶液を用いれば層状無機化合物の分散性が向上するの
で、凝集の発生を抑制することができる。

【０１１６】また、最終的に検出に用いられる検出可能
な物質を層状無機化合物に吸着させて沈降させ、該検出
可能な物質を反応系より分離・濃縮して測定感度をさら
に高めることも可能である。ここで、検出可能な物質の
吸着した層状無機化合物の分離方法は、特に限定されな
いが、例えば自然沈降による方法、遠心分離、ろ過、ク
ロマトグラフィー、電気泳動、溶媒蒸発等が挙げられ
る。具体的な例を挙げると、本発明に例示した層状無機
化合物の分散液のろ過は、例えば、排除限界分子量が約
１万又はポアサイズが約５ｎｍであるポリサルホン製の
限外ろ過膜を用いて行うことができる。

【０１１７】本発明においては、層状無機化合物に吸着
された検出可能な物質の量を測定する。その測定方法と
しては、吸光測定方法、蛍光測定、発光測定、電気化学
的測定方法、散乱光測定方法、反射率測定方法等が挙げ
られる。好ましくは吸光光度計等を用いた光吸収分析に
代表される比色定量等の光学的な測定方法が挙げられ
る。本発明で用いる層状無機化合物は、可視〜近赤外領
域にほとんど吸収を持たないので、コロイド状の分散液
でも、あるいはゲル状でも光学的な測定を行うことがで
きる。尚、溶液のまま測定するときには系はもちろんオ
パールグラス法などの手段を選ぶことができる。

【０１１８】また好ましくは、電極で酸化還元電流や膜
電位を測定する電気化学的な測定方法も用いられる。検
出可能な物質が吸着した層状無機化合物に電極を接触さ
せることによって、電気化学的な応答を高感度に測定す
ることができる。

【０１１９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

【０１２０】

【実施例１】ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）、色素前駆体
として４−ＡＡとＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン
（以下、ＥＨＳＤＡと略す。）、緩衝剤としてビス−ト
リスバッファー（ｐＨ６．５）、及び層状無機化合物と
してスメクタイトを、終濃度が表２の通りになるように
取り、そこへ過酸化水素を終濃度が１２０μｍｏｌ／ｌ
になるように添加して反応させ、反応溶液を得た。得ら
れた反応溶液の凝集部の吸収スペクトルを４５０〜７５
０ｎｍの間で測定した。

【０１２１】また、ＰＯＤ、４−ＡＡ、ＥＨＳＤＡ、及
びビス−トリスバッファーを終濃度が表３の通りになる
ように取り、そこへ過酸化水素を終濃度が１２０μｍｏ
ｌ／ｌになるように添加して反応させ、反応溶液を得
た。得られた反応溶液の吸収スペクトルを、同様に４５
０〜７５０ｎｍの間で測定した。

【０１２２】尚、吸光度の測定は、ＪａｓｃｏＶ−５５
０（日本分光社製）を用い、０．５ｎｍの間隔で行っ
た。走査速度は２００ｎｍ／分であり、バンド幅は１．
０ｎｍである。セルにはセル長１ｃｍのディスポセル
（ポリメチルメタクリレート製）を使用し、凝集部のみ
を測定するために０．１ｍｌ用スリットを使用した。測
定の結果を図１に示す。

【０１２３】

【表２】 ＜表２＞ ─────────────────────────── 試 薬 終濃度 ─────────────────────────── ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ） １Ｕ／ｍｌ ４−ＡＡ^*1 ２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＨＳＤＡ^*2 ２ｍｍｏｌ／ｌ ビス−トリスバッファー^*3 １００ｍｍｏｌ／ｌ スメクタイト^*4 ０．１％ （全量３ｍｌ） ─────────────────────────── *1)4-アミノアンチヒ゜リン(4-アミノ-1,2-シ゛ヒト゛ロ-1,5-シ゛メチル-2-フェニル-3H-ヒ゜ラソ゛ル-3-オン) *2)N-エチル-N-(2-ヒト゛ロキシ-3-スルホフ゜ロヒ゜ル)-3,5-シ゛メトキシアニリン *3)ヒ゛ス(2-ヒト゛ロキシエチル)イミノトリス(ヒト゛ロキシメチル)メタン *4)ルーセンタイトSWN(合成スメクタイト:コーフ゜ケミカル社製)

【０１２４】

【表３】 ＜表３＞ ─────────────────────────── 試 薬 終濃度 ─────────────────────────── ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ） １Ｕ／ｍｌ ４−ＡＡ ２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＨＳＤＡ ２ｍｍｏｌ／ｌ ビス−トリスバッファー １００ｍｍｏｌ／ｌ スメクタイト ０％ （全量３ｍｌ） ───────────────────────────

【０１２５】尚、使用した試薬は各々下記表４に示す通
りである。

【０１２６】

【表４】 ＜表４＞ ─────────────────────────────── 試薬 試薬濃度 メーカー 試薬純度 ─────────────────────────────── ＰＯＤ（III） ３０U/mL 東洋紡(株) ４−ＡＡ ６０mmol/L 和光純薬(株) 試薬特級 ＥＨＳＤＡ ６０mmol/L ＳＩＧＭＡ ヒ゛ス-トリス ０．２５mmol/L ナカライテスク(株) Specially ハ゛ッファー Prepared スメクタイト ０．３％ コープケミカル(株) 過酸化水素 三徳化学工業 (株) 試薬特級 ───────────────────────────────

【０１２７】図１の結果から分かるように、色素がスメ
クタイトに吸着している条件下においても、無添加の条
件下と同じように反応が進行することが確認できた。ス
メクタイト無添加の場合の吸収極大は約５９３ｎｍ、ス
メクタイトを添加した場合の吸収極大は約５７８ｎｍで
あった。

【０１２８】

【実施例２】ＰＯＤ、４−ＡＡ、ＥＨＳＤＡ、及びビス
−トリスバッファー（ｐＨ６．５）を終濃度が上記表３
の通りになるようにセル長１ｃｍの石英セルに取り、３
７℃で３分間インキュベーションを行った。温度調整
後、表５に示す濃度の過酸化水素を添加して反応を開始
し、反応開始３分後に吸光度を測定した。測定した３分
後にはこの反応は十分終点に達していた。

【０１２９】尚、使用機器はＪａｓｃｏＶ−５５０（日
本分光社製）であり、測定波長は５９３ｎｍ（吸収極大
付近の波長）とした。この結果からスメクタイト無添加
時の過酸化水素の検量線を求めることができた。

【０１３０】

【表５】

【０１３１】

【実施例３】 ［実験方法］ＰＯＤ、４−ＡＡ、ＥＨＳＤＡ、ビス−ト
リスバッファー（ｐＨ６．５）及び合成スメクタイト
を、終濃度が上記表２の通りになるように、セル長１ｃ
ｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート製）に取
り、３７℃で１８０秒間温度調整を行った。温度調整
後、過酸化水素を終濃度が表６の通りになるように添加
し、過酸化水素添加１０秒後より２秒毎に１８００秒間
吸光度の測定を行った。測定装置としてＪａｓｃｏＶ−
５５０（日本分光社製）を用い、測定波長を５７７ｎｍ
（極大吸収波長付近の波長）とした。凝集部のみを測定
するため、０．１ｍｌ用のスリットを用いた。過酸化水
素濃度０μｍｏｌ／ｌの測定結果をブランクとし、測定
開始１８００秒後の吸光度の差（ΔＡｂｓ）を求め、ス
メクタイト添加時の過酸化水素の検量線を求めた。

【０１３２】［結果］この結果を実施例２のスメクタイ
ト無添加時の結果と共に図２に示す。図２の結果につい
て更に縦軸、横軸の対数をとった検量線を図３に示す。
表５、表６、図２及び図３から、色素の吸着した吸光度
と過酸化水素との間に相関関係があることがわかった。
［スメクタイト添加時では、過酸化水素濃度０〜２００
μｍｏｌ／ｌの間でｒ＝０．９９９の検量線が得られ
た。ｒ：相関係数］ 図２及び図３より、スメクタイト無添加の場合、最小検
出限界がおよそ６μｍｏｌ／ｌであるのに対し、スメク
タイト添加の場合はおよそ３μｍｏｌ／ｌと感度が向上
した。また、検量線の傾きも約２倍となった。

【０１３３】

【表６】

【０１３４】

【実施例４】 ［実験方法］ＰＯＤ、４−ＡＡ、ＥＨＳＤＡ、ビス−ト
リスバッファー（ｐＨ６．５）、及び合成スメクタイト
を、終濃度が上記表２の通りになるように、セル長１ｃ
ｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート製）に取
り、３７℃で１８０秒間温度調整を行った。温度調整
後、過酸化水素を終濃度が１００μｍｏｌ／ｌとなるよ
うに添加し、過酸化水素添加２０秒後より２秒毎に６０
０秒間吸光度の測定を行った。測定装置としてＪａｓｃ
ｏＶ−５５０（日本分光社製）を用い、測定波長を５７
７ｎｍ（極大吸収波長付近の波長）とした。凝集部のみ
を測定するため、０．１ｍｌ用のスリットを用いた。ま
た、過酸化水素濃度０μｍｏｌ／ｌの測定結果をブラン
クとして測定した。

【０１３５】また、ＰＯＤ、４−ＡＡ、ＥＨＳＤＡ、及
びビス−トリスバッファー（ｐＨ６．５）を終濃度が上
記表３の通りになるように、セル長１ｃｍのディスポセ
ル（ポリメチルメタクリレート製）に取り、３７℃で１
８０秒間温度調整を行った。温度調整後、過酸化水素を
終濃度が１００μｍｏｌ／ｌとなるように添加し、過酸
化水素添加２０秒後より２秒毎に６００秒間吸光度の測
定を行った。測定装置としてＪａｓｃｏＶ−５５０（日
本分光社製）を用い、測定波長を５９３ｎｍ（極大吸収
波長付近の波長）とした。０．１ｍｌ用のスリットを用
いた。

【０１３６】［結果］結果を図４に示す。図４から、ス
メクタイト添加により増感効果があることがわかる。ま
た、過酸化水素添加後約３０秒で発色反応が終点に達し
ていることを確認した。更に、スメクタイト無添加で発
色させた後にスメクタイトを添加しても色素の吸着、凝
集は観察された。

【０１３７】

【実施例５】テトラゾリウム塩として３，３’−（３，
３’−ジメトキシ−４，４’−ビフェニレン）−ビス
［２−（パラニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−
テトラゾリウムクロライド（以下、「テトラゾリウム
塩」と略す。）、緩衝剤としてリン酸バッファー（リン
酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとを混合
してｐＨ８．５に調整したもの）、Ｌ−アスコルビン
酸、及びスメクタイト（商品名ルーセンタイトＳＷＮ：
コープケミカル社製、合成スメクタイト）を、終濃度が
表７の通りになるようにディスポチューブにとって反応
させ、発色させた。得られた発色液を１０倍に希釈し、
４００〜８００ｎｍの間で吸収スペクトルを測定した。

【０１３８】また、比較のため、スメクタイトを加えな
い他は上記と同様にして終濃度が表７の通りになるよう
にテトラゾリウム塩とリン酸バッファーとＬ−アスコル
ビン酸とをディスポチューブにとり発色させた。得られ
た発色液について４００〜８００ｎｍの間で吸収スペク
トルを測定した。

【０１３９】尚、吸光度の測定は、日本分光社製分光光
度計（ＪａｓｃｏＶ−５５０）を用いた。セルにはセル
長１ｃｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート
製）を使用した。測定の結果を図５に示す。

【０１４０】

【表７】 ＜表７＞ ─────────────────────────── 試 薬 終濃度 ─────────────────────────── テトラゾリウム塩 １ｍｍｏｌ／ｌ リン酸バッファー(pH8.5) １００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ(+)−アスコルビン酸 ３３３μｍｏｌ／ｌ スメクタイト ０．１％、又は０％ （全量３ｍｌ） ───────────────────────────

【０１４１】スメクタイト無添加の系では青色に発色
し、吸収極大波長は約６３３ｎｍであった。スメクタイ
ト添加系では赤紫色に発色し、吸収極大波長は約５３５
ｎｍであった。このように、スメクタイトを添加した条
件下においても、無添加の条件下と同じように反応が進
行することが確認できた。また、吸収極大が短波長側へ
シフトしているので、本実施例と同様の発色反応系を用
いる場合は、吸光度の測定は、スメクタイト添加系、無
添加系のそれぞれの吸収極大波長付近の波長である６３
３ｎｍ（スメクタイト無添加系）、５３５ｎｍ（スメク
タイト添加系）で行うのがよいことがわかる。

【０１４２】

【実施例６】実施例５で用いたのと同様のテトラゾリウ
ム塩、リン酸バッファー（ｐＨ８．５）、及びスメクタ
イトを、終濃度が表８の通りになるようにディスポチュ
ーブにとり、３０℃で３分間インキュベートした。イン
キュベート後、Ｌ−アスコルビン酸を０〜３３３μｍｏ
ｌ／ｌの範囲で表９に示す各濃度となるように添加し、
３０℃で３０分間反応を行って吸光度を測定した（測定
波長：５３５ｎｍ）。アスコルビン酸無添加（０μｍｏ
ｌ／ｌ）のサンプルをブランクとして測定結果より検量
線を作成した。

【０１４３】また、比較のため、スメクタイトを添加し
ない他は上記と同様に終濃度が表８の通りになるように
テトラゾリウム塩及びリン酸バッファーをディスポチュ
ーブにとり、３０℃で３分間インキュベートした。イン
キュベート後、アスコルビン酸（０〜３３３μｍｏｌ／
ｌ）を表１０に示す各濃度となるように添加し、３０℃
で３０分間反応を行って吸光度を測定した（測定波長：
６３３ｎｍ）。アスコルビン酸無添加のサンプルをブラ
ンクとして測定結果より検量線を作成した。

【０１４４】図６に得られた検量線を示す。スメクタイ
ト無添加系では、アスコルビン酸終濃度４１．７〜３３
３．３μｍｏｌ／ｌの範囲でｒ（相関関数）＝０．９９
７２の検量線が得られた。スメクタイト添加系では、ア
スコルビン酸終濃度５．２〜１３３．３μｍｏｌ／ｌの
範囲でｒ＝０．９９８５の検量線が得られた。得られた
検量線の傾きは、スメクタイト添加系がスメクタイト無
添加系の約２．５倍であり、スメクタイトを添加するこ
とにより増感効果が得られることがわかる。

【０１４５】尚、吸光度の測定は、日本分光社製分光光
度計（ＪａｓｃｏＶ−５５０）を用いた。セルにはセル
長１ｃｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート
製）を使用した。

【０１４６】

【表８】 ＜表８＞ ─────────────────────────── 試 薬 終濃度 ─────────────────────────── テトラゾリウム塩 ８００μｍｏｌ／ｌ リン酸バッファー(pH8.5) １００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ(+)−アスコルビン酸 ０〜３３３．３μｍｏｌ／ｌ スメクタイト ０．１％、又は０％ （全量３ｍｌ） ───────────────────────────

【０１４７】

【表９】

【０１４８】

【表１０】

【０１４９】

【実施例７】塩酸、スメクタイト（コープケミカル社
製、ルーセンタイトＳＷＮ）、２，４−ジクロロアニリ
ン、及び亜硝酸ナトリウムをこの順に、各試薬の終濃度
が表１１の通りになるようにとり、混合後、津田試薬
（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’−１−ナフチルナフチルエチ
レンジアミンシュウ酸塩）を加えて反応させ、アゾ系色
素を生成させて発色させた。このものの吸光スペクトル
を４００〜８００ｎｍの間で測定した。尚、亜硝酸ナト
リウムは４種類の濃度（０、８、１６、及び３３μｍｏ
ｌ／ｌ）で添加した。結果を図７に示す。

【０１５０】また、比較のため、スメクタイトを添加し
ない他は上記と同様に、塩酸、２，４−ジクロロアニリ
ン、及び亜硝酸ナトリウムを終濃度が表１１の通りにな
るように加えた後、津田試薬を加えて発色させた。この
ものの吸光スペクトルを４００〜８００ｎｍの間で測定
した。尚、亜硝酸ナトリウムは４種類の濃度（０、８、
１６、及び３３μｍｏｌ／ｌ）で添加した。結果を図８
に示す。また、スメクタイト添加系とスメクタイト無添
加系について、各々亜硝酸ナトリウム濃度３３μｍｏｌ
／ｌの場合の吸光スペクトルをともに図９に示す。尚、
吸光度の測定は、日本分光社製分光光度計（Ｊａｓｃｏ
Ｖ−５５０）を用いた。セルにはセル長１ｃｍのディス
ポセル（ポリメチルメタクリレート製）を使用した。

【０１５１】

【表１１】

【０１５２】スメクタイト無添加系では赤紫色に発色
し、吸収極大波長は約５４０ｎｍであった。スメクタイ
ト添加系では紫色に発色し、吸収極大波長は約５５５ｎ
ｍであった。このように、スメクタイトを添加した条件
下においても、無添加の条件下と同じように反応が進行
することが確認できた。また、吸収極大が長波長側へシ
フトしているので、本実施例と同様の発色反応系を用い
る場合は、吸光度の測定は、スメクタイト添加系、無添
加系のそれぞれの吸収極大波長付近の波長である５４０
ｎｍ（スメクタイト無添加系）、５５５ｎｍ（スメクタ
イト添加系）で行うのがよいことがわかる。

【０１５３】

【実施例８】実施例７で用いたのと同様の塩酸、２，４
−ジクロロアニリン、亜硝酸ナトリウム、及び津田試薬
を、終濃度が表１２の通りになるようにディスポセル
（ポリメチルメタクリレート製）にとり、３０℃で１０
分間反応させ、十分に発色させた後、スメクタイトを添
加して凝集を生成沈降させ、スメクタイト添加３０秒後
より凝集の吸光度を１秒毎に２０分間測定した（測定波
長：５５５ｎｍ）。凝集のみの吸光度を測定するために
０．１ｍｌ用スリットを用いた。尚、亜硝酸ナトリウム
は０〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲で表１３に示す各濃度と
なるように添加した。亜硝酸ナトリウム終濃度０μｍｏ
ｌ／ｌのサンプルの結果をブランクとして、測定開始２
０分後の吸光度との差（ΔＡｂｓ）を求め、検量線を作
成した。

【０１５４】また、スメクタイト無添加系として、上記
と同様に終濃度が表１２の通りになるように塩酸、２，
４−ジクロロアニリン、及び亜硝酸ナトリウムをディス
ポセルにとり、３０℃で３分間インキュベートした後、
津田試薬を添加し、添加１０秒後より１秒毎に１０分間
吸光度を測定した（測定波長：５４０ｎｍ）。尚、亜硝
酸ナトリウムは０〜５０μｍｏｌ／ｌの範囲で表１４に
示す各濃度となるように添加した。測定開始１０分後の
吸光度（Ａｂｓ）を求め、検量線を作成した。亜硝酸ナ
トリウム終濃度０μｍｏｌ／ｌのサンプルの結果をブラ
ンクとして測定した。この実験で用いた反応系は、１０
分間で十分に終点に達している。

【０１５５】図１０に得られた検量線を示す。スメクタ
イト無添加系では、亜硝酸ナトリウム終濃度１．６〜５
０．０μｍｏｌ／ｌの範囲でｒ（相関関数）＝０．９９
９１の検量線が得られた。スメクタイト添加系では、亜
硝酸ナトリウム終濃度０．４〜２５．０μｍｏｌ／ｌの
範囲でｒ＝０．９９４０の検量線が得られた。得られた
検量線の傾きは、スメクタイト添加系がスメクタイト無
添加系の約２．５倍であり、スメクタイトを添加するこ
とにより増感効果が得られることがわかる。

【０１５６】尚、吸光度の測定は、日本分光社製分光光
度計（ＪａｓｃｏＶ−５５０）を用いた。セルにはセル
長１ｃｍのディスポセル（ポリメチルメタクリレート
製）を使用した。

【０１５７】

【表１２】

【０１５８】

【表１３】

【０１５９】

【表１４】

【０１６０】

【発明の効果】本発明によれば、反応系に粘土鉱物等の
層状無機化合物を添加して検出可能な物質を吸着させた
後該物質を測定することによって、感度の高い測定を可
能にすることができる。

【０１６１】本発明の測定方法は、体液中の尿や血液等
の生体成分、食品、医薬、自然環境に存在する微量物
質、産業化学物質、廃棄物中の微量物質等の検出・定量
等に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で測定した吸収スペクトル図であ
る。

【図２】 実施例２及び実施例３で求めた過酸化水素の
検量線を示す図である。

【図３】 図２の検量線の縦軸と横軸の対数をとった検
量線を示す図である。

【図４】 実施例４における過酸化水素添加後の吸光度
の経時変化を示す図である。

【図５】 実施例５で測定した吸収スペクトル図であ
る。

【図６】 実施例６で求めたアスコルビン酸濃度の検量
線を示す図である。

【図７】 実施例７で測定した吸収スペクトル図（スメ
クタイト添加系）である。

【図８】 実施例７で測定した吸収スペクトル図（スメ
クタイト無添加系）である。

【図９】 実施例７で測定した亜硝酸ナトリウム濃度３
３μｍｏｌ／ｌにおける吸収スペクトル図（スメクタイ
ト添加系及び無添加系）である。

【図１０】 実施例８で求めた亜硝酸ナトリウム濃度の
検量線を示す図である。

【符号の説明】

１・・・スメクタイトを添加した場合 ２・・・スメクタイトを添加しなかった場合 ３・・・スメクタイトを添加し過酸化水素を添加しなか
った場合 ４・・・亜硝酸濃度３３μｍｏｌ／ｌの場合 ５・・・亜硝酸濃度１６μｍｏｌ／ｌの場合 ６・・・亜硝酸濃度８μｍｏｌ／ｌの場合 ７・・・亜硝酸濃度０μｍｏｌ／ｌの場合

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/00 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３１１Ｋ ３３６Ｂ (56)参考文献 特開 平５−99927（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−35753（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−222061（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−15399（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 31/00 - 31/22 G01N 21/75 G01N 33/48 - 33/98

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の分析対象物質の化学反応に基づ
   いて検出可能な物質を生成する反応を含む水性反応系を
   用いて前記検出可能な物質の量を測定することにより前
   記分析対象物質を測定する方法において、前記水性反応
   系に層状無機化合物を分散させ、前記層状無機化合物に
   前記検出可能な物質を吸着させ、前記検出可能な物質の
   検出感度を増加させる工程を含むことを特徴とする、物
   質の測定方法。
2. 【請求項２】 層状無機化合物が２：１型粘土鉱物であ
   る、請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 ２：１型粘土鉱物が膨潤性層状粘土鉱物
   である、請求項２記載の測定方法。
4. 【請求項４】 膨潤性層状粘土鉱物がベントナイト、ス
   メクタイト、バーミキュライト及び合成フッ素雲母から
   なる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項３記
   載の測定方法。
5. 【請求項５】 スメクタイトが合成スメクタイトであ
   る、請求項４記載の測定方法。
6. 【請求項６】 合成スメクタイトが、ヘクトライト及び
   サポナイトからなる群から選ばれる少なくとも一種であ
   る、請求項５記載の測定方法。
7. 【請求項７】 前記検出可能な物質が、光学的方法また
   は電気化学的方法によって検出可能な物質である、請求
   項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
8. 【請求項８】 前記検出可能な物質が、光学的方法によ
   って検出可能な色素である、請求項７記載の測定方法。
9. 【請求項９】 前記色素がアゾ化合物である、請求項８
   記載の測定方法。
10. 【請求項１０】 前記検出可能な物質が、電子伝達物
    質、電子供与物質、電子受容物質からなる群から選ばれ
    る電気化学的方法によって検出可能な化合物である、請
    求項７記載の測定方法。
11. 【請求項１１】 前記検出可能な物質が、アミン、イミ
    ン、ポリエン類、芳香族化合物、複素環化合物、及びイ
    オンと環状配位子との錯体からなる群から選ばれる化合
    物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の測定方
    法。
12. 【請求項１２】 前記検出可能な物質を生成する反応が
    酸化還元反応である、請求項１〜１１のいずれかに記載
    の測定方法。
13. 【請求項１３】 前記検出可能な物質を生成する反応が
    酸化還元反応であり、前記検出可能な物質を生成する反
    応を含む反応系が、過酸化水素の生成反応または過酸化
    水素を酸化剤とする酸化反応を含む、請求項１２記載の
    測定方法。
14. 【請求項１４】 前記検出可能な物質を生成する反応が
    酸化還元反応であり、前記検出可能な物質を生成する反
    応を含む反応系が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
    チドもしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
    スフェートを生成する反応、または、ニコチンアミドア
    デニンジヌクレオチドもしくはニコチンアミドアデニン
    ジヌクレオチドホスフェートを還元剤として使用する反
    応を含む、請求項１２記載の測定方法。
15. 【請求項１５】 前記反応系に緩衝剤またはその乾燥物
    が含まれる、請求項１〜１４のいずれかに記載の測定方
    法。
16. 【請求項１６】 前記反応系中の層状無機化合物が、前
    記層状無機化合物の分散液の形で前記反応系中に添加さ
    れたものである、請求項１〜１５のいずれかに記載の測
    定方法。