JP3355368B2 - 植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体 - Google Patents
植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ダイズ種子由来の
エポキシド水解酵素cDNAを含むプラスミドベクターおよ
び形質転換体に関する。
エポキシド水解酵素cDNAを含むプラスミドベクターおよ
び形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】エポキシド水解酵素とは、過酸化反応等
によって生体中に生じた有害なエポキシド化合物を加水
分解し、エポキシドの持つ高い化学反応性をなくすこと
により、生体に有害な化学反応を避けるという生体防御
機構の一角を担う酵素である。
によって生体中に生じた有害なエポキシド化合物を加水
分解し、エポキシドの持つ高い化学反応性をなくすこと
により、生体に有害な化学反応を避けるという生体防御
機構の一角を担う酵素である。
【０００３】エポキシド水解酵素は、動物細胞や植物細
胞などに含まれていることが判明している。特に、植物
由来のものは、農業上および食品工業上の利用性が期待
されているが、その含有量が微量なため、大量生産は困
難であるとされていた。
胞などに含まれていることが判明している。特に、植物
由来のものは、農業上および食品工業上の利用性が期待
されているが、その含有量が微量なため、大量生産は困
難であるとされていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】エポキシド水解酵素の
遺伝的情報は、今のところ、動物細胞ではヒト肝細胞
（Beetham, J. K. et al., Arch. Biochem. Biophys.,
305, 197-201 (1993))、ラットおよびマウスの肝細胞
(Knehr, M. et al., J. Biol. Chem., 268, 17623-1762
7 (1993))、Grant, D. F. et al., J. Biol. Chem., 26
8, 17628-17633 (1993)) 等について報告がなされてい
る。また、植物細胞については、ポテト (Stapleton,
A. et al., Plant J. 6, 251-258 (1994))、アラビノプ
シス (Kiyosue, T. et al., Plant J. 6, 259-269 (199
4)) 等についての報告がある。しかし、植物由来のエポ
キシド水解酵素についての遺伝的情報についての報告
は、上記のみに止まっており、高活性を発現することを
明らかにしたものはなかった。
遺伝的情報は、今のところ、動物細胞ではヒト肝細胞
（Beetham, J. K. et al., Arch. Biochem. Biophys.,
305, 197-201 (1993))、ラットおよびマウスの肝細胞
(Knehr, M. et al., J. Biol. Chem., 268, 17623-1762
7 (1993))、Grant, D. F. et al., J. Biol. Chem., 26
8, 17628-17633 (1993)) 等について報告がなされてい
る。また、植物細胞については、ポテト (Stapleton,
A. et al., Plant J. 6, 251-258 (1994))、アラビノプ
シス (Kiyosue, T. et al., Plant J. 6, 259-269 (199
4)) 等についての報告がある。しかし、植物由来のエポ
キシド水解酵素についての遺伝的情報についての報告
は、上記のみに止まっており、高活性を発現することを
明らかにしたものはなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ダイズ種
子由来のエポキシド水解酵素を精製し、そのアミノ酸配
列をもとにして、エポキシド水解酵素のcDNAおよび遺伝
子のクローニングを試みた。その結果、該酵素のcDNAお
よび遺伝子の全構造を解明することに成功し、それらを
利用した大腸菌での発現系の構築にも成功し、本発明に
到達した。
子由来のエポキシド水解酵素を精製し、そのアミノ酸配
列をもとにして、エポキシド水解酵素のcDNAおよび遺伝
子のクローニングを試みた。その結果、該酵素のcDNAお
よび遺伝子の全構造を解明することに成功し、それらを
利用した大腸菌での発現系の構築にも成功し、本発明に
到達した。
【０００６】すなわち、精製されたエポキシド水解酵素
のアミノ酸配列の解析から、縮重のある合成オリゴヌク
レオチドを作製した。次に、ダイズの登熟種子よりmRNA
を抽出し、それを用いて２本鎖cDNAを合成し、ファージ
ベクターにアダプターを介して組み込み、cDNAライブラ
リーを構築した。
のアミノ酸配列の解析から、縮重のある合成オリゴヌク
レオチドを作製した。次に、ダイズの登熟種子よりmRNA
を抽出し、それを用いて２本鎖cDNAを合成し、ファージ
ベクターにアダプターを介して組み込み、cDNAライブラ
リーを構築した。
【０００７】作製した合成オリゴヌクレオチドをラベル
し、これをプローブとして上述のcDNAライブラリーから
スクリーニングを行って、完全長のエポキシド水解酵素
cDNAをクローニングした。このcDNAの一次構造解析によ
り、シグナルペプチドを含むエポキシド水解酵素の全ア
ミノ酸配列が決定された。
し、これをプローブとして上述のcDNAライブラリーから
スクリーニングを行って、完全長のエポキシド水解酵素
cDNAをクローニングした。このcDNAの一次構造解析によ
り、シグナルペプチドを含むエポキシド水解酵素の全ア
ミノ酸配列が決定された。
【０００８】エポキシド水解酵素遺伝子のクローニング
は、発芽したダイズより核DNAを抽出・精製し、制限酵
素Mbo Iにより部分分解し、これをファージベクターに
組み込んだ市販の遺伝子ライブラリーを用いた。先に取
得したエポキシド水解酵素cDNAをラベルし、これをプロ
ーブとして上述の遺伝子ライブラリーからスクリーニン
グを行って、５'上流域を含むエポキシド水解酵素遺伝
子をクローニングした。
は、発芽したダイズより核DNAを抽出・精製し、制限酵
素Mbo Iにより部分分解し、これをファージベクターに
組み込んだ市販の遺伝子ライブラリーを用いた。先に取
得したエポキシド水解酵素cDNAをラベルし、これをプロ
ーブとして上述の遺伝子ライブラリーからスクリーニン
グを行って、５'上流域を含むエポキシド水解酵素遺伝
子をクローニングした。
【０００９】クローニングしたエポキシド水解酵素cDNA
を用いてＴ7プロモーターを利用した大腸菌での発現系
を構築し、本酵素の発現に成功し、その迅速・簡便な精
製法も確立した。
を用いてＴ7プロモーターを利用した大腸菌での発現系
を構築し、本酵素の発現に成功し、その迅速・簡便な精
製法も確立した。
【００１０】すなわち、請求項１記載の本発明は、プラ
イマーとして配列表の配列番号１および２記載のオリゴ
ヌクレオチドを、鋳型としてダイズ種子由来のエポキシ
ド水解酵素cDNAを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増
幅されたDNA産物を、発現用プラスミドにサブクローニ
ングすることによって得られるプラスミドベクターであ
る。
イマーとして配列表の配列番号１および２記載のオリゴ
ヌクレオチドを、鋳型としてダイズ種子由来のエポキシ
ド水解酵素cDNAを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増
幅されたDNA産物を、発現用プラスミドにサブクローニ
ングすることによって得られるプラスミドベクターであ
る。
【００１１】請求項２記載の本発明は、請求項１記載の
プラスミドベクターを保有する形質転換体（FERM BP‐6
624）である。
プラスミドベクターを保有する形質転換体（FERM BP‐6
624）である。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明について、以下に詳しく説
明する。本発明の対象であるエポキシド水解酵素とは、
従来技術の欄ですでに述べたように、生体に有害なエポ
キシドを加水分解しジオール等を生ずる作用を有する酵
素である。
明する。本発明の対象であるエポキシド水解酵素とは、
従来技術の欄ですでに述べたように、生体に有害なエポ
キシドを加水分解しジオール等を生ずる作用を有する酵
素である。
【００１３】まず、請求項１記載の本発明について説明
する請求項１記載の本発明は、プライマーとして配列表
の配列番号１および２記載のオリゴヌクレオチドを、鋳
型としてダイズ種子由来のエポキシド水解酵素cDNAを用
いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA産物
を、発現用プラスミドにサブクローニングすることによ
って得られるプラスミドベクターである。
する請求項１記載の本発明は、プライマーとして配列表
の配列番号１および２記載のオリゴヌクレオチドを、鋳
型としてダイズ種子由来のエポキシド水解酵素cDNAを用
いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA産物
を、発現用プラスミドにサブクローニングすることによ
って得られるプラスミドベクターである。
【００１４】本発明者らは、以下のようにして、請求項
１記載の本発明のcDNAを含むプラス ミドベクターの取得
に成功した。
１記載の本発明のcDNAを含むプラス ミドベクターの取得
に成功した。
【００１５】（１）ｃＤＮＡライブラリーの作成 （１−１）ダイズ種子中に含まれるエポキシド水解酵素
の抽出、精製 エポキシド水解酵素は、各種の植物および動物細胞中に
含まれており、これらのうち、請求項１記載の本発明に
おいては、ダイズ種子細胞由来のものを用いる。ダイズ
の種子からエポキシド水解酵素を抽出する場合には、登
熟初期から完熟期まで、特に登熟初期から後期までのも
のを用いることが好ましい。
の抽出、精製 エポキシド水解酵素は、各種の植物および動物細胞中に
含まれており、これらのうち、請求項１記載の本発明に
おいては、ダイズ種子細胞由来のものを用いる。ダイズ
の種子からエポキシド水解酵素を抽出する場合には、登
熟初期から完熟期まで、特に登熟初期から後期までのも
のを用いることが好ましい。
【００１６】ここで、エポキシド水解酵素を得るために
は、材料であるダイズ種子を高度に精製する必要があ
る。以下に酵素の精製方法を例示する。登熟初期から完
熟期までの植物種子を粉砕し、これに適当な緩衝液を加
えて抽出し、その可溶性画分を透析後、固液分離する。
得られた粗酵素液を、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過等にかけることにより、ほぼ純粋なエポキシド水解酵
素を得ることが可能である。
は、材料であるダイズ種子を高度に精製する必要があ
る。以下に酵素の精製方法を例示する。登熟初期から完
熟期までの植物種子を粉砕し、これに適当な緩衝液を加
えて抽出し、その可溶性画分を透析後、固液分離する。
得られた粗酵素液を、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過等にかけることにより、ほぼ純粋なエポキシド水解酵
素を得ることが可能である。
【００１７】（１−２）精製エポキシド水解酵素の内部
アミノ酸配列の解析 （１−１）で得られる精製エポキシド水解酵素は、Ｎ−
末端がブロックされているので、そのままでは内部のア
ミノ酸配列を得ることができない。そこで、以下の操作
を行う必要がある。まず、エポキシド水解酵素を、短い
ペプチドに酵素分解し、それぞれのペプチドサンプルを
高速液体クロマトグラフィーにより分画した上で、各サ
ンプルのアミノ酸配列を決定する。アミノ酸配列の決定
は、Edman分解により行うことができ、自動アミノ酸シ
ークエンサーを用いると簡便である。各サンプルのアミ
ノ酸配列を検討し、その中から縮重の少ない個所を選択
してオリゴヌクレオチドを合成し、これを後述のプロー
ブとして用いる。
アミノ酸配列の解析 （１−１）で得られる精製エポキシド水解酵素は、Ｎ−
末端がブロックされているので、そのままでは内部のア
ミノ酸配列を得ることができない。そこで、以下の操作
を行う必要がある。まず、エポキシド水解酵素を、短い
ペプチドに酵素分解し、それぞれのペプチドサンプルを
高速液体クロマトグラフィーにより分画した上で、各サ
ンプルのアミノ酸配列を決定する。アミノ酸配列の決定
は、Edman分解により行うことができ、自動アミノ酸シ
ークエンサーを用いると簡便である。各サンプルのアミ
ノ酸配列を検討し、その中から縮重の少ない個所を選択
してオリゴヌクレオチドを合成し、これを後述のプロー
ブとして用いる。
【００１８】（１−３）poly(A)+RNA の調製 次に、ダイズの種子より、RNA を抽出し、抽出した全RN
A 中からpoly(A)+RNAを調製する。植物からのpoly(A)+R
NA の調製は、Fukazawa，C ．et al.，Journal of Biol
ogical Chemistry, 200, 6234-6239 (1985)の方法に従
い、SDS-フェノール法を用いて行うことができる。
A 中からpoly(A)+RNAを調製する。植物からのpoly(A)+R
NA の調製は、Fukazawa，C ．et al.，Journal of Biol
ogical Chemistry, 200, 6234-6239 (1985)の方法に従
い、SDS-フェノール法を用いて行うことができる。
【００１９】（１−４）cDNAライブラリーの構築 得られたmRNAを用いて２本鎖cDNAを合成し、これをファ
ージベクターにアダプターを介して組み込み、cDNAライ
ブラリーを構築する。cDNAライブラリーの作製には、岡
山−Berg法（Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell Bi
ol., 2, p161 (1982)、ガブラー−ホフマン（Gubler−H
offmann）法（Gubler, U. and Hoffmann, B. J., Gene,
25, p263 (1983))等、各種方法が採用できるが、簡略
の点から、後者が好ましい。
ージベクターにアダプターを介して組み込み、cDNAライ
ブラリーを構築する。cDNAライブラリーの作製には、岡
山−Berg法（Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell Bi
ol., 2, p161 (1982)、ガブラー−ホフマン（Gubler−H
offmann）法（Gubler, U. and Hoffmann, B. J., Gene,
25, p263 (1983))等、各種方法が採用できるが、簡略
の点から、後者が好ましい。
【００２０】以下、ガブラー−ホフマン法を採用した場
合について述べる。まず、先述のpoly(A)+RNA から２本
鎖のcDNAを合成する。このcDNAに、Eco RI、Not I 、Ba
m HI等の制限酵素部位を含むアダプターをライゲーショ
ンする。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により500b
p以上のものだけをゲルから切り出して集めるととも
に、過剰なアダプターを除去する。その後、得られたヌ
クレオチドの５'位にリン酸基を導入し、制限酵素で切
断し、脱リン酸化してあるλgt10ファージベクターアー
ム（宝酒造社製）にライゲーションする。これをλファ
ージにパッケージングする。このようにして、cDNAライ
ブラリーを作製する。
合について述べる。まず、先述のpoly(A)+RNA から２本
鎖のcDNAを合成する。このcDNAに、Eco RI、Not I 、Ba
m HI等の制限酵素部位を含むアダプターをライゲーショ
ンする。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により500b
p以上のものだけをゲルから切り出して集めるととも
に、過剰なアダプターを除去する。その後、得られたヌ
クレオチドの５'位にリン酸基を導入し、制限酵素で切
断し、脱リン酸化してあるλgt10ファージベクターアー
ム（宝酒造社製）にライゲーションする。これをλファ
ージにパッケージングする。このようにして、cDNAライ
ブラリーを作製する。
【００２１】（２）cDNAライブラリーからの、ダイズ種
子由来のエポキシド水解酵素cDNA（完全長）のクローニ
ング、その塩基配列決定 （２−１）完全長のエポキシド水解酵素ｃDNA クローニ
ング 上記（１−２）で得られたオリゴヌクレオチドをラベル
し、これをプローブとして、（１−４）のcDNAライブラ
リーからスクリーニングを行い、完全長のエポキシド水
解酵素cDNAをクローニングする。スクリーニングは、cD
NAライブラリーにつき、合成したオリゴヌクレオチドを
放射標識したものをプローブとして、約100 万プラーク
のプラークハイブリダイゼーション（Fukazawa，C. et
al., Journal of Biological Chemistry, 200,6234-62
39 (1985)）により、陽性を示したプラークを分離する
ことにより達成される。
子由来のエポキシド水解酵素cDNA（完全長）のクローニ
ング、その塩基配列決定 （２−１）完全長のエポキシド水解酵素ｃDNA クローニ
ング 上記（１−２）で得られたオリゴヌクレオチドをラベル
し、これをプローブとして、（１−４）のcDNAライブラ
リーからスクリーニングを行い、完全長のエポキシド水
解酵素cDNAをクローニングする。スクリーニングは、cD
NAライブラリーにつき、合成したオリゴヌクレオチドを
放射標識したものをプローブとして、約100 万プラーク
のプラークハイブリダイゼーション（Fukazawa，C. et
al., Journal of Biological Chemistry, 200,6234-62
39 (1985)）により、陽性を示したプラークを分離する
ことにより達成される。
【００２２】次に、陽性プラークを純化し、大腸菌に感
染させてファージを増やした後に、ファージ粒子を精製
しファージDNAを得る。ファージDNAの精製は、CsClステ
ップワイズ密度勾配を用いた超遠心法によって行うこと
ができる。
染させてファージを増やした後に、ファージ粒子を精製
しファージDNAを得る。ファージDNAの精製は、CsClステ
ップワイズ密度勾配を用いた超遠心法によって行うこと
ができる。
【００２３】（２−２）得られるファージDNA の構造決
定 精製したファージDNAから、制限酵素でインサートを切
り出し、精製する。これをプラスミドベクターにサブク
ローニング後、DNAシークエンスを行った。その結果、
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するcDNAが
得られた。これを解析した結果、クローニングした陽性
プラークのcDNAは、エポキシド水解酵素の全長を含んで
いることが判明した。本cDNAは、全長1332bpからなり、
アミノ酸数は、開始メチオニンからの全体で341 塩基で
あった。
定 精製したファージDNAから、制限酵素でインサートを切
り出し、精製する。これをプラスミドベクターにサブク
ローニング後、DNAシークエンスを行った。その結果、
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するcDNAが
得られた。これを解析した結果、クローニングした陽性
プラークのcDNAは、エポキシド水解酵素の全長を含んで
いることが判明した。本cDNAは、全長1332bpからなり、
アミノ酸数は、開始メチオニンからの全体で341 塩基で
あった。
【００２４】次に、上記によって得たダイズ種子由来の
エポキシド水解酵素の全長を含むcDNA配列をもとに、配
列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するダイズ種
子由来のエポキシド水解酵素をコードする遺伝子の解明
を、以下の手順によって行った。
エポキシド水解酵素の全長を含むcDNA配列をもとに、配
列表の配列番号４記載のアミノ酸配列を有するダイズ種
子由来のエポキシド水解酵素をコードする遺伝子の解明
を、以下の手順によって行った。
【００２５】（３）完全長のダイズ種子由来のエポキシ
ド水解酵素遺伝子のクローニングおよび配列解明配列表の配列番号３記載の cDNAをラベルしたものをプロ
ーブとして用い、市販のダイズ遺伝子ライブラリー（ST
RATAGENE社）からスクリーニングを行い、完全長のダイ
ズ種子由来のエポキシド水解酵素遺伝子をクローニング
する。クローニングは、先述のプラークハイブリダイゼ
ーションにより、陽性を示すファージを選択することに
より達成できる。なお、本発明者らが用いた市販のダイ
ズ遺伝子ライブラリーは、発芽したダイズより核DNA を
抽出・精製し、制限酵素Mbo Iにより部分分解し、これ
をファージベクターに組み込んだものである。
ド水解酵素遺伝子のクローニングおよび配列解明配列表の配列番号３記載の cDNAをラベルしたものをプロ
ーブとして用い、市販のダイズ遺伝子ライブラリー（ST
RATAGENE社）からスクリーニングを行い、完全長のダイ
ズ種子由来のエポキシド水解酵素遺伝子をクローニング
する。クローニングは、先述のプラークハイブリダイゼ
ーションにより、陽性を示すファージを選択することに
より達成できる。なお、本発明者らが用いた市販のダイ
ズ遺伝子ライブラリーは、発芽したダイズより核DNA を
抽出・精製し、制限酵素Mbo Iにより部分分解し、これ
をファージベクターに組み込んだものである。
【００２６】ファージを精製後、プラスミドベクターに
サブクローニングして、前記の（２−２）と同様の方法
でDNA シークエンスを行った。その結果得られたもの
が、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素遺伝子の塩基
配列およびアミノ酸配列である（配列表の配列番号４参
照）。
サブクローニングして、前記の（２−２）と同様の方法
でDNA シークエンスを行った。その結果得られたもの
が、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素遺伝子の塩基
配列およびアミノ酸配列である（配列表の配列番号４参
照）。
【００２７】該配列の全長は1933bpで（配列表の配列番
号４参照）、２つのイントロンにより３つのエクソンに
分断されている。各イントロンの塩基数は、第１イント
ロンよりそれぞれ168bp、148bpであった（配列表の配列
番号４参照）。
号４参照）、２つのイントロンにより３つのエクソンに
分断されている。各イントロンの塩基数は、第１イント
ロンよりそれぞれ168bp、148bpであった（配列表の配列
番号４参照）。
【００２８】次に、請求項１記載の本発明と、請求項２
記載の本発明とを併せて説明する。請求項１記載の本発
明は、プライマーとして配列表の配列番号１および２記
載のオリゴヌクレオチドを、鋳型としてダイズ種子由来
のエポキシド水解酵素cDNAを用いたポリメラーゼ連鎖反
応により増幅されたDNA産物を、発現用プラスミドにサ
ブクローニングすることによって得られるプラスミドベ
クターである。請求項２記載の本発明は、請求項１記載
のプラスミドベクターを保有する形質転換体（FERM BP
‐6624）である。すなわち、請求項１および２記載の本
発明は、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素の発現系
を提供するものである。
記載の本発明とを併せて説明する。請求項１記載の本発
明は、プライマーとして配列表の配列番号１および２記
載のオリゴヌクレオチドを、鋳型としてダイズ種子由来
のエポキシド水解酵素cDNAを用いたポリメラーゼ連鎖反
応により増幅されたDNA産物を、発現用プラスミドにサ
ブクローニングすることによって得られるプラスミドベ
クターである。請求項２記載の本発明は、請求項１記載
のプラスミドベクターを保有する形質転換体（FERM BP
‐6624）である。すなわち、請求項１および２記載の本
発明は、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素の発現系
を提供するものである。
【００２９】請求項１記載の本発明のプラスミドベクタ
ーおよび請求項２記載の形質転換体は、以下の操作によ
り作出される。 （４）プラスミドベクターおよび形質転換体の作出 （４−１）PCR による配列表の配列番号３記載のcDNAの
塩基配列の増幅 まず、配列表の配列番号３記載のcDNAの塩基配列と、精
製したエポキシド水解酵素についてイオンスプレーマス
スペクトロメトリーを行った結果を基にして、制限酵素
Nde Iサイトを５'末端に含む32mer(N-末端側）のオリゴ
ヌクレオチドプライマーとEco RIサイトを５'末端に含
む34mer(C-末端側）のオリゴヌクレオチドプライマー
（配列表の配列番号１および２参照）を合成する。な
お、ここで挙げた制限酵素は、後述の発現ベクターと対
応していれば、特に限定されるものではない。
ーおよび請求項２記載の形質転換体は、以下の操作によ
り作出される。 （４）プラスミドベクターおよび形質転換体の作出 （４−１）PCR による配列表の配列番号３記載のcDNAの
塩基配列の増幅 まず、配列表の配列番号３記載のcDNAの塩基配列と、精
製したエポキシド水解酵素についてイオンスプレーマス
スペクトロメトリーを行った結果を基にして、制限酵素
Nde Iサイトを５'末端に含む32mer(N-末端側）のオリゴ
ヌクレオチドプライマーとEco RIサイトを５'末端に含
む34mer(C-末端側）のオリゴヌクレオチドプライマー
（配列表の配列番号１および２参照）を合成する。な
お、ここで挙げた制限酵素は、後述の発現ベクターと対
応していれば、特に限定されるものではない。
【００３０】これらのプライマーを用いて配列表の配列
番号３記載のダイズ種子由来エポキシド水解酵素cDNAを
鋳型としてPCR を行った。PCR の条件は特に限定され
ず、例えば後述の実施例１に示した条件で行うことがで
きる。
番号３記載のダイズ種子由来エポキシド水解酵素cDNAを
鋳型としてPCR を行った。PCR の条件は特に限定され
ず、例えば後述の実施例１に示した条件で行うことがで
きる。
【００３１】（４−２）プラスミドベクターおよび形質
転換体の作出 （４−１）で得られたバンドを、TAベクター［pCR2.1］
(Invitrogen社製) にサブクローニング後、（２−２）
と同様の方法でDNA シークエンスを行い、PCRで増幅し
た発現用cDNAは、変異が入っていないことを確認する。
その上で、先のPCRプライマーそれぞれに含まれる制限
酵素Nde IとEco RIを用いて、クローニングしたTAベク
ターからインサートを切り出し、精製後に、発現用のプ
ラスミドであるpRSET ベクター（Invitrogen社製）のNd
e I サイトとEcoRIサイトの間にサブクローニングす
る。こうして得られるプラスミドが、請求項１記載の本
発明のプラスミドである。
転換体の作出 （４−１）で得られたバンドを、TAベクター［pCR2.1］
(Invitrogen社製) にサブクローニング後、（２−２）
と同様の方法でDNA シークエンスを行い、PCRで増幅し
た発現用cDNAは、変異が入っていないことを確認する。
その上で、先のPCRプライマーそれぞれに含まれる制限
酵素Nde IとEco RIを用いて、クローニングしたTAベク
ターからインサートを切り出し、精製後に、発現用のプ
ラスミドであるpRSET ベクター（Invitrogen社製）のNd
e I サイトとEcoRIサイトの間にサブクローニングす
る。こうして得られるプラスミドが、請求項１記載の本
発明のプラスミドである。
【００３２】この請求項１記載の本発明のプラスミド
を、発現用大腸菌、例えば大腸菌BL21（DE3)(Novagen社
製) に形質転換して得られるのが、請求項２記載の本発
明の形質転換体である。形質転換は、塩化カルシウム法
（Cohen, S. N., Chang, A. C. Y. and Hsu, L., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2114, 1972）、エレ
クトロポレーション法（三浦 謹一郎ら編、新基礎生化
学実験法、遺伝子工学、1988、丸善株式会社）等の通常
用いられる方法で行うことができる。形質転換した大腸
菌は、工業技術院生命工学工業研究所に寄託されてお
り、その受託番号は、FERM BP−6624である。
を、発現用大腸菌、例えば大腸菌BL21（DE3)(Novagen社
製) に形質転換して得られるのが、請求項２記載の本発
明の形質転換体である。形質転換は、塩化カルシウム法
（Cohen, S. N., Chang, A. C. Y. and Hsu, L., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110-2114, 1972）、エレ
クトロポレーション法（三浦 謹一郎ら編、新基礎生化
学実験法、遺伝子工学、1988、丸善株式会社）等の通常
用いられる方法で行うことができる。形質転換した大腸
菌は、工業技術院生命工学工業研究所に寄託されてお
り、その受託番号は、FERM BP−6624である。
【００３３】この請求項２記載の本発明の形質転換体で
ある大腸菌を培養し、該大腸菌の有するアミノ酸配列を
特定し、あるいは酵素の比活性を測定することにより、
配列表の配列番号４記載の遺伝子の発現を確認すること
ができる。従来、ダイズ種子を含む植物由来のエポキシ
ド水解酵素で、高活性を発現することを明らかにした例
はない。このような高活性な植物由来のエポキシド水解
酵素についての大腸菌における大量発現系は、該酵素遺
伝子の機能の簡便な評価に有用である。
ある大腸菌を培養し、該大腸菌の有するアミノ酸配列を
特定し、あるいは酵素の比活性を測定することにより、
配列表の配列番号４記載の遺伝子の発現を確認すること
ができる。従来、ダイズ種子を含む植物由来のエポキシ
ド水解酵素で、高活性を発現することを明らかにした例
はない。このような高活性な植物由来のエポキシド水解
酵素についての大腸菌における大量発現系は、該酵素遺
伝子の機能の簡便な評価に有用である。
【００３４】
【実施例】試験例１（ダイズ種子由来エポキシド水解酵
素cDNAの作製および塩基配列決定） ［１．ｃＤＮＡライブラリーの作成］ 開花後18日目のダイズ種子より、Fukazawa，C．et a
l.，Journal of Biological Chemistry, 200, 6234-623
9 (1985)の方法に従い、SDS-フェノール法を用いて全RN
A を抽出し、poly(A)+RNA を調製した。poly(A)+RNA2.5
μgを、ガブラー−ホフマン（Gubler−Hoffmann）法の
原理に基づいたｃDNA 合成キット（アマシャム−ファル
マシア社製）を用い、[α−32P]−dCTPを加えて合成を
モニターしながら２本鎖DNAを合成した。
素cDNAの作製および塩基配列決定） ［１．ｃＤＮＡライブラリーの作成］ 開花後18日目のダイズ種子より、Fukazawa，C．et a
l.，Journal of Biological Chemistry, 200, 6234-623
9 (1985)の方法に従い、SDS-フェノール法を用いて全RN
A を抽出し、poly(A)+RNA を調製した。poly(A)+RNA2.5
μgを、ガブラー−ホフマン（Gubler−Hoffmann）法の
原理に基づいたｃDNA 合成キット（アマシャム−ファル
マシア社製）を用い、[α−32P]−dCTPを加えて合成を
モニターしながら２本鎖DNAを合成した。
【００３５】１nmolのEco RI−Not I−Bam HIアダプタ
ー（宝酒造社製）を、ニッポンジーン社製ライゲーショ
ンパックでライゲーションした。このcDNAを、Fukazaw
a，C．et al.，Journal of Biological Chemistry, 20
0, 6234-6239 (1985)の方法に従い、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により、500bp以上の長さのものをゲ
ルから切り出して集めるとともに、過剰なアダプターを
除去した。アダプターには、５'位にリン酸基がないの
で、T4ヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン社製）を
用いてリン酸基を導入した。
ー（宝酒造社製）を、ニッポンジーン社製ライゲーショ
ンパックでライゲーションした。このcDNAを、Fukazaw
a，C．et al.，Journal of Biological Chemistry, 20
0, 6234-6239 (1985)の方法に従い、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により、500bp以上の長さのものをゲ
ルから切り出して集めるとともに、過剰なアダプターを
除去した。アダプターには、５'位にリン酸基がないの
で、T4ヌクレオチドキナーゼ（ニッポンジーン社製）を
用いてリン酸基を導入した。
【００３６】その後、Eco RIで切断し、脱リン酸化して
あるλgt10ファージベクターアーム（宝酒造社製）に、
上記と同様に、ニッポンジーン社製ライゲーションパッ
クでライゲーションし、in vitroパッケージングキット
（アマシャム−ファルマシア社製）でλファージにパッ
ケージングを行った。このようにして、開花後18日目の
ダイズ登熟種子cDNAライブラリーを作製した。
あるλgt10ファージベクターアーム（宝酒造社製）に、
上記と同様に、ニッポンジーン社製ライゲーションパッ
クでライゲーションし、in vitroパッケージングキット
（アマシャム−ファルマシア社製）でλファージにパッ
ケージングを行った。このようにして、開花後18日目の
ダイズ登熟種子cDNAライブラリーを作製した。
【００３７】［２．ダイズ種子由来エポキシド水解酵素
のアミノ酸配列決定およびプローブの作製］ 開花後１８日目のダイズ種子を粉砕し、酢酸緩衝液を加
えてエポキシド水解酵素を含む可溶性画分を抽出、透析
した後、疎水クロマト（カラム：ブチルトーヨーパール
５ｃｍ×９０ｃｍ、東ソー社製）、次いでゲルろ過
（カラム：セファクリルＳ−２００ ２．６ｃｍ×１８
０ｃｍ、アマシャム−ファルマシア社製）にかけること
により、ほぼ精製されたエポキシド水解酵素を得た。こ
のダイズ種子由来のエポキシド水解酵素のＮ−末端は、
ブロックされていた。そこで、内部のアミノ酸配列を決
定するために、Arahira M. and Fukazawa C.，Plant Mo
lecular Biology ，25，597-605 （1994）の方法に従
い、V8プロテアーゼ（宝酒造社製）およびリジルエンド
ペプチダーゼ（和光純薬社製）により、エポキシド水解
酵素を分解した。
のアミノ酸配列決定およびプローブの作製］ 開花後１８日目のダイズ種子を粉砕し、酢酸緩衝液を加
えてエポキシド水解酵素を含む可溶性画分を抽出、透析
した後、疎水クロマト（カラム：ブチルトーヨーパール
５ｃｍ×９０ｃｍ、東ソー社製）、次いでゲルろ過
（カラム：セファクリルＳ−２００ ２．６ｃｍ×１８
０ｃｍ、アマシャム−ファルマシア社製）にかけること
により、ほぼ精製されたエポキシド水解酵素を得た。こ
のダイズ種子由来のエポキシド水解酵素のＮ−末端は、
ブロックされていた。そこで、内部のアミノ酸配列を決
定するために、Arahira M. and Fukazawa C.，Plant Mo
lecular Biology ，25，597-605 （1994）の方法に従
い、V8プロテアーゼ（宝酒造社製）およびリジルエンド
ペプチダーゼ（和光純薬社製）により、エポキシド水解
酵素を分解した。
【００３８】分解後、それぞれのサンプルを逆相カラム
（東ソー社製、Silica ODS 120T 4.6mm ×150mm）を接
続した高速液体クロマトグラフィー（島津社製LC−6A
D）を用いて0.1％TFA −0.1％TFA／60％アセトニトリル
の直線密度勾配をかけた溶媒系で分画した。得られたペ
プチドを気相式アミノ酸シークエンサー（パーキンエル
マー社製、477A型）で決定し、内部のアミノ酸配列とし
た。これらのアミノ酸配列のうち、プローブとして適す
る配列を検討し、23merの縮重のあるオリゴヌクレオチ
ドを合成した（配列表の配列番号５参照）。
（東ソー社製、Silica ODS 120T 4.6mm ×150mm）を接
続した高速液体クロマトグラフィー（島津社製LC−6A
D）を用いて0.1％TFA −0.1％TFA／60％アセトニトリル
の直線密度勾配をかけた溶媒系で分画した。得られたペ
プチドを気相式アミノ酸シークエンサー（パーキンエル
マー社製、477A型）で決定し、内部のアミノ酸配列とし
た。これらのアミノ酸配列のうち、プローブとして適す
る配列を検討し、23merの縮重のあるオリゴヌクレオチ
ドを合成した（配列表の配列番号５参照）。
【００３９】［３．ダイズ種子由来のエポキシド水解酵
素ｃDNA のクローニング］ ［２］で得られたオリゴヌクレオチドを、[ γ−32P ］
−ATP で、Fukazawa，C ．et al.，Journal of Biologi
cal Chemistry, 200, 6234-6239 (1985)の方法に従い、
ラベルした。 これをプローブとして、［１］で作製した開花後18日目
の大豆の登熟種子ライブラリーから、Arahira M. and F
ukazawa C.，Plant Molecular Biology, 25, 597-605
（1994）の方法に従って、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを実施した。その結果、100 万プラークから１個の
陽性クローンが分離できた。
素ｃDNA のクローニング］ ［２］で得られたオリゴヌクレオチドを、[ γ−32P ］
−ATP で、Fukazawa，C ．et al.，Journal of Biologi
cal Chemistry, 200, 6234-6239 (1985)の方法に従い、
ラベルした。 これをプローブとして、［１］で作製した開花後18日目
の大豆の登熟種子ライブラリーから、Arahira M. and F
ukazawa C.，Plant Molecular Biology, 25, 597-605
（1994）の方法に従って、プラークハイブリダイゼーシ
ョンを実施した。その結果、100 万プラークから１個の
陽性クローンが分離できた。
【００４０】この陽性プラークを純化し、大腸菌に感染
させてファージを増やした後に、ファージ粒子を、CsCl
ステップワイズ密度勾配を用いた超遠心法により精製
し、ファージDNAを得た。精製したファージDNAから、Ba
m HIでインサートを切り出し、アガロースゲルから精製
した後に、pUC19プラスミドベクターのBam HIサイトに
サブクローニングした。クローン化した大腸菌から、プ
ラスミドDNAを常法（Maniatis T．et al.,“Molecular
cloning" Cold Spring Harber Labo. (1982)）に従い、
調製した。
させてファージを増やした後に、ファージ粒子を、CsCl
ステップワイズ密度勾配を用いた超遠心法により精製
し、ファージDNAを得た。精製したファージDNAから、Ba
m HIでインサートを切り出し、アガロースゲルから精製
した後に、pUC19プラスミドベクターのBam HIサイトに
サブクローニングした。クローン化した大腸菌から、プ
ラスミドDNAを常法（Maniatis T．et al.,“Molecular
cloning" Cold Spring Harber Labo. (1982)）に従い、
調製した。
【００４１】調製したプラスミドについて、島津社製、
DNAシークエンサーDSQ1000 を用いた蛍光オートシーク
エンスを行った。解析の結果、クローニングした陽性プ
ラークのcDNAは、エポキシド水解酵素の全長を含んでお
り、配列表の配列番号３に示す塩基配列およびアミノ酸
配列を有していた。本cDNAの全長は、1332bp、うち、22
bpがpoly Aであった。アミノ酸数は、開始メチオニンか
らの全体で341塩基、イオンスプレーマススペクトロメ
トリーで得られた分子量（36171Da）の結果から、315残
基のアミノ酸から成っていると推測された。
DNAシークエンサーDSQ1000 を用いた蛍光オートシーク
エンスを行った。解析の結果、クローニングした陽性プ
ラークのcDNAは、エポキシド水解酵素の全長を含んでお
り、配列表の配列番号３に示す塩基配列およびアミノ酸
配列を有していた。本cDNAの全長は、1332bp、うち、22
bpがpoly Aであった。アミノ酸数は、開始メチオニンか
らの全体で341塩基、イオンスプレーマススペクトロメ
トリーで得られた分子量（36171Da）の結果から、315残
基のアミノ酸から成っていると推測された。
【００４２】試験例２（ダイズ種子由来のエポキシド水
解酵素遺伝子のクローニング） ［１．エポキシド水解酵素遺伝子のクローニング］ 実施例１で得られたcDNAを、[ α−32P]−dCTPを用い
て、Arahira M. and Fukazawa C.，Plant Molecular Bi
ology ，25，597-605 （1994）の方法に従ってラベル
し、プローブとして用いた。市販のダイズ遺伝子ライブ
ラリー（STRATAGENE社）から、上記プローブを用いてエ
ポキシド水解酵素遺伝子を、試験例１の［３］と同様の
方法を用いてスクリーニングし、約20万プラークから１
個の陽性プラークを得て、ファージDNA を精製した。な
お、使用した市販ライブラリーは、発芽したダイズより
核DNA を抽出・精製し、制限酵素Mbo Iにより部分分解
し、これをファージベクターに組み込んだものである。
解酵素遺伝子のクローニング） ［１．エポキシド水解酵素遺伝子のクローニング］ 実施例１で得られたcDNAを、[ α−32P]−dCTPを用い
て、Arahira M. and Fukazawa C.，Plant Molecular Bi
ology ，25，597-605 （1994）の方法に従ってラベル
し、プローブとして用いた。市販のダイズ遺伝子ライブ
ラリー（STRATAGENE社）から、上記プローブを用いてエ
ポキシド水解酵素遺伝子を、試験例１の［３］と同様の
方法を用いてスクリーニングし、約20万プラークから１
個の陽性プラークを得て、ファージDNA を精製した。な
お、使用した市販ライブラリーは、発芽したダイズより
核DNA を抽出・精製し、制限酵素Mbo Iにより部分分解
し、これをファージベクターに組み込んだものである。
【００４３】本陽性ファージDNAは、約12kbpのインサー
トが含まれていた。これを制限酵素Sal Iで切り出し、
アガロースゲルで精製の後に、pUC19 プラスミドベクタ
ーにサブクローニングした。その後に、試験例１の
［３］に記載した方法でDNAシークエンスを行った。解
析の結果、クローニングした遺伝子の配列は、配列表の
配列番号４に示す塩基配列およびアミノ酸配列を有して
いた。該配列の全長は1933bpで、２つのイントロンによ
り３つのエクソンに分断されていた。各イントロンの塩
基数は、第１イントロンよりそれぞれ168bp、148bpであ
った（配列表の配列番号４参照）。得られたダイズエポ
キシド水解酵素の遺伝子の塩基配列は、データベースで
の検索の結果、アラビドプシス、ポテトで判明している
cDNAの塩基配列とも異なる遺伝子配列であった。
トが含まれていた。これを制限酵素Sal Iで切り出し、
アガロースゲルで精製の後に、pUC19 プラスミドベクタ
ーにサブクローニングした。その後に、試験例１の
［３］に記載した方法でDNAシークエンスを行った。解
析の結果、クローニングした遺伝子の配列は、配列表の
配列番号４に示す塩基配列およびアミノ酸配列を有して
いた。該配列の全長は1933bpで、２つのイントロンによ
り３つのエクソンに分断されていた。各イントロンの塩
基数は、第１イントロンよりそれぞれ168bp、148bpであ
った（配列表の配列番号４参照）。得られたダイズエポ
キシド水解酵素の遺伝子の塩基配列は、データベースで
の検索の結果、アラビドプシス、ポテトで判明している
cDNAの塩基配列とも異なる遺伝子配列であった。
【００４４】実施例１（ダイズ種子由来のエポキシド水
解酵素の大腸菌による発現） ［１．エポキシド水解酵素cDNAのPCR による増幅］ まず、イオンスプレーマススペクトロメトリーで得られ
たエポキシド水解酵素の分子量から推定したタンパク質
のN −末端側と、エポキシド水解酵素cDNAのストップコ
ドン側（エポキシド水解酵素タンパク質のＣ−末端側）
とで、大腸菌での発現プラスミドの構築に必要な制限酵
素サイトを５' 側に含むプライマーをそれぞれ作製し
（配列表の配列番号１，２参照）、試験例１でクローニ
ングしたダイズ種子由来のエポキシド水解酵素cDNAを鋳
型としてPCR を行った。
解酵素の大腸菌による発現） ［１．エポキシド水解酵素cDNAのPCR による増幅］ まず、イオンスプレーマススペクトロメトリーで得られ
たエポキシド水解酵素の分子量から推定したタンパク質
のN −末端側と、エポキシド水解酵素cDNAのストップコ
ドン側（エポキシド水解酵素タンパク質のＣ−末端側）
とで、大腸菌での発現プラスミドの構築に必要な制限酵
素サイトを５' 側に含むプライマーをそれぞれ作製し
（配列表の配列番号１，２参照）、試験例１でクローニ
ングしたダイズ種子由来のエポキシド水解酵素cDNAを鋳
型としてPCR を行った。
【００４５】PCRの条件は、以下のとおりである。ま
ず、Taq ポリメラーゼは、TaKaRa ExTaq（宝酒造社製）
を1 反応あたり2.5Ｕ用いた。また、プライマーは、終
濃度0.4μM、dNTPmix は0.2mM、鋳型となるエポキシド
水解酵素cDNAフラグメントは約10ng使用した。遺伝子増
幅装置は、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480（宝酒造社
製）を用い、変性温度95℃、30秒、アニーリング温度56
℃、30秒、伸張反応72℃、１分30秒、35サイクルの条件
で行った。
ず、Taq ポリメラーゼは、TaKaRa ExTaq（宝酒造社製）
を1 反応あたり2.5Ｕ用いた。また、プライマーは、終
濃度0.4μM、dNTPmix は0.2mM、鋳型となるエポキシド
水解酵素cDNAフラグメントは約10ng使用した。遺伝子増
幅装置は、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480（宝酒造社
製）を用い、変性温度95℃、30秒、アニーリング温度56
℃、30秒、伸張反応72℃、１分30秒、35サイクルの条件
で行った。
【００４６】その結果、得られたバンドをTAベクター[P
CR2.1]（Invitrogen社製）にサブクローニングした。そ
の後に、試験例１［３］に記載した方法でDNAシークエ
ンスを行った。解析の結果、PCR による変異は認められ
なかった。
CR2.1]（Invitrogen社製）にサブクローニングした。そ
の後に、試験例１［３］に記載した方法でDNAシークエ
ンスを行った。解析の結果、PCR による変異は認められ
なかった。
【００４７】［２．プラスミドベクターおよび形質転換
体の作製］ 次に、それぞれのプライマーに含まれている制限酵素Nd
e IとEco RIとで、クローニングしたTAベクターからイ
ンサートを切り出し、アガロースゲルでDNAフラグメン
ト精製した後に、発現用のプラスミドであるpRSETベク
ター（Invitrogen社製）のNde IサイトとEco RIサイト
の間にサブクローニングした。
体の作製］ 次に、それぞれのプライマーに含まれている制限酵素Nd
e IとEco RIとで、クローニングしたTAベクターからイ
ンサートを切り出し、アガロースゲルでDNAフラグメン
ト精製した後に、発現用のプラスミドであるpRSETベク
ター（Invitrogen社製）のNde IサイトとEco RIサイト
の間にサブクローニングした。
【００４８】インサートであるエポキシド水解酵素cDNA
フラグメントとpRSETベクターとの接続部のDNAシークエ
ンスが正確かどうかを調べるために、発現プラスミドを
保持していても、タンパク質が発現しない大腸菌である
JM109株に形質転換した。これは、もしも発現したタン
パク質が大腸菌にとって毒性のあるタンパク質であった
場合に、発現プラスミドのわずかな発現によって大腸菌
がダメージを受け、DNAの抽出等に支障をきたす可能性
があるためである。
フラグメントとpRSETベクターとの接続部のDNAシークエ
ンスが正確かどうかを調べるために、発現プラスミドを
保持していても、タンパク質が発現しない大腸菌である
JM109株に形質転換した。これは、もしも発現したタン
パク質が大腸菌にとって毒性のあるタンパク質であった
場合に、発現プラスミドのわずかな発現によって大腸菌
がダメージを受け、DNAの抽出等に支障をきたす可能性
があるためである。
【００４９】試験例１［３］に記載した方法でDNAシー
クエンスを行った。解析の結果、接続部は正確であっ
た。 この発現プラスミドを発現用大腸菌BL21（DE3）に形質
転換した。このようにして形質転換された大腸菌は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、そ
の受託番号はFERM BP−6624である。
クエンスを行った。解析の結果、接続部は正確であっ
た。 この発現プラスミドを発現用大腸菌BL21（DE3）に形質
転換した。このようにして形質転換された大腸菌は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、そ
の受託番号はFERM BP−6624である。
【００５０】実施例２（形質転換体からのエポキシド水
解酵素の発現） 次に、この発現プラスミドを発現用大腸菌BL21（DE3）
に形質転換し、エポキシド水解酵素の発現を試みた。単
一コロニーを先ず、２mlLB−アンピシリン（濃度50μg
／ml）培地に植菌し、37℃で一晩200r.p.m.で振盪培養
し、これを前培養とした。
解酵素の発現） 次に、この発現プラスミドを発現用大腸菌BL21（DE3）
に形質転換し、エポキシド水解酵素の発現を試みた。単
一コロニーを先ず、２mlLB−アンピシリン（濃度50μg
／ml）培地に植菌し、37℃で一晩200r.p.m.で振盪培養
し、これを前培養とした。
【００５１】５Lの三角フラスコに１Lの上記培地に入れ
て前培養した菌液を１ml植菌し、OD600nm が約0.6とな
るまで、37℃、200r.p.m. で培養した。OD600nm が約0.
6に到達したときに、isopropyl β-D-thiogalactopyran
oside (IPTG) を終濃度１mMになるように添加し、さら
に、３時間上記条件で培養した。培養終了後、遠心して
集菌し、100mMNaCl、１mMEDTAを含んだ200mM酢酸緩衝
液、pH5.0で菌体を洗浄後、同緩衝液で懸濁し、超音波
処理により菌体を破砕して上清を得た。
て前培養した菌液を１ml植菌し、OD600nm が約0.6とな
るまで、37℃、200r.p.m. で培養した。OD600nm が約0.
6に到達したときに、isopropyl β-D-thiogalactopyran
oside (IPTG) を終濃度１mMになるように添加し、さら
に、３時間上記条件で培養した。培養終了後、遠心して
集菌し、100mMNaCl、１mMEDTAを含んだ200mM酢酸緩衝
液、pH5.0で菌体を洗浄後、同緩衝液で懸濁し、超音波
処理により菌体を破砕して上清を得た。
【００５２】得られた上清を55℃、10分間加熱処理をし
て、大腸菌由来のタンパク質の大部分を変性させて、遠
心により除去した。得られた上清タンパク質の大部分
は、発現したエポキシド水解酵素であるが、さらに精製
を試みた。
て、大腸菌由来のタンパク質の大部分を変性させて、遠
心により除去した。得られた上清タンパク質の大部分
は、発現したエポキシド水解酵素であるが、さらに精製
を試みた。
【００５３】上清をゲルろ過カラムSephacryl S-200
（2.6 ×90cm）（アマシャム−ファルマシア社製）に供
して分画した。得られた画分は、SDS−PAGE上で単一バ
ンドであった。本タンパク質のＮ- 末端シークエンスを
試験例１［２］と同様に気相式アミノ酸シークエンサー
（パーキンエルマー社製、477A型）で決定した結果、エ
ポキシド水解酵素であることが確認された。
（2.6 ×90cm）（アマシャム−ファルマシア社製）に供
して分画した。得られた画分は、SDS−PAGE上で単一バ
ンドであった。本タンパク質のＮ- 末端シークエンスを
試験例１［２］と同様に気相式アミノ酸シークエンサー
（パーキンエルマー社製、477A型）で決定した結果、エ
ポキシド水解酵素であることが確認された。
【００５４】得られたダイズ種子由来エポキシド水解酵
素は、SDS‐PAGE上で33キロダルトン（単一バンド）、
スチレンオキサイドに対する比活性 1.36U/mg(１Ｕ＝１
μmol/min ）であった。上記のごとく、精製した酵素は
高い酵素活性を有しており、有害なエポキシドを加水分
解して無害化する優れた能力を有することが明らかとな
った。
素は、SDS‐PAGE上で33キロダルトン（単一バンド）、
スチレンオキサイドに対する比活性 1.36U/mg(１Ｕ＝１
μmol/min ）であった。上記のごとく、精製した酵素は
高い酵素活性を有しており、有害なエポキシドを加水分
解して無害化する優れた能力を有することが明らかとな
った。
【００５５】
【発明の効果】請求項１および２記載の本発明によれ
ば、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素をコードする
cDNAを有するプラスミドベクターおよびそれを保有する
形質転換体が提供される。この形質転換体は、該エポキ
シド水解酵素をコードする遺伝子の機能を簡便に評価す
るための微生物における発現系として有効に利用するこ
とができる。また、この発現系を用いることにより、重
要な生体防御機能を果たすエポキシド水解酵素を容易に
開発することができ、食用植物への応用が期待される。
ば、ダイズ種子由来のエポキシド水解酵素をコードする
cDNAを有するプラスミドベクターおよびそれを保有する
形質転換体が提供される。この形質転換体は、該エポキ
シド水解酵素をコードする遺伝子の機能を簡便に評価す
るための微生物における発現系として有効に利用するこ
とができる。また、この発現系を用いることにより、重
要な生体防御機能を果たすエポキシド水解酵素を容易に
開発することができ、食用植物への応用が期待される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director of National Food Research Institute, Ministry of Agricult ure, Forestry and Fisheries <120> cDNA and genomic sequence of epoxide hydrolase and its assay metho d <130> P101011K <160> 5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on epoxide hydrolase cDNA sequence. <400> 1 atatacatat ggagcaaata aagcacagaa ca 32 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on epoxide hydrolase cDNA sequence. <400> 2 ggttgaattc gtttttggac aagatcagaa cttc 34<210> 3 <211> 1332 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (73)...(1098) <400> 3 gaggagccta cggtttggca ttgagtgtga aacaggctaa taaatgtgag tggttcaccg 60 ccgcaacttc ca atg tgc gag cac tta ctc gtc tca ctg tct tgc tat att 111 Met Cys Glu His Leu Leu Val Ser Leu Ser Cys Tyr Ile 5 10 tgg gtg aga aca cag agg ata gtg gag ttc aac gag atg gag caa ata 159 Trp Val Arg Thr Gln Arg Ile Val Glu Phe Asn Glu Met Glu Gln Ile 15 20 25 aag cac aga aca gtt gaa gtg aat ggc ata aaa atg cat gtt gca gag 207 Lys His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met His Val Ala Glu 30 35 40 45 aaa gga gag ggt cca gtg gtg ttg ttc ctc cac ggc ttc cct gag ctc 255 Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly Phe Pro Glu Leu 50 55 60 tgg tac tca tgg cgc cat cag att ctc tct ctc agc tcc ctc ggc tac 303 Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ser Leu Ser Ser Leu Gly Tyr 65 70 75 cgc gcc gtc gct ccc gat ctc cgt ggc tac ggt gac acc gag gca cca 351 Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp Thr Glu Ala Pro 80 85 90 cct tca atc agc agc tac aac tgc ttc cac ata gtg ggt gat ctc gtt 399 Pro Ser Ile Ser Ser Tyr Asn Cys Phe His Ile Val Gly Asp Leu Val 95 100 105 gcg ctt att gac tct ctg ggt gtc caa caa gtg ttc ctt gtg gct cat 447 Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Gln Gln Val Phe Leu Val Ala His 110 115 120 125 gac tgg gga gcc atc ata ggt tgg tat cta tgc atg ttt cgc cct gac 495 Asp Trp Gly Ala Ile Ile Gly Trp Tyr Leu Cys Met Phe Arg Pro Asp 130 135 140 aaa gtt aag gcc tat gtc tgc ctc agt gtc cct ctc ctc cgc aga gac 543 Lys Val Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Leu Leu Arg Arg Asp 145 150 155 cca aac atc aga acg gtg gat ggc atg cgt gct ttg tat gga gac gac 591 Pro Asn Ile Arg Thr Val Asp Gly Met Arg Ala Leu Tyr Gly Asp Asp 160 165 170 tac tat gtc tgc aga ttt cag aaa cca ggg gaa atg gag gct cag atg 639 Tyr Tyr Val Cys Arg Phe Gln Lys Pro Gly Glu Met Glu Ala Gln Met 175 180 185 gct gaa gtt ggc act gag tat gtt ctc aaa aac atc ctt aca act cgc 687 Ala Glu Val Gly Thr Glu Tyr Val Leu Lys Asn Ile Leu Thr Thr Arg 190 195 200 205 aat cct ggt cct cca att ctt ccc aag gga agg ttt caa ttc aat cca 735 Asn Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Gly Arg Phe Gln Phe Asn Pro 210 215 220 gaa atg ccc aac acc ttg ccc tct tgg ctc aca gaa gaa gat ctc gcc 783 Glu Met Pro Asn Thr Leu Pro Ser Trp Leu Thr Glu Glu Asp Leu Ala 225 230 235 tat tat gtc tcc aaa ttt gag aaa acc gga ttc act gga ccc ttg aac 831 Tyr Tyr Val Ser Lys Phe Glu Lys Thr Gly Phe Thr Gly Pro Leu Asn 240 245 250 tac tac aga aat ttc aac tta aat tgg gag ttg acg gca cca tgg aca 879 Tyr Tyr Arg Asn Phe Asn Leu Asn Trp Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr 255 260 265 gga ggg caa atc aag gtg ccc gta aaa tac ata aca ggt gag ttg gac 927 Gly Gly Gln Ile Lys Val Pro Val Lys Tyr Ile Thr Gly Glu Leu Asp 270 275 280 285 atg gta tac aac tcg ctg aac ttg aag gag tat atc cac ggc gga ggg 975 Met Val Tyr Asn Ser Leu Asn Leu Lys Glu Tyr Ile His Gly Gly Gly 290 295 300 ttc aag caa gat gtg cca aat tta gaa caa gtg att gtg cag aaa gga 1023 Phe Lys Gln Asp Val Pro Asn Leu Glu Gln Val Ile Val Gln Lys Gly 305 310 315 gtg gct cac ttc aat aat caa gaa gca gca gag gaa atc gat aat tac 1071 Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu Ala Ala Glu Glu Ile Asp Asn Tyr 320 325 330 ata tac gat ttt atc aac aag ttc tga tcttgtccaa aaacgaattc 1118 Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe Stop 335 340 aaccagatat aaagtcgcag ctgaagtgaa agggtgttat aattgcgctt ttgttttgat 1178 atttaaggta tcgagatctt ttttatgggc aggattcatc aactgcagaa aacctccata 1238 ccatcaacct tcctatgctt gtttgtatta attaactgat aataatactg tatggtttgg 1298 tacttgctaa ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1332 <210> 4 <211> 1933 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (271) ...(810), (979)...(1217), (1367)...(1613) <400> 4 aatgaaacat ttttattttt tctaatttat ctttaactca tatacaggga agtgaaaaaa 60 ataagaaata aatatataaa tgagtgaaaa tataattaat atgaaaaata agagatatat 120 taggaaatgc atataatgat tttcgtgaaa tgtaaaatat taaatttcct ttttaatatt 180 aaaacggcag gttagctcga ggagcctacg gtttggcatt gagtgtgaaa caggctaata 240 aatgtgagtg gttcaccgcc gcaacttcca atg tgc gag cac tta ctc gtc tca 294 Met Cys Glu His Leu Leu Val Ser 5 ctg tct tgc tat att tgg gtg aga aca cag agg ata gtg gag ttc aac 342 Leu Ser Cys Tyr Ile Trp Val Arg Thr Gln Arg Ile Val Glu Phe Asn 10 15 20 gag atg gag caa ata aag cac aga aca gtt gaa gtg aat ggc ata aaa 390 Glu Met Glu Gln Ile Lys His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys 25 30 35 40 atg cat gtt gca gag aaa gga gag ggt cca gtg gtg ttg ttc ctc cac 438 Met His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His 45 50 55 ggc ttc cct gag ctc tgg tac tca tgg cgc cat cag att ctc tct ctc 486 Gly Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ser Leu 60 65 70 agc tcc ctc ggc tac cgc gcc gtc gct ccc gat ctc cgt ggc tac ggt 534 Ser Ser Leu Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly 75 80 85 gac acc gaa gca cca cct tca atc agc agc tac aac tgc ttc cac ata 582 Asp Thr Glu Ala Pro Pro Ser Ile Ser Ser Tyr Asn Cys Phe His Ile 90 95 100 gtg ggt gat ctc gtt gcg ctt att gac tct ctg ggt gtc caa caa gtg 630 Val Gly Asp Leu Val Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Gln Gln Val 105 110 115 120 ttc ctt gtg gct cat gac tgg gga gcc atc ata ggt tgg tat cta tgc 678 Phe Leu Val Ala His Asp Trp Gly Ala Ile Ile Gly Trp Tyr Leu Cys 125 130 135 atg ttt cgc cct gac aaa gtt aag gcc tat gtc tgc ctc agt gtc cct 726 Met Phe Arg Pro Asp Lys Val Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro 140 145 150 ctc ctc cgc aga gac cca aac atc aga acg gtg gat ggc atg cgt gct 774 Leu Leu Arg Arg Asp Pro Asn Ile Arg Thr Val Asp Gly Met Arg Ala 155 160 165 ttg tat gga gac gac tac tat gtc tgc aga ttt cag gtttattaat 820 Leu Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Val Cys Arg Phe Gln 170 175 180 taattctctc attttgctta tttttatccc acccttgttt ttctttctct ttctaattaa 880 ctttgcacga aatttaattt gtttctgtga aatggggtcg gaagattgta gtaccagatg 940 cgaattattg tttttaaacc gtgtgtgtgt aactgcag aaa cca ggg gaa atg gag 996 Lys Pro Gly Glu Met Glu 185 gct cag atg gct gaa gtt ggc act gag tat gtt ctc gaa aac atc ctt 1044 Ala Gln Met Ala Glu Val Gly Thr Glu Tyr Val Leu Glu Asn Ile Leu 190 195 200 aca act cgc aat cct ggt cct cca att ctt ccc aag gga agg ttt caa 1092 Thr Thr Arg Asn Pro Gly Pro Pro Ile Leu Pro Lys Gly Arg Phe Gln 205 210 215 ttc aat cca gaa atg ccc aac acc ttg ccc tct tgg ctc aca gaa gaa 1140 Phe Asn Pro Glu Met Pro Asn Thr Leu Pro Ser Trp Leu Thr Glu Glu 220 225 230 gat ctc gcc tat tat gtc tcc aaa ttt gag aaa acc gga ttc act gga 1188 Asp Leu Ala Tyr Tyr Val Ser Lys Phe Glu Lys Thr Gly Phe Thr Gly 235 240 245 250 ccc ttg aac tac tac aga aat ttc aac tt gtaatttctt gattctccgt 1237 Pro Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Phe Asn Leu 255 260 atttgcccgg gataattgtt ttccactgct ctaagttaat gtttctttct tgggaaaata 1297 tttgttcaac atgacgggat cccaataaaa aaagaccatt aattaattaa ttattgtatg 1357 tatttgcag a aat tgg gag ttg acg gca cca tgg aca gga ggg caa atc 1406 Asn Trp Glu Leu Thr Ala Pro Trp Thr Gly Gly Gln Ile 265 270 aag gtg ccc gta aaa tac ata aca ggt gag ttg gac atg gta tac aac 1454 Lys Val Pro Val Lys Tyr Ile Thr Gly Glu Leu Asp Met Val Tyr Asn 275 280 285 tcg ctg aac ttg aag gag tat atc cac ggc gga ggg ttc aag caa gat 1502 Ser Leu Asn Leu Lys Glu Tyr Ile His Gly Gly Gly Phe Lys Gln Asp 290 295 300 305 gtg cca aat tta gaa caa gtg att gtg cag aaa gga gtg gct cac ttc 1550 Val Pro Asn Leu Glu Gln Val Ile Val Gln Lys Gly Val Ala His Phe 310 315 320 aat aat caa gaa gca gca gag gaa atc gat aat tac ata tac gat ttt 1598 Asn Asn Gln Glu Ala Ala Glu Glu Ile Asp Asn Tyr Ile Tyr Asp Phe 325 330 335 atc aac aag ttc tga tcttgtccaa aaacgaattc aaccagatat aaagtcgcag 1653 Ile Asn Lys Phe Stop 340 ctgaagtgaa agggtgttat aattgcgctt ttgttttgat atttaaggta tcgagatctt 1713 ttttatgggc aggattcatc aactgcagaa aacctccata ccatcaacct tcctatgctt 1773 gtttgtatta attaactgat aataatactg tatggtttgg tacttgctaa ataaacttag 1833 tcttgtcatg caaatggtat atcttaaaaa atgttttgaa atatgtgtat Ttggaactaa 1893 gcttcaatgc gtgtgtgtat atctcgacat aatctcgtag 1933 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed nucleotide based on epoxide hydrolase amino acid sequence . <400> 5 ggcatytcng grttraaytg raa 23
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，109, ｐ．722−723，1995 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａ ｌ，６（２），ｐ．259−269，1994 Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａ ｌ．，６（２），ｐ．251−258，1994 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，282，ｐ．711 −714，1992 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/21 C12N 9/14
Claims (2)
- 【請求項１】 プライマーとして配列表の配列番号１お
よび２記載のオリゴヌクレオチドを、鋳型としてダイズ
種子由来のエポキシド水解酵素cDNAを用いたポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅されたDNA産物を、発現用プラス
ミドにサブクローニングすることによって得られるプラ
スミドベクター。 - 【請求項２】 請求項１記載のプラスミドベクターを保
有する形質転換体（FERM BP‐6624）。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02118399A JP3355368B2 (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | 植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体 |
| US09/412,600 US6372469B1 (en) | 1999-01-29 | 1999-10-06 | CDNA encoding plant-derived epoxide hydrolase, gene encoding same and transformant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02118399A JP3355368B2 (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | 植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000228983A JP2000228983A (ja) | 2000-08-22 |
| JP3355368B2 true JP3355368B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=12047839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02118399A Expired - Lifetime JP3355368B2 (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | 植物由来のエポキシド水解酵素をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよび形質転換体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6372469B1 (ja) |
| JP (1) | JP3355368B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1578987A2 (en) * | 2001-08-03 | 2005-09-28 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| US6943001B2 (en) * | 2001-08-03 | 2005-09-13 | Diversa Corporation | Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| IT1393405B1 (it) * | 2008-09-23 | 2012-04-20 | Fond Parco Tecnologico Padano | Proteine ricombinanti di epossido idrolasi (eh) di pesco. |
-
1999
- 1999-01-29 JP JP02118399A patent/JP3355368B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-06 US US09/412,600 patent/US6372469B1/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８２，ｐ．７１１−７１４，１９９２ |
| Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０９，ｐ．７２２−７２３，１９９５ |
| Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，６（２），ｐ．２５９−２６９，１９９４ |
| Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．，６（２），ｐ．２５１−２５８，１９９４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6372469B1 (en) | 2002-04-16 |
| US20020039777A1 (en) | 2002-04-04 |
| JP2000228983A (ja) | 2000-08-22 |
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