JP3355367B2 - 魚病抗菌剤 - Google Patents
魚病抗菌剤Info
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- JP3355367B2 JP3355367B2 JP1221398A JP1221398A JP3355367B2 JP 3355367 B2 JP3355367 B2 JP 3355367B2 JP 1221398 A JP1221398 A JP 1221398A JP 1221398 A JP1221398 A JP 1221398A JP 3355367 B2 JP3355367 B2 JP 3355367B2
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- Japan
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- thiotroposin
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- bacteria
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- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を用いたチ
オトロポシンの製造方法およびチオトロポシンの用途に
関する。詳しくは、カウロバクター(Caulobacter)属
に属する微生物を培養し、得られる培養物からチオトロ
ポシンを分離、採取するチオトロポシンの製造方法、お
よびチオトロポシンを有効成分として含む魚病抗菌剤、
抗微細藻剤または抗アレルギー剤に関する。
オトロポシンの製造方法およびチオトロポシンの用途に
関する。詳しくは、カウロバクター(Caulobacter)属
に属する微生物を培養し、得られる培養物からチオトロ
ポシンを分離、採取するチオトロポシンの製造方法、お
よびチオトロポシンを有効成分として含む魚病抗菌剤、
抗微細藻剤または抗アレルギー剤に関する。
【0002】
【従来の技術】チオトロポシンは、硫黄元素を含有する
7員環ヘテロ化合物であり、微生物の産生する様々な抗
生物質の中でも非常に珍しく、抗菌活性以外にも種々の
生物活性が期待できる物質である。従来より、チオトロ
ポシンを生産する微生物は、土壌細菌シュードモナス・
トロポスルフェニイ(Pseudomonas troposulfenii PB-5
020)(特開昭59-205994号公報)、シュードモナス属細菌
(Pseudomonas sp. CB-104) (K.Kintani,H.Ono, S.Tsub
otai, S.Harada, H.Okazaki: J.Antibiotics, 37, 1294
-1300(1984) およびS.Tsubotani, Y.Wada, K.Kamiya,
H.Okazaki, S.Harada: Tetrahedron Letters,25, 419-4
22(1984))が知られている。
7員環ヘテロ化合物であり、微生物の産生する様々な抗
生物質の中でも非常に珍しく、抗菌活性以外にも種々の
生物活性が期待できる物質である。従来より、チオトロ
ポシンを生産する微生物は、土壌細菌シュードモナス・
トロポスルフェニイ(Pseudomonas troposulfenii PB-5
020)(特開昭59-205994号公報)、シュードモナス属細菌
(Pseudomonas sp. CB-104) (K.Kintani,H.Ono, S.Tsub
otai, S.Harada, H.Okazaki: J.Antibiotics, 37, 1294
-1300(1984) およびS.Tsubotani, Y.Wada, K.Kamiya,
H.Okazaki, S.Harada: Tetrahedron Letters,25, 419-4
22(1984))が知られている。
【0003】しかし、その他の細菌、放線菌、かび等に
おいてチオトロポシンが生成されるか否かについては全
く知られておらず、また、抗菌活性以外のチオトロポシ
ンの生物活性についても全く知られていない。
おいてチオトロポシンが生成されるか否かについては全
く知られておらず、また、抗菌活性以外のチオトロポシ
ンの生物活性についても全く知られていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、カウロバク
ター(Caulobacter) 属に属し、チオトロポシン生産能
を有する微生物を用いたチオトロポシンの製造方法およ
びチオトロポシンの新規用途を提供することを目的とす
る。
ター(Caulobacter) 属に属し、チオトロポシン生産能
を有する微生物を用いたチオトロポシンの製造方法およ
びチオトロポシンの新規用途を提供することを目的とす
る。
【0005】
【課題を解決するための手段】発明者らは新たな微生物
資源として海洋微生物、なかでも未開拓な海産微細藻類
と共存する微生物に着目し、日本沿岸海域から多くの微
細藻類を分離し、さらにその微細藻類に共存する多数の
細菌を分離し、チオトロポシン生産能を有する新たな微
生物の探索・開発研究を鋭意重ねた。その結果、これら
微細藻類と共存する細菌の中からチオトロポシン生産能
を有する新規微生物を見出し、該微生物を培養すること
によりチオトロポシンを採取することに成功した。さら
に、該チオトロポシンの珍しい化学構造に着目し、チオ
トロポシンが新規な生物活性である魚病抗菌活性、抗微
細藻活性および抗アレルギー活性を有することを見出
し、本発明を完成するに至った。
資源として海洋微生物、なかでも未開拓な海産微細藻類
と共存する微生物に着目し、日本沿岸海域から多くの微
細藻類を分離し、さらにその微細藻類に共存する多数の
細菌を分離し、チオトロポシン生産能を有する新たな微
生物の探索・開発研究を鋭意重ねた。その結果、これら
微細藻類と共存する細菌の中からチオトロポシン生産能
を有する新規微生物を見出し、該微生物を培養すること
によりチオトロポシンを採取することに成功した。さら
に、該チオトロポシンの珍しい化学構造に着目し、チオ
トロポシンが新規な生物活性である魚病抗菌活性、抗微
細藻活性および抗アレルギー活性を有することを見出
し、本発明を完成するに至った。
【0006】すなわち、本発明は、カウロバクター属に
属し、チオトロポシン生産能を有する微生物を培地中で
培養し、得られる培養物からチオトロポシンを採取する
ことを特徴とするチオトロポシンの製造方法である。こ
こで、カウロバクター属に属するチオトロポシン生産能
を有する微生物としては、カウロバクター・エスピーP
K654菌株が挙げられる。
属し、チオトロポシン生産能を有する微生物を培地中で
培養し、得られる培養物からチオトロポシンを採取する
ことを特徴とするチオトロポシンの製造方法である。こ
こで、カウロバクター属に属するチオトロポシン生産能
を有する微生物としては、カウロバクター・エスピーP
K654菌株が挙げられる。
【0007】さらに、本発明は、チオトロポシン生産能
を有するカウロバクター・エスピーPK654菌株であ
る。さらに、本発明は、チオトロポシンを有効成分とし
て含む魚病抗菌剤、抗微細藻剤または抗アレルギー剤で
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
を有するカウロバクター・エスピーPK654菌株であ
る。さらに、本発明は、チオトロポシンを有効成分とし
て含む魚病抗菌剤、抗微細藻剤または抗アレルギー剤で
ある。以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】本発明のチオトロポシンは、カウロバクタ
ー(Caulobacter) 属に属する微生物を培地中で培養
し、得られる培養物から採取することにより得ることが
できる。本発明の製造方法に用いる微生物は、カウロバ
クター(Caulobacter) 属に属し、チオトロポシン生産
能を有する微生物であればいずれの菌株でもよいが、例
えば、本発明者らが天然界から分離したPK654菌株
を例示することができる。
ー(Caulobacter) 属に属する微生物を培地中で培養
し、得られる培養物から採取することにより得ることが
できる。本発明の製造方法に用いる微生物は、カウロバ
クター(Caulobacter) 属に属し、チオトロポシン生産
能を有する微生物であればいずれの菌株でもよいが、例
えば、本発明者らが天然界から分離したPK654菌株
を例示することができる。
【0009】PK654菌株は、本発明者らが大分県佐
伯市の沿岸海域の海水中から、微細藻類との共存細菌と
して分離した微生物である。チオトロポシン生産能を有
する海洋細菌PK654菌株の菌学的性質は下記の通り
である。
伯市の沿岸海域の海水中から、微細藻類との共存細菌と
して分離した微生物である。チオトロポシン生産能を有
する海洋細菌PK654菌株の菌学的性質は下記の通り
である。
【0010】1.形態的性質 (1) 細胞形態(図1参照) 桿菌 (2) グラム染色性 − (3) 柄(stalk)(図2参照) + 形成位置 極 本数 1 (4) 胞子 − (5) 運動性 + (6) 鞭毛(図3参照) 極単毛 2.生理的性質 (1) 酸素に対する態度 好気性 (2) オキシダーゼ + (3) カタラーゼ + (4) OFテスト − (5) NaCl要求性 NaCl無添加培地での生育 − 0.05%NaCl添加培地での生育 − 2%NaCl添加培地での生育 + 4%NaCl添加培地での生育 + (6) 硝酸塩の還元 − (7) デンプン分解 − (8) 水溶性色素の生成 +(黒茶色) (9) 炭素化合物の資化性 L−アラビノース − リボース + グルコース + ガラクトース + マンノース + ラクトース − L−プロリン + アセテート 微弱 ブチレート + ピルビン酸ナトリウム + カザミノ酸 + (10) キノン系 Q-10 3.菌体内DNAのGC含量(モル%) 58 4.分離源 大分県佐伯市沿岸の海水から分離した微細藻類と共存す
る細菌の中から海洋性細菌PK654菌株を選択・分離
した。
る細菌の中から海洋性細菌PK654菌株を選択・分離
した。
【0011】なお、上記形態的性質および生理学的性質
の試験は次の方法により行った。 (1) 細胞形態、胞子、グラム染色性、運動性、鞭毛、柄
(stalk) 等の形態的性質および酸素に対する態度、オキ
シダーゼ、カタラーゼ、水溶性色素の生成等の生理的性
質の試験は Marine Agar 2216 (Difco製) を用い、25℃
にて一定時間培養し、常法により行った(主として駒形
和男:微生物の分類と同定(下)、(改編版、長谷川武
治編著),学会出版センター,P.99-161(1985)を参考に
した)。
の試験は次の方法により行った。 (1) 細胞形態、胞子、グラム染色性、運動性、鞭毛、柄
(stalk) 等の形態的性質および酸素に対する態度、オキ
シダーゼ、カタラーゼ、水溶性色素の生成等の生理的性
質の試験は Marine Agar 2216 (Difco製) を用い、25℃
にて一定時間培養し、常法により行った(主として駒形
和男:微生物の分類と同定(下)、(改編版、長谷川武
治編著),学会出版センター,P.99-161(1985)を参考に
した)。
【0012】(2) OF試験はMOF(E.Leifson: J.Bact
eriol., 85, 1183(1963)) に準じて試験した。 (3) NaCl要求性は J.S.Poindexter: Bacteriol. Rev.,
28, 231(1964) に準じて試験した。但し、培地はHutne
r's mineral base(Coen-Bazire G.,W.R.Sistrom, R.Y.S
tanier: J.Cell. Comp. Physiol., 49, 25(1957)) 20ml
を添加したものを用いた。
eriol., 85, 1183(1963)) に準じて試験した。 (3) NaCl要求性は J.S.Poindexter: Bacteriol. Rev.,
28, 231(1964) に準じて試験した。但し、培地はHutne
r's mineral base(Coen-Bazire G.,W.R.Sistrom, R.Y.S
tanier: J.Cell. Comp. Physiol., 49, 25(1957)) 20ml
を添加したものを用いた。
【0013】(4) 硝酸塩還元は J.S.Poindexter: Bacte
riol. Rev., 28, 231(1964) に準じて試験した。但し、
培地は Hutner's mineral base 20mlを添加したものを
用いた。 (5) デンプンの分解は、被検菌を1%可溶性デンプンを
添加したMarine Agar2216(Difco製) 平板培地に画線し
て25℃、5〜7日間培養し、ルゴール液を平板全面に注
ぎ、菌苔の真下または周辺に透明帯を生じたものを陽性
と判定した。
riol. Rev., 28, 231(1964) に準じて試験した。但し、
培地は Hutner's mineral base 20mlを添加したものを
用いた。 (5) デンプンの分解は、被検菌を1%可溶性デンプンを
添加したMarine Agar2216(Difco製) 平板培地に画線し
て25℃、5〜7日間培養し、ルゴール液を平板全面に注
ぎ、菌苔の真下または周辺に透明帯を生じたものを陽性
と判定した。
【0014】(6) 炭素化合物の資化性は J.S.Poindexte
r: Bacteriol. Rev., 28, 231(1964) に準じて下記の改
変培地を用いて行った。資化性試験培地 Peptone(Difco) 0.05g Yeast extract 0.05g Agar 10.0 g Hutner's mineral base * 20ml 100 %人工海水 980ml pH無調整(8.2) 培養条件:25℃, 14日間* Hutner's mineral baseの組成 Nitrilotriacetic acid 10.0 g MgSO4・7H2O 14.45g CaCl2・2H2O 3.335g (NH4)6Mo7O24・4H2O 9.25mg FeSO4・7H2O 99.0mg Metals "44" 50.0ml (7) キノン系および菌体内DNAのGC含量 藪内英子他:新しい分類学に伴走する細菌同定法(1987
年)(菜根出版)に準じて試験した。
r: Bacteriol. Rev., 28, 231(1964) に準じて下記の改
変培地を用いて行った。資化性試験培地 Peptone(Difco) 0.05g Yeast extract 0.05g Agar 10.0 g Hutner's mineral base * 20ml 100 %人工海水 980ml pH無調整(8.2) 培養条件:25℃, 14日間* Hutner's mineral baseの組成 Nitrilotriacetic acid 10.0 g MgSO4・7H2O 14.45g CaCl2・2H2O 3.335g (NH4)6Mo7O24・4H2O 9.25mg FeSO4・7H2O 99.0mg Metals "44" 50.0ml (7) キノン系および菌体内DNAのGC含量 藪内英子他:新しい分類学に伴走する細菌同定法(1987
年)(菜根出版)に準じて試験した。
【0015】以上の菌学的性質を Bergey's Manual of
Systematic Bacteriology, Vol.1(N.R.Kieg, J.G. Holt
編, Willams & Wilkins, Baltimor(1984))およびBerge
y'sManual of Determinative Bacteriology(第9版,
J.G.Holt, N.R. Kieg, P.H.A. Sneath, J.T.Staley, S.
T. Williams 編, Williams & Wilkins, Baltimor(199
4))と対比した結果、本海洋細菌PK654菌株はカウ
ロバクター(Caulobacter) 属に属する細菌と同定され
た。さらにカウロバクター (Caulobacter)属細菌の種
に至る同定を試みた。その結果、海洋細菌PK654菌
株は、NaCl要求性および4%NaCl耐性からはカウロバク
ター・マリス(Caulobacter maris) に近いが、糖およ
びアミノ酸、ブチレート、ピルビン酸ナトリウムの資化
性、色素の生成等が異なり、また菌体内DNAのGC含
量は58モル%とカウロバクター(Caulobacter) 属の62
〜67モル%の値より小さいことなどから、本PK654
菌株はカウロバクター属細菌の新しい種であると考え、
カウロバクター・エスピー(Caulobacter sp.) PK6
54とした。
Systematic Bacteriology, Vol.1(N.R.Kieg, J.G. Holt
編, Willams & Wilkins, Baltimor(1984))およびBerge
y'sManual of Determinative Bacteriology(第9版,
J.G.Holt, N.R. Kieg, P.H.A. Sneath, J.T.Staley, S.
T. Williams 編, Williams & Wilkins, Baltimor(199
4))と対比した結果、本海洋細菌PK654菌株はカウ
ロバクター(Caulobacter) 属に属する細菌と同定され
た。さらにカウロバクター (Caulobacter)属細菌の種
に至る同定を試みた。その結果、海洋細菌PK654菌
株は、NaCl要求性および4%NaCl耐性からはカウロバク
ター・マリス(Caulobacter maris) に近いが、糖およ
びアミノ酸、ブチレート、ピルビン酸ナトリウムの資化
性、色素の生成等が異なり、また菌体内DNAのGC含
量は58モル%とカウロバクター(Caulobacter) 属の62
〜67モル%の値より小さいことなどから、本PK654
菌株はカウロバクター属細菌の新しい種であると考え、
カウロバクター・エスピー(Caulobacter sp.) PK6
54とした。
【0016】なお、この海洋細菌カウロバクター・エス
ピー(Caulobacter sp.) PK654菌株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5080 (平
成7年4月19日)として寄託されている。また、本発明
のチオトロポシンの製造法に用いる微生物は前記カウロ
バクター・エスピーPK654菌株(FERM BP-5080)に
限らず、カウロバクター(Caulobacter) 属に属し、生
物活性物質チオトロポシンを生産する能力を有するもの
であれば、すべて本発明に使用できる。
ピー(Caulobacter sp.) PK654菌株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5080 (平
成7年4月19日)として寄託されている。また、本発明
のチオトロポシンの製造法に用いる微生物は前記カウロ
バクター・エスピーPK654菌株(FERM BP-5080)に
限らず、カウロバクター(Caulobacter) 属に属し、生
物活性物質チオトロポシンを生産する能力を有するもの
であれば、すべて本発明に使用できる。
【0017】上記微生物の培養方法は、原則的には微生
物の培養法に準じて行うことができる。培養に用いられ
る培地としては、カウロバクター属に属する微生物が利
用できる栄養源を含有する培地であれば良く、各種の合
成培地、半合成培地および天然培地などいずれも用いる
ことができる。培養に用いられる培地としては、まず公
知のものがいずれも使用できる。例えば、炭素源として
グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、ピ
ルビン酸塩、ペプトン、カザミノ酸、有機酸等を単独ま
たは組み合わせて用いることができる。窒素源として
は、イーストエキス、ペプトン、肉エキス、カゼイン、
酵母エキス、アミノ酸溶液、尿素等の有機窒素源または
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム
等の無機窒素源を単独または組み合わせて用いることが
できる。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カ
リウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜組み
合わせて使用できる。上記培地の pHは7.4〜7.6の範
囲が好ましいが、中性付近であれば良い。微生物の培養
温度は10〜35℃、好ましくは15〜25℃にて5〜7日間、
通気攪拌、振とう培養または静置培養で行われる。上記
培養によって目的とするチオトロポシンが生成蓄積され
る。上記の各種の培養条件は、使用する微生物の種類や
特性、外部の条件などに応じて適宜変更でき、またそれ
ぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択し、調節され
る。
物の培養法に準じて行うことができる。培養に用いられ
る培地としては、カウロバクター属に属する微生物が利
用できる栄養源を含有する培地であれば良く、各種の合
成培地、半合成培地および天然培地などいずれも用いる
ことができる。培養に用いられる培地としては、まず公
知のものがいずれも使用できる。例えば、炭素源として
グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、ピ
ルビン酸塩、ペプトン、カザミノ酸、有機酸等を単独ま
たは組み合わせて用いることができる。窒素源として
は、イーストエキス、ペプトン、肉エキス、カゼイン、
酵母エキス、アミノ酸溶液、尿素等の有機窒素源または
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム
等の無機窒素源を単独または組み合わせて用いることが
できる。無機塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カ
リウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム等を適宜組み
合わせて使用できる。上記培地の pHは7.4〜7.6の範
囲が好ましいが、中性付近であれば良い。微生物の培養
温度は10〜35℃、好ましくは15〜25℃にて5〜7日間、
通気攪拌、振とう培養または静置培養で行われる。上記
培養によって目的とするチオトロポシンが生成蓄積され
る。上記の各種の培養条件は、使用する微生物の種類や
特性、外部の条件などに応じて適宜変更でき、またそれ
ぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択し、調節され
る。
【0018】上記培養によって生産されるチオトロポシ
ンの単離は、当該物質の蓄積が最大になる時に、発酵生
産物を採取する一般的な方法に準じて、チオトロポシン
と他の不純物との溶解度の差、吸着親和力の差、分子量
の差などを利用する手段のいずれも使用でき、それぞれ
の方法を単独または適宜組み合わせて、場合によっては
反復使用することによって行うことができる。
ンの単離は、当該物質の蓄積が最大になる時に、発酵生
産物を採取する一般的な方法に準じて、チオトロポシン
と他の不純物との溶解度の差、吸着親和力の差、分子量
の差などを利用する手段のいずれも使用でき、それぞれ
の方法を単独または適宜組み合わせて、場合によっては
反復使用することによって行うことができる。
【0019】例えば、培養によって得られた培養物から
培養液と菌体を分離する方法としては、従来から行われ
ている遠心分離や濾過等の方法が使用できるが、遠心分
離が好適である。遠心分離で得られた培養液をガラスフ
ィルターで濾過後、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー等を適宜組み合わせて分離を繰り返し行い、メ
タノール等の有機溶媒から再結することによって、チオ
トロポシンを単離することができる。
培養液と菌体を分離する方法としては、従来から行われ
ている遠心分離や濾過等の方法が使用できるが、遠心分
離が好適である。遠心分離で得られた培養液をガラスフ
ィルターで濾過後、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー等を適宜組み合わせて分離を繰り返し行い、メ
タノール等の有機溶媒から再結することによって、チオ
トロポシンを単離することができる。
【0020】また、物質の溶解度に基づく分離法、すな
わち物質の pHによる溶解度の差を利用して有機溶媒で
抽出する方法も好適である。遠心分離した培養液を酸に
て酸性にし、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する。こ
の抽出液を塩基性の緩衝液で抽出を行った後、この塩基
性抽出液を再び酸にて酸性にしてクロロホルム等の有機
溶媒で抽出する。その抽出液を減圧下で濃縮乾固すると
チオトロポシンの粗結晶が得られる。前記と同様さらに
メタノール等の有機溶媒から再結すれば精製されたチオ
トロポシンが得られる。
わち物質の pHによる溶解度の差を利用して有機溶媒で
抽出する方法も好適である。遠心分離した培養液を酸に
て酸性にし、クロロホルム等の有機溶媒で抽出する。こ
の抽出液を塩基性の緩衝液で抽出を行った後、この塩基
性抽出液を再び酸にて酸性にしてクロロホルム等の有機
溶媒で抽出する。その抽出液を減圧下で濃縮乾固すると
チオトロポシンの粗結晶が得られる。前記と同様さらに
メタノール等の有機溶媒から再結すれば精製されたチオ
トロポシンが得られる。
【0021】一般に、チオトロポシンの生物活性につい
てはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母、糸状菌類
に抗菌活性を示すことが知られている(前記 J.Antibio
ics,37, 1294-1300,(1984)および特開昭59-205994号公
報) 。しかしそれ以外の生物活性については全く知られ
ていない。本発明者らは、チオトロポシンの珍しい化学
構造に着目し、上記以外のチオトロポシンの新しい生理
活性について鋭意検討した結果、表1、表2および図4
に示したように魚病抗菌活性、抗微細藻活性および抗ア
レルギー活性等を有することを見出した。
てはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母、糸状菌類
に抗菌活性を示すことが知られている(前記 J.Antibio
ics,37, 1294-1300,(1984)および特開昭59-205994号公
報) 。しかしそれ以外の生物活性については全く知られ
ていない。本発明者らは、チオトロポシンの珍しい化学
構造に着目し、上記以外のチオトロポシンの新しい生理
活性について鋭意検討した結果、表1、表2および図4
に示したように魚病抗菌活性、抗微細藻活性および抗ア
レルギー活性等を有することを見出した。
【0022】魚病抗菌活性、抗微細藻活性については、
被検菌として例えばスタフィロコッカス・オーレウス
(Staphylococcus aureus)、エシェリヒア・コリ(Esche
richiacoli)、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudo
monas aeruginosa)等の他、ハマチやウナギ等の魚類病
原性細菌(エンテロコッカス・セエリオリイシイダ(En
terococcus seriolicida))、赤潮形成微細藻類である珪
藻(Skeletonema costatum )、ラフィド藻(Heterosigma
akashiho) 、渦鞭毛藻(Gymnodinium nagasakiense)
などを用い、これらの微生物に対し、チオトロポシンの
最小発育阻止濃度(MIC)を測定することにより調べ
ることができる。MICの測定は公知方法を使用すれば
よい。
被検菌として例えばスタフィロコッカス・オーレウス
(Staphylococcus aureus)、エシェリヒア・コリ(Esche
richiacoli)、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudo
monas aeruginosa)等の他、ハマチやウナギ等の魚類病
原性細菌(エンテロコッカス・セエリオリイシイダ(En
terococcus seriolicida))、赤潮形成微細藻類である珪
藻(Skeletonema costatum )、ラフィド藻(Heterosigma
akashiho) 、渦鞭毛藻(Gymnodinium nagasakiense)
などを用い、これらの微生物に対し、チオトロポシンの
最小発育阻止濃度(MIC)を測定することにより調べ
ることができる。MICの測定は公知方法を使用すれば
よい。
【0023】また、チオトロポシンの抗アレルギー活性
については、肥満細胞脱顆粒阻害活性を測定することに
より調べることができる。すなわち、IgE感作肥満細
胞懸濁液に被検液を加えインキュベートした後、さらに
脱顆粒誘発剤を添加し、試料溶液中に含まれるヒスタミ
ン量を定量し、これをヒスタミン遊離阻害率に換算する
ことにより求めることができる。
については、肥満細胞脱顆粒阻害活性を測定することに
より調べることができる。すなわち、IgE感作肥満細
胞懸濁液に被検液を加えインキュベートした後、さらに
脱顆粒誘発剤を添加し、試料溶液中に含まれるヒスタミ
ン量を定量し、これをヒスタミン遊離阻害率に換算する
ことにより求めることができる。
【0024】チオトロポシンを魚病抗菌剤として投与す
る場合は、各種魚病菌による疾病を予防または治療し、
斃死率の低下を目的とすることができる。例えば、養殖
ハマチ、ブリおよびうなぎなどの病原菌ストレプトコッ
カス(Streptococcus)属細菌やエンテロコッカス・セ
エリオリイシイダ(Enterococcus seriolicida)に起因
する連鎖球菌症(楠田理一,川合研児,豊嶋利雄,小松
功:日水誌,42,1345-1352 (1976), R.Kusuda, K.Kawa
i, F.Salati, C.R.Banner, J.L.Fryer: Int. J. Syst.
Bacteriol.,41,406-409 (1991))などを適用の対象とす
ることができる。
る場合は、各種魚病菌による疾病を予防または治療し、
斃死率の低下を目的とすることができる。例えば、養殖
ハマチ、ブリおよびうなぎなどの病原菌ストレプトコッ
カス(Streptococcus)属細菌やエンテロコッカス・セ
エリオリイシイダ(Enterococcus seriolicida)に起因
する連鎖球菌症(楠田理一,川合研児,豊嶋利雄,小松
功:日水誌,42,1345-1352 (1976), R.Kusuda, K.Kawa
i, F.Salati, C.R.Banner, J.L.Fryer: Int. J. Syst.
Bacteriol.,41,406-409 (1991))などを適用の対象とす
ることができる。
【0025】また、投与する方法は、製剤基材の乳糖な
どにチオトロポシンを5〜10%含有させ、粉末または顆
粒状とし、これらの製剤を0.1〜0.5 g/魚体重kg/日を配
合飼料、練餌等の飼料に均一に混合して通常5〜7日間
投与する。チオトロポシンを抗微細藻剤として使用する
場合は、チオトロポシンをそのまま直接使用してもよい
が、一般には、適当な液体担体に溶解若しくは分散さ
せ、または適当な粉末担体と混合若しくは吸着させ、所
要の場合はさらにこれらに乳化剤、分散剤、安定剤、懸
濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添加し、
乳剤、油剤、水和剤、粉剤などの製剤として使用され
る。
どにチオトロポシンを5〜10%含有させ、粉末または顆
粒状とし、これらの製剤を0.1〜0.5 g/魚体重kg/日を配
合飼料、練餌等の飼料に均一に混合して通常5〜7日間
投与する。チオトロポシンを抗微細藻剤として使用する
場合は、チオトロポシンをそのまま直接使用してもよい
が、一般には、適当な液体担体に溶解若しくは分散さ
せ、または適当な粉末担体と混合若しくは吸着させ、所
要の場合はさらにこれらに乳化剤、分散剤、安定剤、懸
濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添加し、
乳剤、油剤、水和剤、粉剤などの製剤として使用され
る。
【0026】有効成分の濃度は、一般に乳剤、水和剤、
油剤では0.01〜10%が適当であり、また、粒剤、粉剤で
は0.1〜10%が適当であるが、使用目的によってこれら
の濃度は適宜調節してよい。製剤に使用する液体担体と
しては、例えば、通常は水がベースとして用いられる
が、メタノール、エタノールのようなアルコール類、ア
セトン、メチルエチルケトンのようなケトン類、ジオキ
サン、エチレングリコールのようなエーテル類、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ソルベントナフサ、メチルナ
フタレンのような芳香族炭化水素類、ジメチルホルムア
ミドのような酸アミド類などの溶媒も用いることがで
き、これらの1種または2種以上を混合して使用する。
油剤では0.01〜10%が適当であり、また、粒剤、粉剤で
は0.1〜10%が適当であるが、使用目的によってこれら
の濃度は適宜調節してよい。製剤に使用する液体担体と
しては、例えば、通常は水がベースとして用いられる
が、メタノール、エタノールのようなアルコール類、ア
セトン、メチルエチルケトンのようなケトン類、ジオキ
サン、エチレングリコールのようなエーテル類、ベンゼ
ン、トルエン、キシレン、ソルベントナフサ、メチルナ
フタレンのような芳香族炭化水素類、ジメチルホルムア
ミドのような酸アミド類などの溶媒も用いることがで
き、これらの1種または2種以上を混合して使用する。
【0027】また、粉末担体としては、タルク、カオリ
ン、ベントナイト、ゼオライト、消石灰、珪藻土、酸性
白土のような鉱物質粉末、さらにアルミナ、シリカゲル
なども用いられ、これらの1種または2種以上を混合し
て使用する。展着剤、乳化剤、浸透剤、分散剤、可溶化
剤などとして使用される界面活性剤としては、例えば高
級アルコールの硫酸エステル、アルキレンオキシド系界
面活性剤などが用いられる。
ン、ベントナイト、ゼオライト、消石灰、珪藻土、酸性
白土のような鉱物質粉末、さらにアルミナ、シリカゲル
なども用いられ、これらの1種または2種以上を混合し
て使用する。展着剤、乳化剤、浸透剤、分散剤、可溶化
剤などとして使用される界面活性剤としては、例えば高
級アルコールの硫酸エステル、アルキレンオキシド系界
面活性剤などが用いられる。
【0028】チオトロポシンを抗アレルギー剤として投
与する場合は、投与する対象を特に限定しない。例え
ば、各アレルギー疾患(例えば、気管支喘息、アレルギ
ー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎
等)を予防または治療することを目的として用いること
ができる。また、投与する方法は経口または非経口でも
よく、経口投与には舌下投与を含む。非経口投与には、
注射(例えば静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴
等)、坐剤、クリーム剤、パップ剤等を含む。また、そ
の投与量は、動物かヒトかによって、さらに年齢、投与
経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることがで
きる。この場合、チオトロポシンの有効量と適切な希釈
剤および薬理学的に使用し得る担体の組成物として投与
される有効量は0.1μg〜50mg/day/kg であり、1日1回
から数回に分けて投与される。
与する場合は、投与する対象を特に限定しない。例え
ば、各アレルギー疾患(例えば、気管支喘息、アレルギ
ー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎
等)を予防または治療することを目的として用いること
ができる。また、投与する方法は経口または非経口でも
よく、経口投与には舌下投与を含む。非経口投与には、
注射(例えば静脈注射、皮下注射、筋肉注射、点滴
等)、坐剤、クリーム剤、パップ剤等を含む。また、そ
の投与量は、動物かヒトかによって、さらに年齢、投与
経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることがで
きる。この場合、チオトロポシンの有効量と適切な希釈
剤および薬理学的に使用し得る担体の組成物として投与
される有効量は0.1μg〜50mg/day/kg であり、1日1回
から数回に分けて投与される。
【0029】本発明の抗アレルギー剤を経口投与する場
合、それに適用される錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カ
プセル剤等は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使
用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿
潤剤のような添加剤を含有する。また、経口用液体製剤
としては、内用水剤、懸濁剤、乳剤シロップ剤等いずれ
の状態であってもよく、また、使用する際に再溶解させ
る乾燥生成物であってもよい。さらに、その組成物は、
添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。
合、それに適用される錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カ
プセル剤等は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使
用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿
潤剤のような添加剤を含有する。また、経口用液体製剤
としては、内用水剤、懸濁剤、乳剤シロップ剤等いずれ
の状態であってもよく、また、使用する際に再溶解させ
る乾燥生成物であってもよい。さらに、その組成物は、
添加剤、保存剤のいずれを含有してもよい。
【0030】本発明の抗アレルギー剤を非経口投与する
場合、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を
含有し、通常、単位投与量アンプル若しくは多投与量容
器またはチューブの状態で提供される。上記組成物は、
使用する際に適当な担体、例えば発熱不含の滅菌水で再
溶解させる粉体であってもよい。
場合、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を
含有し、通常、単位投与量アンプル若しくは多投与量容
器またはチューブの状態で提供される。上記組成物は、
使用する際に適当な担体、例えば発熱不含の滅菌水で再
溶解させる粉体であってもよい。
【0031】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例1〕チオトロポシンの製造(1) カウロバクター・エスピーPK654菌株の斜面培養培
地(Marine Agar 2216,Difco製) から Marine Broth (Di
fco製) 3.74%、グルコース1%、蒸留水の組成よりな
る培地(pH7.4) 20ml を含むL字型試験管(外径18mm,
長さ180mm,高さ95mm) に1白金耳接種し、毎分45回転
で、20℃、5日間振とう培養して種培養液を得た。この
種培養液0.1mlを上記の培地 100mlを含む 500ml容三角
フラスコに接種し、20℃で5〜7日間培養を行った。
る。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。 〔実施例1〕チオトロポシンの製造(1) カウロバクター・エスピーPK654菌株の斜面培養培
地(Marine Agar 2216,Difco製) から Marine Broth (Di
fco製) 3.74%、グルコース1%、蒸留水の組成よりな
る培地(pH7.4) 20ml を含むL字型試験管(外径18mm,
長さ180mm,高さ95mm) に1白金耳接種し、毎分45回転
で、20℃、5日間振とう培養して種培養液を得た。この
種培養液0.1mlを上記の培地 100mlを含む 500ml容三角
フラスコに接種し、20℃で5〜7日間培養を行った。
【0032】上記の方法により培養したフラスコの培養
液52Lを集め、それを4℃、8000rpm で遠心分離を行
い、この培養液上澄みをWhatman GF/C(孔径0.45m,直
径4.7cm)で濾過後、濾液を Sephadex LH-20(充填剤 5
00g,ファルマシア製)によるカラムクロマトグラフィ
ーに付し、蒸留水で溶出後、黒褐色の溶出液部分を分画
した。さらにこの溶出液を1N-HCl 水溶液で pH2に調
整した後、上記と同様に Sephadex LH-20(充填剤 500
g,ファルマシア製)によるカラムクロマトグラフィー
を行い、黄色の溶出液部分54Lを得た。黄色の溶出液は
セップパック・バックC18(充填剤 5g,ウォーターズ
製)に付し、メタノールで溶出後、減圧下濃縮乾固する
ことにより、赤色析出物0.42gを得た。再度、この析出
物を蒸留水で溶解、 pH2に調整した後、 Sephadex LH
-20 (200g,ファルマシア製)およびセップパック・バ
ックC18(充填剤 5g,ウォーターズ製)を行い、さら
にメタノールによる再結晶化を行うことにより、黄色針
状結晶 351mgを単離した。
液52Lを集め、それを4℃、8000rpm で遠心分離を行
い、この培養液上澄みをWhatman GF/C(孔径0.45m,直
径4.7cm)で濾過後、濾液を Sephadex LH-20(充填剤 5
00g,ファルマシア製)によるカラムクロマトグラフィ
ーに付し、蒸留水で溶出後、黒褐色の溶出液部分を分画
した。さらにこの溶出液を1N-HCl 水溶液で pH2に調
整した後、上記と同様に Sephadex LH-20(充填剤 500
g,ファルマシア製)によるカラムクロマトグラフィー
を行い、黄色の溶出液部分54Lを得た。黄色の溶出液は
セップパック・バックC18(充填剤 5g,ウォーターズ
製)に付し、メタノールで溶出後、減圧下濃縮乾固する
ことにより、赤色析出物0.42gを得た。再度、この析出
物を蒸留水で溶解、 pH2に調整した後、 Sephadex LH
-20 (200g,ファルマシア製)およびセップパック・バ
ックC18(充填剤 5g,ウォーターズ製)を行い、さら
にメタノールによる再結晶化を行うことにより、黄色針
状結晶 351mgを単離した。
【0033】〔実施例2〕チオトロポシンの製造(2) 実施例1と同様に遠心分離で得られた培養上澄20Lを酢
酸エチル10Lで分配し、水相部分を1N-HCl 水溶液で p
H2に調整後、酢酸エチルで抽出した。さらに酢酸エチ
ル抽出液を2%炭酸ナトリウム水溶液で分配した後、水
相部分を再度1N-HCl 水溶液で pH2に調整、酢酸エチ
ルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を無水硫酸ナトリ
ウムで脱水し、減圧下濃縮乾固後、メタノールから再結
することにより、黄色針状結晶 112mgを得た。
酸エチル10Lで分配し、水相部分を1N-HCl 水溶液で p
H2に調整後、酢酸エチルで抽出した。さらに酢酸エチ
ル抽出液を2%炭酸ナトリウム水溶液で分配した後、水
相部分を再度1N-HCl 水溶液で pH2に調整、酢酸エチ
ルで抽出した。この酢酸エチル抽出液を無水硫酸ナトリ
ウムで脱水し、減圧下濃縮乾固後、メタノールから再結
することにより、黄色針状結晶 112mgを得た。
【0034】以上のようにして得られた黄色針状結晶の
物理化学的性質を以下に示す。 マススペクトル(m/z):212[M]+, 184[M-CO]+, 168[M-
CO2], 140[M-CO2-CO]+,96[M-CO2-CO-CS]+ 元素分析:C, 45.33 ; H, 1.96 ; O, 22.64 ; S,
30.02 融 点:222〜224℃ 紫外吸収スペクトル:λ(MeOH)216(ε25400), 245(11
300), 307(16300),356(6200), 452(2100)nm 赤外吸収スペクトル:IR(KBr)3061, 2926, 2857, 163
3, 1597, 1537, 1460,1373, 1313, 1242, 1109, 1072,
1014, 889, 827, 692, 652, 578,470cm-1 1HNMR核磁気共鳴スペクトル(270MHz, 外部標準 TMS,
溶媒CHCl3) : δ7.12(1H, d, 9Hz), 7.44(1H, d, 12H
z), 7.45(1H, dd, 9, 12), 16.7(1H, s)ppm13 CNMR核磁気共鳴スペクトル(67.5MHz, 外部標準 TM
S, 溶媒 DMSO):δ182.5,170.6, 167.7, 150.1, 137.6,
137.5, 133.7, 120.0ppm 呈色反応:2%塩化第二鉄およびヨウ素−アジド化物
反応試験で陽性を示す。
物理化学的性質を以下に示す。 マススペクトル(m/z):212[M]+, 184[M-CO]+, 168[M-
CO2], 140[M-CO2-CO]+,96[M-CO2-CO-CS]+ 元素分析:C, 45.33 ; H, 1.96 ; O, 22.64 ; S,
30.02 融 点:222〜224℃ 紫外吸収スペクトル:λ(MeOH)216(ε25400), 245(11
300), 307(16300),356(6200), 452(2100)nm 赤外吸収スペクトル:IR(KBr)3061, 2926, 2857, 163
3, 1597, 1537, 1460,1373, 1313, 1242, 1109, 1072,
1014, 889, 827, 692, 652, 578,470cm-1 1HNMR核磁気共鳴スペクトル(270MHz, 外部標準 TMS,
溶媒CHCl3) : δ7.12(1H, d, 9Hz), 7.44(1H, d, 12H
z), 7.45(1H, dd, 9, 12), 16.7(1H, s)ppm13 CNMR核磁気共鳴スペクトル(67.5MHz, 外部標準 TM
S, 溶媒 DMSO):δ182.5,170.6, 167.7, 150.1, 137.6,
137.5, 133.7, 120.0ppm 呈色反応:2%塩化第二鉄およびヨウ素−アジド化物
反応試験で陽性を示す。
【0035】以上の理化学的性質から構造式を決定した
結果、シュードモナス属細菌の産生するチオトロポシン
と一致した(S.Tsubotani, Y.Wada, K.Kamiya, H.Okaza
ki,S.Harada:Tetrahedron Letters, 25, 419-422(198
4) ) 。以上の結果から、カウロバクター・エスピーP
K654菌株の生産する実施例1および2の黄色針状結
晶はチオトロポシンと同定された。
結果、シュードモナス属細菌の産生するチオトロポシン
と一致した(S.Tsubotani, Y.Wada, K.Kamiya, H.Okaza
ki,S.Harada:Tetrahedron Letters, 25, 419-422(198
4) ) 。以上の結果から、カウロバクター・エスピーP
K654菌株の生産する実施例1および2の黄色針状結
晶はチオトロポシンと同定された。
【0036】〔実施例3〕魚病抗菌活性 最小発育阻止濃度(MIC)の測定は、日本化学療法学
会の Chemotherapy,29, 76-79(1981) に準じて行った。
被検菌スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcu
s aureus)IFO 12732 、エシェリヒア・コリ(Escheric
hia coli) IFO14237、シュードモナス・エルギノーザ
(Pseudomonas aeruginosa)IFO 12582の培養は Muller
-Hinton Broth(Difco製)に、1.7%の寒天を加えた培
地(pH6.0)、またエンテロコッカス・セエリオリイシイ
ダ(Enterococcus seriolicida;YT-3株:ATCC 49456と
同一株)は Brain Heart Infusion Broth (Difco製)
に、1.5%の寒天を加えた培地(pH 6.0) をそれぞれ用
いた。
会の Chemotherapy,29, 76-79(1981) に準じて行った。
被検菌スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcu
s aureus)IFO 12732 、エシェリヒア・コリ(Escheric
hia coli) IFO14237、シュードモナス・エルギノーザ
(Pseudomonas aeruginosa)IFO 12582の培養は Muller
-Hinton Broth(Difco製)に、1.7%の寒天を加えた培
地(pH6.0)、またエンテロコッカス・セエリオリイシイ
ダ(Enterococcus seriolicida;YT-3株:ATCC 49456と
同一株)は Brain Heart Infusion Broth (Difco製)
に、1.5%の寒天を加えた培地(pH 6.0) をそれぞれ用
いた。
【0037】チオトロポシン濃度の調製は次のようにし
て行った。チオトロポシン 5.0mgをジメチルスルオキシ
ド(Dimethylsulfoxide)6mlに溶解した後、ディメック
ス25(孔径0.2μm,直径25mm,ミリポア製)のメンブ
レンフィルターでろ過滅菌した後、滅菌蒸留水5mlを加
えたものを薬剤原液とし、さらにそれを滅菌蒸留水にて
2倍希釈法により薬剤希釈液を調製した。
て行った。チオトロポシン 5.0mgをジメチルスルオキシ
ド(Dimethylsulfoxide)6mlに溶解した後、ディメック
ス25(孔径0.2μm,直径25mm,ミリポア製)のメンブ
レンフィルターでろ過滅菌した後、滅菌蒸留水5mlを加
えたものを薬剤原液とし、さらにそれを滅菌蒸留水にて
2倍希釈法により薬剤希釈液を調製した。
【0038】MICの判定はスタフィロコッカス・オー
レウス(Staphylococcus aureus)IFO12732、エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli) IFO 14237、シュード
モナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) IFO
12582では培養温度37℃、18時間後に、またエンテロコ
ッカス・セエリオリイシイダ(Enterococcus seriolici
da)YT-3株(ATCC 49456)では培養温度25℃、3日後に行
った。
レウス(Staphylococcus aureus)IFO12732、エシェリ
ヒア・コリ(Escherichia coli) IFO 14237、シュード
モナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa) IFO
12582では培養温度37℃、18時間後に、またエンテロコ
ッカス・セエリオリイシイダ(Enterococcus seriolici
da)YT-3株(ATCC 49456)では培養温度25℃、3日後に行
った。
【0039】上記の方法でチオトロポシンの抗菌活性を
調べた結果を表1に示した。表1に示したように、チオ
トロポシンは強い抗菌活性を示した。これらの中でチオ
トロポシンの新しい生物活性として魚類病原性細菌エン
テロコッカス・セエリオリイシイダ(Enterococcus ser
iolicida; YT-3株:ATCC 49456と同一株)に強い抗菌
活性を有することを初めて見出した。
調べた結果を表1に示した。表1に示したように、チオ
トロポシンは強い抗菌活性を示した。これらの中でチオ
トロポシンの新しい生物活性として魚類病原性細菌エン
テロコッカス・セエリオリイシイダ(Enterococcus ser
iolicida; YT-3株:ATCC 49456と同一株)に強い抗菌
活性を有することを初めて見出した。
【0040】
【表1】
【0041】〔実施例4〕抗微細藻活性 被検微細藻類(表2参照)の接種量は微細藻類培地中に
30cells/mlになるように調製した。微細藻類の培地は f
/2培地(R.R.L.Guillard and J.H.Ryther: Can.J.Micro
biol.,8, 229-239(1962))を使用し、チオトロポシン 1
00μg/ml培地の薬剤濃度を上限濃度として10倍希釈で5
段階の薬剤濃度の f/2培地を調製した。MICの判定は
20℃、12時間明−12時間暗で7日間培養後に行った。判
定には微細藻類の増殖を蛍光光度計(サイトフロー2300
蛍光光度計,日本パーセプティブ・リミテッド製)を使
用し、励起波長は460nm で、微細藻類のクロロフィルa
に基づく波長 645nm の蛍光強度を測定して行った。
30cells/mlになるように調製した。微細藻類の培地は f
/2培地(R.R.L.Guillard and J.H.Ryther: Can.J.Micro
biol.,8, 229-239(1962))を使用し、チオトロポシン 1
00μg/ml培地の薬剤濃度を上限濃度として10倍希釈で5
段階の薬剤濃度の f/2培地を調製した。MICの判定は
20℃、12時間明−12時間暗で7日間培養後に行った。判
定には微細藻類の増殖を蛍光光度計(サイトフロー2300
蛍光光度計,日本パーセプティブ・リミテッド製)を使
用し、励起波長は460nm で、微細藻類のクロロフィルa
に基づく波長 645nm の蛍光強度を測定して行った。
【0042】上記の方法でチオトロポシンの抗微細藻活
性を調べた結果を表2に示した。表2に示したように、
チオトロポシンの新しい生物活性として抗微細藻活性を
見出した。
性を調べた結果を表2に示した。表2に示したように、
チオトロポシンの新しい生物活性として抗微細藻活性を
見出した。
【0043】
【表2】
【0044】〔実施例5〕抗アレルギー活性 ラット腹腔肥満細胞の調製は、中込らの方法(Nakagomi
et al.:J.Antibiotics, 43, 5, 462-469(1990)) に準じ
て行った。ウイスター系ラット腹腔内に、Tyrode液20ml
を注入し、ピペットで腹水を取り出した。採取した腹水
は4℃、100×g、12分間遠心分離し、沈殿する細胞を
集めた。この細胞をTyrode液2mlに懸濁させ、比重1.06
8 に調製した牛血清アルブミン(BSA)生理食塩水4
mlに重層し、4℃、100×g、12分間遠心分離後、沈殿
する肥満細胞を集めた。抗DNPマウスモノクローナル
IgE抗体を37℃、1時間反応することによりIgEを
肥満細胞に結合させ、感作状態とした。Tyrode液で数回
洗浄した後、0.2%BSAを含むTyrode液に肥満細胞が
106/ml となるように懸濁し、IgE感作肥満細胞懸濁
液を得た。
et al.:J.Antibiotics, 43, 5, 462-469(1990)) に準じ
て行った。ウイスター系ラット腹腔内に、Tyrode液20ml
を注入し、ピペットで腹水を取り出した。採取した腹水
は4℃、100×g、12分間遠心分離し、沈殿する細胞を
集めた。この細胞をTyrode液2mlに懸濁させ、比重1.06
8 に調製した牛血清アルブミン(BSA)生理食塩水4
mlに重層し、4℃、100×g、12分間遠心分離後、沈殿
する肥満細胞を集めた。抗DNPマウスモノクローナル
IgE抗体を37℃、1時間反応することによりIgEを
肥満細胞に結合させ、感作状態とした。Tyrode液で数回
洗浄した後、0.2%BSAを含むTyrode液に肥満細胞が
106/ml となるように懸濁し、IgE感作肥満細胞懸濁
液を得た。
【0045】肥満細胞脱顆粒阻害活性の測定は、1×10
6cells/mlに調製したIgE感作肥満細胞懸濁液に被検
液を加え、37℃、5分間インキュベートした後、脱顆粒
誘発剤として抗原(DNP−BSA)(200ng/ml)+ホス
ファチジルセリン(10μg/ml) PBS(-) を添加し、再
度37℃、10分間インキュベートした。1500×g、5分間
の遠心上清中に含まれるヒスタミン量を、オルトフタル
アルデヒド(OPA)でポストカラムラベルすることに
より、HPLCで定量した。
6cells/mlに調製したIgE感作肥満細胞懸濁液に被検
液を加え、37℃、5分間インキュベートした後、脱顆粒
誘発剤として抗原(DNP−BSA)(200ng/ml)+ホス
ファチジルセリン(10μg/ml) PBS(-) を添加し、再
度37℃、10分間インキュベートした。1500×g、5分間
の遠心上清中に含まれるヒスタミン量を、オルトフタル
アルデヒド(OPA)でポストカラムラベルすることに
より、HPLCで定量した。
【0046】ヒスタミン遊離阻害活性は脱顆粒誘発剤に
より遊離されるヒスタミン量に対する阻害率として表
し、式(1)により求めた。 ヒスタミン遊離阻害率(%)= {1−(Hs−Hb)/(Hi−Hb)}×100 (1) Hb;細胞をPBSとのみインキュベートした時に遊離
されるヒスタミン量 Hi;細胞を被検液非存在下に脱顆粒誘発剤とインキュ
ベートした時に遊離されるヒスタミン量 Hs;細胞を被検液存在下に脱顆粒誘発剤とインキュベ
ートした時に遊離されるヒスタミン量
より遊離されるヒスタミン量に対する阻害率として表
し、式(1)により求めた。 ヒスタミン遊離阻害率(%)= {1−(Hs−Hb)/(Hi−Hb)}×100 (1) Hb;細胞をPBSとのみインキュベートした時に遊離
されるヒスタミン量 Hi;細胞を被検液非存在下に脱顆粒誘発剤とインキュ
ベートした時に遊離されるヒスタミン量 Hs;細胞を被検液存在下に脱顆粒誘発剤とインキュベ
ートした時に遊離されるヒスタミン量
【0047】上記の方法でチオトロポシンの肥満細胞脱
顆粒阻害活性を調べた結果を図4に示した。チオトロポ
シンには強い肥満細胞脱顆粒阻害活性があることが明ら
かになった。図4に示したように、チオトロポシンの新
しい生物活性として抗アレルギー活性を見出した。
顆粒阻害活性を調べた結果を図4に示した。チオトロポ
シンには強い肥満細胞脱顆粒阻害活性があることが明ら
かになった。図4に示したように、チオトロポシンの新
しい生物活性として抗アレルギー活性を見出した。
【0048】
【発明の効果】本発明により、チオトロポシンが得られ
る。チオトロポシンは、魚類病原性細菌に対して抗菌活
性を、微細藻類に対して極めて強い抗藻活性を有し、さ
らにチオトロポシンは抗アレルギー活性も有する。従っ
て、チオトロポシンは医薬品、水産用医薬品、赤潮防止
剤またはそれらの変換素材として利用でき、産業上極め
て有用である。
る。チオトロポシンは、魚類病原性細菌に対して抗菌活
性を、微細藻類に対して極めて強い抗藻活性を有し、さ
らにチオトロポシンは抗アレルギー活性も有する。従っ
て、チオトロポシンは医薬品、水産用医薬品、赤潮防止
剤またはそれらの変換素材として利用でき、産業上極め
て有用である。
【図1】カウロバクター・エスピーPK654の細胞形
態を示した光学顕微鏡写真(生物の形態)。(倍率:2,
000 倍,1目盛は約1μm)
態を示した光学顕微鏡写真(生物の形態)。(倍率:2,
000 倍,1目盛は約1μm)
【図2】付着柄(stalk) を有するカウロバクター・エス
ピーPK654の細胞形態を示した光学顕微鏡写真(生
物の形態)。上段および下段の写真はそれぞれ異なる視
野のものである。
ピーPK654の細胞形態を示した光学顕微鏡写真(生
物の形態)。上段および下段の写真はそれぞれ異なる視
野のものである。
【図3】極鞭毛を有するカウロバクター・エスピーPK
654の細胞形態を示した光学顕微鏡写真(生物の形
態)。(倍率:2,000 倍,1目盛は約1μm)
654の細胞形態を示した光学顕微鏡写真(生物の形
態)。(倍率:2,000 倍,1目盛は約1μm)
【図4】チオトロポシンの肥満細胞脱顆粒阻害活性を示
す図。
す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12P 17/14 C12P 17/14 (C12N 1/20 C12N 1/20 C12R 1:01) C12R 1:01 (C12P 17/14 C12R 1:01) (72)発明者 岡 修一 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 浅田 真弘 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 井上 真美 茨城県牛久市岡見町960−144 (72)発明者 中込 和哉 茨城県つくば市東1丁目1番3 工業技 術院 生命工学工業技術研究所内 (56)参考文献 特開 平7−25873(JP,A) 特開 平5−310703(JP,A) 特開 昭57−70889(JP,A) J.Antibiot.,(1984), 37(11),p.1294−300 Tetrahedron Let t.,(1984),25(4),p.419− 22 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07D 327/04 CA(STN) REGISTRY(STN)
Claims (4)
- 【請求項1】 チオトロポシンを有効成分として含む、
陸上生物に対する病原菌を除く病原菌による魚類連鎖球
菌症の予防または治療のための抗菌剤。 - 【請求項2】 陸上生物に対する病原菌を除く病原菌が
エンテロコッカス(Enterococcus)属細菌またはストレプ
トコッカス(Streptococcus)属細菌である、請求項1記
載の抗菌剤。 - 【請求項3】 エンテロコッカス(Enterococcus)属細菌
がエンテロコッカス・セエリオリイシイダ(Enterococc
us seriolicida)である、請求項2に記載の抗菌剤。 - 【請求項4】 チオトロポシンを5〜10%含有する製剤
を0.1〜0.5g/魚体重kg/日で投与する、請求項1〜3の
いずれか1項に記載の抗菌剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1221398A JP3355367B2 (ja) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | 魚病抗菌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1221398A JP3355367B2 (ja) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | 魚病抗菌剤 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7191183A Division JP2769996B2 (ja) | 1995-07-04 | 1995-07-04 | チオトロポシンの製造方法および用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10182454A JPH10182454A (ja) | 1998-07-07 |
JP3355367B2 true JP3355367B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=11799114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1221398A Expired - Lifetime JP3355367B2 (ja) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | 魚病抗菌剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3355367B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6270910B1 (en) | 1998-04-03 | 2001-08-07 | 3M Innovative Properties Company | Anisotropic film |
-
1998
- 1998-01-26 JP JP1221398A patent/JP3355367B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J.Antibiot.,(1984),37(11),p.1294−300 |
Tetrahedron Lett.,(1984),25(4),p.419−22 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH10182454A (ja) | 1998-07-07 |
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Legal Events
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