JP3351524B2

JP3351524B2 - 糖蛋白質および核酸結合物質を含む新しい結合体

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Publication number: JP3351524B2
Application number: JP50853592A
Authority: JP
Inventors: マックスエルビルンシュティール; マシューコッテン; エルンストワーグナー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1991-05-08
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 2002-11-25
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: CA2105771A1; EP0584118B1; GR3035006T3; WO1992019281A2; ES2150421T3; ATE196608T1; EP0584118A1; DE4115038A1; JPH06507158A; DE59209869D1; WO1992019281A3; DK0584118T3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は核酸または核酸アナログを高等な真核細胞に
吸収させうる複合体を形成しうる糖蛋白質および核酸結
合物質を含む結合体および該結合体の製造方法に関す
る。

ヨーロッパ特許出願EP A1 0388 758は、核酸と複合体
を形成しうるトランスフェリン・ポリカチオン結合体を
示している。これらの複合体は生細胞に効率的にインタ
ーナライズされ、輸送されたDNAが発現される。トラン
スフェリン・ポリカチオン・DNA複合体の細胞への吸収
はトランスフェリン・レセプターを介して起こる。

未公開のオーストリア特許出願1110/90は、CD4−発現
細胞に核酸を輸送しうる、CD4およびポリカチオンに結
合しうるタンパク質を含む結合体について報告してい
る。適当なCD4−結合タンパク質にはウイルス性糖蛋白
質gp120が含まれる。

EP A1 0388 758およびオーストリア特許出願1110/90
で述べられているタンパク質・ポリカチオン結合体の調
製方法は、ペプチドのカップリングに関する従来法を用
いたトランスフェリンまたはCD4−結合タンパク質とポ
リカチオンの化学的カップリングを含む。一般にこのよ
うな方法では、カップリング反応前に個々の成分にリン
カー物質が提供される（この事はメルカプト基またはア
ルコール基等のカップリングに必要な適当な官能基が無
い場合に必要となる。リンカー物質とは個々の成分の官
能基と最初に反応し、後に修飾された個々の成分のカッ
プリングを可能とする二官能性化合物である。）。結合
体の望ましい性質、特に安定性に依存してカップリング
は以下に示す手段：ａ）還元条件下で再度切断可能なジスルフィド結合（例
えばスクシンイミジルピリジルジチオプロピオネート
（ジャング（Jung）等、1981）を用いる）、ｂ）生物学的条件下で非常に安定な化合物（例えば、第
２成分に結合するリンカーのスルフィドリル基とマレイ
ミド・リンカーを反応させる事によるチオエステル）の
使用、ｃ）弱酸性条件下で不安定なエステル結合、またはアセ
タールまたはケタール結合等、生物学的条件下で不安定
な結合の使用、等を用いたリンカーを使用する方法で行いうる。

合成の際にタンパク質分子全体に渡ってリンカーが非
常に統計的に分布する結果、異なるタンパク質／ポリカ
チオン比を持つ結合体混合物が得られ、最初に均一なフ
ラクションになるまで分離しなければならず、結果的に
この種の方法は大量の結合体を生産するには適さない。
さらに、この方法は得られる結合体がタンパク質と核酸
結合物質の間の結合位置に関して精密に規定できないと
いう欠点を有する。その接近可能性が糖蛋白質の細胞表
面タンパク質への結合に関係する糖蛋白質の特定部位に
ポリカチオンが結合することを除外できず、その結果と
してインターナリゼーションが影響を受ける。このよう
な方法で調製した結合体の別の欠点には、カップリング
に全てが使用される訳ではない過剰なリンカー物質のた
めに幾らかのリンカー残基が分子上に残り、結合体の効
率に悪影響を与えるようなタンパク質の生物学的活性の
変化をもたらされる事が挙げられる。

本発明の目的は糖蛋白質および核酸を結合しうる化合
物を含む改良された結合体、および該結合体の調製方法
を提供することである。

ヒト・トランスフェリンについてはアミノ酸配列（マ
クギリブレイ（MacGillivray）等、1983）、グリコシレ
ーション部位および炭水化物側鎖の構造（ドーランド
（Dorland）等、1977）が報告されている。このタンパ
ク質はAsn−413およびAsn−611にＮ−グリコシド結合で
結合する２つの同じ炭水化物鎖を有している。このグリ
カン鎖は２つのＮ−アセチルニューラミニル−Ｎ−アセ
チルラクトサミン基を有するマンノトリシド−ジ−Ｎ−
アセチル−チトビオース・コアを含む二触角構造を有す
る。これまでに知られている限りでは、トランスフェリ
ンのグリコシル化は血漿からのアシアロトランスフェリ
ンの沈殿は別としてレセプターへの結合またはその他の
生物学的機能には影響を持たない（フューバース（Hueb
ers）およびフィンチ（Finch）、1987）。

gp120はHIVウイルスの外皮糖蛋白質である。これは高
い炭水化物含有率を有し、感染した細胞およびウイルス
粒子の膜の外側に存在する。gp120は、CD4レセプターへ
のウイルスの結合に関する基本的な決定因子を含んでい
る。ウイルスおよび細胞膜間の高いアフィニティー結合
はgp120のＣ末端の40個のアミノ酸とCD4のＮ末端の近傍
のドメイン間の相互作用によるものである。種々のHIV
株に間ではgp120の配列に関して実質的な差異が存在す
るが、HIV−１、HIV−２および関連SIVウイルスの間のC
D4結合ドメインは保存されている。95および25kDaのタ
ンパク質分解フラグメントが単離されており、これらは
gp120のドメイン様断片であり本来のgp120と同様にCD4
に結合しうる（ニグレン（Nygren）等、1988）。成熟し
た分泌型のgp120から末端のシアル酸残基を除いてもgp1
20のCD4への結合能は影響を受けない（フェニー（Fenni
e）およびラスキー（Lasky）、1989）。

ブァンレンテン（Van Lenten）およびアシュウェル
（Ashwell）（1971）はシアル酸を含む糖蛋白質をラベ
ルする一般的方法を報告した。低温でヴィシナル・ジオ
ール・システムを有する炭水化物鎖のシアル酸を過沃素
酸ナトリウムで酸化する。同様のテストをトランスフェ
リンについても行って炭水化物鎖中のシアル酸の２つの
末端環外炭素原子を過沃素酸酸化で選択的に除去し、続
いてこの事を修正されたシアル残基へのトリチウムの取
り込みによるラベル化で確認した（キシモト（Kishimot
o）およびタバソリ（Tavassoli）,1986）。

モレル（Morell）等、1966は最初にシアル酸をノイラ
ミニダーゼで除去し、生じたアシアロセルロプラスミン
をガラクトースオキシダーゼで処理し、生成したアルデ
ヒドをトリチウムラベルしたホウ化水素で還元するセル
ロプラスミンのラベル方法を報告している。

特定の用途に使用するアフィニティー・クロマトグラ
フィー・カラムを調製する場合、アミノ基を含むカラム
・マトリクス（それ自体または末端アミンを持つスペー
サーの付加による）と抗体との結合を重鎖の炭水化物に
よって行う（ハーロー（Harlow）およびレーン（Lan
e）,1988）。

オシャネシー（O'Shannessy）およびホフマン（Hoffm
an）,1987は、酸化した糖蛋白質がヒドラジド誘導体化
アガロースキャリヤーと反応させる、オリゴサッカライ
ド残基により特異的に行われる糖蛋白質の固定化に使用
するためのヒドラジド基を含む固体キャリヤーの調製お
よび使用法を報告した。

本発明で設定された問題点を解決するための最初の考
え方は、細胞表面への糖蛋白質の結合が影響を受けない
という条件でポリカチオンまたは他の核酸結合分子に対
する特異的結合部位として糖蛋白質の炭水化物基を使用
することである。

意外にも糖蛋白質と核酸結合物質間の結合が炭水化物
鎖を介して提供される糖蛋白質・ポリカチオン結合体を
用いると、従来法で調製した結合体と比較してトランス
フェクション効率が増加することが分かった。

従って、本発明は核酸または核酸アナログと複合体を
形成しうる新しい結合体に関する。この結合体は糖蛋白
質および核酸結合物質を含み、糖蛋白質および核酸結合
物質が１つ以上の糖蛋白質の炭水化物鎖を介して結合さ
れている特徴を有する。（核酸結合物質は糖蛋白質と核
酸間の結合を形成しうる事から以後「結合因子」と呼
ぶ）。

本発明で行われる実験において、ヒト・トランスフェ
リンの炭水化物鎖中のシアル酸の末端環外炭素原子は選
択的に除去された。さらに、HOC−COH結合の切断によっ
て得られるアルデヒド型のトランスフェリンをポリカチ
オンのアミノ酸の基へカップリングに使用した。アルジ
ミンの形成に由来する結合を加水分解しえない対応する
アミン結合にまで還元した。得られたトランスフェリン
・ポリカチオン結合体を精製し、DNAと複合体を形成し
た後生細胞への吸収能を調べた。

同様に、gp120およびポリリジンから結合体を形成
し、DNAと複合体を形成した後CD4⁺細胞への吸収および
そこでの発現を調べた。

本発明の範囲内において、これらの結合体は核酸との
複合体を形成しうることが示された。これらの複合体を
使用して治療的に活性のある核酸を高等な真核細胞に導
入しうる。糖蛋白質・結合因子／核酸複合体はトランス
フェリン・レセプターを通して吸収される事が示され
た。

従来のカップリング法で調製された物とは異なり、本
発明の結合体は使用するリンカー物質に由来する修飾を
含まない。また、例えば、トランスフェリン等のカップ
リングに適した唯一、または僅かな炭水化物基しか含ま
ない糖タンパク質の場合、本発明の結合体は糖蛋白質と
結合因子との結合部位を正確に規定しうる利点を有す
る。

さらに、炭水化物基は糖蛋白質と核酸結合物質の間に
32個の原子のスペースをあける天然のスペーサーとして
の役割を果たす。このスペーシングは、核酸結合分子に
よるいかなる障害も実質的に回避する事によりインター
ナリゼーションに適した様式で結合できるように糖蛋白
質が細胞表面タンパク質に対して提供されることを保証
するのに重要である。本発明の結合体の別の利点には、
リンカーを用いた従来法で調製した物よりも高収率で得
られることが挙げられる。

糖蛋白質の選択は特に標的細胞、特に特定の細胞に特
異的または非常に特異的であり、このタイプの細胞に直
接核酸を導入しうる特定の表面抗原またはレセプターに
より決定される。

本発明の範囲において、細胞に結合する糖蛋白質また
はそのフラグメントを使用しており、その結果特にエン
ドサイトーシス、または、その結合・インターナリゼー
ションが細胞膜要素との融合により起こる糖蛋白質によ
り簡便に結合体・DNA複合体がインターナライズされ
る。

本発明の糖蛋白質（フラグメント）の適合性に重要な
ことは、ａ）それらが核酸を導入する特定の細胞により認識さ
れ、かつそれらの１つ以上の炭水化物鎖を介して結合因
子に結合した場合、それらの結合能が全くまたは実質的
に影響を受けないこと、およびｂ）この性質の範囲内でそれらが使用する経路により細
胞内への核酸の「ピギーバック」を行いうること、以上ａ）およびｂ）である。

ａ）およびｂ）で規定した条件に適合するなら、直接
または活性化後、結合因子と反応しうる基を炭水化物成
分内に有している全ての糖蛋白質は基本的に本発明にお
ける使用に適している。これらには、特に１つ以上のア
ルデヒド基が酸化により形成される炭水化物基を有する
糖蛋白質が含まれる（例えば、ガラクトース・オキシデ
ースによる酵素的酸化によるガラクトースの場合（モレ
ル（Morell）等、1966））。

特に適している化合物は、末端シアル酸を含む炭水化
物鎖（Ｎ−アセチルノイラミノ酸、NerNAc）を有する糖
蛋白質である。本発明において、炭水化物鎖にシアル酸
を含まないコナルブミン（ニワトリ卵由来のトランスフ
ェリン）はヒト・トランスフェリンとは異なり、その炭
水化物鎖を介してポリリジンに殆ど結合しえない（５％
以下）。

上述のトランスフェリンおよびgp120の別に、本発明
で使用しうる糖蛋白質の例には、細胞膜の融合またはエ
ンドサイトーシスのいずれかによる細胞内へのウイルス
の侵入に関連する糖蛋白質が含まれる。これらにはヘル
ペス・シンプレックス・ウイルス糖蛋白質gBおよびgD、
ベシキュラー・ストマチチス・ウイルス糖蛋白質および
インフルエンザ・ウイルス糖蛋白質が含まれる。これら
の糖蛋白質は細胞内へのウイルスの侵入に重要な働きを
していることが分かっている（ブッチャー（Butcher）
等、1990;リサンチ（Lisanti）等、1990;ウィット（Whi
tt）等、1990）。また、インフルエンザ・ウイルス糖蛋
白質は、細胞内にDNA含有リポソームを輸送するのに使
用しうることが示された（ラピドット（Lapidot）およ
びロイター（Loyter）,1990）。その他の適当な糖蛋白
質にはインターロイキン−１およびインターロイキン−
２等のグリコシル化されたサイトカインがある。

本発明の目的に広く使用しうる１群の糖蛋白質には核
酸を輸送する標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗
体、特にモノクローナル抗体であって、重鎖の不変部に
適当な炭水化物側鎖、特に末端にシアル酸を有する物を
有する抗体が含まれる。

炭水化物の構造およびインターナリゼーションにおけ
る役割が十分に知られていない糖蛋白質リガンドまたは
抗体の本発明の結合体を調製する上での適合性は、種々
の結合因子とカップリングしうる能力を予備実験で調べ
ること、並びに特定の標的細胞に輸送しうる核酸との複
合体を形成しうるか否かを調べるために生成された全て
の結合体を試験する事により検定しうる。

本発明の範囲における結合因子としての物質の適合性
に関する条件は、糖蛋白質の場合によっては修飾を受け
た炭水化物成分における官能基と反応しうる能力であ
る。これらには糖蛋白質の酸化された炭水化物基のアル
デヒド基と反応しうる１つ以上の官能基を含む物質、特
に１つ以上の一級および／または二級アミノ基を有する
物質、またはヒドラジンまたはヒドラジド基を有する物
質が含まれる。

本発明における望ましい結合因子は、そのポリカチオ
ン性により核酸と結合しうる物質である。適当な有機性
ポリカチオンにはポリリジン、ポリオルニチン等の同種
ポリペプチドまたは２つ以上のアミノ酸を含む異種ポリ
ペプチドであって、おそらく種々の鎖長を有するポリペ
プチド、並びにポリエチレンイミン等の非ペプチド合成
ポリカチオンが含まれる。また、ヒストンまたはプロタ
ミン、またはそのアナログまたはフラグメント等のポリ
カチオン性を有する天然のDNA結合タンパク質も適して
いる。

ポリカチオンのサイズは、正電荷の総和が輸送される
特定の核酸に従って約20乃至500となるように選択され
ることが望ましい。

静電相互作用の結果として核酸に結合するポリカチオ
ンに加えて、インターカレーション等別のメカニズムで
糖蛋白質・DNA間の結合を形成する結合因子物質を使用
することも可能である。この様な物質の例にはエチジウ
ムまたはアクリジンを含む化合物がある。

また、糖蛋白質の炭水化物部分へのカップリングに適
した１つ以上の特定の官能基を導入するように修飾され
た結合因子も適当である。この１つの例にはポリアルギ
ニンへのヒドラジド基の導入があり、この事はこの様な
修飾の結果として糖蛋白質の炭水化物鎖のアルデヒド基
とのみ反応することを可能にする。この様な結合因子の
利点は結合因子の結合部位が正確に規定しうることであ
る。

ポリカチオンに対する糖蛋白質のモル比は糖蛋白質の
分子当たりのポリカチオン分子の最大数が糖蛋白質の炭
水化物鎖におけるカップリングに使用しうる官能基の最
大数で規定されることから10:1乃至1:10の範囲にあるこ
とが望ましい。

本発明の目的の１つでもある本発明の糖蛋白質・結合
因子結合体を調製する望ましい方法には、温和な条件下
で糖蛋白質を酸化して炭水化物部分に１つ以上のアルデ
ヒド基を含むものを生成し、酸化された糖蛋白質のアル
デヒド基と反応しうる１つ以上の官能基を含む核酸結合
物質に酸化された糖蛋白質をさせることが含まれる。

核酸結合物質には１つ以上の一級および／または二級
アミノ基、またはヒドラジンまたはヒドラジド基が含ま
れることが望ましい。アミノ基を含む物質とのカップリ
ングの場合、この反応は還元条件下で行う。

本発明の範囲において特に望ましい事は糖蛋白質の炭
水化物鎖の末端シアル酸がアルデヒドまで酸化される過
程である。望ましい酸化剤は過沃素酸、特に過沃素酸ナ
トリウムである。

アルデヒド型の糖蛋白質とアミノ基を含む結合因子と
をカップリングする場合の還元条件を作るのに適してい
る物質は、糖蛋白質に穏やかな条件下で選択的にシッフ
塩基を還元する還元剤である。本発明のこの方法におけ
る還元剤としてはシアノホウ素化水素ナトリウムまたは
三級ブチルアミンボランを使用することが望ましい。

この方法は低温、特に０℃から室温の範囲で行うこと
が望ましい。

この望ましい方法をトランスフェリン・ポリリジン結
合体に関して第１図に模式図的に示した。

本発明の方法の別の態様にはガラクトース・オキシデ
ースによる末端ガラクトース残基の処理および生成した
酸化型糖蛋白質の結合因子へのカップリングが含まれ
る。必要ならば、ガラクトース残基酸化の前に末端シア
ル酸をモレル（Morell）等、1966の方法を除去しうる。

この反応の各段階のメカニズムは当業者にとって馴染
みの深いものである。従って、この方法の各ステップの
条件を個々の必要条件に適合させることは当業者の能力
の範囲内にある。

抗体・ポリカチオン結合体（またはアミノ基を含む他
の結合因子との抗体結合体）の場合、一般にアミノ基を
含むカラムマトリクスに抗体をカップリングするのに用
いられる方法の原則に従って処理することができる。

さらに本発明は本発明の結合体が標的細胞に輸送する
核酸と複合体を形成した糖蛋白質・結合因子／核酸複合
体に関する。

本発明の複合体は細胞内に効率的に吸収され、そこで
天然の糖蛋白質がインターナライズされ、かつ、導入さ
れたDNAは発現される一方、結合体含量が増加するにつ
れ、細胞におけるDNAの発現の増加が見られる。

細胞に輸送される核酸はDNAでもRNAでもよく、ヌクレ
オチド配列に関する制限もない。結合因子としてポリカ
チオンが使用でき、修正が核酸のポリアニオン性に影響
しないならば核酸を修正することも可能である。このよ
うな修正には、例えば、ホスホロチオエート基によるホ
スホジエステル基の置換またはヌクレオチドアナログの
使用が含まれる。この様な修正は当業者にとっては一般
的な物である。代表的方法で修正した核酸、および一般
的にヌクレオチドアナログと呼ばれる物、およびそれら
の作用の原則のまとめはゾン（Zon）（1988）の報告に
示されている。

核酸のサイズに関しても本発明は広い範囲を許容して
いる。糖蛋白質・結合因子・核酸複合体が細胞内に輸送
されることが保証されるかぎり、本発明の結合体に課せ
られる理論的上限は無い。下限は、例えば約10ヌクレオ
チド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドは特異性が
不十分であることから使用しえない理由から等、特定の
用途に特異的な理由の結果として存在する。また、本発
明の結合体を用いることによりプラスミドも細胞内に輸
送しうる。

適当な核酸の例にはウイルス複製に必須の遺伝子部分
に相補的な上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドまた
はリボザイムがある。

相補性による阻害効果を有する本発明の糖蛋白質・ポ
リカチオン・核酸複合体の望ましい核酸成分には、アン
チセンスDNA、アンチセンスRNAまたはリボザイム、また
はこれらをコードする遺伝子が含まれる。リボザイムま
たはアンチセンスRNAを使用する場合、場合によっては
キャリヤー遺伝子と共にこれらをコードする遺伝子を使
用することが特に有利である。細胞内にこの遺伝子を導
入することにより、このようなRNAを導入した場合に比
べてかなりRNAの増幅が達成され、結果的に目的の生物
学的反応に十分な供給量が保証される。特に適当なキャ
リヤー遺伝子には、例えばtRNA遺伝子など、ポリメラー
ゼIIIによる転写に必要な転写単位である。例えば、リ
ボザイム遺伝子を転写が行われたときに該リボザイムが
コンパクトなポリメラーゼIII転写物の一部となるよう
にキャリヤー遺伝子中に挿入しうる。ポリメラーゼIII
によって転写されるリボザイム遺伝子およびキャリヤー
遺伝子を含む適当な遺伝子単位はヨーロッパ特許出願A1
0 387 775に公開されている。本発明の輸送システムに
より細胞中の遺伝子初期濃度の増加を保証することによ
り、これらの遺伝子単位の効果を促進する事が出来る。

原則として、そのブロッキングがウイルス複製および
発現の阻害を起こすHIV遺伝子の全ての配列は、AIDSの
治療に使用しうる相補的なアンチセスオリゴヌクレオチ
ド、リボザイム、またはこれらをコードする遺伝子の構
築のための標的配列として適当である。最も重要な標的
配列は調節機能を有する配列、特にtat−、rev−または
nef−遺伝子である。他の適当な配列には開始、ポリア
デニレーション、LTR配列のスプライシングtRNAプライ
マー結合部位（PBS）またはtar−配列がある。

また、ウイルス遺伝子に相補的な理由で阻害する核酸
分子とは異なり、例えばいわゆるトランスドミナント突
然変異を含むウイルスタンパク質をコードする物など
（ヘルスコウィッツ（Herskowitz）、1987）異なる活性
メカニズムを有する遺伝子も使用しうる。細胞における
該遺伝子産物の発現が対応する野生型ウイルスタンパク
質を凌駕するタンパク質を生じ、その結果、前者がウイ
ルス複製に関する通常の機能を果たせず効率的にウイル
ス複製が阻害される。基本的に、ウイルス複製および発
現に必要なウイルスタンパク質のトランスドミナント変
異体、例えばHIV−複製に阻害効果を有することが示さ
れているgag−、tat−およびrev−変異体（トロノ（Tro
no）等、1989;グリーン（Green）等、1989;マリム（Mal
im）等、1989）が適当である。

治療的に活性のある核酸の別の例にはオンコジーンに
阻害効果を有するものがある。

また、本発明によりその発現産物が標的細胞、例えば
CD4⁺細胞、特にＴ−細胞へのシグナル・トランスミッシ
ョンに関してポジティブな効果を産むようにシグナルの
伝達において機能し、その結果、例えばＴ−細胞の生存
率を増加させる遺伝子またはその断片を細胞に輸送する
ことも可能である。

理論的に細胞表面タンパク質を発現する細胞において
治療的または遺伝子治療的効果を有する全ての遺伝子ま
たは遺伝子断片が本発明の目的に対して適している。

ヒトの遺伝子治療に使用され、本発明の方法により細
胞内に挿入される核酸の例には因子VIII（ウッド（Woo
d）等、1984）因子IX（ハモフィリ（Ｈmophilie）；
クラチ（Kurachi）等、1982）、アデノシン・デアミナ
ーゼ（重度合併免疫欠損症、SCID、ヴァレリオ（Valeri
o）等、1984）、α−１−アンチトリプシン（肺気腫、
シリベルト（Ciliberto）等、1985）または嚢胞性線維
症コンダクタンス調節遺伝子（リョーダン（Riordan）
等、1989）をコードするDNAがある。

結合体に対する核酸の比は広い範囲で変化しうるもの
で、核酸の全ての電荷を中和する必要は必ずしも無い。
この比は輸送される核酸のサイズおよび構造、ポリカチ
オンのサイズ、その電荷の数および分布等の基準に従っ
て個々に調節しなければならず、結果的に特定の用途に
対しては核酸の輸送能と生物学的活性間に望ましい比が
存在する。先ず、この比をゲル中のDNAの移動速度の遅
延（例えばアガロースゲルにおける移動度シフト）また
は密度勾配遠心により調整しうる。この予備的比を得た
後、細胞における核酸の最高の使用可能な活性を得、お
よび残存する核酸の負の電荷が細胞への輸送を妨害しな
いように結合体の一部を還元する観点から放射能ラベル
した複合体を用いた輸送テストを行うことが望ましい。

糖蛋白質・ポリカチオン／核酸複合体の調製は、ポリ
イオン化合物の複合体化に関する従来法で行うことが出
来る。制御の効かない凝集または沈殿を避ける１つの方
法には２つの成分を高い希釈率（≦50μg/ml）で混合す
ることが含まれる。

本発明の範囲において、DNA成分を形成するためのレ
ポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用し
た。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用
いたトランスフェリン・ポリカチオン/DNA複合体での予
備実験において、ルシフェラーゼ遺伝子の輸送効率が別
の核酸を使用しうるか否かを示すことが分かった。即
ち、使用される核酸は定性的にはタンパク質・ポリカチ
オン・DNA複合体の使用に関する制限因子ではない。

エンドサイトーシスにより高等真核細胞に吸収されう
る糖蛋白質・結合因子・核酸複合体は、さらに該結合体
によって達成される核酸のインターナリゼーションおよ
び／または発現を増加させるために、結合体中のポリカ
チオンと同じであり得る非共有結合型の１つ以上のポリ
カチオンを含みうる。

PCT出願PCT/EP 92/00217の主要課題であるこのような
手段を用いると（ワグナー（Wagner）等、1991）、細胞
内に輸送される核酸量から判断してより少量の糖蛋白質
・ポリカチオン結合体で少なくとも同等のトランスフェ
クション／発現効率を達成でき、一方この事は合成のコ
ストが少なくて済むことを示している。また、複合体内
の多くの糖蛋白質分子によって占有されるいくつかの隣
接する「ドッキング部位」を有する効果で、別の複合体
が使用できる部位が無くなる結果となることを回避する
ことが望ましい場合は、結合体が少量で済むことは都合
がよい。複合体中に含まれる糖蛋白質の量を最小限に制
限すること、即ち、出来るだけ結合体量を少なく維持
し、かつ、それを遊離したポリカチオンで希釈する事
は、複合体が結合する細胞表面タンパク質の数が問題の
細胞型に少ない場合には特に有利である。

このような手段を用いる事により、これまで特に効率
的ではなかった結合体の性能を実質的に向上し、並びに
既に高い効率を示す結合体の性能をさらに増加しうる。

本発明の複合体の定性的組成に関しては、一般に先ず
細胞内に輸送される核酸および糖蛋白質が決定される。
核酸は主に、例えば阻害されるか、または例えば欠陥遺
伝子を置換するために発現される（遺伝子治療で使用さ
れる場合）遺伝子または遺伝子断片の標的配列により、
細胞内で行われる生物学的効果で決定される。核酸は、
例えば特定の用途に関する安定性が必要な理由等、場合
によっては修正されることもある。

核酸および糖蛋白質の決定から始まり、ポリカチオン
がこれらのパラメーター、例えば特に負の電荷の実質的
中和に関して重要な核酸のサイズに適合される。

複合体内に含まれうる非共有結合ポリカチオンを選択
する場合、これらの物質の添加が結合体そのものよりも
核酸のインターナリゼーション／発現の増加をもたらす
事が重要である。

定性的組成と同様に複合体の定量的組成も、例えば核
酸を濃縮する必要性またはその程度、複合体全体の電
荷、特定の細胞型に対する結合およびインターナリゼー
ション能の程度、およびそれを増加する必要性の程度
等、互いに有機的に関連する多くの基準で決定される。
複合体の組成の別のパラメーターには細胞表面タンパク
質に対する糖蛋白質の接近可能性があり、この重要な因
子は細胞に対してこの糖蛋白質が複合体内にどの様に存
在するかを示すものである。別の基本的特性に核酸の機
能を果たすための細胞内の核酸の接近可能性が挙げられ
る。

複合体内に非共有結合型で含まれるポリカチオンは結
合体に含まれる物と同じでも異なっていてもよい。これ
らを選択する基準は、特に核酸の濃縮に関する核酸のサ
イズである。より小さい核酸分子は一般にコンパクトに
する必要がない。また、このポリカチオンの性質および
量に関する選択は結合体、特に結合体に含まれるポリカ
チオンに依存して行われる。例えば、もしこのポリカチ
オンがDNA濃縮に関して全くまたは殆ど能力を持たない
なら、一般に複合体の効率的なインターナリゼーション
を達成するためにはこの性質をより多く持つポリカチオ
ンを使用することが薦められる。もし、結合体内に含ま
れるポリカチオンがそれ自体核酸を濃縮する物質であ
り、かつ、効率的なインターナリゼーションに必要な核
酸のコンパクト化が達成されるならば、別のメカニズム
により発現の増加をもたらすポリカチオンを使用する方
が良い。

また、場合によっては複合体中に含まれる非共有結合
ポリカチオンに重要な事は、核酸を濃縮する能力および
／または細胞中で不都合な分解から核酸を防御する能力
である。

さらに、本発明は望ましくは生理学的条件下で可溶性
の糖蛋白質・結合因子／核酸複合体を細胞と接触させる
ことを含むヒトまたは動物の細胞に核酸を導入する方法
に関する。

本発明の態様に対し、細胞内に輸送された核酸の分解
が阻害される条件を作ることは有用である。

核酸の分解が阻害される条件は、いわゆるリソソマト
ロピック物質の添加により提供される。これらの物質は
リソソーム中のプロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性
を阻害し、核酸の分解を阻害しうることが知られている
（ルスマン（Luthmann）およびマグヌソン（Magnusso
n）、1983）。

これらの物質にはクロロキン、モネンシン、ニゲリシ
ン、塩化アンモニウムおよびメチルアミンが含まれる。

本発明の範囲内でリソソマトロピック物質の群から選
択される物質を使用する必要性は特に処理される細胞の
タイプに依存するか、または、もし種々の糖蛋白質が使
用されるなら複合体が細胞に吸収される種々のメカニズ
ムに依存する。このように、本発明の範囲において、例
えば種々の抗体を使用する時（抗CD4モノクローナル抗
体）クロロキンにより細胞へのDNAの輸送が様々に影響
を受けることが分かった。

どのような場合にも予備実験により本発明の範囲にお
けるこのような物質の必要性または適合性をテストする
必要がある。

特に適当なトランスフェクション条件がトランスフェ
クトされる細胞またはその状態に対応付けられる。も
し、トランスフェリン結合体が使用されるならば、トラ
ンスフェリン・レセプター数が増加する手段が採られ
る。

トランスフェリン・レセプター数を増加するために細
胞が置かれる条件には、例えば細胞内のヘム濃度を低下
しうる物質と細胞を接触させることが含まれる。

これらは、以下の事項：ａ）プロトポルフィリンIXの生合成の阻害ｂ）ヘム生成の阻害ｃ）ヘム分解の促進による細胞内のヘム濃度の減少をもたらす物質であるこ
とが望ましい。

グループａ）の物質にはスクシニルアセトンが含まれ
るが、トランスフェリン・レセプター数の増加はおそら
くプロトポリフィリンIXの整合性の阻害に帰することが
できる。グループｂ）の物質には例えば鉄キレート剤デ
スフェリオキサミン等、細胞における鉄欠乏を誘導する
物質が含まれ、おそらくこの事はプロトポルフィリンIX
のヘムへの転換が阻害されることからトランスフェリン
・レセプター数の増加を引き起こす。基本的に細胞内に
吸収され、ヘム形成に使用しうる鉄の量に関するデスフ
ェリオキサミンの効果を有する全ての物質、特に鉄キレ
ート剤はトランスフェリン・レセプター数を増加するの
に適している。

上述の物質群は明らかにレセプターへの結合に関する
天然のトランスフェリンおよびトランスフェリン・ポリ
カチオン／核酸複合体間の競争を除外するのに適してい
ることから本発明のトランスフェリン複合体の使用に重
要な物である。インビボまたはインビトロでこのような
物質で細胞を前処理することにより、トランスフェリン
に結合しなかった鉄を除去でき、その結果細胞から排除
されたトランスフェリンが使用しうる鉄はもはや無くな
り、従ってこのトランスフェリンはトランスフェリン・
レセプターへの結合に関してトランスフェリン・ポリカ
チオン／核酸複合体と競争しない。一方、遊離した鉄の
除去は遊離鉄により引き起こされるトランスフェリン・
レセプター数の減少を防ぎうる。

グループｃ）には細胞内のヘム分解を誘導または刺激
する物質が含まれ、トランスフェリン・レセプター濃
度、またはトランスフェリンの該レセプターに対するア
フィニティー、またはレセプターのリサイクル速度の増
加により細胞がこの物質と反応する。これらの物質によ
り細胞へのDNAの取り込みが増加する事が分かり、また
発現されるレポーター遺伝子の活性によって測定される
ように、グループａ）乃至ｃ）の物質の組み合わせが副
次的効果を有することが判明した。

さらに、本発明は糖蛋白質・結合因子結合体と複合体
を形成する、活性成分としての１つ以上の治療的又は遺
伝子治療的活性核酸を含む（糖蛋白質・ポリカチオン結
合体と核酸も別々に生成し、治療直前に複合体を形成す
ることも出来る）医薬組成物に関する。

治療的に活性な核酸の例には特定の標的細胞に含まれ
る内在性または外因性遺伝子又は遺伝子産物に関して阻
害効果を有する先に述べたアンチセンス・オリゴヌクレ
オチドまたはリボザイム、またはこれらをコードする遺
伝子、またはトランスドミナント変異体をコードする遺
伝子が含まれる。これらには、例えば、その配列特異性
（トランスドミナント変異体をコードする標的配列に対
する相補性（ヘルスコウィッツ（Herskowitz）、198
7））によりHIVに対する細胞内免疫をもたらし（バルチ
モア（Baltimore）、1988）、AIDS症候群の治療または
感染後のウイルスの活性化の阻害に使用しうる遺伝子が
含まれる。

この医薬製剤は一般的な塩またはリン酸緩衝塩、また
は本発明の複合体が使用に際して必要とされる溶解性を
有するキャリヤー等、従来の医薬的に許容されるキャリ
ヤーを含み得る。医薬製剤を成形するための規則は関連
するテキストブックに記載されている（例えば、Lehrbu
ch der pharmazeutischen Technologie,1984;Pharmazeu
tische Technologie,1978）。

該医薬製剤は例えば、ヒトまたは動物体内のHIVまた
は関連するレトロウイルス等のウイルス配列を阻害する
のに使用しうる。関連するレトロウイルスを阻害するこ
とによる治療応用例にはHTLV−１ウイルスによって引き
起こされる増殖性Ｔ−細胞白血病の治療がある。

また、ウイルス性Ｔ−細胞白血病の治療に加えて、本
発明は非ウイルス性白血病の治療にも使用しうる。最
近、リンパ性白血病の発生におけるオンコジーン（abl,
bcr,ras,rat,c−myc,N−myc）の関連が示されてきた。
観察される特異的染色体転座に基づいて他のオンコジー
ンがあると考えられている。これらのオンコジーンのク
ローニングはオンコジーン阻害核酸の構築および本発明
の治療用途に関する基礎を形成する。

本発明の用途に関する別の重要な分野は遺伝子治療で
ある。本発明による遺伝子治療においては、全ての遺伝
子またはその断片を標的細胞に挿入することが可能であ
り、その発現は例えば遺伝的に起こる欠陥を置換するこ
と、または免疫応答を開始すること等により細胞中での
治療効果を提供する。

治療的用途における医薬製剤の一部としての本発明の
複合体は、例えば静脈注射等により全身的に投与するこ
とができる。この応用に関する標的器官には、例えば肝
臓、脾臓、肺、骨髄または腫瘍が含まれる。また、この
医薬製剤は、例えば筋肉組織または腫瘍への直接的注射
または消化器系への直接的投与により局部的に投与する
こともできる。

また、この治療的応用は例えば骨髄細胞または肝細胞
等について体外で処理した細胞を再び体内に導入する様
な治療にも適応しうる（例えば、ポンダー（Ponder）
等、1991）。

（図面の簡単な説明）第１図：炭水化物鎖を介したトランスフェリンとポリリ
ジンとの結合の反応計画第２図：カチオン交換クロマトグラフィーによるトラン
スフェリン・ポリリジン結合体の単離第３図：トランスフェリン・ポリリジン/DNA複合体によ
る真核細胞のトランスフェクション第４図：鉄含有トランスフェリンを用いたトランスフェ
リン・ポリカチオン結合体によるトランスフェクション
の拮抗阻害第５図:gp120・ポリリジン/DNA複合体によるCD4⁺細胞の
トランスフェクション以下に示す実施例で本発明を説明する。

実施例１トランスフェリン・ポリリジン結合体の調製 3mlの30mM酢酸ナトリウムバッファ（pH5）中102mg
（1.28μmol）のヒト・ランスフェリン（鉄フリー、シ
グマ）溶液をセファデックスＧ−25カラム（ファルマシ
ア）でゲル濾過した。生成した3.8mlの溶液を０℃に冷
却し、4mg（19μmol）の過沃素酸ナトリウムを含む30mM
酢酸ナトリウムバッファ（pH5）80μｌを添加した。こ
の混合物を氷水中、暗所に90分間放置した。さらに、低
分子量生産物を除くためにゲル濾過を行い、酸化したト
ランスフェリン82mg（1.03μmol）（280nmのUV吸収およ
びニンヒドリン検定で測定）を含む溶液を得た。（アル
デヒドを含みアニスアルデヒドで染色した時発色反応を
起こす酸化型を検出するために、サンプルを薄層シリカ
ゲルプレートに滴下し、乾燥後、そのプレートをｐ−ア
ニスアルデヒド／硫酸／エタノール（1/1/18）に浸漬
し、さらに乾燥、加熱した）。処理したトランスフェリ
ン溶液を激しく攪拌しながら4.5mlの100mM酢酸ナトリウ
ム（pH5）溶液中平均鎖長300リジンモノマーの蛍光ラベ
ル化ポリ（Ｌ）リジン（重炭酸ナトリウムバッファ（pH
9）中、130μｇのフルオレセインイソチオシアネート溶
液と臭化水素34mgを３時間反応させることにより得た）
0.50μmolを含む溶液に素早く添加した（10−15分間以
内）。20分後、1Mの重炭酸ナトリウムバッファを添加す
ることで溶液のpHを7.5に調整した。この混合物に１時
間の間隔でシアノ臭素化水素ナトリウム9.5mg（150μmo
l）を４回添加した。18時間後、1.9mlの5M塩化ナトリウ
ムを添加し、最終濃度を0.75Mとした。この反応混合物
をカチオン交換カラム（ファルマシア、Mono S HR 10/1
0）にかけ、25mM HEPES（pH7.3）の0.75M−2.5M塩化ナ
トリウム濃度勾配で分画した。カラムのチャージおよび
勾配の開始時における高塩濃度はポリカチオン結合体の
回収に必須である。弱い蛍光活性を伴うトランスフェリ
ンの一部（約30％）が素抜け画分に溶出してきた。蛍光
ラベル化結合体の大部分は1.35Mと1.9Mとの間の塩濃度
の所に溶出し（第２図参照、…280nmにおけるUV吸収；
…520nmの蛍光）、３個のフラクションに回収された。
２リットルの25mM HEPES（pH7.3）に対する２回の透析
後、これらのフラクションは（溶出の順番で）80nmolの
ポリリジンで修飾されたトランスフェリン19mg（0.24μ
mol）を含むフラクションＡ（TfpL300A）、150nmolのポ
リリジンで修飾されたトランスフェリン27mg（0.34μmo
l）を含むフラクションＢ（TfpL300B）および80nmolの
ポリリジンで修飾されたトランスフェリン5mg（62nmo
l）を含むフラクションＣ（TfpL300C）を生成した。ト
ランスフェリンに関しては全収率50％、ポリリジンに関
しては62％であった。もし、直ぐに使用しないならば、
トランスフェリン結合体は液体窒素で瞬間冷凍し、鉄フ
リーの状態で−20℃で保存した。鉄を取り込ませる前
に、サンプル（0.5−1mg）を塩化ナトリウムで生理学的
塩濃度に調整した。鉄はトランスフェリン含量1mg当た
り６μｌの10mMクエン酸鉄（III）（重炭酸ナトリウム
の添加によりpHを7.8に調整した200mMのクエン酸を含
む）の添加により取り込ませた。鉄を含む結合体はDNA
複合体形成前に子分けして、液体窒素またはドライアイ
ス／エタノール中で瞬間冷凍し、−20℃で保存した（反
復する融解および凍結が結合体を損傷する場合、この手
段が適当である）。

実施例２トランスフェリン・ポリリジン/DNA複合体による真核生
物のトランスフェクション赤白血病細胞系列K562の細胞を10％ FCS、100ユニッ
ト/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンおよび
2mMグルタミンを含むRPMI1640培地中、細胞密度500,000
細胞/mlとなるまで懸濁液として増殖し、次いで新鮮な
培地で二回洗浄した。トランスフェクションの20時間
前、細胞が200,000細胞/mlとなるように50μｇのデスフ
ェロキサミン（シグマ）を含む新鮮な培地を添加した。
トランスフェクション前に細胞を回収し、250,000細胞/
mlとなるように10％FCS（および50μＭデスフェリオキ
サミン）を含む新鮮な培地に懸濁し、24穴培養プレート
（ウェル当たり2ml）に入れた。（デスフェロキサミン
による前処理はトランスフェリン・レセプター数を約５
倍に増加し、DNAの取り込みを改善する働きを持つ）。

330μｌのHBS（150mM NaCl、20mM HEPES pH7.3）中
６μｇのDNAプラスミドpRSVL（Triton−Ｘ分解標準法
（マニアチス（Maniatis））で調製し、CsCl/EtBr平衡
密度勾配遠心、ブタノール脱色および10mM トリス/HCl
pH7.5、1mMEDTAに対する透析で精製した、ラウス・ザ
ルコーマ・ウイルスLTRエンハンサー・プロモーターの
制御下のフォチナス・ピラリス（Photinus pyralis）ル
シフェラーゼ遺伝子を含む（ウチダ（Uchida）等、197
7;ドゥウェット（De Wet）等、1987））溶液を170μｌ
のHBS中第３図に示した量のトランスフェリン・ポリリ
ジン結合体と混合した。室温約30分後、この混合物500
μｌをK652細胞に添加した（DNA/結合体複合体の添加前
５乃至10分前に2mlの細胞サンプルをクロロキン（最終
濃度100μＭ）で処理し、細胞内でのDNAの分解を防い
だ）。37℃４時間のインキュベーション後、細胞を保温
した新鮮な培地（クロロキンを含まない）で洗浄し、37
℃でインキュベートした。トランスフェクションから20
時間後、細胞を回収し、抽出物を調製した。タンパク質
含量に関して標準化した細胞抽出物部分標本に関し、EP
−A1 0338 578に示されている方法を用いてルシフェラ
ーゼ活性を検定した。この実験の結果を第３図に示す
（比較のためにジスルフィド結合を介してカップリング
することによる従来の合成法で調製したトランスフェリ
ン・ポリリジン結合体を使用した。予備実験では使用し
たTfpL200C結合体が最も効率が良いことが分かった）。

実施例３トランスフェリン・レセプターを介したトランスフェリ
ン・ポリリジン/DNA複合体の取り込み DNAと本発明の結合体の間の複合体がトランスフェリ
ン・レセプターを介して形成される事を確認するため
に、６μｇのpRSVLと実施例１（フラクションＢ）で得
られた18μｇのTfpL300結合体との複合体を用いてK562
細胞をトランスフェクトしたが、該細胞はトランスフェ
クションの30分前に種々の量の鉄含有トランスフェリン
または鉄フリー・アポトランスフェリンで前処理したも
のを使用した。出来るかぎり鉄源を排除するために、こ
の実験では無血清培地を使用した。この実験結果を第４
図に示す。示されている当量はDNA複合体中のトランス
フェリン含量に対応している。ルシフェラーゼ活性は50
0,000個の細胞に関するものである。

実施例４ gp120・ポリリジン結合体の調製 800μｌの150mM酢酸ナトリウムバッファ（pH5）中3.6
mg（30nmol）の組み換えgp120（ラスキー（Lasky）等、
1986、1987）溶液を０℃に冷却し、100μｇ（0.46μmo
l）の過沃素酸ナトリウムを含む30mM 酢酸ナトリウム
バッファ50μｌを添加した。この混合物を暗所、氷水中
に１時間放置した。低分子量の生産物を除去するために
反応混合物をゲル濾過した（セファデックスＧ−25、30
mM酢酸ナトリウムバッファ pH5）。酸化したgp120約3.
5mgを含む1.4mlの溶液が得られた（280nmのUV吸収およ
びニンヒドリン検定法で測定した。未修正タンパク質と
は異なり酸化型はアニスアルデヒド試薬により発色反応
を起こした。実施例１参照）。修飾されたgp120溶液を
激しく攪拌しながら室温で60μｌの100mM酢酸ナトリウ
ムバッファ（pH5）中平均鎖長300リジン残基のポリ
（Ｌ）リジン47nmolを含む溶液に添加した。１時間後、
80μｌの1M HEPESを添加することによりこの溶液のpHを
7.3に調整した。さらに、１時間の間隔で0.5mg（８μmo
l）のシアノホウ素化水素ナトリウムを３回添加し、こ
の混合物を室温で一晩放置した。次いで、150μｌの5M
塩化ナトリウムを添加し、最終塩濃度約0.5Mに調整し
た。この反応混合物をカチオン交換クロマトグラフィー
（ファルマシアMono S HR 5/5）にチャージし、25mM H
EPES（pH7.3）中0.6M−3Mの塩濃度勾配を用いて分画し
た。約15％のgp120が素抜け画分に溶出した。結合体の
大部分は塩濃度1.2Mと1.7Mとの間に溶出し、２つのフラ
クションとして回収した。25mMHEPES（pH7.3）に対する
２回の透析の後、これらのフラクションから溶出の順序
で11nmolのポリリジンで修飾されたgp120 0.7mg（5.8nm
mol）を含むフラクションＡと20nmolのポリリジンで修
飾されたgp120 0.8mg（6.7nmol）を含むフラクションＢ
が得られた。結合体の総収率は、gp120に基づくものは
約42％、ポリリジンに基づくものは約65％であった。

実施例５ 10％のFCSを含むDME培地中のCD4⁺HeLa細胞（マドン
（Maddon）等、1986）をT25バイアル当たり５×10⁵細胞
の割合で植種し、37℃で５時間培養した。この細胞を実
施例４で調製したgp120・ポリリジン結合体と６μｇのp
RSVL−DNAとの複合体でトランスフェクションした。複
合体のあるものは非共有結合のポリリジン90を含んでい
た。血清存在下での４時間の接触後、血清含有培地を添
加し、20時間後細胞を回収した。細胞抽出物からの同一
のタンパク質含量で標準化した部分標本についてルシフ
ェラーゼ活性を検定した。このテスト結果を第５図に示
す。比較のためにジスルフィド基を介してカップリング
により調製した抗CD4・ポリリジン結合体を用いたトラ
ンスフェクションを行った。ルシフェラーゼ活性は５×
10⁵個の細胞に対応するものである。

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g Stuttgart,H.サッカー（Sucker）等編

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ワーグナーエルンストオーストリアアー2103 ランゲンツェルスドルフウィーネルシュトラーセ 201 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 48/00 A61K 47/48 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】高等真核細胞に吸収されうる複合体を核酸
または核酸アナログと形成することができる、糖タンパ
ク質および核酸結合物質を含む新しい結合体であって、
該糖タンパク質および核酸結合物質が該糖タンパク質の
１つ以上の炭水化物鎖を介して結合していることを特徴
とする結合体。
【請求項２】糖タンパク質成分が１つ以上の炭水化物鎖
の末端部分に本来の形でシアル酸を含む糖タンパク質に
由来することを特徴とする請求項１記載の結合体。
【請求項３】糖タンパク質がトランスフェリンであるこ
とを特徴とする請求項２記載の結合体。
【請求項４】糖タンパク質がgp120であることを特徴と
する請求項２記載の結合体。
【請求項５】糖タンパク質が標的細胞の細胞表面タンパ
ク質に対する抗体であることを特徴とする請求項１また
は２記載の結合体。
【請求項６】本来の形の核酸結合物質が糖タンパク質の
酸化された炭水化物鎖のアルデヒド基と反応しうる１つ
以上の官能基を有することを特徴とする請求項１〜５の
いずれか１項記載の結合体。
【請求項７】核酸結合物質が１つ以上の１級および／ま
たは２級アミノ基を有することを特徴とする請求項６記
載の結合体。
【請求項８】核酸結合物質がポリカチオン性ポリペプチ
ドであることを特徴とする請求項７記載の結合体。
【請求項９】核酸結合物質がポリリジンであることを特
徴とする請求項８記載の結合体。
【請求項１０】核酸結合物質がヒストンまたはプロタミ
ン、またはそのアナログまたはフラグメントからなる群
から選択される天然のDNA結合タンパク質であることを
特徴とする請求項８記載の結合体。
【請求項１１】ポリカチオンの正電荷の総計が約20〜50
0であることを特徴とする請求項８〜10のいずれか１項
記載の結合体。
【請求項１２】糖タンパク質を温和な条件で、炭水化物
部分に１つ以上のアルデヒド基を含む形に酸化し、か
つ、該酸化した糖タンパク質を該酸化した糖タンパク質
のアルデヒド基と反応しうる１つ以上の官能基を含む核
酸結合物質とカップリングすることを特徴とする、請求
項１〜11のいずれか１項記載の結合体を調製する方法。
【請求項１３】１つ以上の末端シアル酸を含む糖タンパ
ク質を使用することを特徴とする請求項12記載の方法。
【請求項１４】トランスフェリンを使用することを特徴
とする請求項13記載の方法。
【請求項１５】gp120を使用することを特徴とする請求
項13記載の方法。
【請求項１６】糖タンパク質を過ヨウ素酸で酸化するこ
とを特徴とする請求項12〜15のいずれか１項記載の方
法。
【請求項１７】核酸結合物質として１つ以上の１級およ
び／または２級アミノ基を有する化合物を使用すること
を特徴とする請求項12〜16のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】同種ポリカチオン性ポリペプチドを使用
することを特徴とする請求項17記載の方法。
【請求項１９】ポリリジンを使用することを特徴とする
請求項18記載の方法。
【請求項２０】カップリングが、糖タンパク質に対して
温和な条件下で選択的にシッフ塩基を還元する物質の存
在する、還元条件下で行なわれることを特徴とする請求
項17〜19記載の方法。
【請求項２１】カップリングをシアノホウ素化水素ナト
リウムの存在下で行なうことを特徴とする請求項20記載
の方法。
【請求項２２】糖タンパク質および核酸結合物質並びに
核酸または核酸アナログを含み、ヒトまたは動物細胞に
吸収される新しい複合体であって、該糖タンパク質と該
核酸結合物質が該糖タンパク質の１つ以上の炭水化物鎖
を介して結合していることを特徴とする複合体。
【請求項２３】結合体成分として請求項１〜11記載の結
合体の１つを含むことを特徴とする請求項22記載の複合
体。
【請求項２４】結合体のポリカチオンと同じ又は異なる
非共有結合ポリカチオンを更に含み、その結果、該結合
体による核酸のインターナリゼーションおよび／または
発現が増加することを特徴とする請求項22または23記載
の複合体。
【請求項２５】アンチセンス・オリゴヌクレオチドまた
はリボザイム、または、これらをコードする遺伝子の形
の阻害性核酸を含むことを特徴とする請求項22〜24のい
ずれか１項記載の複合体。
【請求項２６】ウイルス阻害性核酸を含むことを特徴と
する請求項25記載の複合体。
【請求項２７】オンコジーン阻害性核酸を含むことを特
徴とする請求項25記載の複合体。
【請求項２８】遺伝子または遺伝子断片の形で治療的ま
たは遺伝子治療的に活性な核酸を含むことを特徴とする
請求項22〜24のいずれか１項記載の複合体。
【請求項２９】高等真核細胞に核酸または核酸アナログ
を導入する方法であって、請求項22〜28記載の複合体の
１つを請求項１〜11記載の糖タンパク質結合体から調製
し、かつ、該糖タンパク質が結合する細胞表面タンパク
質を発現する細胞を該複合体と接触させることを含む、
前記方法。
【請求項３０】複合体をトランスフェリン結合体および
核酸から調製し、かつ、細胞のトランスフェクションの
ためにトランスフェリン・レセプター数が増加する条件
を使用することを特徴とする請求項29記載の方法。
【請求項３１】活性成分として請求項22〜28記載の複合
体の１つの形で１つ以上の治療的または遺伝子治療的に
活性な核酸を含む医薬製剤。