JP3347314B2 - Mouse adhesion molecule occludin - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、マウスのタイトジ
ャンクション（tight junction、以下「TJ」と記す）の
膜タンパク質オクルディンのアミノ酸配列およびそれを
コードするDNAに関する。The present invention relates to an amino acid sequence of a mouse tight junction (hereinafter referred to as "TJ") membrane protein occludin and a DNA encoding the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】多細胞
動物において、隣接する細胞との接着の情報は、細胞の
増殖、分化、炎症、癌転移などの生命現象の調節、維持
に深く関係している。接着に関与している細胞間接着分
子は細胞表面で集合して、接着のための特殊に分化した
膜領域をつくることが多い。とくに、上皮細胞におい
て、カドヘリンなどの細胞間接着分子は、その細胞質ド
メインで細胞骨格と強く結合していることが知られてい
る。このような膜領域は、細胞間接着装置と呼ばれ、主
として次の４つに分類されている。gap junction（G
J）、adherens junction（AJ）、desmosome およびtigh
tjunction（TJ）である。2. Description of the Related Art In a multicellular animal, information on adhesion to adjacent cells is closely related to the regulation and maintenance of life phenomena such as cell proliferation, differentiation, inflammation and cancer metastasis. ing. Intercellular adhesion molecules involved in adhesion often aggregate at the cell surface, creating a specialized differentiated membrane region for adhesion. In particular, in epithelial cells, intercellular adhesion molecules such as cadherin are known to be strongly bound to the cytoskeleton in their cytoplasmic domains. Such a membrane region is called an intercellular adhesion device, and is mainly classified into the following four. gap junction (G
J), adherens junction (AJ), desmosome and tigh
tjunction (TJ).

【０００３】これら接着装置は、最初電子顕微鏡下で同
定されたものであるが、構成タンパク質の解明研究によ
り、その生理学的病理学的意義の重要性が大きな注目の
的となっている。いわゆる接着分子と呼ばれるタンパク
質がこれら接着装置中に特異的に存在し、AJの接着分子
はカドヘリンであり現在までN−カドヘリン、P−カドヘ
リンなどいく種類ものカドヘリンが同定されている（Ta
keichi, M. et al.,Science, 251, 1451-1455, 199
1）。desmosome の接着分子としてはデスモグレン、デ
スモコリンであり、最近の研究により、その構造がカド
ヘリンに類似していることが判明した（Buxton, R. S.
et al., J. Cell Biol., 121, 481-484, 1993)。GJの接
着分子はコネキシンと呼ばれ、4個所の細胞膜貫通部位
を保有し、N末端C末端とも膜の細胞質側に出ていること
がわかっている。[0003] Although these bonding devices were first identified under an electron microscope, the importance of their physiological and pathological significance has attracted much attention due to research into the elucidation of constituent proteins. Proteins called so-called adhesion molecules are specifically present in these adhesion devices, and the adhesion molecule of AJ is cadherin, and various cadherins such as N-cadherin and P-cadherin have been identified to date (Ta).
keichi, M. et al., Science, 251, 1451-1455, 199
1). The adhesion molecules of desmosome are desmogren and desmocholine, and recent studies have revealed that its structure is similar to cadherin (Buxton, RS
et al., J. Cell Biol., 121, 481-484, 1993). The GJ adhesion molecule is called connexin and has four transmembrane sites and both N-terminal and C-terminal are known to be located on the cytoplasmic side of the membrane.

【０００４】TJは、上皮細胞と内皮細胞に特有の細胞間
接着装置で、そこでは隣り合う細胞の細胞膜が完全に密
着してみえる。TJは個々の細胞の周囲を取り巻いてい
て、細胞層をはさんだ管腔側と基底膜側との間の水溶性
分子の透過を遮る、あるいは調節するバリアとして機能
している。また、細胞膜をapical側とbasolateral 側に
仕切るフェンスとして働き、イオンチャンネル、ポンプ
などの膜タンパク質や、脂質の細胞膜上での極性をもっ
た分布を維持しているともいわれている（Schneeberge
r, E.E. et al.,Am. J. Physiol., 262,L647-L661, 199
2）。これらの機能により、細胞層をはさんだ両側で異
なる溶液組成からなる環境がつくられ、その細胞層の極
性が保たれるのであり、TJは多細胞生物においてきわめ
て基本的な重要な構造の1つといえる。[0004] TJ is an intercellular adhesion device peculiar to epithelial cells and endothelial cells, in which the cell membranes of adjacent cells appear to be completely adhered. TJs surround individual cells and function as barriers that block or regulate the penetration of water-soluble molecules between the luminal side and the basement membrane side of the cell layer. It also acts as a fence that partitions the cell membrane between the apical and basolateral sides, and is said to maintain the polar distribution of membrane proteins and lipids such as ion channels and pumps on the cell membrane (Schneeberge
r, EE et al., Am. J. Physiol., 262, L647-L661, 199
2). These functions create an environment consisting of different solution compositions on both sides of the cell layer, maintaining the polarity of the cell layer.TJ is one of the most fundamental and important structures in multicellular organisms. I can say.

【０００５】しかしながら、TJの分子構築の解析は他の
接着装置に比べて遅れており、これまでTJの接着分子そ
のものが同定されていなかったために、TJに関する分子
生物学的研究を進めるうえで大きな障害となっていた。[0005] However, the analysis of the molecular construction of TJ has been delayed compared to other adhesion devices, and the adhesion molecule itself of TJ has not been identified so far. Was an obstacle.

【０００６】本発明者はラット肝臓からのAJ分離法を確
立し、この分離したAJからラディキシン、ZO−1など多
くのタンパク質を同定してきた（Tsukita, Sh. et al.,
Curr. Opin. Cell Biol., 4, 834-839, 1992）。ZO−1
に関する研究およびAJとTJの組織学的知見から、AJ中の
タンパク質はTJのタンパク質も含んでいることが予想さ
れた。そこで、ニワトリ（chic）肝臓よりAJを分離し、
このAJを抗原とするモノクローナル抗体を作製しTJと特
異的に反応する抗体を用いて、TJ構成タンパク質の構造
解析を行った。その結果、公知のタンパク質と類似しな
い新規構成タンパク質の構造解析に成功し、オクルディ
ンと命名した（Furuse, M. et al., J.Cell Biol., 12
3, 1777-1788, 1993) 。The present inventors have established a method for separating AJ from rat liver, and have identified many proteins such as radixin and ZO-1 from the separated AJ (Tsukita, Sh. Et al.,
Curr. Opin. Cell Biol., 4, 834-839, 1992). ZO-1
Studies on AJ and the histological findings of AJ and TJ suggested that the proteins in AJ also contained TJ proteins. Therefore, AJ was isolated from chicken liver,
A monoclonal antibody using this AJ as an antigen was prepared, and the structural analysis of a TJ-constituting protein was performed using an antibody that specifically reacts with TJ. As a result, we succeeded in structural analysis of a novel constituent protein that is not similar to a known protein and named it occludin (Furuse, M. et al., J. Cell Biol., 12
3, 1777-1788, 1993).

【０００７】このニワトリオクルディンは504個のアミ
ノ酸からなる56KDaのタンパク質で、最大の特徴はN末端
部半分に4ヶ所の膜貫通領域を有し、N末端とC末端を細
胞質に向け、細胞外に2つのループを持つタンパク質で
ある。[0007] This chicken occludin is a 56 kDa protein consisting of 504 amino acids. The most distinctive feature is that it has four transmembrane domains in the N-terminal half, directs the N-terminal and C-terminal to the cytoplasm, A protein with two loops.

【０００８】その後の研究によりオクルディンが、細胞
レベルおよび生体全体レベルにおいてTJ生理機能の解析
に重要な因子であることが推察され、非常に大きな注目
を集めた。[0008] Subsequent studies have suggested that occludin is an important factor in the analysis of TJ physiology at the cellular level and the whole organism level, and has received a great deal of attention.

【０００９】しかしながらニワトリというヒトとかなり
かけ離れた種の起源であることから、それ以上全く研究
は進展せず、TJの生理機構の解明および医学的解析のた
めにはヒト等の哺乳動物由来オクルディンの構造解析が
待望された。この目的のためにこの分野において世界的
な競争が行われていたにも拘わらず、未だヒト等の哺乳
動物オクルディンの解明は成功していない。[0009] However, since the origin of the species is very different from that of humans, chickens, no further research has been progressed. For elucidation of the physiological mechanism of TJ and medical analysis, occludin derived from mammals such as humans has been developed. Structural analysis has been anticipated. Despite global competition in this field for this purpose, elucidation of mammalian occludins, such as humans, has not been successful.

【００１０】上記現状に鑑み、本発明の目的は、マウス
のオクルディンのアミノ酸配列およびそれをコードする
DNAを提供することにある。[0010] In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a mouse occludin amino acid sequence and encode it.
To provide DNA.

【００１１】[0011]

【課題を解決するための手段】Roy らはヒトneuronal a
poptosis inhibitory protein （NAIP）の遺伝子を報告
したが、その中でNAIP遺伝子の欠失体において、ニワト
リオクルディンのＣ末端部と類似の塩基配列を保有する
DNA断片が存在することを報告した（Roy, N.etal.,Cel
l,80,167-178,1995）。そこで本発明者は、この配列が
実際にオクルディンのヒト相同体の一部をコードしてい
るか否かを決定するために、ニワトリオクルディンとの
類似塩基配列からプライマーを選択し、ヒト腸管上皮T8
4細胞株のcDNAライブラリーをPCRの鋳型として鋭意スク
リーニングした結果、ヒトオクルディンの全構造解析に
成功した。さらにマウスのオクルディン解析も完成さ
せ、抗オクルディンモノクロナール抗体を作成し、組織
染色により、TJの膜貫通型タンパク質であることを確認
した。[Means for Solving the Problems] Roy et al.
We reported the gene for poptosis inhibitory protein (NAIP), and in the deletion of NAIP gene, it has a nucleotide sequence similar to the C-terminal part of chicken occludin.
Reported the presence of DNA fragments (Roy, N. et al., Cel
1, 80, 167-178, 1995). Therefore, the present inventors selected a primer from a similar nucleotide sequence to chicken occludin to determine whether this sequence actually encodes a part of a human homolog of occludin, and selected human intestinal epithelial T8
As a result of extensive screening of the cDNA libraries of the four cell lines as PCR templates, we succeeded in analyzing the entire structure of human occludin. Furthermore, mouse occludin analysis was completed, an anti-occludin monoclonal antibody was prepared, and tissue staining confirmed that it was a transmembrane protein of TJ.

【００１２】本発明は、マウスのオクルディンアミノ酸
配列、それをコードするDNA、抗オクルディン抗体およ
びそれらを利用する遺伝子解析法に関するものであっ
て、 1)配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するマウスオク
ルディンをコードする、配列番号２に記載のDNA、 2)配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、マウスオ
クルディン、 3)マウスオクルディンのアミノ酸配列のうち1若しくは
数個のアミノ酸が、付加、欠失若しくは置換されたアミ
ノ酸配列を有するオクルディン改変体、及びこれら改変
体をコードするDNA、 4)マウスオクルディンおよびそれらの改変体をコードす
るDNAのいずれかを含有するベクター、 5)前記ベクターを保持する形質転換体、 6)前記の形質転換体を培養し、発現産物を回収すること
を含む、オクルディンタンパク質の製造方法、 7)配列番号２に記載の塩基配列の全部または一部を含む
ものからなるDNAプローブ、 8)配列番号２に記載の塩基配列の一部を含むものからな
るDNAプライマー、 9)マウスオクルディンタンパク質と特異的に結合するポ
リクロナール抗体またはモノクロナール抗体、 10)抗オクルディン抗体を用いることを特徴とする生体
資料中のオクルディンの測定法方および測定試薬、 11)上記DNAプライマー又はDNAプローブを用いることを
特徴とする生体試料中のオクルディン遺伝子の解析方
法、 12)オクルディンを発現している細胞と被検物質を共存
させた後、該細胞のオクルディン遺伝子の発現量をDNA
プライマー又はDNAプローブを用いて解析することを特
徴とする、オクルディンの発現に影響を与える薬物のス
クリーニング方法、 13)オクルディンDNAをノックアウトした実験動物、に関
する。The present invention relates to a mouse occludin amino acid sequence, a DNA encoding the same, an anti-occludin antibody, and a gene analysis method utilizing the same. 2) a mouse occludin having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; 3) one or several amino acids of the amino acid sequence of mouse occludin are added, deleted or Occludin variants having a substituted amino acid sequence, and DNAs encoding these variants, 4) a vector containing any of mouse occludin and DNAs encoding the variants, 5) transformation carrying the vector 6) culturing the transformant and recovering the expression product, A protein production method, 7) a DNA probe comprising all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 8) a DNA primer comprising a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 9) polyclonal antibody or monoclonal antibody that specifically binds to mouse occludin protein, 10) method and reagent for measuring occludin in biological material, which comprises using an anti-occludin antibody, 11) the above DNA primer or DNA A method for analyzing an occludin gene in a biological sample, which comprises using a probe;
The present invention relates to a method for screening for a drug that affects the expression of occludin, characterized by analyzing using a primer or a DNA probe, and 13) an experimental animal in which occludin DNA has been knocked out.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】本発明者が哺乳動物オクルディン
相同体の同定に成功したことにより、TJの構成や機能を
構造的に且つ機能的に分子レベルで試験することができ
る。種々のタイプの培養したマウス細胞を使用して、オ
クルディン遺伝子発現を調節するかまたはアンチセンス
プローブ若しくは抗体でオクルディンの機能を阻害する
ことによって、TJのバリヤーおよびフェンス機能並びに
これに関与する調節メカニズムを実験的に分析すること
ができる。例えば、オクルディンcDNAの過剰発現によっ
て、フリーズフラクチャーレプリカに見られるTJストラ
ンド数が増加し、バリヤー機能が付随的に向上するかど
うかを今や決定することができる。さらに本発明によ
り、TJの機能に影響を及ぼす薬物の簡便なスクリーニン
グ法の樹立を可能にした。例えば、オクルディンを発現
している種種の細胞を用い、検体と反応させた後、細胞
のオクルディン遺伝子又はオクルディンタンパク質の発
現量を測定することにより、TJの機能に影響を及ぼす薬
物をスクリーニングすることができる。遺伝子の解析
は、DNAプローブ又はプライマーなどを用いて行うこと
ができる。例えば、検体試料から常法によりRNAまたはD
NAを抽出し、必要に応じて前処理後、メンブレンまたは
ゲル上で電気泳動を行った後、ラベルしたDNAプローブ
とハイブリダイズさせるノザンブロット法又はサザンブ
ロット法、ゲノムDNAやcDNAを鋳型として、適切な位置
に相当する約20塩基程度のプライマーを用いて目的DNA
を増幅させるPCR法など公知の方法で行うことができ
る。オクルディンタンパク質は、例えば抗体を用いて定
量することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The successful identification of mammalian occludin homologues by the present inventor makes it possible to test the structure and function of TJ structurally and functionally at the molecular level. Various types of cultured mouse cells can be used to modulate Tcl barrier and fence functions and the regulatory mechanisms involved by modulating occludin gene expression or inhibiting occludin function with antisense probes or antibodies. It can be analyzed experimentally. For example, it can now be determined whether overexpression of occludin cDNA increases the number of TJ strands found in freeze-fracture replicas and concomitantly enhances barrier function. Furthermore, the present invention has made it possible to establish a simple screening method for drugs that affect the function of TJ. For example, using a variety of cells expressing occludin, reacting with a sample, and then measuring the expression level of the occludin gene or occludin protein in the cells, it is possible to screen for a drug that affects the function of TJ. it can. Gene analysis can be performed using a DNA probe or primer. For example, RNA or D
After extracting NA, performing pretreatment if necessary, performing electrophoresis on a membrane or gel, and then hybridizing with a labeled DNA probe, Northern blotting or Southern blotting, using genomic DNA or cDNA as a template, Target DNA using a primer of about 20 bases corresponding to the position
Can be performed by a known method such as a PCR method for amplifying DNA. Occludin protein can be quantified using, for example, an antibody.

【００１４】また、種々のタイプの突然変異およびオク
ルディン遺伝子ノックアウトマウスを作成することによ
って、TJ形成が種々の器官の形態形成にどのように関与
しているのか、そしてTJの機能不全が炎症や腫瘍転移の
ような種々の病理学的状態に関係があるのかどうかを知
ることが可能となる。TJ機能、特にそのバリヤー機能の
調節の可能性も医薬品の透過性に関連して興味がある。
かくして、脳上皮細胞中でのオクルディン合成の上方ま
たは下方調節によって血液−脳関門を調節することが可
能であろう。腸からの医薬品吸収を調節するためには腸
上皮細胞内でのTJ機能の調節が必要である。このよう
に、TJの機能を調節する薬物をスクリーニングして効果
を有する物質を投与することにより、医薬品の吸収調
節、特に脳内への移行を調節することが可能となる。こ
のように本発明は、血液−脳関門を中心とする生理的機
構の解明、病態の解析、診断、治療に大きく期待され
る。[0014] By creating various types of mutant and occludin gene knockout mice, we have also shown how TJ formation is involved in morphogenesis of various organs, and that TJ dysfunction is associated with inflammation and tumors. It is possible to know whether it is involved in various pathological conditions such as metastasis. The possibility of modulating the TJ function, especially its barrier function, is also of interest in relation to the permeability of pharmaceuticals.
Thus, it would be possible to regulate the blood-brain barrier by up- or down-regulation of occludin synthesis in brain epithelial cells. Regulation of TJ function in intestinal epithelial cells is required to regulate drug absorption from the intestine. As described above, by screening for a drug that regulates the function of TJ and administering a substance having an effect, it becomes possible to regulate the absorption of a drug, in particular, to control the translocation into the brain. As described above, the present invention is greatly expected for elucidation of a physiological mechanism centering on the blood-brain barrier, analysis of a disease state, diagnosis, and treatment.

【００１５】本発明のＤＮＡは、その一部をプライマー
またはプローブとして用いることにより、オクルディン
タンパク質の遺伝子解析や遺伝子の発現の解析に利用す
ることができる。一部とは、プライマーまたはプローブ
として使用するオリゴヌクレオチドが本発明のDNA配列
をもとに少なくとも10個の対応する塩基配列を含むもの
からなり、好ましくは少なくとも15個の塩基配列、さら
に好ましくは約20〜30個の塩基配列を含むものからなる
対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブと
しては、さらに高分子のもの、全DNAも使用することが
できる。By using a part of the DNA of the present invention as a primer or a probe, it can be used for gene analysis of occludin protein and gene expression analysis. The part includes an oligonucleotide used as a primer or a probe comprising at least 10 corresponding nucleotide sequences based on the DNA sequence of the present invention, preferably at least 15 nucleotide sequences, and more preferably about It means the corresponding polynucleotide consisting of one containing 20 to 30 base sequences. Further, as the probe, a high-molecular-weight probe and total DNA can also be used.

【００１６】オクルディンの機能を調節する手段の一つ
として、アンチセンスDNA又はアンチセンスRNAを用いる
方法がある。DNA複製、転写、翻訳などの遺伝子発現の
各段階において、遺伝子の情報が読みとられなくして発
現の流れを遮断する方法であって、この遮断に核酸ある
いはそのアナログを用いる方法がアンチセンス法である
（Wickstrome, E., ed., Prospects for Antisense Nuc
leic Acid TheraphyofCancer and AIDs.Wiley-Liss, Ne
w York, 1991）。本発明のオクルディンDNAを解明した
ことにより、アンチセンス法によりオクルディンの機能
を抑制させる手段を可能とした。DNAオリゴマーの長さ
は二重鎖形成能、膜透過性、塩基配列特異性が関係し、
少なくとも６個、好ましくは少なくとも10 mer,通常15
から30 merを用いることができる。配列は本発明DNA配
列に基づいて適宜選択し、実験確認することができる。
通常、オリゴマーの安定性を増すために、リン酸基、糖
部分、3', 5'末端に化学修飾を施させる（Cook, P.D.,
Anticancer Drig Des., 5,585, 1991）。代表的アナロ
グはヌクレオシド間のホスホジエステル基の酸素原子の
一つを硫黄原子に置換したオリゴホスホロサイオエー
ト、メチル基に置換したオリゴメチルホスホネートであ
って、いずれもヌクレアーゼに対してきわめて安定とな
る。その他ハイブリッド二重鎖の安定性を増すためにア
クリジンやポリリジンを結合させたオリゴマー、Ｎ-メ
チルチミジレートを含むオリゴマーなどが用いられる。
これらオリゴマーは公知の化学合成法により合成するこ
とができる。また、本発明DNAから導かれるアンチセン
スRNAも利用できる。As one of means for regulating the function of occludin, there is a method using antisense DNA or antisense RNA. At each stage of gene expression such as DNA replication, transcription, and translation, the gene information cannot be read and the expression flow is interrupted. (Wickstrome, E., ed., Prospects for Antisense Nuc
leic Acid TheraphyofCancer and AIDs.Wiley-Liss, Ne
w York, 1991). The elucidation of the occludin DNA of the present invention has made possible a means for suppressing the function of occludin by the antisense method. The length of the DNA oligomer is related to the ability to form a duplex, membrane permeability, and base sequence specificity.
At least 6, preferably at least 10 mer, usually 15
To 30 mer can be used. The sequence can be appropriately selected based on the DNA sequence of the present invention, and can be confirmed experimentally.
Usually, chemical modification is applied to the phosphate group, sugar moiety, and 3 ', 5' end to increase the stability of oligomers (Cook, PD,
Anticancer Drig Des., 5,585, 1991). Representative analogs are oligophosphorothioate, in which one of the oxygen atoms of the phosphodiester group between nucleosides is substituted with a sulfur atom, and oligomethylphosphonate, in which one is substituted with a methyl group, both of which are extremely stable to nucleases . In order to increase the stability of the hybrid duplex, oligomers to which acridine or polylysine is bound, oligomers containing N-methylthymidylate, and the like are used.
These oligomers can be synthesized by a known chemical synthesis method. Further, antisense RNA derived from the DNA of the present invention can also be used.

【００１７】本発明のオクルディンタンパク質の全部ま
たは一部（部分）をエピトープとして用い、抗体の作
成、およびその抗体を用いる研究用、診断用試薬として
利用することができる。エピトープとは、ポリペプチド
の抗原決定基を意味し、一般に少なくとも６個のアミノ
酸で構成され、６個のアミノ酸で構成されるポリペプチ
ドが抗体と結合することは公知である（公表特許公報60
-500684 号）。本タンパク質の抗原ペプチドは、本発明
のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少なくとも6
個のアミノ酸、好ましくは連続してなる少なくとも8個
のアミノ酸、より好ましくは連続してなる少なくとも約
15個のアミノ酸、さらに好ましくは連続してなる少なく
とも約20個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味す
る。本発明のオクルディンはそのアミノ酸配列から、ニ
ワトリオクルディンと同様にＮ末端部半分に４カ所の膜
貫通領域を有し、N末端とC末端を細胞質に向け、細胞外
に２つのループを持つタンパク質である。ヒトオクルデ
ィンの場合、アミノ酸89〜135位および196〜243位部分
が細胞外に位置すると予想されることから、抗原部位を
目的に応じて選択することにより、各種の抗体を作成す
ることができ、それらを使い分けることによりTJの機能
解明手段、抗体によるTJ機能抑制手段として利用するこ
とができる。また、部分ペプチドは、部分ペプチドと結
合性を有する化合物のスクリーニング手段として利用す
ることも可能である。The whole or a part (part) of the occludin protein of the present invention can be used as an epitope to prepare an antibody and to use it as a reagent for research and diagnosis using the antibody. Epitope refers to an antigenic determinant of a polypeptide, which is generally composed of at least 6 amino acids, and it is known that a polypeptide composed of 6 amino acids binds to an antibody (Publication No. 60).
-500684). The antigenic peptide of the present protein has at least 6 contiguous sequences based on the amino acid sequence of the present invention.
Amino acids, preferably at least 8 contiguous amino acids, more preferably at least about contiguous
A polypeptide of 15 amino acids, more preferably at least about 20 contiguous amino acids is meant. From the amino acid sequence, the occludin of the present invention is a protein having four transmembrane regions in the half of the N-terminus, the N-terminus and the C-terminus directed to the cytoplasm, and having two extracellular loops, like chicken occludin. is there. In the case of human occludin, amino acids 89-135 and 196-243 are expected to be located extracellularly, so that various antibodies can be prepared by selecting an antigen site according to the purpose, By properly using them, they can be used as a means for elucidating the function of TJ and a means for suppressing TJ function by an antibody. Further, the partial peptide can be used as a screening means for a compound having a binding property to the partial peptide.

【００１８】本発明のオクルディンのアミノ酸配列にお
いて、1若しくは数個のアミノ酸が、付加、欠失若しく
は置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明
に含まれる。 (1) cDNAライブラリーの作製およびオクルディンの構
造解析 RNAの調製は、ヒトまたは動物の細胞（株）を原料とし
て、例えばグアニジンチオシアネート、界面活性剤、キ
レート剤および還元剤の混合溶液にて抽出を行った後、
フェノール抽出、有機溶媒分画（Chamezynski et al.,
Anal, Biochem., 162, 156, 1987）、次いで密度勾配超
遠心操作により行うことができる。得られた RNAを鋳型
として用い、ランダムプライマー、逆転写酵素、DNA ポ
リメラーゼ等を用いるcDNA合成法（Gubler, U. et al.,
Gene, 25, 263, 1983）などの常法により、2本鎖 DNA
を調製し、得られた2本鎖 DNAを、常法に従い、バクテ
リオファージ、例えばλzap 、λgtllなどに組み込みcD
NAライブラリーを作製することができる。また市販のcD
NAライブラリーを使用することも可能である。The present invention also includes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been added, deleted or substituted in the amino acid sequence of occludin of the present invention. (1) Preparation of cDNA library and structural analysis of occludin RNA is prepared by extracting human or animal cells (strain) with a mixed solution of, for example, guanidine thiocyanate, a surfactant, a chelating agent and a reducing agent. After going,
Phenol extraction, organic solvent fractionation (Chamezynski et al.,
Anal, Biochem., 162, 156, 1987), followed by density gradient ultracentrifugation. Using the obtained RNA as a template, a cDNA synthesis method using random primers, reverse transcriptase, DNA polymerase, etc. (Gubler, U. et al.,
Gene, 25, 263, 1983) and double-stranded DNA
Is prepared, and the resulting double-stranded DNA is incorporated into a bacteriophage, for example, λzap, λgtll, etc., according to a conventional method.
An NA library can be created. Also commercially available cD
It is also possible to use NA libraries.

【００１９】次いで、Roy らの報告の中で、ニワトリオ
クルディンＣ末端部と類似した塩基配列をもとに適切に
プライマー部位を選択し、常法の PCR法により DNAを増
幅させ、サブクローニングすることにより、オクルディ
ンDNA 由来と予想されるDNA断片を得ることができる。
次いで、この断片をプローブとしてcDNAライブラリーを
スクリーニングし、単離したクローンの塩基配列を解析
することによりオクルディン全長cDNAを得ることができ
る。塩基配列の構造は、マキサム・ギルバート法（Maxa
m, A. M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 560, 1977） あるいはジデオキシ法（Sanger,
F., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74, 5463, 1977）に
よって決められる。その塩基配列をもとにアミノ酸配列
が演繹される。これら遺伝子の操作は通常行われる公知
の方法により実施することができ、例えばMolecular Cl
oning. A Laboratory Manual., T.Manitisら編集（198
9）,Cold Spring Harbor Laboratoryに記載の方法に準
じて行うことができる。 (2) 抗体の調製 本発明のモノクローナル抗体の調製はマウスのオクルデ
ィンを抗原とし、必要に応じてキャリアー蛋白との複合
体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動
物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を
骨髄腫細胞と融合し、オクルディンに強い特異性を示す
抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調
製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。Next, in the report of Roy et al., A primer site was appropriately selected based on a nucleotide sequence similar to that of the chicken C-terminal, and DNA was amplified by a conventional PCR method, followed by subcloning. Thus, a DNA fragment expected to be derived from occludin DNA can be obtained.
Next, a cDNA library is screened using this fragment as a probe, and the nucleotide sequence of the isolated clone is analyzed to obtain a full-length occludin cDNA. The structure of the nucleotide sequence was determined by the Maxam-Gilbert method (Maxa
m, AM and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 560, 1977) or the dideoxy method (Sanger,
Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). An amino acid sequence is deduced based on the base sequence. The manipulation of these genes can be performed by a commonly known method, for example, Molecular Cl
oning. A Laboratory Manual., edited by T. Manitis et al. (198
9) It can be carried out according to the method described in Cold Spring Harbor Laboratory. (2) Preparation of Antibody The monoclonal antibody of the present invention is prepared by using mouse occludin as an antigen, forming a complex with a carrier protein if necessary, and inoculating the animal with the complex. It is prepared by fusing antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph node of the above-mentioned immunized animal with myeloma cells, and selecting a hybridoma that produces an antibody exhibiting strong specificity for occludin. The operation may be in accordance with a conventionally known method.

【００２０】免疫抗原としては天然精製品、遺伝子組換
手法あるいは化学合成手法による生産品などいずれも使
用できる。遺伝子組換手法によるオクルディンの調製
は、オクルディンをコードするｃＤＮＡをオクルディン
の発現に適したベクターのプロモター下流に制限酵素と
ＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合して組
換え発現ベクターを作製することでできる。ベクターは
宿主内で複製、増幅可能であれば特に限定されない。プ
ロモーターおよびターミネーターに関してもオクルディ
ンをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応
したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な
組み合わせも可能である。このようにして得られた組換
え発現ベクターはコンピテント細胞法（J. Mol. Biol.,
53, 154,1970）、リン酸カルシウム法（Science, 221,
551, 1983 ）などにより宿主に導入し、形質転換体が
作製される。宿主としては大腸菌および動物細胞などが
用いられ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切
な培地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜
８の範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われ
る。培養物からのオクルディンの分離、精製は公知の分
離、精製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これら
の公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過
法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどが挙げられる。As the immunizing antigen, any of natural purified products, products produced by genetic recombination techniques or chemical synthesis techniques can be used. Preparation of occludin by a gene recombination technique involves recombining cDNA encoding occludin downstream of a promoter suitable for occludin expression by a known method using restriction enzymes and DNA ligase to prepare a recombinant expression vector. Can be done. The vector is not particularly limited as long as it can be replicated and amplified in the host. The promoter and terminator are not particularly limited as long as they correspond to the host used for the expression of the nucleotide sequence encoding occludin, and an appropriate combination is possible according to the host. The recombinant expression vector thus obtained is used for the competent cell method (J. Mol. Biol.,
53, 154, 1970), calcium phosphate method (Science, 221,
551, 1983) to obtain a transformant. Escherichia coli and animal cells are used as a host, and the obtained transformant is cultured in an appropriate medium according to the host. Culture is usually at 20 ° C to 45 ° C, pH5
8 and, if necessary, aeration and stirring. The separation and purification of occludin from the culture may be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known methods include salting out, solvent precipitation, dialysis gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, and the like.

【００２１】免疫抗原オクルディンは全構造を保有して
いることが好ましいが、部分構造を有するフラグメント
あるいはペプチドであってもよく、オクルディンの全ア
ミノ酸配列から適宜選択することができる。フラグメン
トあるいはペプチドの調製は化学合成法、上記遺伝子組
換法あるいは天然物の分解の方法などが用いられる。The immunizing antigen occludin preferably has the entire structure, but may be a fragment or peptide having a partial structure, and can be appropriately selected from the entire amino acid sequence of occludin. For the preparation of the fragment or peptide, a chemical synthesis method, the above-described gene recombination method, a method for decomposing a natural product, or the like is used.

【００２２】抗原とキャリア蛋白の複合体の調製は種々
の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用
できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロ
ブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、
通常1〜5倍量の割合でカップリングさせる方法が用いら
れる。Various condensing agents can be used for preparing the complex of the antigen and the carrier protein, and glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester and the like can be used. Carrier protein may be commonly used such as bovine serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin,
Usually, a method of coupling at a ratio of 1 to 5 times is used.

【００２３】免疫される動物としてはマウス、ラット、
ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、
筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全
フロイントアジュバンドや不完全フロイントアジュバン
ドと混和して投与してもよく、投与は通常2〜5週毎に1
回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ
節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合さ
せられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞と
してはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、
抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましい
が、異種間においても可能な場合もある。Animals to be immunized are mice, rats,
Rabbits, guinea pigs, etc.
Administered intramuscularly or intraperitoneally. For administration, it may be mixed with complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant, and the administration is usually performed every 2 to 5 weeks.
It is performed one by one. Antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph node of the immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hybridomas. As myeloma cells, those derived from mice, rats, humans, etc. are used,
It is preferably derived from the same species as the antibody-producing cells, but it may be possible between different species.

【００２４】細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケ
ーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 197
5）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、
通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平
均分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30
〜37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は
通常1:1〜10:1程度、約1〜10分間程度反応させることに
より細胞融合を実施することができる。The operation of cell fusion is performed by known methods, for example, the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495, 197).
Can be implemented according to 5). Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol and Sendai virus.
Usually 20 to 40 ° C., preferably 30 to 40% using polyethylene glycol (average molecular weight 1000 to 4000) at a concentration of about 20 to 50%.
Cell fusion can be carried out by reacting at a temperature of about 37 ° C., usually at a ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells of about 1: 1 to 10: 1, for about 1 to 10 minutes.

【００２５】抗オクルディン抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用でき
る。たとえば、オクルディンをコートしたマイクロプレ
ートを用いるＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorben
t assay ）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイ
クロプレートを用いるＥＩＡ（Enzyme immunoassay）
法、オクルディンを含むサンプルを電気泳動後ニトロセ
ルロース転写膜を用いるウエスタンブロット法などがあ
げられる。Various immunochemical methods can be used for screening anti-occludin antibody-producing hybridomas. For example, an ELISA using an occludin-coated microplate (Enzyme-linked immunosorben
t assay) method, EIA (Enzyme immunoassay) using microplate coated with anti-immunoglobulin antibody
And a Western blot method using a nitrocellulose transfer membrane after electrophoresis of a sample containing occludin.

【００２６】このようなウエルから更に例えば限界希釈
法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブ
リドーマの選別、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児
血清を含む動物細胞用培地（例、RPMI 1640）で行われ
る。このようにして得られたクローンはあらかじめブリ
スタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内へ移植し、10〜
14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取
し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クロ
ーンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすること
もできる。モノクローナル抗体の回収は免疫グロブリン
の精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、
硫安分画法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィー
などの手段により容易に達成することができる。From such wells, cloning is further performed, for example, by a limiting dilution method to obtain a clone. Hybridoma selection and breeding are usually performed in an animal cell culture medium (eg, RPMI 1640) containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) and containing 10 to 20% fetal calf serum. The clones thus obtained were transplanted intraperitoneally into BALB / C mice to which blisters had been administered in advance, and 10 to
After 14 days, ascites containing a high concentration of the monoclonal antibody is collected and used as a raw material for antibody purification. Alternatively, the clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material for antibody purification. The monoclonal antibody may be recovered by a method known as a method for purifying immunoglobulins.
It can be easily achieved by means such as ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, use of an anion exchanger, and affinity chromatography.

【００２７】本発明によって得られた抗オクルディンモ
ノクローナル抗体を用いる免疫学的方法により生体試料
中のオクルディンの定性、定量を行うことができる。免
疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処
理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした試料につい
て、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合
法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することがで
きる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直
接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる
間接法などにより行ないうる。標識化剤としては螢光物
質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質
はいずれも使用できる。The qualitative and quantitative determination of occludin in a biological sample can be carried out by an immunological method using the anti-occludin monoclonal antibody obtained according to the present invention. As an immunological method, a biological sample is appropriately processed as necessary, for example, a sample obtained by performing cell separation, extraction, etc., is subjected to immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, agglutination, competition, sandwich, and the like. Method can be applied. The immunohistological staining method can be performed, for example, by a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody to the antibody, or the like. Any known labeling substance such as a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme, a metal, and a dye can be used as the labeling agent.

【００２８】本発明のモノクローナル抗体はFc'あるい
はFc領域を除去したFab'あるいはFab画分、あるいはそ
の重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化
抗体、ヒト抗体であってもよい。The monoclonal antibody of the present invention may use Fab 'or Fab fraction from which Fc' or Fc region has been removed, or a polymer thereof. The chimeric antibody, humanized antibody, and human antibody may also be used.

【００２９】[0029]

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。EXAMPLES The present invention will be described in detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００３０】参考例1．ヒトオクルディンの構造解析 ヒトNAIP欠損遺伝子の一部に見られる、ニワトリオクル
ディンC末端部と類似している塩基配列をもとに、配列
番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用い、PCRを実施した。λgt11 cDNA ライブラ
リーはヒト腸管上皮細胞下部T84を原料としてpoly(A)+R
NA を精製し、TimeSaver cDNA synthesis kit（商品
名、ファルマシア LKBバイオテクノロジ−社製）および
GIGAPACK IIPackaging Extract （ストラテジ−ン社）
を用いて作製した。このライブラリーをPCRの鋳型とし
て上記二つのプライマーを用いてPCRを実施した結果、3
63bpcDNA断片が得られた。Reference Example 1 Structural analysis of human occludin Based on the nucleotide sequence similar to the chicken occludin C-terminal part found in a part of the human NAIP-deficient gene, PCR was performed using the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 5 and 6 as primers. Carried out. λgt11 cDNA library is poly (A) + R using human intestinal epithelial cell lower T84 as raw material.
NA was purified, and TimeSaver cDNA synthesis kit (trade name, manufactured by Pharmacia LKB Biotechnology) and
GIGAPACK IIPackaging Extract (Strategine)
It was produced using. As a result of performing PCR using the above two primers with this library as a template for PCR, 3
A 63 bpc DNA fragment was obtained.

【００３１】この DNA断片を DIG labeling kit （商品
名、ベ−リンガ−マンハイム社製）を用いて DIGラベル
した後、これをプローブとして同ライブラリーをスクリ
ーニングした。その結果、３個のcDNAクローンを単離
し、これらのインサ−ト部位を切り出し、pBluescript
SK(-) にサブクロ−ニングした。このうち、phＯc6とph
Ｏc16 のクローンが全ORFを含むと予想されたので、こ
の二つのクローン両鎖の塩基配列を解析した結果、ヒト
オクルディン全構造をコ−ドする塩基配列であることを
確認した。塩基配列は7-deaza Sequenase Version Deox
y Terminator CycleSequencing Kit（商品名、アプライ
ドバイオシステム社製）を用いて決定した。配列番号４
に塩基配列を、それから演繹されるアミノ酸配列を配列
番号３に示した。なお、ヒトオクルディンcDNAを含有す
る Esherichia Coli JM 109は1996年3月15日、受託番号
FERM BP-5477として通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（あて名： 日本国茨城県つくば市東1丁
目1番3号（郵便番号305））に寄託された。This DNA fragment was DIG-labeled using a DIG labeling kit (trade name, manufactured by Boehringer Mannheim), and the library was screened using this as a probe. As a result, three cDNA clones were isolated, their insert sites were cut out, and pBluescript
Sub-cloned to SK (-). Of these, phOc6 and ph
Since the Oc16 clone was expected to contain the entire ORF, the nucleotide sequences of both chains of the two clones were analyzed, and it was confirmed that the nucleotide sequence encodes the entire structure of human occludin. The nucleotide sequence is 7-deaza Sequenase Version Deox
y Determined using the Terminator CycleSequencing Kit (trade name, manufactured by Applied Biosystems). SEQ ID NO: 4
And the amino acid sequence deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 3. Esherichia Coli JM109 containing human occludin cDNA was deposited on March 15, 1996 under the accession number
Deposited as FERM BP-5477 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (address: 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, postal code 305).

【００３２】実施例1. マウスオクルディンの構造解析 マウスオクルディンの構造を、参考例１と同じ手法によ
り、マウス肺細胞から作製した、λgt10 cDNA ライブラ
リーを用いて決定した。マウスオクルディンの塩基配列
およびアミノ酸配列は、配列番号２および１に示した。Example 1 Structural Analysis of Mouse Occludin The structure of mouse occludin was determined using the λgt10 cDNA library prepared from mouse lung cells in the same manner as in Reference Example 1. The nucleotide sequence and amino acid sequence of mouse occludin are shown in SEQ ID NOs: 2 and 1.

【００３３】実施例2. 脳血管細胞におけるオクルディ
ンの発現 脳血管内皮細胞は、末梢血管内皮細胞と異なり、高電気
抵抗ＴＪを有しており、高電気抵抗TJは脳−血液関門を
形成していると考えられていることから、高電気抵抗TJ
を有する培養豚脳血管内皮細胞（PBEC）と低電気抵抗TJ
を有する培養豚大動脈内皮細胞（PAEC）のオクルディン
の分布、発現を検討した。Example 2 Expression of Occludin in Cerebral Vascular Cells Cerebral vascular endothelial cells, unlike peripheral vascular endothelial cells, have a high electrical resistance TJ, which forms a brain-blood barrier. High electrical resistance TJ
Porcine brain endothelial cells (PBEC) with low electrical resistance and low electrical resistance TJ
The distribution and expression of occludin in cultured porcine aortic endothelial cells (PAECs) with E. coli were investigated.

【００３４】豚オクルディンcDNA断片は、ヒトオクルデ
ィンDNA配列（配列番号４）の1359-1391位センス鎖（配
列番号５）および1692-1721位アンチセンス鎖（配列番
号６）をプライマーとしてPCR法により増幅し363塩基断
片を調製した。該断片の塩基配列の解析に基づく、その
コードするアミノ酸配列はヒト及びマウスオクルディン
のアミノ酸配列と高い相同性を示し、豚オクルディンの
cDNAであることを確認した。³²Pラベルした該断片をプ
ローブとして使用した。The pig occludin cDNA fragment was amplified by PCR using the sense strand (SEQ ID NO: 5) at positions 1359-1391 and the antisense strand (SEQ ID NO: 6) at positions 1692-1721 of the human occludin DNA sequence (SEQ ID NO: 4) as primers. Then, a 363 base fragment was prepared. Based on the nucleotide sequence analysis of the fragment, the amino acid sequence encoded by the fragment shows high homology with the amino acid sequences of human and mouse occludin.
It was confirmed to be cDNA. ^{The 32} P-labeled fragment was used as a probe.

【００３５】培養細胞からのmRNAの調製はRNA分離キッ
ト（ストラタジーン社（Stratagene）製）を使用し、ア
ガロースゲル電気泳動後ニトロセルロース膜に転写し、
高ストリンジェント条件下でプローブとハイブリダイズ
させた。その結果、オクルディンmRNAはPBECにおいて訳
2.4kbに強いバンドが認められたが、PAECにおいては、
同位置に非常に弱いバンドしか認められなかった。The mRNA was prepared from the cultured cells using an RNA isolation kit (Stratagene), transferred to a nitrocellulose membrane after agarose gel electrophoresis,
Hybridized with the probe under high stringency conditions. As a result, occludin mRNA was translated in PBEC.
Although a strong band was observed at 2.4 kb, in PAEC,
Only a very weak band was observed at the same position.

【００３６】ついで哺乳類オクルディンを特異的に認識
するモノクローナル抗体として抗マウスオクルディン抗
体を、及びTJ関連タンパク質ZO−1にたいする抗体を用
いオクルディンの発現を比較した。Then, the expression of occludin was compared using an anti-mouse occludin antibody as a monoclonal antibody that specifically recognizes mammalian occludin and an antibody against the TJ-related protein ZO-1.

【００３７】ラット抗マウスオクルディン抗体は、マウ
スオクルディンとグルタチオン−S−トランスフェラー
ゼ融合タンパク質を抗原として作製し、該抗体の検出は
FITC標識羊抗ラットIgG抗体を用いた。培養細胞の破砕
抽出物の同一タンパク質量を一次元ゲル電気泳動後、イ
ムノプロット法で検出したところ、PBECにおいては約58
KDの位置に強く検出されたが、PAECにおいては、それに
比較してかなり弱く検出された。A rat anti-mouse occludin antibody is prepared by using mouse occludin and a glutathione-S-transferase fusion protein as antigens.
FITC-labeled sheep anti-rat IgG antibody was used. After one-dimensional gel electrophoresis, the same amount of protein in the crushed extract of the cultured cells was detected by immunoplotting.
Strongly detected at the KD position, but significantly weaker in PAEC.

【００３８】一方、ZO-1の発現は２つの細胞で明らかな
差は認めなかった。免疫染色ではイムノブロットと同様
にPBECではオクルディンは高度に発現し、細胞間に連続
性にZO−1と同一の局在を示した。一方、PAECではまた
オクルディンの検出は困難であり、ZO−1は細胞間に不
連続に局在した。これらの結果はPBECにおけるオクルデ
ィンの相対的に高度な発現は高電気抵抗TJの形成に必要
であることが示唆され、オクルディンがTJ構成タンパク
質であることを立証したものである。On the other hand, there was no apparent difference in the expression of ZO-1 between the two cells. Occludin was highly expressed in PBEC as well as in immunoblots, and showed the same localization as ZO-1 between cells continuously. On the other hand, it was also difficult to detect occludin in PAEC, and ZO-1 was localized discontinuously between cells. These results suggest that relatively high expression of occludin in PBEC is required for the formation of high electrical resistance TJ, and demonstrate that occludin is a TJ component protein.

【００３９】 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：５２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：マウス（肺細胞） 配列の記述 Met Ser Val Arg Pro Phe Glu Ser Pro Pro Pro Tyr Arg Pro Asp Glu 1 5 10 15 Phe Lys Pro Asn His Tyr Ala Pro Ser Asn Asp Met Tyr Gly Gly Glu 20 25 30 Met His Val Arg Pro Met Leu Ser Gln Pro Ala Tyr Ser Phe Tyr Pro 35 40 45 Glu Asp Glu Ile Leu His Phe Tyr Lys Trp Thr Ser Pro Pro Gly Val 50 55 60 Ile Arg Ile Leu Ser Met Leu Ile Ile Val Met Cys Ile Ala Ile Phe 65 70 75 80 Ala Cys Val Ala Ser Thr Leu Ala Trp Asp Arg Gly Tyr Gly Thr Gly 85 90 95 Leu Phe Gly Gly Ser Leu Asn Tyr Pro Tyr Ser Gly Phe Gly Tyr Gly 100 105 110 Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Gly Gly 115 120 125 Tyr Thr Asp Pro Arg Ala Ala Lys Gly Phe Leu Leu Ala Met Ala Ala 130 135 140 Phe Cys Phe Ile Ala Ser Leu Val Ile Phe Val Thr Ser Val Ile Arg 145 150 155 160 Ser Gly Met Ser Arg Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Ile Val Ile Ile Val 165 170 175 Ser Ala Ile Leu Gly Ile Met Val Phe Ile Ala Thr Ile Val Tyr Ile 180 185 190 Met Gly Val Asn Pro Thr Ala Gln Ala Ser Gly Ser Met Tyr Gly Ser 195 200 205 Gln Ile Tyr Met Ile Cys Asn Gln Phe Tyr Thr Pro Gly Gly Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Val Asp Gln Tyr Leu Tyr His Tyr Cys Val Val Asp Pro Gln 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ile Val Leu Gly Phe Met Ile Ile Val Ala Phe Ala 245 250 255 Leu Ile Ile Phe Phe Ala Val Lys Thr Arg Arg Lys Met Asp Arg Tyr 260 265 270 Asp Lys Ser Asn Ile Leu Trp Asp Lys Glu His Ile Tyr Asp Glu Gln 275 280 285 Pro Pro Asn Val Glu Glu Trp Val Lys Asn Val Ser Ala Gly Thr Gln 290 295 300 Asp Met Pro Pro Pro Pro Ser Asp Tyr Ala Glu Arg Val Asp Ser Pro 305 310 315 320 Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Gly Lys Arg Ser Tyr Pro 325 330 335 Glu Ser Phe Tyr Lys Ser Thr Pro Leu Val Pro Glu Val Ala Gln Glu 340 345 350 Ile Pro Leu Thr Leu Ser Val Asp Asp Phe Arg Gln Pro Arg Tyr Ser 355 360 365 Ser Asn Gly Asn Leu Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ala Pro Thr Lys Gly 370 375 380 Lys Ala Gly Lys Gly Lys Arg Thr Asp Pro Asp His Tyr Glu Thr Asp 385 390 395 400 Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Glu Glu Leu Glu Glu Asp Trp Val 405 410 415 Arg Glu Tyr Pro Pro Ile Thr Ser Asp Gln Gln Arg Gln Leu Tyr Lys 420 425 430 Arg Asn Phe Asp Ala Gly Leu Gln Glu Tyr Lys Ser Leu Gln Ala Glu 435 440 445 Leu Asp Asp Val Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu Asp 450 455 460 Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu Tyr 465 470 475 480 Asn Arg Leu Lys Gln Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser Lys Arg 485 490 495 Asn Tyr Cys Lys Gln Leu Lys Ser Lys Leu Ser His Ile Lys Arg Met 500 505 510 Val Gly Asp Tyr Asp Arg Arg Lys Pro 515 520 配列番号：２ 配列の長さ：２８３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：マウス（肺細胞） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２２３．．１７８５ 配列の記述 GGAGTTTCAG GTGAATGGGT CACCGAGGGA GGAGGCTGGC CACGCCACAC CTCGTCGCTA 60 GTGCCCACCT CCCGGCCCCT CTTTCCTTAG GCGACAGCGG TGGAGTTGCG GGAGAGCGGT 120 CCAGCGCACG GAGCAACCGG CTAGGGGCTC GGCAGGTTCG CTTATCTTGG GAGCCTGGAC 180 ATTTTGCTCA TCATAAAGAT TAGGTGACCA GTGACATCAG CCATGTCCGT GAGGCCTTTT 240 GAAAGTCCAC CTCCTTACAG ACCTGATGAA TTCAAACCCA ATCATTATGC ACCAAGCAAT 300 GACATGTATG GCGGAGAGAT GCATGTCCGG CCGATGCTCT CTCAGCCAGC GTACTCTTTT 360 TATCCGGAAG ATGAAATTCT TCACTTCTAC AAATGGACGT CGCCCCCAGG GGTGATCCGG 420 ATCCTGTCTA TGCTCATTAT TGTGATGTGC ATCGCCATAT TTGCCTGTGT GGCTTCCACA 480 CTTGCTTGGG ACAGAGGCTA TGGGACAGGG CTCTTTGGAG GAAGCCTAAA CTACCCTTAT 540 AGTGGCTTTG GCTACGGAGG TGGCTATGGA GGCGGCTATG GAGGCTATGG CTATGGCTAT 600 GGCGGATATA CAGACCCAAG AGCAGCCAAA GGCTTCCTGT TGGCCATGGC AGCCTTCTGC 660 TTCATCGCTT CCTTAGTAAT ATTTGTGACC AGTGTTATAA GATCTGGAAT GTCCAGGACA 720 AGAAGATATT ACTTGATCGT GATCATAGTC AGCGCTATCC TGGGCATCAT GGTGTTTATT 780 GCCACGATCG TGTACATAAT GGGAGTGAAC CCGACGGCCC AGGCTTCTGG ATCTATGTAC 840 GGCTCACAGA TATATATGAT CTGCAACCAG TTTTATACTC CTGGAGGTAC TGGTCTCTAC 900 GTGGATCAAT ATTTGTATCA CTACTGTGTG GTTGATCCCC AGGAGGCTAT AGCCATTGTC 960 CTGGGGTTCA TGATTATCGT GGCTTTTGCT TTAATCATCT TTTTTGCTGT GAAAACCCGA 1020 AGAAAGATGG ATCGGTATGA TAAGTCCAAT ATTTTGTGGG ATAAGGAACA CATTTATGAT 1080 GAACAGCCCC CCAATGTTGA AGAGTGGGTT AAAAATGTGT 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Gly 290 295 300 Thr Gln Asp Val Pro Ser Pro Pro Ser Asp Tyr Val Glu Arg Val Asp 305 310 315 320 Ser Pro Met Ala Tyr Ser Ser Asn Gly Lys Val Asn Asp Lys Arg Phe 325 330 335 Tyr Pro Glu Ser Ser Tyr Lys Ser Thr Pro Val Pro Glu Val Val Gln 340 345 350 Glu Leu Pro Leu Thr Ser Pro Val Asp Asp Phe Arg Gln Pro Arg Tyr 355 360 365 Ser Ser Gly Gly Asn Phe Glu Thr Pro Ser Lys Arg Ala Pro Ala Lys 370 375 380 Gly Arg Ala Gly Arg Ser Lys Arg Thr Glu Gln Asp His Tyr Glu Thr 385 390 395 400 Asp Tyr Thr Thr Gly Gly Glu Ser Cys Asp Glu Leu Glu Glu Asp Trp 405 410 415 Ile Arg Glu Tyr Pro Pro Ile Thr Ser Asp Gln Gln Arg Gln Leu Tyr 420 425 430 Lys Arg Asn Phe Asp Thr Gly Leu Gln Glu Tyr Lys Ser Leu Gln Ser 435 440 445 Glu Leu Asp Glu Ile Asn Lys Glu Leu Ser Arg Leu Asp Lys Glu Leu 450 455 460 Asp Asp Tyr Arg Glu Glu Ser Glu Glu Tyr Met Ala Ala Ala Asp Glu 465 470 475 480 Tyr Asn Arg Leu Lys Gln Val Lys Gly Ser Ala Asp Tyr Lys Ser Lys 485 490 495 Lys Asn His Cys Lys Gln Leu Lys Ser Lys Leu SerHis Ile Lys Lys 500 505 510 Met Val Gly Asp Tyr Asp Arg Gln Lys Thr 515 520 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 2379 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Origin of cDNA Organism name: human (intestinal epithelial cell line T84) Sequence characteristics Symbol indicating characteristics: mat peptide Location of occurrence: 168. . Description of 1733 sequences CTCCCGCGTC CACCTCTCCC TCCCTGCTTC CTCTGGCGGA GGCGGCAGGA ACCGAGAGCC 60 AGGTCCAGAG CGCCGAGGAG CCGGTCTAGG ACGCAGCAGA TTGGTTTATC TTGGAAGCTA 120 AAGGGCATTG CTCATCCTGA AGATCAGCTG ACCATTGACA ATCAGCCATG TCATCCAGGC 180 CTCTTGAAAG TCCACCTCCT TACAGGCCTG ATGAATTCAA ACCGAATCAT TATGCACCAA 240 GCAATGACAT ATATGGTGGA GAGATGCATG TTCGACCAAT GCTCTCTCAG CCAGCCTACT 300 CTTTTTACCC AGAAGATGAA ATTCTTCACT TCTACAAATG GACCTCTCCT CCAGGAGTGA 360 TTCGGATCCT GTCTATGCTC ATTATTGTGA TGTGCATTGC CATCTTTGCC TGTGTGGCCT 420 CCACGCTTGC CTGGGACAGA GGCTATGGAA CTTCCCTTTT AGGAGGTAGT GTAGGCTACC 480 CTTATGGAGG AAGTGGCTTT GGTAGCTACG GAAGTGGCTA TGGCTATGGC TATGGTTATG 540 GCTATGGCTA CGGAGGCTAT ACAGACCCAA GAGCAGCAAA GGGCTTCATG TTGGCCATGG 600 CTGCCTTTTG TTTCATTGCC GCGTTGGTGA TCTTTGTTAC CAGTGTTATA AGATCTGAAA 660 TGTCCAGAAC AAGAAGATAC TACTTAAGTG TGATAATAGT GAGTGCTATC CTGGGCATCA 720 TGGTGTTTAT TGCCACAATT GTCTATATAA TGGGAGTGAA CCCAACTGCT CAGTCTTCTG 780 GATCTCTATA TGGTTCACAA ATATATGCCC TCTGCAACCA ATTTTATACA CCTGCAG CTA 840 CTGGACTCTA CGTGGATCAG TATTTGTATC ACTACTGTGT TGTGGATCCC CAGGAGGCCA 900 TTGCCATTGT ACTGGGGTTC ATGATTATTG TGGCTTTTGC TTTAATAATT TTCTTTGCTG 960 TGAAAACTCG AAGAAAGATG GACAGGTATG ACAAGTCCAA TATTTTGTGG GACAAGGAAC 1020 ACATTTATGA TGAGCAGCCC CCCAATGTCG AGGAGTGGGT TAAAAATGTG TCTGCAGGCA 1080 CACAGGACGT GCCTTCACCC CCATCTGACT ATGTGGAAAG AGTTGACAGT CCCATGGCAT 1140 ACTCTTCCAA TGGCAAAGTG AATGACAAGC GGTTTTATCC AGAGTCTTCC TATAAATCCA 1200 CGCCGGTTCC TGAAGTGGTT CAGGAGCTTC CATTAACTTC GCCTGTGGAT GACTTCAGGC 1260 AGCCTCGTTA CAGCAGCGGT GGTAACTTTG AGACACCTTC AAAAAGAGCA CCTGCAAAGG 1320 GAAGAGCAGG AAGGTCAAAG AGAACAGAGC AAGATCACTA TGAGACAGAC TACACAACTG 1380 GCGGCGAGTC CTGTGATGAG CTGGAGGAGG ACTGGATCAG GGAATATCCA CCTATCACTT 1440 CAGATCAACA AAGACAACTG TACAAGAGGA ATTTTGACAC TGGCCTACAG GAATACAAGA 1500 GCTTACAATC AGAACTTGAT GAGATCAATA AAGAACTCTC CCGTTTGGAT AAAGAATTGG 1560 ATGACTATAG AGAAGAAAGT GAAGAGTACA TGGCTGCTGC TGATGAATAC AATAGACTGA 1620 AGCAAGTGAA GGGATCTGCA GATTACAAAA GTAAGAAGAA TCATTGCAAG CAGTTAAAGA 1680GCAAATTGTC ACACATCAAG AAGATGGTTG GAGACTATGA TAGACAGAAA ACATAGAAGG 1740 CTGATGCCAA GTTGTTTGAG AAATTAAGTA TCTGACATCT CTGCAATCTT CTCAGAAGGC 1800 AAATGACTTT GGACCATAAC CCCGGAAGCC AAACCTCTGT GAGCATCACA AAGTTTTGGT 1860 TGCTTTAACA TCATCAGTAT TGAAGCATTT TATAAATCGC TTTTGATAAT CAACTGGGCT 1920 GAACACTCCA ATTAAGGATT TTATGCTTTA AACATTGGTT CTTGTATTAA GAATGAAATA 1980 CTGTTTGAGG TTTTTAAGCC TTAAAGGAAG GTTCTGGTGT GAACTAAACT TTCACACCCC 2040 AGACGATGTC TTCATACCTA CATGTATTTG TTTGCATAGG TGATCTCATT TAATCCTCTC 2100 AACCACCTTT CAGATAACTG TTATTTATAA TCACTTTTTT CCACATAAGG AAACTGGGTT 2160 CCTGCAATGA AGTCTCTGAA GTGAAACTGC TTGTTTCCTA GCACACACTT TTGGTTAAGT 2220 CTGTTTTATG ACTTCATTAA TAATAAATTC CCTGGCCTTT CATATTTTAG CTACTATATA 2280 TGTGATGATC TACCAGCCTC CCTATTTTTT TTCTGTTATA TAAATGGTTA AAAGAGGTTT 2340 TTCTTAAATA ATAAAGATCA TGTAAAAGTA aAAAAAAAA 2379 SEQ ID NO: 5 SEQ length: 33 sequence types: the number of nucleic acid strands : Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence description TATGA GACAG ACTACACAAC TGGCGGCGAG TCC SEQ ID NO: 6 Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence description ATCATAGTCT CCAACCATCT TCTTGATGTG

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (56)参考文献 Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．80、ｐｐ．167− 178（1995) Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ ｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｖｏｌ．20、Ｎ ｏ．６、ｐ．585（1995) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．133, Ｎｏ．１，ｐｐ．43−47 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/47 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI C12P 21/02 C12Q 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/68 33/50 Z G01N 33/15 33/53 D 33/50 M 33/53 33/566 C12P 21/08 33/566 C12N 15/00 ZNAA // C12P 21/08 5/00 A (56) References Cell, Vol. 80, pp. 167-178 (1995) Cell Structure and Function, Vol. 20, No. 6, p. 585 (1995) The Journal of Cell Biology, Vol. 133, no. 1, pp. 43-47 (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/00 C07K 14/47 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG) SwissProt / PIR / GeneSeq GenBank / EMBL / DDBJ / GeneSeq

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
るマウスオクルディンタンパク質をコードする、配列番
号２に記載のＤＮＡ。1. The DNA of SEQ ID NO: 2, which encodes a mouse occludin protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含有するベク
ター。2. A vector containing the DNA according to claim 1. 【請求項３】 請求項２に記載のベクターを保持する形
質転換体。A transformant carrying the vector according to claim 2. 【請求項４】 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
るマウスオクルディンタンパク質。4. A mouse occludin protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 【請求項５】 請求項３に記載の形質転換体を培養し、
発現産物を回収することを含む、請求項４に記載のタン
パク質の製造方法。5. culturing the transformant according to claim 3,
The method for producing a protein according to claim 4, comprising recovering the expression product. 【請求項６】 配列番号２に記載の塩基配列の全部また
は一部を含むものからなる、マウスオクルディンタンパ
ク質をコードするＤＮＡプローブ。6. A DNA probe encoding a mouse occludin protein, which comprises all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 【請求項７】 配列番号２に記載の塩基配列の一部を含
むものからなる、マウスオクルディンタンパク質をコー
ドするＤＮＡプライマー。7. A DNA primer encoding a mouse occludin protein, comprising a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 【請求項８】 請求項４に記載のタンパク質と特異的に
結合するポリクロナール抗体またはモノクロナール抗
体。8. A polyclonal or monoclonal antibody that specifically binds to the protein of claim 4. 【請求項９】 請求項７に記載のＤＮＡプライマーを用
いることを特徴とする生体試料中の請求項１に記載のＤ
ＮＡ遺伝子の解析方法。9. The method according to claim 1, wherein the DNA primer according to claim 7 is used in a biological sample.
Analysis method of NA gene. 【請求項１０】 請求項６に記載のＤＮＡプローブを用
いることを特徴とする生体試料中の請求項１に記載のＤ
ＮＡ遺伝子の解析方法。10. The biological sample according to claim 1, wherein the DNA probe according to claim 6 is used.
Analysis method of NA gene. 【請求項１１】 オクルディンを発現している細胞と被
検物質を共存させた後、該細胞のオクルディン遺伝子の
発現量を、請求項９又は１０の方法により解析すること
を特徴とする、オクルディンの発現に影響を与える薬物
のスクリーニング方法11. A method of claim 9, wherein after coexistence of a test substance and a cell expressing occludin, the expression level of the occludin gene in the cell is analyzed by the method according to claim 9 or 10. Screening method for drugs affecting expression 【請求項１２】 請求項８に記載の抗体を含むことを特
徴とする、生体試料中のオクルディン測定試薬。A reagent for measuring occludin in a biological sample, comprising the antibody according to claim 8.