JP3340164B2 - 新規なカルシウム調節プロモータpo438 - Google Patents
新規なカルシウム調節プロモータpo438Info
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- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はバイオテクノロジーの分
野のものである。さらに詳細には、それは細胞外酵素ま
たは異種ポリペプチドの増産に用いるための新規なカル
シウム調節プロモータ、上記の酵素またはポリペプチド
を暗号化しているDNAと効果的に結合されているプロ
モータのDNA配列を包含する組換えベクターおよび上
記の酵素またはポリペプチドを暗号化しているDNAと
効果的に結合されているプロモータを包含する組換えベ
クターで形質転換された宿主微生物に関するものであ
る。本発明は、ストレプトマイセス(Streptomyces)
発現系およびストレプトマイセス中で外来DNA配列を
発現するため、これらの外来DNA配列によりコード化
されるポリペプチドおよび蛋白質を周辺の媒体に分泌す
るための方法に関するものである。
野のものである。さらに詳細には、それは細胞外酵素ま
たは異種ポリペプチドの増産に用いるための新規なカル
シウム調節プロモータ、上記の酵素またはポリペプチド
を暗号化しているDNAと効果的に結合されているプロ
モータのDNA配列を包含する組換えベクターおよび上
記の酵素またはポリペプチドを暗号化しているDNAと
効果的に結合されているプロモータを包含する組換えベ
クターで形質転換された宿主微生物に関するものであ
る。本発明は、ストレプトマイセス(Streptomyces)
発現系およびストレプトマイセス中で外来DNA配列を
発現するため、これらの外来DNA配列によりコード化
されるポリペプチドおよび蛋白質を周辺の媒体に分泌す
るための方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】スト
レプトマイセスはプロテアーゼ、ホスファターゼ、キシ
ラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヌ
クレアーゼを包含するいろいろな細胞外酵素の周知の生
産者である。その上に、多くのストレプトマイセス属は
多くの抗生物質、色素および他の二次代謝産物を生産
し、胞子形成に帰着する複雑なパターンの分化を有す
る。ストレプトマイセスの回分培養において、細胞外酵
素の生産および抗生物質生産および色素生合成の開始期
および胞子形成に同時性がある。全てのこれらの過程は
高成長率に好適な栄養状態により抑制され、P、Cまた
はN源の不足により制御解除される。酵素分泌、二次代
謝産物の生成および分化が全く影響を受けないが同一の
引金機作に反応するということではないようである。
レプトマイセスはプロテアーゼ、ホスファターゼ、キシ
ラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびヌ
クレアーゼを包含するいろいろな細胞外酵素の周知の生
産者である。その上に、多くのストレプトマイセス属は
多くの抗生物質、色素および他の二次代謝産物を生産
し、胞子形成に帰着する複雑なパターンの分化を有す
る。ストレプトマイセスの回分培養において、細胞外酵
素の生産および抗生物質生産および色素生合成の開始期
および胞子形成に同時性がある。全てのこれらの過程は
高成長率に好適な栄養状態により抑制され、P、Cまた
はN源の不足により制御解除される。酵素分泌、二次代
謝産物の生成および分化が全く影響を受けないが同一の
引金機作に反応するということではないようである。
【0003】細胞外酵素を暗号化しているストレプトマ
イセス(Streptomyces)のいくつかの遺伝子はクロー
ン化されている。これらはストレプトマイセス・コエリ
コロル(Streptomyces coelicolor)からのアガラー
ゼ、ストレプトマイセス・プリカタス(Streptomyces
plicatus)からのエンドグリコシダーゼ、ストレプト
マイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)か
らのキシラナーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカス(Streptomyces hygroscopicus)からのアルフ
ァーアミラーゼ、ストレプトマイセス・エスピーA2
(Strep.spas)からのセルラーゼ、ストレプトマイセ
ス・リビダンス(Strep.lividans)からのベーターガ
ラクトシダーゼおよびストレプトマイセス・カカオイ
(Strep.cacaoi)、バデアス(badius)およびフラジ
アェ(fradiae)からのベーターラクタマーゼを包含す
る。
イセス(Streptomyces)のいくつかの遺伝子はクロー
ン化されている。これらはストレプトマイセス・コエリ
コロル(Streptomyces coelicolor)からのアガラー
ゼ、ストレプトマイセス・プリカタス(Streptomyces
plicatus)からのエンドグリコシダーゼ、ストレプト
マイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)か
らのキシラナーゼ、ストレプトマイセス・ハイグロスコ
ピカス(Streptomyces hygroscopicus)からのアルフ
ァーアミラーゼ、ストレプトマイセス・エスピーA2
(Strep.spas)からのセルラーゼ、ストレプトマイセ
ス・リビダンス(Strep.lividans)からのベーターガ
ラクトシダーゼおよびストレプトマイセス・カカオイ
(Strep.cacaoi)、バデアス(badius)およびフラジ
アェ(fradiae)からのベーターラクタマーゼを包含す
る。
【0004】しかし、これらの遺伝子の発現を制御する
調節機作はほとんど未知である。デキストリンまたはマ
ルトトリオーズによるアミラーゼの誘導およびアミラー
ゼまたはアガラーゼの炭素代謝物調節のような特定の調
節機作以外にいくつかの細胞外酵素の制御解除の一般の
機作が存在するらしいが、それはいくつかの重合体基質
を分解する酵素の同時生産が栄養のダウン−シフト後に
ストレプトマイセス(Streptomyces)で観察されてい
るためである。上記のトランス作用性調節遺伝子はバチ
ルス・ズブテリス(Bacillus subtilis)〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(J.BACTERIO
L)第169巻:324−333頁、1987年〕、バ
チルス・ナトリー(Bacillus)〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー(J.BACTERIOL)、および
バチルス・ライケニフォルミス(Bacillus lichenifo
rmis)に見い出される。
調節機作はほとんど未知である。デキストリンまたはマ
ルトトリオーズによるアミラーゼの誘導およびアミラー
ゼまたはアガラーゼの炭素代謝物調節のような特定の調
節機作以外にいくつかの細胞外酵素の制御解除の一般の
機作が存在するらしいが、それはいくつかの重合体基質
を分解する酵素の同時生産が栄養のダウン−シフト後に
ストレプトマイセス(Streptomyces)で観察されてい
るためである。上記のトランス作用性調節遺伝子はバチ
ルス・ズブテリス(Bacillus subtilis)〔ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー(J.BACTERIO
L)第169巻:324−333頁、1987年〕、バ
チルス・ナトリー(Bacillus)〔ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー(J.BACTERIOL)、および
バチルス・ライケニフォルミス(Bacillus lichenifo
rmis)に見い出される。
【0005】酵素合成および/または分泌に影響する正
の調節遺伝子は、ストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)のような弱い分泌性株で細胞外酵素の
増加した分泌を探索することによりクローン化され得
る。ストレプトマイセス(Streptomyces)に外来DN
A配列を発現する系は、たとえばヨーロッパ特許第14
8552号および国際出願公開第88/07079号に
既に報告されている。これらの系はストレプトマイセス
(Streptomyces)により生産される細胞外酵素の内因
性プロモータを用いる。外来プロモータによる内因性プ
ロモータの置換は、細胞外酵素に対する構造遺伝子の制
御領域との相互作用によりストレプトマイセス(Strep
tomyces)中で細胞外酵素に対する遺伝子の発現を直接
または間接に調節するSafポリペプチドと称する新規な
ポリペプチドを暗号化している新たに分離した遺伝子S
af遺伝子のクローニングおよび特性を記載する国際出願
公開第90/14426号に開示されている。
の調節遺伝子は、ストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)のような弱い分泌性株で細胞外酵素の
増加した分泌を探索することによりクローン化され得
る。ストレプトマイセス(Streptomyces)に外来DN
A配列を発現する系は、たとえばヨーロッパ特許第14
8552号および国際出願公開第88/07079号に
既に報告されている。これらの系はストレプトマイセス
(Streptomyces)により生産される細胞外酵素の内因
性プロモータを用いる。外来プロモータによる内因性プ
ロモータの置換は、細胞外酵素に対する構造遺伝子の制
御領域との相互作用によりストレプトマイセス(Strep
tomyces)中で細胞外酵素に対する遺伝子の発現を直接
または間接に調節するSafポリペプチドと称する新規な
ポリペプチドを暗号化している新たに分離した遺伝子S
af遺伝子のクローニングおよび特性を記載する国際出願
公開第90/14426号に開示されている。
【0006】Saf遺伝子のプロモータは細胞外酵素の天
然のプロモータよりもさらに強力であることが見い出さ
れている。たとえば、アミラーゼ遺伝子はSafプロモー
タが天然のアミラーゼプロモータで置換される場合非常
に大量のアミラーゼを発現する。すなわち、Safプロモ
ータはその蛋白質の天然プロモータの代わりに全ての内
因性ポリペプチドまたは蛋白質の発現を増幅するのに用
いられる。Saf遺伝子のクローニングおよび確認には、
プラスミドpIJ702〔カツら、ジャーナル・オブ・
マイクロバイオロジー(J.GEN・MICROBIO
L)第129巻:2703−2714頁、1983年〕
がクローニングベクターとして用いられた。このプラス
ミドはストレプトマイセス(Streptomyces)のいくつ
かの種でチロジンからメラニンの生成の原因である酵
素、チロジナーゼの遺伝子を含む。pIJ702のme
l遺伝子座は配列決定され、二つの転写解読枠(ORF
s)が同定されている:一番目はチロジナーゼのポリペ
プチド鎖をコード化するmel遺伝子に対応するORF
であり、mel遺伝子の下流に位置している第二番目の
ORFはORF438と命名され〔バーナンら、ジーン
(GENE)第37巻:101−110頁、1985
年〕、その役割はなお不明である。
然のプロモータよりもさらに強力であることが見い出さ
れている。たとえば、アミラーゼ遺伝子はSafプロモー
タが天然のアミラーゼプロモータで置換される場合非常
に大量のアミラーゼを発現する。すなわち、Safプロモ
ータはその蛋白質の天然プロモータの代わりに全ての内
因性ポリペプチドまたは蛋白質の発現を増幅するのに用
いられる。Saf遺伝子のクローニングおよび確認には、
プラスミドpIJ702〔カツら、ジャーナル・オブ・
マイクロバイオロジー(J.GEN・MICROBIO
L)第129巻:2703−2714頁、1983年〕
がクローニングベクターとして用いられた。このプラス
ミドはストレプトマイセス(Streptomyces)のいくつ
かの種でチロジンからメラニンの生成の原因である酵
素、チロジナーゼの遺伝子を含む。pIJ702のme
l遺伝子座は配列決定され、二つの転写解読枠(ORF
s)が同定されている:一番目はチロジナーゼのポリペ
プチド鎖をコード化するmel遺伝子に対応するORF
であり、mel遺伝子の下流に位置している第二番目の
ORFはORF438と命名され〔バーナンら、ジーン
(GENE)第37巻:101−110頁、1985
年〕、その役割はなお不明である。
【0007】Saf遺伝子の位置を詳細に示す研究が行わ
れている間に、Saf遺伝子断片Sstr−KpnI(432
ヌクレオチド−プロモータをもたないSaf遺伝子)がp
IJ702のBglII部位に挿入された。研究の予期し
ない特徴は、正配位で挿入される場合のこの断片の発現
の欠失および逆配向(時計回り配向)で挿入される場合
その発現であった。この事実は、逆配位でORF438
内に位置した、遺伝子melの前でBglII部位にある
プロモータ活性をもつ断片の存在を暗示する。
れている間に、Saf遺伝子断片Sstr−KpnI(432
ヌクレオチド−プロモータをもたないSaf遺伝子)がp
IJ702のBglII部位に挿入された。研究の予期し
ない特徴は、正配位で挿入される場合のこの断片の発現
の欠失および逆配向(時計回り配向)で挿入される場合
その発現であった。この事実は、逆配位でORF438
内に位置した、遺伝子melの前でBglII部位にある
プロモータ活性をもつ断片の存在を暗示する。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明の主なる目的は、
pIJ702プラスミドのORF438内に含まれるD
NA断片中に同定される新規なプロモータを提供するも
のである。プロモータ活性はカルシウムイオンによって
正に調節され、作動可能に上記プロモータに結合される
ストレプトマイセスの細胞外酵素に対する遺伝子の発現
はCaCl2溶液の存在で大いに増大される。ポリペプ
チドまたは蛋白質を暗号化している内因性または外来D
NA配列に作動可能に結合された上記のプロモータを含
むクローニングビークル(ベクター)および上記のクロ
ーニングビークルにより形質転換された宿主微生物また
は細胞を提供し、それにより上記のDNA配列により暗
号化されているポリペプチドの発現および分泌をもたら
すことは本発明の他の特徴である。本発明の他の特徴は
ストレプトマイセスの染色体DNAに外来DNA配列を
保有する上記のクローニングビークルを挿入することで
ある。なお本発明の形質転換された宿主微生物を培養す
ることおよび培養ブロスから生成物を回収することによ
り細胞外酵素、目的とするポリペプチドまたは蛋白質を
製造する方法は本発明の他の特徴である。
pIJ702プラスミドのORF438内に含まれるD
NA断片中に同定される新規なプロモータを提供するも
のである。プロモータ活性はカルシウムイオンによって
正に調節され、作動可能に上記プロモータに結合される
ストレプトマイセスの細胞外酵素に対する遺伝子の発現
はCaCl2溶液の存在で大いに増大される。ポリペプ
チドまたは蛋白質を暗号化している内因性または外来D
NA配列に作動可能に結合された上記のプロモータを含
むクローニングビークル(ベクター)および上記のクロ
ーニングビークルにより形質転換された宿主微生物また
は細胞を提供し、それにより上記のDNA配列により暗
号化されているポリペプチドの発現および分泌をもたら
すことは本発明の他の特徴である。本発明の他の特徴は
ストレプトマイセスの染色体DNAに外来DNA配列を
保有する上記のクローニングビークルを挿入することで
ある。なお本発明の形質転換された宿主微生物を培養す
ることおよび培養ブロスから生成物を回収することによ
り細胞外酵素、目的とするポリペプチドまたは蛋白質を
製造する方法は本発明の他の特徴である。
【0009】ORF438に含まれる新規なプロモータ
は、ORF438のそれと逆配位にプロモータ活性を示
し、以下Po438(ORF438と逆のプロモータ)
と称する。pIJ702のその時計回りプロモータ活性
に関する知識はこのベクター中にクローンされるDNA
断片の遺伝子発現研究におけるまちがった解釈を避ける
ためにも非常に重要である。Po438プロモータはス
トレプトマイセス(Streptomyces)に特徴づけられて
いる最初に知られたカルシウム−調節プロモータであっ
て、適当なクローニングビークル中へ目的の蛋白質に対
する遺伝子の上流の適当な切断部位にPo438プロモ
ータを含んでいるDNA断片を挿入すること、上記のク
ローニングビークルでストレプトマイセス(Streptomy
ces)宿主を形質転換することおよびCa2+溶液の存在
下で形質転換された細菌を培養して選択した蛋白質また
はその一部を外分泌させることにより、選択した異種蛋
白質のストレプトマイセス(Streptomyces)中での発
現を増大するのに用いられ得る。Po438のプロモー
タ活性は2つの異なるプロモータ−プローブベクターを
用いて測定されている。Po438プロモータを含むD
NA断片は、プロモータを欠くアミノグリコシド ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)およびプロモー
タを欠くカラコール ジオキシゲナーゼ遺伝子(Xgl
E)をそれぞれ保有する2つの異なるプラスミドにサブ
クローンされた(図1)。両遺伝子はカルシウムイオン
の増大する濃度の存在下で多量の各酵素を発現し、かく
して、Po438のカルシウム−調節プロモータ活性を
示す。Po438の転写の出発点は、S1ヌクレアーゼ
マッピング試験で測定された結果SstI部位から24
ntのCa周辺に出発点に位置する(図4)。
は、ORF438のそれと逆配位にプロモータ活性を示
し、以下Po438(ORF438と逆のプロモータ)
と称する。pIJ702のその時計回りプロモータ活性
に関する知識はこのベクター中にクローンされるDNA
断片の遺伝子発現研究におけるまちがった解釈を避ける
ためにも非常に重要である。Po438プロモータはス
トレプトマイセス(Streptomyces)に特徴づけられて
いる最初に知られたカルシウム−調節プロモータであっ
て、適当なクローニングビークル中へ目的の蛋白質に対
する遺伝子の上流の適当な切断部位にPo438プロモ
ータを含んでいるDNA断片を挿入すること、上記のク
ローニングビークルでストレプトマイセス(Streptomy
ces)宿主を形質転換することおよびCa2+溶液の存在
下で形質転換された細菌を培養して選択した蛋白質また
はその一部を外分泌させることにより、選択した異種蛋
白質のストレプトマイセス(Streptomyces)中での発
現を増大するのに用いられ得る。Po438のプロモー
タ活性は2つの異なるプロモータ−プローブベクターを
用いて測定されている。Po438プロモータを含むD
NA断片は、プロモータを欠くアミノグリコシド ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)およびプロモー
タを欠くカラコール ジオキシゲナーゼ遺伝子(Xgl
E)をそれぞれ保有する2つの異なるプラスミドにサブ
クローンされた(図1)。両遺伝子はカルシウムイオン
の増大する濃度の存在下で多量の各酵素を発現し、かく
して、Po438のカルシウム−調節プロモータ活性を
示す。Po438の転写の出発点は、S1ヌクレアーゼ
マッピング試験で測定された結果SstI部位から24
ntのCa周辺に出発点に位置する(図4)。
【0010】添付図において:図1は、プロモータ−プ
ローブベクターpIJ487(ワードら、1986年)
およびpIJ4083中にクローンされたpIJ702
の242bp SstI−BglII断片(Po438を
含有)を保有するプラスミドpULAD50およびpU
LAD51の構築を示す図である。図2は、pIJ70
2の242bp SstI−BglII断片のプロモータ
活性を示す図である。カナマイシン グレディエント
(0−180μg/ml)を固体最小(MM)培地に設定
し(ポプウド、1967年)、プラスミドpULAD5
0(A)またはpIJ487(B)を保有するストレプ
トマイセス・リビダンス(S.lividans)を線状接種し
た。図3は、pIJ702の242 bp SstI−
BglII断片を保有するpULAD50の領域およびS
1マッピングによるストラテジーの図解である。星印に
よりマークされたバーは標識断片を示し、S1をもつバ
ーは得られた保護断片を示す。レーンA−C−G−Tは
M13mp18一本鎖DNA(右)による、およびpIJ7
02からの242 bp SstI−BglII断片(左)によ
る、4つの配列反応を示す。
ローブベクターpIJ487(ワードら、1986年)
およびpIJ4083中にクローンされたpIJ702
の242bp SstI−BglII断片(Po438を
含有)を保有するプラスミドpULAD50およびpU
LAD51の構築を示す図である。図2は、pIJ70
2の242bp SstI−BglII断片のプロモータ
活性を示す図である。カナマイシン グレディエント
(0−180μg/ml)を固体最小(MM)培地に設定
し(ポプウド、1967年)、プラスミドpULAD5
0(A)またはpIJ487(B)を保有するストレプ
トマイセス・リビダンス(S.lividans)を線状接種し
た。図3は、pIJ702の242 bp SstI−
BglII断片を保有するpULAD50の領域およびS
1マッピングによるストラテジーの図解である。星印に
よりマークされたバーは標識断片を示し、S1をもつバ
ーは得られた保護断片を示す。レーンA−C−G−Tは
M13mp18一本鎖DNA(右)による、およびpIJ7
02からの242 bp SstI−BglII断片(左)によ
る、4つの配列反応を示す。
【0011】1−pULAD50の270nt HindII
I−SstI断片およストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)からのmRNAの間のハイブリダイゼー
ションでの保護断片[pULAD50]。 2−270nt HindIII−SstI−プローブ。 3−242nt BglII−SstIプローブ。 4−pIJ702の242nt BglII−SstI断片お
よびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)か
らのmRNAの間のハイブリダイゼーションでの保護断
片。 やじり状印は保護断片に対応するハイブリダイゼーショ
ン バンドを示す。図4は、そのアミノ酸配列を示して
いるORF438を含むmelクラスターのDNA領域の
ヌクレオチド配列である。pULAD50を構築するた
めにpIJ487にクローンされたDNA断片の側面に
あるBglIIおよびSstI制限部位が示される。チロシナ
ーゼの二つの最初のアミノ酸もまた示される。 ●●→黒丸(2個)つき矢印:ゲィストリヒら(1989
年)およびロィら(1989年)によるmel転写の開始。 ○○→白丸(2個)つき矢印:S1ヌクレアーゼマッピン
グ試験によるPo438からの転写開始(図3)。 rbs.リボゾーム結合部位。
I−SstI断片およストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)からのmRNAの間のハイブリダイゼー
ションでの保護断片[pULAD50]。 2−270nt HindIII−SstI−プローブ。 3−242nt BglII−SstIプローブ。 4−pIJ702の242nt BglII−SstI断片お
よびストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)か
らのmRNAの間のハイブリダイゼーションでの保護断
片。 やじり状印は保護断片に対応するハイブリダイゼーショ
ン バンドを示す。図4は、そのアミノ酸配列を示して
いるORF438を含むmelクラスターのDNA領域の
ヌクレオチド配列である。pULAD50を構築するた
めにpIJ487にクローンされたDNA断片の側面に
あるBglIIおよびSstI制限部位が示される。チロシナ
ーゼの二つの最初のアミノ酸もまた示される。 ●●→黒丸(2個)つき矢印:ゲィストリヒら(1989
年)およびロィら(1989年)によるmel転写の開始。 ○○→白丸(2個)つき矢印:S1ヌクレアーゼマッピン
グ試験によるPo438からの転写開始(図3)。 rbs.リボゾーム結合部位。
【0012】図5は、Po438プロモータからの発現
のリン酸抑制を示す図である。ネオマイシン勾配(0−
180ug/ml)は固体MM+TES緩衝液825mM、p
H7.2(上面プレート)および20MMリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.2で補足した同じ培地(下面プレート)
上でつくられた。両プレートは同量のストレプトマイセ
ス・リビダンス(S.lividans)〔PULAD50〕胞子
を線状接種した。図6は、Po438プロモータの下流
に位置した場合のプソイドモナス・プチダ(Psendomona
s putida)のプロモータを欠くXylE遺伝子のストレプ
トマイセス(Streptomyces)中でのカルシウム誘導を示
すグラフである。ストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)〔pULAD51〕はカルシウム除去の
R2YE液体培地(黒丸●)および60mMまで別のCa
Cl2で補足したR2YE培地(白三角△)中に増殖され
た。pIJ4083により形質転換したストレプトマイ
セス・リビダンス(S.lividans)のカテコール ジオキ
シゲナーゼ活性(CatO2 ase)(白丸○)はCaCl2
共存または不在のR2YE培地に増殖した場合変らなか
った。
のリン酸抑制を示す図である。ネオマイシン勾配(0−
180ug/ml)は固体MM+TES緩衝液825mM、p
H7.2(上面プレート)および20MMリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.2で補足した同じ培地(下面プレート)
上でつくられた。両プレートは同量のストレプトマイセ
ス・リビダンス(S.lividans)〔PULAD50〕胞子
を線状接種した。図6は、Po438プロモータの下流
に位置した場合のプソイドモナス・プチダ(Psendomona
s putida)のプロモータを欠くXylE遺伝子のストレプ
トマイセス(Streptomyces)中でのカルシウム誘導を示
すグラフである。ストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)〔pULAD51〕はカルシウム除去の
R2YE液体培地(黒丸●)および60mMまで別のCa
Cl2で補足したR2YE培地(白三角△)中に増殖され
た。pIJ4083により形質転換したストレプトマイ
セス・リビダンス(S.lividans)のカテコール ジオキ
シゲナーゼ活性(CatO2 ase)(白丸○)はCaCl2
共存または不在のR2YE培地に増殖した場合変らなか
った。
【0013】明細書に記載した研究を下記の物質および
方法を用いて行った。細菌株およびプラスミド。本研究
に用いたストレプトマイセス(Streptomyces)株および
プラスミドを第1表に示す。培地および培養条件、プロ
トプラストの形質転換。ストレプトマイセス(Streptom
yces)株をR2YE、最小培地(MM)または34%スク
ロースおよびMgCl2で補足したYEMEに増殖させ
た。[ホプウドら、ジェネテック・マニプレション・オ
ブ・ストレプトマイセス(Streptomyces)。ア・ラボラ
トリィ・マニュアル(A LABORATORY MA
NUAL)。ザ・ジョン・イネス・ファウンデイショ
ン、ノリッヂ、ユー・ケイ、1985年)。ストレプト
マイセス(Streptomyces)の液体培養を220rpmで振と
うしつつロータリーシェカー中で28℃で三角振とうフ
ラスコ中に増殖させた。ストレプトマイセス・リビダン
ス(S.lividans)プロトプラストの製造および形質転換
は〔トムプソンら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(J.BACTERIOL)。第151巻:668−67
7頁、1982年〕記載通りで行った。
方法を用いて行った。細菌株およびプラスミド。本研究
に用いたストレプトマイセス(Streptomyces)株および
プラスミドを第1表に示す。培地および培養条件、プロ
トプラストの形質転換。ストレプトマイセス(Streptom
yces)株をR2YE、最小培地(MM)または34%スク
ロースおよびMgCl2で補足したYEMEに増殖させ
た。[ホプウドら、ジェネテック・マニプレション・オ
ブ・ストレプトマイセス(Streptomyces)。ア・ラボラ
トリィ・マニュアル(A LABORATORY MA
NUAL)。ザ・ジョン・イネス・ファウンデイショ
ン、ノリッヂ、ユー・ケイ、1985年)。ストレプト
マイセス(Streptomyces)の液体培養を220rpmで振と
うしつつロータリーシェカー中で28℃で三角振とうフ
ラスコ中に増殖させた。ストレプトマイセス・リビダン
ス(S.lividans)プロトプラストの製造および形質転換
は〔トムプソンら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(J.BACTERIOL)。第151巻:668−67
7頁、1982年〕記載通りで行った。
【0014】DNA分離、操作およびDNA配列。プラ
スミドDNAをキエセルの方法〔キエセルら、プラスミ
ド(PLASMID)第12巻:19−36頁、1984
年〕により分離した。消化および結さつをアガロース
ゲル電気泳動によりモニターした。制限エンドヌクレア
ーゼおよび結さつ反応による消化のための条件は製造者
によりすすめられたものであった。DNA断片のサブク
ローニングを充分な制限酵素により1−2ugのプラスミ
ドDNAを消化することにより行って、反応生成物を低
融点アガロース(LMPA)でゲル電気泳動により分離し
た。ヌクレオチド配列をM13クローン〔メーシング
ら、ヌクレイク・アシズ・リサーチ(NUCLEIC
ACID(S) RESEACH)第9巻:309−321
頁、1981年〕を用いて、サンガーの鎖終止法〔サン
ガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
(PROC.NATL.ACAD.SCI.U・S・A)
第74巻:5463−5467頁、1977年〕により
決定した。
スミドDNAをキエセルの方法〔キエセルら、プラスミ
ド(PLASMID)第12巻:19−36頁、1984
年〕により分離した。消化および結さつをアガロース
ゲル電気泳動によりモニターした。制限エンドヌクレア
ーゼおよび結さつ反応による消化のための条件は製造者
によりすすめられたものであった。DNA断片のサブク
ローニングを充分な制限酵素により1−2ugのプラスミ
ドDNAを消化することにより行って、反応生成物を低
融点アガロース(LMPA)でゲル電気泳動により分離し
た。ヌクレオチド配列をM13クローン〔メーシング
ら、ヌクレイク・アシズ・リサーチ(NUCLEIC
ACID(S) RESEACH)第9巻:309−321
頁、1981年〕を用いて、サンガーの鎖終止法〔サン
ガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ
(PROC.NATL.ACAD.SCI.U・S・A)
第74巻:5463−5467頁、1977年〕により
決定した。
【0015】RNA分離およびS1ヌクレアーゼマッピ
ング。RNAをMM培地での50時間培養からキルビー
[キルビーら、バイオケミカル・ジャーナル(BIOCH
EM.J)第104巻:258−262頁、1967年]
により分離した。S1マッピングのためにDNAプロー
ブは末端を標識した。[アサムおよびギルバート、メソ
ズ・イン・エンザイモロジー(METHODS.ENZ
YMOL)第65巻:499−560頁、1980年)。
RNA(40ug)を[32P]で末端標識したDNA断片の1
05C・P・Mと混合して、15分間85℃で変性させ
た。[ファバロラら、メソズ・イン・エンザイモロジー
(METHODS.ENZYMOL)第65巻:718−
749頁、1980年]。ハイブリダイゼーションを3
時間60℃で行って、60単位のS1ヌクレアーゼで処
理し、S1消化生成物を7M尿素を含む7%(W/V)ポ
リアクリルアミド ゲルに負荷して、M13 mp18フ
ァージおよびサンガー法により配列決定した242 bp
BglII−SstI断片と平行して移動させた。
ング。RNAをMM培地での50時間培養からキルビー
[キルビーら、バイオケミカル・ジャーナル(BIOCH
EM.J)第104巻:258−262頁、1967年]
により分離した。S1マッピングのためにDNAプロー
ブは末端を標識した。[アサムおよびギルバート、メソ
ズ・イン・エンザイモロジー(METHODS.ENZ
YMOL)第65巻:499−560頁、1980年)。
RNA(40ug)を[32P]で末端標識したDNA断片の1
05C・P・Mと混合して、15分間85℃で変性させ
た。[ファバロラら、メソズ・イン・エンザイモロジー
(METHODS.ENZYMOL)第65巻:718−
749頁、1980年]。ハイブリダイゼーションを3
時間60℃で行って、60単位のS1ヌクレアーゼで処
理し、S1消化生成物を7M尿素を含む7%(W/V)ポ
リアクリルアミド ゲルに負荷して、M13 mp18フ
ァージおよびサンガー法により配列決定した242 bp
BglII−SstI断片と平行して移動させた。
【0016】カテコールジデキシゲナーゼ活性の測定。
プレート検定として、ストレプトマイセス(Streptomyc
es)形質転換体コロニーを3日間28℃で増殖させ、プ
レートに0.5Mカテコールの水溶液を噴霧した。液体
検定として、ストレプトマイセス(Streptomyces)株を
CaCl2を欠くまたはCaCl2(60mM)で補足したR2
YE液体培地50ml、28℃で増殖させた。異なる時間
にサンプルを取り、カテコールジオキシゲナーゼ活性を
[イングラムら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(J.BACTERIOL)第171巻:6617−66
24頁、1989年]に記載の通り測定した。蛋白質濃
度を牛血清アルブミンを標準として用いるプラスミドフ
ォード法により測定した[ブラドフォード、アナリテカ
ル・バイオケミストリー(ANAL・BIOCHEM)第
72巻:248−254頁、1976年]。
プレート検定として、ストレプトマイセス(Streptomyc
es)形質転換体コロニーを3日間28℃で増殖させ、プ
レートに0.5Mカテコールの水溶液を噴霧した。液体
検定として、ストレプトマイセス(Streptomyces)株を
CaCl2を欠くまたはCaCl2(60mM)で補足したR2
YE液体培地50ml、28℃で増殖させた。異なる時間
にサンプルを取り、カテコールジオキシゲナーゼ活性を
[イングラムら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
(J.BACTERIOL)第171巻:6617−66
24頁、1989年]に記載の通り測定した。蛋白質濃
度を牛血清アルブミンを標準として用いるプラスミドフ
ォード法により測定した[ブラドフォード、アナリテカ
ル・バイオケミストリー(ANAL・BIOCHEM)第
72巻:248−254頁、1976年]。
【0017】下記の詳細な記述は本発明を説明するもの
である: Po438のプロモータ活性 Po438のプロモータ活性を2つの異なるプロモータ
プローブに含まれたアミノグリコシド ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子およびカテコールジオキシゲナーゼ遺
伝子の発現により測定した。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の発現。pIJ702プラス
ミドからの242 bp BglII−SstI断片をプロモ
ータを欠くアミノグリコシド ホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子(neo)を保有したpIJ487[ワードら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(MO
L.GEN.GENET)第203巻:468−478
頁、1986年]にサブクローンした。この遺伝子の発
現はストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans)にカナマイシン(Km)およびネオマイシン耐性
を付与する。プラスミドpULAD50をこうして造っ
た(図1)。pULAD50により形質転換したストレ
プトマイセス・リビダンス(S.lividans)を150ug/
ml以上のKmを含むMMに増殖させ得るが、それに反し
て、pIJ487(挿入したプロモータを欠くプロモータ
プローブ)により形質転換したストレプトマイセス・リ
ビダンス(S.lividans)は図2に示したように10ug/
ml KmをもつMMに増殖しない。この結果は明らか
に、pIJ702のBglII−SstI断片がSstI部位
からBglII部位への配位によりストレプトマイセス
(Streptomyces)のプロモータ活性を有することを示
す。
である: Po438のプロモータ活性 Po438のプロモータ活性を2つの異なるプロモータ
プローブに含まれたアミノグリコシド ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子およびカテコールジオキシゲナーゼ遺
伝子の発現により測定した。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子の発現。pIJ702プラス
ミドからの242 bp BglII−SstI断片をプロモ
ータを欠くアミノグリコシド ホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子(neo)を保有したpIJ487[ワードら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(MO
L.GEN.GENET)第203巻:468−478
頁、1986年]にサブクローンした。この遺伝子の発
現はストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans)にカナマイシン(Km)およびネオマイシン耐性
を付与する。プラスミドpULAD50をこうして造っ
た(図1)。pULAD50により形質転換したストレ
プトマイセス・リビダンス(S.lividans)を150ug/
ml以上のKmを含むMMに増殖させ得るが、それに反し
て、pIJ487(挿入したプロモータを欠くプロモータ
プローブ)により形質転換したストレプトマイセス・リ
ビダンス(S.lividans)は図2に示したように10ug/
ml KmをもつMMに増殖しない。この結果は明らか
に、pIJ702のBglII−SstI断片がSstI部位
からBglII部位への配位によりストレプトマイセス
(Streptomyces)のプロモータ活性を有することを示
す。
【0018】カテコール ジオキシゲナーゼ遺伝子の発
現。上記の実施例におけるように242 bp BglII
−SstI断片を異なるプロモータプローブベクター、酵
素カテコール ジオキシゲナーゼに対してコード化する
プソイドモナスプチダ(Psendomonas putida)からのX
ylEを保有するプラスミドにサブクローンした。ハイブ
ライドプラスミドをpULAD51と命名した(図1)。p
ULAD51により形質転換したストレプトマイセス・
リビダンス(Streptomyces lividans)を60mMまでの
CaCl2で補足したR2YE培地に増殖させた。カテコ
ール ジオキシゲナーゼ活性の定量はXylE遺伝子の下
流に挿入した場合、またPo438がプロモータ活性を
発現することを示す(図6)。
現。上記の実施例におけるように242 bp BglII
−SstI断片を異なるプロモータプローブベクター、酵
素カテコール ジオキシゲナーゼに対してコード化する
プソイドモナスプチダ(Psendomonas putida)からのX
ylEを保有するプラスミドにサブクローンした。ハイブ
ライドプラスミドをpULAD51と命名した(図1)。p
ULAD51により形質転換したストレプトマイセス・
リビダンス(Streptomyces lividans)を60mMまでの
CaCl2で補足したR2YE培地に増殖させた。カテコ
ール ジオキシゲナーゼ活性の定量はXylE遺伝子の下
流に挿入した場合、またPo438がプロモータ活性を
発現することを示す(図6)。
【0019】カルシウムイオンによるPo438からの
発現の調節。Po438のプロモータ活性に及ぼす異な
るイオンの作用を分析した。カナマイシン耐性のレベル
は増殖培地中の塩の量によって異なるから〔ホプムウド
ら、ジェネティク・マニプレション・オブ・ストレプト
マイセス(Streptomyces)。ア・ラボラトリイ・マニュ
アル(A.LABORATORY.MANUAL)ザ.ジ
ョン・イネス・ファウンデーション、ノリッヂ、ユー・
ケイ.1985年〕、ネオマイシン(NeO)をこれらの
研究のためにMMに用いた。全ての場合に、MMをpH
の変化を避けるためにTES緩衝液(25mM、pH7.
2)で補足した。Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+陽イオン
はPo438の力価に及ぼす作用はなかったが(MMプレ
ート上での170ug/ml NeOに対する耐性)、それに
反して、いくつかの一価陽イオン(Na+、K+、Li+、C
s+、10mM)はプロモータ活性の僅かな減少を招き、1
00ug/ml以上のNeOを含むMMでの増殖はなかっ
た。プロモータ活性の減少は、MMをリン酸緩衝液(2
0mM、pH7.2)で補足した場合にまた図5で示したよ
うに観察した。カルシウムイオンはPo438のプロモ
ータ活性を正に調節する。Ca2+はpULAD50プラス
ミドで形質転換したストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)のNeO耐性を増大し、CaCl2濃度およ
びNeOレベル耐性の間の厳密な相互関係を示している
(第2表)。
発現の調節。Po438のプロモータ活性に及ぼす異な
るイオンの作用を分析した。カナマイシン耐性のレベル
は増殖培地中の塩の量によって異なるから〔ホプムウド
ら、ジェネティク・マニプレション・オブ・ストレプト
マイセス(Streptomyces)。ア・ラボラトリイ・マニュ
アル(A.LABORATORY.MANUAL)ザ.ジ
ョン・イネス・ファウンデーション、ノリッヂ、ユー・
ケイ.1985年〕、ネオマイシン(NeO)をこれらの
研究のためにMMに用いた。全ての場合に、MMをpH
の変化を避けるためにTES緩衝液(25mM、pH7.
2)で補足した。Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+陽イオン
はPo438の力価に及ぼす作用はなかったが(MMプレ
ート上での170ug/ml NeOに対する耐性)、それに
反して、いくつかの一価陽イオン(Na+、K+、Li+、C
s+、10mM)はプロモータ活性の僅かな減少を招き、1
00ug/ml以上のNeOを含むMMでの増殖はなかっ
た。プロモータ活性の減少は、MMをリン酸緩衝液(2
0mM、pH7.2)で補足した場合にまた図5で示したよ
うに観察した。カルシウムイオンはPo438のプロモ
ータ活性を正に調節する。Ca2+はpULAD50プラス
ミドで形質転換したストレプトマイセス・リビダンス
(S.lividans)のNeO耐性を増大し、CaCl2濃度およ
びNeOレベル耐性の間の厳密な相互関係を示している
(第2表)。
【0020】プラスミドpULAD60は、国際出願公
開第90/14426号に記載されているように、異な
るプロモータ、safプロモータと結合したneo遺伝子をも
つ同様なプラスミドの例を示す。しかし、pULAD6
0で形質転換したストレプトマイセス・リビダンス(St
reptomyces lividans)のNeO耐性は、異なる濃度のC
aCl2(0、10、20、30、40mM)を含むMMに増
殖する場合修飾されず、neo遺伝子生成物の翻訳後の刺
激またはネオマイシンのカルシウム不活性化がないこと
を示唆した。Ca2+の作用が特異的でなかった場合刺激
性作用が全構築物で観察される筈である。これは、Po
438プロモータ活性を特異的にカルシウムイオンによ
り調節することを示す。カルシウム誘導体はまた図6に
記録したようにプラスミドpULAD51で形質転換し
たストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces li
vidans)のXylEの発現で観察された。カテコール ジ
オキシゲナーゼ活性(Cat O2 ase)は、R2YE培地
を60mMまでのCaCl2で補足した場合非常に増大し
た。逆に、pIJ4038(Po438プロモータを欠く
プロモータプローブベクター)で形質転換したストレプ
トマイセス・リビダンス(Streptomyces)のカテコール
ジオキシゲナーゼ活性は塩化カルシウム共存または不
在のR2YE培地に増殖した場合変わらない。
開第90/14426号に記載されているように、異な
るプロモータ、safプロモータと結合したneo遺伝子をも
つ同様なプラスミドの例を示す。しかし、pULAD6
0で形質転換したストレプトマイセス・リビダンス(St
reptomyces lividans)のNeO耐性は、異なる濃度のC
aCl2(0、10、20、30、40mM)を含むMMに増
殖する場合修飾されず、neo遺伝子生成物の翻訳後の刺
激またはネオマイシンのカルシウム不活性化がないこと
を示唆した。Ca2+の作用が特異的でなかった場合刺激
性作用が全構築物で観察される筈である。これは、Po
438プロモータ活性を特異的にカルシウムイオンによ
り調節することを示す。カルシウム誘導体はまた図6に
記録したようにプラスミドpULAD51で形質転換し
たストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces li
vidans)のXylEの発現で観察された。カテコール ジ
オキシゲナーゼ活性(Cat O2 ase)は、R2YE培地
を60mMまでのCaCl2で補足した場合非常に増大し
た。逆に、pIJ4038(Po438プロモータを欠く
プロモータプローブベクター)で形質転換したストレプ
トマイセス・リビダンス(Streptomyces)のカテコール
ジオキシゲナーゼ活性は塩化カルシウム共存または不
在のR2YE培地に増殖した場合変わらない。
【0021】Po438での転写出発点の決定 S1ヌクレアーゼマッピング試験を、Po438の転写
出発点および配列を測定するため行った。pULAD5
0から分離した270 bp HindIII−SstI断片
をHindIII5'末端に標識し、pULAD50を保有
するストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans)から分離したmRNAとハイブリダイズした。
保護断片は、SstI部位から24ntのC周辺に転写出発
点を位置させた(図4)調節プローブより約24nt短いサ
イズを示した(図3)。2番目のS1ヌクレアーゼマッピ
ング試験を、Po438DNA領域を含む元のプラスミ
ドpIJ702で行った。pIJ702の242 bp B
glII−SstI断片をプローブとして用いた。断片をB
glII5'末端に標識し、pIJ702で形質転換したス
トレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces livida
ns)から分離したmRNAとハイブリダイズした。図3は
保護断片がつねにプローブより24nt短かったことを示
し、転写開始がpULAD50と同様なヌクレオチドでp
IJ702に起こることを示す。
出発点および配列を測定するため行った。pULAD5
0から分離した270 bp HindIII−SstI断片
をHindIII5'末端に標識し、pULAD50を保有
するストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces
lividans)から分離したmRNAとハイブリダイズした。
保護断片は、SstI部位から24ntのC周辺に転写出発
点を位置させた(図4)調節プローブより約24nt短いサ
イズを示した(図3)。2番目のS1ヌクレアーゼマッピ
ング試験を、Po438DNA領域を含む元のプラスミ
ドpIJ702で行った。pIJ702の242 bp B
glII−SstI断片をプローブとして用いた。断片をB
glII5'末端に標識し、pIJ702で形質転換したス
トレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces livida
ns)から分離したmRNAとハイブリダイズした。図3は
保護断片がつねにプローブより24nt短かったことを示
し、転写開始がpULAD50と同様なヌクレオチドでp
IJ702に起こることを示す。
【0022】図4は、ORF438の出発コドンから約
30nt下流に位置したORF438のmel遺伝子のプロ
モータ領域[ゲイストリヒら、モレキュラー・マイクロ
バイオロジー(Molecular.Microbiology)第3巻:10
61−1069頁、1989年ロィら、ジーン(GEN
E)第84巻:267−277頁、1989年]およびO
RF438のそれと逆配位に位置したPo438プロモ
ータおよび本研究のS1ヌクレアーゼマッピング試験に
よるその転写出発点を示す。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子およびカテコール ジオキシ
ゲナーゼ遺伝子を特に例に挙げたが、Po438プロモ
ータの使用により発現を増進するために、用いるストレ
プトマイセス・リビダンス(Streptmyces)種により生産
した全てのポリペプチドまたは蛋白質に対する遺伝子を
天然のプロモータを除去することおよびPo438プロ
モータで置換することにより修飾し得ることがわかる。
同様に、ポリペプチドまたは蛋白質をコード化する異種
DNAを全ての上記の内因性遺伝子に挿入し得る。しか
し好ましくは、選択した内因性遺伝子は細胞壁を通し
て、培地中に発現するものであり、その場合、それは分
泌シグナル配列を保つことが重要である。それ故外来D
NAを細胞外酵素遺伝子からできるだけ多く分泌シグナ
ルを保つように上記の方法により挿入することが好まし
い。これらのシグナルは優勢にリーダー配列上にある
が、細胞外酵素に対する内因性遺伝子に関してターミナ
ル カルボキシル末端がまた分泌に重要であることの証
拠がある。それ故、内因性DNAに外来DNAを挿入す
ることではなく内因性DNAの転写部分を除去すること
および外来DNAを置換することにより融合蛋白質を造
ることが最良である。
30nt下流に位置したORF438のmel遺伝子のプロ
モータ領域[ゲイストリヒら、モレキュラー・マイクロ
バイオロジー(Molecular.Microbiology)第3巻:10
61−1069頁、1989年ロィら、ジーン(GEN
E)第84巻:267−277頁、1989年]およびO
RF438のそれと逆配位に位置したPo438プロモ
ータおよび本研究のS1ヌクレアーゼマッピング試験に
よるその転写出発点を示す。アミノグリコシド ホスホ
トランスフェラーゼ遺伝子およびカテコール ジオキシ
ゲナーゼ遺伝子を特に例に挙げたが、Po438プロモ
ータの使用により発現を増進するために、用いるストレ
プトマイセス・リビダンス(Streptmyces)種により生産
した全てのポリペプチドまたは蛋白質に対する遺伝子を
天然のプロモータを除去することおよびPo438プロ
モータで置換することにより修飾し得ることがわかる。
同様に、ポリペプチドまたは蛋白質をコード化する異種
DNAを全ての上記の内因性遺伝子に挿入し得る。しか
し好ましくは、選択した内因性遺伝子は細胞壁を通し
て、培地中に発現するものであり、その場合、それは分
泌シグナル配列を保つことが重要である。それ故外来D
NAを細胞外酵素遺伝子からできるだけ多く分泌シグナ
ルを保つように上記の方法により挿入することが好まし
い。これらのシグナルは優勢にリーダー配列上にある
が、細胞外酵素に対する内因性遺伝子に関してターミナ
ル カルボキシル末端がまた分泌に重要であることの証
拠がある。それ故、内因性DNAに外来DNAを挿入す
ることではなく内因性DNAの転写部分を除去すること
および外来DNAを置換することにより融合蛋白質を造
ることが最良である。
【0023】外来DNA配列は、蛋白質またはポリペプ
チドを暗号化している全ての非ストレプトマイセス(St
reptmyces)由来のDNA配列、特に真核生物またはウイ
ルス起源のものであり得ることをまた理解すべきであ
る。上記の真核生物およびウイルスDNA配列の例は、
ヒトおよび動物真核生物インタフェロン(IFN−アル
ファ)線維芽細胞インタフェロン(IFN−ベーター)お
よび免疫性インタフェロン(IFN−ガンマー)、ヒトイ
ンシュリン、コルチコトロビン放出因子(CRF)のよう
なヒトおよび動物成長および他のホルモン、ヒト血清ア
ルブミンおよびいろいろなヒト血液因子およびプラスミ
ノゲン活性化因子、両組織およびウロキナーゼ、B型肝
炎ウイルスコアおよび表面抗原、FMDウイルス抗原お
よび他のヒト、動物およびウイルスポリペプチドおよび
蛋白質を暗号化している配列である。
チドを暗号化している全ての非ストレプトマイセス(St
reptmyces)由来のDNA配列、特に真核生物またはウイ
ルス起源のものであり得ることをまた理解すべきであ
る。上記の真核生物およびウイルスDNA配列の例は、
ヒトおよび動物真核生物インタフェロン(IFN−アル
ファ)線維芽細胞インタフェロン(IFN−ベーター)お
よび免疫性インタフェロン(IFN−ガンマー)、ヒトイ
ンシュリン、コルチコトロビン放出因子(CRF)のよう
なヒトおよび動物成長および他のホルモン、ヒト血清ア
ルブミンおよびいろいろなヒト血液因子およびプラスミ
ノゲン活性化因子、両組織およびウロキナーゼ、B型肝
炎ウイルスコアおよび表面抗原、FMDウイルス抗原お
よび他のヒト、動物およびウイルスポリペプチドおよび
蛋白質を暗号化している配列である。
【0024】
【表1】
【表2】
【0025】図および表1に引用した参考文献 ゲイストリヒ.エム、イル=ゲル.エスおよびフテル.
アル:ストレプトマイセス・グラウセスセンス(Streptm
yces glaucescens)melオペロンからの調節したプロモ
ータの局在および基本的分布。モレキェラー・マイクロ
バイオロジー(Molecular.Microbiology)第3巻(19
89年)1061−1069頁)。ホプウド.デ.エ:ス
トレプトマイセス・コエリコロル(Streptmyces coeli
color)の遺伝学的分析およびゲノム構造。バクテリアル
・レビュー(Bacterial.Review)第31巻(1967
年)373−403頁。カツ・エ、トムプソン.シ.ジ
ェおよびホプウド.ディ.エ:ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptmyces lividans)中へのストレプトマ
イセス・アンテバイオテカス(Streptomyces antibiot
icus)からのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現。ジャーナル・オブ・シェネナル・マイクロバイオ
ロジー(J.Gen.Microbiol)第129巻(1983年)
2703−2714頁。ロイ、ダブリュ.−エム、ム、
エス.−ワイ、リン、ジェ、−ジェ、ロ、エス.ジェお
よびムゥ リー、ワイ.−エッチ:ストレプトマイセス
アンテバイオテカス(Streptomyces antibioticus)か
らのメラニン遺伝子座のプロモータ領域の分析。ジーン
(Gene)第84巻(1989年)267−277頁。ワー
ド、ジェ.エム.、ジャンセン、ジ・アル、キエセル、
ティ、ビブ、エム.ジェ、ブトネル、エム.ジェおよび
ビブ、エム.ジェ:インデケーターとしてTn5からのア
ミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼを用いたス
トレプトマイセス(Streptomyces)に対する一連の多重
コピーのプロモータプローブプラスミド ベクターの構
築および特性。モレキュラル・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティク(Mol.Gen.Genet)第203巻(1986
年)468−478頁。
アル:ストレプトマイセス・グラウセスセンス(Streptm
yces glaucescens)melオペロンからの調節したプロモ
ータの局在および基本的分布。モレキェラー・マイクロ
バイオロジー(Molecular.Microbiology)第3巻(19
89年)1061−1069頁)。ホプウド.デ.エ:ス
トレプトマイセス・コエリコロル(Streptmyces coeli
color)の遺伝学的分析およびゲノム構造。バクテリアル
・レビュー(Bacterial.Review)第31巻(1967
年)373−403頁。カツ・エ、トムプソン.シ.ジ
ェおよびホプウド.ディ.エ:ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptmyces lividans)中へのストレプトマ
イセス・アンテバイオテカス(Streptomyces antibiot
icus)からのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現。ジャーナル・オブ・シェネナル・マイクロバイオ
ロジー(J.Gen.Microbiol)第129巻(1983年)
2703−2714頁。ロイ、ダブリュ.−エム、ム、
エス.−ワイ、リン、ジェ、−ジェ、ロ、エス.ジェお
よびムゥ リー、ワイ.−エッチ:ストレプトマイセス
アンテバイオテカス(Streptomyces antibioticus)か
らのメラニン遺伝子座のプロモータ領域の分析。ジーン
(Gene)第84巻(1989年)267−277頁。ワー
ド、ジェ.エム.、ジャンセン、ジ・アル、キエセル、
ティ、ビブ、エム.ジェ、ブトネル、エム.ジェおよび
ビブ、エム.ジェ:インデケーターとしてTn5からのア
ミノグリコシド ホスホトランスフェラーゼを用いたス
トレプトマイセス(Streptomyces)に対する一連の多重
コピーのプロモータプローブプラスミド ベクターの構
築および特性。モレキュラル・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティク(Mol.Gen.Genet)第203巻(1986
年)468−478頁。
【図1】プロモータ−プローブベクターpIJ487
(ワードら、1986年)およびpIJ4083中にク
ローンされたpIJ702の242bp SstI−B
glII断片(Po438を含有)を保有するプラスミド
pULAD50およびpULAD51の構築を示す図で
ある。
(ワードら、1986年)およびpIJ4083中にク
ローンされたpIJ702の242bp SstI−B
glII断片(Po438を含有)を保有するプラスミド
pULAD50およびpULAD51の構築を示す図で
ある。
【図2】pIJ702の242bp SstI−Bgl
II断片のプロモータ活性を示す図である。
II断片のプロモータ活性を示す図である。
【図3】pIJ702の242 bp SstI−Bg
lII断片を保有するpULAD50の領域およびS1マ
ッピングによるストラテジーの図解である。
lII断片を保有するpULAD50の領域およびS1マ
ッピングによるストラテジーの図解である。
【図4】そのアミノ酸配列を示しているORF438を
含むmelクラスターのDNA領域のヌクレオチド配列で
ある。
含むmelクラスターのDNA領域のヌクレオチド配列で
ある。
【図5】Po438プロモータからの発現のリン酸抑制
を示す図である。
を示す図である。
【図6】Po438プロモータの下流に位置した場合の
プソイドモナス・プチダ(Psendomonas putida)のプロ
モータを欠くXylE遺伝子のストレプトマイセス(Stre
ptomyces)中でのカルシウム誘導を示すグラフである。
プソイドモナス・プチダ(Psendomonas putida)のプロ
モータを欠くXylE遺伝子のストレプトマイセス(Stre
ptomyces)中でのカルシウム誘導を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12P 21/02 C12R 1:465) (72)発明者 ホセ・アントニオ・ヒル スペイン24008レオン、アベニーダ・マ リアーノ・アンドレス18−3デ番 (72)発明者 トーマス・ビガル・ガルシア スペイン24002レオン、カジェ/アルバ ロ・ロペス・ヌネス10−4デ番 (72)発明者 フアン・フランシスコ・マルティン スペイン2400レオン、アベニーダ・ファ クルタッド・デ・ベテリナリア13−4ア ー番 (56)参考文献 特表 平4−501855(JP,A) Gene,Vol.37(1985)p. 101−110 Gene,Vol.25(1983)p. 119−132 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) GenBank/EMBL/DDBJ/G eneSeq BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed
Claims (11)
- 【請求項1】 下記のヌクレオチド配列を有するDNAま
たはその断片であって、当該DNAまたは断片がカルシウ
ム調節プロモータ活性を有するもの: 【化1】 - 【請求項2】 DNAまたは断片が、それに作動可能に結
合したストレプトマイセス(Streptomyces)の細胞外酵
素遺伝子の発現に対し、カルシウム調節プロモータ活性
を発揮するものである、請求項1記載のDNAまたは断
片。 - 【請求項3】 請求項1記載のヌクレオチド配列を有す
るDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するDNAであって、カルシウム調節プロモータ活性を有
するもの。 - 【請求項4】 請求項1〜3のいずれか記載のDNAまた
は断片を含む、プロモータ。 - 【請求項5】 請求項1記載のDNAまたは断片と、これ
に作動可能に結合したポリペプチドまたは蛋白質をコー
ドする遺伝子を含む、クローニングビークル。 - 【請求項6】 遺伝子が、ストレプトマイセスに内因性
のものである、請求項5記載のクローニングビークル。 - 【請求項7】 遺伝子が、同じ解読枠中で非ストレプト
マイセスのポリペプチドまたは蛋白質をコードする遺伝
子に融合されたストレプトマイセスに内因性のポリペプ
チドまたは蛋白質をコードする遺伝子の全部または一部
を含む、請求項5記載のクローニングビークル。 - 【請求項8】 請求項5〜7のいずれか記載のクローニ
ングビークルにより形質転換された、ストレプトマイセ
ス宿主細胞。 - 【請求項9】 請求項4記載のプロモータを含んでいる
ストレプトマイセス発現制御配列に作動可能に外来DNA
を結合させることを特徴とする、ストレプトマイセス中
で外来DNAを発現させる方法。 - 【請求項10】 外来DNAおよびストレプトマイセス発
現制御配列がストレプトマイセスの染色体DNAに挿入さ
れる、請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 外来DNAが、ストレプトマイセスから
分泌される蛋白質またはポリペプチドのシグナル配列の
少なくとも一部をコードしているDNAを介してストレプ
トマイセス発現制御配列に作動可能に連結され、上記シ
グナル配列をコードするDNAが上記ストレプトマイセス
発現制御配列の制御の下に上記外来DNAと共に発現され
て、当該外来DNAによりコードされている蛋白質または
ポリペプチドを分泌するものである、請求項9記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES9102765 | 1991-12-12 | ||
ES9102765 | 1991-12-12 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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---|---|
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US4745056A (en) * | 1984-10-23 | 1988-05-17 | Biotechnica International, Inc. | Streptomyces secretion vector |
DE3536182A1 (de) * | 1985-10-10 | 1987-04-16 | Hoechst Ag | Promotor-anordnung fuer streptomyceten-vektoren |
US5200327A (en) * | 1985-11-06 | 1993-04-06 | Cangene Corporation | Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from streptomyces |
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US5118617A (en) * | 1989-05-19 | 1992-06-02 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Saf polypeptide, gene coding therefor, saf promoter and expression methods for expressing foreign dna sequences in streptomyces |
ZA929284B (en) * | 1991-12-12 | 1993-06-02 | Serono Lab | P0438, an new calcium-regulated promoter. |
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